KR20070101341A - 백신 전달 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20070101341A
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윌리엄 쥐 터넬
바실 피. 바실리브
크리스틴 엠. 데피프
홍 엔엠엔 리
자자 디. 고머라쉬빌리
라마즈 캇사라바
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메디바스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 인간 및 기타 포유류에서 다양한 병원성 유기체 및 종양 세포에 대한 면역 반응을 촉진하기 위한, 폴리에스테르 아미드 (PEA), 폴리에스테르 우레탄 (PEUR), 및 폴리에스테르 우레아 (PEU) 중합체를 기재로 하는 합성 백신 전달 조성물을 제공한다. 본 백신 전달 조성물은 유기체 또는 종양 세포 단백질로부터 유래되는 클래스 I 또는 클래스 II 항원 펩티드를 포함하는 중합체 입자 또는 분자의 액체 분산물로서 제형화되는데, 이는 포유류의 항원 제시 세포에 의해 흡수되어 포유류에서 면역 반응을 유도한다. 본 발명의 조성물에 있어서 병원성 유기체 또는 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 방법도 포함된다.
폴리에스테르 아미드, 폴리에스테르 우레탄, 폴리에스테르 우레아, 백신 전달 조성물, 면역 반응, 항원 제시 세포, 병원성 유기체, 종양 세포

Description

백신 전달 조성물 및 사용 방법{VACCINE DELIVERY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
관련 출원
본 출원은 §35 U.S.C. 119(e) 하에 2005년 2월 1일자로 출원된 미국 가출원 제60/649,289호; 2005년 6월 8일자로 출원된 제60/689,003호; 2005년 12월 2일자로 출원된 제60/742,188호; 2005년 12월 7일자로 출원된 제60/748,486호; 2005년 9월 22일자로 출원된 제60/719,950호; 2005년 6월 3일자로 출원된 제60/687,570호; 2006년 1월 13일자로 출원된 제60/759,179호를 우선권으로 주장한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 면역원성 조성물, 특히 MHC 대립 형질에 결합하는 백신 전달 조성물에 관한 것이다.
백신 개발 및 투여가 유의하게 진보되었지만, 백신 제제의 효능 및 안전성을 증강시키는 대안적인 접근법은 여전히 조사 중이다. 서브-유닛 백신, 예를 들어 재조합 단백질, 합성 펩티드, 및 다당류-펩티드 콘쥬게이트가 신규한 백신 후보로서 나타나고 있다. 그러나, 약화된 병원체 및 불활성화된 전 유기체로 구성된 전통적인 백신은 아쥬반트 (adjuvant) - 이들 서브유닛 백신에서 활성이 결여 - 로서작용 할 수 있는 박테리아 성분 및 불순물을 포함한다. 따라서, 독립형(stand-alone) 제형으로서 전달되는 고도로 정제된 서브-유닛 백신의 효능은 강력한 아쥬반트의 첨가를 필요로 한다.
현재, 알루미늄 화합물이 미국에서 인간 백신에서의 사용에 있어서 FDA가 승인한 유일한 아쥬반트로 남아있다. 알루미늄 화합물은, 그의 우수한 안전성 상의 기록에도 불구하고, 상대적으로 약한 아쥬반트이며, 흔히 방어 면역과 결부된 항체 수준의 유도를 위하여 다회 투약 섭생법을 필요로 한다. 따라서, 알루미늄 화합물은 서브-유닛 백신에 대한 방어 면역 반응의 유도에 이상적인 아쥬반트는 아닐 수도 있다. 다수의 후보 아쥬반트가 현재 조사 중이지만, 이들은 인간에 있어서의 독성 및 항원의 혼입을 위한 정교한 기술에 대한 요건을 비롯한 다수의 단점으로 고민하고 있다.
백신에서의 펩티드 항원의 사용은 포유류 및 기타 동물에서의 면역계, 특히 주요 조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC)의 작동에 대한 지식에 기초하고 있다. MHC 분자는 대부분의 체세포에 의해 합성 및 표시된다. MHC는 특수 유형의 T 세포 (예를 들어, 세포 독성 T 세포)와 조화롭게 작용하여 "비자기 (nonself)" 또는 외래 바이러스 단백질을 신체에서 제거한다. T-세포 상의 항원 수용체는 에피토프를 인식하는데, 이는 에피토프의 측면에 위치하는 홈 (groove)을 구성하는 알파 나선의 부분들 및 결합 펩티드의 모자이크이다. 외래 단백질의 절단에 의한 펩티드 단편의 생성에 이어, MHC 분자에 의한 펩티드 단편의 제시에 의해 항원-제한성 (antigen-restricted) 세포 독성 T 세포가 "비자기" 또는 외래 바이러스 단백질의 발현에 대하여 세포를 조사하는 것이 허용된다. 기능성 T-세포는 T-세포 특이성인 결합 펩티드 항원을 포함하는 MHC 분자의 인식시 세포 독성 면역 반응을 나타낼 것이다.
외인성 항원은 외부 체세포 유래의 것이다. 그 예는 박테리아, 자유 바이러스, 효모, 원생 동물, 및 독소를 포함한다. 이러한 외인성 항원은 식작용 (phagocytosis)을 통하여 항원 제시 세포 또는 APC (대식세포, 수지상 세포 및 B-림프구)에 들어간다. 미생물은 삼켜지고 단백질 항원은 프로테아제에 의해 일련의 펩티드로 분해된다. 이러한 펩티드는 결국 MHC-II 분자의 홈에 결합되고 APC의 표면으로 수송된다. 그러면 T4-림프구는 T-세포 수용체 (T-cell receptor, TCR) 및 CD4 분자에 의해 펩티드/MHC-II 복합체를 인식할 수 있다. 클래스 II MHC에 있어서 APC에 의해 제시되는 펩티드는 길이가 약 10 내지 약 30개의 아미노산, 예를 들어 약 12 내지 약 24개의 아미노산이다 (문헌[Marsh, S. G. E. et al. (2000) The HLA Facts Book, Academic Press, p. 58-59]). 활성화된 T4-림프구의 이펙터 (effector) 기능은 B-세포에 의한 항체의 생성 및 대식세포의 살균 활성을 포함하는데, 이는 세포외 또는 식작용화된 미생물이 파괴되는 주요 기작이다.
바이러스, 세포내 박테리아 및 암에 대한 신체의 주요 방어 중 하나는 세포 독성 T-림프구 또는 CTL에 의한 내인성 감염 세포 및 종양 세포의 파괴이다. 이러한 CTL은 세포 매개 면역 동안 T-8 림프구로부터 유래되는 이펙터 세포이다. 그러나, CTL이 되기 위해서는, 나이브 (naive) T8-림프구는 APC에 의해 생성되는 사이토카인에 의해 활성화되게 되어야 한다. APC와 나이브 T8-림프구 사이의 이러한 상 호작용은 주로 림프절, 림프 노듈 (nodule), 및 비장에서 일어난다. 이 과정은 수지상 세포 및 대식세포의 삼킴과, 감염된 세포, 종양 세포, 및 나머지의 사멸된 감염 세포와 종양 세포의 분해를 포함한다. 이러한 방식으로 질환에 걸린 세포 유래의 내인성 항원은 APC에 들어갈 수 있고, 여기서 프로테아제 및 펩티다아제는 단백질을 길이가 약 8 내지 약 10개, 가능하게는 약 8 내지 약 11개, 또는 약 8 내지 약 12개인 아미노산의 일련의 펩티드로 절단한다. 펩티드가 결합되고 APC의 표면 상에 나타나는 MHC 클래스 I 분자는 이제 상보성 형상을 갖는 CD8 분자 및 TCR을 보유하는 나이브 T8-림프구에 의해 인식될 수 있다. TCR에 의한 이러한 펩티드 에피토프의 인식은 세포 매개 면역 기능에 있어서 나이브 T8-림프구를 활성화하는 제1 신호로서의 역할을 한다. 단일 세포는 표면에 에피토프가 결합된 MHC-1 분자를 최대 250,000개 가질 수도 있다.
이와 같이, 불활성화된 병원체보다는 오히려 펩티드 항원이 이용되는 새롭고도 보다 우수한 백신 전달 조성물과, MHC 클래스 I 및 클래스 II 대립 형질에 의해 확인되는 병원성 유기체에 대하여 개체에 있어서 면역 반응을 유도하기 위한 그의 사용 방법에 대한 당 기술 분야에서의 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 중합체 사슬, 예를 들어 소정 폴리 (에스테르 아미드) (PEA), 폴리 (에스테르 우레탄) (PEUR), 및 폴리 (에스테르 우레아) (PEU) 중합체 중 아미노산을 포함하는 생분해성 중합체를 사용하여 완전히 합성인, 따라서 제조가 용이한, 인간 및 기타 포유류에서 다양한 병원성 유기체에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 백신 전달 조성물을 제형화할 수 있다는 전제를 기초로 한다.
따라서, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 생분해성 중합체 분자 내에 분산된 5 내지 약 30개의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 펩티드 항원 또는 단량체 당 적어도 하나의 아미노산외 (non-amino acid) 부분에 콘쥬게이션된 적어도 하나의 유형의 아미노산을 포함하는 입자를 유효량 함유하는 백신 전달 조성물을 제공한다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 5 내지 약 30개의 아미노산을 포함하는 유효량의 적어도 하나의 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 펩티드 항원에 콘쥬게이션된 중합체 입자 또는 분자와, 하기 화학식 I:
Figure 112007060428012-PCT00001
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며; R1은 독립적으로 α,ω-비스(4-카르복시페녹시)-(C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산, (C2-C20) 알킬렌, 또는 (C2-C20) 알케닐렌의 잔기로부터 선택되며; 개개의 n 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시, (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기, 하기 화학식 II:
Figure 112007060428012-PCT00002
의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 (bicyclic) 단편, 및 그의 조합, (C2-C20) 알킬렌, 및 (C2-C20) 알케닐렌으로 구성된 군으로부터 선택됨 -
로 설명되는 구조식을 갖는 생분해성 PEA; 또는
하기 화학식 III:
Figure 112007060428012-PCT00003
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며, m은 약 0.1 내지 0.9 범위이며, p는 약 0.9 내지 0.1 범위이며; R1은 독립적으로 α,ω-비스(4-카르복시페녹시)-(C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산, (C2-C20) 알킬렌, 또는 (C2-C20) 알케닐렌 잔기로부터 선택되며, 각각의 R2는 독립적으로 수소, (C1-C12) 알킬 또는 (C6-C10) 아릴 또는 보호기이며; 개개의 m 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시, (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택됨 -
로 설명되는 화학식을 갖는 PEA 중합체의 액체 분산물 형태로 투여하기 위한 것으로 제형화된 백신 전달 조성물을 제공한다.
다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 IV:
Figure 112007060428012-PCT00004
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며; R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기, 화학식 II의 1,4:3,6-디언 히드로헥시톨의 비시클릭 단편, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로부터 선택됨 -
로 설명되는 화학식을 갖는 PEUR 중합체; 또는
하기 화학식 V:
Figure 112007060428012-PCT00005
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며, m은 약 0.1 내지 약 0.9 범위이며, p는 약 0.9 내지 약 0.1 범위이며; R2는 독립적으로 수소, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 또는 보호기로부터 선택되며; 개개의 m 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기 및 화학식 II의 1,4:3,6- 디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며; R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 유효량의 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기, 및 그의 조합으로부터 선택됨 -
로 설명되는 화학 구조를 갖는 PEUR 중합체이다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 VI:
Figure 112007060428012-PCT00006
- 여기서, n은 약 10 내지 약 150이며; 개개의 n 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기; 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로부터 선택됨 -
로 설명되는 화학식을 갖는 생분해성 PEU 중합체; 또는
하기 화학식 VII:
Figure 112007060428012-PCT00007
- 여기서, m은 약 0.1 내지 약 1.0이며; p는 약 0.9 내지 약 0.1이며; n은 약 10 내지 약 150이며; 각각의 R2는 독립적으로 수소, (C1-C12) 알킬 또는 (C6-C10) 아릴이며; 개개의 m 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로부터 선택되며; 각각의 R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기; 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로부터 선택됨 -
로 설명되는 화학식을 갖는 PEU이다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 화학식 I 및 III-VII로 설명되며 유효량의 클래스 I 또는 클래스 II 펩티드 항원에 콘쥬게이션된 중합체의 입자 또는 분자의 액체 분산물 형태의 본 발명의 백신 전달 조성물을 포유류에게 투여하는 단계에 의해 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 조성물은 포유류에서 면역 반응을 유도하도록 포유류의 항원 제시 세포에 의해 흡수된다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 화학식 I 및 III-VII로 설명되며 유효량의 클래스 I 또는 클래스 II 펩티드 항원에 콘쥬게이션된 중합체의 입자 또는 분자의 액체 분산물 형태의 본 발명의 백신 전달 조성물을 포유류에게 투여하는 단계에 의해 포유류에게 백신을 전달하는 방법을 제공한다.
도 1은 본원에 설명된 이중 및 삼중 에멀젼 절차에 의해 펩티드 항원과 같은 다양한 유형의 활성제가 내부에 분산된 PEA, PEUR 또는 PEU의 입자의 생성법을 도시하는 개략도이다.
도 2는, 본원에 설명된 바와 같이, 분산된 펩티드 항원을 포함하는 본 발명의 미셸 (micelles)을 도시하는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 백신의 제조 및 본 발명의 백신에 대한 시험관 내 인간 T-세포 반응의 시험 방법의 흐름도이다.
도 4A-B는 중합체-펩티드 콘쥬게이트에 노출된 수지상 세포에 반응하는 T-세포 활성화를 도시하는 그래프이다. 도 4A는 96시간에 걸친 T-세포 증식률을 도시하고 있으며, 여기서, PEA-펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 또는 PEA 단독에 비하여 상당한 증식을 자극하였다. 도 4B는 96시간에 걸친 T-세포 IL-2 분비량을 도시하고 있으며, 여기서, PEA-펩티드 (화학식 III, 실시예 B1)는 펩티드 또는 PEA 단독과 비교하여 상당한 IL-2 분비를 자극하였다.
본 발명은 단량체 당 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 생분해성 중합체를 사용하여, 다량으로, 안전하게 (약화된 바이러스를 전혀 포함하지 않음) 그리고 안정하게 재현가능하고 수송 및 보관용으로 동결 건조될 수 있는, 피하 또는 근육내 주사 또는 점막 투여용의 합성 백신 전달 조성물을 생성할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 사용되는 중합체의 구조적 특성으로 인하여, 본 백신 전달 조성물은 항원의 큰 카피수 (copy number) 및 국소적 밀도를 제공한다.
상이한 특성을 갖는 중합체가 백신 전달 조성물로 제형화될 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 중합체는 APC에 의해 흡수되고 생체 내에서 중합체 저장체가 생분해될 때 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 대립 형질에 의해 제시될 항원-중합체 단편 및 펩티드 항원을 방출하는, 서방형 (time release) 중합체 저장체로서 작용한다. 다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 펩티드 항원의 APC 내로의 담체로서 작용하며, 펩티드 항원은 세포 내에서의 제시를 위하여 방출된다. 중합체는 실제로 중합체-항원 콘쥬게이트의 식작용의 유도에 의해 APC를 자극할 수 있다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 포유류의 항원 제시 세포에 의해 흡수되어 포유류에서 면역 반응을 유도하는 유효량의 본 발명의 백신 전달 조성물을 포유류에게 투여하는 단계에 의해 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
인간의 치료 외에도, 본 발명의 백신 전달 조성물은 다양한 포유류 환자, 예를 들어, 애완 동물 (예를 들어, 고양이, 개, 토끼 및 족제비), 농장 동물 (예를 들어, 돼지, 말, 노새, 젖소 및 육우) 및 경주마의 수의학적 치료에서 사용하기 위한 것이기도 하다.
직접적으로 전달되거나 생체 내 중합체 저장체로부터 방출되는 중합체 입자 또는 중합체 분자는 항원 제시 세포 (APC)에 의해 손쉽게 흡수되는 크기의 것이며, 펩티드 항원과, 선택적으로 아쥬반트 - 이는 중합체 입자 내에 분산되거나 중합체 분자 상의 작용기에 콘쥬게이션되어 있음 - 를 포함한다. APC는 MHC 복합체를 통하여 펩티드 항원을 표시하며, T-세포, 예를 들어 세포 독성 T-세포에 의해 인식되어 내인성 면역 반응을 생성 및 촉진하며, 이는 매칭 또는 유사 항원을 지니는 병원성 세포를 파괴시킨다. 본 발명의 백신 전달 조성물에서 사용되는 중합체는 중합체의 저장체, 분자 및 입자의 생분해 속도를 맞추도록 설계되어 선택된 기간에 걸쳐 펩티드 항원이 항원 제시 세포와 계속적으로 접촉되게 할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로, 중합체 저장체는 약 24시간, 약 7일, 약 30일, 또는 약 90 또는 그 이상으로부터 선택되는 시간에 걸쳐 분해된다. 적합한 면역 반응을 얻기 위하여 백신을 반복적으로 주사할 필요가 없는 이식가능한 백신 전달 조성물의 제공에는 보다 긴 시간 범위가 특히 적합하다.
본 발명에서는 점막에 의해 전해지는 병원체를 비롯한 매우 다양한 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 생분해성 중합체-매개된 전달 기술이 이용된다. 본 조성물은 항원이 그것만으로 약한 면역원성을 가질 경우에도 강력한 면역 반응을 낳는다. 본원에 설명된 방법 및 백신 전달 조성물의 개개의 성분이 공지되어 있지만, 그러한 조합이 항원의 효율을 성분들이 개별적으로 사용될 때 달성되는 수준을 넘어서게 증강시키고, 또한 백신 전달 조성물의 제조에 사용되는 중합체가 몇몇 경우 부가적인 아쥬반트에 대한 필요성을 없앤다는 것은 기대되지 않은 놀라운 것이었다.
본 발명은 임의의 상기 병원체에 대한 면역 반응의 제공에 광범위하게 적용가능하지만, 본 발명은 본원에서 인플루엔자 바이러스 및 HIV를 참고로 하여 예시된다.
본 발명의 방법은 세포 매개 면역 및/또는 체액성 항체 응답을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 항체, T-헬퍼 (helper) 세포 활성 및 T-세포의 세포 독성 활성을 유도할 수도 있는 바이러스, 박테리아, 진균류 및 기생충 병원체로부터 유래되는 항원을 비롯한, 세포성 및/또는 체액성 면역 반응이 요망되는 임의의 항원에서 유용하다. 이와 같이, 본원에서 사용되는 "면역 반응"은 사용되는 펩티드 항원에 특이적인 항체, T-헬퍼 세포 활성 또는 T-세포의 세포 독성 활성의 생성을 의미한다. 이러한 항원은 인간 및 동물 병원체에 의해 코딩되는 것을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니며, 구조 또는 비-구조 (non-structural) 단백질, 다당류-펩티드 콘쥬게이트 또는 DNA 중 어느 하나에 상응할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 제1형 및 제2형 단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus, HSV)로부터 유래되는 단백질을 비롯한 헤르페스 바이러스 과 유래의 매우 다양한 단백질, 예를 들어 HSV-I 및 HSV-2 당단백질 gB, gD 및 gH; 바리셀라 조스터 바이러스 (varicella zoster virus, VZV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus) (EBV) 및 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) - CMV gB 및 gH를 포함함 - 로부터 유래되는 항원; 및 HHV6 및 HHV7과 같은 기타 인간 헤르페스 바이러스로부터 유래되는 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 데에 유용하다 (예를 들어, 사이토메갈로바이러스의 단백질 코딩 내용의 개관에 대해서는 문헌[Chee et al, Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed., Springer- Verlag 1990) pp. 125- 169]; 다양한 HSV-1 코딩 단백질의 논의에 대해서는 문헌[McGeoch et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:1531-1574]; HSV-I 및 HSV-2의 gB 및 gD 단백질과 그를 코딩하는 유전자의 논의에 대해서는 미국 특허 제5,171,568호; EBV 게놈에서의 단백질 코딩 서열의 확인에 대해서는 문헌[Baer et al., Nature (1984) 310:207-211]; 및 VZV의 개관에 대해서는 문헌[Davison and Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816]을 참조).
A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 델타형 간염 바이러스 (HDV), E형 간염 바이러스 (HEV) 및 G형 간염 바이러스 (HGV)를 비롯한 간염 바이러스 과 유래의 항원도 본원에 설명된 기술에서 편리하게 사용될 수 있다. 예로서, 서열을 얻는 방법에서와 같이, HCV의 바이러스 게놈 서열이 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 공보 제WO 89/04669호; 동 제WO 90/11089호; 및 동 제WO 90/14436호를 참조한다. HCV 게놈은 E1 (E로도 공지됨) 및 E2 (E2/NSI로도 공지됨)와 N-말단 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 단백질("코어"로 칭해짐)을 비롯한 여러 바이러스 단백질을 코딩한다 (E1 및 E2를 비롯한 HCV 단백질의 논의에 대해서는 문헌[Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388] 참조). 각각의 상기 단백질과, 그의 항원성 단편이 본 발명에서 유용하다. 이와 유사하게, HDV 유래의 δ 항원의 서열이 공지되어 있으며 (예를 들어, 미국 특허 제5,378,814호 참조) 이 항원도 본 발명의 방법에서 편리하게 사용될 수 있다. 부가적으로, HBV로부터 유래되는 항원, 예를 들어 코어 항원, 표면 항원, sAg와, 프리서피스 서열 (presurface sequence), pre-S1 및 pre-S2 (이전에는 pre-S라 함), 및 상기의 조합, 예를 들어 sAg/pre-S1, sAg/pre-S2, sAg/pre-S1/pre-S2, 및 pre-S1/pre-S2가 본원에서 유용하다. 예를 들어, HBV 구조의 논의에 대해서 문헌["HBV Vaccines-from the laboratory to license: a case study" in Mackett, M. and Williamson, J. D., Human Vaccines and Vaccination, pp. 159-176]; 그리고 본원에 전체 내용이 참고로 포함된 미국 특허 제4,722,840호, 동 제5,098,704호, 동 제5,324,513호; 문헌[Beames et al., J. Virol. (1995) 69:6833-6838, Birnbaum et al., J. Virol. (1990) 64:3319-3330]; 및 문헌[Zhou et al., J. Virol. (1991) 65:5457-5464]을 참조한다.
