KR101691972B1

KR101691972B1 - 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101691972B1
Application number: KR1020160011531A
Authority: KR
Inventors: 박용만; 신은지; 김윤수; 윤성균
Original assignee: (주)퓨젠바이오농업회사법인
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2017-01-02
Also published as: CN107182201A; WO2016122261A1; KR20160094332A; CN107182201B

Abstract

본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 각종 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF A CANCER COMPRISING EXOPOLYSACCHARIDE PRODUCED BY CERIPORIA LACERATA AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

암은 여러 가지 원인에 의해 무제한 증식하는 미분화 세포로 구성된 종괴 또는 종양이 주위의 정상조직 또는 기관을 파괴시킴으로써 개체의 생명을 빼앗아 갈 수 있는 질환군을 총칭한다. 암에 대한 화학요법은 강한 세포독성을 보이는 항암물질 투여에 의존하고 있는데, 이는 많은 부작용을 유발하는 문제점이 있다. 따라서, 부작용을 줄이면서 치료율을 높일 수 있는 새로운 항암제의 개발이 요구되고 있다. 이에, 최근에는 종래 천연물, 특히 자생식물, 식물 생약으로부터 항암제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다. 이러한 천연물 유래 항암제에는 주목나무에서 분리한 택솔(Taxol; 파클리탁셀)이 알려져 있으나, 이는 암세포 사멸뿐만 아니라 신체 내 다른 정상세포에도 작용하기 때문에 다른 질환을 유발할 수 있는 문제점을 안고 있다.

세리포리아 락세라타는 백색 부후균의 일종으로서, 생태계에서 셀룰로오스, 헤미 셀룰로오스, 기타 다당류 및 글리세롤 등의 탄소원을 이용하기 위하여 리그닌 분해라는 공동대사(co-metabolism)를 수행하는 것으로 알려져 있다.

세리포리아 락세라타를 이용한 의학적 치료 용도와 관련하여, 본 발명자들에 의하여 출원된 대한민국 등록특허 제 10-1031605 호에 세리포리아 락세라타 배양액 추출물의 당뇨 치료 용도만이 지금까지 알려져 있을 뿐, 세리포리아 락세라타를 이용한 암 예방 또는 치료 효과는 아직까지 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물이 암 예방 또는 치료 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제 10-1031605 호

본 발명의 목적은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 활성성분을 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 각종 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 간암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 대장암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 위암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 폐암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 자궁경부암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 피부암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(**P<0.01).
도 7은 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 구강암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(**P<0.01).
도 8은 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 전립선암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(**P<0.01).
도 9는 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 췌장암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 10은 세리포리아 락세라타에 의해 생산된 세포외다당체의 갑상선암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(**P<0.01).
도 11은 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 피부암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(**P<0.01).
도 12는 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 구강암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(**P<0.01).
도 13은 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 전립선암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(**P<0.01).
도 14는 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 췌장암세포주에 대한 세포성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다(*P<0.05, **P<0.01).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "세포외다당체(extracellular polysaccharide, EPS)"란, 균류 등 미생물의 세포벽의 일부로서, 다당류가 세포 외로 분비되어 그 주위에 협막을 형성하거나 점질물로서 세포주위나 배지로 분비되는 물질을 의미한다. 상기 세포외다당체는 미생물이 항체, 독성물질, 원생동물 및 박테리오파지 등의 외부환경으로부터 자신을 보호하기 위해 분비된다.

상기 세포외다당체는 40 내지 60 중량%의 당과 30 내지 40 중량%의 단백질, 40 내지 50 중량%의 당과 32 내지 38 중량%의 단백질, 43 내지 47 중량%의 당과 33 내지 36 중량%의 단백질, 또는 약 45 중량%의 당과 약 34 중량%의 단백질을 포함할 수 있다.

상기 당은 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유할 수 있다.

