KR20070097593A - 요실금 치료용 화합물 - Google Patents

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제프리 마틴 톰슨
한스 쥬르겐 그루스
알렉산더 운가르
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노어긴 유럽 비브이
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물에 관한 것이며,
Figure 112007062207198-PCT00011
(Ⅰ)
이때 R1은 화학식 (I)의 화합물이 신장 세관 내에서 활성 형태 또는 이의 활성 대사물질로 변환되는 1R,2S-메톡사민의 프로드럭인 것과 같은 기이다. 상기 화합물은 요실금의 예방 및 치료에 특정 용도를 제공한다.

Description

요실금 치료용 화합물{COMPOUNDS FOR TREATING URINARY INCONTINENCE}
본 발명은 1R,2S-메톡사민 화합물(화학식(Ⅰb))의 프로드럭(prodrugs)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 프로드럭을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
Figure 112007062207198-PCT00001
(Ⅰb)
요실금은 많은 장애에 의해 야기될 수 있다. 이는 특히 중장년층, 그리고 임신 및 출산시 손상을 입은 여성 중에서 주로 일어난다. 남성의 2배 이상의 많은 여성들이 환경에 의해 영향을 받는다. 요실금은 또한 유전적 환경에 의해 야기될 수 있다.
다양한 형태의 요실금은 절박성 요실금(urge incontinence), 반사성 요실 금(reflex incontinence), 일출성 요실금(overflow incontinence), 신경성 요실금 (neurogenic incontinence), 전립선 절제 후 요실금(post-prostatectomy incontinence), 일시적 요실금(transient incontinence)(감염 또는 투약 때문에 일시적인 증상) 및 긴장성 또는 적재성 요실금(stress or load incontinence)을 포함한다. 어떤 환자들은 이런 형의 요실금을 두가지 이상 가지며, 이는 혼합 요실금으로 불린다. 활동이 지나친 방광에 의해 야기되는 절박성 요실금은 지나치게 활동적인 신경 경로에 의해 야기될 수 있다. 긴장성 요실금은 요실금의 가장 일반적인 형태이며, 예를 들면 요도 괄약근에 초과 압력을 받는 부위에서 방광의 탈출에 의해 야기될 수 있다.
현재 요실금을 제거하기 위해 사용되는 많은 약물은 치료가 듣지 않는 결과를 가져오는 부작용 문제가 있다. 어떤 형의 요실금에 있어서, 수술이 이용될 수 있으나, 수술은 항상 확실한 위험성을 동반하여 환자들에게 확실히 권할 만하지는 않다.
본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물을 제공하며,
Figure 112007062207198-PCT00002
(Ⅰ)
이때 R1은 화학식 (I)의 화합물이 신장 세관 내에서 활성 형태 또는 이의 활성 대사물질로 변환되는 1R,2S-메톡사민의 프로드럭인 것과 같은 기이다. 상기 화합물은 약제로서 사용될 수 있다.
특히, 본 발명은 또한 화학식 (Ia)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물을 제공한다.
Figure 112007062207198-PCT00003
(Ia)
화학식 (Ia)의 화합물은 약제로서 사용될 수 있다. 화학식 (Ia)의 화합물 은 1R,2S-메톡사민의 프로드럭이다. 따라서 상기 화합물은 요실금의 예방 및 치료의 용도를 갖는다.
본 발명은 화학식 (I)의 화합물 및 예를 들면 요실금의 예방 및 치료와 같은 이 화합물의 치료적 용도에 관한 것이다.
1R,2S-메톡사민은 WO　03/055474에서 대변실금(faecal incontinence)용으로 가능한 치료제로서 알려져 있다. 적합한 수준에 도달한 시스템적인 1R,2S-메톡사민의 실험 연구에서 다른 경우에는 건강한 방광이 1R,2S-메톡사민의 부작용에 의해 배뇨(micturition)의 어려움이 발생할 수 있음이 본 발명자들에 의해 놀랍게도 발견되었다. 배뇨의 어려움는 방광 및/또는 요도에 영향을 미치는 1R,2S-메톡사민에 의해 야기된다고 고려된다. 그러나, 1R,2S-메톡사민이 혈압의 상승과 같은 원하지 않는 시스템적인 부작용 또한 발생하는 것이 관찰됨으로써, 1R,2S-메톡사민은 이러한 징후에 대한 약제로서 적합하지 않게 되었다.
본 발명자들은 또한 1R,2S-메톡사민(화학식 Ib)이 단독으로 투여시, 생체 외 돼지 방광 경부 근육의 농도를 유발하는 데 효과적임을 알아냈다. R1이 화학식 (I)의 화합물이 신장 세관 내에서 활성 형태 또는 이의 활성 대사물질로 변환되는 1R,2S-메톡사민의 프로드럭인 것과 같은 기인 화학식 (I)의 화합물은 R1기를 분해시키는 데 적합한 효소 및 선택적으로 카복시기 수용체(acceptor)와 조합하여 투여시, 생체 외 돼지 방광 경부 근육의 농도를 유발하는 데 효과적이다. 예를 들면, 화학식 (Ia)의 화합물은 감마 글루타밀 전이효소 및 글라이실글라이신 수용체와 조합하여 투여시, 생체 외 돼지 방광 경부 근육의 농도를 유발하는 데 효과적이다.
나아가, 본 발명자들은 생체 내 돼지 요역학 모델(pig urodynamic model)에서 투여시, 화학식 (I)의 화합물이 요속(urinary flow rate) 지연 또는 배뇨 효율(voiding efficiency) 저하 없이 방광요도 접합부(vesicourethral junction; VUJ) 바탕압력(baseline pressure), VUJ 임계압력(threshold pressure) 및 VUJ 배뇨압(voiding pressure)을 상승시키는 데 효과가 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 생체 내 돼지 요역학 모델(pig urodynamic model)에서 투여시 화학식 (I)의 화합물이 동맥압(arterial pressure)에서 최소 상승을 유발하는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 약제로서 사용되는, 특히 요실금의 예방 및 치료에 사용되는 화학식 (I)의 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 요실금의 예방 및 치료용 약제의 제조를 위한, 상기에서 정의한 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 요실금 치료방법을 제공하며, 이는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 상기에서 정의된 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
실금은 방광 경부, 요로, 수포성 또는 요도 괄약근에서 근육의 긴장(tone)의 감소로부터 발생될 수 있다; 따라서 본 발명은 방광 경부, 요로, 수포성 또는 요도 괄약근에서 평활근(smooth muscle)의 긴장 증가에 대한 용도를 제공한다.
상술한 바와 같이, R1은 화학식 (I)의 화합물이 신장 세관 내에서 활성 형태 또는 이의 활성 대사물질로 변환되는 1R,2S-메톡사민의 프로드럭인 것과 같은 기이다. 신체 내에서 상기 화합물은 매우 낮은 활성을 갖고, 상기 R1기는 분자에서 생물학적 활성 형태가 생생되도록 분해되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 R1기는 1R,2S-메톡사민의 아미노기에 아미드 결합에 의해 연결된다. 따라서, 바람직한 R1기는 부착 말단에 카보닐기를 갖는다. 예를 들면, R1은 카보닐기, 즉, -C(=O)에서 종결시키는 치환된 알킬기일 수 있다. 이런 알킬기는 아민 또는 카복실산기로 치환될 수 있으며, 예를 들면 R1은 CO2H-CHNH2-(CH2)n-C(=O)일 수 있고, 이때 n은 0~5이고, 바람직하게는 1~3, 가장 바람직하게는 n은 2이다. 가장 바람직하게는 R1기는 감마 글루타밀 전이효소에 의해 분해될 수 있는 기이다. 예를 들면, 상기 R1기는 감마 L-글루탐산일 수 있다. 바람직한 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ia)의 화합물이다.
특히, 본 발명은 화학식 (Ia)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물을 제공한다.
Figure 112007062207198-PCT00004
(Ia)
화학식 (Ia)의 화합물은 (S)-2-아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5-디메톡시페닐)-2-하이드록시-1-메틸-에틸카바모일]부티르산이며, 감마-L-글루타밀-1R,2S-메톡사민으로서 알려져 있다.
화학식 (Ia)의 화합물은 약제로 사용될 수 있다. 화학식 (Ia)의 화합물은 1R,2S-메톡사민의 프로드럭이다. 따라서 상기 화합물은 요실금의 예방 및 치료의 용도를 갖는다.
본 발명에 따라 치료되어야 할 대상은 통상적으로 포유동물이다. 상기 포유동물은 일반적으로 사람이나, 상업적으로 사육되는 동물(commercially reared animal) 또는 반려동물(companion animal)일 수 있다.
상기 화학식 (I)의 화합물은 절박성 요실금(urge incontinence), 반사성 요실금(reflex incontinence), 일출성 요실금(overflow incontinence), 신경성 요실금 (neurogenic incontinence), 전립선 절제 후 요실금(post-prostatectomy incontinence), 일시적 요실금(transient incontinence) 및 긴장성 또는 적재성 요실금(stress or load incontinence)을 포함하는 임의의 형태의 요실금의 예방 및 치료용 약제로서 사용될 수 있다. 상기 화학식 (I)의 화합물은 혼합 실금(mixed incontinence)의 예방 및 치료용 약제로서 사용될 수 있다. 상기 화학식 (I)의 화합물은 긴장성 실금(stress incontinence)의 예방 및 치료용 약제로서 특정 적용을 제공한다.
환자에게 투여시에는 비활성이나, 투여된 상태에서는 활성 1R,2S-메톡사민 또는 이의 활성 대사물질을 (직접적 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 화합물을 1R,2S-메톡사민 "프로드럭"으로서 알려져 있다. 프로드럭은 체내에서 약효를 갖는 활성 형태로 변환된다. 약학적으로 허용가능한 프로드럭은 T. Higuchi 및 V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A. C. S. Symposium Series; 및 in Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association 및 Pergamon Press, 1987에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 참조문헌으로 통합된다.
프로드럭이 체내에서 활성 형태 또는 활성 대사물질 또는 이의 잔여물로 변환될 수 있는 방법의 일례는 분해이다. 본 발명의 프로드럭 화합물은 상기 프로드럭 분자를 분해할 수 있는 특정 효소의 존재에 의해 신장에서 선택적으로 활성화가 되는 것으로 가정된다. 이러한 효소들이 간에서도 발견되지만, 1차 통과 대사(first-pass metabolism)를 회피하는 투여 경로를 선택함으로써 간에서 프로드럭 화합물의 상당한 분해를 피하게 된다.
