KR20070091283A - 레티놀-레티놀 결합단백질(ｒｂｐ)-트랜스타이레틴(ｔｔｒ) 복합체 형성의조절 인자 - Google Patents

레티놀-레티놀 결합단백질(ｒｂｐ)-트랜스타이레틴(ｔｔｒ) 복합체 형성의조절 인자 Download PDF

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나탄 엘. 마타
윤 한
케네스 위더
제이 리츠터
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시리온 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 트랜스타이레틴(TTR), 레티놀 결합 단백질(RBP) 및 레티놀의 복합체 형성을 탐지하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자의 스크리닝을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법 및 조성물은 노인성 황반 변성증 및/또는 이영양증의 치료 및/또는 예방을 위한 치료 제제를 위해 제공한다.
레티놀, 황반 변성증, 노인성, 안구, 안과 질환, 질병

Description

레티놀-레티놀 결합 단백질(ＲＢＰ)-트랜스타이레틴(ＴＴＲ) 복합체 형성의 조절 인자{MODULATORS OF RETINOL-RETINOL BINDING PROTEIN(RBP)-TRANSTHYRETIN(TTR) COMPLEX FORMATION}
관련 출원에 대한 교차-참증
본 출원은 2004년 11월 4일 출원된 미국 가출원 제60/625,532호, 2004년 11월 19일 출원된 미국 가출원 제60/629,695호, 2005년 3월 11일 출원된 미국 가출원 60/660,904호, 및 2005년 4월 18일에 출원된 미국 가출원 제60/672,405호를 우선권으로 주장하며, 상기 모든 문헌을 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다.
기술 분야
본 발명의 방법 및 조성물은 안과성 병태의 치료에 관한 것이다.
레티노이드(Retinoid)는 정상적인 성장, 발달, 면역성, 재생, 시각, 및 기타 생리적 과정의 유지에 필수적이다. 바꾸어 말하면, 레티놀의 비정상적인 생산이나 프로세싱은 황반 변성증 등을 포함하는 질병 진행의 징후와 관련된다.
황반 변성증은 미국에서 55세 이상의 사람들이 시력을 잃게 되는 주요 원인이 되는 안구 질환 군이며, 천만 이상의 미국인들이 이를 앓고 있다. 일부 연구에 의하면 지난 10년에 비해 새로운 황반 변성증 환자의 수가 6 배 증가한 것으로 추 정되며, 유행성의 특징을 나타내고 있다. 노인성 황반 변성증(age-ralted macular degeneration) 또는 이영양증(dystrophy)은, 특히 소모성 질환이며, 점차적으로 시력을 잃게되어 결국 중심 시력에 심각한 손상을 야기하게 된다.
최근까지, 황반 변성증을 효과적으로 치료하는 방법이 없다. 따라서, 이러한 질병을 치료할 수 있는 치료 조성물을 스크린하는 분석법을 제공해야 하는 절박한 요구가 존재한다.
- 발명의 요약 -
본 발명에서는 레티놀-레티놀 결합 단백질(RBP)-트랜스타이레틴(TTR) 복합체의 형성을 조절하는 제제를 검출하기 위한 방법 및 조성물에 관하여 개시한다. 또한 본 발명에서는 레티놀-RBP-TTR 복합체를 검출, 정량화, 및/또는 모니터링하기 위한 방법 및 조성물에 대하여 개시한다. 본 발명에서는 또한 레티놀-레티놀 결합 단백질(RBP)-트랜스타이레틴(TTR) 복합체의 형성을 조절하는 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 황반 변성증의 습성 및 건성 형태 및 이영양증 및 지도상 위축증(geographic astrophy)을 포함하는 안과성 병태의 치료 방법을 개시한다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 RBP, 레티놀 및 TTR을 함유하는 샘플에서, 이들이 형성한 복합체의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 레티놀-RBP-TTR 복합체를 검출 및/또는 정량화를 제공하며, 상기 TTR의 적어도 일부는 표지(label)를 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 TTR은 형광 부분(moiety)으로 표지화된다. 다른 구체예에서, 상기 형광 부분은 수용체(acceptor) 형광 부분이다. 다르게는, 상기 복합체는 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer)를 통해 검출할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 형광 부분은 380 ㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하고 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광한다. 또 다른 구체예에서, 상기 형광 부분은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드 또는 ALEXA FLUOR®(형광 화학 물질 및 생분자 표지한 키트) 염료로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 샘플 내 RBP의 아미노산 기의 적어도 일부가 여기하도록 샘플에 조사할 수 있다.
다르게, 본 발명에서 개시한 상기 표지화한 TTR-RBP-레티놀 복합체는 275 ㎚ 내지 295 ㎚의 파장에서 여기시키며 발광 파장은 330 ㎚ 내지 650 ㎚에서 측정한다. 다른 구체예에서, 발광 스펙트럼을 측정하기 위한 여기 파장은 315 ㎚ 내지 345 ㎚일 수 있으며, 발광 파장은 525 ㎚ 내지 600 ㎚에서 측정할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 표지화한 TTR은 고상 지지체 상에 고정시킬 수 있다. 다르게는, 상기 RBP를 고상 지지체상에 고정시킬 수 있다. 본 발명에서 개시하는 고상 지지체는 나노입자를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하는 샘플은 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 또는 마이크로어레이(microarray)에서 항온반응시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 샘플은 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 억제제를 더 포함한다. 또한, 일 구체예에서, 상기 억제제는 레티닐 유도체이다.
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물은 샘플 내 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성을 검출 및/또는 정량화하도록 제공되며, 상기 샘플은 RBP, 레티놀, 및 형광 부분에 부착된 TTR을 포함하고, 레티놀-RBP-TTR 복합체가 형성시키기에 충분한 조건하에서 상기 샘플을 항온반응시키는 단계 및 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 복합체는 형광 공명 에너지 전이를 통해 검출하고, 상기 형광 부분은 380 ㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하고 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 275 ㎚ 내지 295 ㎚에서 발광 스펙트럼을 측정하기 위한 여기 파장을 제공하며 발광 파장은 330 ㎚ 내지 650 ㎚에서 측정될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 315 ㎚ 내지 345 ㎚에서 발광 스펙트럼을 측정하기 위한 여기 파장을 제공하며, 발광 파장은 525 ㎚ 내지 600 ㎚에서 측정할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 샘플 내 레티놀-RBP-TTR 복 합체 형성의 조절 인자를 스크리닝 하도록 제공되며, 상기 샘플은 하나 이상의 후보 조절인자, 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하고, 상기 방법은 레티놀-RBP-TTR 복합체가 형성될 수 있는 충분한 조건하에서 상기 샘플을 항온반응시키는 단계 및 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 더 포함하고, 여기서 후보 조절 인자의 항온 만응 후 복합체의 발광 스펙트럼의 변화는 레티놀-RBP-TTR 복합체의 조절을 의미한다. 일 구체예서, 상기 TTR 표지는 형광 부분이다. 다른 구체예에서, 상기 형광 부분은 수용체 형광 부분이다.
또 다른 구체예에서, 상기 복합체는 형광 공명 에너지 전이를 통해 검출한다. 다른 구체예에서, 상기 형광 부분은 380㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하고 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광한다. 다른 구체예에서, 상기 형광 부분은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드 또는 ALEXA FLUOR®(형광 화학 물질 및 생분자 표지한 키트) 염료로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
일 구체예에서, RBP의 아미노산 부분의 적어도 일부를 여기하기에 충분한 광으로 상기 샘플을 조사할 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플 내 RBP의 적어도 일부는 샘플 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체를 형성한다.
다른 구체예에서, 상기 여기 파장은 275 ㎚ 내지 295 ㎚로 설정할 수 있으며 발광 파장은 330 ㎚ 내지 650 ㎚에서 측정한다. 다르게는, 여기 파장은 315 ㎚ 내지 345 ㎚로 설정할 수 있으며, 발광 파장은 525 ㎚ 내지 600 ㎚에서 측정한다.