상기 세포외다당체는 100 내지 150 kDa, 110 내지 140 kDa 또는 115 내지 125 kDa의 분자량을 가질 수 있고, 보다 구체적으로는 약 120 kDa의 분자량을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포외다당체는, (a) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하는 단계; (b) 상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 건조시켜 분말화하는 단계; 및 (c) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 분말을 용매로 추출한 후 이를 여과하고 감압농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해서 제조될 수 있다.

상기 (a) 단계에서의 세리포리아 락세라타 균사체의 액체 배양을 위한 배지는 설탕, 포도당, 전분, 수수분, 대맥분, 대두분, 황산마그네슘(MgSO₄), 1인산칼륨(KH₂PO₄), 2인산칼륨(K₂HPO₄) 및 물을 포함할 수 있고, 수소이온농도(pH)가 4.5 내지 6.0인 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 배지는, 설탕 0.2 내지 3 중량%, 포도당 0.2 내지 3 중량%, 전분 0.2 내지 4 중량%, 수수분 0.1 내지 0.5 중량%, 대맥분 0.1 내지 0.5 중량%, 대두분 0.2 내지 3 중량%, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.05 내지 0.1 중량%, 1인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05 내지 0.25 중량%, 2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.05 내지 0.25 중량% 및 잔량의 물을 포함할 수 있다.

상기 (a) 단계에서의 액체 배양은 청색 LED 광원 하에서 수행될 수 있고, 구체적으로, 상기 액체 배양은 청색 LED 광원 하에서 이산화탄소의 농도를 1,000 내지 2,000 ppm으로 유지하여 수행될 수 있다.

상기 액체 배양은 예를 들어, 20 내지 28 ℃에서, 수소이온농도는 4.5 내지 6.0, 광원은 청색 LED, 조도는 0.1 내지 0.8 LUX를 유지하며 공기는 0.5 내지 2.0 kgf/㎠으로 주입하고, 이산화탄소의 농도는 1,000 내지 2,000 ppm으로 유지하면서 8 내지 13일간 수행될 수 있다. 구체적으로, 20 내지 25 ℃, pH 4.5 내지 6.0, 0.5 내지 2.0 kgf/㎠의 공기 주입 및 1,000 내지 2,000 ppm의 이산화탄소 농도의 조건에서 5 내지 15일간 수행될 수 있다. 상술한 바와 같은 조건으로 액체 배양할 경우, 생산되는 세포외다당체의 함량이 높으므로 바람직하다.

상기 (a) 단계 모균주는 PDA(potato dextrose agar) 배지 상태로 1 내지 5 ℃에 보관중인 우량 균주를 삼각플라스크에 PDB(potato dextrose broth) 배지를 사용하여 진탕 배양기에서 25 ℃의 항온을 유지하며 7 내지 9 일간 배양과정을 거친 후 사용할 수 있다. 또한, 이와 같이 모균주를 배양한 후 배양액 또는 수득한 균사체를 접종원으로 이용할 수 있다. 이때, 접종원으로 투입될 균사체의 양은 배양할 용액의 양을 기준으로 0.5 %(w/v) 정도인 것이 바람직하다. 균사체량(%/100 ㎖, w/v)이 많다고 세포외다당체의 함량도 같이 높아지는 것이 아니므로 배지 조성은 균사체의 성장에 가장 양호한 영양 비율 및 환경조건이 아닌, 세포외다당체의 함량을 가장 높게 형성시키는 선택적 배양조건을 적용하는 것이 바람직하다.

상기 배양액은 균사체와 수용액으로 분리 정제할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리 정제는 원심분리기로 균사체를 제거한 용액을 다중필터프레스(multi-sheet filter press)와 진동원심막분리기(PALLSEP)로 반복하여 정제한 후, 1분간 자외선(UV)을 조사할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 산소를 제거한 후 밀봉하여 보관할 수 있으며, 이는 배양액 속에 균사가 존재할 경우 균사의 성장으로 유효성분의 함량에 변화를 가져올 수 있다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제조된 균사체 배양액을 건조시켜 분말화할 수 있다. 상기 건조는 유효물질의 소멸을 방지하기 위해 40 ℃ 이하의 온도, 보다 구체적으로는 30 ℃ 이하의 온도에서 48 내지 96 시간 동안 수행될 수 있다. 또한, (b) 단계의 건조는 증발온도를 상대적으로 높게 설정하는 진공건조기보다 진공동결건조기를 사용하는 것이 유효물질 함량 변화가 최소화되므로 바람직하다.