1R,2S-메톡사민의 프로드럭의 일례는 화학식 (Ia)의 화합물, 즉, R1이 감마-L-글루탐산인 화학식 (I)의 화합물이다. 상기 신장은 감마 글루타밀 전이효소(GGT)를 함유하며, 이는 글루탐산과 아민 사이의 펩타이드 결합을 분해한다. GGT는 신장 및 간의 높은 수준으로 발견되나, 상기 설명된 바와 같이 간 GGT에 의한 상당 분해는 1차 통과 대사(first-pass metabolism), 예를 들면 정맥 주사를 회피하는 투여 경로를 선택함으로써 회피된다. 따라서 신체에 적절하게 투여시 프로드럭의 분해는 신장에서 거의 독점적으로 일어난다.
글루탐산이 링크(link)된 제제는 뇨(urine)와 함께 수뇨관 하부를 지나 방관 내부 및 이후 요도 내부로 들어가는 신장에 도달할 때까지 혈액 내에서 순환된다고 가정된다. 이에 의해 상기 제제는 비뇨기 시스템 및 방광에서 선택적인 활성이 있고, 따라서 시스템적인 부작용은 감소된다. 예를 들면, 무스카린성(muscarinic) 제제 또는 콜린억제제(anticholinergic agents)에 의해 야기되는 전형적인 부작용, 예를 들면 구강 건조증(dry mouth), 시각 장애(visual disturbances), 변비 및 빈맥(tachychardia)이 감소하고, 전립성 비대증(prostatic hypertrophy) 및 녹내장(glaucoma)이 있는 환자의 치료를 위한 콜린억제제의 사용 가능성이 증가한다. 따라서, 본 발명은 현재 사용되는 콜린억제제 및 무스카린성 제제의 부작용 없이 요실금 치료에 효과적인 제제의 필요를 바람직하게 충족시킨다.
치료에 사용하기 위해 상기 화학식 (I)의 화합물은 예를 들면 유리 염기의 형태, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물의 형태로 사용될 수 있다. 특별히 명세서에 달리 기재되지 않는 한, 하기 사용되는 바와 같이, "화학식 (I)의 화합물"은 유리 염기 및 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물을 포함한다. 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 용매화물 또는 염, 또는 이러한 염의 용매화물의 양 또는 백분율(percentages)이 주어지면, 용매화물 또는 염, 또는 이러한 염의 용매화물의 양 또는 농도는 화학식 (I)의 화합물의 양 또는 농도를 기준으로 하여 바람직하게 계산된다.
화학식 (I)의 화합물의 염은 예를 들면, 산부가염을 포함하는 산을 갖는 염이다. 염의 예로는 염산, 브롬산, 술폰산, 인산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 락트산(lactic acid), 피루브산(pyruvic acid), 말론산(malonic acid), 숙신산(succinic acid), 글루타르산(glutaric acid), 푸마르산(fumaric acid), 타르타르산(tartaric acid), 말레산(maleic acid), 시트르산, 아스코르브산, 옥살산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 벤젠술폰산, 이세티온(isethionic) 또는 캄포르산(camphoric acid)을 갖는 염이 있다.
유기화학분야의 당업자는 많은 유기화합물이 용매와 함께 반응되거나 침전 또는 재결정화됨으로부터 복합체를 형성할 수 있다는 것에 감사할 것이다. 이들 복합체는 "용매화물"로서 알려져 있다. 예를 들면 물을 이용한 복합체는 "수화물"로 알려져 있다.
치료효과를 달성하는 데 요구되는 화학식 (I)의 화합물의 양은 물론 투여 경로, 치료 대상 및 치료받을 요실금의 형태에 따라 다양할 것이다. 임상치료에 있어서, 일반적으로 요구되는 효과를 달성시키는 최소 투여량의 사용이 바람직하다.
본 발명의 화합물은 하루에 0.1~1500 mg/kg, 바람직하게는 0.1~500 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 단위 투여량 형태(unit dose form)는 예를 들면 5~500 mg, 일반적으로 약 10~200 mg을 함유하는 단위와 같이 이런 투여량에 효과적인 본 발명의 화합물의 양 또는 이의 배수로서 편리하게 함유할 수 있다.
본 발명의 화합물은 하루에 1회 이상, 예를 들면 하루에 2회 또는 3회 또는 심지어는 더욱 자주, 예를 들면 하루에 4회 또는 5회 투여될 수 있다.
활성 성분은 단독으로 투여되는 것이 가능하나, 약학적 제형 또는 조성물 내에 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와의 혼합물 또는 결합물(conjunction) 내에 본 발명은 상기에서 정의한 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 하기 기재된 바와 같이 약학적 제형의 형태로 섭취할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 제형은 비경구(피하(皮下), 피내(皮內), 근육 내, 정맥 내 및 관절 내를 포함), 흡입(다양한 형의 투여량 측정 가압 흡입제(metered dose pressurized aerosols), 흡입기(nebulizers) 또는 취분기(insufflators)의 수단에 의해 발생될 수 있는 미세입자 분진 또는 안개 포함), 국소 부위(피부, 구강 및 설하 포함) 및 직장 투여에 적합한 제형을 포함하나, 대부분의 적합한 경로는 예를 들면 환자의 장애 및 상태의 정도 및 특징에 따라 달라질 수 있다.
상기 화학식 (I)의 화합물 또는 약학적 조성물 또는 이의 제형는 요실금의 예방 및 치료용 약제로서 사용시 경구 투여와 다른 경로를 통해 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면 겔, 크림, 연고, 페이스트, 거품 또는 점착성 패치(adhesive patch)와 같이 피부에 국소부위 투여를 위한 적합한 형태일 수 있다. 여성 환자를 위하여 상기 조성물은 질 내 투여용으로 적합한 형태일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면, 좌제와 같은 대장 투여용으로 적합한 형태일 수 있다. 예를 들면 지속 방출 좌제(sustained release suppository)가 적합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면, 경피 투여용으로 적합한 형태일 수 있다. 경피 투여용으로 적합한 약학적 조성물은 화학식 (I)의 화합물의 경피 전달을 증가시키는 보조제(adjuvant)를 포함한다. 이런 증가가 달성되는 방법과 관계없이 화학식 (I)의 화합물의 경피 전달을 증가시키는 어느 보조제도 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다.
적합한 보조제는 경피 투여 약물 전달 시스템에서 피부 투과 촉진자 또는 가용화제로서 사용되는 특정한 약학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 일례의 물질은 이소스테아린산, 옥타논산 및 올레산과 같은 C8-C36 지방산; 올레일 알콜 및 라우릴 알콜과 같은 C8-C36 지방 알콜; 에틸올레산염, 이소프로필미리스테이트, 부틸스테아린산염 및 메틸라우릴산염과 같은 C8-C36 지방산의 저급알킬에스테르;디이소프로필 아디프산염(adipate)과 같은 C6-C8 이산(diacid)의 디(저급)알킬에스테르; 글리세릴 모노라우릴산염과 같은 C8-C36 지방산의 모노글리세라이드; 테트라글리콜(테트라하이드로퍼퓨릴 알콜 폴리에틸렌글리콜 에테르); 테트라에틸렌글리콜(에탄올, 2,2'(옥시비스(에틸렌옥시))디글리콜); C6-C36 알킬 피롤리돈 카복실레이트; 폴리에틸렌 글리콜; 프로필렌글리콜; 2-(2-에톡시에톡시)에탄올; 디에틸렌글리콜 모노메틸 에테르; N,N-디메틸도데실아민 N-옥사이드; 디메틸술폭사이드; 및 상기의 조합을 포함한다.
글리세롤 및 N-메틸 피롤리돈과 같은 가용화제로서, 폴리에틸렌 옥사이드의 알킬아릴 에테르, 폴리에틸렌 옥사이드 모노메틸에테르 및 폴리에틸렌 옥사이드 디메틸 에테르 또한 적합하다. 테르펜은 유연제의 또다른 유용한 부류(class)이며, 피넨, d-리모넨, 카렌, 테르피네올, 테르피넨-4-올, 카르베올, 카르본, 플레곤, 피페리톤, 멘톤, 멘톨, 네오멘톨, 티몰, 캄포르, 보르네올, 시트랄, 이오논 및 시네올을 단독 또는 조합으로 포함한다.
특히 바람직한 보조제는 미국의 Advance Scientific & Chemical사로부터 입수가능한 이소프로필미리스테이트(IPM) 및 파마솔브TM(PharmasolveTM)(N-메틸 피롤리돈, 미국 뉴저지 웨인의 International Speciality Products으로부터 입수가능함)의 80:20(v/v) 혼합물이다. 이소프로필미리스테이트(IPM) 및 파마솔브TM의 80:20(v/v) 혼합물에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물의 포화 용액의 경피 흡수 관찰을 실시예 6에 나타내었다. 관찰 결과, 화학식 (Ia)의 화합물의 대조군 용액과 비교하여 IPM/파마솔브에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물의 경피 흡수 촉진 인자는 13.84를 나타내었다.
약학적 조성물은 피하 투여용일 수 있다. 몇몇 조성물, 예를 들면, 피하저장제제(subcutaneous depot preparations) 및 점착성 패치(adhesive patches)의 조성물은 지연방출(delay release) 또는 서방출(sustained release)을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단위 투약 형태일 수 있다. 주사 또는 주입에 의한 투여용 단위 투약 형태는 예를 들면 바이알(vials) 및 앰플(ampoules)을 포함한다. 피부에 국소부위 투여용 단위 투약 형태는 발포제 팩(blister packs) 또는 향낭(sachets)을 포함하고, 각각의 발포제 팩 또는 향낭은 예를 들면 상술한 바와 같은 겔, 크림 또는 연고와 같은 단위 투여량을 함유한다. 예를 들면, 크림, 연고 또는 겔과 같은 국소부위 조성물의 소정 부피를 투약하기 위해, 펌프 장치와 같은 투여량 측정 장치도 제공될 수 있다. 제제는 저장제제 또는 점착성 패치를 위해 서방출을 제공할 수 있다.
상술한 약학적 조성물은 또한 1 이상의 추가적 활성 성분, 예를 들면 요실금 치료에 있어서 효능 있는 활성 성분을 상기 화학식 (I)의 화합물에 부가하여 더 포함할 수 있다.
상술한 다양한 형태의 약학적 조성물 및 상술한 투여 경로에 적합한 그외 다른 조성물은 이러한 조성의 제형 및 이들의 제조 방법이 알려져 있다. 당업계의 문헌으로는 예를 들면 마틴(EW Martin)의 Remington's Pharmaceutical Sciences과 같은 안내서를 포함한다. 리뷰(Reviews) 및 문헌(literature articles)은 기준 및 더욱 복잡한 제형 및 장치, 예를 들면 다양한 형태의 점착성 패치를 기술하였다.
