KR20070107941A

KR20070107941A - 개선된 방출 양상을 갖는 인간성장호르몬 지속제어 방출생분해성 고분자의 약학적 조성물 및 미립구 제형

Info

Publication number: KR20070107941A
Application number: KR1020060040534A
Authority: KR
Inventors: 조영우; 곽현희; 이건일; 박용만; 양희창; 김병문; 이성희; 강수형
Original assignee: 동아제약주식회사
Priority date: 2006-05-04
Filing date: 2006-05-04
Publication date: 2007-11-08

Abstract

본 발명은 인간성장호르몬 함유 생분해성 고분자 미립구 제형에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 인간성장호르몬과 시클로덱스트린류 및 다가 금속 양이온 혼합 조성물에 담체로서 생분해성 폴리에스테르 고분자 그리고 계면활성제 및 유화제를 포함하는 생분해성 미립구 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 인간성장호르몬의 개선된 지속제어방출 양상을 가능하게 한다.

생분해성 미립구, 미립구 제형

Description

개선된 방출 양상을 갖는 인간성장호르몬 지속제어 방출 생분해성 고분자의 약학적 조성물 및 미립구 제형{An improved biodegradable microsphere composition suitable for the controlled release of human growth hormone and formulation thereof}

도 1은 본 발명의 실시예2 따라 제조된 미립구의 실험동물에서 방출양상을 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 실시예3 따라 제조된 미립구의 실험동물에서 방출양상을 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 실시예4 따라 제조된 미립구의 실험동물에서 방출양상을 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 실시예5 따라 제조된 미립구의 실험동물에서 방출양상을 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 개선된 방출 양상을 갖는 단백질 약물의 지속제어 방출 생분해성 미립구의 조성물 및 그 미립구 제형에 관한 것이다.

일반적으로 단백질 약물은 대다수가 경구 투여시 위의 산성 환경 하에서 활성 구조를 잃게 되거나 효소적 분해로 인하여 파괴되고 또한 위 또는 장 점막에서 흡수되는 비율도 상당히 낮다. 이로 인해 대부분의 단백질 약물은 비경구 투여, 즉 정맥주사, 피하주사, 근육주사 등의 방법으로 투여된다. 그런데 비경구 투여된 단백질 약물은 생체 내에서 짧은 반감기를 갖기 때문에 그러한 경로를 통해 투여한 후에도 반복적으로 계속 주사하여야 하며, 수개월 동안의 장기간 투여를 필요로 하는 경우가 많다.

단백질 약물을 포함하는 제형으로 생체 분해성 고분자를 이용한 지속성, 서방성 제형 연구가 활발히 진행되고 있다[Heller, J. et al., Controlled release of water-soluble macromolecules from bioerodible hydrogels, Biomaterials, 4, 262-266, 1983; Langer, R., New methods of drug delivery, Science, 249, 1527-1533, 1990; Langer, R., Chem. Eng. Commun., 6, 1-48, 1980; Langer, R. S. and Peppas, N. A., Biomaterials, 2, 201-214, 1981; Heller, J., CRC Crit. Rev. Ther. Drug Cattrier Syst., 1(1), 39-90, 1984; Holland, S.J. Tighe, B. J. and Gould, P. L., J. Controlled Release, 155-180, 1986)].

현재 단백질 약물에 있어 고분자 담체로 개발되어 사용되는 것으로 지방족 폴리에스테르는 이미 그 생체적합성이 인정되어 미국식품의약국(FDA)에 의해 승인을 받았으며, 약물전달용 담체 또는 수술용 봉합사 등의 용도로 널리 사용되고 있다. 지방족 폴리에스테르의 구체적인 예로는, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜산, 폴리-D-락트산-코-글리콜산, 폴리-L-락트산-코-글리콜산, 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산 (이하 'PLGA'라 함), 폴리-카프로락톤, 폴리-발레로락톤, 폴리-하이드록시 부티레이트 및 폴리-하이드록시 발러레이트 등이 포함된다[Peppas, L. B., Int. J. Pharm., 116, 1-9, 1995].

전술한 생분해성 고분자 담체는 주사 후 체내에서 서서히 분해가 일어나 인체에 무해한 저분자 물질로 변화된다. 따라서 일정기간 약물이 방출된 후 별도로 고분자 담체의 외과적 제거과정이 필요로 하지 않는 장점이 있어 이를 의약품에 적용하기 위한 연구가 널리 진행되고 있으며, 생분해성 고분자 담체를 이용한 약물방출 조절기술은 작은 분자량의 생리활성물질 등을 중심으로 연구된 것 들이다.