상기 (c) 단계에서는 (b) 단계에서 얻은 균사체 배양액의 건조분말을 용매로 추출한 후, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 세포외다당체를 분리한다.

구체적으로, 균사체 배양액의 건조 분말 3 내지 10 g에 증류수 100 ㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 5,000 내지 10,000 rpm으로 10 내지 30 분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 그 양의 2 내지 3 배에 해당하는 추출 용매를 첨가한 후, 1 내지 5 ℃의 냉장고에 넣어 10 내지 15 시간 정치시킬 수 있다. 상기 정치물에서 상등액만을 다시 5,000 내지 10,000 rpm으로 10 내지 30 분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수하여 조(crude) 세포외다당체를 제조할 수 있다. 상기 조 세포외다당체를 30 ℃ 이하에서 진공동결건조하여 세포외다당체를 수득할 수 있다.

상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에테르, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 보다 구체적으로는, 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세톤 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 물 또는 50 내지 99 %(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있다.

본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 통상적으로 사용되는 적절함 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 세포외다당체는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 80 중량%, 또는 0.1 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물은 상기 세포외다당체의 함량에 해당하는 양으로 적절히 포함될 수 있다. 그러나, 상기 세포외다당체; 이를 포함하는 배양액; 상기 배양액의 건조분말; 또는 상기 배양액의 추출물의 유효 함량은 약학 조성물의 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우, 락토오스, 수크로오스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 나아가, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및/또는 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여경로에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 유효성분인 세포외다당체를 기준으로 5 내지 1,000 mg/kg체중의 양, 구체적으로는 10 내지 600 mg/kg체중의 양을 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 우수한 암 예방 또는 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라 약물에 의한 독성 및 부작용도 거의 없어 항암제로서 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학 조성물은 다양한 암, 예를 들어, 간암, 대장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 방광암, 유방암, 난소암, 갑상선암, 중추신경암, 뇌암, 피부암, 췌장암, 직장암, 식도암, 신장암, 상피암, 혈액암, 구강암, 전립선암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있고, 캔디, 초콜릿, 껌, 차, 비타민복합체, 건강보조식품 등일 수 있다.

이때, 상기 건강기능식품 중에 포함되는 본 발명에 따른 세포외다당체; 이를 포함하는 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물의 함량은, 통상적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 건강 음료 조성물의 경우, 건강 음료 조성물 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 또는 0.3 내지 1 g의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 식품은 본 발명의 세포외다당체; 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물과 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

제조예 1. 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 제조

경북 상주시(한국)에서 채취한 참나무 변제부 속에서 분리한 세리포리아 락세라타를 계대배양을 통해 육성한 모균을 -80 ℃에 냉동보관하였고, 보관중인 균주를 PDA(potato dextrose agar) 배지(87 플라스틱 배양구; Difco, Becton Dickinson and Company)에서 2 내지 3회 계대 후 균주(이하 "PDA 배양균주"라 함)를 4 ℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다. 그리고 삼각플라스크에 PDB(potato dextrose broth) 배지(Difco, Becton Dickinson and Company) 600 ㎖를 조성한 후, 여기에 PDA 배양균주 1개를 넣고 25 ℃에서 8일간 진탕배양하여, PDB 배양균주를 수득하였다.

