KR20070112507A - 신경세포 보호활성을 갖는 노다케닌을 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당귀 추출물의 유효성분인 노다케닌(Nodakenin)을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 당귀 추출물 유효성분인 노다케닌은 뇌허혈에 의해 유도되는 뇌신경세포 손상을 보호하는 효과를 나타내므로, 노다케닌을 포함하는 조성물은 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

노다케닌(Nodakeknin), 신경세포 보호, 뇌허혈, 퇴행성 뇌질환

Description

신경세포 보호활성을 갖는 노다케닌을 함유하는 조성물{Composition comprising Nodakenin having neuronal cell-protecting activity for preventing and treating the degenerative brain disease}

도 1는 중대뇌동맥 페쇄법(MCAo 방법)을 이용한 흰쥐의 국소뇌허혈 모델에서, 본 발명의 노다케닌(Nodakenin)의 투여 농도에 따른 흰쥐 뇌조직에서의 뇌신경세포 손상 보호 효과를 관찰하기 위해 흰쥐의 뇌조직 절편을 TTC 염색법으로 관찰한 도이고,

도 2 는 다이메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide : DMSO)을 투여한 대조군과 노다케닌 투여군에서의 뇌조직 손상율 (또는 뇌경색비율)을 비교하여 나타낸 도이며,

도 3a 및 b는 전뇌허혈을 유발 시키지 않은 정상 대조군(sham)쥐의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관성(coronal)절편을 크레질 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 도이고,

도 4a 및 b는 10분간 전뇌허혈을 유발시킨 다음 0분과 90분에 20% 다이메틸 설폭사이드를 투여한 약물처치군 쥐의 7일후의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관성(coronal)절편을 크레질 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경 으로 촬영한 도이며,

도 5a 및 b는 10분간 전뇌허혈을 유발시킨 다음 0분과 90분에 본 발명의 노다케닌을 30mg/kg 복강투여한 약물처치군 쥐의 7일후의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관성(coronal)절편을 크레질 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 도이고,

도 6는 전뇌허혈 실험모델에서 노다케닌의 신경보호효과를 나타낸 그래프이다. 10분간 전뇌허혈을 유발시킨 다음 0분과 90분 총 2회에 걸쳐 20% 다이메틸설폭사이드(DMSO), 노다케닌을 복강투여하였다. 7일 후에 다이케틸설폭사이드를 투여한 대조군과, 노다케닌을 투여한 군의 뇌 해마 CA1 영역의 세포수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 당귀 추출물의 유효성분인 노다케닌(Nodakenin)을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 당귀 추출물 유효성분인 노다케닌은 뇌허혈에 의해 유도되는 뇌신경세포 손상을 보호하는 효과를 나타내므로, 노다케닌을 포함하는 조성물은 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

통계청에서 2003년 10월 발표한 우리나라 노령 인구의 비율을 살펴보면, 우 리나라는 지난 2000년 65세 이상 인구가 총인구에서 차지하는 비중이 7.2 %에 이르러 고령화 사회에 들어섰으며, 오는 2019년에는 이 비율이 14 %를 넘어 고령사회에 진입할 것으로 전망되고 있다. 이와 같이 최근 고령화 문제가 사회적인 이슈로 대두됨에 따라 고령인구의 특성이나 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지 등에 대한 국민의 관심이 높아지고, 이에 대한 통계 수요도 늘어나고 있다. 이러한 변화의 핵심은 노령화 인구의 증가로 인해서 지난 50여 년간 사망의 주된 원인이 되었던 급성전염성질병보다는 만성퇴행성 질병이 더욱더 큰 문제로 대두되고 있다는 점이다. 특히 만성퇴행성 질병 중에서 뇌혈관질환에 의한 사망은 단일질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환이다.

뇌혈관질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환이다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP 감소, 부종(edema)이 발생되며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다 (Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol ., 1984, 62, pp.201-208 ; Kirino T. Brain Res., 1982, 239, pp.57-69).