또한, 본 발명에서 개시하는 방법은 고상 지지체 상에 고정된 표지화한 TTR을 포함할 수 있다. 다르게는, RBP를 고상 지지체 상에 고정할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 고상 지지체는 나노입자일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 샘플은 마이크로타이터 플레이트 또는 마이크로어레이에서 항온 반응시킨다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 샘플 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체의 조절 인자를 스크리닝 하도록 제공되며, 상기 샘플은 하나 이상의 후보 조절 인자, 수용체 형광 부분에 부착된 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하고, 상기 방법은 레티놀-RBP-TTR 복합체를 형성시키기에 충분한 조건 하에서 상기 샘플을 항온 반응시키는 단계, 및 상기 샘플의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 후보 조절 인자의 항온 반응 후 상기 복합체의 발광 스펙트럼이 변하는 것은 레티놀-RBP-TTR 복합체의 조절을 의미한다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 샘플 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체의 조절 인자를 스크리닝하도록 제공되며, 상기 샘플은 하나 이상의 후보 조절 인자, 수용체, 형광 부분에 부착된 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하며, 상기 방법은 레티놀-RBP-TTR 복합체를 형성시키기에 충분한 조건하에서 상기 샘플을 항온 반응시키는 단계, 및 형광 공명 에너지 전이를 통해 상기 샘플의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 더 포함하며, 후보 조절 인자의 항온 반응 후 복합체의 발광 스펙트럼이 변하는 것은 레티놀-RBP-TTR 복합체가 조절되는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 또한 샘플 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체의 조절 인자의 스크리닝하도록 제공되며, 상기 샘플은 하나 이상의 후보 조절 인자, 수용체 형광 부분에 부착된 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하고, 상기 방법은 레티놀-RBP-TTR 복합체를 형성시키기에 충분한 조건 하에서 상기 샘플을 항온 반응시키는 단계, 하나 이상의 후보 억제제를 첨가하는 단계, 및 상기 샘플의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 후보 조절 인자의 항온 반응 후 상기 복합체의 발광 스펙트럼이 변하는 것은 레티놀-RBP-TTR 복합체가 조절되는 것을 의미한다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 생체 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자를 스크리닝하도록 제공되며, 상기 방법은 표지화한 TTR을 개체에 주입하는 단계, 상기 개체에게 하나 이상의 후보 조절 인자를 도입하는 단계, 상기 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 및 상기 샘플의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하며, 후보 조절 인자의 도입 후 복합체의 발광 스펙트 럼이 변하는 것은 생체 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체가 조절되는 것을 의미한다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 생체 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자를 스크리닝하도록 제공되며, 상기 방법은 수용체 형광 부분에 부착된 TTR을 개체에게 주입하는 단계, 하나 이상의 후보 조절 인자를 상기 개체에 도입하는 단계, 상기 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 및 형광 공명 에너지 전이를 통해 상기 샘플의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 후보 조절 인자의 도입 후 상기 복합체의 발광 스펙트럼이 변하는 것은 생체 내에서 레티놀-RBP-TTR 복합체가 조절되는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 구체예에서, TTR 및 상기 TTR의 적어도 일부를 표지화하기 위한 수단을 포함하는 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자를 스크리닝 하기 위한 키트가 제공된다. 일 구체예에서, 상기 키트는 레티놀 및 RBP를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 키트는 TTR을 표지화하기 위한 형광 표지화 수단을 제공한다. 다른 구체예에서, 키트 내의 형광 표지는 수용체 형광 부분이다. 일 구체예에서 키트 내 수용체 형광 부분은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N,N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포 네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드 및 ALEXA FLUOR®염료로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 키트의 수용체 형광 부분은 380 ㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하며 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광한다. 또한, 키트의 RBP 및/또는 표지화한 TTR은 고상 지지체 상에 고정시킬 수 있다. 일 구체예에서, 키트의 고상 지지체는 나노입자일 수 있다.
다른 구체예에서, 표지화한 TTR 분자가 제공되며, 이때 표지화한 TTR은 형광 부분에 부착되어 있다. 일 구체예에서, 표지화한 TTR 분자에 부착된 형광 부분은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3- (숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드 또는 ALEXA FLUOR®염료로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 표지화한 TTR 분자에 부착된 수용체 형광 부분은 380 ㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하며 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광한다. 또한, 표지화한 TTR은 고상 지지체에 부착될 수 있다.
다른 구체예에서, 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하는 조성물이 제공된다. 일 구체예에서, 상기 방법 및 조성물은 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하는 조성물에 의해 형성되는 복합체를 더 제공한다.
또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 후보 치료 제제를 더 포함한다. 일 구체예에서, 후보 치료 제제는 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 또는 항체이다. 다른 구체예에서, 후보 치료 제제는 레티닐 유도체이다.
다른 구체예에서, 상기 조성물의 표지화한 TTR은 형광 부분에 부착될 수 있다. 일 구체예에서, 형광 부분은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에 틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드 또는 ALEXA FLUOR®염료로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다르게는, 상기 조성물의 형광 부분은 380 ㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하며 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광한다. 일 구체예에서, 표지화한 TTR은 고상 지지체에 부착된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 황반 변성증(노인성 황반 변성증의 습성 형태 및 건성 형태를 모두 포함함) 또는 이영양증의 치료를 위한 치료 제제를 동정하도록 제공되며, 이는 레티놀-RBP-표지화한 TTR 복합체를 형성시키기에 충분한 조건하에서 하나 이상의 후보 치료 제제, 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하는 샘플을 항온 반응시키는 단계, 및 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하고, 이때 상기 후보 치료 제제는 항온 반응 후 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 감소시킨다.
일 구체예에서, TTR 표지는 형광 부분이다. 다른 구체예에서, 형광 부분은 수용체 형광 부분이다. 일 구체예에서, 상기 복합체는 형광 공명 에너지 전이를 통해 검출한다. 다른 구체예에서, 형광 부분은 380 ㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하며 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광한다. 일 구체예에서, 형광 부분은 N-((2-(아이오도아세트 옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드 또는 ALEXA FLUOR®염료로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 샘플을 RBP의 아미노산 부분 중 적어도 일부를 여기시키기에 충분한 광으로 조사한다. 또한, 다른 구체예에서, 샘플 내 RBP의 적어도 일부는 레티놀-RBP-TTR 복합체를 형성한다.
또 다른 구체예에서, 여기 파장은 275 ㎚ 내지 295 ㎚이고 발광 파장은 330 ㎚ 내지 650 ㎚에서 측정된다. 다르게는, 여기 파장은 315 ㎚ 내지 345 ㎚이고, 발광 파장은 525 내지 600 ㎚에서 측정된다. 일 구체예에서, 표지화한 TTR 또는 RBP는 고상 지지체 상에 고정시킨다. 상기 고상 지지체는 또한 나노입자일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 샘플은 마이크로타이터 플레이트 또는 마이크로어레이에서 항온 반응시킨다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 후보 치료 제제는 소분자, 폴리펩티드, 핵산 또는 항체이다. 다른 구체예에서, 후보 치료 제제는 레티닐 유도체이다. 다르게, 상기 레티닐 유도체는 N-(4-히드록시페닐)레틴아미드("HPR" 또는 "펜레티니드" 또는 "4-히드록시페닐레틴아미드" 또는 "히드록시페닐 레틴아미드"라고도 함), N-(4-메톡시페닐)레틴아미드("MPR"; HPR의 가장 우세한 대사 산물), 또는 에틸레틴아미드이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 황반 변성증(노인성 황반 변성증의 습성 형태 및 건성 형태를 모두 포함함) 또는 이영양증의 치료를 위한 치료 제제를 동정하기 위해 제공되며, 상기 방법은 TTR-RBP-레티놀 TTR 복합체를 형성시키기에 충분한 조건하에서 하나 이상의 후보 치료 제제, 수용체 형광 부분에 부착된 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하는 샘플을 항온 반응시키는 단계, 및 형광 공명 에너지 전이를 통해서 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 검출하는 단계를 포함하며, 이때 상기 후보 치료 제제는 항온 반응 후 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 감소시킨다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법은 레티놀, RBP 및 TTR을 포함하는 복합체 형성의 조절 인자를 제공하며, 이때 상기 조절 인자는 또한 레티놀, RBP 및 표지화한 TTR을 포함하는 복합체의 형성도 조절한다. 일 구체예에서, 상기 TTR은 형광으로 표지화되어 있다. 일 구체예에서, 조절 인자의 복합체는 시험관 내 샘플 내에 존재한다. 다른 구체예에서, 상기 복합체는 생체 내 샘플 내에 존재한 다. 일 구체예에서, 상기 조절 인자는 레티닐 유도체를 더 포함한다. 다르게는, 상기 조절 인자의 레티닐 유도체는 N-(4-히드록시페닐)레틴아미드("HPR"), N-(4-메톡시페닐)레틴아미드("MPR"), 또는 에틸레틴아미드이다.