메톡사민(2-아미노-1-(2,5-디메톡시페닐)-1-프로판올)은 현재 혈압증진제(pressor agent) 및 혈관수축제(vasoconstrictor agent)로서 임상적으로 사용된다. 메톡사민은 두 개의 키랄 중심을 가지며, 따라서 네 개의 입체 이성질체를 갖는다. 이는 혼합 이성질체의 형태로 치료에 사용된다.
WO 03/055474는 1R,2S-메톡사민의 합성 및 핵자기공명(NMR) 분광학 및 단결정 X-선 회절분광학에 의한 특성을 개시하고 있다. 이는 또한 대변 실금 치료에 있어서, 1R,2S-메톡사민의 용도를 개시하고 있다.
본 발명은 R1이 화학식 (I)의 화합물이 신장 세관 내에서 활성 형태 또는 이의 활성 대사물질로 변환되는 1R,2S-메톡사민의 프로드럭인 것과 같은 기인 화학식 (I)의 화합물의 제조에 적합한 방법을 제공하며, 이는 적합한 커플링제 및 선택적으로 염기의 존재 하에서 1R,2S-메톡사민을 화학식 R1-OH인 기와 반응시키는 단계를 포함하며, 이때 R1은 위에서 정의한 바와 같다.
적합한 커플링제는 EDCI, HOBT, BOP, PyBOP, HATU 및 당업자에게 알려진 다른 펩타이드를 포함한다. 적합한 염기는 예를 들면, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 2,6-루티딘 및 1-메틸모포린과 같은 알킬아민과 같은 아민 또는 예를 들면 탄산칼륨, 포타슘 t-부톡사이드, 탄산나트륨과 같은 무기 염기를 포함한다. 상기 반응 혼합물은 상온에서 혼합되거나, 출발 물질이 모두 소비될 때까지 가열된다. 상기 반응은 보호기의 존재 하에서 수행되고, 이들 보호기는 반응 후에 제거된다. 적합한 보호기는 당업자에 의해 알려져 있다(T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, New York, 1999 참조).
또한 본 발명은 화학식 (I)의 화합물의 제조에 적합한 방법을 제공하며, 여기서 R1은 화학식 (I)의 화합물이 신장 세관 내에서 활성 형태 또는 이의 활성 대사물질로 변환되는 1R,2S-메톡사민의 프로드럭인 기이고, 상기 제조방법은 선택적으로 염기의 존재 하에서 1R,2S-메톡사민을 화학식 R1-L인 기와 반응시키는 단계를 포함하며, 이때 R1은 위에서 정의한 바와 같고, L은 적합한 이탈기이다.
적합한 이탈기 L의 예로는 할로겐, C1 - 4알킬술폰산에스테르, C5 - 10아릴술폰산에스테르 또는 C5 -10아르C1 - 4알킬술폰산에스테르(C5 -10ar-C1 -4alkyl sulphonate esters), 예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 메틸술포닐 또는 톨루엔술포닐기를 포함한다. 적합한 염기는 예를 들면, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 2,6-루티딘 및 1-메틸모포린과 같은 알킬아민과 같은 아민 또는 예를 들면 탄산칼륨, 포타슘 t-부톡사이드, 탄산나트륨과 같은 무기 염기를 포함한다. 상기 반응 혼합물은 상온에서 혼합되거나, 출발 물질이 모두 소비될 때까지 가열된다. 상기 반응은 보호기의 존재 하에서 수행되고, 이들 보호기는 반응 후에 제거된다. 적합한 보호기는 당업자에 의해 알려져 있다(T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, New York, 1999 참조).
본 발명은 화학식 (Ia)의 화합물의 적합한 제조방법을 제공하며, 이는 적합한 염기의 존재 및 선택적으로 1 이상의 적합한 커플링제의 존재하에서 화학식 (Ⅱ)의 화합물,
Figure 112007062207198-PCT00005
(Ⅱ)
이때 P1 및 P2는 적합한 보호기인 화합물을 1R,2S-메톡사민과 반응시키는 단계를 포함한다.
적합한 염기는 예를 들면, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 2,6-루티딘 및 1-메틸모포린과 같은 알킬아민과 같은 아민 또는 예를 들면 탄산칼륨, 포타슘 t-부톡사이드, 탄산나트륨과 같은 무기 염기를 포함한다. 적합한 커플링제는 EDCI, HOBT, BOP, PyBOP, HATU 및 당업자에게 알려진 다른 펩타이드를 포함한다. 상기 반응 혼합물은 상온에서 혼합되거나, 출발 물질이 모두 소비될 때까지 가열된다. 상기 보호기 P1 및 P2는 단일 또는 분리된 단계로 반응 이후에 제거된다. 상기 반응은 P1 및 P2 보다 다른 보호기의 존재하에 수행되고, 이들 보호기는 반응 후에 제거된다. 적합한 보호기는 당업자에 의해 알려져 있다(T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, New York, 1999 참조). 바람직하게 P1은 벤질카바메이트이다. 바람직하게 P2는 벤질이다.
결과로 나타나는 화학식 (I)의 화합물은 이의 염, 예를 들면 산을 갖는 염, 예를 들면 상술한 바와 같이 예를 들면 산과의 반응에 의한 염으로 변환될 수 있다. 상기 염은 선택적으로 용매화물로서 분리될 수 있다.
상기 화학식 (I)의 화합물은 대안적으로 용매화물로서 분리된다.
본 발명은 이제 하기 실시예에 의하여 설명될 것이나, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
도 1은 화학식 (Ⅲ)의 화합물, 1R,2S-메톡사민 및 화학식 (Ia)의 화합물에 반응하는 분리된 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육 스트립의 대표적인 신호(traces)를 나타낸다.
도 2는 1R,2S-메톡사민, 및 화학식 (Ia)의 화합물 또는 화학식 (Ⅲ)의 화합물의 투여량 증가에 따른 방광요도 접합 괄약근의 수축 응답 그래프를 나타낸다.
도 3은 다양한 효소 반응 생성물에 반응하는 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육의 대표적인 신호를 나타낸다.
도 3a는 50 mM 트리스 염산 완충액(Tris HCl buffer)의 투여에 따른 돼지 방광요도 접합 괄약근의 수축 응답을 나타낸다.
도 3b는 50 mM 트리스 염산 완충액 및 감마 글루타밀 전이효소의 투여에 따른 돼지 방광요도 접합 괄약근의 수축 응답을 나타낸다.
도 3c는 50 mM 트리스 염산 완충액, MgCl2.6H2O, 글라이실글라이신 및 화학식 (Ia)의 화합물의 투여에 따른 돼지 방광요도 접합 괄약근의 수축 응답을 나타낸다.
도 4a는 50 mM 트리스 염산 완충액, MgCl2.6H2O, 글라이실글라이신, 감마 글루타밀 전이효소 및 화학식 (Ia)의 화합물의 투여에 따른 돼지 근위괄약근 근육의 수축 응답을 나타낸다.
도 4b 0.3 mM의 화학식 (Ib)의 화합물의 투여에 따른 돼지 근위괄약근 근육의 수축 응답을 나타낸다.
도 5는 도 3a~c 및 4a~b에서 개시된 다양한 반응 조건 하에서 돼지 방광 경부 근육의 수축 응답의 비교 그래프이다.
도 6는 배양 후 10분, 30분 및 60분에서 방광요도 접합 괄약근 근육 스트립상에서 반응 혼합물의 효과의 비교 그래프이다.
도 7은 효소와 함께 30분 동안 배양한 다음 2배 희석한 후에 방광요도 접합 괄약근 근육 스트립상에서의 화학식 (Ia)의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 8은 염수(saline)에서 제조시 효과와 비교하여 트리스 완충액에서 제조시 화학식 (Ib)의 화합물(0.3 mM)의 방광요도 접합 괄약근 근육 스트립상에서의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 생체 내 미니 돼지 요역학 연구에서 사용되는 복막 및 방광 카테터의 도안을 나타내는 도해이다.
도 10은 염수로 방광을 충전시 방광내압(intravesical pressure), 방광내 배뇨압(intravesical voiding pressure), 방광요도 접합(VUJ) 압력, VUJ 임계 배뇨압(threshold voiding pressure) 및 VUJ 배뇨압의 효과를 나타낸다.
도 11은 화학식 (Ia)의 화합물의 환약 투여후 염수로 방광을 채울시 방광내압, 방광내 배뇨압, 방광요도 접합(VUJ) 압fur, VUJ 임계 배뇨압 및 VUJ 배뇨압의 효과를 나타낸다.
도 12는 화학식 (Ia)의 화합물의 존재 및 부재(대조군)에서 요역학 측정 동안 동맥압의 효과를 나타낸다.
도 13은 란드라스 돼지(landrace pig)의 다양한 요역학 및 심혈관 파라미터(cardiovascular parameters)에 있어서 화학식 (Ia)의 화합물의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 생체 외 피부 투과 테스트 세포를 나타내는 도해이다.
도 15는 Ethanol GTM에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물의 피부 투과 수준을 나타내는 그래프이다.
도 16은 톨루엔:DMSO(80:20, v/v)에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물의 피부 투과 수준을 나타내는 그래프이다.
도 17은 이소프로필미리스테이트:파마솔브TM(80:20,v/v)에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물의 피부 투과 수준을 나타내는 그래프이다.
도 18은 세 실험 용액 모두에 대한 화학식 (Ia)의 화합물의 피부 투과 수준 을 나타내는 그래프이다.
약어( Abbreviations )
EDCI 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산
HOBT 1-하이드록시벤조트리아졸
BOP 1-벤조트리아졸리옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오
로포스페이트(카스트로 시약(Castro's Reagent))
PyBOP 1-벤조트리아졸리옥시트리스(피롤리디노)포스포늄헥사플루오로
포스페이트
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄헥사플
루오로포스페이트
실시예 1
화학식 ( Ia )의 화합물 - (S)-2-아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5- 디메톡시페닐 )-2-하이드록시-1- 메틸 - 에틸카바모일 ]부티르산 (감마-L- 글루타밀 -1R,2S- 메톡사민 )의 합성
단계 1
(1R,2S)-2-아미노-1-(2,5-디메톡시페닐)프로판-1-올(1R,2S-메톡사민, 16.15 mmol, 4 g), (S)-2-벤질옥시카보닐아미노-4-카바모일부티르산 벤질 에스테르(13.5 mmol, 5 g) 및 EDCI(14.85 mmol, 2.85 g)을 아세토니트릴(100 ml)에 현탁시키고, 충분한 물을 적가하여 모든 시약이 용해될 수 있도록 하였다. 반응 혼합물은 상온에서 48시간 동안 교반하였고, 이후 감압하에서 증발시켰다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산 = 1:1)로 정제하여 무색오일의 (S)-2-벤질옥시카보닐아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5-디메톡시페닐)-2-하이드록시-1-메틸-에틸카바모일]부티르산 벤질 에스테르를 수득하였다(2.3g, 30%): MS (+EI) 565 [M+1]+.