지금까지 가장 많은 사람들이 받아들이는 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전(Kang TC, et al., J. Neurocytol., 30, pp.945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사, 2가지 기전에 있다(Won MH, et al., Brain Res., 1999, 836, pp.70-78. ; Sun AY, Chen YM. J. Biomed . Sci., 1998, 5 , pp.401-414. ; Flowers F, Zimmerman JJ. New Horiz ., 1998, 6, pp.169-180).

이러한 기전적인 연구를 바탕으로 해서 뇌허혈시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나 아직까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.

지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로 FDA 공인 시판 중인 조직플라즈미겐활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질이다. 따라서 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량 사용 또는 자주 사용시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유 발하게 된다.

또한 초기의 칼슘 유입을 효과적으로 억제하기 위한 칼슘채널 억제제(calcium channel blocker)인 MK-801의 경우 임상적 테스트가 실행이 되었으나 그 부작용으로 인해 약물을 폐기한 바 있다.

한편 국내의 경우, 다수의 천연물질이 뇌졸중 예방에 효과가 있는 건강식품으로 시판되고 있으나 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다.

따라서, 오랫동안 사용되어 그 안전성이 입증된 천연자원들을 객관적으로 검증하여 뇌질환 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하고자 하는 노력이 시급히 요구되고 있다.

당귀는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 식물로써 한국에서는 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 사용하고 있으며, 그 뿌리는 예로부터 보혈, 활혈 등의 효능으로 사용되어 왔다. 참당귀의 성분으로는 쿠마린(coumarin) 유도체인 데커신(decursin), 데커시놀(decursinol), 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)(Ryu KS et al, Kor J. pharmacology, 21,64-68,1990), 15여종의 정유성분과 β-시토스테롤(β-sitosterol)의 수종의 스테로이드(steroid) 성분(Yoon HR et al,Kyung Hee pharma.sci,23,55-71) 노다케닌(nodakenin), n-부틸이딘(n-butylidene), 프탈라이드(phthalide) 등이 보고되어져 있다. 약리작용은 글루타메이트(glutamate) 독성에 대한 억제작용, 항산화, 신생혈관, 항암, 아세틸콜린 에스터레이즈(acetycholin esterase) 억제작용, 혈청 지질 강하 작용 등이 있다. 신감( 辛甘), 온(溫) 하고 간(肝), 심(心), 비경(脾經)으로 들어가 보혈(補血), 활혈지통(活血止通), 윤장통변(潤腸通便)의 효능이 있어서 심계(心悸), 두혼목현(頭昏目眩), 통경(通經), 경폐((徑閉), 혈허장조변비(血虛腸燥便秘)등을 치료한다고 알려져 있다. 또한 관장동맥 혈류증가, 혈소판 응집저하(Lee YY et al Arch. Pharm . Res., 2003, 26(9), 723-6.), 심계, 건망을 치료한다고 하여 혈병에 요약으로 널리 사용되어지는 약이다.(김호철: 한약약리학, 집문당, 2001, 464-467.) 그러나 신경세포 보호 작용에 대한 연구는 보고 된 바가 없으며, 특히 동물모델을 이용한 신경보호 작용에 대한 연구는 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은, 노다케닌이 중대뇌동맥 폐쇄와 4-혈관폐쇄로 유발한 실험동물의 뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대하여 신경세포를 보호하여, 뇌허혈에 의한 신경세포 손상을 현저히 예방할 수 있음을 확인하여, 이를 근간으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신경세포 보호활성을 갖는 당귀 추출물인 노다케닌을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 당귀 추출물로부터 분리된 노다케닌을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공한다.

상기 노다케닌은 참당귀 (Angelica gigas), 왜당귀 (Angelica acutiloba) 또는 중당귀 (Angelica sinensis), 바람직하게는 참당귀 (Angelica gigas) 추출물로 분리됨을 특징으로 한다.

상기 추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 n-부탄올로 추출한 것을 포함한다. 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병이 포함된다.

이하 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 노다케닌은 하기 구조식 A로 표기된다.