한편, 균주의 배양을 위해, 설탕 1.5 중량%, 포도당 0.5 중량%, 감자전분 0.5 중량%, 수수분 0.25 중량%, 대맥분 0.25 중량%, 대두분 0.75 중량%, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.05 중량%, 1인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05 중량%, 2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.05 중량% 및 잔량의 물을 포함하는 액체 배양 배지를 800 ℓ 발효조에서 121 ℃의 공기를 1.5 kgf/㎠로 주입하여 20 분간 살균한 후, 23℃로 냉각한 상태에서 스타터로 상기 PDB 배양균주 600 ㎖를 접종하고, 공기를 0.5 내지 1.5 kgf/㎠으로 통기시키면서, 광원은 청색 LED, 조도는 0.5 LUX를 유지하며, 이산화탄소의 농도는 2,000 ppm으로 세리포리아 락세라타 균사체를 23 ℃의 항온에서 10 일간 액체 배양함으로써 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하였다.

제조예 2 세리포리아 락세라타 배양액 건조분말의 제조

상기 제조예 1에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 진공동결건조기를 이용하여 25 ℃에서 72 시간 동안 진공동결건조시켜 분말화함으로써, 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 건조분말을 제조하였다.

제조예 3. 세리포리아 락세라타 배양액 추출물의 제조

상기 제조예 2에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 건조분말 5 g에 증류수 100 ㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리한 다음 이의 상등액에 그 양의 2 내지 3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 4 ℃에서 12 시간 정치시켰다. 이후 정치물에서 상등액을 취해 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 추출물을 제조하였다.

제조예 4. 세리포리아 락세라타 배양액으로부터 세포외다당체( extracellular polysaccharide; 이하 "EPS"라 함)의 제조

상기 제조예 3에서 수득된 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 추출물을 다시 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수하여 조(crude) EPS를 얻었다. 상기 조 EPS를 진공동결건조기를 이용하여 25 ℃에서 72 시간 진공동결건조시켜 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 EPS를 획득하였다.

실시예 1. EPS의 특성 평가

1.1 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC )를 이용한 EPS의 분자량 측정

상기 제조예 4에서 제조한 EPS를 0.1 M Na₂SO₄/0.05 M NaN₃[빙초산(glacial acetic acid)으로 pH를 4로 조정] 용액에 1 %(w/v)가 되도록 녹인 다음, 4,000 rpm으로 0.5 시간 동안 원심분리 후 상층액만을 0.45 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)로 여과하여 GPC로 분석하였다.

GPC 분석조건은 검출기로 굴절지수를 이용하였으며, GPC 칼럼은 OHpak SB 805 HQ(Shodex, Japan)를 이용하였고, 이동상은 0.1 M Na₂SO₄/0.05 M NaN₃[빙초산으로 pH를 4로 조정]을 사용하였으며, 이동상의 유속은 1.0 ㎖/분의 속도로 흘려주었다. 표준곡선은 각기 다른 분자량(130 kDa, 400 kDa, 770 kDa 또는 1,200 kDa)을 가진 덱스트란(American Polymer Corporation, USA)을 이용하여 작성하였으며, 굴절지수(refractive index, RI) 측정기 Knauer K-2310(Germany)를 이용하여 EPS의 분자량을 측정하였다. 측정 조건을 정리하면 하기 표 1과 같다.

	분자량의 측정
GPC 시스템	Knauer K-501 시스템
컬럼	OHpak SB 805 HQ(Shodex, Japan)
이동상	0.1 M Na₂SO₄/0.05 M NaN₃/pH 4
유속	0.1 ㎖/분
측정기	RI(Knauer K-2310)

그 결과, 본 발명의 EPS 분자량은 약 120 kDa으로 나타났다.

1.2 EPS의 당 및 단백질 함량 측정

제조예 4에서 제조한 EPS를 2차 정제하고 단백질 가수분해 효소를 처리하여 당 및 단백질 함량을 측정하였다.