다른 바이러스로부터 유래되는 항원, 예를 들어 한정됨이 없이, 피코르나바이러스과 (Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오바이러스(Poliovirus) 등); 칼리시바이러스과 (Caliciviridae); 토가바이러스과 (Togaviridae) (예를 들어, 풍진 바이러스 (rubella virus), 뎅기열 바이러스 (dengue virus) 등); 플라비바이러스과 (Flaviviridae); 코로나바이러스과 (Coronaviridae); 레오바이러스과 (Reoviridae); 비르나바이러스과 (Birnaviridae); 라보도바이러스과 (Rhabodoviridae) (예를 들어, 광견병 바이러스 (rabies virus) 등); 필로바이러스과 (Filoviridae); 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae) (예를 들어, 이하선염 바이러스 (mumps virus), 홍역 바이러스 (measles virus), 호흡기 세포 융합 바이러스 (respiratory syncytial virus) 등); 오르토믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae) (예를 들어, A형, B형, 및 C형 인플루엔자 바이러스 (influenza virus) 등); 분야바이러스과 (Bunyaviddae); 아레나바이러스과 (Arenaviridae); 레트로바이러스과 (Retroviradae) (예를 들어, HTLV-I; HTLV-II; HIV-I (HTLV-III LAV, ARV, hTLR 등으로도 공지됨) - HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN 단리체 유래의 항원들을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아님 - ); HIV-1CM235, HIV-1US4; HIV-2; 특히 원숭이 면역결핍 바이러스 (simian immunodeficiency virus, SIV)의 구성원 유래의 단백질도 특허 청구되는 방법에서 유용하다. 부가적으로, g항원은 인간 파필로마바이러스 (human papillomavirus, HPV) 및 진드기 매개 뇌염 바이러스 (tick-borne encephalitis viruses)로부터 또한 유래될 수 있다. 예를 들어 상기 및 기타 바이러스의 설명에 대해서는 문헌[Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988)]; 문헌[Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)]을 참조한다.
더욱 특히는, HIV의 다양한 유전적 아형의 구성원을 비롯한 임의의 상기 HIV 단리체 유래의 엔벨로프 (envelope) 단백질이 공지되고 보고되어 있으며 (예를 들어, 다양한 HIV 단리체의 엔벨로프 서열들의 비교에 대해서는 문헌[Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.Mex. (1992)]; 문헌[Myers et al., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, N.Mex.: Los Alamos National Laboratory]; 및 문헌[Modrow et al., J. Virol. (1987) 61:570-578]을 참조함), 임의의 상기 단리체로부터 유래되는 항원은 본 발명의 방법에서 유용하다. 구체적으로는, gp120의 V3 루프로부터 유래되며 서열 RIQRGPGRAFVTIGK (서열 번호 1)를 갖는 합성 펩티드 R15K (문헌[Nehete et al. Antiviral Res. (2002) 56:233-251])가 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용하다. 또한, 본 발명은 임의의 다양한 HIV 단리체로부터 유래되는 다른 면역원성 단백질 - 임의의 다양한 엔벨로프 단백질, 예를 들어 gp160 및 gp41, gag 항원, 예를 들어 p24gag 및 p55gag과, pol 영역으로부터 유래되는 단백질을 포함함 - 에 동일하게 적용가능하다. 또한, HIV 단백질 유래의 다양한 에피토프가 이용되는 중합체-펩티드 콘쥬게이트의 다중-에피토프 칵테일 (cocktail)이 구상될 수 있다. 예를 들어, gp120 및 gp41 유래의 하기의 6개의 보존 펩티드가 붉은털 원숭이/SHIV 모델에서 바이러스 로드 (load)를 감소시키고 전염을 방지하는 것으로 밝혀졌다: SVITQACSKVSFE (S13E) (서열 번호 2), GTGPCTNVSTVQC (G13C) (서열 번호 3), LWDQSLKPCVKLT (L13T) (서열 번호 4), VYYGVPVWKEA (V11A) (서열 번호 5), YLRDQQLLGIWG (V12G) (서열 번호 6), 및 FLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARQ (F25Q) (서열 번호 7) (문헌[Nehete et al. Vaccine (2001) 20:813- ]). 본 발명의 조성물 및 방법에 있어서 본 출원인에 의해 시험된 항원의 아미노산 서열은 IFPGKRTIVAGQRGR (서열 번호 8)이며, 여기서, 모든 아미노산은 천연 L-아미노산이다.
상기에 설명된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스는 본 발명에 특히 유용한 바이러스의 다른 예이다. 구체적으로는, 인플루엔자 A의 엔벨로프 당단백질 HA 및 NA는 핵 단백질에서 그러하듯이 면역 반응의 생성에 있어서 특히 흥미로운 것이다. 인플루엔자 A의 다수의 HA 아형이 동정되었다 (문헌[Kawaoka et al., Virology (1990) 12:759-767]; 문헌[Webster et al., "Antigenic variation among type A influenza viruses," p. 127-168. In: P. Palese and D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer- Verlag, New York]). 이와 같이, 임의의 상기 단리체로부터 유래되는 단백질이 본원에 설명된 면역화 기술에서 또한 사용될 수 있다. 특히, HA의 보존된 13개의 아미노산의 서열이 본 발명의 백신 전달 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 제형에서 사용되는 H3 주 (strain)에서, 이 아미노산 서열은 PRYVKQNTLKLAT (서열 번호 9)이며, H5 주에서는 이것은 주로 PKYVKSNRLVLAT (서열 번호 10)이다.
본원에 설명된 방법은 다수의 박테리아 항원, 예를 들어 디프테리아, 콜레라, 결핵, 파상풍, 백일해, 수막염을 야기하는 유기체, 및 기타 병원성 유기체 - 한정됨이 없이, 메닝고코커스 (Meningococcus) A, B 및 C, 헤모필루스 (Hemophilus) 인플루엔자 타입 B (HIB), 및 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)를 포함함 - 로부터 유래되는 것에서도 유용하다. 기생충 항원의 예는 말라리아 및 라임병 (Lyme disease)을 야기하는 유기체로부터 유래되는 것을 포함한다.
또한, 본원에 설명된 방법은 다양한 악성 암의 치료 수단을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 이용하여 당해 암에 특이적인 특정 단백질, 예를 들어 활성화된 발암 유전자, 태아 항원, 또는 활성화 마커에 대한 체액성 및 세포 매개 면역 반응 둘 모두를 개시할 수 있다. 이러한 종양 항원은 특히 임의의 다양한 MAGE (흑색종 관련 항원 (melanoma associated antigen) E) - MAGE 1, 2, 3, 4 등을 포함함 - ( 문헌[oon, T. Scientific American (March 1993):82-89)]; 임의의 다양한 티로시나아제 (tyrosinase); MART 1 (T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원), 돌연변이 ras; 돌연변이 p53; p97 흑색종 항원; CEA (carcinoembryonic antigen)를 포함한다. 본 발명의 조성물에서 유용한 부가적인 흑색종 펩티드 항원 및 조성물은 하기를 포함한다:
명칭 항원 서열 단백질
Mart1-27 AAGIGILTV (서열 번호 11) MART1
Gp100-209* ITDQVPFSV (서열 번호 12) 멜라노사이트 계통-특이성 항원 GP100
Gp100-154 KTWGQYWQV (서열 번호 13) 멜라노사이트 계통-특이성 항원 GP100
Gp100-280 YLEPGPVTA (서열 번호 14) 멜라노사이트 계통-특이성 항원 GP100
*GP100은 흑색종 관련 ME20 항원이라고도 함.
본 발명을 이용하여 매우 다양한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것은 자명하다.
본 발명의 백신 전달 조성물 중 중합체 내에 분산된 펩티드 항원은 임의의 적합한 길이를 가질 수 있지만, 펩티드-제한성 T-림프구에 의해 인식되는 8 내지 약 30개의 아미노산의 펩티드 항원 절편이 혼입될 수도 있다. 구체적으로는, 상응하는 클래스 I 펩티드-제한성 세포 독성 T-세포에 의해 인식되는 펩티드 항원 절편은 8 내지 약 12개의 아미노산, 예를 들어 9 내지 약 11개의 아미노산을 포함하며, 상응하는 클래스 II 펩티드-제한성 T-헬퍼 세포에 의해 인식되는 펩티드 항원 절편은 8 내지 약 30개의 아미노산, 예를 들어 약 12 내지 약 24개의 아미노산을 포함한다.
T-세포 매개 자연 면역은 (APC의 표면 상에서) MHC 분자에 의한 펩티드 에피토프의 제시를 통하여 작용하지만, MHC는 펩티드 부가물 (adjunct), 특히 글리콜-펩티드 및 리포-펩티드도 제시할 수 있으며, 여기서, 펩티드 부분은 T-세포에 당 또는 지질 부분을 표시하도록 MHC에 의해 지탱된다. 이러한 고려 사항은 암 백신학에서 특히 관련이 있는데, 이는 여러 종양이 글리코-유도체형 단백질 또는 리포-유도체형 단백질을 과다 발현하며, 이들의 글리코- 또는 리포-유도체형 펩티드 단편은 몇몇 경우 강력한 T-세포 에피토프일 수 있기 때문이다. 또한, 이러한 T-세포 에피토프 중 지질은 당지질일 수 있다.
정상적인 펩티드 단독 제시와는 다르게, 상기의 경우 T-세포 인식은 펩티드 상의 당 또는 지질 기에 의해 너무나도 많이 지배되어서, 높은 친화도로 MHC에 결합하지만, 종양 단백질로부터 유래되지는 않은, 종양 관련 당 또는 지질 분자가 합성에 의해 공유 결합된 짧은 합성 펩티드가 펩티드 항원으로서 성공적으로 사용되었다. 천연 종양 세포주에 대하여 유도된 인공 T-세포 에피토프의 제작에 대한 이러한 접근법은 최근에 문헌[Franco et aL, J. Exp. Med (2004) 199(5):707-716]에 채용되었다. 따라서, 펩티드 분지체 및 비-펩티드 항원의 T-세포에의 제시를 위한 플랫폼 (platform)을 형성하는 고친화성 MHC-결합 리간드로서의 작용을 위하여, 합성 펩티드 유도체와 심지어 펩티도미메틱 (peptidomimetic)이 본 발명의 백신 전달 조성물 중 펩티드 항원 대신 사용될 수 있다.
따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이 "펩티드 항원"이라는 용어는 펩티드, 전적으로 펩티드인 유도체 (wholly peptide derivative) (예를 들어 분지된 펩티드) 및 펩티드의 공유 결합 헤테로- (예를 들어 글리코- 및 리포- 및 글리코리포-) 유도체를 나타낸다. 상기 용어는 또한 특정 항체 또는 특정 T 림프구가 특이적으로 결합하는 물질의 단편도 포함하려는 것이다.
펩티드 항원은 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 펩티드 항원은 "펩티드 모방체 (peptide mimetics)"를 또한 포함할 수 있다. 펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 (non-peptide) 생활성제로서 제약 업계에서 일반적으로 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도미메틱"으로 칭해지며 (문헌[Fauchere, J. (1986) Adv. Bioactive agent Res., 15:29]; 문헌[Veber and Freidinger (1985) TINS p. 392]; 및 문헌[Evans et al. (1987) J. Med. Chem., 30:1229]; 일반적으로 컴퓨터를 사용한 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 패러다임 (paradigm) 폴리펩티드 (즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, -CH2NH-, -CH2S-, CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO- 로 구성된 군으로부터 선택되는 결합에 의해 선택적으로 대체되는 하나 이상의 펩티드 결합을 가지며, 이는 당업계에 공지되어 있으며 하기 참고 문헌에 또한 설명되어 있는 방법에 의한 것이다: 문헌[Spatola, A.F. in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins," B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)]; 문헌[Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications"] (일반적인 개관); Morley, J. S., Trends. Pharm. Sci., (1980) pp. 463-468] (일반적인 개관); 문헌[Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res., (1979) 14:177-185] (-CH2NH-, CH2CH2-); 문헌[Spatola, A.F. et al., Life Sci., (1986) 38:1243-1249] (-CH2-S-); 문헌[Harm, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314] (-CH=CH-, 시스 및 트랜스); 문헌[Almquist, R.G. et al., J. Med. Chem., (1980) 23:2533] ("-COCH2-); 문헌[Jennings-Whie, C. et al., Tetrahedron Lett., (1982) 23:2533] (-COCH2-); Szelke, M. 등의 유럽 특허 출원 제EP 45665호 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); 문헌[Holladay, M. W. et al., Tetrahedron Lett, (1983) 24:4401-4404] (--C(OH)CH2-); 및 문헌[Hruby, V.J., Life Sci., (1982) 31:189-199] (-CH2-S-). 이러한 펩티드 모방체는 폴리펩티드 실시 형태에 비하여 유의한 이점을 가질 수도 있으며, 상기 이점은 예를 들어 보다 경제적인 제조, 보다 큰 화학적 안정성, 약리학적 특성 증강 (반감기, 흡수성, 효험, 효능 등), 특이성 변경 (예를 들어, 광범한 스펙트럼의 생물학적 활성), 항원성 감소, 및 기타의 것을 포함한다.
부가적으로, 펩티드 내의 하나 이상의 아미노산의 치환 (예를 들어 L-라이신 대신 D-라이신으로의 치환)을 이용하여 보다 안정한 펩티드 및 내인성 프로테아제에 내성을 갖는 펩티드를 생성할 수도 있다. 대안적으로는, 합성 펩티드 항원, 예를 들어 생분해성 중합체에 공유 결합된 것도 D-아미노산으로부터 제조될 수 있는데, 이는 인버소 (inverso) 펩티드로 칭해진다. 펩티드가 천연 펩티드 서열의 반대 방향으로 어셈블링될 경우, 이것은 레트로 (retro) 펩티드로 칭해진다. 일반적으로, D-아미노산으로부터 제조되는 펩티드는 효소에 의한 가수분해에 대하여 매우 안정하다. 레트로-인버소 또는 부분적 레트로-인버소 펩티드에 있어서의 보존된 생물학적 활성에 대한 다수의 경우가 보고되었다 (미국 특허 제6,261,569 B1호 및 상기 특허 내의 참고 문헌; 문헌[B. Fromme et al., Endocrinology (2003) 144:3262-3269]).
선택된 펩티드 항원은 포유류 대상에게 후속적으로 투여하기 위하여 아쥬반트를 포함하거나 포함함이 없이 생분해성 중합체와 조합된다. 본 발명의 백신 전달 조성물은 정맥내 전달, 점막 전달, 근육내 전달 또는 피하 전달용으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에서 유용한 중합체는 본원에 기술된 PEA, PEUR 및 PEU 중합체를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 중합체는 다양한 분자량으로 제작될 수 있으며, 주어진 항원에서 사용하기에 적절한 분자량은 당업계의 숙련자에 의해 손쉽게 결정된다. 이와 같이, 예를 들어 적합한 분자량은 대략적으로 약 5,000 내지 약 300,000, 예를 들어 약 5,000 내지 약 250,000, 또는 약 75,000 내지 약 200,000, 또는 약 100,000 내지 약 150,000이다.
몇몇 실시 형태에 있어서, 중합체 조성물 그 자체에 의한 APC 내로의 펩티드의 전달, 펩티드의 보호 및 지속성은 아쥬반트 활성을 제공하기에 충분할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 백신 전달 조성물은 항원의 전달의 증가, 사이토카인 생성의 자극, 및/또는 항원 제시 세포의 자극에 의해 용해성 단백질 항원에 대한 면역 반응, 특히 세포성 면역 반응을 증대시킬 수 있는 아쥬반트를 함유할 수도 있다. 아쥬반트는 아쥬반트를 중합체 매트릭스 내에 펩티드 항원과 함께 분산시킴으로써, 예를 들어 아쥬반트를 항원에 콘쥬게이션시킴으로써 투여할 수 있다. 대안적으로는, 아쥬반트는 본 발명의 백신 전달 조성물과 동시에, 예를 들어 동일 조성물 또는 별개의 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 아쥬반트는 본 발명의 백신 전달 조성물 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 또한 대안적으로는, 아쥬반트 또는 아쥬반트/펩티드 항원은 동시 전달을 위하여 본원에 기술된 바와 같이 중합체에 화학적으로 결합될 수 있다. 이러한 아쥬반트는 (1) 알루미늄 염 (명반), 예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등; (2) 수중유 에멀젼 제형 (다른 특정 면역자극제,, 예를 들어 뮤라밀 펩티드 또는 박테리아 세포벽 성분을 포함하거나 포함하지 않음), 예를 들어, (a) MF59 (국제 특허 공보 제WO 90/14837호) - 이는 5%의 스쿠알렌, 0.5%의 트윈 (Tween) 80TM, 및 0.5%의 스판 (Span) 85를 포함하며, 선택적으로 다양한 양의 MTP-PB를 포함하고, 마이크로플루이다이저 (microfluidizer), 예를 들어 모델 HOY 마이크로플루이다이저 (Microfluidics, 미국 매사추세츠주 뉴튼 소재)를 사용하여 서브미크론 입자로 제형화됨 - , (b) SAF - 이는 10%의 스쿠알란, 0.4%의 트윈 80TM, 5%의 플루로닉 (pluronic)-차단 중합체 L121, 및 thr-MDP를 포함하며, 서브미크론 에멀젼으로 미세유동화되거나 와동되어 보다 큰 입자 크기의 에멀젼을 생성함 - , 및 (c) RibiTM 아쥬반트 조성물 (RAS) (Ribi Immunochem, 미국 몬태나주 해밀턴 소재) - 이는 2%의 스쿠알렌, 0.2%의 트윈 80TM, 및 모노포스포릴리피드 A (MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (cell wall skeleton, CWS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS (DetoxTM)을 포함함 -; (3) 사포닌 아쥬반트, StimulonTM (Cambridge Bioscience, 미국 매사추세츠주 워세스터 소재) 또는 그로부터 생성되는 입자, 예를 들어 ISCOM (면역자극 복합체 (immunostimulating complexe)) - 이것이 사용될 수도 있음 - ; (4) 완전 프로인트 아쥬반트 (Complete Freunds Adjuvant, CFA) 및 불완전 프로인트 아쥬반트 (Incomplete Freunds Adjuvant, IFA); (5) 사이토카인, 예를 들어 인터류킨 (IL-1, IL-2 등), 대식세포 콜로니 자극 인자 (macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor, TNF) 등; (6) 콜레라 독소 (cholera toxin, CT), 백일해 독소 (pertussis toxin, PT), 또는 이. 콜라이 (E. coli) 열 민감 독소 (heat-labile toxin, LT), 특히 LT-K63 (여기서, 라이신이 63 위치에서 야생형 아미노산을 치환함), LT-R72 (여기서, 아르기닌이 72 위치에서 야생형 아미노산을 치환함), CT-S 109 (여기서, 세린이 109 위치에서 야생형 아미노산을 치환함), 및 PT-K9/G129 (여기서, 라이신이 9 위치에서 야생형 아미노산을 치환하고, 글리신이 129 위치에서 치환함)와 같은 박테리아 ADP-리보실화 독소의 독 제거 돌연변이체 (예를 들어, 국제 특허 공보 제W093/13202호 및 국제 특허 공보 제W092/19265호 참조); 및 (7) 세포성 및 체액성 면역 반응을 증강시키기 위한, 정제된 형태의 사포닌 및 3D-모노포스포릴 지질 A (MPL) - 리포폴리사카라이드 (LPS)의 비독성 유도체 - 의 QS21 (문헌[Moore, et al., Vaccine. 1999 Jun 4;17(20-21): 2517-27])을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 면역자극제로서 작용하는 다른 물질도 본 조성물의 유효성의 증강을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 실행에 있어서 사용하기에 적합한 중합체는 펩티드 항원, 아쥬반트, 또는 항원-아쥬반트 콘쥬게이트의 중합체에의 간편한 공유 결합을 허용하는 작용체를 지닌다. 예를 들어, 카르복실기를 지니는 중합체는 손쉽게 아미노 부분과 반응함으로써, 생성되는 아미드기를 통하여 펩티드를 중합체에 공유 결합시킬 수 있다. 본원에 기술되는 바와 같이, 생분해성 중합체 및 펩티드 또는 아쥬반트는 다수의 상보성 작용기를 포함할 수 있으며, 상기 상보성 작용기를 이용하여 펩티드 항원 및/또는 아쥬반트를 생분해성 중합체에 공유 결합시킬 수 있다.