(A)

본발명의 당귀 추출물은 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리를 건조, 세절하여 건조 중량(kg)의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 10배의 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 70% 에탄올로 추출한 후 감압 농축하여 조 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 용매극성에 따라 핵산, 클로로포름, 디클로로메탄(CH₂Cl₂)등의 비극성용매, 바람직하게는 디클로메탄으로 그리고 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올등의 극성용매, 바람직하게는 n-부탄올(n-butanol)으로 순차적으로 분획하여 각각 극성용매 분획물, 비극성용매 분획물을 얻는 2단계; 상기 2단계에서 수득한 각 분획물들을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column Chromatography) 세파덱스 LH-20 크로마토그래피(Sephadex LH-20 chromatography) 및 고압액체크로마토그래피(High pressure liquid chromatography) 등의 다양한 분리방법을 이용하여 당귀의 극성용매 분획물과 비극성 분획물로부터 각각 유효성분 후보물질을 분리하는 3단계; 상기 3단계의 극성용매, 바람직하게는 n-부탄올 분획물로부터 본 발명의 노나케닌 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 노다케닌은 중대뇌동맥 폐쇄와 4-혈관폐쇄로 유발한 실험동물의 뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대하여 신경세포를 보호하여 뇌허혈에 의한 신경세포 손상을 현저히 예방할 수 있음을 확인하였다.

이에 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 신경세포보호활성을 갖는 노타케닌을 제공하며, 이는 신경세포사에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환을 예방하고 치 료하는 용도로 사용할 수 있다.

또한, 상기 노다케닌을 함유한 당귀는 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약제로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

이에, 본 발명은 신경세포보호활성을 갖는 상기 노다케닌을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 신경세포사에 의한 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 노다케닌을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 노다케닌의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 노다케닌을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로 필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 노다케닌의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어 떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 노다케닌은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 상기 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 신경세포 보호 및 퇴행성 뇌질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 노다케닌의 제조

참당귀 뿌리(건조중량 15kg)를 70% 에탄올로 추출한 후 감압 농축하여 1.4kg의 조추출물을 얻었다. 조추출물을 증류수에 현탁시킨 후 이를 용매극성에 따라 디클로로메탄(CH₂Cl₂), n-부탄올(n-butanol)로 순차적으로 분획하여 각각 디클로 로메탄(CH₂Cl₂) 분획물(450g), n-부탄올(n-butanol) 분획물(130g)을 얻었다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 크로마토그래피 및 고압액체 크로마토그래피 등의 다양한 분리방법을 이용하여 당귀의 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 분획과 n-부탄올(n-butanol) 분획물로부터 각각 유효성분 후보물질을 분리 실시하였으며, 실험결과, n-부탄올 분획물로부터 하기 물성치를 나타내는 노다케닌 화합물(13g)을 분리하여 참고문헌의 기재된 물성치와 비교하였다(Kim, SH, Kang SS, Kim, CM. Arch. Pharm. Res. 1992, 15, 73-77).

참고예 1. 실험동물의 준비

실험동물로 300 g 내외, 8주령의 스프라그-다울리계(sprague-dawly) 수컷 흰쥐와 170g 내외, 5주령의 위스터계(Wistar) 수컷 흰쥐를 각각 샘타코사와 중앙실험동물(서울, 대한민국)에서 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 실험환경에 적응시킨 다음 실험에 착수하였다.

실험예 1. 노다케닌의 뇌신경세포 보호 효과 - 중대뇌동맥폐색모델( MCAo )

노다케닌의 국소 뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대하여 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 응용된 혈관내 봉합사 삽입법(intraluminal suture method)을 사용하였다(Zea Longa, et al, Stroke., 1989, 20, 84-91).