최근 고분자량의 펩타이드나 단백질 등이 새로운 치료약물로 개발됨에 따라, 이들 약물을 고분자 담체 내에 봉입시켜 지속적으로 방출시키려는 노력이 다양하게 시도되고 있으나, 전기한 지방족 폴리에스테르로 이루어진 미립구에 단백질 약물을 봉입한 제형의 경우 약물의 초기 과다 방출(initial burst effect)과 여러 요인의 영향으로 주사부위에서의 미립구 내에 약물 일부의 잔류 등이 발생하기 때문에 일 정 기간동안 약물의 방출을 일정한 속도로 조절하는 데에 큰 어려움이 있다.

예를 들면, 소의 혈청알부민, 라이소자임(lysozyme) 등의 모델 단백질 약물의 경우 초기에 다량의 약물이 방출된 후 최종 방출량이 50 % 전후이고[Crotts, G. and Park, T.G., J. Control. Release, 44, 123-134, 1997; Leonard, N.B., Michael, L. H., Lee, M.M. J. Pharm. Sci., 84, 707-712), 재조합 인간성장호르몬(recombinant human growth hormone)을 지방족 폴리에스테르를 담체로 이용하여 미립구에 봉입한 경우, 30~50 %의 단백질 약물이 초기에 과다 방출되며, 이후 40~60 % 정도의 양이 방출되지 못하고 미립구 내에 남아있다는 것이 보고되었다[ Yan, C., et al., J. Control. Release, 32, 231-241, 1994; Kim, H.K. and Park, T.G., Biotechnol. Bioeng., 65, 659-667, 1999].

이러한 약물의 초기 과다 방출은 미립구 표면 및 구멍에 응집 또는 흡착되어 있던 단백질 약물들이 초기에 빠른 확산에 의해 방출이 일어나기 때문이며, 단백질 약물이 미립구의 제조공정중 물과 유기용매에 의한 계면의 영향으로 변성 등에 의한 비가역적 응집이 생겨 불완전한 방출이 발생하게 되며 이러한 현상들은 단백질 약물의 지속성 전달에 큰 문제점으로 대두되고 있다. 이러한 계면의 영향으로 인한 단백질 약물의 변성을 방지하기 위해 계면활성제와 같은 안정화제의 사용을 시도하고 있고, 또 한편으로는 물을 배제한 유기용매만을 사용하여 미립구를 제조함으로써 단백질 변성의 원인을 제거하였다는 보고가 있다[Gombotz, W.R., Healy, M., Brown, L., 미합중국특허 제5019400호, 1991]

또한 단백질을 폴리에스테르 고분자 내로 포획하는 과정 중에 나타나는 변성과 비가역적 응집현상을 최소화하려는 연구가 활발히 이루어져 왔다. 이러한 연구의 일환으로 미립구 제조공정 중 계면에서의 약물의 안정성을 높이기 위해 수용성 용액에 안정화제가 첨가해 주는 경우가 많은데, 안정화제로 많이 사용되는 성분 중의 하나가 시클로덱스트린이다. 시클로덱스트린은 α-, β- 또는 γ- 화합물인 경우 각각 6, 7 또는 8 개의 글루코스 단위를 포함하는 매크로사이클 화합물로서, 다양한 화합물을 용해시키고 안정화시키는 성질을 가지고 있다. 이러한 성질들은 시클로덱스트린이 매크로사이클 안에 함유할 수 있는 화합물과 부분적으로 또는 전체적으로 착물을 형성하는 능력을 가지고 있는 것에 기인한다. 시클로덱스트린의 물에 대한 용해도를 높이기 위하여 시클로덱스트린 유도체에 대한 연구가 진행되어 왔는데, 이러한 시클로덱스트린 유도체 중에서 시클로덱스트린 에테르, 특히 히드록시알킬시클로덱스트린 화합물은 물에 대한 높은 용해도, 무해성, 조작의 용이성으로 인해 특별한 관심의 대상이 되고 있다. 히드록시알킬시클로덱스트린은 시클로덱스트린의 히드록실기의 일부 또는 전부가 히드록시알킬기로 에테르화된 화합물이다. 히드록시알킬시클로덱스트린 유도체들의 물에 대한 용해도가 우수해지면, 이는 그 자체가 물에 매우 적게 녹거나 녹지 않는 활성이 있는 약제를 물에 녹는 형태이면서 높은 안정성을 가지는 형태로 개발하는데 매우 유용하다.