본 발명의 백신 전달 조성물 중 중합체는, 중합체의 생분해 동안 약제들을 포함하는 입자 또는 중합체 분자를 서서히 방출하면서, 개개의 면역 세포가 펩티드 항원 및 선택적 아쥬반트와 상호작용하여 면역 과정에 영향을 미치게 하기에 충분한 기간 동안 주사 부위에서 펩티드 항원 및 선택적 아쥬반트를 유지함으로써 이식 부위에서 내인성 면역 과정에서 적극적인 역할을 한다. 연약한 생물학적 펩티드 항원은 보다 느리게 생분해되는 중합체에 의해 보호되어 이 항원의 반감기 및 지속성이 증가된다.
중합체 그 자체는 또한 중합체-항원 조성물의 식작용을 촉진함으로써 항원의 APC 내로의 전달에서 적극적인 역할을 할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 중합체 (예를 들어 화학식 I 및 III-VIII을 갖는 것)는, 효소에 의한 분해시, 필수 아미노산을 제공하는데, 상기 필수 아미노산은 세포에 영양을 공급하며, 반면, 다른 분해 산물은 지방산 및 당이 대사되도록 하는 방식으로 대사될 수 있다. 항원을 포함하는 중합체의 흡수는 안전한데, 연구에 의하면, APC가 생존하고, 정상적으로 기능하며, 중합체 분해 산물을 대사/제거할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 이러한 중합체 및 백신 전달 조성물은 주사 그 자체에 의해 야기되는 외상과는 별도로, 주사 부위에서 그리고 전신적으로 대상에게 실질적으로 비-염증성이다. 또한, APC에 의한 중합체의 능동 흡수의 경우, 중합체는 항원을 위한 아쥬반트로서 작용할 수 있어서, 개별적으로 아쥬반트를 제형화하는 것이 본질적으로 전혀 필요하지 않다.
본 발명의 생체 적합성 백신 전달 조성물의 형성에 유용한 생분해성 중합체는 단량체 당 적어도 하나의 아미노산외 부분에 콘쥬게이션된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산외 부분"이라는 용어는 다양한 화학적 부분을 포함하지만, 구체적으로는 본원에 기술되어 있는 아미노산 유도체 및 펩티도미메틱은 제외된다. 또한, 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 중합체는, 그와 같이 구체적으로 기술하지 않는 한, 자연 발생 폴리펩티드를 비롯하여 폴리아미노산 절편을 포함하지 않는 것으로 생각된다. 일 실시 형태에 있어서, 비-아미노산은 단량체 중 2개의 인접한 아미노산들 사이에 두어진다. 다른 실시 형태에 있어서, 아미노산외 부분은 소수성이다. 중합체는 또한 블록 공중합체일 수도 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 바람직한 것은 PEA 또는 PEUR 골격 상에 빌트-인 (built-in) 작용기를 갖는 폴리에스테르 아미드 (PEA) 및 폴리에스테르 우레탄 (PEUR)이며, 이러한 빌트-인 작용기는 다른 화학 물질과 반응하여 부가적인 작용기를 혼입시켜 PEA 또는 PEUR의 작용성을 추가로 확장시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 그러한 중합체는 수 용해도가 증가되도록 친수성 구조를 갖는 다른 화학 물질과 기꺼이 반응하며, 사전에 변경시킬 필요 없이 펩티드 항원, 아쥬반트 및 기타 약제와 기꺼이 반응한다.
또한, 본 발명의 백신 전달 조성물에서 사용되는 중합체는 염수 (PBS) 매질에서 시험할 경우 가수분해에 의한 분해를 전혀 나타내지 않지만, 효소 용액, 예를 들어 키모트립신 또는 CT에서는 균일한 침식 거동이 관찰되었다.
일 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 I:
화학식 I
Figure 112007060428012-PCT00008
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며; R1은 독립적으로 α,ω-비스(4-카르복시페녹시)-(C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산, (C2-C20) 알킬렌, 또는 (C2-C20) 알케닐렌의 잔기로부터 선택되며; 개개의 n 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시, (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기, 하기 화학식 II:
화학식 II
Figure 112007060428012-PCT00009
의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편, 및 그의 조합, (C2-C20) 알킬렌, 및 (C2-C20) 알케닐렌으로 구성된 군으로부터 선택됨 -
으로 설명되는 화학식을 갖는 PEA; 또는
하기 화학식 III:
화학식 III
Figure 112007060428012-PCT00010
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며, m은 약 0.1 내지 0.9 범위이며, p는 약 0.9 내지 0.1 범위이며; R1은 독립적으로 α,ω-비스(4- 카르복시페녹시)-(C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산, (C2-C20) 알킬렌, 또는 (C2-C20) 알케닐렌 잔기로부터 선택되며, 각각의 R2는 독립적으로 수소, (C1-C12) 알킬 또는 (C6-C10) 아릴 또는 보호기이며; 개개의 m 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시, (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택됨 -
으로 설명되는 화학식을 갖는 PEA 중합체이다.
다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 IV로 설명되는 화학식을 갖는 PEUR 중합체이다:
화학식 IV
Figure 112007060428012-PCT00011
여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며; R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 V로 설명되는 화학 구조를 갖는 PEUR이다:
화학식 V
Figure 112007060428012-PCT00012
여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며, m은 약 0.1 내지 약 0.9 범위이며, p는 약 0.9 내지 약 0.1 범위이며; R2는 독립적으로 수소, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 또는 보호기로부터 선택되며; 개개의 m 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기 및 화학식 II의 1,4:3,6- 디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며; R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 유효량의 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 VI로 설명되는 화학식을 갖는 생분해성 PEU 중합체이다:
화학식 VI
Figure 112007060428012-PCT00013
여기서, n은 약 10 내지 약 150이며; 개개의 n 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기; 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로부터 선택된다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 VII로 설명되는 화학식을 갖는 PEU이다:
화학식 VII
Figure 112007060428012-PCT00014
여기서, m은 약 0.1 내지 약 1.0이며; p는 약 0.9 내지 약 0.1이며; n은 약 10 내지 약 150이며; 각각의 R2는 독립적으로 수소, (C1-C12) 알킬 또는 (C6-C10) 아릴이며; 개개의 m 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로부터 선택되며; 각각의 R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기; 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
예를 들어, 하나의 대안에서, 본 발명의 입자 전달 조성물에서 사용되는 PEA 중합체에 있어서 적어도 하나의 R1은 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산, 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산 잔기이며, R4는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편이다. 다른 대안에서, PEA 중합체 중 R1은 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산, 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산 잔기 중 어느 하나이다. 또 다른 대안에서, PEA 중합체 중 R1은 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸 잔기, 예를 들어 1,3-비스(4-카르복시페녹시)프로판 (CPP), 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산 또는 4,4'-(아디포일디옥시)디신남산이며, R4는 DAS와 같은 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편이다.
다른 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 IV:
화학식 IV
Figure 112007060428012-PCT00015
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며; R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기 및 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편으로 구성된 군으로부터 선택되며, R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 유효량의 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기, 및 그의 조합으로부터 선택됨 -
로 설명되는 화학식을 갖는 PEUR; 또는
하기 화학식 V:
화학식 V
Figure 112007060428012-PCT00016
- 여기서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며, m은 약 0.1 내지 약 0.9 범위이며, p는 약 0.9 내지 약 0.1 범위이며; R2는 독립적으로 수소, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 또는 보호기로부터 선택되며; 개개의 m 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 및 화학식 II의 1,4:3,6- 디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로 구성된 군으로부터 선택되며; R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로부터 선택됨 - 로 설명되는 화학 구조를 갖는 PEUR 중합체이다.
하나의 대안에서 PEUR 중합체에 있어서 R4 중 적어도 하나가 1,4:3,6-디언히드로소르비톨 (DAS)과 같은 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편 (화학식 II)이거나; R6이 1,4:3,6- 디언히드로소르비톨 (DAS)과 같은 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편이다. 다른 대안에서 PEUR 중합체에 있어서 R4 및/또는 R6은 1,4:3,6-디언히드로소르비톨 (DAS)과 같은 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편이다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 입자 전달 조성물 중 중합체는 하기 화학식 VI:
화학식 VI
Figure 112007060428012-PCT00017
- 여기서, n은 약 10 내지 약 150이며; 개개의 n 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 유효량의 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기; 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로부터 선택됨 -으로 설명되는 화학식을 갖는 PEU 중합체; 또는
하기 화학식 VII:
화학식 VII
Figure 112007060428012-PCT00018
- 여기서, m은 약 0.1 내지 약 1.0이며; p는 약 0.9 내지 약 0.1이며; n은 약 10 내지 약 150이며; 각각의 R2는 독립적으로 수소, (C1-C12) 알킬 또는 (C6-C10) 아릴 또는 기타 보호기이며; 개개의 m 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)3- 및 -(CH2)2(CH3)으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 유효량의 치료성 포화 또는 불포화 디올 잔기; 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로부터 선택됨 - 로 설명되는 화학식을 갖는 PEU이다.
본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 보호기는 t-부틸 및 당업계에 공지된 기타의 것을 포함한다. 적합한 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편은 당 알코올, 예를 들어 D-글루시톨, D-만니톨, 및 L-이디톨로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 1,4:3,6-디언히드로소르비톨 (이소소르바이드, DAS)이 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로서 사용하기에 특히 적합하다.
이러한 PEU 중합체는 다양한 약학적 및 생물학적 활성제의 인간 및 기타 포유류에게의 전달을 위한 본 발명의 백신 전달 조성물의 제조에 유용한 고분자량 중합체로서 제작될 수 있다. 본 발명의 PEU에는 중합체 사슬 중에 α-아미노산을 포함하는 비독성의 자연 발생 단량체 및 가수 분해에 의해 절단가능한 에스테르기가 포함되어 있다. PEU의 궁극적인 생분해 생성물은 α-아미노산 (생물학적인 것이든지 아니든지 간에), 디올, 및 CO2이다. PEA 및 PEUR과는 대조적으로, 본 발명의 PEU는 결정질 또는 반-결정질이며 완전 합성 제형을 허용하는 유리한 기계적 특성, 화학적 특성 및 생분해 특성을 보유하며, 따라서 결정질 및 반-결정질 중합체 입자, 예를 들어 나노입자의 제조가 용이하다.
예를 들어, 본 발명의 백신 전달 조성물에서 사용되는 PEU 중합체는 기계적 강도가 크며, PEU 중합체의 표면 침식은 생리학적 조건에서 존재하는 효소, 예를 들어 히드롤라아제에 의해 촉매될 수 있다.
하나의 대안에서 PEU 중합체에 있어서 적어도 하나의 R1은 1,4:3,6-디언히드로소르비톨 (DAS)과 같은 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편이다.
본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 보호기는 t-부틸 및 당업계에 공지된 기타의 것을 포함한다. 적합한 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편은 당 알코올, 예를 들어 D-글루시톨, D-만니톨, 및 L-이디톨로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 디언히드로소르비톨이 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로서 사용하기에 특히 적합하다.
하나의 대안에 있어서, 적어도 하나의 n 단량체 중 R3은 CH2Ph이며, 합성에서 사용되는 α-아미노산은 L-페닐알라닌이다. 단량체 내의 R3이 -CH2-CH(CH3)2인 대안에 있어서, 중합체는 α-아미노산, 류신을 포함한다. R3을 변화시킴으로써, 다른 α-아미노산, 예를 들어, 글리신 (R3이 -H일 경우), 프롤린 (R3이 에틸렌 아미드일 경우); 알라닌 (R3이 -CH3일 경우), 발린 (R3이 -CH(CH3)2일 경우), 이소류신 (R3이 -CH(CH3)-CH2-CH3일 경우), 페닐알라닌 (R3이 -CH2-C6H5일 경우); 라이신 (R3이 -(CH2)4-NH2일 때); 또는 메티오닌 (R3이 -(CH2)2S(CH3)일 경우)도 사용될 수 있다.
중합체가 화학식 I 또는 III-VII의 PEA, PEUR 또는 PEU인 또 다른 추가의 실시 형태에 있어서, R3 중 적어도 하나는 또한 -(CH2)3-일 수 있으며, R3 중 적어도 하나는 환화되어 하기 화학식 XVIII으로 설명되는 화학 구조를 형성한다:
Figure 112007060428012-PCT00019
R3이 -(CH2)3일 경우, 피롤리딘-2-카르복실산과 유사한 α-아미노산 (프롤린)이 사용된다.
PEA, PEUR 및 PEU는 시간이 지남에 따라 분산된 펩티드 항원 및 선택적 아쥬반트를 방출하도록 실질적으로 효소 작용에 의해 생분해되는 생분해성 중합체이다. 사용되는 중합체의 구조적 특성으로 인하여, 본 발명의 백신 전달 조성물은 그의 3차원 구조, 그리고 그에 따라 생활성을 보존하면서 펩티드 항원 및 선택적 아쥬반트의 안정한 로딩을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산" 및 "α-아미노산"이라는 용어는 아미노기, 카르복실기 및 펜던트 R기, 예를 들어 본원에 정의되어 있는 R3 기를 포함하는 화학적 화합물을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적 α- 아미노산"이라는 용어는 합성에 사용되는 아미노산(들)이 페닐알라닌, 류신, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 메티오닌, 프롤린 또는 그 혼합물로부터 선택됨을 의미한다.
본 발명의 실행에서 유용한 PEA, PEUR 및 PEU 중합체에 있어서, 다수의 상이한 α-아미노산이 단일 중합체 분자에서 이용될 수 있다. 이러한 중합체는 반복 단위 당 적어도 2개의 상이한 아미노산을 포함할 수도 있으며, 단일 중합체 분자는 분자의 크기에 따라 중합체 분자 내에 다수의 상이한 α-아미노산을 포함할 수도 있다. 하나의 대안에 있어서, 본 발명의 중합체의 제작에 사용되는 α-아미노산 중 적어도 하나는 생물학적 α-아미노산이다.
예를 들어, R3이 CH2Ph일 경우, 합성에서 사용되는 생물학적 α-아미노산은 L-페닐알라닌이다. R3이 CH2-CH(CH3)2인 대안에 있어서, 중합체는 생물학적 α-아미노산, L-류신을 포함할 수 있다. 본원에 기술되어 있는 공단량체 내의 R3을 변화시킴으로써, 다른 생물학적 α-아미노산, 예를 들어 글리신 (R3이 H일 경우), 알라닌 (R3이 CH3일 경우), 발린 (R3이 CH(CH3)2일 경우), 이소류신 (R3이 CH(CH3)-CH2-CH3일 경우), 페닐알라닌 (R3이 CH2-C6H5일 경우), 또는 메티오닌 (R3이 -(CH2)2S(CH3)일 경우) 및 그의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 2-피롤리딘카르복실산에서와 같이 R3 이 -(CH2)3-일 경우 (프롤린), 생물학적 α-이미노산이 사용될 수 있다. 또 다른 대안적인 실시 형태에 있어서, 본 발명의 백신 전달 조성물에 함유되는 다양한 α-아미노산 모두는 본원에 기술된 바와 같이 생물학적 α-아미노산이다.
중합체 분자는 링커를 통하여 이 중합체 분자에 콘쥬게이션되거나 분자들 사이의 가교결합체 내로 혼입된 펩티드 항원을 또한 가질 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에 있어서, 중합체는 하기 화학식 VIII을 갖는 중합체-항원 콘쥬게이트에 포함된다:
Figure 112007060428012-PCT00020
여기서, n, m, p, R1, R3, 및 R4는 상기와 같으며, R5는 -O-, -S-, 및 -NR8-로 구성된 군으로부터 선택되며, R8은 H 또는 (C1-C8)알킬이며; R7은 펩티드 항원이다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 하기 화학식 IX의 2개의 중합체 분자는 가교결합되어 -R5-R7-R5- 콘쥬게이트를 제공할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 하기 화학식 IX에 예시된 바와 같이, 펩티드 항원은 -R5-R7-R5- 콘쥬게이트를 통하여 화학식 IV의 단일 중합체 분자의 2개의 부분에 공유 결합되며, R5는 독립적으로 -O-, -S-, 및 - NR8-로 구성된 군으로부터 선택되며, R8은 H 또는 (C1-C8) 알킬이며, R7은 펩티드 항원이다.
Figure 112007060428012-PCT00021
또한 대안적으로는, 하기 화학식 X에 예시된 바와 같이, 링커 -X-Y-는 화학식 VIII의 분자에서 R5와 펩티드 항원 R7 사이에 삽입될 수 있으며, 여기서, X는 (C1-C18) 알킬렌, 치환 알킬렌, (C3-C8) 시클로알킬렌, 치환 시클로알킬렌, O, N 및 S 군으로부터 선택되는 1-3개의 헤테로원자를 포함하는 5-6원 헤테로시클릭 시스템, 치환 헤테로시클릭, (C2-C18) 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, C6 및 C10 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 알킬아릴, 치환 알킬아릴, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐, 아릴알케닐, 치환 아릴알케닐, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐 - 여기서, 치환체는 H, F, Cl, Br, I, (C1-C6) 알킬, -CN, -NO2, -OH, -0(C1-C4) 알킬, -S(C1-C6) 알킬, -S[(=O)(C1-C6) 알킬], -S[(O2)(C1-C6) 알킬], -C[(=O)(C1-C6) 알킬], CF3, -O[(CO)-(C1-C6) 알킬], -S(O2)[N(R9R10)], -NH[(C=O)(C1-C6) 알킬], -NH(C=O)N(R9R10), -N(R9R10)의 군으로부터 선택되며, R9 및 R10은 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬임 - 로 구성된 군으로부터 선택되며; Y는 -0-, -S-, -S-S-, -S(O)-,-S(O2)-, -NR8-, -C(=0)-, -0C(=0)-, -C(=0)0-, -0C(=0)NH-, -NR8C(=O)-, -C(=O)N R8-, -N R8C(=O)NR8-, -N R8C(=O)NR8-, 및 -N R8C(=S)N R8-로 구성된 군으로부터 선택된다.
Figure 112007060428012-PCT00022
다른 실시 형태에 있어서, 단일 펩티드 항원의 2개의 부분은 -R5-R7-Y-X-R5- (화학식 XI) 가교를 통하여 생활성제에 공유 결합된다:
Figure 112007060428012-PCT00023
여기서, X는 (C1-C18) 알킬렌, 치환 알킬렌, (C3-C8) 시클로알킬렌, 치환 시클 로알킬렌, O, N 및 S 군으로부터 선택되는 1-3개의 헤테로원자를 포함하는 5-6원 헤테로시클릭 시스템, 치환 헤테로시클릭, (C2-C18) 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, (C6-C10) 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 알킬아릴, 치환 알킬아릴, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐, 아릴알케닐, 치환 아릴알케닐, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐 - 여기서, 치환체는 H, F, Cl, Br, I, (C1-C6) 알킬, -CN, -N02, -OH, -0(C1-C6) 알킬, -S(C1-C6) 알킬, -S[(=O)(C1-C6) 알킬], -S[(O2)(C1-C6) 알킬], -C[(=O)(C1-C6) 알킬], CF3, -O[(CO)-(C1-C6) 알킬], -S(O2)[N(R9R10)], -NH(C=O)(C1-C6) 알킬], -NH(C=O)N(R9R10) - 여기서, R9 및 R10은 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬임 - , 및 -N(R11R12) - 여기서, R11 및 R12는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌 및 (C2-C20) 알케닐렌로부터 선택됨 - 로 구성된 군으로부터 선택됨 - 로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 본 백신 전달 조성물은 4개의 분자 중 단지 2개가 R7이 빠져 있으며 가교결합되어 단일 -R5-X-R5- 콘쥬게이트를 제공한다는 것을 제외하고는, 4개의 분자의 중합체를 포함한다.
"아릴"이라는 용어는 본원의 구조식을 참고로 하면 적어도 하나의 고리가 방향족인 약 9 내지 10개의 고리 원자를 갖는 오르토-융합 비시클릭 탄소환식 라디칼 또는 페닐 라디칼을 나타내기 위하여 사용된다. 소정 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 고리 원자는 하나 이상의 니트로, 시아노, 할로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시로 치환될 수 있다. 아릴의 예는 페닐, 나프틸, 및 니트로페닐을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
"알케닐렌"이라는 용어는 본원의 구조식을 참고로 하면 주쇄 또는 측쇄 중 적어도 하나의 불포화 결합을 포함하는 이가 분지 또는 미분지 탄화수소 사슬을 의미하기 위하여 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료성 디올"은 합성 제조 또는 자연 발생 (예를 들어 내인성)이든지 간에, 포유류에게 투여될 경우 치료적이거나 완화적인 방식으로 포유류 개체, 예를 들어 인간에 있어서 생물학적 과정에 영향을 주는 임의의 디올 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료성 디올 잔기"라는 용어는, 본원에 설명되는 바와 같이, 디올의 2개의 히드록실기가 제외된 치료성 디올 부분을 의미한다. 그의 "잔기"를 포함하는 상응하는 치료성 디올이 중합체 조성물의 합성에서 사용된다. 치료성 디올의 잔기는 조성물의 제작을 위하여 선택되는 PEA, PEUR 또는 PEU 중합체의 특성에 의존하는 조절된 방식으로 생분해에 의해 중합체의 골격으로부터의 방출시 상응하는 디올로 생체 내에서 (또는 pH, 수성 매질 등의 유사한 조건 하에) 재구성되는데, 상기 특성은 당업계에 공지되고 본원에 기술된 바와 같다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 PEA, PEUR 및 PEU 중합체의 다재 다능함으로 인하여, 중합체 골격에 혼입되는 치료성 디올의 양은 중합체의 빌딩 블록 (building block) 의 비율을 변하게 함으로써 조절할 수 있다. 예를 들어, PEA의 조성에 따라 최대 40% (w/w)의 17β-에스트라디올의 로딩이 성취될 수 있다. 17β-에스트라디올의 로딩 비가 다양한 세 가지의 상이한 보통의 선형 PEA가 하기 도식 1에 도시되어 있다:
도식 1
"호모폴리"-비스-Leu-에스트라디올-아디페이트 (중합체 상의 40% (w/w)의 에스트라디올)
Figure 112007060428012-PCT00024
공중합체: Leu(ED)3Lys(OEt)Adip4; 38% (w/w)의 에스트라디올 로딩
Figure 112007060428012-PCT00025
이와 유사하게, PEUR 및 PEU 중합체로의 치료성 디올의 로딩량은 중합체의 2개 이상의 빌딩 블록의 양을 변하게 함으로써 변화시킬 수 있다.