상기 언급한 모든 스크리닝 또는 검출 또는 측정 또는 정량화 방법, 전략, 조성물 및 키트에 있어서, 다음의 후속 구체예들이 단독으로 또는 임의 조합으로 더 사용될 수 있다: (a) 상기 샘플은 동결시키지 않은 것이다; (b)상기 샘플은 최대 약 2 주 동안 동결시켰던 것이다; (c) 상기 샘플은 디메틸설폭시드를 함유하지 않는다; (d) 상기 샘플은 최대 약 8 %의 디메틸설폭시드를 함유한다; (e) 상기 샘플은 고효율(high-throughput) 방법을 사용하여 수행한다; (f) 상기 샘플은 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 함유된다; (g) 4량체 TTR에 대한 표지의 몰 %는 5 % 미만이다; (h) 4량체 TTR에 대한 표지의 몰 %는 3 % 미만이다; (i) 4량체 TTR에 대한 표지의 몰 %는 2.5 % 미만이다; (j) 4량체 TTR에 대한 표지의 몰 %는 1.8 % 미만이다; (k) 화학식 I의 화합물을 사용한다; (l) 펜레티니드를 사용한다; (m) 펜레티니드의 대사 산물을 사용한다; (n) 샘플에 레티놀-RBP-TTR 형성 조절 인자의 첨가를 통해 검출 신호의 감소가 일어난다; (o) 레티놀-RBP-TTR 복합체로부터 검출되는 신호는 조절 인자의 농도 함수로 측정한다; (p) 레티놀-RBP-TTR 복합체로부터 검출되는 신호는 분광계(spectrometer)를 사용하여 측정한다; (r) 레티놀-RBP-TTR 복합체로부터 검출되는 신호는 이중-회절격자(double-grating) 발광 분광계를 사용하여 측정한다; (s) 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자는 인간에게 투여시 혈청의 레티놀 농도를 저하시킨다; (t) 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자는 인간에게 투여시 안구 내 레티놀의 농도를 저하시킨다; (u) 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자는 인간에게 투여시 안구 내 레티노이드의 농도를 저하시킨다; (v) 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자는 인간에게 투여시 안구 내 A2E의 농도를 저하시킨다; 또는 (w) 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자는 인간에게 투여시 인간 환자의 노인성 황반 변성증(노인성 황반 변성증의 습성 형태 및 건성 형태 모두를 포함함)을 치료하는 데 사용된다. 상기 언급한 모든 구체예에서, "TTR"은 형광단(fluorophore)으로 표지화시킬 수 있다.
다른 구체예는 황반 변성증(노인성 황반 변성증의 습성 형태 및 건성 형태를 모두 포함) 및 이영양증 및 지도상 위축증을 포함하는, 안과성 병태의 치료 방법이며, 이는 레티놀-레티놀 결합 단백질(RBP)-트랜스타이레틴(TTR) 복합체의 형성을 조절하는 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 치료 방법의 다른 구체예에서, 레티놀-레티놀 결합 단백질-(RBP)-트랜스타이레틴(TTR) 복합체의 형성을 조절하는 화합물은 all-trans 레티닐 유도체; 또는 이의 활성 대사 산물, 또는 약학적으로 허용가능한 프로드러그 또는 용매화물이며, 이때 all-trans 레티닐 유도체는 유효량으로 1회 이상 투여되며 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
Figure 112007040817382-PCT00001
상기 식에서, X1는 NR2, O, S, CHR2로 이루어진 군으로부터 선택되고; R1은 (CHR2)x-L1-R3이며, 여기서 x는 0, 1, 2, 또는 3이고; L1은 단일 결합이거나 -C(O)-이며; R2는 수소, (C1-C4)알킬, F, (C1-C4)플루오로알킬, (C1-C4)알콕시, -C(O)OH, -C(O)-NH2, -(C1-C4)알킬아민, -C(O)-(C1-C4)알킬, -C(O)-(C1-C4)플루오로알킬, -C(O)-(C1-C4)알킬아민, 및 -C(O)-(C1-C4)알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분이며; R3는 수소이거나 (C2-C7)알케닐, (C2-C7)알키닐, 아릴, (C3-C7)시클로알킬, (C5-C7)시클로알케닐, 및 복소환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 1∼3의 독립적으로 선택되는 치환기로 임의 치환되는 부분이며, 단 x가 0이고 L1이 단일 결합일 때 R3는 H가 아니다.
다른 구체예에서, (a) X1은 NR2이고, 이때, R2는 H이거나 (C1-C4)알킬이고; (b) x는 0이며; (c) x는 1이고 L1은 -C(O)-이며; (d) R3는 임의 치환되는 아릴이고; (e)는 R3는 임의 치환되는 헤테로아릴이고; (f) X1은 NH이고 R3는 임의 치환되는 아릴이고, 여기서 더 포함되는 다른 구체예에서 (i) 아릴기는 하나의 치환체를 보유하거나, (ii) 아릴기는 할로겐, OH, O(C1-C4)알킬, NH(C1-C4)알킬, O(C1-C4)플루오로알킬, 및 N[(C1-C4)알킬]2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환체를 보유하 거나, (iii) 아릴기는 OH인 하나의 치환체를 보유하거나, (v) 아릴기는 페닐이거나, 또는 (vi) 아릴은 나프틸이고; (g) 상기 화합물은
Figure 112007040817382-PCT00002
이거나, 이의 활성 대사산물, 또는 약학적으로 허용가능한 프로드러그 또는 용매화물이며; (h) 상기 화합물은 4-히드록시페닐레틴아미드, 또는 이의 대사 산물, 또는 약학적으로 허용가능한 프로드러그 또는 용매화물이며; (i) 상기 화합물은 4-메톡시페닐레틴아미드, 또는 (j) 4-옥소 펜레티니드, 또는 이의 대사 산물, 또는 약학적으로 허용가능한 프로드러그 또는 용매화물이다.
다른 구체예에서, 화학식 I의 화합물의 투여를 사용하여 환자의 신체 내 혈청 레티놀의 농도를 낮추어서 안과성 병태를 치료하게 된다. 다른 구체예에서, (a) 상기 화합물의 유효량을 포유 동물에게 전신 투여한다; (b) 상기 화합물의 유효량을 포유 동물에게 경구 투여한다; (c) 상기 화합물의 유효량을 포유 동물에게 정맥 내 투여한다; (d) 상기 화합물의 유효량을 포유 동물에게 안구 내 투여한다; (e) 상기 화합물의 유효량을 이온 영동법(iontophoresis)으로 투여한다; 또는 (f) 상기 화합물의 유효량을 포유 동물에게 주입법으로 투여한다.
다른 구체예에서, 포유 동물은 인간이며, 여기서 포함되는 구체예에서, (a) 인간은 스타르가르트 질환에 대한 돌연변이 ABCA4 유전자의 보균자이거나, 스타르가르트 질환에 대한 돌연변이 ELOV4 유전자를 보유하거나, 노인성 황반 변성증과 연관된 보체 인자 H에 유전적 변이를 가지며, 또는 (b) 인간은 스타르가르트 질환, 퇴행성(recessive) 망막 색소 변성증, 지도상 위축증(이에 제한되지는 않으나, 암점이 일례임), 광수용체 변성증, 건성 형태 AMD, 퇴행성 추상체-간상체 이영양증, 삼출성(또는 습성 형태) 노인성 황반 변성증, 추상체-간상체 이영양증, 및 망막 색소 변성증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질 또는 단과성 병태를 보유한다. 다른 구체예에서, 포유 동물은 황반 변성증의 동물 모델이다.