피사 (Pitha)사 에서 출원한 미국특허 제 4,727,064 호는 시클로덱스트린 화 합물, 특히 히드록시프로필-β-시클로덱스트린과 약제학적으로 활성이 있는 약물의 비결정질 착물을 포함하는 약제학적 조성물을 개시하고 있다. 이 착물은 활성이 있는 약제의 용해도를 향상시키고, 이로 인해 인체에의 흡수 또한 향상시켰다. 또한 얀센사(Janssen Pharmaceutica)의 유럽특허 제 149,197 호는 물에 용해되기 어렵고 불안정한 의약품 화합물의 물에 대한 용해도와 안정성을 개선시키기 위한 목적으로 β-시클로덱스트린, 특히 히드록시프로필-β-시클로덱스트린을 부분적으로 에테르화 시키는 약제학적 제조 방법에 관한 것이다.

위에서 설명한 바와 같이 시클로덱스트린의 경우 약물의 용해도 개선이나 안정성 증가와 관련된 특허는 많이 있는데 반해 지속제어방출에 적용된 예, 특히 단백질 의약품의 지속제어방출에 이용된 예는 보고된 바가 없다.

또 다른 단백질 약물의 안정화와 방출조절을 위한 다른 방법으로 다가 금속 양이온 특히, 아연 2가 이온(Zn2+ )을 이용하여 안정화된 이량체로 만듦으로써, 미립담체에 봉입하는 과정과 봉입 이후의 상태에서 단백질의 안정성을 개선시킨 연구가 보고되어 있다.[참조: US 6,051,259. Cleland, J.L., et al., Pharm. Research, 14, 420-425, 1997; Cleland, J.L., et al., Adv. Drug Delivery, 28, 71-84, 1997]

하지만 아연 2가 이온을 사용하여 제조된 미립구는 첨부된 도 1에서 보는 바 와 같이 첨가되는 탄산 아연(ZnCO₃)에 의해 혈중 인성장호르몬 농도는 증가되었으나, 초기 과다방출 이후 약물농도를 높게 유지하는 것은 불충분하였다. 즉, 초기 과다 방출이 종료되는 시점인 1일 이후부터 최종일까지의 혈중 인성장호르몬의 AUC값(AUC_{1일-최종일}값)을 비교했을 때 AUC_{1일-최종일}값이 비첨가군 대비 287.9% 증가한 것으로 나타났지만 지속제어 방출제형의 효력에 중요한 인자인 C_1일의 값에는 변화가 없었다.(표1) 즉, 안정화 및 방출조절제를 사용하지 않은 대부분의 지속제어 방출제형에서 C_1일의 값은 최소유효혈중농도 보다 낮게 나타나기 때문에 약효 유지에 문제가 생기게 된다.

최근 본 발명자 등은 대한민국 제2001-42196호에서 인간성장호르몬, 폴리에틸렌글리콜 및 고분자 담체로서 폴리에스테르 고분자를 포함하는 생분해성 미립구 조성물을 제공함으로써, 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 미립구 내로부터 인간성장호르몬이 약 2주 동안 지속적으로 방출되는 제제를 개발한 바 있다.

인성장 호르몬과 같은 단백질 제제에 있어서, 또 다른 양상의 문제는 일반적으로 안정성이 낮아 잦은 반복 투여 및 혈중 농도의 변화에 따라 면역 반응을 일으킬 가능성이 타 제제에 비하여 높은 것이다. 그러한 경우 단백질이 신속하게 제거되어 치료효과를 유지하기 위해 더 많은 단백질을 투여해야 하는 악순환을 거듭하게 되므로 지속적으로 일정하게 약물의 혈중 농도를 유지하는 것이 중요하다.