또한, 테스토스테론 또는 콜레스테롤을 기재로 하는 합성 스테로이드 기재의 디올, 예를 들어 4-안드로스텐-3, 17 디올 (4-안드로스텐디올), 5-안드로스텐-3, 17 디올 (5- 안드로스텐디올), 19-노르5-안드로스텐-3, 17 디올 (19-노르안드로스 텐디올)이 본 발명에 따른 PEA 및 PEUR 중합체의 골격 내로의 혼입에 적합하다. 또한, 본 발명의 백신 전달 조성물의 제조에서 사용하기에 적합한 치료성 디올 화합물은 예를 들어 아미카신 (amikacin); 암포테리신 (amphotericin) B; 아피시클린 (apicycline); 아프라마이신 (apramycin); 아르베카신 (arbekacin); 아지담페니콜 (azidamfenicol); 밤베르마이신 (bambermycin)(들); 부티로신 (butirosin); 카르보마이신 (carbomycin); 세프피라미드 (cefpiramide); 클로람페니콜 (chloramphenicol); 클로르테트라사이클린 (chlortetracycline); 클린다마이신 (clindamycin); 클로모사이클린 (clomocycline); 데메클로사이클린 (demeclocycline); 디아티모술폰 (diathymosulfone); 디베카신 (dibekacin), 디히드로스트렙토마이신 (dihydrostreptomycin); 디리트로마이신 (dirithromycin); 독시사이클린 (doxycycline); 에리트로마이신 (erythromycin); 포르티미신 (fortimicin)(들); 젠타마이신 (gentamycin)(들); 글루코술폰 (glucosulfone) 솔라술폰 (solasulfone); 구아메사이클린 (guamecycline); 이세파미신 (isepamicin); 조사마이신 (josamycin); 카나마이신 (kanamycin)(들); 류코마이신 (leucomycin)(들); 린코마이신 (lincomycin); 루센소마이신 (lucensomycin); 라이메사이클린 (lymecycline); 메클로사이클린 (meclocycline); 메타사이클린 (methacycline); 미크로노마이신 (micronomycin); 미데카마이신 (midecamycin)(들); 미노사이클린 (minocycline); 뮤피로신 (mupirocin); 나타마이신 (natamycin); 네오마이신 (neomycin); 네틸미신 (netilmicin); 올레안도마이신 (oleandomycin); 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline); 파로마이신 (paromycin); 피파사이클린 (pipacycline); 포도필린산 2-에틸히드라진; 프리마이신 (primycin); 리보스타마이신 (ribostamycin); 리파미드 (rifamide); 리팜핀 (rifampin); 라파마이신 (rafamycin) SV; 리파펜틴 (rifapentine); 리팍시민 (rifaximin); 리스토세틴 (ristocetin); 로키타마이신 (rokitamycin); 롤리테트라사이클린 (rolitetracycline); 라사라마이신 (rasaramycin); 록시트로마이신 (roxithromycin); 산사이클린 (sancycline); 시소미신 (sisomicin); 스펙티노마이신 (spectinomycin); 스피라마이신 (spiramycin); 스트렙토마이신 (streptomycin); 테이코플라닌 (teicoplanin); 테트라사이클린 (tetracycline); 티암페니콜 (thiamphenicol); 테이오스트렙톤 (theiostrepton); 토브라마이신 (tobramycin); 트로스펙토마이신 (trospectomycin); 튜베르악티노마이신 (tuberactinomycin); 반코마이신 (vancomycin); 칸디시딘 (candicidin)(들); 클로르페네신 (chlorphenesin); 더모스타틴 (dermostatin)(들); 필리핀 (filipin); 펑지크로민 (fungichromin); 카나마이신 (kanamycin)(들); 류코마이신즈(leucomycins)(들); 린코마이신 (lincomycin); 르베센소마이신 (lvcensomycin); 라임사이클린 (lymecycline); 메클로사이클린 (meclocycline); 메타사이클린 (methacycline); 미크로노마이신 (micronomycin); 미데카마이신(들); 미노사이클린 (minocycline); 뮤피로신 (mupirocin); 나타마이신 (natamycin); 네오마이신 (neomycin); 네틸미신 (netilmicin); 올레안도마이신 (oleandomycin); 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline); 파라모마이신 (paramomycin); 피파사이클린 (pipacycline); 포도필린산 2-에틸히드라진; 프리이신 (priycin); 리보스타마이딘 (ribostamydin); 리파미드 (rifamide); 리팜핀 (rifampin); 리파마이신 (rifamycin) SV; 리파펜틴 (rifapentine); 리팍시민 (rifaximin); 리스토세틴 (ristocetin); 로키타마이신 (rokitamycin); 롤리테트라사이클린 (rolitetracycline); 로사라마이신 (rosaramycin); 록시트로마이신 (roxithromycin); 산사이클린 (sancycline); 시소미신 (sisomicin); 스펙티노마이신 (spectinomycin); 스피라마이신 (spiramycin); 스트렙톤 (strepton); 오트브라마이신 (otbramycin); 트로스펙토마이신 (trospectomycin); 튜베르악티노마이신 (tuberactinomycin); 반코마이신 (vancomycin); 칸디시딘 (candicidin)(들); 클로르페네신 (chlorphenesin); 더모스타틴 (dermostatin)(들); 필리핀 (filipin); 펑지크로민 (fungichromin); 메파르티신 (meparticin); 미스타틴 (mystatin); 올리고마이신 (oligomycin)(들); 에리마이신 (erimycin) A; 튜베르시딘 (tubercidin); 6-아자우리딘; 아클라시노마이신(들); 안시타빈 (ancitabine); 안트라마이신 (anthramycin); 아자시타딘 (azacitadine); 블레오마이신(들) 카루비신 (carubicin); 카르지노필린 (carzinophillin) A; 클로로조토신 (chlorozotocin); 크로몸신 (chromomcin)(들); 독시피우리딘 (doxifiuridine); 에토시타빈 (enocitabine); 에피루비신 (epirubicin); 겜시타빈 (gemcitabine); 만노무스틴 (mannomustine); 메노가릴 (menogaril); 아토르바시 프라바스타틴 (atorvasi pravastatin); 클라리트로마이신 (clarithromycin); 류프롤린 (leuproline); 파클리탁셀 (paclitaxel); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 모피다몰 (mopidamol); 노갈라마이신 (nogalamycin); 올리보마이신 (들); 페플로마이신 (peplomycin); 피라루비신 (pirarubicin); 프레드니무스틴 (prednimustine); 퓨로마이신 (puromycin); 라니무스틴 (ranimustine); 튜베르시딘 (tubercidin); 비네신 (vinesine); 조루비신 (zorubicin); 쿠메타롤 (coumetarol); 디쿠마롤 (dicoumarol); 에틸 비스쿠마세테이트 (에틸 biscoumacetate); 에ㅌㄹ리딘 디쿠마롤 (에틸idine dicoumarol); 일로프로스트 (iloprost); 타프로스텐 (taprostene); 티오클로마롤 (tioclomarol); 아미프릴로스 (amiprilose); 로무르티드 (romurtide); 시로리무스 (sirolimus) (라파마이신 (rapamycin)); 타크로리무스 (tacrolimus); 살리실 알코올; 브로모살리게닌 (bromosaligenin); 디타졸 (ditazol); 페프라디놀 (fepradinol); 겐티식산; 글루카메타신 (glucamethacin); 올살라진 (olsalazine); S-아데노실메티오닌; 아지트로마이신 (azithromycin); 살메테롤 (salmeterol); 부데소니드 (budesonide); 알부테알 (albuteal); 인디나비르 (indinavir); 플루바스타틴 (fluvastatin); 스트렙토조신 (streptozocin); 독소루비신 (doxorubicin); 다우노루비신 (daunorubicin); 플리카마이신 (plicamycin); 이다루비신 (idarubicin); 펜토스타틴 (pentostatin); 메토잔트론 (metoxantrone); 사이타라빈 (cytarabine); 플루다라빈 포스페이트 (fludarabine phosphate); 플록수리딘 (floxuridine); 클라드리인 (cladriine); 카페시타비엔 (capecitabien); 도세탁셀 (docetaxel); 에토포시드 (etoposide); 토포테칸 (topotecan); 빈블라스틴 (vinblastine); 테니포시드 (teniposide) 등을 포함한다. 치료성 디올은 포화 또는 불포화 디올이 되도록 선택될 수 있다.
본원에서 분자량 및 다분산도는 폴리스티렌 표준물을 사용하여 겔 투과 크로마토그래피 (gel permeation chromatography, GPC)로 측정한다. 더욱 특히는, 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량 (Mn 및 Mw)은 예를 들어 고압 액체 크로마토그래픽 펌프, Waters 486 UV 검출기 및 Waters 2410 차등 굴절률 탐지기가 갖추어진 모델 510 겔 투과 크로마토그래피 (Water Associates, Inc., 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)를 사용하여 결정한다. 테트라히드로푸란 (THF), N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 또는 N,N-디메틸아세트아미드 (DMAc)가 용출제 (1.0 mL/분)로서 사용된다. 분자량 분포가 좁은 폴리스티렌 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준물이 보정용으로 사용되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산" 및 "α-아미노산"이라는 용어는 아미노기, 카르복실기 및 펜던트 R 기, 예를 들어 본원에 정의되어 있는 R3 기를 포함하는 화학적 화합물을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적 α-아미노산"이라는 용어는 합성에서 사용되는 아미노산(들)을 의미하며, 이는 페닐알라닌, 류신, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 메ㅌ오닌 또는 그 혼합물로부터 선택된다.
일반식 중 α-아미노산을 포함하는 화학식 I 및 III-VII의 중합체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 중합체 합성에 있어서, R4가 α-아미노산 내로 혼입된 화학식 I의 중합체의 실시 형태에 있어서, 중합체 합성의 경우 펜던트 R3을 포함하는 α-아미노산은 펜던트 R3을 포함하는 α-아미노산을 디올 HO-R4-OH와 축합시킴으로써 에스테르화를 통하여 비스-α,ω-디아민으로 전환시킬 수 있다. 그 결과, 반응성 α,ω-아미노기를 포함하는 디-에스테르 단량체가 형성된다. 이어서, 비스-α,ω-디아민은 이산 (di-acid), 예를 들어 세바식 산, 또는 그의 비스-활성화 에스테르, 또는 비스-아실 클로라이드와의 중축합 반응으로 들어가게 되어, 에스테르 및 아미드 결합 둘 모두를 갖는 최종 중합체 (PEA)가 얻어진다. 대안적으로는, PEUR에 있어서, 이산 대신, 디-카르보네이트 유도체 - 하기 화학식 XII - 가 사용되며, 여기서, R6은 상기에 정의된 바와 같고, R13은 독립적으로 하나 이상의 니트로, 시아노, 할로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시로 선택적으로 치환된 (C6-C10) 아릴이다.
Figure 112007060428012-PCT00026
더욱 특히는, 상기에 개시되어 있는 바와 같이 화학식 I의 생분해성 중합체로서 유용한 불포화 폴리(에스테르-아미드) (UPEA)의 합성이 기술되며, 여기서,
(a)
Figure 112007060428012-PCT00027
는
Figure 112007060428012-PCT00028
이고/이거나 (b) R4는 -CH2-CH=CH-CH2- 이다. (a)가 존재하고 (b)가 존재하지 않을 경우, 화학식 I 중 R4는 -C4H8- 또는 -C6H12- 이다. (a)가 존재하지 않고 (b)가 존재할 경우, 화학식 I 중 R1은 -C4H8- 또는 -C8H16- 이다.
UPEA는 비스 (알파-아미노산) 디에스테르 - R4 중 적어도 1개의 이중 결합을 포함함 - 의 디-p-톨루엔 술폰산 염, 및 포화 디카르복실산의 디-p-니트로페닐 에스테르, 또는 (2) 비스 (알파-아미노산) 디에스테르 - R4 중 이중 결합을 전혀 포함하지 않음 - 의 디-p-톨루엔 술폰산 염, 및 불포화 디카르복실산의 디-니트로페닐 에스테르 또는 (3) 비스 (알파-아미노산) - R4 중 적어도 하나의 이중 결합을 포함함 - 의 디-p-톨루엔 술폰산 염, 및 불포화 디카르복실산의 디-니트로페닐 에스테르의 용액 중축합에 의해 제조될 수 있다.
p-톨루엔 술폰산의 염은 아미노산 잔기를 포함하는 중합체의 합성에서의 사용에 있어서 공지되어 있다. 아릴 술폰산 염이 자유 염기 대신 사용되는데, 이는 비스 (알파-아미노산) 디에스테르의 아릴 술폰산이 재결정화를 통하여 용이하게 정제되며 워크업 (workup) 전반에 걸쳐 아미노기가 미반응 암모늄 토실레이트가 되게 하기 때문이다. 중축합 반응에 있어서, 친핵성 아미노기는 유기 염기, 예를 들어 트리에틸아민의 첨가를 통하여 손쉽게 나타내게 되어서, 중합체 생성물은 고수율로 얻어진다.
불포화 디카르복실산의 디-p-니트로페닐 에스테르는 예를 들어 트리에틸아민 및 p-니트로페놀을 아세톤에 용해시키고, 불포화 디카르복실산 클로라이드를 -78℃에서 교반하면서 적가하고 물에 부어 생성물을 침전시킴으로써 p-니트로페놀 및 불포화 디카르복실산 클로라이드로부터 합성할 수 있다. 이 목적에 유용한 적합한 산 클로라이드는 푸마르산, 말레산, 메사콘산, 시트라콘산, 글루타콘산, 이타콘산, 에틸-부탄 디오익산 및 2-프로페닐-부탄디오익산 클로라이드를 포함한다.
비스(알파-아미노산) 디에스테르의 디-아릴 술폰산 염은 알파-아미노산, p-아릴 술폰산 (예를 들어 p-톨루엔 술폰산 일수화물), 및 포화 또는 불포화 디올을 톨루엔 중에 혼합하고, 물 증발이 최소화될 때까지 환류 온도로 가열하고, 이어서 냉각시킴으로써 제조할 수 있다. 이 목적에 유용한 불포화 디올은 예를 들어 하기를 포함한다:
2-부텐-1,3-디올 및 1,18-옥타데크-9-엔-디올.
디카르복실산의 포화 디-p-니트로페닐 에스테르 및 비스(알파-아미노산) 디-에스테르의 포화 디-p-톨루엔 술폰산 염은 미국 특허 제6,503,538 B1호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다.
상기에 개시된 화학식 I의 생분해성 중합체로서 유용한 불포화 폴리(에스테르-아미드) (UPEA)의 합성을 이제 기술할 것이다. 화학식 I을 갖는 UPEA는 미국 특허 제6,503,538 B1호의 화학식 III의 R4 및/또는 미국 특허 제6,503,538 B1호의 화학식 V의 R1이 상기에 기술된 바와 같이 (C2-C20) 알케닐렌이라는 것을 제외하고는, 미국 특허 제6,503,538 B1호의 화학식 VII의 화합물과 유사한 양식으로 제조할 수 있다. 이 반응은 예를 들어 실온에서 건조 트리에틸아민을 미국 특허 제6,503,538 B1호의 상기 화합물 (III) 및 화합물 (IV)의 혼합물 및 건조 N,N-디메틸아세트아미드 중 미국 특허 제6,503,538 B1호의 상기 화합물 (V)에 첨가하고, 온도를 80℃로 증가시켜 16시간 동안 교반시키고, 이어서 반응 용액을 실온으로 냉각시키고, 에탄올로 희석시키고, 물에 붓고, 중합체를 분리하고, 분리된 중합체를 물로 세척하고, 감압 하에 약 30℃로 건조시키고, 이어서 p-니트로페놀 및 p-톨루엔 술포네이트 상에서의 음성 시험이 될 때까지 정제함으로써 실시한다. 바람직한 반응물 (IV)은 라이신 벤질 에스테르의 p-톨루엔 술폰산 염이며, 벤질 에스테르 보호기는 바람직하게는 화합물 (II)로부터 제거되어 생분해성을 부여하지만, 이것은 미국 특허 제6,503,538호의 실시예 22에서와 같이 가수소 분해에 의해 제거되어서는 아니되는데, 이는 가수소 분해에 의해 요망되는 이중 결합이 포화되게 되기 때문이며, 오히려 벤질 에스테르기는 불포화체를 보존하는 방법에 의해 산성 기로 전환되어야 한다. 대안적으로는, 라이신 반응물 (IV)은 불포화체를 보존하면서 최종 생성물에서 손쉽게 제거될 수 있는, 벤질기와는 상이한 보호기에 의해 보호될 수 있는데, 예를 들어, 라이신 반응물은 t-부틸로 보호될 수 있으며 (즉, 반응물은 라이신의 t-부틸 에스테르일 수 있음), t-부틸은 생성물 (II)을 산으로 처리함으로써 불포화체는 보존하면서 H로 전환시킬 수 있다.
화학식 I을 갖는 화합물의 실시예는 미국 특허 제6,503,538호의 실시예 1에서 화합물 (III)을 비스(L-페닐알라닌) 2-부텐-1,4-디에스테르의 p-톨루엔 술폰산 염으로 치환하거나 미국 특허 제6,503,538호의 실시예 1에서 화합물 (V)을 디-p-니 트로페닐 푸마레이트로 치환하거나 미국 특허 제6,503,538호의 실시예 1에서 화합물 (III)을 L-페닐알라닌 2-부텐-1,3-디에스테르의 p-톨루엔 술폰산 염으로 치환하고 또한 미국 특허 제6,503,538호의 실시예 1에서 화합물 (V)을 데-p-니트로페닐 푸마레이트로 치환함으로써 제공된다.
화학식 I 또는 III을 갖는 불포화 화합물에 있어서, 하기가 유지된다: 아미녹실 라디칼, 예를 들어 4-아미노 TEMPO는 축합제로서 카르보닐디이미다졸 또는 적합한 카르보디이미드를 사용하여 부착시킬 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 펩티드 항원, 아쥬반트 및 펩티드 항원/아쥬반트 콘쥬게이트는 이중 결합 작용체를 통하여 부착될 수 있다. 친수성은 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트에의 결합에 의해 부여될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 백신 전달 시스템의 형성에 사용하기 위한 것으로 고려되는 중합체는 미국 특허 제5,516, 881호; 동 제6,476,204호; 동 제6,503,538호; 및 미국 특허 출원 제10/096,435호; 동 제10/101,408호; 동 제10/143,572호; 및 동 제10/194,965호에 나타내어진 것을 포함하는데, 상기 특허 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
생분해성 PEA, PEUR 및 PEU 중합체 및 공중합체는 단량체 당 최대 2개의 아미노산, 중합체 분자 당 다수의 아미노산을 포함하며, 바람직하게는 중량 평균 분자량이 10,000 내지 125,000 범위이고; 이러한 중합체 및 공중합체는 표준 점도 측정 방법으로 측정할 경우 일반적으로 25℃에서 고유 점도가 0.3 내지 4.0 범위, 예를 들어 0.5 내지 3.5 범위이다.
본 발명의 실행에서의 사용에 고려되는 중합체는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어 일반적으로 트리부틸주석 (IV) 촉매를 사용하여 폴리에스테르, 예를 들어 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(글리콜리드), 폴리(락티드) 등을 형성한다. 그러나, 매우 다양한 촉매가 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 중합체의 형성을 위하여 사용될 수 있음이 이해된다.
본 발명의 실행에서의 사용에 고려되는 PEA 및 PEUR 중합체는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어 일반적으로 트리부틸주석 (IV) 촉매를 사용하여 폴리에스테르, 예를 들어 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(글리콜리드), 폴리(락티드) 등을 형성한다. 그러나, 매우 다양한 촉매가 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 중합체의 형성을 위하여 사용될 수 있음이 이해된다.
사용에 고려되는 이러한 폴리(카프로락톤)은 하기와 같은 예시적 화학식 XIII을 갖는다:
Figure 112007060428012-PCT00029
사용에 고려되는 폴리(글리콜리드)는 하기와 같은 예시적 화학식 XIV를 갖는다:
Figure 112007060428012-PCT00030
사용에 고려되는 폴리(락티드)는 하기와 같은 예시적 화학식 XV를 갖는다:
Figure 112007060428012-PCT00031
아미녹실 부분을 포함하는 적합한 폴리(락티드-코-ε-카프로락톤)의 예시적 합성법이 하기에 나타내어져 있다. 제1 단계는 촉매로서 제1주석 옥토에이트를 사용하여 벤질 알코올의 존재 하에 락티드와 ε-카프로락톤을 공중합시켜 화학식 XVI의 중합체를 형성하는 것을 포함한다.