다른 구체예에서, 상기 화합물의 유효량을 복수로 투여하는 단계를 포함하는 방법이며, 여기서 더욱 포함되는 구체예는 (i) 복수 투여 사이의 시간 간격은 1 주일 이상이며; (ii) 복수 투여 사이의 시간 간격은 하루 이상이고; (iii) 상기 화합물은 일일 단위로 포유 동물에게 투여되거나; 또는 (iv) 상기 화합물은 매 12 시간 마다 포유 동물에게 투여된다. 다른 구체예 또는 대체적인 구체예에서, 상기 방법은 휴약기를 포함하며, 이때 화합물의 투여를 일시적으로 중지하거나 투여하려는 화합물의 용량을 줄이며; 휴약기의 종료시, 화합물의 투약을 다시 시작한다. 휴약기의 기간은 2 일 내지 1 년으로 다양할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 산화 질소 생성 유도제, 소염제, 생리학적으로 허용되는 항산화제, 생리학적으로 허용되는 미네랄, 음전하로 하전된 인지질, 카로테노이드, 스타틴, 혈관생성 억제제, 메트릭스 메탈로프로테나제 억제제, 13-cis-레티노산(13-cis-레티노산의 유도체 포함), 11-cis-레티노산(11-cis-레티노산의 유도체 포함), 9-cis-레티노산(9-cis-레티노산의 유도체 포함), 및 레틸아민 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서,
(a) 상기 부가 제제는 산화 질소 생성 유도제이며, 여기서 포함되는 구체예에서 산화 질소 생성의 유도제는 시트룰린, 오르니틴, 니트로소화(nitrosated) L-아르기닌, 니트로실화(nitrosylated) L-아르기닌, 니트로소화 N-히드록시-L-아르기닌, 니트로실화 N-히드록시-L-아르기닌, 니트로소화 L-호모아르기닌 및 니트로실화 L-호모아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다;
(b) 상기 부가 제제는 소염제이며, 여기서 포함되는 구체예에서 소염제는 비스테로이드성 소염 제제, 리폭시게나제 억제제, 프레드니손, 덱사메타손, 및 시클로옥시게나제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다;
(c) 상기 부가 제제는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 항산화제이며, 여기서 포함되는 구체예에서 생리학적으로 허용되는 항산화제는 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로텐, 코엔자임 Q, 및 4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페라딘-N-옥실로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 다른 구체예에서 (i) 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 항산화제가 화학식 I의 구조를 갖는 화합물과 함께 투여되거나 또는 (ii) 둘 이상의 생리학적으로 허용되는 항산화제가 화학식 I의 구조를 갖는 화합물과 함께 투여된다;
(d) 상기 부가 제제는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 미네랄이며, 여기서 포함되는 구체예에서 생리적으로 허용되는 미네랄은 Zn (II) 화합물, Cu (II) 화합물, 및 셀레늄 (II) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 다른 구체예에서는 하나 이상의 생리적으로 허용되는 항산화제를 포유 동물에 투여하는 단계를 더 포함한다;
(e) 상기 부가 제제는 음전하로 하전된 인지질이며, 포함되는 구체예에서, 음전하로 하전된 인지질은 포스파티딜글리세롤이다;
(f) 상기 부가 제제는 카로테노이드이며, 여기서 포함되는 구체예에서 카로테노이드는 루테인 및 제아크산틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다;
(g) 상기 부가 제제는 스타틴이며, 여기서 포함되는 구체예에서 스타틴은 로수바스타틴, 피티바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 메바스타틴, 벨로스타틴, 플루바스타틴, 컴팩틴, 로바스타틴, 달바스타틴, 플루인도스타틴, 아토르바스타틴, 아토르바스타틴 칼슘, 및 디히드로컴팩틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다;
(h) 상기 부가 제제는 혈관 생성 억제제이며, 여기서 포함되는 구체예에서 혈관 생성 억제제는 Rhufab V2, 트립토파닐-tRNA 합성 효소, 항-VEGF PEG화 앱타머, 스쿠알라민, 아네코르타브 아세테이트, 컴브레타스타틴 A4 프로드러그, Macugen ™, 미페프리스톤, 서브테논 트리암시놀론 아세토니드, 유리체강(intravitreal) 결정성 트리암시놀론 아세토니드, AG3340, 플루오시놀론 아세토니드, 및 VEGF-트랩이다;
(i) 상기 부가 제제는 메트릭스 메탈로프로테나제 억제제이며, 여기서 포함되는 구체예에서 메트릭스 메탈로프로테나제 억제제는 메탈로프로테나제의 조직 억제제, α2-마크로글로불린, 테트라사이클린, 히드록사메이트, 킬레이터, 합성 MMP 단편, 숙시닐 머캅토퓨린, 포스폰아미데이트, 및 히드록사민산이다;
(j) 상기 부가 제제는 13-cis-레티노산(13-cis-레티노산의 유도체 포함), 11-cis-레티노산(11-cis-레티노산의 유도체 포함), 또는 9-cis-레티노산(9-cis-레티노산의 유도체 포함)이다;
(k) 상기 부가 제제는 all-trans-레티닐아민 유도체, 13-cis-레티닐아민 유도체, 11-cis-레티닐아민 유도체, 또는 9-cis-레티닐아민 유도체를 포함하는 레티닐 아민 유도체이다;
(l) 상기 부가 제제는 (i) 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 투여 전, (ii) 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 투여에 이어서, (iii) 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 투여와 동시에, 또는 (iv) 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 투여 전과 후에 투여된다; 또는
(m) 상기 부가 제제 및 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 동일한 약학 조성물 내에서 투여된다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 포유 동물에게 체외 레오페레시스(extracorporeal rheopheresis)를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 제한 망막 전위술, 광역학 치료법, 드루젠 레이저법, 황반 원공 수술법, 황반 전위 수술법, 파이-운동법(phi-motion), 양자선 치료법, 망막 박리술 및 유리체 수술법, 공막 돌융술, 황반하(submacular) 수술법, 동공경유 온열치료법, 광시스템 I 치료법, 미세전류 자극벅, 소염제, RAN 간섭법, 안구 약물 예컨대 포스포린 요오드 또는 에코티오페이트 또는 탄산 탈수효소 억제제, 마이크로칩 주입법, 줄기 세포 치료법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법, 광수용체/망막 세포 이식법, 및 침술로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료법을 포유 동물에게 실시하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 포유 동물의 안구에서 드루젠을 제거하기 위한 레이저 광응고술의 사용을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 화학식 I의 구조를 갖는 제2 화합물의 유효량을 1회 이상 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 이때 제1 화합물은 제2 화합물과는 상이하다.
다른 구체예에서, 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성을 검출 및/또는 정량화할 수 있는 장치가 제공되며, 이때 TTR의 적어도 일부는 형광으로 표지화되어 있다.
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물의 다른 목적, 특징 및 장점들은 이하 상세한 설명을 통해 분명해질 것이다. 그러나, 특정 구체예를 나타내면서, 상세한 설명 및 특정 실시예가 실례를 통해 주어지지만, 본 발명의 상세한 설명을 통해서 본 발명의 의도 및 범주내에서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 당 분야의 당업자들에게는 자명하다.
본 발명에서 언급한 모든 출판물 및 특허 출원서는 이들 각각이 참조 문헌으로 포함시키고자 구체적이며 개별적으로 언급되는 한 동일한 정도로 본 반명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물의 신규한 특징은 첨부되는 청구항에서 구체적으로 설명한다. 본 발명의 특징 및 장점의 이해를 돕기 위해서 본 발명에서 개시하는 원리를 이용하는 실례적인 구체예를 들어 상세한 설명을 참조하여 설명할 것이며, 이하 첨부되는 도면은 다음과 같다.
도 1은 본 발명의 하나의 구체적인 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 표지화된 TTR을 이용하여 TTR-RBP-레티놀 복합체 형성을 FRET 검출한 그래프이다.
도 3은 샘플에서 형광 화합물의 존재를 검출 및/또는 측정하기 위한 장치의 일례를 간략하게 나타내는 도면이다.
도 4는 방향족 아미노산 켄칭 대 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 FRET 검출로부터 얻은 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 방향족 아미노산 켄칭 대 레티놀-RBT-TTR 복합체 형성의 FRET 검출고부터 얻은 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 혈청 레티놀 농도 및 레티노이드 및 A2E의 안구 내 농도와 혈청 HPR 농도의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 7은 야생형 생쥐에 HPR을 투여했을 경우 (A) 혈청 레티놀 농도 및 (B) 안구 내 레티노이드 농도에 대한 이의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 HPR의 유무에 따라 RBP-TTR 복합체에서 확인된 FRET 스펙트럼을 나타내는 그래프로, 여기서 상기 TTR은 형광 부분으로 표지화된 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라서, 본 발명에서 개시한 FRET 방법을 사용하여 측정한 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성에 대한 HPR의 용량 의존적 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에서 개시한 FRET 방법을 사용하여 측정한 HPR, 13-cis-레티노산 및 all-trans-레티노산을 사용하여 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 억제능을 비교한 그래프이다.
도 11은 본 발명에서 개시한 FRET 방법 및 형광 이방성(anisotropy) 방법을 사용하여 측정한 HPR을 사용하여 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 억제능을 비교한 그래프이다.
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물의 구체예들을 이하 구체적으로 언급할 것이다. 구체예들의 일례는 이하 실시예 부분에서 설명한다.
달리 언급하지 않으면, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자들이 공통적으로 이해하고 있는 바와 동일한 의미로 사용하는 것이다. 본 발명에서 언급하는 모든 특허 및 공개 출판물을 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
레티놀-RBP-TTR 복합체의 형성을 조절하는 제제를 검출하는 방법 중 하나를 도 1에 개략적으로 나타내었다. 제1 단계는 샘플의 임의 제조이다. 샘플은 레티놀-RBP-TTR 복합체의 정제된 성분들을 포함할 수 있다; 다르게, 상기 샘플은 생물학적 표본, 예컨대 혈액, 혈청, 조직, 점액, 타액, 누액, 소변 또는 배설물 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 시험 및/또는 실험실 동물, 예컨대 생쥐, 래트, 인간 이외의 영장류 등을 사용할 수 있다. 이러한 시험 및/또는 실험실 동물들은 살아있거나 죽은 것이다. 또한 이러한 샘플 제조는 예를 들어, 다른 매질 내 분산물 또는 현탁물 등을 포함하는, 생물학적 표본의 균질화(homogenization)를 포함한다. 또한, 상기 샘플은 배양한 세포 또는 조직 은행, 또는 보관 센터에서 유래한 것일 수 있거나 이들을 포함한다.