먼저, 25 ㎜의 4-0 나이론 봉합사의 끝 부분에서 약 5-8 ㎜길이를 실리콘으 로 코팅하되 지름이 0.30 ㎜가 되게 제작하여 실험에 사용하였다. 흰쥐를 70 % N₂O와 30 % O₂가 섞인 혼합가스에 5 %의 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 한 후 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 조심스럽게 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인 익돌근구개동맥을 전기소작하고 외경동맥을 자르고 프로브를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 18~20 ㎜정도 삽입한 후 실로 고정하였다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연회복 시켰다. 유발 직후 및 120분에 노다케닌을 10 및 30 mg/kg의 농도로 각각 흰쥐 체중 100 g당 0.1 ㎖씩의 부피로 20% DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 으로 희석하여 복강 주사하였으며, 대조군은 같은 부피의 5% DMSO 를 투여하였다. 모든 실험군은 당일에 같은 마리수를 유발하였으며 수술은 체온이 37±0.5 ℃가 되게 유지하면서 관찰하였다. 수술 120분 후 상기와 같은 방법으로 재 마취하여 프로브를 후퇴시켜 재관류 시켰다. 재관류 후 24시간 후에 경추탈골 시키고, 2분 이내에 뇌를 적출하여 2 ㎜ 두께로 6개의 절편을 얻었다. 2 % TTC(triphenyltetrazolium chloride)가 들어 있는 16 웰 플레이트(well plate)에 조직을 충분히 담그고 37 ℃에서 30 분 동안 방치하였다. 모든 수술과정은 수술현미경하에서 시행하였으며, 마취는 이소플루란을 2 %로 계속 유지하면서 체온이 37℃이하로 떨어지지 않도록 램프를 쬐어주었다. 조직은 디지털 카메라로 하나씩 촬영한 후 컴퓨터로 옮겼고, 이미지 분석프로그램인 옵티마스 6.5(Optimas 6.5, Bioscan)를 이용하여 뇌경색 비율 (%)을 하기 수학식 1로 계산하였다. 이때, 교정된 뇌경색의 부피(mm³)는 하기 수학식 2로 계산하였다.

뇌경색 비율(%) = (A-B/A)× 100

A: 정상 좌반구의 부피(mm³)

B: 교정된 뇌경색의 부피 (mm³)

교정된 뇌경색의 부피(mm³)

= (정상 좌반구의 부피)- (손상 반구의 정상 부위 부피)

노다케닌의 뇌조직 및 뇌신경세포 보호 효과를 측정한 결과, 도 1 에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 노다케닌을 30mg/kg 복강투여한 군은 신경세포가 사멸되어 TTC로 염색 되지 않은 부위의 면적이 적었고, 신경세포가 손상되지 않아 TTC로 염색 된 흑적색 부위의 면적이 적은 것을 알 수 있었다. 참고로, TTC로 뇌조직을 염색하면 손상으로 인하여 조직이 사멸한 부위는 염색이 되지 않아 흰색으로 나타나며, 정상 부위의 조직은 염색이 되어 흑적색으로 나타난다.

또한, 도 2 에서 보는 바와 같이, 20% DMSO 를 투여한 대조군은 뇌경색 비율(%)이 30.28±2.24 % 로 나타났고, 노다케닌을 10 및 30 mg/kg으로 투여한 군에서는 각각 25.5±5.54 및 13.38±1.67 % 로 나타나 30mg/kg에서 신경보호효과를 나타내었다. 이는 대조군에 비하여 55.8 %의 신경보호효과를 나타내었다.

실험예 2. 노다케닌의 뇌신경세포 보호 효과 - 4-혈관폐색모델(4- VO )

노다케닌의 뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대하여 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여, 중풍 치료 효과 관찰을 목적으로 1979년 펄시넬리(Pulsinelli)가 개발한 4-혈관폐색(4-Vessel Occlusion) 모델을 사용하였다. (Pulsinelli WA, Brierley JB., Stroke., 10, pp 267-272. 1979)

쥐를 질소와 산소의 혼합가스(질소 70%, 산소 30%)에 포함된 5% 이소플루레인(isoflurane)으로 마취시킨 다음 정위고정장치(stereotaxic apparatus)에 수평면으로 머리를 기준으로 하여 꼬리를 아래도 30℃ 경사지게 고정시켰다. 코와 입 주위는 플라스틱 원추흡입기(cone)로 마취기에 연결시키고 마취는 1.5% 이소플루레인으로 계속 유지시켰다.