Figure 112007060428012-PCT00032
이어서, 히드록시 종결 중합체 사슬을 말레산 무수물로 캡핑하여 하기 화학식 XVII를 갖는 중합체 사슬을 형성할 수 있다:
Figure 112007060428012-PCT00033
이 시점에서, 4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥시를 카르복실릭 말단기와 반응시켜 아미드 결합을 통하여 아미녹실 부분을 이 공중합체에 공유 결합에 의해 부착시킬 수 있는데, 상기 아미드 결합은 4-아미노기와 카르복실산 말단기 사이의 반응으로부터 생성된다. 대안적으로는, 말레산 캡핑된 공중합체는 폴리아크릴산과 그래프팅되어 부가적인 카르복실산 부분을 제공할 수 있으며, 상기 카르복실산 부분은 추가의 아미녹실기의 후속적인 부착을 위한 것이다.
PEU에 있어서의 화학식 VII를 갖는 불포화 화합물에 있어서, 하기가 유지된다. 아미노 치환 아미녹실 (N-옥시드) 라디칼을 지니는 기, 예를 들어 4-아미노 TEMPO는 축합제로서 카르보닐디이미다졸 또는 적합한 카르보디이미드를 사용하여 부착시킬 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 부가적인 생활성제 등은 이중 결합을 통하여 선택적으로 부착될 수 있다.
예를 들어, 화학식 VI를 갖는 본 발명의 고분자량의 반-결정질 PEU는, 하기 반응식 2에 예시된 바와 같이, 클로로포름/물 시스템 중 비스-친전자성 단량체로서 포스겐을 사용함으로써 계면에서 제조될 수 있다:
Figure 112007060428012-PCT00034
L-라이신 에스테르를 포함하며, 화학식 VII를 갖는 코폴리(에스테르 우레아) (PEU)의 합성은 유사한 반응식 3에 의해 실시될 수 있다:
Figure 112007060428012-PCT00035
예를 들어 (Fluka Chemie, GMBH (스위스 부흐스 소재)로부터 구매가능한) 톨루엔 중 포스겐 (ClCOCl) (고도로 유독함)의 20% 용액은 디포스겐 (트리클로로메틸클로로포르메이트) 또는 트리포스겐 (비스(트리클로로메틸)카르보네이트)에 의해 치환될 수 있다. 덜 유독한 카르보닐디이미다졸도 포스겐, 디-포스겐 또는 트리-포스겐 대신 비스-친전자성 단량체로서 사용될 수 있다.
PEU 의 일반적인 합성 절차
냉각된 단량체 용액을 사용하여 고분자량의 PEU를 얻는 것이 필요하다. 예를 들어, 150 mL의 물 중 비스(α-아미노산)-α,ω-알킬렌 디에스테르의 디-p-톨루엔술폰산 염의 현탁물에 무수 탄산나트륨을 첨가하고, 실온에서 약 30분 동안 교반시키고, 약 2 - 0℃로 냉각시켜, 제1 용액을 형성한다. 이와 동시에, 클로로포름 중 포스겐의 제2 용액을 약 15 - 10℃로 냉각시킨다. 제1 용액을 계면 중축합용 반응기 내로 넣고 제2 용액을 한번에 빠르게 첨가하고 약 15분 동안 세차게 교반시킨다. 이어서 클로로포름층을 분리하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시킬 수 있다. 얻어진 용액을 추가의 사용을 위하여 보관할 수 있다.
제작된 모든 예시적 PEU 중합체는 클로로포름 중의 용액으로서 얻었으며, 이러한 용액은 보관 동안 안정하다. 그러나, 몇몇 중합체, 예를 들어 1-Phe-4는 분리 후 클로로포름에서 불용성으로 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 중합체는 매끄러운 소수성 표면 상으로 주조하고 클로로포름이 증발 건조되게 함으로써 클로로포름 용액으로부터 분리할 수 있다. 얻어진 PEU의 추가의 정제는 필요하지 않다. 이 절차로 얻어지는 예시적 PEU의 수율 및 특성이 본원의 표 1에 요약되어 있다.
다공성 PEU 의 일반적인 제조 절차
이제 일반식의 α-아미노산을 포함하는 PEU 중합체의 제조 방법을 기술할 것이다. 예를 들어 화학식 I 또는 II의 중합체의 실시 형태에 있어서, α-아미노산은 예를 들어 α-아미노산과 디올 HO-R1-OH를 축합시킴으로써 비스-(α-아미노산)-α,ω-디올-디에스테르 단량체로 전환시킬 수 있다. 그 결과, 에스테르 결합이 형성된다. 이어서, 카르본산의 산 클로라이드 (포스겐, 디포스겐, 트리포스겐)는 비스-(α-아미노산)-알킬렌 디에스테르의 디-p-톨루엔술폰산 염과의 중축합 반응으로 들어가 에스테르 및 우레아 결합 둘 모두를 갖는 최종 중합체가 얻어진다.
불포화 PEU는 R1 중 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는, 비스-(α-아미노산)-알킬렌 디에스테르의 디-p-톨루엔술포네이트 염의 계면 용액 축합에 의해 제조될 수 있다. 이 목적에 유용한 불포화 디올은 예를 들어 2-부텐-1,4-디올 및 1,18-옥타데크-9-엔-디올을 포함한다. 불포화 단량체는 이 반응 이전에 알칼리 수용액, 예를 들어 수산화나트륨 용액에 용해시킬 수 있다. 이어서, 유기 용매층, 예를 들어 클로로포름을 포함하는 수용액은 외부 냉각 하에 격렬하게 교반시킬 수 있는데, 상기 유기 용매층은 등몰량의 단량체, 이량체 또는 삼량체 포스겐을 포함한다. 발열 반응이 급속하게 진행되고, (대부분의 경우) 유기 용매 중에 용해된 채 남아있는 중합체가 생성된다. 유기층은 물로 수회 세척하고, 무수 황산나트륨 으로 건조시키고, 여과시키고, 증발시킬 수 있다. 수율이 약 75%-85%인 불포화 PEU를 진공 하에, 예를 들어 약 45℃에서 건조시킬 수 있다.
다공성의 강한 물질을 얻기 위하여, L-Leu 기재 PEU, 예를 들어, 1-L-Leu-4 및 1-L-Leu-6를 하기에 기술하는 일반적인 절차를 이용하여 제작할 수 있다. 이러한 절차는 L-Phe 기재 PEU에 적용할 경우 다공성의 강한 물질의 형성에 있어서 덜 성공적이다.
계면 중축합 직후 얻어지는 클로로포름 중 PEU의 반응 용액 또는 에멀젼 (약 100 mL)은, 유리 비이커, 바람직하게는 비이커 벽에의 PEU의 점착의 감소를 위하여 디메틸디클로르실란으로 소수성으로 만들어진 비이커 중 약 80℃-85℃의 물에 교반하면서 적가한다. 중합체 용액은 작은 드롭 (drop)으로 물에서 미분화되고 클로로포름은 오히려 격렬하게 증발된다. 점차, 클로로포름이 증발됨에 따라 작은 드롭은 압축 타르 유사 물질로 합해지고, 상기 물질은 점착성 고무 제품으로 변환된다. 이 고무 제품은 비이커로부터 옮겨지며, 소수성화된 원통형 시험관 내로 넣어지는데, 상기 시험관은 약 80℃에서 약 24시간 동안 온도 조절 장치에 의해 제어된다. 이어서, 시험관을 온도 조절 장치로부터 옮기고, 실온으로 냉각시키고, 파쇄하여 중합체를 얻는다. 얻엊ㄴ 다공성 바아 (bar)는 진공 건조기 내에 두고, 감압 하에 약 80℃에서 약 24시간 동안 건조시킨다. 또한, 다공성 중합체 물질을 얻기 위한 당업계에 공지된 임의의 절차도 이용될 수 있다.
상기 절차로 제조된 고분자량의 다공성 PEU의 특성에 의해 표 1에 요약된 결과가 생성되었다.
화학식 VI 및 VII의 PEU 중합체의 특성
PEU* 수율 [%] ηred a) [dL/g] MW b) Mn b) Mw/Mn b) Tg c) [℃] Tm c) [℃]
1-L-Leu-4 80 0.49 84000 45000 1.90 67 103
1-L-Leu-6 82 0.59 96700 50000 1.90 64 126
1-L-Phe-6 77 0.43 60400 34500 1.75 - 167
[1-L-Leu-6]0.75-[1-L-Lys(OBn)]0.25 84 0.31 64400 43000 1.47 34 114
1-L-Leu-DAS 57 0.28 55700d) 27700d) 2.1d) 56 165
* 화학식 VI의 PEU 여기서, 1-L-Leu-4: R4 = (CH2)4, R3 = i-C4H9 1-L-Leu-6: R4 = (CH2)6, R3 = i-C4H9 1-L-Phe-6: R4 = (CH2)6, R3 = -CH2-C6H5. 1-L-Leu-DAS: R4 = 1,4:3,6-디언히드로소르비톨, R3 = i-C4H
a) 감소된 점도는 25℃의 DMF에서, 그리고 0.5 g/dL의 농도에서 측정함.
b) GPC 측정은 DMF, (PMMA)에서 실시함.
c) DSC 측정으로부터의 제2 가열 곡선으로부터 취해진 Tg (가열 속도: 10℃/분)
d) GPC 측정은 DMAc, (PS)에서 실시함.
합성된 예시적 PEU의 인장 강도를 측정하고 그 결과를 표 2에 요약하였다. 인장 강도 측정치는, 아령형 PEU 필름 (4 x 1.6 cm)을 사용하여 얻었는데, 상기 필름은 클로로포름 용액으로부터 주조되고 평균 두께가 0.125이며, 60 mm/분의 크로스헤드 속도에서 Nexygen FM 소프트웨어 (Amtek, 미국 플로리다주 라르고 소재)를 사용하여 PC가 내장된 인장 강도 기계 (Chatillon TDC200) 상에서 인장 시험을 하였다. 본원에 예시된 실시예는 하기의 기계적 특성을 가질 것으로 기대할 수 있다:
1. 약 30 ℃ 내지 약 90 ℃ 범위, 예를 들어 약 35 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 유리 전이 온도;
2. 평균 두께가 약 1.6 cm인 중합체 필름은 항복점 인장 응력이 약 20 Mpa 내지 약 150 Mpa, 예를 들어 약 25 Mpa 내지 약 60 Mpa임;
3. 평균 두께가 약 1.6 cm인 중합체 필름은 신장률이 약 10 % 내지 약 200%, 예를 들어 약 50 % 내지 약 150%임; 및
4. 평균 두께가 약 1.6 cm인 중합체의 필름은 약 500 MPa 내지 약 2000 MPa 범위의 영 계수 (Young's modulus)를 가짐. 하기 표 2에는 이러한 유형의 예시적 PEU의 특성이 요약되어 있다.
PEU의 기계적 특성
중합체 명칭 Tg a) (℃) 항복점 인장 응력 (MPa) 신장률 (%) 영 계수 (MPa)
1-L-Leu-6 64 21 114 622
[1-L-Leu-6]0.75-[1-L-Lys(OBn)]0.25 34 25 159 915
본 발명의 백신 전달 조성물의 다양한 성분은 넓은 범위의 비로 존재할 수 있다. 예를 들어, 중합체 반복 단위:항원은 일반적으로 1:50 내지 50:1, 예를 들어 1:10 내지 10:1, 약 1:3 내지 3:1, 또는 약 1:1의 비로 사용된다. 그러나, 특정 항원이 특정 중합체 내로 혼입되기가 어렵고 낮은 면역원성을 갖는 경우와 같이, 특정 목적에는 다른 비가 보다 적절할 수도 있는데, 상기의 경우 보다 큰 상대적인 양의 펩티드 항원이 필요하다.
소정 실시 형태에 있어서, 본원에 기술된 본 발명의 백신 전달 조성물은 입자로서 제공될 수 있으며, 펩티드 항원/아쥬반트 콘쥬게이트, 또는 항원 - 아쥬반트를 이용하거나 아쥬반트 없이 - 은 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기술된 임의의 여러 기술을 이용하여, 선택적으로 링커의 사용에 의해 중합체 작용기에 부착되거나 입자 내에 물리적으로 혼입된다 (분산됨). 입자는 APC에 의한 흡수를 위한 크기의 것으로서, 평균 직경이 예를 들어 약 10 나노미터 내지 약 1000 미크론 범위, 또는 약 10 나노미터 내지 약 10 미크론 범위이다. 선택적으로, 입자는 그의 생분해의 조절을 돕기 위한 중합체의 얇은 외피 (covering)를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 입자는 중합체 분자 당 약 5 내지 약 150개의 펩티드 항원을 포함한다.
본 발명의 백신 전달 조성물에서 사용되는 중합체, 예를 들어 PEA, PEUR 및 PEU 중합체는 표면에서의 효소 활성에 의해 생분해된다. 따라서, 중합체, 예를 들어 그의 입자는 항원을 대상에게 제어된 방출 속도로 투여하는데, 상기 제어된 방출 속도는 장기간에 걸쳐 특정하고 일정하다. 부가적으로, PEA, PEUR 및 PEU 중합체는 불리한 부산물의 생성이 없이 가수분해 효소를 통하여 생체 내에서 분해되기 때문에, 본 발명의 백신 전달 조성물은 실질적으로 비-염증성이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 백신 조성물 중 중합체의 기술을 위하여 사용되는 "생분해성"은 중합체가 신체의 정상 기능에서 무해한 생성물로 분해될 수 있음을 의미한다. 일 실시 형태에 있어서, 전체 백신 전달 조성물이 생분해성이다. 바람직한 생분해성 중합체는 생분해성을 제공하는 가수분해성 에스테르 결합을 가지며, 일반적으로 주로 아미노기로 종결된 사슬이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "분산된"은 본원에 개시된 펩티드 항원 또는 아쥬반트가 중합체 내에 분산, 혼합, 용해, 균질화 및/또는 공유 결합됨을 의미하는데 ("분산"되거나 로딩됨), 상기 중합체는 입자로 형성되거나 형성될 수 없다.
펩티드 항원 및 선택적 아쥬반트는 중합체 담체에의 화학적 결합 없이 중합체 매트릭스 내에 분산될 수 있지만, 항원 및/또는 항원-아쥬반트 콘쥬게이트는 매우 다양한 적합한 작용기를 통하여 생분해성 중합체에 공유 결합될 수 있음이 또한 고려된다. 예를 들어, 생분해성 중합체가 폴리에스테르일 경우, 카르복실기 사슬 말단이 항원 또는 아쥬반트 상의 컴플리멘터리 (complimentary) 부분, 예를 들어 히드록시, 아미노, 티오 등과의 반응에 사용될 수 있다. 매우 다양한 적합한 시약 및 반응 조건은 예를 들어 문헌[March 's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, (2001)]; 및 문헌[Comprehensive Organic Transformations, Second Edition, Larock (1999)]에 개시되어 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 항원 및/또는 아쥬반트는 아미드, 에스테르, 에테르, 아미노, 케톤, 티오에테르, 술피닐, 술포닐, 디술피드 결합을 통하여 화학식 I 또는 III-VII의 임의의 중합체에 결합될 수 있다. 이러한 결합은 당업계에 공지된 합성 절차를 이용하여 적합하게 작용화된 출발 물질로부터 형성될 수 있다.
예를 들어, 일 실시 형태에 있어서, 중합체는 중합체의 말단 또는 펜던트 카르복실기 (예를 들어, COOH)를 통하여 펩티드 항원 또는 아쥬반트에 결합될 수 있다. 구체적으로는, 화학식 III, V 및 VII의 화합물은 펩티드 항원의 아미노 작용기 또는 히드록실 작용기와 반응하여 펩티드 항원이 각각 아미드 결합 또는 카르복실릭 에스테르 결합을 통하여 부착된 생분해성 중합체를 제공할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 중합체의 카르복실기는 아실 할라이드, 아실 무수물/"혼합" 무수물 또는 활성 에스테르로 변환될 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 중합체 분자의 자유 -NH2 말단은 아실화되어, 펩티드 항원이 단지 중합체의 카르복실기를 통하여 부착되며 중합체의 자유 말단에는 부착되지 않는 것을 확실하게 할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 본 발명의 백신 전달 조성물은 PEA, PEUR 또는 PEU로부터 제조될 수 있으며, 여기서, N-말단 자유 아미노기는 예를 들어 무수물 RCOOCOR - 여기서, R은 (C1-C24) 알킬임 - 로 아실화하여, 생활성제가 단지 중합체의 카르복실기를 통하여 부착되며 중합체의 자유 말단에는 부착되지 않는 것을 확실하게 한다.
대안적으로는, 펩티드 항원 또는 아쥬반트는 예를 들어 화학식 VIII-XI에서 설명된 바와 같이 링커 분자를 통하여 중합체에 부착될 수 있다. 실제, 생분해성 중합체의 표면 소수성의 개선, 효소 활성화에 대한 생분해성 중합체의 접근성의 개선, 및 생분해성 중합체의 방출 프로필의 개선을 위하여, 링커를 이용하여 펩티드 항원 및/또는 아쥬반트를 생분해성 중합체에 간접적으로 부착시킬 수 있다. 소정 실시 형태에 있어서, 링커 화합물은 분자량 (MW)이 약 44 내지 약 10,000, 바람직하게는 44 내지 2000인 폴리(에틸렌 글리콜); 아미노산, 예를 들어 세린; 1 내지 100개의 반복 단위를 갖는 폴리펩티드; 및 임의의 다른 적합한 저분자량 중합체를 포함한다. 링커는 일반적으로 펩티드 항원을 중합체로부터 약 5 옹스트롬에서 최대 약 200 옹스트롬으로 분리시킨다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 링커는 식 W-A-Q의 이가 라디칼이며, 여기서, A는 (C1-C24) 알킬, (C2-C24) 알케닐, (C2-C24) 알키닐, (C3-C8) 시클로알킬, 또는 (C6-C10) 아릴이고, W 및 Q는 각각 독립적으로 -N(R)C(=O)-, -C(=O)N(R)-, -OC(=O)-, -C(=O)O, -O-, -S-, -S(O), -S(O)2-, -S-S-, -N(R)-, -C(=O)- 이며, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬이다.
상기 링커를 기술하기 위하여 사용되는 바와 같이, "알킬"이라는 용어는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 나타내며, 이는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 링커의 기술에 사용되는 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 링커의 기술에 사용되는 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 링커의 기술에 사용되는 "아릴"은 탄소 원자수가 6 내지 최대 14 범위인 방향족 기를 나타낸다.
소정 실시 형태에 있어서, 링커는 약 2 내지 최대 약 25개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 사용에 고려되는 적합한 펩티드는 폴리-L-라이신, 폴리-L-글루탐산, 폴리-L-아스파르트산, 폴리-L-히스티딘, 폴리-L-오르니틴, 폴리-L-트레오닌, 폴리-L-타이로신, 폴리-L-류신, 폴리-L-라이신-L-페닐알라닌, 폴리-L-아르기닌, 폴리-L-라이신-L-타이로신 등을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, 펩티드 항원은 중합체에 공유 결합될 수 있는데, 즉, 항원은 하나 초과의 중합체 분자에 결합된다. 이러한 공유 가교결합은 부가적인 중합체-항원 링크를 이용하여 또는 이것을 이용하지 않고 행해질 수 있다.
펩티드 항원 분자는 또한 단일 거대분자의 2개의 부분들 사이의 공유 결합에 의해 분자간 가교를 형성할 수 있다.
선형 중합체 펩티드 콘쥬게이트는 항원 골격 상의 잠재적인 친핵체를 보호하고, 단지 하나의 반응성 기가 중합체 또는 중합체 링커 작제물에 결합된 채 남아있게 함으로써 만들어진다. 탈보호는 당업계에 잘 알려진 펩티드 탈보호법 (예를 들어 Boc 및 Fmoc 화학)에 따라 수행된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 펩티드 항원은 retro-inverso 또는 부분적 retro-inverso 펩티드로서 제시된다.
다른 실시 형태에 있어서, 펩티드 항원은 매트릭스 중 중합체의 광가교결합성 버전과 혼합되고, 가교결합 후, 이 물질은 식작용 가능한 크기, 즉, 0.1-10 ㎛로 분산 (분쇄)된다.
링커는 먼저 중합체 또는 펩티드 항원 또는 아쥬반트에 부착될 수 있다. 합성 동안 링커는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 다양한 보호기를 사용하여 비보호 형태 또는 보호 형태로 존재할 수 있다. 보호 링커의 경우, 링커의 비보호 말단이 먼저 중합체 또는 펩티드 항원에 부착될 수 있다. 이어서 보호기는 Pd/H2 가수소 분해, 순한 산 또는 염기 가수분해, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 일반적인 탈보호 방법을 이용하여 탈보호시킬 수 있다. 이어서 탈보호된 링커는 펩티드 항원, 아쥬반트 또는 아쥬반트/펩티드 항원 콘쥬게이트에 부착시킬 수 있다.