샘플을 임의로 제조한 후, 복합체 형성을 검출하는데, 예를 들어, 광 조사를 통해 검출한다. 본 발명에서 개시하는 방법 및 디바이스는 특정 광 유형이나 광원에 제한되지 않으며, 다시 말해서, 상기 광은 예를 들자면, 램프, 레이저, 또는 발광 다이오드에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 광은 펄스로하거나(임의 순서로) 연속적일 수 있으며; 또한 상기 광은 간섭성이거나 비간섭성일 수 있고; 또한 상기 광은 편광상태이거나 비편광 상태일 수 있으며; 또한 상기 광은 필터(예를 들어, 밴스-패스 필터 포함), 블록킹(예를 들어, 공간 필터링) 및/또는 집속(focusing) 디바이스를 통과할 수 있고; 또한 상기 광은 샘플 전체 또는 단지 일부만을 조사할 수 있다. 샘플을 조사하기 위해 사용되는 파장 범위 또는 범위들은 검출하려는 형광 화합물 또는 화합물들에 따라 좌우되며, 구체적으로 본 발명에서는 특정 화합물에 대해 제공된다. 바람직하게, 조사 단계에서 사용되는 광 파장(들)은 이어서 검출 및/또는 측정할 수 있는 형광 신호를 발광하도록 형광 화합물을 여기시켜야 한다. 게다가, 조사용으로 사용되는 파장 범위는 또한 대상 형광 화합물에 의해 잘(아니면 전혀) 흡광되지 않는 파장을 포함하게되고; 이러한 광은 참조 신호나 배경값 삭감을 위해 사용된다. 그러나, 이러한 참조 또는 배경값 신호의 사용은 본 발명에서 개시하는 방법 및 디바이스에서 요구되지 않는다. 또한, 조사하는 광의 흡광은 검출 단계에서 측정 및/또는 검출하는 형광 신호와 조합하거나 또는 별개로 측정하고 사용할 수 있다. 이러한 흡광 신호는 본 발명의 다른 부분에서 기술하는 바와 같이, 특정 형광 화합물에 대한 진단용일 수 있다. 조사 단계의 핵심 요구사항은 검출하려는 형광 화합물 또는 화합물들이 샘플에 적용되는 광의 적어도 일부를 흡광해야한다는 것이다. 마이크로프로세서를 사용하여 또한 조사 단계를 제어할 수 있다. 임의 샘플에, 형광 화합물의 하나 이상의 유형이 존재할 수 있으며; 형광 화합물의 하나 이상의 유형이 존재하면, 조사광은 단지 한 유형의 화합물에 의해서 또는 다수 유형의 화합물에 의해서 흡광되도록 제공된다.
샘플을 조사한 후, 샘플 내 형광 화합물에 의해 발광되는 형광을 검출한다. 상기 발광되는 형광은 임의 수의 방법이나, 방법들을 조합하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광 신호는 단지 한 파장에서, 다른 파장들에서, 파장 범위에서, 파장의 다수 범위에 걸쳐서 검출할 수 있다. 특정 형광을 검출 및/또는 측정하려면, 본 발명에서 개시하는 방법 중 하나로 주요 성분에 상응하는 파장의 특정 범위를 실험할 수 있다.
검출 단계에서 얻은 정보 또는 데이타는 이에 제한되는 것은 아니나 예를 들어, 필름, 컴퓨터 메모리 또는 기타 기록 도구 중 임의의 기타 형태를 포함하는, 다양한 매체에 일시적으로나 영구적으로 저장할 수 있다. 이러한 기록-유지 및/또는 정보와 데이타의 저장은 일반적으로 조절 인자나 치료 제제의 효능을 시험(생체내에서 또는 시험관 내에서)하기 위해서뿐만 아니라, 임상 실습, 및/또는 환자의 진단 및 치료와 연관시킬 수 있다. 상기 정보를 저장 또는 기록함으로서, 당 분야의 당업자는 샘플의 일시적 분석을 또한 수행할 수 있다. 뿐만 아니라, 기록된 정보, 데이타 또는 이미지를 필요하다면 더 정리할 수 있다(예를 들어, 확대, 강화(enriched), 디컨볼루션화(deconvoluted), 의사색채화, 정량화 등).
상기 샘플의 임의 제조, 샘플의 조사, 형광 검출 및 정보의 임의 저장을 하나의 검출 사이클로 판단할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에서는 샘플에 대해서 이러한 검출 사이클의 반복을 고려한다. 분명하게, 샘플이 이미 준비되었다면, 샘플을 다시 준비할 필요가 없을 것이고, 특히, 검출 사이클간의 시간 간격이 짧다면(예를 들어, 10 초 미만, 1 분 미만, 5 분 미만 또는 1 시간 미만이거나 1 일 미만 정도), 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 측정의 정확성을 위해서 검출 사이클을 반복할 필요가 있을 것이며, 이 경우에 있어서, 검출 사이클 간 시간 간격은 비교적 짧을 것이다. 검출 사이클 간 간격이 보다 길면, 샘플을 보관할 필요가 있다. 또한, 샘플을 치료 제제 또는 가능성 있는 조절 인자와 함께 시험 중이면(예를 들어, 신약의 시험 및/또는 디자인 중), 검출 사이클 간 간격은 샘플에 후속 조작을 가할 수 있도록 제공될 것이다. 검출 사이클 사이의 시간은 10 초 미만, 1 분 미만, 5 분 이상, 1 시간 이상, 또는 1 일 이상일 수 있다. 검출 사이클 사이의 시간 기간 및 검출 사이클을 반복하는 회수는 당 분야의 당업자의 판단에 의한다. 어떠한 경우에, 검출 사이클 사이의 시간 기간은 일정할 필요가 없으며 다수의 반복 사이클을 조합할 수 있다.
검출 사이클 또는 사이클들로부터 수집된 정보는 샘플로부터 검출된 흡광 및/또는 형광을 샘플의 상태에 대한 위험 요소 및/또는 대리 지표로 사용하는 등의 다양한 목적을 위해 선택적으로 사용할 수 있다. 비제한적인 예로는 (a) 샘플에 치료 후보제를 투여한 후 샘플 내 형광 화합물(들)의 양 변화를 측정하여 시험관 내 샘플 또는 생체 내 샘플(설치류 또는 ABCA4 넉아웃 생쥐를 포함하는, 살아있는 실험 동물에게 레티놀-RBP-표지화한 TTR의 성분 주입을 포함함)에서 관련되는 안과적 질환 또는 병태(망막 및/또는 황반 변성증(노인성 황반 변성증의 습성 형태 및 건성 형태를 모두 포함) 또는 이영양증) 에 대한 상기 치료 후보제의 효능을 측정하는 것; 및 (b) 실험 동물에 치료제를 투여한 후 샘플 내 형광 화합물(들)의 양 변화를 측정하여 생체 내 샘플(설치류 또는 ABCA4 넉아웃 생쥐를 비롯하여, 살아있는 실험 동물에게 레티놀-RBP-표지화한 TTR의 성분 주입을 포함함)에서 관련되는 안과적 질환 또는 병태(망막 및/또는 황반 변성증(노인성 황반 변성증의 습성 형태 및 건성 형태를 모두 포함) 또는 이영양증)에 대한 상기 치료제의 효능을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "ABCA4 유전자"는 림(rim) 단백질 또는 RmP를 인코딩하는 유전자를 의미한다. ABCA4 유전자는 또한 ABCR 유전자로도 알려져있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "항산화제"는 화합물 또는 생물학적 물질의 산화를 방지, 지연 또는 아니면 억제할 수 있는 합성 또는 천연 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "디컨볼루팅(deconvoluting)"은 데이타, 정보 및/또는 이미지를 (적어도 부분적으로) 구성 성분으로 전환시키는 과정을 의미한다. 예를 들어서, 복합체 파형(wave form)을 특징으로 하는 형광 또는 흡광 스펙트럼을 복합체 파형을 포함하는 개별 흡광 또는 형광 피크로 수학적으로 디컨볼루팅할 수 있다. 적절한 수학적 절차 및 알고리즘은 당 분야에서 공지이며, 데이타, 자료 및/또는 이미지의 디컨볼루팅을 위한 적절한 소프트웨어 패키지도 시판중이다.