단계 2
(S)-2-벤질옥시카보닐아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5-디메톡시페닐)-2-하이드록시-1-메틸-에틸카바모일]부티르산 벤질 에스테르(4.07 mmol, 2.3 g)를 메탄올(80 ml)에 녹인 용액에 10% Pd-C(0.41 mmol, 0.44 g)을 첨가하였다. 플라스크에 H2을 함유하는 풍선을 고정시키고, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)를 통해 여과한 후, 메탄올로 세척하였다. 감압하에서 농축하여 고체의 (2S)-2-아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5-디메톡시페닐)-2-하이드록시-1-메틸-에틸카바모일]부티르산{감마-L-글루타밀-1R,2S-메톡사민}을 수득하였다(1.0 g, 72 % 수율): MS (+EI) 341 [M+1]+, 323 [M-OH].
비교예 2
화학식 (Ⅲ)의 화합물 - (S)-4-아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5- 디메톡시페닐 )-2- 하이드록시-1- 메틸 - 에틸카바모일 ]부티르산 (알파-L- 글루타밀 -1R,2S- 메톡사민 )의 합성
Figure 112007062207198-PCT00006
(Ⅲ)
단계 1
(1R,2S)-2-아미노-1-(2,5-디메톡시페닐)프로판-1-올(1R,2S-메톡사민, 16.15 mmol, 4 g), (S)-4-벤질옥시카보닐아미노-4-카바모일부티르산 벤질 에스테르(13.5 mmol, 5 g) 및 EDCI(14.85 mmol, 2.85 g)을 아세토니트릴(100 ml)에 현탁시키고, 충분한 물을 적가하여 모든 시약이 용해될 수 있도록 하였다. 반응 혼합물을 상온에서 7일 동안 교반한 다음, 감압하에서 증발시켰다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산 = 1:1)로 정제하여 무색 오일의 (S)-4-벤질옥시카보닐아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5-디메톡시페닐)-2-하이드록시-1-메틸-에틸카바모일]부티르산 벤질 에스테르를 수득하였다(1.9, 25 %): MS (+EI) 565 [M+1]+.
단계 2
(S)-2-벤질옥시카보닐아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5-디메톡시페닐)-2-하이드록시-1-메틸-에틸카바모일]부티르산 벤질 에스테르(3.37 mmol, 1.9 g)을 메탄올(38 ml) 에 녹인 용액에 10% Pd-C(0.19 g)을 첨가하였다. 플라스크에 H2을 함유하는 풍선을 고정시키고, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)를 통해 여과한 후, 메탄올로 세척하였다. Concentration 감압하에서 농축하여 고체의 (S)-4-아미노-4-[(1S,2R)-2-(2,5-디메톡시페닐)-2-하이드록시-1-메틸-에틸카바모일]부티르산 {알파-L-글루타밀-1R,2S-메톡사민}을 수득하였다(1.1g, 96% 수율): MS (+EI) 341 [M+1]+, 323 [M-OH].
실시예 3
돼지 방광 경부 근육에서 화학식 ( Ia )의 화합물 및 화학식 (Ⅲ)의 화합물의 생체 외 연구
a) 관능 검사( Functional Assay )
방법
샘플 채취 및 제조(sample Collections and Preparation )
흰색 란드라스종 암컷 돼지 방관 및 요도의 샘플을 지역 도살장에 있는 신선한 도살 돼지로부터 얻었다. 상기 돼지는 전기적 쇼크에 의해 초기 기절(initial stunning) 이후 빈혈증에 의해 죽었다. 이후, 내장 적출하는 동안 일괄적으로 항문, 직장, 방광 및 요도를 절제하여 즉시 사전에 산화된(preoxygenated) 크렙 용액(Krebs' 용액, mmol/l: NaCl 120, KCl 5.9 NaHCO3 15.4, CaCl2 2.5, MgCl2 1.2, 글루코스 11.5)에 넣고 진행 준비가 될 때까지 냉장고(4 ℃에서)에 저장하여 실험실 로 옮겼다.
상기 샘플로부터 요방광 및 요도를 적출하여 삼각부가 노출되도록 방광을 절개하여 절개 접시 위에 놓고 핀으로 고정하고, 상기 삼각부의 정점에서 방광 없이 절개하였다.
다음으로 방광요도 접합 괄약근 부위를 확인하였다. 상기 방광을 경요도 카테터를 통해 200 ml의 유동물질을 넣어 부풀렸다. 이후 뚜렷한 좁은 방광 바닥이 보일때까지 상기 유동물질을 출구쪽으로 적당히 압착하였다(Dass, 1997; Dass et al., 2001). 다음으로 이 구역으로부터 요로상피의 근육 부위를 노출시키고 가로로 절개하여 다수의 근육 스트립으로 절개하였다.
근육 절개
절개는 절개현미경이 지원하는 절개 페트리디쉬(dissecting Petri-dish)(근육의 일정 산화를 확보하기 위하여 지속적으로 보충되는 산소가 포화된 크렙스 용액 포함)를 기초로 한 코팅된 실리콘 탄성체에서 수행되었다.
설치 및 스트립의 평형
약 5~6 mm에서 2~3 mm까지 측정되고 7 mg의 평균 무게를 갖는 근육 스트립이 절개되었고, 상기 스트립의 각 말단은 미세한 (5/0) 실크 실로 묶고, 각 스트립은 0.2 ml의 용량의 전장 자극(EFS)이 전달될 수 있는 두 오목한(recessed) 백금 전극간 방풍 유리 장기조(perspex organ bath)에 수직으로 올려졌다. 1.5 ml/min의 속도로 크렙스 용액(37 ℃)을 스트립에 지속적으로 부었다. 상기 크렙스 용액은 97% 산소 3% 이산화탄소로 가스처리 하였다. 약물은 크렙스 용액용의 바람직한 농도의 용액을 함유하는 약물을 대체함으로써 전달되었다.
장치
브라딩(Brading)과 실브레이(Sibley)(1983)에 의해 설명된 바와 같이 상기 장치는 6개의 스트립의 연구를 동시에 허용하는 평행한 6개의 장기조(organ bath)로 구성하였다. 각 채널은 각 실험 전에 변환기에 부착된 1 g 무게로 검정되었고 근육은 설치 후 1 g이 긴장되었다. 상기 스트립에 의해 발생되는 이성장력(isomeric tension)은 이성 힘 변위 변환기(isomeric force displacement transducers), 피오덴 다이나모미터 UFI 변환기(Pioden Dynamometer UFI transducers; Pioden Controls Ltd, Canterbury, Kent) 또는 AD 계기 MLT050/D 힘 변환기(AD Instruments MLT050/D force transducers), 증폭기(하바드 변환기/증폭기(Harvard transducers/Amplifier), Harvard Apparatus Ltd, Edenbridge, Kent) 및 맥랩 데이타 획득 시스템(MacLab Data Acquisition system)(AD Instruments, Sydney, Australia) 또는 파워 Lab/8SP에 연결되는 AD 계기 OCTAL 브릿지 증폭기(AD Instruments, Sydney, Australia)을 이용한 분석 및 차트 v3.6 소프트웨어(맥킨토시) 또는 차트 v5(PC)를 이용하여 측정될 수 있다.
투여량 응답 곡선 프로토콜( Dose Response Curve Protocol )
각 실험에서 한 쌍의 스트립에 대하여 한 약물을 테스트함으로써 다양한 화합물에 대하여 투여량 응답 곡선 프로토콜을 그렸다. 제제는 중간 세척 주기를 조절하면서 약물 투여량 증가의 일련의 연속적인 10초(@1.5 ml/s) 적용을 받는다.
약물 및 시약
노르진 국제 리서치, 미들섹스(Norgine International Research, Middlesex)에서 제조된 1R,2S-메톡사민 염산염, 화학식 (Ia)의 화합물 및 화학식 (Ⅲ)의 화합물이 사용되었다.
데이타 분석
응답은 장력의 그램 또는 % 최대 힘 중 어느 하나로서 보고되고 평균값±SEM으로서 제공되었다. EC50값은 효능의 척도로서 사용되었다. 상기 EC50값은 칼레이다그래프(kaleidagraph) 그래픽 소프트웨어 응용프로그램을 사용하여 투여량 응답 곡선 그래프로부터 측정된다. 결과를 피셔 테스트(Fisher's test)에 따른 아노바(ANOVA)를 사용하는 통계 분석 소프트웨어인 스타트뷰(StatView) 5.0(SAS Institute Inc.) 사용하여 평가하였다. 데이타 간의 유의한 차이를 p<0.05로 가정하였다.
결과
화학식 (Ⅲ)의 화합물, 1R,2S-메톡사민 및 화학식 (Ia)의 화합물에 대한 분리된 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육 스트립 반응의 대표적인 신호(traces)를 도 1에 나타내었다. 1R,2S-메톡사민은 잘 정의된 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육의 수축 응답을 야기하였다(도 1, 중간 신호). 비교예 2에 서 설명한 대로 화학적 합성에 의해 생성된 상기 화학식 (Ⅲ)의 화합물 또한 잘 정의된 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육의 수축 응답을 야기하였다(도 1, 상부 신호). 실시예 1에서 설명한 대로 화학적 합성에 의해 생성된 화학식 (Ia)의 화합물은 유의한 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육의 수축을 야기하지 않았다(도 1, 하부 신호).
1R,2S-메톡사민, 화학식 (Ia)의 화합물 또는 화학식 (Ⅲ)의 화합물의 투여량 증가에 대한 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육의 수축 응답 그래프를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 1R,2S-메톡사민은 10-3M의 농도에서 1.12±0.26 g의 최대 반응을 유발하였다(도 2a). 화학식 (Ⅲ)의 화합물 또한 방광 활성을 나타내었으나 10-2M에서 1.33±0.25 g의 최대 반응을 나타내었고, 반면 화학식 (Ia)의 화합물은 테스트한 상기 투여량 범위(10-6~10-2M) 내에서 감지할 수 있는 반응을 유발시키지 못했다(도 2a). 화학식 (Ia)의 화합물에서 관찰된 평이한 반응과 대조적으로 1R,2S-메톡사민와 화학식 (Ⅲ)의 화합물 모두 전형적인 시그모이드(Sigmoid) 투여량 곡선을 나타내었다(도 2b). 상대 효능(EC50)은 1R,2S-메톡사민(0.0562 mM) > 화학식 (Ⅲ)의 화합물(0.495 mM)> 화학식 (Ia)의 화합물(4.64 mM)의 순서로 나타났다. 따라서 화학식 (Ⅲ)의 화합물은 1R,2S-메톡사민의 생물학적 활성의 약 10%를 유지한다.