본 발명에 따른 생분해성 중합체 (여기서, 부착될 분자는 아미녹실임)의 예시적 합성이 하기에 나타내어져 있다. 폴리에스테르는 N,N'-카르보닐디이미다졸의 존재 하에 아미노 치환된 N-옥시드 자유 라디칼 (아미녹실) 보유기, 예를 들어, 4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥시와 반응시켜 폴리에스테르의 사슬 말단의 카르복실산 부분을 아미노 치환된 아미녹실 함유 라디칼에의 아미드 결합으로 대체하여서, 아미노 부분이 중합체의 카르복실기의 카르보닐 잔기의 탄소에 공유 결합되게 할 수 있다. N,N'-카르보닐 디이미다졸 또는 적합한 카르보디이미드는 폴리에스테르의 사슬 말단의 카르복실기 중 히드록실 부분을 중간 생성물 부분으로 전환시키며, 상기 중간 생성물 부분은 아미녹실, 예를 들어 4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥시와 반응할 것이다. 아미녹실 반응물은 일반적으로 1:1 내지 100:1의 범위의 폴리에스테르에 대한 반응물의 몰 비로 사용된다. N,N'-카르보닐 디이미다졸 대 아미녹실의 몰 비는 바람직하게는 약 1:1이다.
전형적인 반응은 하기와 같다. 폴리에스테르는 반응 용매에 용해되고, 반응은 용해에 이용되는 온도에서 손쉽게 실시된다. 반응 용매는 폴리에스테르가 용해되는 임의의 것일 수 있다. 폴리에스테르가 폴리글리콜산 또는 폴리(글리콜리드-L-락티드)일 경우 (글리콜산 대 L-락트산의 단량체 몰 비는 50:50 초과임), 115℃ 내지 130℃에서 고도로 정제된 (99.9+% 순수함) 디메틸 술폭시드 또는 실온에서 디메틸술폭시드 (DMSO)가 폴리에스테르를 적합하게 용해시킨다. 폴리에스테르가 폴리-L-락트산, 폴리-DL-락트산 또는 폴리(글리콜리드-L-락티드) (글리콜산 대 L-락트산의 단량체 몰 비는 50:50 또는 50:50 미만임)일 경우, 실온 내지 50℃에서 테트라히드로푸란, 메틸렌 클로라이드 및 클로로포름은 폴리에스테르를 적합하게 용해시킨다.
중합체/펩티드 항원 결합
일 실시 형태에 있어서, 본원에 기술된 본 발명의 백신 전달 조성물의 제조에 사용되는 중합체는 적어도 하나의 펩티드 항원이 중합체에 직접 결합된 것을 가진다. 중합체의 잔기는 하나 이상의 펩티드 항원의 잔기에 결합될 수 있다. 예를 들어, 중합체의 하나의 잔기는 펩티드 항원의 하나의 잔기에 직접 결합될 수 있다. 중합체 및 펩티드 항원은 각각 하나의 개방 원자가 (open valency)를 가질 수 있다. 대안적으로는, 하나 초과의 펩티드 항원, 다수의 펩티드 항원, 또는 상이한 병원성 유기체 유래의 펩티드 항원들의 혼합물이 중합체에 직접적으로 결합될 수 있다. 그러나, 각각의 펩티드 항원의 잔기는 중합체의 상응하는 잔기에 결합될 수 있기 때문에, 하나 이상의 펩티드 항원의 잔기의 갯수는 중합체의 잔기 상의 개방 원자가의 갯수에 상응할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "중합체의 잔기"는 하나 이상의 개방 원자가를 갖는 중합체의 라디칼을 나타낸다. 본 발명의 중합체의 (중합체 골격 또는 펜던트 기 상의) 임의의 합성 가능한 원자, 원자들 또는 작용기는 개방 원자가를 제공하도록 제거될 수 있되, 단, 라디칼이 펩티드 항원의 잔기에 부착된 경우 생활성은 실질적으로 유지된다. 부가적으로, 임의의 합성 가능한 작용기 (예를 들어 카르복실)이 중합체 상에서 (예를 들어 중합체 골격 또는 펜던트 기 상에서) 생성되어 개방 원자가를 제공할 수 있되, 단, 라디칼이 펩티드 항원의 잔기에 부착된 경우 생활성은 실질적으로 유지된다. 요망되는 결합에 기초하여, 당업계의 숙련자라면 당업계에 공지된 절차를 사용하여 본 발명의 중합체로부터 유도될 수 있는 적합하게 작용화된 출발 물질을 선택할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "화학식의 화합물의 잔기 (*)"는 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 개방 원자가를 갖는 화학식 I 및 III-VII의 중합체의 화합물의 라디칼을 나타낸다. 화합물의 임의의 합성 가능한 원자, 원자들 또는 작용기 (예를 들어 중합체 골격 또는 펜던트 기 상의)는 개방 원자가를 제공하도록 제거될 수 있되, 단, 이 라디칼이 펩티드 항원의 잔기에 부착된 경우 생활성은 실질적으로 유지된다. 부가적으로, 임의의 합성 가능한 작용기 (예를 들어 카르복실)가 개방 원자가가 생성되도록 화학식 I 및 III-VII의 화합물 상에서 (예를 들어, 중합체 골격 또는 펜던트 기 상에서) 생성될 수 있되, 단, 라디칼이 펩티드 항원의 잔기에 부착된 경우 생활성은 실질적으로 유지된다. 요망되는 결합에 기초하여, 당업계의 숙련자라면 당업계에 공지된 절차를 이용하여 화학식 I 및 III-VII의 화합물로부터 유도될 수 있는 적합하게 작용화된 출발 물질을 선택할 수 있다.
예를 들어, 펩티드 항원의 잔기는 아미드 (예를 들어 , -N(R)C(=O)- 또는 -C(O)N(R)-), 에스테르 (예를 들어, -0C(=0)- 또는 -C(=0)0-), 에테르 (예를 들어, -0-), 아미노 (예를 들어, -N(R)- ), 케톤 (예를 들어, -C(=0)-), 티오에테르 (예를 들어, -S-), 술피닐 (예를 들어, -S(O)-), 술포닐 (예를 들어, -S(O)2- ), 디술피드 (예를 들어, -S-S-), 또는 직접 (예를 들어, C-C 결합) 결합을 통하여 화학식 I 및 III-VII의 화합물의 잔기에 결합될 수 있으며, 여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬이다. 이러한 결합은 당업계에 공지된 합성 절차를 이용하여 적합하게 작용화된 출발 물질로부터 형성될 수 있다. 요망되는 결합에 기초하여, 당업계의 숙련자라면 화학식 I 및 III-VII 중 임의의 하나의 화합물의 잔기로부터, 그리고 펩티드 항원 또는 아쥬반트의 주어진 잔기로부터 유도될 수 있는 적합하게 작용화된 출발 물질을 선택할 수 있다. 펩티드 항원 또는 아쥬반트의 잔기는 화학식 I 및 III-VII 중 임의의 하나의 화합물의 잔기 상의 임의의 합성 가능한 위치에 결합될 수 있다. 부가적으로, 본 발명은 아쥬반트 생활성제 또는 펩티드 항원의 하나 초과의 잔기가 펩티드 항원 또는 화학식 I 및 III-VII 중 임의의 하나의 화합물에 직접 결합된 화합물도 제공한다.
중합체 분자에 결합될 수 있는 펩티드 항원의 갯수는 일반적으로 중합체의 분자량에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, n이 약 5 내지 약 150, 바람직하게는은 약 5 내지 약 70인 화학식 I 또는 II의 화합물에 있어서, 최대 약 150개의 펩티드 항원 (즉, 그의 잔기)이 펩티드 항원과, 중합체의 말단 기와의 반응에 의해 중합체 (즉, 그의 잔기)에 직접 결합될 수 있다. 불포화 중합체에 있어서, 펩티드 항원은 중합체 중 이중 (또는 삼중) 결합과도 반응할 수 있다.
본원에 기술된 PEA, PEUR 및 PEU 중합체는 물을 손쉽게 흡수하여 (중합체 필름 상에서 5 내지 25% (w/w)의 물 흡수), 친수성 분자가 상기 중합체를 통하여 손쉽게 확산되게 한다. 이러한 특성에 의해 PEA, PEUR 및 PEU 중합체는 제어된 방출 속도로 입자 상에서 오버 코팅 (over coating)으로서 사용하기에 적합하게 된다. 물 흡수는 중합체 및 이러한 중합체를 기재로 하는 백신 전달 조성물의 생체 적합성도 증강시킨다. 또한, PEA, PEUR 및 PEU 중합체의 친수성 특성으로 인하여, 생체 내에서 전달될 경우 입자는 특히 생체 내 온도에서 점착성으로 되어 응집된다. 이와 같이, 중합체 입자는 피하용 바늘 또는 바늘이 없는 (needle-less) 주사에 의한 것과 같이 국소 전달을 위하여 피하 또는 근육내 주사될 경우, 중합체 저장체를 자발적으로 형성한다. 평균 직경 범위가 약 1 미크론 내지 약 100 미크론이고, 체내에서의 순환을 가능하게 하지 않는 크기의 입자가 생체 내에서 그러한 중합체 저장체를 형성하기에 적합하다. 대안적으로, 경구 투여에 있어서, 위장관은 훨씬 더 큰 입자, 예를 들어 약 1 미크론 내지 최대 약 1000 미크론의 평균 직경의 미세 입자를 견딜 수 있다.
예를 들어, 일반적으로, 중합체 저장체는 약 24시간, 약 7일, 약 30일, 또는 약 90일 또는 그 이상의 시간으로부터 선택되는 시간에 걸쳐 분해된다. 보다 긴 시간 범위가 이식가능한 백신 전달 조성물의 제공에 특히 적합한데, 상기 이식가능한 백신 전달 조성물은 적합한 면역 반응을 얻기 위하여 백신을 반복적으로 주사할 필요가 없게 한다.
본 발명의 백신 전달 조성물에서 사용하기에 적합한 입자는 불혼화성 용매 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 두 가지의 불혼화성 액체의 에멀젼의 제조를 필요로 한다. 단일 에멀젼 방법을 이용하여 소수성 아쥬반트 및 펩티드 항원, 또는 그의 콘쥬게이트가 혼입된 중합체 입자를 제조할 수 있다. 단일 에멀젼 방법에 있어서, 입자 내로 혼입될 분자는 먼저 용매 중 중합체와 혼합되며, 이어서 표면 안정제, 예를 들어 계면활성제로 수용액에서 유화시킨다. 이러한 방식으로, 소수성 아쥬반트, 펩티드 항원 또는 아쥬반트/펩티드 항원 콘쥬게이트를 포함하는 중합체 입자가 수용액 중에 형성 및 현탁되며, 여기서, 입자 중 소수성 콘쥬게이트는 수용액 내로의 유의한 용출 없이 안정하지만, 이러한 분자는 신체 조직, 예를 들어 근육 조직 내로 용출된다.
합성 펩티드 항원을 비롯한 대부분의 생물학적 물질 (biologics)은 친수성이다. 이중 에멀젼 방법을 이용하여 내부에 액체 또는 친수성 아쥬반트/펩티드 항원이 분산된 중합체 입자를 제조할 수 있다. 이중 에멀젼 방법에 있어서, 액체 또는 물에 용해된 친수성 아쥬반트/펩티드 항원은 먼저 중합체 용액에 유화되며, 전 에멀젼은 에 넣어져 다시 유화되어 외부 중합체 코팅 및 입자 내부의 액체 아쥬반트/펩티드 항원을 포함하는 입자를 형성한다. 계면활성제가 둘 모두의 유화 방법에서 사용되어 입자 응집을 방지할 수 있다. 물에 혼화될 수 없는 클로로포름 또는 디클로로메탄 (DCM)이 PEA 및 PEUR 중합체용 용매로서 사용되지만, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 나중에 제조에 있어서 용매를 제거한다.
그러나, 수 용해도가 낮은 소정 펩티드 항원 또는 아쥬반트에 있어서, 상기 두 가지 에멀젼 방법은 제한 사항을 갖는다. 이와 관련하여, "낮은 수 용해도"는 참으로 친유성인 약물, 예를 들어 탁솔 (Taxo)보다 덜 소수성이지만, 참으로 수-용해성인 약물, 예를 들어 다수의 생물학적 물질보다 덜 친수성인 활성제를 의미한다. 이러한 유형의 중간 화합물은 단일 에멀젼 입자로의 높은 로딩량 및 안정한 매트릭스화에 있어서 너무 친수성이며, 이중 에멀젼 내에서의 높은 로딩량 및 안정성에 있어서는 너무 소수성이다. 이러한 경우, 3회의 유화 공정에 의해 중합체 및 낮은 수 용해도를 갖는 약물로 만들어진 입자 상으로 중합체 층이 코팅된다. 이 방법에 의해 상대적으로 낮은 약물 로딩 (~10% (w/w))이 제공되지만, 구조 안정성 및 제어된 약물 방출 속도가 제공된다.
제1 에멀젼은 활성제를 중합체 용액 내로 혼합하고, 수용액 중 이 혼합물을 계면활성제 또는 지질, 예를 들어 디-(헥사데카노일)포스파티딜콜린 (DHPC; 천연 지질의 단쇄 유도체)으로 유화시킴으로써 제조된다. 이러한 방식으로, 활성제를 포함하는 입자를 물 중에 형성 및 현탁시켜 제1 에멀젼을 형성한다. 제2 에멀젼은 제1 에멀젼을 중합체 내에 넣고, 혼합물을 유화시켜서, 중합체/약물 입자를 내부에 포함하는 물 드롭이 중합체 용액 내에 형성되게 함으로써 형성한다. 물 및 계면활성제 또는 지질은 입자를 분리시키고 입자를 중합체 용액에 용해시킨다. 이어서 제3 에멀젼은 제2 에멀젼을 계면활성제 또는 지질을 포함하는 물 내로 넣고, 이 혼합물을 유화시켜 물 중 최종 입자를 형성함으로써 형성시킨다. 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, 생성된 입자 구조는 중심부에 아쥬반트를 포함하거나 포함하지 않는 중합체 플러스 펩티드 항원으로 만들어지고, 상기 중심부는 물 및 표면 안정제, 예를 들어 계면활성제 또는 지질로 둘러싸인, 순수 중합체 쉘로 싸인 하나 이상의 입자를 갖는다. 표면 안정제 및 물은 중합체 코팅 중 용매가 코팅 내부의 입자와 접촉하여 그 입자를 용해시키는 것을 방지한다.
삼중 에멀젼 방법에 의한, 활성제, 예를 들어 펩티드 항원 또는 아쥬반트의 로딩의 증가를 위하여, 수 용해도가 낮은 활성제를 중합체 코팅 없이 그리고 물에 활성제를 용해시킴이 없이 제1 에멀젼 중 표면 안정제로 코팅시킬 수 있다. 이러한 제1 에멀젼에서, 물, 표면 안정제 및 활성제는 유사한 부피를 갖거나 각각 (1 내지 3):(0.2 내지 약 2):1의 범위의 부피 비로 존재한다. 이러한 경우, 활성제를 용해시키기 위해서가 아니라 오히려 활성제를 표면 안정제의 도움으로 보호하기 위하여 물이 사용된다. 그러면 이중 및 삼중 에멀젼이 상기에 기술된 바와 같이 제조된다 (도 1).
입자의 제조에서 사용되는 에멀젼의 제조에 있어서 다수의 유화 기술이 작동한다. 그러나, 현재 바람직한 에멀젼의 제조 방법은 물에서 혼화될 수 없는 용매의 사용에 의한 것이다. 유화 절차는 중합체를 용매로 용해시키는 단계, 아쥬반트/펩티드 항원 분자(들)와 혼합시키는 단계, 물에 넣는 단계, 이어서 교반기 및/또는 초음파기로 교반시키는 단계로 구성된다. 입자 크기는 교반 속도 및/또는 중합체, 아쥬반트/펩티드 항원 분자(들) 및 표면 안정제의 농도를 제어함으로써 제어할 수 있다. 코팅 두께는 제2 에멀젼 대 제3 에멀젼의 비를 조정함으로써 제어할 수 있다. 상기에 기술된 임의의 입자 형성 방법에서, 항원 펩티드 및 선택적 아쥬반트는 입자 형성 후 입자에서 중합체에의 콘쥬게이션에 의해 표면 입자 상에 코팅을 형성할 수 있다.
적합한 에멀젼 안정제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 만니드 모노올레에이트, 덱스트란 70,000, 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리글리콜 에테르 등을 포함할 수 있으며, 이 모두는 예를 들어 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemical Co.로부터 손쉽게 구매가능하다. 계면활성제는 약 0.3% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 8%, 더 바람직하게는 약 1% 내지 약 5%의 농도로 존재한다.
조성물로부터의 아쥬반트/펩티드 항원의 방출 속도는 코팅 두께, 입자의 외부를 싸고 있는 항원의 갯수, 입자 크기, 구조, 및 코팅의 밀도를 조정함으로써 제어할 수 있다. 코팅의 밀도는 코팅 중 아쥬반트/펩티드 항원의 로딩을 조정함으로써 조정할 수 있다. 코팅이 아쥬반트/펩티드 항원을 전혀 포함하지 않을 경우, 중합체 코팅이 가장 조밀하며, 아쥬반트/펩티드 항원은 코팅을 통하여 가장 느리게 용출된다. 이와는 대조적으로, 아쥬반트/펩티드 항원이 코팅 내로 로딩될 경우, 코팅은 코팅의 외면으로부터 출발하여 일단 아쥬반트/펩티드 항원이 용출되었으면 다공성으로 되며, 따라서 입자 중심부의 아쥬반트/펩티드 항원이 증가된 속도로 용출될 수 있다. 약물 로딩량이 클수록, 코팅층의 밀도는 보다 낮아지며 용출 속도는 보다 커진다. 코팅 중 아쥬반트/펩티드 항원의 로딩량은 외부 코팅 아래의 입자의 내부에서보다 작을 수 있다. 입자로부터의 아쥬반트/펩티드 항원의 방출 속도는 상기에 기술한 바와 같이 제조된, 방출 속도가 상이한 입자를 혼합함으로써 또한 제어할 수 있다.
이중 및 삼중 에멀젼 중합체의 제조 방법에 대한 상세한 설명은 Pierre Autant 등의 미국 특허 제6,022,562호 - 발명의 명칭: Medicinal and/or nutritional microcapsules for oral administration - ; 문헌[Iosif Daniel Rosea et al., Microparticle formation and its mechanism in single and double emulsion solvent evaporation, Journal of Controlled Release (2004) 99:271-280]; 문헌[L. Mu and S.S. Feng, A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E (TPGS, J. Control. Release (2003) 86:33- 48]; 문헌[Somatosin containing biodegradable microspheres prepared by a modified solvent evaporation method based on W/O/W-multiple emulsions, Int. J. Pharm. (1995) 126:129- 138] 및 문헌[F. Gabor et al., Ketoprofenpoly(d,l-lactic-co-glycolic acid) microspheres: influence of manufacturing parameters and type of polymer on the release characteristics, J. Microencapsul. (1999) 16 (1):1- 12]에서 발견할 수 있으며, 이들 각각은 본원에 그의 전체 내용이 포함되어 있다.
수용성 펩티드 항원 및/또는 아쥬반트의 전달에 있어서의 또 다른 실시 형태에 있어서, 입자는 순환체에의 전달에 있어서 평균 직경이 약 20nm 내지 약 200 nm인 나노입자로 만들어질 수 있다. 나노입자는 내부에 펩티드 항원이 분산된 단일 에멀젼 방법으로 제조될 수 있는데, 즉, 본원에 기술된 바와 같이 에멀젼 내로 혼합하거나 중합체에 콘쥬게이션시킨다. 또한 나노입자는 본원에 기술된 PEA 또는 PEUR 중합체를 포함하는 미셸로서 제공될 수 있다. 미셸이 물 중에 형성되며, 선택적 아쥬반트 단백질을 포함하는 수용성 항원은 용매 없이 동시에 미셸 내로 로딩된다.
더욱 특히는, 도 2에 도시되어 있는 생분해성 미셸은 수용성 이온화 중합체 사슬이 소수성 중합체 사슬에 콘쥬게이션된 것으로 형성된다. 반면, 미셸의 외부 부분은 중합체의 수용성 이온화 단편부로 주로 구성되며, 중합체의 소수성 단편부는 미셸의 내부로 주로 분배되어 중합체 분자들을 결합시킨다.
본원에 기술된 바와 같이, 미셸의 제조에 사용되는 중합체의 생분해성 소수성 단편부는 PEA, PEUR 또는 PEU 중합체로 만들어진다. 강력 소수성 PEA, PEUR 또는 PEU 중합체에 있어서, 1,4:3,6-디언히드로-D-소르비톨의 디-L-류신 에스테르 또는 강성 방향족 이산, 예를 들어 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸과 같은 구성 요소가 중합체 반복 단위에 포함될 수 있다. 이와는 대조적으로, 중합체의 수용성 단편부는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리글리코사미노글리칸 또는 다당류 및 적어도 하나의 이온화가능하거나 극성인 아미노산의 교대 반복 단위를 포함하며, 여기서, 교대 반복 단위는 실질적으로 유사한 분자량을 갖고, 중합체의 분자량은 약 10 kD 내지 약 300 kD 범위이다. 수용성 단편부의 분자량이 보다 클수록, 미셸의 다공도는 보다 커지며, 보다 긴 사슬은 수용성 항원 및 선택적 아쥬반트의 큰 로딩량을 가능하게 한다. 또한, 폴리아미노산은 단일 아미노산보다 면역원성이 더 크다.