이에 본 발명자들은 인성장 호르몬 제제의 초기 혈중농도를 조절하기 위하여 고분자 담체에 봉입되는 약물의 안정성을 유지하면서 초기 과다 방출을 억제시키고, C₁ _일의 값을 증가시켜 개선된 지속제어방출 양상을 갖는 미립구를 개발하고자 다년간 연구 노력한 결과, 시클로덱스트린류와 다가 금속 양이온을 함께 포함한 약학적 조성물을 제조하였고, 상기 조성물을 이용하여 미립구 형태의 제제를 개발하였으며, 상기 제조된 제제가 개선된 양상으로 약물을 일정농도로 지속적으로 방출됨을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인성장 호르몬 제제의 초기 혈중농도를 조절하여 개선된 지속제어방출 양상을 갖는 인간성장호르몬 함유 생분해성 고분자 미립구의 조성물 및 미립구 제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간성장호르몬을 시클로덱스트린류 및 다가 금속 양이온과 함께 생분해성 폴리에스테르계 고분자로 구성된 미립구 내에 봉입한 생분해성 고분자 미립구를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 사용될 수 있는 인간성장호르몬의 예로는 뇌하수체 유래 인간성장호르몬, 재조합 메치오닐 인간성장호르몬, 천연형과 동일한 재조합 인간성장호르몬을 들 수 있고, 바람직하게는 천연형과 동일한 재조합 인간성장호르몬을 들 수 있다. 미립구에서 인간성장호르몬의 함량은 용법용량, 단백질 특성에 따라 적절히 선택할 수 있으나, 미립구 중량 대비 통상 8.0~20.0 중량%의 양으로 첨가되며, 바람직하게는 11.0 ~ 16.0 중량 %의 양으로 첨가된다. 이때 그 함량이 상기 범위 미만이면 유효한 약물의 효과를 얻기 위해 1회 투여하는 인간성장호르몬 함유 미립구의 양이 지나치게 많아져 환자에게 부담을 주는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하게 되면 초기방출이 증가하는 문제점이 있어 바람직하지 못하다.

본 발명에 사용되는 시클로덱스트린류와 다가 금속 양이온은 단백질을 안정화시키고 방출을 조절하는 단백질 안정화제와 방출조절제로 작용한다.

시클로덱스트린류의 예로는 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린 및 그 유도체가 있으며, 그 중에서도 β-시클로덱스트린류, 특히 알킬기로 에테르화한 β-시클로덱스트린류가 사용된다. 존재하는 에테르 치환기는 바람직하게는 히드록시에틸 및/또는 히드록시프로필기이다. 본 발명의 생분해성 미립구 조성물에 사용되는 시클로덱스트린류의 사용량은 미립구 중량 대비 통상 0.5 ~ 10.0 중량 %, 바람직하게는 2 ~ 6 중량 %이다.

다가 금속 양이온의 예로는 ZnCO₃ (예를 들어 3Zn(OH)₂·2ZnCO₃), ZnO, Zn(OAc)₂, ZnSO4, ZnCl₂, Zn₃(C₆H₅O₇)₂, Mg(OH)₂, MgCO₃ (예를 들어, 4MgCO₃·Mg(OH)₂·5H₂O), Mg(OAc)₂, MgSO₄, MgCl₂, Mg₃(C₆H₅O₇)₂ 및 CaCO₃가 있으며, 바람직하게는 아연 2가이온을 사용한다. 본 발명의 생분해성 미립구 조성물에 사용되는 다가 금속 양이온의 사용량은 미립구 중량 대비 통상 0.1 ~ 15.0 중량 %, 바람직하게는 0.5 ~ 10 중량 %이다.

생분해성 폴리에스테르계 고분자는 미립구의 형태를 유지하면서 내부에 인간성장호르몬을 함유하고, 고분자가 서서히 분해되면서 내부의 인간성장호르몬을 방출해 주는 역할을 하며, 그 예로는 폴리-L-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-D-락트산-코-글리콜산, 폴리-L-락트산-코-글리콜산, 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산, 폴리-카프로락톤, 폴리-발레로락톤, 폴리-하이드록시 부티레이트 또는 폴리-하이드록시 발러레이트를 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 당해 분야에서 통상 사용되는 생분해성 폴리에스테르계 고분자이면 특별히 제한되지 아니한다. 바람직하게는 폴리-D-락트산-코-글리콜산, 폴리-L-락트산-코-글리콜산 또는 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산(PLGA)을 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 락트산과 글리콜산의 비율이 1:1이고, 평균분자량이 5000 ~ 15000 사이의 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산(PLGA)이다. 상기 생분해성 폴리에스테르계 고분자의 함량은 인간성장호르몬의 사용량에 반비례하여 정해지는 것으로, 미립구 중량 대비 통상 80.0 ∼ 92.0 중량 %, 바람직하게는 84.0 ∼ 89.0 중량 %의 양으로 사용된다.

본 발명의 약학적 조성물은 유기용매 및 수용액의 용매에 분산시켜 제조하는 2중 유화방법(W/O/W emulsion)에 의해 제조되며, 약물의 분산성을 안정하게 유지하기 위하여 유화제를 사용한다. 상기 유화제는 유기용매에 분산되는 친유성 유화제(lipophilic emulsifier)및 수용액에 분산되는 친수성 유화제(hydrophilic emulsifier)를 사용할 수 있다.