본 발명에서 사용하는 용어 "시각 회로의 파괴(disruption of the visual cycle)" 등은 시각 회로에 포함되는 하나 이상의 효소 활성을 직접적으로나 간접적으로 조절하는 임의 수단을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "분산"은 다른 매질(medium)에 물질을 현탁하는 것을 의미한다. 분산은 현탁 단계를 촉진하기 위해서 물질의 크기를 줄이거나, 유체화하거나, 파쇄하거나, 분획화하거나, 균질화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 레티닐 유도체는 다양한 cis 또는 trans 레티날 이성질체 중 하나를 기타 화합물이나 일련의 화합물들과 반응시켜서 생성할 수 있는 화합물을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "노인성 황반 변성증 또는 이영양증" 또는 "ARMD"는 ARMD의 습성 및 건성 형태를 포함하는 소모성 질환을 의미한다. ARMD의 건성 형태는, 모든 사례의 약 90 %를 차지하는데, 위축성(atrophic), 비삼출성(nonexudative), 또는 드루젠성(drusenoid)(노인성) 황반 변성증으로 알려져 있다. ARMD의 건성 형태는, 통상적으로 브루크 막하/막 내의 망막 색소 상피(RPE) 조직에 드루젠이 축적된다. 이후 드루젠이 황반 내 광수용체의 기능을 간섭할 경우 시력 상실이 일어날 수 있다. ARMD의 건상 형태는 수년간에 걸쳐서 점차적으로 시력을 상실하게 만든다. ARMD의 건상 형태는 ARMD의 습성 형태로 진행될 수 있다. 삼출성 또는 신생혈관(노인성) 황반 변성증으로 또한 알려진, ARMD의 습성 형태는 빠르게 진행하여 중심 시력에 심각한 손상을 야기할 수 있다. 황반 변성증은 유년기에 가장 빈번하게 발병하는 황반 이형증의 형태로서, 스타르가르트 황반 이영양증 또는 노란점 안저(Fundus Flavimaculatus)로도 알려진 스타르가르트 질환을 포함한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "포유 동물"은 인간을 포함하는 모든 포유 동물을 의미한다. 포유 동물은 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들어, 인간, 인간 이외의 영장류, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 돼지, 래트, 생쥐 및 토끼 등을 포함한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "생물학적 샘플"은 포유 동물의 안구, 혈장, 혈액, 소변, 배설물, 조직, 점액, 누액 또는 타액 등을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "유효량"은 개체 또는 환자에게 의미있는 혜택을 나타내기에 유의한 약학 제제 또는 방법에서의 치료 제제의 총량을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "발광 형광을 측정하다"는 (a) 일정 형태의 조사를 통해서 여기시킨 후 형광 존재를 검출하여 형광 화합물의 존재를 검출하는 것, (b) 일정 형태의 조사를 통해 여기시킨 후 샘플 내 형광 화합물에서 발광하는 형광의 세기를 측정하여 형광 화합물의 양을 측정하는 것, 및 (c) 이들의 조합 중 임의 방식을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "발광 스펙트럼"은 파장 함수에 따라 발광 방사선의 상대적인 세기를 도표화한 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "발광 파장"은 광 에너지에 의해 여기 시 발광하는 방사선의 파장 범위 또는 최대 파장을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "여기 파장"은 외부 공급원, 예컨대 백열 램프 또는 레이저에 의해 공급되고, 형광단에 의해 흡광되고, 여기된 단일항 전자 상태를 생성시키는, 에너지 hυ EX의 광자와 동등한 외부 에너지 공급원의 파장을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "형광 부분"은 형광 종 또는 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "수용체 형광 부분"은 공여체 형광 종으로 부터 공여 전자를 수용하는 FRET 검출법에서의 형광 종 또는 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "형광 공명 에너지 전이" 또는 "FRET"는 수용체 및 공여체 종들 사이의 에너지 전이를 의미하는 것으로 이때 수용체 종의 흡광 스펙트럼은 공여체 종들의 발광 스펙트럼과 중첩된다.
본 발명에서 사용하는 용어 "안과적 질환 또는 병태"는 안구 또는 관련 조직과 연관된 임의 질환 또는 병태를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들어 망막 및/또는 황반 이영양증 및 망막 및/또는 황반 변성증을 포함하는, 망막 및/또는 황반의 변성증을 포함하는 질환 또는 병태를 포함한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "고정(immobilized)"는 화학적 또는 생물학적 종을 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착시킨 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "영장류"는 인간, 유인원 및 원숭이를 포함하는 고등 포유 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "위험(risk)"은 사건이 일어날 수 있는 가능성을 의미한다.
시각 회로
척추 동물의 망막은 두 가지 유형의 광수용체 세포를 함유한다. 간상체(rod)는 빛이 적은 조건에서 시각 작용을 담당한다. 추상체(cone)는 감도가 덜하며, 고 시간(temporal) 및 공간 해상도의 시각을 제공하고, 색체 인지에 관여한다. 일광 조건하에서, 간상체 반응이 포화되면 시각은 전체적으로 추상체에 의해 매개된다. 두 유형의 세포는 막 디스크 스택을 포함하는 외부 구획으로 불리는 구조를 포함한다. 시각 신호 전달 반응은 상기 디스크의 표면 상에서 일어난다. 시각의 제1 단계는 옵신 색소 분자에 의한 광자의 흡수이며, 이는 레티날 발색단(chromophore)의 11-cis 에서 all-trans 이성질체화를 포함한다. 감광성을 회복할 수 있기 전, 최종 all-trans-레티날은 옵신 아포단백질과 분리되어서 11-cis-레티날로 이성질체화되어야 한다.
척추 동물 안구의 해부학적 조직도, 로돕신의 재생에 대한 시각 회로, 및 A2E-옥시란의 생체 내 합성에 관한 추가 정보는 2004년 6월 23일에 출원된 미국 가출원 제60/582,293호, 2004년 8월 18일에 출원된 미국 가출원 제60/602,675호, 및 2004년 10월 25일 출원된 미국 가출원 60/622,213호에 제공되어 있으며, 이들의 개시 내용을 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다.
황반 또는 망막 변성증
상술한 바와 같이, 황반 변성증(망막 변성증이라고도 함)은 망막의 중심 부분인, 황반의 기능 저하(deterioration)를 수반하는 안구 질환이다. 황반 변성증 사례의 대략 85 % 내지 90 %가 "건성"(위축성 또는 비혈관신생) 유형이다.
"건성" 황반 변성증에서, 망막의 기능 저하는 황반 아래에, 드루젠이라 알려진 작은 황색 침착이 형성되는 것과 관련되어 있다. 이러한 현상은 황반을 박막화(thinning)시키고 건조하게 만든다. 드루젠에 의해 야기된 망막의 박막화 위치 및 양은 중심 시력 손실 양과 직접적으로 관련된다. 드루젠 위에 존재하는 광수용체 및 망막 색소 층의 변성은 위축성이 되어서 중심 시력을 둔하게 만든다. 이는 대개 십여년에 걸쳐서 일어나게 된다.
노인성 황반 변성증으로 인해 시력을 상실하게 되는 대부분의 사람들은 "습성" 황반 변성증을 앓고 있다. "습성"(혈관신생) 황반 변성증에서는, 망막하 신생혈관 형성으로 알려진, 안구의 맥락막(choroidal) 층으로부터 비정상적인 혈관이 망막 및 황반 밑에서 성장한다. 이러한 혈관은 섬유성 조직과 함께 증식하는 경향이 있으며, 황반 밑의 유체 누수 및 출혈을 수반하여, 황반이 팽창되거나 이동하여 중심 시력을 왜곡시키게 된다. 급성 시력 손실은 망막하 및 내부에 여출물 또는 출혈이 축적되면서 일어난다. 영구 시력 손실은 외부 망막이 위축성이 되거나 섬유성 조직으로 교체되면서 일어난다.
스타르가르트 질환
스타르가르트 질환은 유년기에 발병하는 황반 변성증의 퇴행성 형태로 나타나는 황반 이영양증이다. 예를 들어, [Allikmets 등., Science, 277:1805-07 (1997)]를 참조한다. 임상적으로 스타르가르트 질환은 황반상에서의 진행성 RBP의 위축증 및 진행성 중심 시력 손실로 특징된다. RmP에 대한 인간 ABCA4 유전자의 돌연변이가 스타르가르트 질환의 원인이다. 상기 질환의 진행 초기에, 환자의 간상체 기능은 정상이지만 암순응이 지연되는 증상이 나타난다. 조직학적으로, 스타르가르트 질환은 RPE 세포 내에 리포푸신 색소 과립이 침착되는 것과 관련되어 있다.
스타르가르트 질환뿐만 아니라, ABCA4의 돌연변이는 퇴행성 망막 색소 변성증, 퇴행성 추상체-간상체 이영양증, 및 AMD에서 ABCA4 돌연변이가 우세한지는 아직까지 불확실하지만, 비삼출성 노인성 황반 변성증(AMD)(예를 들어, [Lewis 등, Am.J.Hum.Genet., 64:422-34 (1999)] 참조)에도 관여되어 있는 것으로 알려져 있다([Allikmets, Am.J.Hum.Gen., 67:793-799(2000)] 참조). 스타르가르트 질환과 유사하게, 이들 질환도 지연성 간상체 암순응 현상과 관련되어 있다. RPE 세포 내 리포푸신 침착은 또한 AMD에서도 두드러지게 나타나며(예를 들어, [Kliffen 등, Microsc.Res.Tech., 36:106-22 (1997)] 참조) 망막 색소 변성증 및 추상체-간상체 이영양증의 일부 사례에서도 나타난다.
상기와 같은 단계의 환자를 진료한 안과 의사는 대부분의 사람들이 특정 징후가 없지만, 드루젠이 존재하는 것을 인식할 수 있을 것이다. 진료시 드루젠이 확인되었을 경우, 시간 경과에 따른 모니터링이 필요하게 된다. 60세 이상의 대다수 사람들은 어느 정도 드루젠을 보유하게 된다.