결론
화학식 (Ia)의 화합물은 표준 생체 외 근육 스트립 실험에서 활성이 거의 없거나 활성을 갖지 않으며(도 1), 이는 상기 화합물이 프로드럭 상태임을 나타낸다. 그러나, 화학식 (Ⅲ)의 화합물은 표준 생체 외 근육 스트립 실험에서 소정의 활성을 가지며, 1R,2S-메톡사민의 생물학적 활성의 약 10%를 유지함을 발견하였다. 따라서 글루탐산이 알파 카복시기를 통하여 1R,2S-메톡사민과 커플링되는 상기 화학식 (Ⅲ)의 화합물은 요실금의 예방 및 치료에서 프로드럭으로서 사용에 있어서, 글루탐산이 감마 카복시기를 통하여 1R,2S-메톡사민과 커플링되는 화학식 (Ia)의 화합물만큼 적합하지 않다.
b)효소 실험
방법
확인 상태(Validation phase )
상업적으로 구입되는 감마 글루타밀 전이효소(γGT)를 상업적 물질, 글루타밀 p-니트로아닐라이드(GpNA) 및 보조인지 글리글라이신(glygly) 및 마그네슘을 이 용하여 확인하였다. 반응은 하기 반응식에 의해 특징지어질 수 있다:
Figure 112007062207198-PCT00007
.
γGT는 접합 GpNA로부터 니트로아닐라이드를 방출하여 최대파장(λmax) 405 nm에서 측정될 수 있는 노르스름한 색깔의 반응 생성물을 생성해야 한다.
a) 하기 서술된 대로 저장용액을 제조하였다:
pH 8.2의 50 mM 트리스 염산 완충액에서 하기와 같은 저장 용액을 제조하였다:
A. 트리스 염산 완충액 내 글라이실글라이신(glygly)(수용체) 20 mg/ml
B. 트리스 완충액 내 MgCl2·6H2O 3.3 mg/ml
C. 트리스 완충액 내 감마 글루타밀 p-니트로아닐라이드 6 mg/ml
D. 10 ml의 트리스 완충액(=　300 U/ml)에 γGT(3000 U)를 용해시키고, 20 ㎕(500 U)의 저장 용액을 분주하여 -20 ℃에 저장함으로써 효소 저장 용액을 제조하였다.
E. 효소 작동 용액(Enzyme working solution). 1 분주액(=6 Units)을 1 ml의 트리스 완충액(=6　units/ml)으로 재구성.
b) 효소 분석 프로토콜(Enzyme assay Protocol)
하기와 같이 96 웰에서 GpNA를 분광광도법으로 실험하였다:
복제 웰(replicate wells)에서 하기를 피펫팅하였다:
60 ㎕ A 용액
60 ㎕ B 용액
60 ㎕ C 용액(=0.36 mg 또는 1.26 μMoles)
반응 혼합물 군:
1= 완충액(200 ㎕) 바탕용액
2= A 용액(60 ㎕), B 용액 (60 ㎕), C 용액(60 ㎕), 완충액(20 ㎕) 대조군
3= 완충액(180 ㎕) + E 용액(20 ㎕) 대조군
4= A 용액(60 ㎕), B 용액 (60 ㎕), C 용액(60 ㎕), E 용액(20 ㎕) 실험군
20 ㎕의 E 용액(=0.12 units γGT)을 받은 군에 대해, 상기 용액(E)은 37 ℃에서 평형 10분 후에만 첨가되었다. 이후 플레이트를 시간 0 및 이후 중간 평형구간(intervening equilibration period) 이후 평탄구간(plateau)이 도달할 때까지 매 5분 후에 즉시 읽었다(@λmax 405nm).
주의(NB.). 1U는 분당 1 μMole씩 분해되므로 0.12 단위는 10.5분에 1.26 μMole이 분해된다.
화학식 ( Ia )의 화합물로부터 1R,2S- 메톡사민의 재생
깨끗한 유리 바이알 내에서(1 ml 부피) 하기 반응 혼합물이 이하와 같이 피 펫팅되었다:
100 ㎕ A 용액
100 ㎕ B 용액
200 ㎕ 화학식 (Ia)의 화합물, 트리스 완충액 내 10 mg/ml(mol. wt. 376, 따라서= 2 mg 화학식 (Ia) 의 화합물=5.3 μMoles), 100 ㎕ E 용액
반응 혼합물 군:
1= 완충액 단독(200 ㎕) 바탕용액
2= A 용액(60 ㎕), B 용액(60 ㎕), C 용액(60 ㎕), 완충액(20 ㎕) 대조군
3= 완충액(180 ㎕) + E 용액(20 ㎕) 대조군
4= A 용액(60 ㎕), B 용액(60 ㎕), C 용액(60 ㎕), E 용액(20 ㎕) 실험군
100 ㎕ E 용액 = 8.8분에 0.6 units은 5.3 μMole이 분해되야 한다.
1, 2 및 3군의 반응 생성물은 37 ℃에서 30분의 배양 기간 후에만 생물학적 활성에 대하여 실험한 반면, 4군은 10, 30 및 60분의 배양 기간 후에 실험하였다. 4군에서 30분 배양 후 2배 희석된 반응 혼합물을 나타내는 5번째 군도 또한 생물학적 활성을 실험을 하였다.
시약
감마 글루타밀 전이효소, 2-1-18 돼지 신장을 칼자임 연구실(Calzyme Labs, San Luis Obispo, CA 93401, USA)로부터 구입하였으며 글리글라이신을 아크로스 오 가닉스(Acros Organics, New Jersey, USA)로부터 얻는 반면, L-글루탐산 5-(4-니트로아닐라이드)는 플루카(Fluka Chemie Switzerland)로부터 얻었다.
장치
반응 혼합물은 영국 갈렌파크(Gallenpark, England)에서 제조된 사이즈 1 배양기인 핫박스 오븐(HOT BOX oven)에서 배양되었고, 반면 흡광도는 안토스(Anthos) 2020 UV/VIS 분광광도계를 이용하여 측정되었다(@λmax 405 nm).
결과
다양한 효소 반응 생성물에 대한 돼지 방광요도 접합 괄약근 근육 응답의 대표적인 신호를 도 3에 나타내었고, 다양한 효소 반응 생성물에 대한 돼지 근위괄약근 근육 응답의 대표적인 신호를 도 4에 나타내었다. 실험한 상기 효소 반응 생성물은 하기와 같다:
도 3a - 50 mM 트리스 염산 완충액;
도 3b - 50 mM 트리스 염산 완충액, 감마 글루타밀 전이효소.
도 3c - 50 mM 트리스 염산 완충액, MgCl2.6H2O, 글라이실글라이신, 화학식 (Ia)의 화합물;
도 4a - 50 mM 트리스 염산 완충액, MgCl2.6H2O, 글라이실글라이신, 감마 글루타밀 전이효소, 화학식 (Ia)의 화합물;
도 4b - 0.3 mM 1R,2S-메톡사민.
감마 글루타밀 전이효소 및 글라이실글라이신과 함께 투여되는 화학식 (Ia)의 화합물은 1R,2S-메톡사민에서 관찰된 것(도 4b)에 비해 뚜렷하게 잘 정의된 돼지 방광 경부 근육의 수축 응답을 야기하였다(도 4a).
도 3a~c 및 도 4a~b에서 기재된 다양한 반응 조건하에서 돼지 방광 경부 근육 수축 응답의 비교 그래프를 도 5에 나타내었다. 상기 그래프는 1R,2S-메톡사민 및 화학식 (Ia)의 화합물과 효소 감마 글루타밀 전이효소 간의 개별적인 반응 생성물에 대한 방광요도 접합 괄약근의 수축 응답을 나타낸다. 상기 완충액 단독(0.06±0.03g) 및 완충액 + 효소 모두 어떠한 유의적인 활성(0.5±0.06g)도 제공하지 못한다. 또한 완충액-Mg2 +-글라이실글라이신-화학식 (Ia)의 화합물의 반응 혼합물도 어떠한 유의적인 활성도 제공하지 못한다(0.12±0.09g). 그러나 Mg2 +-글라이실글라이신-화학식 (Ia)의 화합물-효소의 혼합물은 왕성한 방광 활성을 일으켰다(1.62±0.17g). 1R,2S-메톡사민 또한 방광 반응을 일으켰으나(1.15±0.18g) 이는 Mg2 +- 글라이실글라이신- 화학식 (Ia)의 화합물-효소(1.62±0.17g)에서 관찰된 것보다 29% 낮은 효과였다. 결과는 감마 글루타밀 전이효소 존재시 검사에서 화학식 (Ia)의 화합물이 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 상기 화합물이 그의 강하게 소유한 활성을 나타내지 못했다는 상기 관찰과 공동으로 본 관찰은 상기 화합물이 프로드럭이라는 것을 암시한다.
방광요도 접합 괄약근 근육 스트립에 대한 반응 혼합물의 효과의 시간-진행(time-course)을 도 6에 나타내었다. 목표는 근육에 대한 가장 현저한 효과를 제공하는 화학식 (Ia)의 화합물과 반응에서 시간을 결정하는 것이었다. 상기 반응 혼합물의 효능을 배양 후 10, 30 및 60분에서 측정하였다. 10분(1.52±0.34g) 및 30분(1.62±0.17g) 동안 배양된 반응 혼합물간 반응은 뚜렷한 차이가 없었으나, 60분 배양(1.10±0.24g)에서는 작은 감소가 일어났다.
효소와 함께 30분 배양 후 2배 희석 후 방광요도 접합 괄약근 근육 스트립상의 화학식 (Ia)의 화합물의 효과를 도 7에 나타내었다. 상기 반응 혼합물의 방광 활성은 2배 희석 후 38%까지 감소되었다.
트리스 완충액 또는 염수 중 어느 하나에 용해시켜 제조한, 방광요도 접합 괄약근 근육 스트립상의 1R,2S-메톡사민(0.3mM)의 효과를 도 8에 나타내었다. 트리스 완충액(1.22±0.50g)에서 제조된 화학식 (Ia)의 화합물과 염수에서 제조된 것(1.15±0.18g) 간의 반응에서 상당한 차이는 없었다.