교대 반복 단위는 약 300D 내지 약 700D 범위의 실질적으로 유사한 분자량을 가질 수 있다. 중합체의 분자량이 10 kD를 초과하는 일 실시 형태에 있어서, 아미노산 단위들 중 적어도 하나는 세린, 글루탐산, 아스파르트산, 라이신 및 아르기닌으로부터 선택되는 이온화가능하거나 극성인 아미노산이다. 일 실시 형태에 있어서, 이온화가능한 아미노산의 단위는 이온화가능한 폴리(아미노산), 예를 들어 글루타메이트 또는 아스파르테이트의 적어도 하나의 블록을 포함하며, 이는 중합체 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 미셸형 조성물은 중합체의 수용성 단편부 중 이온화가능한 아미노산의 적어도 일부가 이온화되는 pH 값을 갖는 약학적으로 허용가능한 수성 매질을 추가로 함유할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 생분해성 소수성 중합체 사슬은 PEA, PEUR 또는 PEU 중합체로 만들어진다. 강력 소수성 PEA, PEUR 또는 PEU에 있어서, 1,3-비스(-4-카르복실레이트-페녹시)-프로판 (CPP) 및/또는 -1,4:3,6-디언히드로헥시톨-D-소르비톨 (DAS)의 비스(-L-류신) 디에스테르와 같은 구성 요소가 소수성 중합체 사슬 중에 포함될 수 있다. 이와는 대조적으로, 수용성 사슬은 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG) 및 이온화가능한 아미노산, 예를 들어, (폴리)라이신 또는 (폴리)글루타메이트의 다수의 반복 단위로 만들어지며, 여기서, PEG 단위 및 이온화가능한 아미노산은 유사한 분자량, 예를 들어 수백 kD을 갖는다 (즉, PEG 단위는 이 범위 내의 실질적으로 임의의 값의 분자량을 가질 수 있음). 그러나, 중합체의 수용성 단편부의 총 분자량은 예를 들어 약 1O kD 내지 약 30O kD 범위일 수 있다. 수용성 단편부의 분자량이 보다 클수록, 미셸의 다공도는 보다 커지며, 보다 긴 사슬은 수용성 항원 및 선택적 아쥬반트의 큰 로딩량을 가능하게 한다. 또한, 폴리아미노산은 단일 아미노산보다 면역원성이 더 크다.
미셸 내의 하전된 부분은 물에서 서로로부터 부분적으로 분리되며, 수용성 약제, 예를 들어 펩티드 항원 및 선택적 단백질 아쥬반트의 흡수를 위한 공간을 생성한다. 동일한 유형의 전하를 갖는 이온화된 사슬은 서로 반발하여 더욱 큰 공간을 생성한다. 또한 이온화된 중합체는 펩티드 항원을 끌어당겨서, 안정성을 매트릭스에 제공한다. 또한, 수용성 미셸 외부는 이온화된 부위가 치료제에 의해 취해진 후 체액에서 미셸이 단백질에 점착하는 것을 방지한다. 이러한 유형의 미셸은 미셸 부피의 최대 95%까지의 매우 큰 다공도를 가져서, 수용성 생물학적 물질, 예를 들어 펩티드 항원 및 항원의 큰 로딩량을 허용한다. 미셸의 입자 크기 범위는 약 20 nm 내지 약 200 nm이며, 약 20 nm 내지 약 100 nm가 혈중 순환에 바람직하다.
조성물로부터의 아쥬반트/펩티드 항원의 방출 속도는 코팅 두께, 입자의 외부를 싸고 있는 항원의 갯수, 입자 크기, 구조, 및 코팅의 밀도를 조정함으로써 제어할 수 있다. 코팅의 밀도는 코팅 중 아쥬반트/펩티드 항원의 로딩을 조정함으로써 조정할 수 있다. 코팅이 아쥬반트/펩티드 항원을 전혀 포함하지 않을 경우, 중합체 코팅이 가장 조밀하며, 아쥬반트/펩티드 항원은 코팅을 통하여 가장 느리게 용출된다. 이와는 대조적으로, 아쥬반트/펩티드 항원이 코팅 내로 로딩될 경우, 코팅은 코팅의 외면으로부터 출발하여 일단 아쥬반트/펩티드 항원이 용출되었으면 다공성으로 되며, 따라서 입자 중심부의 아쥬반트/펩티드 항원이 증가된 속도로 용출될 수 있다. 약물 로딩량이 클수록, 코팅층의 밀도는 보다 낮아지며 용출 속도는 보다 커진다. 코팅 중 아쥬반트/펩티드 항원의 로딩량은 외부 코팅 아래의 입자의 내부에서보다 작을 수 있다. 입자로부터의 아쥬반트/펩티드 항원의 방출 속도는 상기에 기술한 바와 같이 제조된, 방출 속도가 상이한 입자를 혼합함으로써 또한 제어할 수 있다.
입자 크기는 예를 들어 헬륨-네온 레이저가 포함된 분광계를 사용하여, 예를 들어 레이저 광 산란법으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 입자 크기는 실온에서 측정되며, 입자 직경에 있어서의 평균 값을 생성하기 위하여 당해 샘플의 다수의 분석 (예를 들어, 5-10회)을 포함한다. 또한, 입자 크기는 주사 전자 현미경 (scanning electron microscopy, SEM)을 이용하여 손쉽게 측정된다. 그렇게 하기 위하여, 건조 입자를 금/팔라듐 혼합물로 대략 100 옹스트롬의 두께로 스퍼터 코팅하고 (sputter-coated), 이어서 주사 전자 현미경을 사용하여 조사한다. 대안적으로는, 입자의 형태 또는 그 외의 형태의 중합체는 당업계에 잘 알려진, 그리고 본원에서 하기에 기술한 바와 같이 임의의 여러 방법을 이용하여 화학적 부착 없이 펩티드 항원을 내부에 혼입 ("로딩" 또는 "매트릭스화")한다기보다는 오리혀 펩티드 항원에 직접적으로 공유 결합에 의해 부착할 수 있다. 펩티드 항원 함량은 일반적으로 중합체에 대하여 대략 0.1% 내지 약 40% (w/w)의 펩티드 항원, 더 바람직하게는 약 1% 내지 약 25% (w/w)의 펩티드 항원, 더욱 더 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% (w/w)의 펩티드 항원을 나타내는 양으로 존재한다. 펩티드 항원의 백분율은, 하기에 더욱 상세하게 논의되어 있는 바와 같이, 요망되는 용량 및 치료되는 질병에 따라 달랒ㄹ 것이다. 펩티드 항원이 로딩된, 아쥬반트를 포함하거나 포함하지 않는 입자 또는 중합체 분자의 제조 후, 조성물을 동결 건조시키고 건조된 조성물을 적절한 비히클에 현탁시킨 후 면역화할 수 있다.
백신 전달 조성물에 함유되는, 펩티드 항원 및 임의의 아쥬반트를 포함하는 임의의 적합하고 유효한 양의 면역원성 입자 또는 중합체 단편은 중합체 입자 (생체 내에서 형성되는 중합체 저장체 중의 것을 포함함)로부터 시간이 지남에 따라 방출될 수 있으며, 상기의 적합하고 유효한 양은 일반적으로 예를 들어 특정 중합체, 펩티드 항원, 아쥬반트 또는 중합체/펩티드 항원 결합 - 존재할 경우 - 에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 최대 약 100%의 중합체 입자 또는 분자가 중합체 저장체로부터 방출될 수 있다. 구체적으로는 그의 최대 약 90%, 최대 75%, 최대 50%, 또는 최대 25%가 중합체 저장체로부터 방출될 수 있다. 일반적으로 중합체로부터의 방출 속도에 영향을 주는 요인은 중합체의 성질 및 양, 중합체/펩티드 항원 결합의 유형 및/또는 중합체/생활성제 결합, 및 제형 중에 존재하는 부가적인 물질의 성질 및 양이다.
상기와 같이, 일단 본 발명의 백신 전달 조성물이 만들어지면, 이 조성물은 후속적인 점막 또는 피하 전달용으로 제형화된다. 본 조성물은 일반적으로 점막 또는 피하 전달에 적절한 하나 이상의 "약학적으로 허용가능한 부형제 또는 비히클", 예를 들어, 물, 염수, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 에탄올 등을 함유할 것이다. 부가적으로, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 존재할 수도 있다.
예를 들어, 비강내 및 폐용 제형은 일반적으로 비강 점막에 대하여 자극을 야기하지도 않고 섬모 기능을 유의하게 방해하지도 않는 비히클을 포함할 것이다. 희석제, 예를 들어 물, 수성 염수 또는 기타 공지된 물질이 본 발명에서 이용될 수 있다. 비강용 제형은 한정됨이 없이 클로로부탄올 및 벤즈알코늄 클로라이드와 같은 방부제를 또한 함유할 수 있다. 계면활성제가 비강 점막에 의한 흡수의 증강을 위하여 존재할 수도 있다.
직장 및 요도용 좌약에 있어서, 비히클은 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 코코아 버터 (테오브로마유) 또는 기타 트리글리세라이드, 에스테르화, 수소화 및/또는 분획화로 개질된 식물유, 그리세린화 젤라틴, 폴리알칼린 글리콜, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물 및 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르를 포함한다.
질 전달에 있어서, 본 발명의 제형은 페서리 베이스, 예를 들어 폴리에틸렌 트리글리세라이드의 혼합물을 포함하거나 오일, 예를 들어 옥수수유 또는 참기름에 현탁된 것 - 선택적으로 콜로이드성 실리카를 포함함 - 에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Richardson et al., Int. J. Pharm. (1995) 115: 9-15]을 참조한다.
특정 전달 양식에 사용하기 위한 적절한 비히클에 대한 추가의 논의에 대해서는, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995]을 참조한다. 당업계의 숙련자라면 특정 항원 및 전달 부위에 사용하기 위한 적당한 비히클을 손쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 "유효량"의 목적 펩티드 항원을 함유할 수 있다. 즉, 증상을 예방하거나, 감소시키거나 제거하기 위하여 대상이 충분한 면역학적 반응을 생성하게 하는 양의 항원이 조성물 중에 함유될 것이다. 필요한 정확한 양은 다른 요인들 중에서도 치료되는 대상; 치료될 대상의 연령 및 종합적인 상태; 항체를 합성하는 대상의 면역계의 역량; 요망되는 보호 정도; 치료되는 질병의 중증도; 선택되는 특정 항원 및 그의 투여 양식에 따라 달라진다. 적당한 유효량은 당업계의 숙련자에 의해 손쉽게 결정될 수 있다. 이와 같이, "유효량"은 일상적인 시험을 통하여 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위가 된다. 예를 들어, 본 발명의 목적상, 유효 용량은 일반적으로 투약 당 전달되는 항원이 약 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 5 ㎍ 내지 약 1 mg, 또는 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍ 범위이다.
본 발명의 조성물은, 일단 제형화되면 표준 기술을 이용하여 주사에 의해 점막 또는 피하 투여된다. 예를 들어, 비강내, 폐, 질 및 직장 기술을 비롯한 점막 전달 기술에 대해서는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995]을 참조하며, 이외에도, 비강내 투여 기술에 대해서는 유럽 특허 공보 제517,565호 및 문헌[Ilium et al, J. Controlled Rel (1994) 29:133-141]을 참조한다.
투여 치료는 본 발명의 시간에 따라 방출되는 백신 전달 조성물의 1회 투약, 또는 당업계에 공지된 바와 같이 다회 투약 일정일 수 있다. 효능 촉진제는 일차 면역 반응용으로 주어지는 동일 제형과 함께일 수도 있거나, 항원을 포함하는 상이한 제형과 함께일 수 있다. 또한 투여 섭생법은 적어도 부분적으로는 대상의 필요에 의해 결정되며 개업의의 판단에 따라 달라진다. 또한, 질환의 예방이 요망될 경우, 본 백신 전달 조성물은 일반적으로 목적 병원체의 일차 감염 이전에 투여된다. 치료가 요망되는 경우, 예를 들어 증상 또는 재발의 감소가 요망되는 경우, 본 백신 전달 조성물은 일반적으로 일차 감염 이후에 투여된다.
본 발명의 조성물은 피하 또는 점막 전달 연구용으로 개발된 다수의 동물 모델에서 생체 내에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 의식 양 모델이 당 기술 분야가 인정하는 물질의 비강 전달 시험용 모델이다. 예를 들어, 문헌[Longenecker et al, J. Pharm. Sci (1987) 76:351-355] 및 문헌[Ilium et al., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141]을 참조한다. 일반적으로 분말화된, 동결 건조된 형태의 백신 전달 조성물은 비강 내로 취입된다. 핼액 샘플은 상기에 기술된 바와 같이 당업계에 공ㅈ된 표준 기술을 이용하여 항체 역치에 대하여 분석될 수 있다. 세포 면역 반응도 상기에 기술된 바와 같이 모니터링될 수 있다.
현재, 제공자 유래의 세포를 이용하는 세포 매개 면역 반응에 대한 일련의 시험관 내 분석법이 존재한다. 이 분석법은 세포가 제공자로부터 유래되는 상황을 포함하지만, 다수의 분석법은 다른 원천, 예를 들어 B 세포주 유래의 항원 제시 세포 원천을 제공한다. 이러한 시험관 내 분석법은 세포 독성 T 림프구 분석법; 림프 증식 분석법, 예를 들어, 삼중 수소화 티미딘 혼입법; 단백질 키나아제 분석법, 이온 수송 분석법 및 림프구 이동 저해 기능 분석법을 포함한다 (문헌[Hickling, J. K. et al. (1987) J. Virol., 61: 3463]; 문헌[Hengel, H. et al. (1987) J. Immunol., 139: 4196]; 문헌[Thorley-Lawson, D. A. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 84: 5384]; 문헌[Kadival, G. J. et al. (1987) J. Immunol, 139: 2447]; 문헌[Samuelson, L. E. et al. (1987) J. Immunol, 139: 2708]; 문헌[Cason, J. et al. (1987) J. Immunol Meth., 102:109]; 및 문헌[Tsein, R. J. et al. (1982) Nature, 293: 68]). 이러한 분석법은 세포 매개 면역 활성에 대한 진정한 특이성이 결여될 수 있고, 동일한 MHC 유형의 APC에 의한 항원 프로세싱 및 제시를 필요로 하며, 느리고 (때로, 수일간 지속됨), 몇몇은 주관적이고/이거나 방사성 동위원소를 필요로 한다는 점에서 불리하다.
T-세포에 의해 인식되는 펩티드가 T-세포를 활성화하여 면역 반응을 생성하는지를 시험하기 위하여, 소위 "기능 시험"이 이용된다. 마이크로플레이트 상에서의 사이토카인 또는 이펙터 분자에 특이적인 단일클론 항체의 부착에 의한 ELISpot (enzyme-linked immunospot) 분석법을 특정 사이토카인을 분비하는 개개의 세포 또는 기타 이펙터 (effector) 분자에 대하여 채용하였다. 항원에 의해 자극된 세포를 고정시킨 항체와 접촉시킨다. 세포 및 모든 미결합 물질의 세척 후, 태깅된 (tagged) 다클론 항체 또는 더욱 흔히는 단일클론 항체 - 동일한 사이토카인 또는 기타 이펙터 분자에 특이적임 - 를 웰에 첨가한다. 세척 후, 사이토카인 국소화 부위에 짙은 남색 침전물 (또는 스폿)이 형성되도록 태깅된 항체에 결합하는 착색제를 첨가한다. 스폿을 수동으로 계수하거나 자동화 ELISpot 판독 조성물로 계수하여 상기 반응을 정량화할 수 있다. 시험 펩티드에 의한 T-세포 활성화의 최종 확인은 생체 내 시험, 예를 들어 생쥐 또는 기타 동물 모델에서의 시험을 필요로 할 수도 있다.
자명하듯이, 본 발명의 백신 전달 조성물은 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균류에 대한 면역 반응의 유도, 이러한 병원체에 의해 야기되는 매우 다양한 질환 및 감염의 치료 및/또는 예방과, 다양한 종양 항원에 대한 면역 반응의 촉진에 유용하다. 상기에 기술한 바와 같이, 본 조성물은 치료용 또는 예방용으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 예를 들어 진단용의 다클론 및 단일클론 항체와, 목적 항원의 면역정제용의 다클론 및 단일클론 항체의 제조를 위해서도 사용될 수 있다. 다클론 항체가 요망될 경우, 선택된 포유류 (예를 들어 생쥐, 토끼, 염소, 말 등)를 본 발명의 조성물로 면역화한다. 동물은 선택적으로 항원을 1회 이상 투여한지 2-6주 후에 추가 접종한다 (boost). 이어서 다클론 항혈청이 면역화 동물로부터 얻어지며 공지된 절차에 따라 처리된다. 예를 들어, 문헌[Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370]을 참조한다.
단일클론 항체는 일반적으로 문헌[Kohler and Milstein, Nature (1975) 256:495-96]의 방법 또는 그의 변형 방법을 이용하여 제조된다. 일반적으로, 생쥐 또는 쥐는 상기에 기술한 바와 같이 면역화된다. 그러나, 혈청의 추출을 위하여 동물을 채혈하기보다는 오히려, 비장 (및 선택적으로 여러 큰 림프절)을 제거하여 단일 세포로 분리시킨다. 요망될 경우, 비장 세포는 (비특이적 유착 세포의 제거 후) 세포 현탁물을 단백질 항원으로 코팅된 플레이트 또는 웰에 적용함으로써 스크리닝할 수 있다. 항원에 특이적인 막 결합 면역글로불린을 발현하는 B 세포는 플레이트에 결합될 것이며, 이는 상기 현탁물의 나머지로 헹구어지지 않는다. 이어서, 생성된 B 세포, 또는 모든 분리된 비장 세포는 골수종 세포와 융합되게 되고, 선택 배지 (예를 들어, 하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘 배지, "HAT")에서 배양된다. 생성된 하이브리도마는 한계 희석법으로 도말하고, 면역화 항원에 특이적으로 결합하는 (그리고 관련되지 않은 항원에는 결합하지 않는) 항체의 생성에 대하여 분석한다. 이어서, 선택된 단일클론 항체-분비 하이브리도마는 시험관 내에서 (예를 들어, 조직 배양용 병 또는 중공 섬유 반응기에서), 또는 생체 내에서 (생쥐에서 복수 (ascites)로서) 배양한다. 예를 들어, 문헌[M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980)]; 문헌[Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981)]; 문헌[Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980)]을 참조하며; 또한, 미국 특허 제4,341,761호; 동 제4,399,121호; 동 제4,427,783호; 동 제4,444,887호; 동 제4,466,917호; 동 제4,472,500호; 동 제4,491,632호; 및 동 제4,493,890호를 참조한다. 목적 폴리펩티드에 대하여 생성되는 단일클론 항체의 패널은 다양한 특성, 예를 들어, 이소타입, 에피토프, 친화도 등에 대하여 스크리닝될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하려는 것이지 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1
PEA-항원 콘쥬게이트의 합성
PEA 숙신이미딜 에스테르 (PEA- OSu )의 합성. 모든 실시예는 N-아세틸화 중합체 (A)로부터의 것이다. 반복 단위 당 PEA 1.392g, 754μM - MW=1845에 대하여 계산됨 - (화학식 I, R1 = (CH2)8; R2 = H; R3 = (CH3)2CHCH2; R4 = (CH2)6; n = 70; m/m+p=0.75 및 p/m+p=0.25)을 교반하면서 7 ml의 무수 DMF에 용해시켰다. 약간 점성인 PEA 용액에 N-히드록시숙신이미드 (NHS), 0.11O g, 955 μM을 고형물로서 첨가하였다. 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드, 146 mg, 759.8 μM을 DMF 중 현탁물로서 옮겼다. 반응용 DMF의 총 부피는 10 ml이었다. 반응은 질소 분위기 하에 실온에서 24시간 동안 실시하였다.
PEA-인플루엔자 펩티드 콘쥬게이트의 합성:
B1) PEA-펩티드 콘쥬게이트 (화학식 IV, R1 = (CH2)8;; R3 = (CH3)2CHCH2; R4 = (CH2)6; R5 = NH; n = 70; m/m+p=0.75 및 p/m+p=0.25 및 R7 = PKYVKQNTLKLAT)의 합성은 DMF 중 활성화 에스테르 (A)의 49.5 μM 분취물 및 96 mg (49.5 μM)의 H-PKYVKQNTLKLAT-OH를 트리플루오로아세트산 염으로서 이용하여 수행하였다. 펩티드를 용해시키고, 5 ml의 DMSO 중 활성화 에스테르에 옮겼다. 1 당량, 즉, 49.5 μM의 에틸-디이소프로필아민을 첨가하고, 반응을 질소 하에 24시간 동안 계속하였다. 300 μl의 DMSO 중 30 μl의 증류수를 첨가하고, 교반을 실온에서 추가의 4시간 동안 계속하였다.
반응 혼합물을 디에틸 에테르 (60 ml)에서 침전시키고, 원심분리 후, 얻어진 물질을 15 ml의 디에틸 에테르로 3회 세척하였다. 공기 건조 후, 얻어진 생성물을 1분 동안의 초음파 처리 하에 증류수 5 ml로 3회 처리하였다. 원심분리 후, 얻어진 물질을 동결 건조시켰다. 수율: 86mg, 47%.