친유성 계면활성제의 예로는 스팬(Span) 20 ∼ 85 계열을 들 수 있으며, 그 사용량은 유기용액에서의 농도로 0.01 ∼ 3 중량 %, 보다 바람직하기로는 0.1 ∼ 1 중량 %를 사용한다. 구체적으로, 상기 계면활성제는 스팬 20, 25, 40, 60, 65, 80 및 85로 이루어진 군에서 선택하여 사용한다. 바람직하기로는 스팬 40을 사용한다.

친수성 계면활성제의 예로는 트윈, 트리톤, 브리즈, 폴리비닐프롤리돈, 폴리비닐알콜 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 폴리비닐알콜을 들 수 있다. 상기 폴리비닐알콜은 수 평균 분자량이 30,000 ∼ 70,000인 것을 사용하고, 그 사용량은 수용액에서의 농도로 0.1 ∼ 5 중량 %, 바람직하기로는 0.5 ∼ 2 중량 %로 사용한다. 이때 그 함량이 상기 범위 미만이면 분산성이 안정하게 유지되지 않아 균질한 에멀젼을 형성하지 못하는 문제점이 있어 바람직하지 못하다.

또한 본 발명은, 약물을 지속적으로 방출시킬 수 있는 약학적 조성물의 제조방법을 제공하며, 다음과 같은 단계를 포함한다.

a) 인간성장호르몬을 시클로덱스트린류가 용해된 완충용액에 첨가하여 용해시키는 단계 (단계 1);

b) 계면활성제가 용해된 유기용매에 생분해성 폴리에스테르계 고분자 담체를 용해하고 다가금속 양이온을 첨가하여 분산시키는 단계 (단계 2);

c) 상기 단계 1에서 얻어진 용액을 단계 2에서 얻어진 용액과 혼합하여 교반시켜 1차 에멀젼을 제조하는 단계 (단계 3); 및

d) 상기 단계 3의 1차 에멀젼을, 염과 유화제가 용해된 수용액에 분산시켜 2차 에멀젼을 제조하는 단계 (단계 4)를 거쳐 제조된다.

이하 상기 제조방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.

단계 1에서는 약물을 시클로덱스트린류가 포함된 완충용액에 용해시키는데, 바람직한 완충용액의 예로는 인산염 완충용액을 들 수 있다. 이 수용액에 약물을 120 ~ 150 mg/ml의 농도로 용해시킨다.

단계 2에서는 계면활성제가 용해된 유기용매에 고분자 담체를 용해시킨다. 상기 계면활성제 및 생분해성 고분자 담체는 상기에서 설명한 바와 같으며, 유기용 매는 상기 생분해성 고분자 담체에 대한 용해성을 지닌 것이면 특별히 제한되지 아니한다. 예를 들면, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤 또는 아세토나이트릴 등이 있으며, 바람직하기로는 상기 생분해성 고분자 담체에 대한 용매성과 증발을 통한 제거 용이성이 모두 뛰어난 휘발성 유기용매가 사용되며, 메틸렌클로라이드, 클로로포름이, 가장 바람직하게는 메틸렌클로라이드가 사용된다.

단계 3에서는 상기 단계 1에서 얻어진 약물 수용액을 단계 2에서 얻어진 분산용액에 첨가한 후 교반기를 이용하여 1차 에멀젼을 제조한다. 상기 1차 에멀젼은 외곽에 유기용매가 분산되어 있으며, 친유성 계면활성제로 이루어진 드롭렛 내에 약물이 용해된 수용액이 존재하게 된다.

단계 4에서는 상기 단계 3의 1차 에멀젼을, 삼투압을 조절하기 위한 염과 유화제가 분산된 과량의 수용액에 분산시켜 에멀젼을 제조하고 동결건조 과정을 거쳐 본 발명을 완성한다.

본 발명의 지속적 약물방출이 가능한 생분해성 미립구는 장기간 투여가 요구되는 호르몬제제, 기타 치료약물, 및 백신에 응용될 수 있다. 예를 들어, 미립구의 유효성분으로 사용되는 약물은 인간성장호르몬(human growth hormone), G- CSF(granulocyte colony-stimulating factor), GM-CSF(granulocyte -macrophage colony-stimulating factor), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 백신, 항체, 인슐린, 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), 글루카곤, 소마토스태틴(somatostation), 소마토트로핀(somatotropin), 소마토메딘(somatomedin), 부갑상선호르몬, 시상하부 분비물질, 갑상선호르몬, 프로락틴(prolactin), 엔돌핀, VEGF(vascular endothelial growth factor), 엔케팔린(enkephalin), 바소프레신(vasopressin), 신경성장인자(nerve growth factor), 비자연발생적 오피오이드(non-naturally occurring opioid), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 인터페론(interferons), 아스파라기나제(asparaginase), 알기나제(arginase), 트립신, 키모트립신(chymotrypsin) 및 펩신으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않고 장기 투여를 요구하는 모든 약물은 본 발명의 제조방법의 대상이 된다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명은 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> : 약물을 함유한 미립구 제형의 제조