실시예 4
배뇨( micturition )에 대한 1R,2S- 메톡사민이 미치는 영향 조사
방법
연구는 하기 프로토콜에 따라 수행되었다:
실험 물질(Test substances) :
a) 4% w/w 겔 내 1R,2S- 메톡사민 1 중량%
b) 4% w/w 겔 내 1R,2S- 메톡사민 3 중량%
상기 4% w/w 겔은 96 ml의 0.5 M 아세테이트 완충액에 4 g의 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈를 포함한다. 4% w/w 겔 내의 1R,2S-메톡사민 1 중량%는 99 g의 4% 겔 내에 1 g의 1R,2S-메톡사민을 포함한다.
조사(Investigation )
44명의 대상을 포함하는 다른 목적을 위한 연구에 있어서, 각 대상은 항문내부와 관련하여(intraanally) 적용되는 3% 메톡사민 겔 또는 1% 메톡사민 겔 중 어느 하나를 가졌다. 약 1 g의 겔이 사용되었다.
결과
4명의 대상이 배뇨에서의 어려움을 기록하였고, 이때 두 명은 1% 겔을 받았고, 두 명은 3% 겔을 받았다. 다른 지원자들은 배뇨곤란의 경험이 보고되지 않았다.
결론
항문으로 1% 또는 3% 1R,2S-메톡사민 겔의 투여는 비뇨기 시스템에 영향을 미쳐 배뇨의 곤란을 야기한다.
관찰된 효과, 특히 배뇨의 곤란은 1R,2S-메톡사민 또는 신장 세관에서 1R,2S-메톡사민으로 변환되는 1R,2S-메톡사민 유도체의 요실금 및 긴장(tone) 상실 및/또는 방광 경부, 요로 및 요 괄약근 중 어느 하나 이상의 기능 상실의 결과를 초래하는 다른 질환의 치료에 대한 유용성을 나타낸다.
실시예 5
돼지 모델에 있어서 요역학 및 심혈관계 파라미터에 대한 화학식 ( Ia )의 화합물의 생체 내 연구
방법
수술 과정(Surgical Procedure )
이 연구에 고용된 동물 모델은 밀스(Mills)(1999)에 의해 이전에 기재된 돼지 생체 내 요역학 모델을 약간 변형하였다. 수술 과정은 본사 개인 자격증 보유자에 의해 진행되었다. 중량이 약 60 kg인 암컷 란드라스 돼지가 이 연구에 이용되었다.
마취(Anaesthesia )
돼지를 초기에 정맥 중심선을 통하여 케타민 염산염 15 mg/kg(ketaset, Willows Francis Veterinary, Crawley, UK) 및 미다졸람 0.2 mg/kg(Hypnovel, Roche Products Ltd, Welwyn Garden City, UK)으로 진정시켰다. 진정 작용은 보통 일반적인 마취의 도입 전 15~20 분에 유도되었다. 일반적인 마취의 유도 단계는 돼지 코 위에 고정되는 원뿔형 마스크를 통해 마취 기계로부터 전달되는 이산화질소 50%/산소 50% 내의 5% 할로탄(플루오탄, Astra ZenecaLtd, Macclesfield UK)을 이용하여 성취되었다. 상기 유도 단계 다음으로, 정맥 1% 프로포폴(intravenous 1% propofol)을 200 mg/hr의 속도로 사용하여 일반적인 마취의 유지 단계를 성취하였다.
카테터의 제조
도 9에 나타낸 바와 같이, 1.5 mm 구멍 및 1 mm 벽 두께의 실라스틱 관(Bibbly Sterilin Ltd, Stone, Uk)을 약 100 cm 길이인 카테터로 절단되었고; 각 동물을 위해 2개의 이러한 카테터들이 방광 선을 위해 요구되었으며(하나는 상기 방광을 충진용, 다른 것은 방광내부 선 측정용) 세번째 것은 복근압을 측정하기 위해 복강용으로 요구되었다. 각각의 근위 말단(proximal end)은 단일 밸로(valour) 폴리에스테르 섬유(Meadox Medicals, Oakland, NJ, USA)의 소매 끝동(cuff)을 실리콘 접착제(RS components, Corby, UK)를 이용하여 말단으로부터 약 3 cm를 고정시켰다. 이후의 이식(implantation)에 의한 혈관폐색(occlusion)을 방지하기 위하여 원위 말단(distal end)을 가늘게하고 그 내부에 몇개의 구멍을 내었다. 이들을 말단으로부터 20 cm 되는 곳을 이등분함으로써 2개의 방광 카테터를 더 제조하고, 이 후 실라스틱 시트(silastic sheet)의 작은 조각(2~1 cm)을 더 작은 반쪽을 따라 대략 중간까지 접착시켰다. 이들 두 반쪽은 이후 나일론 커넥터(Microplastics, Coventry, UK)를 이용하여 연결될 수 있다.
유치카테터의 이식( Implatation of indwelling catheters )
수술 시작시, 돼지를 요추 지역에 접근이 허용되도록 초기에 좌측 측면 위치로 위치시켰다. 각 카테터용 절개를 요추 중간부(lumbar dorsal midline)뿐만 아니라 단일 작은 우측 장골와(single small right iliac fossa incision) 절개를 수행하였다. 특별하게 고안된 투과침(trocar)을 사용하여 요추 절개(dorsal lumbar incision)에서 우측 장골와까지 복막 카테터 및 방광 카테터의 인접 부분에 터널을 뚫어, 근위 말단의 커프가 작은 피하낭에서 종결되었다. 각 절개는 2개의 단속(interrupted) 2/0 나일론 봉합으로 가까워졌고, 카테터의 혈관폐색을 피하도록 다루었다. 상기 돼지는 이후 똑바로 누운 자세(supine position)가 되고 하복부 절개가 이루어졌다. 스펜서-웰 집게(Spencer-Well forceps)를 사용하여 내부에서 바깥으로 복막 및 복부 벽 근육을 구멍을 내고 3개의 카테터를 잡아 복강 내부에 넣었다. 상기 긴 복막 카테터는 방광질 오목(vesicovaginal pouch)에 위치시켰다. 두 2/0 실크의 쌈지봉합(purse-string suture)이 방광의 정점에 위치되었고, 이들 각각의 중심을 지나는 절개를 수행하였다. 각 카테터의 루멘(lumen)이 개방된 채로 남겨지는 것을 보장하면서 방광 선의 중심에서 먼 말단의 더 짧은 반쪽은 이들 절개 및 쌈지 묶음을 통해 유발되었다. 다음 선 교체에 대한 안전성을 더 제공하 기 위하여 이들 카테터상에서 실라스틱 시트의 작은 조각의 각 모서리를 방광의 융모막에 봉합하였다. 상기 두 방광 카테터의 이들 원위 말단 부분은 이후 나일론 커넥터를 사용하여 근위 부분과 연결하였다. 복부 상처는 통틀어서 1 나일론으로 인접시키고, 이후 지방에 2/0 크롬산 장선(腸線) 및 피부에 단속 2/0 나일론으로 연결시켰다. 우측 장골와(iliac fossa) 상처는 속경사선 및 바깥경사선에 비크릴 및 피부에 단속 2/0 나일론으로 층을 이루어 인접시켰다. 하나의 방광선은 관의 또다른 조각에 외부로 부착되며 치료를 위한 방관 허용을 위해 48시간 동안 무배액으로 남겨졌다.
요도 및 동맥혈관( Urethra and arterial blood vessel cannulations)
마취의 도입 이후에, 상기 동물을 똑바로 누운 자세로 위치시키고, 신체 온도를 유지시키기 위하여 온수 덮개로 덮었다. 이후 작은 절개가 좌측 사타구니 부위(left groin area)에서 수행되고, 이를 통해 좌측 고동맥(left femoral artery)이 촉진(palpation)에 의해 확인되었다. 다음으로 상기 동맥에 동맥 14 Fr 캐뉼러(Abbocath-T, Abbott Ireland, 및 Sligo, Ireland)를 꽂았고, 이는 이후 동맥압 측정용 변압기에 연결되었다. 방광요도 접합 방광내압(Vesico-urethral junction cystometry)을 마이크로트랜듀서(microtranducer; Gaeltec LTD, Isle of Skye)로 장치 연결한 카테터를 사용하여 얻었다. 상기 요도에 캐뉼러를 꽂기 위해, 스펙큘럼으로 질을 열어 전방 질 벽에서 상위인 외부 요도 오리피스(external urethral orifice)를 노출시켰다. 상기 외부 오리피스를 검증하고, 그 다음으로 상기 카테터 를 직접 삽입한 후, 방광요도 접합 내에 위치될 때까지 점진적으로 당겼다.
프로토콜
동물 계측에 의거 및 안정화 기간 경과 후, 화학식 (Ia)의 화합물 없이 및 이의 첨가 투여(1 mg/kg. iv) 이후에 3개의 배뇨 순환(voiding cycle)이 기록되었다. 이 연구에서 고용된 화학식 (Ia)의 화합물의 투여량은 미니 돼지 생체 내 연구(Norgine International Research, 미발행)에서 화학식 Ib의 화합물의 심혈관계 효과를 기초로 하였다. 이 연구에서 상기 화학식 Ib의 화합물은 1 mg/kg, i.v. 에서 미니돼지의 수축기압 및 확장기압이 일시적으로 증가하였다. 상기 화학식 Ib의 화합물의 효과는 약물 투여 15분 후에 최대로 나타났으며, 수축기압 및 확장기압이 각각 23 및 57%까지 증가하였다(Norgine International Research, 미발행). 효소 연구에 관련된 이들 관찰은 1 mg/kg., i.v.에서 화학식 (Ia)의 화합물의 실험을 기초로 하였다.
각 배뇨 순환에 대하여, 상기 방광은 배뇨가 시작될 때까지 48 ml/min의 속도로 상온 염수가 방광내선을 통해 천천히 충전되었다. 각 순환 동안 하기에 파라미터가 기록되었다; 방광내압(IVP), 배뇨근 배뇨압(DvP), 방광요도 접합 임계 배뇨압(VUJTVP), 방광요도 접합 배뇨압(VUJVP), 복부압(AbP) 및 동맥압(AP). 다른 파라미터는 배뇨 순환의 지속을 포함하며, 이는 배뇨 순환(DVC)을 완성하기 위해 고려되는 시간과 랩(laps)에 대한 배뇨(DV)를 위해 고려되는 시간이다. 배뇨 부 피(VV) 및 잔여 부피(RV) 또한 얻었다. 방광 능력(BC)은 VV 및 RV의 합계로서 계산되었으나 반면 유속(FR)은 분당 측정된 VV이다. 또한 배뇨 효율도 확립되었고, BC로부터 VV의 백분율로서 측정되었다. 배뇨근(Detrusor) 최대압은 DvP = IVP - AbP으로 표현될 수 있는 방광내압 및 복부압 간의 차이값이다. 한 동물에 대한 데이타는 부재시(대조군) 및 화학식 (Ia)의 화합물의 추가 투여 이후 배뇨 순환의 평균을 나타내는 각각의 데이타 점으로 발생되었다.