구체적으로, 1차 정제된 EPS(제조예 4에서 제조한 EPS)를 증류수에 녹이고 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하여 상등액을 분리한 후, 분리된 상등액에 그 양의 2 내지 3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 4 ℃ 냉장고에 넣어 12 시간 정치시켰다. 그 후, 정치물에서 상등액만을 취해 이를 다시 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하고, 침전물을 회수하여 2차 정제된 EPS를 획득하였다. 상기 2차 정제된 EPS를 증류수에 용해시킨 후 단백질 가수분해 효소인 알칼레이즈(alcalase)를 0.5%(w/v)의 농도로 50 ℃에서 30 분간 처리하였다.

당 함량은 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid method)에 의해 측정하였다. 구체적으로, 농도별로 희석한 시료 1 ㎖에 80 %(v/v) 페놀을 25 ㎕ 첨가한 후, 황산 2.5 ㎖를 첨가하고 실온으로 냉각하고 465 nm에서 흡광도를 측정하여 당 함량을 계산하였다.

또한, 단백질 함량은 BCA 방법(Smith PK et al., Analytical Biochemistry, 150(1):76-85, 1985)에 의해 측정되었고 표준품으로 소혈청알부민을 사용하였다.

상술한 바와 같이 측정한 당 함량 및 단백질 함량은 하기 표 2에 나타냈으며, 당 함량은 45 내지 51 중량%이고 단백질 함량은 33 내지 34 중량%인 것으로 나타났다.

	수율(%)	총 당 함량(%)	총 단백질 함량(%)
EPS	1.22±0.03	45.32±1.41	34.17±0.73
2차 정제된 EPS	0.78±0.01	50.49±0.52	33.50±2.79
효소 처리된 EPS^*	0.24±0.06	51.39±1.32	34.61±1.51

^*효소 처리: 알칼레이즈 0.5 %, 50 ℃, 30 분.

각 수치는 평균±SE(n≥3)임.

또한, EPS의 당 구성성분 분석 결과, EPS는 주로 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유하고 있는 것으로 나타났다.

실시예 2. EPS의 항암 효과 검증 Ⅰ

2.1 MTT 어세이

상기 제조예 4에서 제조한 EPS의 항암 효과를 확인하기 위하여, 상기 EPS의 처리 농도별 MTT 어세이를 시행함으로써 각종 암세포에 대한 세포성장 억제 효과를 측정하였다.

상기 MTT(3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 담황색의 기질로서, 생세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄효소에 의해 개열하고 암청색의 포르마잔(formazan)을 생성하며 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로, 이 포르마잔의 생성량은 생세포수 측정에 이용된다(관련문헌: Van de Loosdrecht, A.A., et al., J. Immunol . Methods, 141(1):15-22, 1991).

먼저, 한국 세포주 은행에서 입수한 Hep3B(간암세포주), DLD-1(대장암세포주), AGS(위암세포주), A549(폐암세포주) 및 HeLa(자궁경부암세포주)를 각각 24 웰 플레이트에 5 × 10⁴ 세포/웰 농도로 분주한 후 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 하루 동안 배양하였다.

각 암세포주의 배양액의 조성은 다음과 같다.

- Hep3B(간암세포주): DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium), 10 %(v/v) FBS(Fetal Bovine Serum), 1 %(v/v) P/S (Penicillin/Streptomycin Solution)

- DLD-1(대장암세포주), AGS(위암세포주) 및 A549(폐암세포주): RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium), 10 %(v/v) FBS, 1 %(v/v) P/S

- HeLa(자궁경부암세포주): MEM(Minimum Essential Medium), 10 %(v/v) FBS, 1 %(v/v) P/S

세포부착을 확인한 후 새로운 배양액으로 바꾸어 주고, 증류수에 녹여 각각 5, 10 또는 20 mg/㎖의 농도가 되도록 EPS를 각 웰에 처리하고, 3일 동안 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 대조군은 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다.