B2) PEA-펩티드 콘쥬게이트 (화학식 IX, R5-R7-R5를 통하여 가교결합됨, 여기서, R1 = (CH2)8; R3 = (CH3)2CHCH2; R4 = (CH2)6; R5 = NH; n = 70; m/m+p=0.75 및 p/m+p=0.25 및 R7 = PKYVKQNTLKLAT)의 합성은 DMF (600 μl) 중 활성화 에스테르 (A)의 37.7 μM 분취물 및 74 mg (37.7 μM)의 H-PKYVKQNTLKLAT-OH를 트리플루오로아세트산 염으로서 이용하여 수행하였다. 펩티드를 용해시키고 0.8 ml의 DMSO (디메틸술폭시드) 중 활성화 에스테르에 옮겼다. 4 당량, 즉, 198 μM의 에틸-디이소프로필아민을 첨가하고, 반응을 질소 하에 48시간 동안 계속하였다. 가만히 따름으로써 투명한 겔 유사 물질을 유기 용매로부터 분리하였다. 2-3 mm의 큰 조각으로 절단한 후, 생성물을 +4℃에서 18시간 동안 17 ml의 증류수로 처리하였다. 원심분리하고 가만히 따라낸 후, 이 물질을 17 ml의 증류수로 2회 (매번 3시간) 처리하고, 마지막으로 원심분리한 후 생성물을 동결 건조시켰다. 수율: 75mg, 53%.
B3) PEA-펩티드 콘쥬게이트 (R5-R7-R5를 통하여 가교결합된 화학식 IX, 여기서, R1 = (CH2)8; R3 = (CH3)2CHCH2; R4 = (CH2)6; R5 = NH; n = 8; m/m+p=0.75 및 p/m+p=0.25 및 R7 = PKYVKQNTLKLAT)의 합성은 (A)와 유사한 방식으로 합성된, DMF (600 μl) 중 41.2 μM의 활성화된 에스테르와, 40 mg (20.6 μM)의 H-PKYVKQNTLKLAT-OH를 트리플루오로아세트산 염으로서 이용하여 수행하였다. 펩티드를 용해시키고 5 ml의 DMSO 중 활성화 에스테르에 옮겼다. 4 당량, 즉, 80 μM의 에틸-디이소프로필아민을 첨가하고, 반응을 질소 하에 72시간 동안 계속하였다. 300 μl의 DMSO 중 75 μl (4.2 mM)의 증류수를 첨가하고, 교반을 추가로 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 24 ml의 물/아세톤 (1:1 (v/v))에서 침전시켰다. 생성된 침전물을 +4℃에서 매번 약 1시간 동안 증류수 12 ml로 4회 처리하고, 이어서 원심분리하였다. 마지막 원심분리 후, 생성물을 동결 건조시켰다. 수율: 50 mg, 45%.
시험관 내에서의 인간 T 세포 반응의 프로토콜의 요약
CD4+ T 세포 및 단구를 인간 제공자의 말초 혈액으로부터 단리한다. 단구를 사이토카인 풍부 배지에서 48시간 동안 배양하여 수지상 세포 (항원 제시 세포)로의 분화를 유도한다. 24시간의 상기 배양 기간 동안, PEA 또는 PEA-헤마글루티닌 펩티드 (307-319) 콘쥬게이트를 배지에 첨가한다. 수지상 세포와 T 세포의 공동 배양을 시작하기 2시간 전에, 자유 펩티드를 대조 웰에 첨가한다. 수지상 세포와 함께 배양한 T 세포를 48시간, 72시간 및 96시간에서의 증식 및 사이토카인 분비에 의한 활성화에 대하여 측정한다. T 세포 반응 프로토콜의 개략도가 본원의 도 3에 도시되어 있다.
중합체-펩티드 콘쥬게이트에 노출시킨 수지상 세포에 반응하는 T-세포의 활성화를 상기 프로토콜을 이용하여 시험하였다. 도 4A에는 96시간에 걸친 T-세포 증식률이 도시되어 있는데, 여기서, PEA-펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 또는 PEA 단독에 비하여 상당한 증식을 자극하였다. 도 4B에는 96시간에 걸친 T-세포에 의한 IL-2의 분비가 도시되어 있는데, 여기서, PEA-펩티드 (화학식 III, 실시예 B1)는 펩티드 또는 PEA 단독과 비교하여 상당한 IL-2 분비를 자극하였다.
개별적으로 참고로 포함된 것처럼, 모든 간행물, 특허 및 특허 문헌이 본원에 참고로 포함된다. 본 발명은 다양한 특정의 바람직한 실시 형태 및 기술을 참고로 하여 기술되었다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범주 내에 남아 있으면서 다수의 변화 및 변형이 가해질 수도 있음을 이해하여야 한다.
본 발명을 상기 실시예를 참고로 하여 기술하였지만, 본 발명의 정신 및 범주 내에는 변형 및 변화가 포함된다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 특허 청구의 범위에 의해서만 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIVAS, LLC TURNELL, William G. VASSILEV, Vassil P. DeFIFE, Kristin M. LI, Hong GOMURASHVILI, Zaza D. KATSARAVA, Ramaz <120> VACCINE DELIVERY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> MEDIV2050-3WO <150> US 60/759,179 <151> 2006-01-13 <150> US 60/748,486 <151> 2005-12-07 <150> US 60/742,188 <151> 2005-12-02 <150> US 60/719,950 <151> 2005-09-22 <150> US 60/689,003 <151> 2005-06-08 <150> US 60/687,570 <151> 2005-06-03 <150> US 60/649,289 <151> 2005-02-01 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Ser Lys Val Ser Phe Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln 20 25 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 Ile Phe Pro Gly Lys Arg Thr Ile Val Ala Gly Gln Arg Gly Arg 1 5 10 15 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 15 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10

Claims (68)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 생분해성 폴리(에스테르 아미드)(PEA) 중합체,
    하기 화학식 III으로 표시되는 PEA 중합체,
    하기 화학식 IV로 표시되는 폴리(에스테르 우레탄)(PEUR) 중합체,
    하기 화학식 V로 표시되는 PEUR 중합체,
    하기 화학식 VI으로 표시되는 폴리(에스테르 우레아)(PEU), 또는
    하기 화학식 VII로 표시되는 PEU
    의 입자 또는 분자에 콘쥬게이션된 하나 이상의 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 펩티드 항원의 유효량을 포함하는 백신 전달 조성물:
    [화학식 I]
    Figure 112007060428012-PCT00036
    [상기 화학식 I에서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며; R1은 독립적으로 α,ω-비스(4-카르복시페녹시)-(C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산, (C2-C20) 알킬렌, 또는 (C2-C20) 알케닐렌의 잔기로부터 선택되며; 개개의 n 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)로 구성된 군 으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시, (C2-C20) 알킬렌, 포화 또는 불포화 치료성 디올 잔기, 하기 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 (bicyclic) 단편, 및 그의 조합, (C2-C20) 알킬렌, 및 (C2-C20) 알케닐렌으로 구성된 군으로부터 선택된다.]
    [화학식 II]
    Figure 112007060428012-PCT00037
    [화학식 III]
    Figure 112007060428012-PCT00038
    [상기 화학식 III에서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며, m은 약 0.1 내지 0.9 범위이며, p는 약 0.9 내지 0.1 범위이며; R1은 독립적으로 α,ω-비스(4-카르복시페녹시)-(C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산, (C2-C20) 알킬렌, 또는 (C2-C20) 알케닐렌의 잔기로부터 선택되며; 각각의 R2는 독립적으로 수소, (C1-C12) 알킬 또는 (C6-C10) 아릴 또는 보호기이 며; 개개의 m 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시, (C2-C20) 알킬렌, 포화 또는 불포화 치료성 디올 잔기 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.]
    [화학식 IV]
    Figure 112007060428012-PCT00039
    [상기 화학식 IV에서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며; R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 및 -(CH2)2S(CH3)로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 포화 또는 불포화 치료성 디올 잔기, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭 단편, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로부터 선택된다.]
    [화학식 V]
    Figure 112007060428012-PCT00040
    [상기 화학식 V에 있어서, n은 약 5 내지 약 150 범위이며, m은 약 0.1 내지 약 0.9 범위이며, p는 약 0.9 내지 약 0.1 범위이며; R2는 독립적으로 수소, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬, 또는 보호기로부터 선택되며; 개개의 m 단량체 중 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 포화 또는 불포화 치료성 디올 잔기 및 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며; R6은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌 또는 알킬옥시, 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 포화 또는 불포화 치료성 디올 잔기의 유효량, 및 그의 조합으로부터 선택된다.]
    [화학식 VI]
    Figure 112007060428012-PCT00041
    [상기 화학식 VI에서, n은 약 10 내지 약 150이며; 개개의 n 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로부터 선택되며; R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 포화 또는 불포화 치료성 디올 잔기; 또는 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편으로부터 선택된다.]
    [화학식 VII]
    Figure 112007060428012-PCT00042
    [상기 화학식 VII에서, m은 약 0.1 내지 약 1.0이며; p는 약 0.9 내지 약 0.1이며; n은 약 10 내지 약 150이며; 각각의 R2는 독립적으로 수소, (C1-C12) 알킬 또는 (C6-C10) 아릴이며; 개개의 m 단량체 내의 R3은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C6-C10) 아릴 (C1-C20) 알킬 및 -(CH2)2S(CH3)으로부터 선택되며; 각각의 R4는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌, (C2-C20) 알케닐렌, (C2-C8) 알킬옥시 (C2-C20) 알킬렌, 포화 또는 불포화 치료성 디올 잔기; 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편, 및 그의 조합으로부터 선택된다.]
  2. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 5 내지 약 30개의 아미노산을 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 중합체 입자 또는 분자의 분산물로 제형화한 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 중합체가 화학식 I 또는 화학식 III으로 표시되는 PEA인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 R1이 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산, 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산의 잔기이거나, 하나 이상의 R4가 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편인 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 하나 이상의 R1이 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산, 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산의 잔기, 또는 그 조합이거나, 하나 이상의 R4가 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 중합체가 화학식 IV 또는 V로 표시되는 PEUR인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 R1이 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산, 또는 4,4'-(알칸디오일디옥시)디신남산의 잔기이거나, 하나 이상의 R4가 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 하나 이상의 R1이 α,ω-비스 (4-카르복시페녹시) (C1-C8) 알칸, 3,3'-(알칸디오일디옥시)디신남산, 또는 4,4'(알칸디오일디옥시)디신남산의 잔기, 또는 그 조합이거나, 하나 이상의 R4가 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨의 비시클릭-단편인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 중합체가 화학식 VI 또는 화학식 VII로 표시되는 PEU인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 R1이 화학식 II의 1,4:3,6-디언히드로헥시톨 의 비시클릭-단편인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 생체 내 투여시 서방형(time release) 중합체 저장체를 형성하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 24시간, 약 7일, 약 30일 또는 약 90일의 기간에 걸쳐 생분해되는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 조성물은 평균 입자 직경이 약 10 나노미터 내지 약 1000 미크론 범위인 입자 형태이고, 상기 입자의 각 중합체 분자 내에 하나 이상의 펩티드 항원이 분산된 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 입자는 중합체 외피(covering)를 더 포함하는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 입자의 평균 입자 직경이 약 10 나노미터 내지 약 10 미크론 범위인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 입자가 중합체 분자 당 약 5 내지 약 150개의 펩티드 항원을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 중합체 분자의 평균 분자량이 약 5,000 내지 약 300,000 범위이며, 중합체 분자에 하나 이상의 펩티드 항원이 콘쥬게이션된 것인 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 중합체 분자에 약 5 내지 약 70개의 펩티드 항원이 콘쥬게이션된 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 중합체는 하기 화학식 VIII로 표시되는 중합체-항원 콘쥬게이트 내에 포함되는 것인 조성물:
    [화학식 VIII]
    Figure 112007060428012-PCT00043
    [여기서, n, m, p, R1, R3, 및 R4는 상기와 같으며, R5는 -O-, -S-, 및 -NR8-로 구성된 군으로부터 선택되며, R8은 H 또는 (C1-C8)알킬이며; R7은 펩티드 항원이다.]
  21. 제20항에 있어서, 단, 2이상의 중합체 분자가 가교결합하여 -R5-R7-R5 콘쥬게이트를 제공하는 것인 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 단, 항원이 -R5-R7-R5 [R5는 독립적으로 -O-, -S-, 및 NR8-로 구성되는 군으로부터 선택되며, R8은 H 또는 알킬임] 콘쥬게이트를 통하여 하나의 중합체 분자에 공유 결합되는 것(화학식 IX)인 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 단, R1은 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌 또는 (C2-C20) 알케닐렌이고, R5 중 하나가 -X-Y-[여기서, X는 (C1-C18) 알킬렌, 치환 알킬렌, (C3-C8) 시클로알킬렌, 치환 시클로알킬렌, O, N 및 S로부터 선택되는 1-3개의 헤테로원자를 포함하는 5-6원 헤테로시클릭 시스템, 치환 헤테로시클릭, (C2-C18) 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, C6 및 C10 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 알킬아릴, 치환 알킬아릴, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐, 아릴알케닐, 치환 아릴알케닐, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐로 구성된 군으로부터 선택되며(여기서, 치환체는 H, F, Cl, Br, I, (C1-C6) 알킬, -CN, -NO2, -OH, -0(C1-C4) 알킬, -S(C1-C6) 알킬, -S[(=O)(C1-C6) 알킬], -S[(O2)(C1-C6) 알킬], -C[(=O)(C1-C6) 알킬], CF3, -O[(CO)-(C1-C6) 알킬], -S(O2)[N(R9R10)], -NH[(C=O)(C1-C6) 알킬], -NH(C=O)N(R9R10), 및 -N(R9R10)으로 구성된 군으로부터 선택되며, R9 및 R10은 독립적 으로 H 또는 (C1-C6) 알킬임); Y는 -0-, -S-, -S-S-, -S(O)-,-S(O2)-, -NR8-, -C(=0)-, -0C(=0)-, -C(=0)0-, -0C(=0)NH-, -NR8C(=O)-, -C(=O)NR8-, -NR8C(=O)N R8-, -NR8C(=O)N R8-, 및 -NR8C(=S)NR8-로 구성된 군으로부터 선택됨]인 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 단, 각 R5가 -X-Y인 것인 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 2개의 중합체 분자를 포함하지만, 단 4개의 반복 단위 중 2개에는 R7이 빠져 있고 상기 2개의 반복 단위가 가교결합되어 단일 -R5-X-R5- 콘쥬게이트[여기서, X는 (C1-C18) 알킬, 치환 알킬, (C3-C8) 시클로알킬, 치환 시클로알킬, O, N 및 S로부터 선택되는 1-3개의 헤테로원자를 포함하는 5-6원 헤테로시클릭 시스템, 치환 헤테로시클릭, (C2-C18) 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, C6 및 C10 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 알킬아릴, 치환 알킬아릴, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐, 아릴알케닐, 치환 아릴알케닐, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, 치환체는 H, F, Cl, Br, I, (C1-C6) 알킬, -CN, -NO2, -OH, -0(C1-C4) 알킬, -S(C1-C6) 알킬, -S[(=O)(C1-C6) 알 킬], -S[(O2)(C1-C6) 알킬], -C[(=O)(C1-C6) 알킬], CF3, -O[(CO)-(C1-C6) 알킬], -S(O2)[N(R9R10)], -NH[(C=O)(C1-C6) 알킬], -NH(C=O)N(R9R10), 및 -N(R9R10)로 구성된 군으로부터 선택되며, 이때 R9 및 R10은 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬임)]를 제공하는 것인 조성물.
  26. 제20항에 있어서, 단, 2개의 중합체 분자가 부분적으로 가교결합하여 -R5-X-Y-R7-R5- 콘쥬게이트를 제공하는 것인 조성물.
  27. 제22항에 있어서, 단, 하나의 중합체 분자가 -R5-R7-X-Y-R5-가교를 통하여 항원에 공유 결합하는 것(화학식 XI)인 조성물:
    화학식 XI
    Figure 112007060428012-PCT00044
    [여기서, X는 (C1-C18) 알킬렌, 치환 알킬렌, (C3-C8) 시클로알킬렌, 치환 시클로알킬렌, O, N 및 S로부터 선택되는 1-3개의 헤테로원자를 포함하는 5-6원 헤테 로시클릭 시스템, 치환 헤테로시클릭, (C2-C18) 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, C6 및 C10 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 알킬아릴, 치환 알킬아릴, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐, 아릴알케닐, 치환 아릴알케닐, 아릴알키닐, 치환 아릴알키닐로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, 치환체는 H, F, Cl, Br, I, (C1-C6) 알킬, -CN, -N02, -OH, -0(C1-C4) 알킬, -S(C1-C6) 알킬, -S[(=O)(C1-C6) 알킬], -S[(O2)(C1-C6) 알킬], -C[(=O)(C1-C6) 알킬], CF3, -O[(CO)-(C1-C6) 알킬], -S(O2)[N(R9R10)], -NH(C=O)(C1-C6) 알킬], -NH(C=O)N(R9R10), -N(R11R12)로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, R9 및 R10은 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬이고, R11 및 R12는 독립적으로 (C2-C20) 알킬렌 및 (C2-C20) 알케닐렌임)] .
  28. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 약 8 내지 약 12개의 아미노산의 클래스 I 에피토프를 포함하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 아쥬반트(adjuvant)를 더 함유하는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 아쥬반트가 중합체에 공유 결합된 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 아쥬반트 및 항원이 동일 중합체에 콘쥬게이션된 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 약 8 내지 약 30개의 아미노산의 클래스 II 에피토프를 포함하는 조성물.
  33. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 종양 세포 표면 항원의 에피토프를 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 항원이 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티드인 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 항원이 부분적으로 레트로-인버소 펩티드인 조성물.
  36. 제1항에 있어서, 펩티드 항원이 바이러스 에피토프를 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 바이러스 에피토프가 HIV 또는 인플루엔자 바이러스 에피토프인 조성물.
  38. 제37항에 있어서, HIV 에피토프가 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 인플루엔자 에피토프가 서열 번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 갖는 조성물.
  40. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 비히클(vehicle)을 추가로 함유하는 조성물.
  41. 제1항에 있어서, 분무형 분산 액적의 형태인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 분무는 분무기를 통해 생성되는 조성물.
  43. 제1항에 있어서, 분산된 비히클 액적을 포함하는 분무를 생성하도록 작동가능한 분무기 내에 포함된 것인 조성물.
  44. 제1항에 있어서, 주입을 통해 조성물을 투여하도록 작동가능한 주입 기구 내에 포함된 조성물.
  45. 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    포유류의 항원 제시 세포에 의해 흡수되어 포유류에서 면역 반응을 유도하는 중합체 입자 또는 분자의 액체 분산물 형태인 제1항의 백신 전달 조성물의 면역자극 양을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 생체 내 투여시 조성물은 서방형 중합체 저장체를 형성하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 조성물이 24시간, 약 7일, 약 30일 또는 약 90일의 기간에 걸쳐 생분해되는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 조성물은 평균 입자 직경이 약 10 나노미터 내지 약 1000 미크론 범위인 입자 형태이고, 상기 입자 내에 하나 이상의 펩티드 항원이 분산된 것인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 상기 입자는 평균 입자 직경이 약 10 나노미터 내지 약 10 미크론 범위인 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 입자는 중합체 외피를 더 포함하는 것인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 입자가 중합체 분자 당 약 5 내지 약 150개의 펩티드 항원을 포함하는 것인 방법.
  52. 제45항에 있어서, 중합체 분자는 평균 분자량이 약 5,000 내지 약 300,000 범위이고, 중합체 분자에 하나 이상의 펩티드 항원이 콘쥬게이션된 것인 방법.
  53. 제45항에 있어서, 중합체 분자에 약 5 내지 약 70개의 펩티드 항원이 콘쥬게이션된 것인 방법.
  54. 제45항에 있어서, 펩티드 항원은 약 8 내지 약 12개 아미노산의 클래스 I 에피토프를 포함하는 방법.
  55. 제45항에 있어서, 아쥬반트를 더 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 아쥬반트가 중합체에 공유 결합된 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 아쥬반트 및 항원이 동일 중합체에 콘쥬게이션된 것인 방법.
  58. 제45항에 있어서, 펩티드 항원이 약 8 내지 약 30개 아미노산의 클래스 II 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 펩티드 항원이 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 종양 세포 표면 항원의 에피토프를 포함하는 방법.
  60. 백신을 대상에게 전달하는 방법으로서, 제1항의 백신 전달 조성물을 대상에게 투여하여 상기 백신이 대상의 항원 제시 세포에 의해 흡수되도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  61. 단량체 당 하나 이상의 아미노산외(non-amino acid) 부분에 콘쥬게이션된 하나 이상의 아미노산 유형을 포함하는, 생분해성 중합체 내에 분산된 하나 이상의 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 펩티드 항원의 유효량을 함유하는 백신 전달 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 아미노산외 부분이 2개의 인접한 아미노산들 사이에 존재하는 것인 조성물.
  63. 제61항에 있어서, 아미노산외 부분이 소수성인 것인 조성물.
  64. 제61항에 있어서, 펩티드 항원이 5 내지 약 30개의 아미노산을 포함하는 조성물.
  65. 제61항에 있어서, 중합체가 2 이상의 상이한 아미노산을 포함하는 조성물.
  66. 제61항에 있어서, 중합체는 액체 중에서 미셀을 형성하는 블록 공중합체인 조성물.
  67. 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    포유류의 항원 제시 세포에 의해 흡수되어 포유류에서 면역 반응을 유도하는 중합체 입자 또는 분자의 액체 분산물 형태인 제61항의 백신 전달 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  68. 제1항에 있어서, 하나 이상의 단량체 중의 R3은 또한 -(CH2)3- 일 수 있으며, 하나 이상의 R3은 환화되어 하기 화학식 XVIII을 형성하는 것인 조성물.
    [화학식 XVIII]
    Figure 112007060428012-PCT00045
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