결과
도 10a에 나타낸 바와 같이, 대조군 실험시 충전 단계 동안, 방광내압은 바탕 압력(8.40±0.17 cmH20)에서 임계배뇨압(threshold voiding pressure)(16.60± 1.61 cmH20)까지 점진적으로 증가하였다. 화학식 (Ia)의 화합물의 존재하에서 실험시 유사한 관찰(도 11a) - 8.53±0.34 cmH20의 바탕압력에서 16.23±1.16cmH20의 임계배뇨압까지 바탕 압력의 증가가 기록되었다. 대조군 실험(43.9±7.57 cmH20) 및 화학식 (Ia)의 화합물의 존재(41.1±8.3 cmH20) 간의 배뇨 단계 동안 발생되는 배뇨압에서 유의한 차이가 없었다(도 10a 및 11a, 표 1 및 도 13). 충전 동안 대조군은 38±8.11 cmH20, 화학식 (Ia)의 화합물은 28±10.11 cmH20의 결과를 나타내는 배뇨근 압력의 점진적 증가 또한 나타났다(표 1 및 도 13). 변화된 배뇨근 배뇨압은 대조군에서 화학식 (Ia)의 화합물까지 36.5% 강하를 나타내었다.
방광압력 파라미터에 대한 화학식 (Ia)의 화합물의 양성 효과와 대조적으로, 방광내압곡선의 정밀 분석 분석은 화학식 (Ia)의 화합물이 VUJ의 활성을 변형시키는 것으로 나타났다. 비교군 실험(도 10b)과 화학식 (Ia)의 화합물의 실험(도 11b)을 비교할 때, VUJ 바탕 압력에서 일시적인 증가의 독특한 상태가 화학식 (Ia)의 화합물의 실험에서 명백하였다. 이러한 효과는 배뇨 순환 전체에 걸쳐 잔존하는 현저한 자발적 활성에 의해 동반됨으로 나타났다(도 11b). 화학식 (Ia)의 화합물로 생성되는 VUJ 임계압력은 대조군에서 보여진 것보다 약 31% 더 높았다. 화학식 (Ia)의 화합물의 투여로 임계 VUJ 배뇨압의 15% 증가 또한 관찰되었다.
화학식 (Ia)의 화합물로 잔여 부피의 31% 감소가 관찰된 반면, 모든 다른 요역학 파라미터들은 좀 더 많이 또는 적게 불변한 채로 남아있는 것처럼 보이며, 상기 유속, 배뇨 유지 및 배뇨 간격은 대조군으로부터 각각 단지 2.4, 4.1 및 -4.7%의 근소하게 변화하였다. 배뇨 효율 또한 변함없이(uncompromised) 남아있는 것처럼 보이며, 90% 배뇨 효율은 대조군 실험에서 달성된 반면, 95%는 화학식 (Ia)의 화합물로 치료하에서 달성되었다.
동맥압 효과에 관하여, 화학식 (Ia)의 화합물은 대조군으로부터 15%의 차이를 유발시켰다. 그러나, 약물 투여 후 곧 동맥 라인 내 응고의 결과로 상기 동맥 라인이 관개(flush)되어야 함을 인지해야 한다. 이러한 반응은 관찰된 혈압 상승 에 기여할 것이다(도 12, 표 1 및 도 13).
결론
이들 데이타는 화학식 (Ia)의 화합물이 돼지 요역학 모델에서 요류 속도 방해 또는 배뇨 효율 손상 없이 방광요도 접합 바탕 압력(vesicourethral junction baseline pressure), 임계 압력 및 배뇨압을 상승시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 화학식 (Ia)의 화합물이 동맥압을 약간 증가시키는 반면, 그 효과는 화학식 Ib의 화합물에서 보여진 것보다 적게 두드러졌다 - 화학식 (Ia)의 화합물(1 mg/kg, i.v.)에서 동맥압의 15% 증가가 관찰된 것에 비해 화학식 Ib의 화합물(1 mg/kg, i.v.)에서는 수축기압 및 확장기압에 있어서 각각 23% 및 5%의 증가가 관찰되었다. 상술한 바와 같이, 화학식 (Ia)의 화합물의 동맥압의 증가는 라인 붉어짐(line flushing)으로 인한 인공적인 것일 수도 있다.
따라서 상기 데이타는 화학식 Ib의 화합물에서 보이는 원하지 않는 혈압 부작용을 최소화시키는 반면, 활성 1R,2S-메톡사민(화학식 Ib의 화합물)을 방광에 전달하 데 있어서 상기 프로드럭 시스템(화학식 (Ia)의 화합물)의 생존력을 나타낸다.
실시예 6
절제된 인체 피부에서 화학식 ( Ia )의 화합물의 포화 용액의 생체 외 경피 흡수의 관찰
이번 실험에서는 화학식 (Ia)의 화합물의 피부 투과를 관찰하였다.
방법
절개된 인체 피부
한 여성 환자로부터 모든 실험용(one run with 9 cells) 피부가 사용되었다. 상기 피부는 허벅지 수술에서 전체 피부를 절개하고, 부착된 지방 근육을 깨끗하게 제거하고 사용하기 전에 -18 ℃에서 저장하되, 6개월을 넘지 않도록 저장하였다.
실험 설계
이러한 실시예에서 설명한 바와 같이 생체 외 피부 투과 관찰을 수행하였다. 세포는 도 14에 나타낸 바와 같이 탑재되었다.
조건
세포: 프란츠 세포(Franz cell), 변이(modified)(s. Pic.1),
35 ml 부피, n=9
수용체: 0.9% NaCl 80% (V/V), PEG 400 20% (V/V), 0.1%
NaN3(Water HPLC quality, 가스 제거), 100 ml
투과 면적: 1.77 cm2
온도: 32 ± 0.5 ℃(물 배쓰)
회전 속도: 3(IKA 마그네틱 교반기); 별모양 피쉬(star-shaped fish)
샘플링 부피: 2.0 ml
치환 부피: 2.0 ml
샘플링 간격: 6, 12, 24, 48, 72 시간
실험 과정: 실험 용액용으로 3 ml의 도너 용액(donor 용액)을 피펫으로 용액 장치에 넣고 나사로 폐쇄시켰다. 이는 실험의 시작이다.
생성물
(계산을 위해 4.6 참조)
실험 용액 #1: Ethanol GTM에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물 용액.
용액은 실험 전날 551.5 mg의 화학식 (Ia)의 화합물을 25 ml의 Ethanol GTM(22.1 mg/ml 포화 용액)에 첨가함으로써 제조하였다. 농도는 0.030 mg/ml이었다(HPLC에 의해 결정됨, 용해도 농도).
실험 용액 #2: 톨루엔과 DMSO이 80:20(V/V)인 혼합물에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물 용액.
용액은 실험 전날 1236.2 mg의 화학식 (Ia)의 화합물을 25 ml의 톨루엔과 DMSO이 80:20(V/V)인 혼합물(49,5 mg/ml 포화 용액)에 첨가함으로써 제조하였다. 농도는 5.4 mg/ml이었다(HPLC에 의해 결정됨, 용해도 농도).
실험 용액 #3: 이소프로필미리스테이트와 파마솔브TM가 80:20(V/V)인 혼합물 에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물 용액.
용액은 실험 전날 550.4 mg의 화학식 (Ia)의 화합물을 25 ml의 이소프로필미리스테이트와 파마솔브TM가 80:20(V/V)인 혼합물(22 mg/ml 포화 용액)에 첨가함으로써 제조하였다. 농도는 0.052 mg/ml이었다(HPLC에 의해 결정됨, 용해도 농도).
분석
시료는 갈색 유리 HPLC 바이알로 이동시키고 분석 전에 -20 ℃에서 저장되었 다.
HPLC 파라미터
컬럼: Nucleosil C-18, 250 × 3 mm, 5 ㎛
컬럼 온도: 40 ℃
이동상 A: 0.01M 암모늄 포미에이트(1000 ml의 물에 0,63 g
의 암모늄 포미에이트를 용해시킨다)
이동상 B: 아세토니트릴
구배 프로그램: to, 95% A / 5% B
t10, 95% B, 선형 증가
t15, 95% B, 일정 용매(isocratic)
t17, 5% B, 선형 증가
t25, 정지
유속 : 0.5 ml/min
주입 부피: 50 ㎕
검출: 290 nm
체류 시간: 화학식 (Ia)의 화합물 약 5.9분
정지 시간: 25 분
주입 수: 2
품질 보증( Quality assurance )
모든 실험은 EG-cGMP 규칙에 의해 윤곽이 잡힌 품질 요구에 따라 수행된다. 사용되는 실험 장비는 정기 기간에 모니터(monitor)되며, 국내 및 국제 기준에 따라 점검된다.
사용되는 모든 화학물질 및 시약은 분석당시 제조업자에 의해 기재된 보존기간 이내에 있었다. 테스트된 약물의 원재료는 실시예 1에 기재된 바에 따라 합성된 물질이고, 100%로 되게 하였으며 그대로 사용하였다.
싱크 조건(Sink conditions)은 전체 실험을 통해 유지되었다(수용 매기체에서의 용해도는 가장 많이 투과하는 실험 용액의 72시간 후 측정된 양보다 적어도 10배 많았다). 용액 #2가 49,5 mg/ml의 가장 높은 약물 로딩을 함유하기 때문에, 수용체에서 측정된 완전 투과량은 0,24 mg/ml이었으며, 이는 인자가 200 낮으므로 싱크 조건은 유지되었다. 수용체 매개체 내에서 화학식 (Ia)의 화합물의 포화 농도는 130 mg/ml이었으며, 이는 투과된 양보다 인자가 540 많았다. 검출 한계는 0,12 ㎍/ml까지 검출되었다.
수용체 상에서 세포의 긴장(tightness) 및 공기방울의 부재를 모니터하여 각 샘플링 지점을 얻었다.
용액을 함유하는 모든 약물은 빛으로부터 차단되어 보관되었다. 상기 용액은 다만 내용물이 약간 증가하는 경우에만 출발에 비해 32 ℃에서 72시간 동안 순 도에 관하여 안정하였는데, 이는 아마도 더 많은 API의 가용화 때문이다.