인간성장호르몬(hGH, 동아제약, 대한민국)을 글리신(Glycine)을 포함한 인산 염 완충용액(phosphate buffer)에 120 ~150 mg/ml의 농도로 용해시킨다.

PLGA(800mg)를 계면활성제인 스팬 40 (Span 40)을 0.2 %(w/v) 농도로 미리 용해시킨 메틸렌클로라이드 (2.5 ml)에 용해시켜 유기용액을 제조하고 상기 인간성장호르몬 수용액 (1.2ml) 액을 첨가한 후 교반기를 이용하여 1차 유화액을 제조하였다. 이 때, PLGA는 락트산과 글리콜산의 비율이 1:1 의 분자량 5,000내외의 것을 사용하였다.

상기 1차 유화액을, 폴리비닐알콜(분자량 30,000 ∼ 70,000)을 1.0 %(w/v), 염화나트륨을 500 mM 농도로 용해시킨 300 ml 수용액에 주입하여 수 분간 균질기(homogenizer)를 사용하여 유화시켰다.

수 시간 동안 상온, 상압 하에서 교반하여 메틸렌클로라이드를 공기 중으로 서서히 증발시키면서 미립구를 경화시키고 이를 원심 분리 또는 여과하여 수거한 후, 증류수로 세척하고 동결건조하여 약물이 지속적으로 방출되는 미립구 제형을 제조하였다.

<실시예 2> : 탄산 아연(ZnCO ₃ )을 첨가한 미립구 제형의 제조

실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되 PLGA를 용해시킨 유기용액에 탄산 아연(ZnCO₃) 10 mg, 50mg, 100mg을 첨가하여 분산시키고, 이 분산액을 인간성장호르몬 수용액과 혼합하여 유화시킨 후 미립구를 제조하였다.

< 실시예 3> : 약물 수용액 중 첨가제 종류에 따른 미립구 제형의 제조

실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되 약물 수용액 제조시 각각 54mg/ml 만니톨, 10%(v/v)의 글리세롤, 25mg/ml 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPCD)을 첨가한 인산염 완충용액에 인간성장호르몬을 용해시켜 유기용액과 혼합하여 유화시킨 후 미립구를 제조하였다.

<실시예 4> : 탄산 아연(ZnCO ₃ )과 HPCD를 첨가한 미립구 제형의 제조

실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPCD)을 10 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml 농도로 용해시킨 인산염 완충용액을 사용하여 제조한 인간성장호르몬 수용액과 탄산 아연(ZnCO₃) 10mg을 첨가하여 분산시킨 유기용액을 혼합하여 유화시켜 미립구를 제조하였다. 또한 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPCD)의 농도가 25 mg/ml, 탄산 아연(ZnCO₃) 첨가량이 100mg인 미립구도 제조하였다.

<실시예 5> : 산화 아연 (ZnO) 과 HPCD를 첨가한 미립구 제형의 제조

실시예 4와 동일한 방법을 사용하되 유기용액에 탄산 아연(ZnCO₃) 및 산화 아연 (ZnO) 70 mg을 첨가하여 미립구를 제조하였다.

< 실험예 1> : 제조된 미립구 제형의 약물속도론적 평가

하기의 조건에서 인성장호르몬 함유 미립구의 생체 내(in vivo) 인성장호르몬 방출 특성 및 다양한 미립구 제형의 약물속도론적 평가하기 위한 연구를 쥐를 대상으로 수행하였다.

스프라그-돌리 쥐를 체중에 의해 무작위로 각각 5개의 군으로 나누고, 각각의 군에 하나 또는 그 이상의 인성장호르몬 함유 미립구 제형을 투여하였다. 즉, 실시예의 미립구를 인성장호르몬의 양을 기준으로 7.5mg을 취하여 1.5% CMC, 0.5% 트윈 20, 그리고 0.9% 염화나트륨을 함유한 수용성 현탁액에 125 mg/ml의 농도로 현탁하여 실시예 별로 3마리의 쥐에 약 1.1ml을 피하주사 하였다. 그 후 적당한 시간 간격으로 혈액을 채취하여 혈청 중의 인성장호르몬의 양을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

도 1 내지 도 4는 각 실시예 2 내지 실시예 5에 의해 제조된 미립구 투여 후 시간의 추이에 따른 쥐의 혈중 인성장호르몬의 농도변화를 나타낸 그래프이다.