레티놀-레티놀 결합 단백질( RBP )- 트랜스타이레틴 ( TTR ) 결합의 조절
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물은 레티놀 결합 단백질(RBP)에 대한 레티놀 결합의 조절 인자의 스크리닝 및 검출에 유용하며, 전달 복합체 레티놀-RBP-TTR의 조절 인자 스크리닝 및 검출에 유용하다. 비타민 A(all-trans 레티놀)은 새롭게 합성할 수 없기 때문에 음식물에서 섭취해야만 하는 필수 세포 영양소이다. 소화 후, 음식물 내 레티놀은 지질 응집물에 결합되어 간으로 운반된다. 문헌 [Bellovino 등, MolAspects Med., 24:411-20)]을 참조한다. 간에서, 레티놀이 레티놀 결합 단백질(RBP)과 복합체를 형성하면 이후 혈류로 분비된다. 상기 레티놀-RBP 홀로단백질을 간 이외의 표적 조직, 예컨대 안구에 전달될 수 있기 전에, 트랜스타이레틴(TTR)과 결합해야 된다. 문헌 [Zanotti and Berni, Vitam.Horm., 69:271-95(2004)]를 참조한다. 장기간 동안 레티놀이 혈류에 체류하도록 하는 것이 바로 상기 2차 복합체이다. TTR과의 연합으로 간세포에서 RBP의 발광이 촉진되며, RBP-레티놀 복합체의 신장 여과가 방지된다. 상기 레티놀-RBP-TTR 복합체는 레티놀을 흡수하여 다양한 세포 과정에 이용하는 표적 조직에 전달된다. RBP-TTR 복합체에 의해서 혈류를 통하여 세포로 레티놀이 전달되는 것은 세포 및 조직이 레티놀을 얻게 되는 주요한 경로이다.
레티놀 결합 단백질, 또는 RBP는 분자량이 대략 21 kD인, 단일 폴리펩티드 사슬이다. RBP는 클로닝되어서 서열분석이 이루어져 있으며, 이의 아미노산 서열도 확인되어 있다. 문헌 [Colantuni 등, Nuc.Acids Res., 11:7769-7776(1983)]을 참조할 수 있다. RBP의 3차 구조를 통해서 지용성 비타민 레티놀이 결합하고 이를 보호하도록 디자인된 특수한 소수성 포켓이 확인되었다. 문헌 [Newcomer 등, EMBO J., 3:1451-1454(1984)] 참조. 시험관 내 실험으로, 배양한 간 세포가 RBP를 합성하여 분비하는 것으로 나타났다. 문헌 [Blaner, W.S., Endocrine Rev., 10:308-316(1989)] 참조한다. 후속 실험에서는 많은 세포들이 RBP의 mRNA를 함유하고 있는 것으로 확인되었으며, 이는 신체 전반에 걸쳐서 광범위하게 분포되어 RBP 합성이 이루어지고 있음을 의미하는 것이다(Blaner(1989)). 간에서 분비되는 RBP의 대부분은 1:1 몰비로 레티놀을 함유하고 있으며, 정상적인 RBP 분비를 위해서는 RBP에 레티놀 결합하는 것이 요구된다.
세포 내에서, RBP는 소포체 내 레티놀에 단단히 결합되어 있는데, 소포체에는 RBP가 고농도로 존재한다. RBP에 레티놀이 결합하면 레티놀-RBP가 소포체에서 골지 복합체로 전위하기 시작하고, 이후 레티놀-RBP가 세포에서 분비된다. 간 세포에서 분비되는 RBP는 또한 간 세포로부터, 성상 세포로 레티놀이 이동하는 것을 보조하며, 성상세포에서는 레티놀-RBP가 혈장으로 직접 분비된다.
혈장에서는 혈장 RBP의 대략 95 %가 1:1 몰/몰 비로 트랜스타이레틴(TTR)과 연합되어 있는데, 이때, 혈장 비타민 A는 모두 필수적으로 RBP와 결합한다. TTR은 분자량이 54,980이며 4개의 동일 서브유니트로 이루어진, 구체적으로 특징화된 혈장 단백질이다. X-선 회절 분석법으로 밝혀진 전체 3차 구조에 의하면 사면체적으로 배열된 광대한 베타-시트 구조인 것으로 확인되었다. 문헌 [Blake 등, J. Mol.Biol., 121:339-356(1978)]을 참조한다. 2개의 타이록신 결합 부위가 위치한 4량체의 중심부를 통하여 채널을 이루고 있다. 그러나, 부의 협동 작용(negative cooperativity)으로 인해 단 하나의 타이록신 분자만이 TTR에 정상적으로 결합하게 되는 것으로 나타난다. RBP-레티놀에 대한 TTR의 복합체 형성은 레티놀의 신장 사구체의 여과율을 감소시켜서 대략 3 배 정도로 혈장 내 레티놀 및 RBP의 반감기를 증가시키는 것으로 여겨지고 있다(예를 들어, Blomhoff(1994) 참조).
복합체를 형성하고 있는 레티놀-RBP-TTR 형태로부터 세포 내로 레티놀이 섭취되는 것은 표적 세포 상의 세포 수용체에 RBP가 결합하는 것을 통해 일어나게 된다. 이러한 상호 작용은 RBP-수용체 복합체의 세포 내 흡입 작용(endocytosis)를 일으키고, 이어서 복합체에서 레티놀이 방출되거나, 레티놀이 세포내 레티놀 결합 단백질(CRBP)와 결합하며, 이후 세포에 의해 혈장으로 아포RBP가 방출된다. 레티놀 단독으로 세포 내로 섭취되는 것을 비롯하여, 레티놀이 세포 내로 도입되는 다른 기전의 경로도 고려할 수 있다(예를 들어, Blomhoff(1994)를 참조한다)
리포푸신의 주요 형광단인 A2E는 A2E의 전구체인 시각-회로 레티노이드, 즉, all-trans-레틴알데히드의 과생성으로 야기되는, 노인성 황반 변성증 및 스타르가르트 질환을 비롯한 황반 또는 망막 변성증 또는 이영양증에서 형성된다. 따라서, 망막 내 비타민 A 및 all-trans 레틴알데히드의 감소를 통해, A2E 및 리포푸신 축적을 감소시키고 노인성 황반 변성증을 치료하는 데 도움이 될 것이다. 혈청 레티놀을 감소시켜서 RPE에서 A2E 및 리포푸신을 감소시키는 바람직한 효과를 나타내는 것으로 실험을 통해 확인되었다. 예를 들어, 비타민 A가 결핍된 식이 요법을 지속시킨 동물은 리포푸신 축적이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 문헌 [Katz 등, Mech.Ageing Dev., 35:291-305(1986); Katz 등, Mech.Ageing Dev., 39:81-90(1987); Katz 등, Biochim.Biophys.Acta., 924:432-41(1987)]을 참조한다. 비타민 A의 농도를 저하시키는 것이 황반 변성증 및 이영양증의 진행에 영향이 있을 수 있다는 추가적인 증거가 Radu 등에 의해 밝혀졌는데, 안구 내 비타민 A 농도 감소로 리포루신 및 A2E가 감소되는 것으로 확인되었다. 문헌 [Radu 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 100:4742-7(2003); Radu 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 101:5928-33(2004)] 참조한다.
레티노산 유사체, N-4-(히드록시페닐)레틴아미드가 혈청 레티놀 및 RBP를 상당히 감소시키는 것으로 나타났다. 문헌 [Formelli 등, Cancer Res. 49:6149-52(1989); Formelli 등, J.Clin Oncol., 11:2036-42(1993); Torrisi 등, Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev., 3:507-10(1994)]를 참조한다. 시험관 내 실험으로 HPR이 TTR과 RBP의 정상적인 상호 작용을 방해하는 것으로 확인되었다. 문헌 [Malpeli 등, Biochim.Biophys.Acta 1294:48-54(1996); Holven 등, Int.J.Cancer 71:654-9(1997)]를 참조한다.
RBP 또는 RBP-TTR 복합체에 레티놀이 결합하는 것을 방해하거나, 레티놀과 RBP의 신장 배설이 증가하여 세포로 레티놀이 배달되는 것을 억제하는 조절 인자(예를 들어, HPR)는 따라서, 표적 조직 예컨대 안구에서 레티놀 및 이의 유도체의 축적, 및 혈청 농도를 감소시키는 데 유용할 것이다. 본 발명에서 개시하는 조성물 및 방법은 이러한 조절 인자의 검출 및 스크리닝을 위해 제공되며, 레티놀 결합 조절 인자의 스크리닝을 위한 키트를 제공한다.
일 구체예에서, 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성을 모니터링하기 위해서 레티놀, 레티놀 결합 단백질(RBP) 및 트랜스타이레틴(TTR)을 제공한다. 레티놀, 또는 비타민 A는 표적 기관 예컨대 안구로 이동하기 위해서, 레티놀 결합 단백질을 포함하여, 다양한 결합 단백질에 결합한다. 비타민 A는 결합 활성을 비롯한, 레티놀의 생물학적 활성을 보유한 임의 화합물을 나타내는 일반 명사이다. 1 레티놀 당량(RE)은 1 ㎍의 all-trans 레티놀(3.33 IU) 또는 6 ㎍(10 IU)의 베타-카로텐의 특정 생물학적 활성도이다. 베타-카로텐, 레티놀 및 레티날(비타민 A 알데히드)은 모두 유효하고 신뢰도가 높은 비타민 A 활성을 갖는다.