꼬리를 수술대에 고정하고 경추를 신전시킨 상태로 실험하였다. 먼저 인후(咽喉)부위를 수술하기 위하여 총경동맥에 실리콘 듀브로 고리를 만들어 허혈을 유발하고 재관류할 수 있도록 장치하였다. 그리고 허혈 유발시 미세혈관의 순환을 봉쇄하기 위하여 실로 뒤쪽으로는 기관(氣管, trachea), 식도(esophagus), 외부 경정맥(external jugular vein), 총경동맥(common carotid arteries) 들이 위치하도록 앞쪽으로는 경부(cervical), 척추주위(paravertebral) 근육들이 지나가도록 꿰뚫은 다음 수술용 클립으로 상처를 봉합하였다.

그 다음 쥐를 돌려서 목 정중선 절개를 하여 후두골 하단의 1번 경추부를 수술확대경을 이용하여 근육이 다치지 않게 수술하고 1mm 이하의 미세한 전기소작침을 1번 경추의 우상공(alar foramina)을 통하여 밑으로 척추동맥이 통과하고 있는 터널로 집어넣어, 간헐적인 전류를 통전시켜 척추동맥을 소작하였다. 수술 현미경을 이용하여 뼈 속으로 지나가는 터널에 존재하는 척추동맥이 완전히 소작되어서 폐쇄되었다는 것을 확인한 다음 수술용 클립으로 봉합하였다. 봉합후 24시간이 지난 다음 수술용 클립을 제거한 다음 총경동맥을 동맥류(動脈瘤, aneurysm) 클립으로 10분 동안 조여서 허혈을 유발하였다. 만약 1분 이내에 대광반사(對光反射)가 소실되지 않으면 경부봉합을 단단하게 하였고 이때 대광반사가 소실되지 않은 쥐들은 완전한 양측 평행적인 CA1 신경손상이 유발되지 않았기 때문에 제외시켰고, 경련을 일으키는 쥐들도 제외시켰다. 허혈 유발 10분 후 총경동맥에서 동맥류 클립을 떼어 내어 허혈을 중지시키고 재관류시켰다.

허혈 유발 1주일 후에 쥐를 클로랄 하이드레이트(35.0mg/kg, i.p.)로 마취시켜 개흉한 다음, 심장 우심이를 절개하여 좌심실에 바늘을 주입한 후 헤파린 처리한 5% 질산 나트륨 생리식염수를 10분동안 심장에 관류시키고, 4.0% 포르말린 고정액으로 관류시켰다. 그 후 쥐의 뇌부분을 떼어내어 2시간 동안 0.1M 인산 완충된 포르말린 고정액에 후고정 시킨 다음, 30% 수크로오즈 용액에 담가 4에서 하룻밤 동안 방치하였다. 고정된 뇌에서 정수리점(Bregma) -2.5 mm 와 -4.0 mm 사이의 등 쪽 해마(dorsal hippocampus) 부위에 있는 관상조각(coronal block)을 절개하고 -70에서 동결한 후 슬라이딩 마이크로톰을 이용하여 30㎛ 간격으로 절단하여 해마를 포함하는 조직 절편을 제조하였다.

상기의 방법으로 제조된 절편을 크레실 바이올렛에 염색하여 고정시킨 다음 등쪽 해마(odrsal hippocampal) CA1 중 지연성 신경원세포 사망(delayed neuronal death)에 의해 가장 손상받기 쉬운 부분인(Crain BJ et al,. Neuroscience 1988, 27, 387-402) 중간대(middle zone) 1,000㎛ 부분내에 존재하는 손상된 신경 세포수를 관찰하였다. 세포수의 관찰은 고배율(X 250)에서 정상적인 형태를 보이는 추체세포(pyramidal cell)의 수를 3인의 관찰자가 한 개의 뇌조직에서 3개의 다른 조직 절편의 좌우양측 2개, 총 6부위에서 관찰한 값을 평균하였다.