약물의 지속제어방출 양상에 미치는 다가 금속 양이온의 효과를 확인하기 위해 본 발명의 실시예 2에 기술된 바와 같이 미립구를 제조하여 시간의 추이에 따른 쥐의 혈중 인성장호르몬의 농도변화를 관찰하였다. 일반적으로 미립구 제형은 체내 투여 후 미립구 표면 근처에 분포되어 있던 인성장호르몬이 확산 등에 의해 초기에 과량으로 방출된 후, 1일에서 4일 사이에 혈중 농도가 감소하는 경향을 나타낸다. 본 발명에 의한 미립구 제형의 경우 체내 투여 시험 결과, 첨가되는 탄산 아연(ZnCO₃)의 양에 비례하여 초기 방출 종료 이후 혈중 인성장호르몬 농도가 증가되었다.(도1) 이를 확인하기 위해 초기 과다 방출이 종료되는 시점인 1일 이후부터 최종일까지의 혈중 인성장호르몬의 AUC값(AUC_{1일-최종일}값)을 비교했을 때 AUC_{1일-최종일}값이 비첨가군 대비 287.9% 증가한 것으로 나타났다. 하지만 지속제어 방출제형의 효력에 중요한 인자인 C_1일의 값에는 변화가 없었다. (표1)

지속제어 방출제형의 효력에 중요한 인자인 C₁ _일의 값을 증가시키는 첨가제를 찾기 위해 본 발명의 실시예 3에 기술된 바와 같이 미립구를 제조하여 시간의 추이에 따른 쥐의 혈중 인성장호르몬의 농도변화를 관찰하였다. Mannitol이나 Glycerol에 비해 HPCD에 의한 상승효과가 우수하였다.(도2, 표2)

지속제어 방출제형의 효력에 중요한 인자인 C₁ _일의 값은 수용액상에 첨가되는 HPCD의 양에 비례하여 증가하였고, HPCD를 25 mg/ml이상 첨가한 경우 C₁ _일의 값이 유의적으로 증가하였으며, 특히 25 mg/ml 첨가한 경우 비첨가군에 비해 509.4% 증가함을 확인하였다. (도3, 표3)

결과적으로 인성장호르몬의 방출양상에 있어서 다가 금속 양이온만 단독으로 첨가한 경우에 비해 다가 금속 양이온과 시클로덱스트린을 병용 첨가한 경우 C₁ _일의 값 및 AUC_{1일-최종일}값이 유의적으로 증가하였으며 초기 방출패턴과 지속적인 방출패턴 모두에 있어서 개선된 제어 방출양상을 갖게 됨을 알 수 있다.(표4)

또한 다가 금속양이온의 다른 사용예로 산화아연(ZnO)과 HPCD와의 병용 첨가에 의한 상승작용을 확인하기 위해 본 발명의 실시예 5에 기술된 바와 같이 미립구를 제조하여 시간의 추이에 따른 쥐의 혈중 인성장호르몬의 농도변화를 관찰하였다. 산화 아연(ZnO)을 첨가하여 제조한 경우에도 탄산 아연(ZnCO₃)의 효과와 동등한 혈중 인성장 호르몬 농도의 상승 효과를 나타내었다. (도4, 표5)

이에 본 발명에 따라 제조된 미립구 제형은 시클로덱스트린류와 다가 금속 양이온의 병용 첨가에 따른 상승작용에 의해 초기 과다 방출 이후 혈중 인성장호르몬의 농도(C_1일) 및 유지 농도가 유의성 있게 증가하여 보다 개선된 지속제어방출 양상을 나타내었다.

상기와 같은 시클로덱스트린류와 다가 금속 양이온의 조건 변화에 따라 제조한 본 발명 인간성장호르몬 함유 미립구는 1주일 이상의 인간성장호르몬 지속성 제형에 적용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 단백질 안정화제 및 방출조절제인 시클로덱스트린류와 다가 금속 양이온을 적절한 양으로 약물에 첨가하여 생분해성 폴리에스테르계 고분자에 봉입하여 약물 함유 미립구를 제조함으로써, 약물을 안정화시키고 물/유기용매의 계면 상에서 단백질이 변성되는 것을 막아주며 개선된 약물 방출양상을 갖는 인간성장호르몬 지속제어방출 생분해성 미립구의 제조가 가능해진다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 시클로덱스트린과 다가 금속 양이온을 적절한 비율로 첨가하여 인간성장호르몬을 미립구에 봉입함으로써, C₁ _일의 값을 증가시킨 개선된 방출 양상으로 생체 내에서 미립구 내로부터 인간성장호르몬이 1주 이상 지속적으로 방출되게 하는 특징을 가진다.