미가공 데이타(raw data)로부터 값 계산
포화 인자( saturation factor )의 계산
다른 투과 비율로 비교되고 적용된 매개체에서 다른 용해도가 예상되는 모든 경우에서, 모든 용액은 무한한 투여량을 가져야 하며, 예를 들면 아무리 많은 양이 녹는다고 할지라도 도너 용액(donor 용액)에 충분한 양의 약물이 있어야 한다. 이는 포화 용액의 적용에 의해 달성되었고, 이 용액은 용해가능한 것(예를 들면, 현탁액이 되는 것)보다 더 많은 양의 약물이 함유되어 있는 용액이었다. 따라서, 상기 용액의 제조로부터, 용매 부피당 화학식 (Ia)의 화합물의 양이 알려졌다. 상기 양은 포화 용액으로 명명되었다. 이후 상기 포화 용액은 원심분리되고 상기 용액의 맑은 상청액의 용해도 농도는 HPLC에 의해 정량적으로 결정되었다. 상기 포화 인자는 포화 용액:용해도 농도의 비율로부터 계산되었다. 높은 비율은 높은 수준의 무한 투여량(infinite dose)을 나타내었다.
유속[㎍/ cm 2 /h] 및 래그타임의 계산( Calculation of flux rate in ㎍/ cm 2 /h] and lag - time )
모든 제형의 유속은 시간(h)에 대하여 정상상태 동안 평균 누적 투과량(㎍/cm2)으로부터 선형 회귀 방법에 의해 계산되었다(엑셀 소프트웨어로 수행; 회귀 계 수는 > 0.98). 실험 용액 #1의 선형 회귀는 12~48시간으로부터 계산되었다(48시간 이후에는 투과가 감소하기 때문에 72시간까지는 계산하지 않는다). 실험 용액 #2의 선형 회귀는 24~72시간으로부터 계산되었다(12시간 이후에 시작되는 긴 정상상태 래그타임 때문). 실험 용액 #3의 선형 회귀는 12~72시간의 전 시간에 걸쳐 계산되었다. 래그타임(적용 이후 정상상태의 투과가 시작되는 시간)는 시간축을 갖는 회귀선의 교점으로부터 얻었다.
촉진 인자의 계산
촉진 인자는 실험 용액 #1(대조 매개체): 실험 용액 #2 또는 #3(촉진자를 갖는 매개체)로부터 ㎍/cm2/h인 유속의 비율이었다. 인자가 높을수록, 사용된 촉진자 조성물은 효능이 더 높았다.
가정된 경피 전달 속도의 계산
경피 전달 속도는 생체 외와 같이 생체 내도 동일하다고 가정되었다(이는 물론 이후의 동역학 연구에 의해 증명될 것이다). 패치 크기는 20 cm2로 하였고, 이는 중간 크기이며(작은 패치는 5 cm2; 큰 패치는 60 cm2), 전달 속도는 매일 계산되 었다(1일 = 24시간).
전체:
(정상상태 유속[㎍/cm2/h] × 20 [cm2] x 24 [h]) / 1000
= 전달 속도 [mg/20 cm2/24 h].
전달 속도는 [mg/패치/일]로 표현되었다.
결과
결과를 도 15~18에 요약정리하였다.
도 15는 실험 용액 #1(Ethanol GTM에 용해된 화학식 (Ia)의 화합물)의 개별값 및 평균값을 나타낸다. 도 16은 실험 용액 #2(톨루엔:DMSO에 용해된 화학식 (Ia))의 화합물의 개별값 및 평균값을 나타낸다. 도 17은 실험 용액 #3(이소프로필미리스테이트: 파마솔브TM에 용해된 화학식 (Ia))의 화합물의 개별값 및 평균값을 나타낸다. 도 18에는 세 용액으로부터의 평균값이 함께 나타나 있다.
실험 용액 #1:
래그타임(정상상태 유속이 도달될 때까지의 시간)은 6시간이었고, 이는 국부 적용에 매우 일반적이었다. 상기 정상상태 유속은 0.318 ㎍/cm2/h로서 계산되었다. 만일 생체 외 유속이 생체 내의 것과 동일하고 치료된 부위가 20 cm2로 가정된다면, 하루에 0.15 mg의 화학식 (Ia)의 화합물이 신체에 전달될 수 있다.
이 용액은 "대조군"으로서 사용되었다. 원래는 물이 계획되었으나, 상기 화합물의 높은 수용해성 때문에 Ethanol G(2-옥틸-도데카놀)이 사용되었으며, 이는 촉진자로서 보고되지 않았지만 피부에 높은 친화성을 갖는다.
6개의 결과중 하나는 평가로부터 삭제되었다. 이 세포는 10의 더 높은 투과 인자를 갖기 때문에, 다른 5개의 대한 평균값을 현저히 높이기 때문이다. 피부 내 소수의 이형(異形)은 실험 후에 인식되었으며, 이는 잘못된 높은 결과에 대한 이유로 사료되므로 이 세포는 이상치(outlier)로서 삭제되었다.
실험 용액 #2:
래그타임(정상상태 유속이 도달될 때까지의 시간)은 18시간이었고, 이는 국부 적용에 매우 길었다. 상기 정상상태 유속은 85.09 ㎍/cm2/h로서 계산되었다. 만일 생체 외 유속이 생체 내의 것과 동일하고 치료된 부위가 20 cm2로 가정된다면, 하루에 40.8 mg의 화학식 (Ia)의 화합물이 신체에 전달될 수 있다. 원래 상기 용액은 물:DMSO가 30:70인 혼합물을 포함하여야 한다. 그러나 양쪽 매질에서의 화학식 (Ia)의 화합물의 높은 용해도 때문에 DMSO의 양을 20%로 감소하였다. DMSO 에 혼화성을 갖고 물보다는 낮은 용해도를 갖는 매질이 바람직하였다. 활성을 너무 많은 소비 없이 빠르게 확인할 수 있는 단 하나는 톨루엔이었다. PEG 400, 파라핀, n-헥산 및 텐사이드 트윈 80(tenside Tween 80)과 같은 매개체는 유용하지 못하다. 톨루엔은 피부의 지방산을 고갈시키기 때문에 많은 양에 있어서 피부에 매개체로서 일반적으로 사용되지는 않는다. 지방산은 각질층의 장벽 기능을 위해 필요하다. 화학식 (Ia)의 화합물과 같은 친수성 약물에 있어서, 상기 각질층은 가장 강한 장벽이 될 수 있으며, 이는 톨루엔에 의해 여기서 손상되었다고 가정될 수 있다. 따라서 이러한 투과 결과는 화학식 (Ia)의 화합물에 대하여 가능한 최대 촉진이 증가 또는 감소하는 것을 나타낸다고 예상된다.
실험 용액 #3:
래그타임(정상상태 유속이 도달될 때까지의 시간)는 9시간이었고, 이는 국부 적용에 매우 일반적이었다. 상기 정상상태 유속은 4.4 ㎍/cm2/h로서 계산되었다. 만일 생체 외 유속이 생체 내의 것과 동일하고 치료된 부위가 20 cm2로 가정된다면, 하루에 2.1 mg의 화학식 (Ia)의 화합물이 신체에 전달될 수 있다.
원래는 에탄올, 이소프로필미리스테이트(IPM) 및 N-메틸-2-피롤리돈(파라솔브)이 27:64:9의 비율인 3차 혼합물이 계획되었다. 이 혼합물은 문헌(Suwanipidokkul N. et al.)으로부터 얻었다. 상기 혼합물은 돼지 피부에서 지 도부딘(AZT)의 경피성 전달 촉진자로서 테스트되었고, 치료 목적에 효과적인 것으로 밝혀졌다. AZT는 3'-아지도-3'-데옥시티미딘이고, 용해도 및 분자량을 비교해볼 때 화학식 (Ia)의 화합물에 비해 친수성 분자이므로 이들 촉진자는 테스트에 가치가 있다고 사료되었다. 그러나, 에탄올 내에서 화학식 (Ia)의 화합물의 높은 용해도 때문에, 상기 혼합물은 이원계 혼합물(binary mixture), 예를 들면 IPM:파마솔브가 80:20인 혼합물로 변경되었다. 양쪽 부형제 모두 크림 뿐만 아니라 자가점착성 경피 패치(self-adhesive transdermal patch)의 기본 제형으로 통합될 수 있다.
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Claims (18)

  1. 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물 포함하는 화합물:
    Figure 112007062207198-PCT00008
    (Ⅰ)
    이때 R1은 화학식 (I)의 화합물이 신장 세관 내에서 활성 형태 또는 이의 활성 대사물질로 변환되는 1R,2S-메톡사민의 프로드럭인 것과 같은 기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1은 아미노전이효소에 의해 분해될 수 있는 기인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 R1은 감마 글루타밀 전이효소에 의해 분해될 수 있는 기인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1은 1R,2S-메톡사민의 아미노기에 아미드 결합을 통해 연결되는 기인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ia) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 용매화물 또는 염, 이러한 염의 용매화물을 포함하는 화합물:
    Figure 112007062207198-PCT00009
    (Ⅰa).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용되는 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 요실금의 예방 또는 치료용 약제로서 사용되는 화합물.
  8. 요실금의 예방 및 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 경구 이외의 다른 경로에 의한 투여에 적합한 형태인 약학적 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 경피 투여에 적합한 형태인 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 피부 투과 촉진자를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 피부 투과 촉진자는 이소프로필미리스테이트와 파마 솔브TM(N-메틸피롤리돈)의 혼합물인 약학적 조성물.
  14. 치료를 필요로 하는 포유동물에게 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물의 치료학적 유효량 또는 제9항 또는 제13항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 요실금 치료 방법.
  15. 제8항 또는 14항에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물은 경피 투여되는 방법 또는 용도.
  16. 적합한 커플링제의 존재 및 선택적으로 염기의 존재하에서 1R,2S-메톡사민을 화학식 R1-OH의 화합물(R1은 제1항에서 정의한 바와 같다)과 반응시키는 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물의 제조방법.
  17. 선택적으로 염기의 존재하에서 1R,2S-메톡사민을 화학식 R1-L의 화합물(R1은 제1항에서 정의한 바와 같고, L은 적합한 이탈기이다)과 반응시키는 단계를 포함하 는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물의 제조방법.
  18. 적합한 염기의 존재 및 선택적으로 1 이상의 적합한 커플링제의 존재하에서 P1 및 P2는 적합한 보호기인 화학식 (Ⅱ)의 화합물을 1R,2S-메톡사민과 반응시키고, 이후 상기 보호기를 제거하는 단계를 포함하는 제5항의 화합물의 제조방법:
    Figure 112007062207198-PCT00010
    (Ⅱ).
    .
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