정상 대조군으로는 뇌허혈을 유발하지 않은 흰쥐의 뇌 해마 조직을, 무첨가 대조군으로는 상기 과정에서 본 발명의 노다케닌 대신 20% 다이메틸 설폭사이드를 주사 투여한 흰쥐의 뇌 해마 조직을 사용하였다.

실험결과, 정상 대조군(sham operated)에서는 해마(hippocampal) 신경세포들이 정상적으로 관찰되었으며(도 3a 및 3b 참조), 무첨가 대조군 신경세포의 경우 정상 신경세포와는 다르게 조직이 이완되면서 세포들이 주변 세포로부터 유리되는 현상을 관찰할 수 있었으며, 세포체(cell body) 역시 본래의 추체상(pyramidal) 형태를 잃고 응축되어 단일 세포의 형태로 되어있음을 확인할 수 있었다. 또한 핵 염색질이 농축되고 핵막이 붕괴되는 현상이 관찰됨으로써 세포고사(apoptosis)가 이루어 졌음을 확인할 수 있었다(도 4a 및 도 4b 참조).

본 발명의 노다케닌을 30mg/kg 복강투여한 군의 신경세포는 정상 세포와 유사한 형태를 나타내었으며, 잘 뻗어나가는 핵주위질(perikaryon)과 중앙에 위치하는 둥근 핵으로 인하여 쉽게 구별되었으며 비교적 건강한 상태로 주위의 호중구(neutrophil)와는 명확하게 구별되었다. 또한, 대다수의 세포들이 세포고사(apoptosis)로부터 방어되어 정상적인 추체(phramidale) 형태를 이루었으며 주변세포들과의 연결(junction)을 계속하여 유지하고 있음을 확인하였다(도 5a 및 도 5b 참조).

또한, 정상 대조군(sham)에서는 가로x세포 1mm² 당 세포수 평균은 374± 34.8 인 반면, 무첨가 대조군에서는 85±18.8로 나타나 신경세포 고사가 많이 일어났음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 노타케닌 10, 30mg/kg 을 투여한 실험군에서는 세포수 평균이 각각 164±37.7, 193±35.7 세포수/mm 로 무첨가 대조군에 비하여 48.1, 55.9 % 정도의 신경세포가 살아있음을 확인함으로써 우수한 신경세포 보호 효과를 나타냄을 확인하였다(도 6 참조).

실험예 3. 급성독성 실험

3 -1. 경구투여

ICR계 마우스(몸무게 25ㅁ 5 g)와 스프라그-다울리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 100, 250, 500 및 1000 ㎎ /㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰하였다.

실험결과 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 보아, 본 발명의 화합물은 랫트에서 각각 1000㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 100 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

3-2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25±5g)와 스프라그-다울리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 25, 50, 100 및 200㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰하였다.

실험결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 보아, 본 발명의 화합물은 랫트에서 각각 200㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 노다케닌을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

노다케닌 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

노다케닌 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

노다케닌 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전 하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

노다케닌 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

노다케닌 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

노다케닌 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산 제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 5 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

노다케닌 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 신경세포 보호활성을 갖는 당귀의 추출물인 노다케닌(Nodakenin)을 유효성분으로 함유하는 조성물은 뇌허혈시 발생되는 신경세포사를 저해하는 효과를 확인함으로써, 신경세포의 괴사에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 및 후유증의 개선을 위한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 이용될 수 있다.

Claims (5)

1. 신경세포 보호활성을 갖는 하기 구조식 (A)의 노다케닌(Nodakenin)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물:

   

   (A)
2. 제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병인 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 노다케닌은 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리로부터 수득 분리됨을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 신경세포 보호활성을 갖는 제 1항의 노다케닌 및 식품학적으로 허용되는 식품 보조 첨가제를 함유하는 건강기능식품.
5. 제 4항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.

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