Claims

인간성장호르몬, 시클로덱스트린류 및 다가 금속 양이온과 고분자 담체로서 생분해성 폴리에스테르 고분자를 포함하는 생분해성 미립구 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 미립구 조성물이:

a) 인간성장호르몬 및 시클로덱스트린류와 다가 금속 양이온이 계면활성제의 드롭렛 내에 분산되어 제1 에멀젼을 형성하고,

b) 상기 제1 에멀젼이 유화제의 드롭렛 내에 분산되어 있는 구조를 갖는 미립구인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 인간성장호르몬이 뇌하수체유래 인간성장호르몬, 재조합 메티오닐 인간성장호르몬 또는 천연형의 재조합 인간성장호르몬인 것을 특징으로 하는 생분해성 미립구 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 인간성장호르몬이 천연형이 재조합 인간성장호르몬인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 시클로덱스트린류가 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린 및 그 유도체, 그 중에서도 β-시클로덱스트린류, 특히 알킬기로 에테르화한 β-시클로덱스트린류로 구성된 그룹 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 알킬기로 에테르화한 β-시클로덱스트린류 중 에테르 치환기가 히드록시에틸 및/또는 히드록시프로필기인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 다가 금속 양이온이 ZnCO₃ (예를 들어 3Zn(OH)₂·2ZnCO₃), ZnO, Zn(OAc)₂, ZnSO4, ZnCl₂, Zn₃(C₆H₅O₇)₂, Mg(OH)₂, MgCO₃ (예를 들어, 4MgCO₃·Mg(OH)₂·5H₂O), Mg(OAc)₂, MgSO₄, MgCl₂, Mg₃(C₆H₅O₇)₂ 및 CaCO₃ 로 구성된 그룹 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 다가 금속 양이온이 아연 양이온인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 폴리에스테르 고분자가 폴리-L-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-D-락트산-코-글리콜산, 폴리-L-락트산-코-글리콜산, 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산, 폴리-카프로락톤, 폴리-발레로락톤, 폴리-하이드록시 부티레이트 및 폴리-하이드록시 발러레이트로 구성된 그룹 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 폴리에스테르 고분자가 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산의 평균분자량이 5,000 ∼ 15,000 범위 내인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 스팬(Span) 20, 25, 40, 60, 65, 80 및 85로 구성된 그룹 중에서 선택되는 계면활성제를 더 포함된 것을 특징으로 하는 생분해성 미립구 조성물.
제 1 항에 있어서, 트윈, 트리톤, 브리즈, 폴리비닐프롤리돈, 및 폴리비닐알콜로 구성된 그룹 중에서 선택되는 유화제를 더 포함된 것을 특징으로 하는 생분해성 미립구 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 미립구 조성물은 인간성장호르몬 8.0 ~ 20.0 중량 %, 생분해성 고분자 담체 80.0 ~ 92.0 중량 %, 시클로덱스트린류는 2.0 ~ 6.0 중량 %, 다가 금속 양이온은 0.1~15.0 중량 %로 구성되는 것을 특징으로 하는 생분해성 미립구 조성물.
a) 인간성장호르몬을 시클로덱스트린류가 용해된 완충용액에 첨가하여 용해시키는 단계 (단계 1);

b) 계면활성제가 용해된 유기용매에 생분해성 폴리에스테르계 고분자 담체를 용해하고 다가금속 양이온을 첨가하여 분산시키는 단계 (단계 2);

c) 상기 단계 1에서 얻어진 용액을 단계 2에서 얻어진 용액과 혼합하여 교반시켜 1차 에멀젼을 제조하는 단계 (단계 3); 및

d) 상기 단계 3의 1차 에멀젼을, 염과 유화제가 용해된 수용액에 분산시켜 2 차 에멀젼을 제조하는 단계 (단계 4)의 이중유화 단계를 포함하는 생분해성 미립구 조성물의 제조방법.
제 15 항에 있어서, 상기 유기용매가 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤 및 아세토나이트릴로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조방법.
제 16 항에 있어서, 상기 용매가 메틸렌클로라이드인 것을 특징으로 하는 방법.