여기에, 전체 배지의 1/10(v/v) 되는 양의 MTT 용액을 각각 처리하고, 배양기에서 4 시간 동안 반응시킨 후 포르마잔 형성을 확인하고, 포르마잔이 흩어지지 않게 상등액을 완전히 제거하였다. 그 후, 각 웰에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100 ㎕씩 넣고 세포 내에 형성된 포르마잔을 용해시켰다. 엘리사(ELISA) 판독기로 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여, 각 암세포주의 세포 생존률을 측정하였다.

2.2 간암 치료 효과 분석

하기 표 3 및 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 EPS의 처리 농도가 5 mg/㎖에서 20 mg/㎖로 증가함에 따라 Hep3B(간암세포주)의 세포 생존률이 점점 감소하였다. 특히, EPS를 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 97 %의 세포성장 억제 효과를 보였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS의 탁월한 간암 치료 효과를 보여준다.

종류	농도 (mg/㎖)	OD (570 nm)				세포 생존률(%)	세포 생존률의 표준편차(%)
종류	농도 (mg/㎖)	1회	2회	평균	표준편차	세포 생존률(%)	세포 생존률의 표준편차(%)
control	0	0.747	0.754	0.751	0.00	100.00	0.66
EPS	5	0.024	0.025	0.025	0.00	3.26	0.09
	10	0.005	0.004	0.005	0.00	0.60	0.09
	20	0.005	0.004	0.005	0.00	0.60	0.09

2.3 대장암 치료 효과 분석

하기 표 4 및 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2.1의 MTT 어세이 결과 본 발명에 따른 EPS의 처리 농도가 5 mg/㎖에서 20 mg/㎖로 증가함에 따라 DLD-1(대장암세포주)의 세포 생존률이 점점 감소하였다. 특히, EPS를 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 98 %의 세포성장 억제 효과를 보였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS의 탁월한 대장암 치료 효과를 보여준다.

종류	농도 (mg/㎖)	OD (570 nm)				세포 생존률(%)	세포 생존률의 표준편차(%)
종류	농도 (mg/㎖)	1회	2회	평균	표준편차	세포 생존률(%)	세포 생존률의 표준편차(%)
control	0	0.480	0.488	0.484	0.01	100.00	1.17
EPS	5	0.011	0.011	0.011	0.00	2.27	0.00
	10	0.010	0.009	0.095	0.00	1.96	0.15
	20	0.006	0.005	0.006	0.00	1.14	0.15

2.4 위암 치료 효과 분석

하기 표 5 및 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2.1의 MTT 어세이 결과 본 발명에 따른 EPS의 처리 농도가 5 mg/㎖에서 20 mg/㎖로 증가함에 따라 AGS(위암세포주)의 세포 생존률이 점점 감소하였다. 특히, EPS를 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 85 %의 세포성장 억제 효과를 보였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS의 탁월한 위암 치료 효과를 보여준다.

종류	농도 (mg/㎖)	OD (570 nm)					세포 생존률(%)	세포 생존률 표준편차(%)
종류	농도 (mg/㎖)	1회	2회	3회	평균	표준편차	세포 생존률(%)	세포 생존률 표준편차(%)
control	0	0.902	0.844	0.973	0.906	0.065	100.00	7.13
EPS	5	0.124	0.126	0.124	0.125	0.001	13.8	0.13
	10	0.113	0.112	0.113	0.113	0.001	14.0	0.06
	20	0.101	0.110	0.115	0.109	0.007	12.0	0.78

2.5 폐암 치료 효과 분석

하기 표 6 및 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2.1의 MTT 어세이 결과 본 발명에 따른 EPS의 처리 농도가 5 mg/㎖에서 20 mg/㎖로 증가함에 따라 A549(폐암세포주)의 세포 생존률이 점점 감소하였다. 특히, EPS를 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 43 %의 세포성장 억제 효과를 보였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS의 탁월한 폐암 치료 효과를 보여준다.

종류	농도 (mg/㎖)	OD (570 nm)					세포 생존률(%)	세포 생존률 표준편차(%)
종류	농도 (mg/㎖)	1회	2회	3회	평균	표준편차	세포 생존률(%)	세포 생존률 표준편차(%)
control	0	0.804	0.795	0.825	0.808	0.015	100.0	1.91
EPS	5	0.425	0.503	0.459	0.462	0.039	57.2	4.84
	10	0.152	0.162	0.160	0.158	0.005	19.6	0.65
	20	0.100	0.109	0.114	0.108	0.007	13.3	0.88

2.6 자궁경부암 치료 효과 분석

하기 표 7 및 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2.1의 MTT 어세이 결과 본 발명에 따른 EPS의 처리 농도가 5 mg/㎖에서 20 mg/㎖로 증가함에 따라 HeLa(자궁경부암세포주)의 세포 생존률이 점점 감소하였다. 특히, EPS를 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 96 %의 세포성장 억제 효과를 보였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS의 탁월한 자궁경부암 치료 효과를 보여준다.

종류	농도 (mg/㎖)	OD (570 nm)				세포 생존률(%)	세포 생존률 표준편차(%)
종류	농도 (mg/㎖)	1회	2회	평균	표준편차	세포 생존률(%)	세포 생존률 표준편차(%)
control	0	0.429	0.437	0.433	0.01	100.00	1.31
EPS	5	0.016	0.016	0.016	0.00	3.70	0.00
	10	0.013	0.013	0.013	0.00	3.00	0.00
	20	0.008	0.008	0.008	0.00	1.85	0.00

실시예 3. EPS의 항암 효과 검증 Ⅱ

3.1 MTT 어세이

EPS의 처리 농도를 0.25, 0.5 또는 1 mg/㎖로 하고, 암세포로서 Melanoma B16(피부암세포주), CRL-1628(구강암세포주), PC-3(전립선암세포주), SNU-410(췌장암세포주) 및 SNU-790(갑상선암세포주)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 EPS의 항암 효과를 검증하였다.

각 암세포주의 배양액의 조성은 다음과 같다.

- Melanoma B16: DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium), 10 %(v/v) FBS(Fetal Bovine Serum), 1 %(v/v) P/S (Penicillin/Streptomycin Solution)

- CRL-1628, PC-3, SNU-410 및 SNU-790: RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium), 10 %(v/v) FBS, 1 %(v/v) P/S

3.2 피부암 치료 효과 분석

도 6에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 3.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 EPS의 처리 농도가 0.25 mg/㎖에서 1 mg/㎖로 증가함에 따라 피부암세포주의 세포 생존률이 점차 감소하였다. 특히, EPS를 1 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 14 %의 세포성장 억제 효과를 보였다.

3.3 구강암 치료 효과 분석

도 7에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 3.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 EPS를 1 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 15 %의 세포성장 억제 효과를 보였다(EPS의 처리 농도 0.25 및 0.5 mg/㎖의 MTT 어세이 결과 미기재).

3.4 전립선암 치료 효과 분석

도 8에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 3.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 EPS의 처리 농도가 0.25 mg/㎖에서 1 mg/㎖로 증가함에 따라 전립선암세포주의 세포 생존률이 점차 감소하였다. 특히, EPS를 1 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 49 %의 세포성장 억제 효과를 보였다.

3.5 췌장암 치료 효과 분석

도 9에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 3.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 EPS의 처리 농도가 0.5 mg/㎖에서 1 mg/㎖로 증가함에 따라 췌장암세포주의 세포 생존률이 점차 감소하였다. 특히, EPS를 1 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 14 %의 세포성장 억제 효과를 보였다(EPS의 처리 농도 0.25 mg/㎖의 MTT 어세이 결과 미기재).

3.6 갑상선암 치료 효과 분석

도 10에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 3.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 EPS의 처리 농도가 0.5 mg/㎖에서 1 mg/㎖로 증가함에 따라 갑상선암세포주의 세포 생존률이 점차 감소하였다. 특히, EPS를 1 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 14 %의 세포성장 억제 효과를 보였다(EPS의 처리 농도 0.25 mg/㎖의 MTT 어세이 결과 미기재).

실시예 4. 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 항암 효과 검증

4.1 MTT 어세이

상기 제조예 1에서 제조한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액(이하, 표 및 도면에서 CL01로 표기함)의 항암 효과를 확인하기 위하여, CL01의 처리 농도를 1, 2.5 또는 5 mg/㎖로 하여 실시예 2.1에서와 같이 MTT 어세이를 시행함으로써 각종 암세포에 대한 세포성장 억제 효과를 측정하였다.

암세포로서 Melanoma B16(피부암세포주), CRL-1628(구강암세포주), PC-3(전립선암세포주) 및 SNU-410(췌장암세포주)를 사용하였고, 각 암세포주의 배양액의 조성은 실시예 3에 기재된 바와 같았다.

4.2 피부암 치료 효과 분석

도 11에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 4.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 CL01의 처리 농도가 1 mg/㎖에서 5 mg/㎖로 증가함에 따라 피부암세포주의 세포 생존률이 다소 감소하였다. 특히, CL01을 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 14 %의 세포성장 억제 효과를 보였다.

4.3 구강암 치료 효과 분석

도 12에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 4.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 CL01의 처리 농도가 1 mg/㎖에서 5 mg/㎖로 증가함에 따라 구강암세포주의 세포 생존률이 점차 감소하였다. 특히, CL01을 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 48 %의 세포성장 억제 효과를 보였다.

4.4 전립선암 치료 효과 분석

도 13에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 4.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 CL01의 처리 농도가 1 mg/㎖에서 5 mg/㎖로 증가함에 따라 전립선암세포주의 세포 생존률이 점차 감소하였다. 특히, CL01을 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 48 %의 세포성장 억제 효과를 보였다.

4.5 췌장암 치료 효과 분석

도 14에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 4.1의 MTT 어세이 결과 본 발명의 CL01의 처리 농도가 1 mg/㎖에서 5 mg/㎖로 증가함에 따라 췌장암세포주의 세포 생존률이 점차 감소하였다. 특히, CL01을 5 mg/㎖의 농도로 처리하였을 때, 약 54 %의 세포성장 억제 효과를 보였다.

이로부터 본 발명에 따른 EPS뿐만 아니라, 상기 EPS를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말, 및 상기 균사체 배양액의 추출물도 항암제로서 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims

세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 방광암, 유방암, 난소암, 갑상선암, 중추신경암, 뇌암, 피부암, 췌장암, 직장암, 식도암, 신장암, 상피암, 혈액암, 구강암 또는 전립선암인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 세포외다당체가 40 내지 60 중량%의 당 및 30 내지 40 중량%의 단백질을 포함하고, 100 내지 150 kDa의 분자량을 갖는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 세포외다당체가 43 내지 47 중량%의 당 및 33 내지 36 중량%의 단백질을 포함하고, 115 내지 125 kDa의 분자량을 갖는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 당이 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외다당체가,
(a) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하는 단계;
(b) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 건조시켜 분말화하는 단계; 및
(c) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 분말을 용매로 추출한 후, 이를 여과하고 감압농축하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의하여 제조된, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,
상기 액체 배양을 위한 배지가 설탕, 포도당, 전분, 수수분, 대맥분, 대두분, 황산마그네슘(MgSO₄), 1인산칼륨(KH₂PO₄), 2인산칼륨(K₂HPO₄) 및 물을 포함하고, 수소이온농도(pH)가 4.5 내지 6.0인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,
상기 액체 배양이 청색 LED 광원 하에서 수행되는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 액체 배양이 이산화탄소의 농도를 1,000 내지 2,000 ppm으로 유지하여 수행되는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 세포외다당체가 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 80 중량%로 포함되는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 방광암, 유방암, 난소암, 갑상선암, 중추신경암, 뇌암, 피부암, 췌장암, 직장암, 식도암, 신장암, 상피암, 혈액암, 구강암 또는 전립선암인, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품.