레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 유력한 후보 조절 인자의 일례로는 비타민 A의 유도체, 예컨대 트레티노인(all trans-레티노산) 및 이소트레티노인(13-cis-레티노산)을 포함하며, 이들은 여드름 및 기타 임의 피부 질병을 치료하는 데 사용된다. 다른 유도체들로는 펜레티니드(N-(4-히드록시페닐)레틴아미드), MPR 및 에틸레틴아미드가 포함된다. 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물의 일면에서, 레티놀 유도체, 레티닐 유도체 및 관련 레티노이드를 단독으로, 또는 레티놀 또는 관련 레티노이드의 기타 유도체와 조합하여 사용할 수 있음을 고려한다.
펜레티니드(이하 히드록시페닐 레틴아미드라고 함)는 본 발명에서 개시하는 조성물 및 방법에서 특히 유용하다. 이하 설명하는 바와 같이, 펜레티니드는 레티놀, RBP 및 TTR 복합체의 조절 인자로 사용된다. 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물의 일 면에서, 펜레티니드 유도체는 펜레티니드 대신, 또는 이와 조합하여 사용된다. 본 발명에서 사용되는, "펜레티니드 유도체"는 이의 화학 구조가 4-히드록시 부분 및 레틴아미드를 포함하는 화합물을 의미한다. HPR의 가장 우세한 대사 산물은 MPR인데, 이는 또한 혈청 레티놀 농도를 저하시킬 수 있는 화합물이다. 이와 같이, 본 발명에서 HPR 또는 펜레티니드에 대해서 언급할 때 대사 산물 MPR을 포함한다.
일 구체예에서, 이에 제한되는 것은 아니나, 펜레티니드의 유도체는 N-(4-히드록시페닐)레틴아미드-O-글루쿠로니드의 C-글리코시드 및 아릴아미드 유사체, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 4-(레틴아미도)페닐-C-글루쿠로니드, 4-(레틴아미도)페닐-C-글루코시드, 4-(레틴아미도)페닐-C-실록시드, 4-(레틴아미도)벤질-C-글루쿠로니드, 4-(레틴아미도)벤질-C-글루코시드, 4-(레틴아미도)벤질-C-실록시드; 및 레티노일 β-글루쿠로니드 유사체 예컨대, 1-(β-D-글루코피라노실)레틴아미드 및 1-(D-글루코피라노실우로노실)레틴아미드를 포함하며, 이들은 미국 특허 제5,516,792호, 제5,663,377호, 제5,599,953호, 제5,574,177호, 및 [Bhatnagar 등, Biochem.Pharmacol., 41:1471-7(1991)]에 기술되어 있으며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
다른 구체예에서, 기타 비타민 A 유도체를 사용할 수 있는데, 미국 특허 제4,743,400호에 개시된 것들을 포함할 수 있으며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 이러한 레티노이드는 예를 들어, all-trans 레티노일 클로라이드, all-trans-4-(메톡시페닐)레틴아미드, 13-cis-4-(히드록시페닐)레틴아미드 및 all-trans-4-(에톡시페닐)레틴아미드를 포함한다. 본 발명의 참조 문헌으로 포함시키고자 하는, 미국 특허 제4,310,546호에는 N-(4-아실옥시페닐)-all-trans 레틴아미드, 예컨대 N-(4-아세톡시페닐)-all-trans-레틴아미드, N-(4-프로피오닐옥시페닐)-all-trans-레틴아미드 및 N-(4-n-부티릴옥시페닐)-all-trans-레틴아미드가 기술되어 있으며, 이들을 모두 특정 구체예에서 사용하는 것을 고려한다.
기타 비타민 A 유도체 또는 대사 산물, 예컨대 N-(1H-테트라졸-5-일)레틴아미드, N-(에틸레틴아미드, 13-cis-N-에틸레틴아미드, N-부틸레틴아미드, 에트레틴(아시트레틴), 에트레티네이트, 트레티노인(all-trans-레티노산) 또는 이소트레티노인(13-cis-레티노산)을 특정 구체예에서 사용하는 것을 고려할 수 있다. 예컨대 미국 가출원 제60/582,293호 및 제60/602,675호를 참조할 수 있으며; 또한 문헌[Turton 등, Int.J.Exp.Pathol, 73:551-63(1992)]를 참조하며, 이들을 본 발명의 참조 문헌으로 모두 포함시킨다.
기타 유력한 후보 조질 인자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 비스테로이드성 소염제, 예컨대 플루페남산, 메페라남산, 메틀로페남산, 디플루니살, 디클로페나크, 플루비프로펜, 페노프로펜, 및 인도페나신을 포함한다. 기타 유력한 후보 조절 인자는 예를 들어, 비아릴, 비아릴아민, 스틸벤, 및 디벤조푸란을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 외 예시적인 유력한 조절 인자들은 문헌 [Purkey 등, Proc.Natl.Acad.Sci., 98:5566-71(2001)]을 참조하며, 이를 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
기타 유력한 후보 조절 인자로는 소분자, 폴리펩티드, 핵산 및 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물은 본 발명에서 개시하는 바와 함께 항체 라이브러리, 펩티드 라이브러리, 핵산 라이브러리, 또는 소분자 라이브러리에서 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 라이브러리, 예컨대 조합 라이브러리 및 기타 상기 언급한 라이브리러리를 스크리닝하는 방법은 미국 특허 제5,591,646호; 제5,866,341호; 및 제6,343,257호에서 확인할 수 있으며, 이들을 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
일 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물은 레티놀-RBP-TTR 복합체 구성원을 표지화하는데 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 표지, 예컨대 효소, 형광체, 방사선 동위원소 표지, 화학발광체, 특이적 결합 쌍, 예컨대 아비딘과 바이오틴, 리탄드, 및 항체, 예를 들어, 디고신 및 항디고신 등을 사용하여, 대상 단백질, 예컨대 TTR을 상기 언급한 표지들로 표시화할 수 있다. 일 구체예에서, 형광단을 TTR에 부착시킨다. 다른 구체예에서, 단백질은 흡광 스펙트럼이 380 ㎚ 내지 480 ㎚이고, 발광 스펙트럼이 520 ㎚ 내지 600 ㎚인 형광단으로 표지화할 수 있다. 다른 구체예에서, 단백질은 흡광 스펙트럼이 410 ㎚ 내지 490 ㎚이고, 발광 스펙트럼이 530 ㎚ 내지 595 ㎚인 형광단으로 표지화할 수 있다. 당 분야의 당업자 중 하나는 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자를 동정하기 위해서 본 발명에서 개시한 바와 결합시켜서 기타 형광단을 사용할 수 있음을 인지할 수 있다.
대표적인 형광단은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 및 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드를 포함한다. 일 구체예에서, 단백질은 배경 단백질 또는 레티놀 형광으로부터 최소로 간섭받는 염료로 표지화시킨다. 이러한 배경값 간섭은 RBP의 내부 방향족 아미노산 잔기 또는 레티놀 자체에 의한 것일 수 있다. 따라서, RBP 또는 레티놀과 구별되는 파장에서 흡광 및 발광하는 염료가 본 발명에서 바람직하다.
일 구체예에서는 흡광 스펙트럼이 380 ㎚ 내지 480 ㎚이고 발광 스펙트럼이 520 ㎚ 내지 600 ㎚인 ALEXA FLUOR® 염료(fluorescent chemicals and biomolecule labeling kit, Molecular Probes Inc.)를 사용하는 것을 제공한다. 예를 들어, ALEXA FLUOR® 430은 430 ㎚에서 흡광하고, 대략 540 ㎚에서 발광한다. 당 분야의 당업자는 본 발명에서 개시한 것과 함께 다양한 염료를 사용할 수 있음을 인지할 수 있을 것이며, 실시자가 본 발명에서 개시한 목적에 적절한 형광 염료를 선택할 수 있다.
단백질(예컨대 TTR)은 ALEXA FLUOR® 430 단백질 표지화 키트(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)를 포함하여, 시판 중인 키트를 사용하여 형광단으로 표지화시킬 수 있다. 다르게, 단백질은 활성 링커(예를 들어, 미국 특허 제6,140,041호를 참조하며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킴)를 갖는 형광 단 표지로 표지화할 수 있거나, 또는 형광단 표지는 대상 단백질에 공유적으로 부착시킨 것이다. 기타 표지화 수단은 선택하는 형광단의 유형에 따라서 당 분야의 당업자에게는 분명해 질것이다.
본 발명에서 개시하는 표지는 또한 수용체 형광 부분, 바람직하게는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 검출법에 사용되는 것을 포함한다. FRET는 결합 이베ㅌ느를 나타내는 신호를 검출하는데, 기타 형광단 또는 소색단(quencher)인 형광 공명 에너지 수용체 부분으로부터 형광 공명 에너지 공여 부분이 떨어져 있는 거리가 변화하여서 샘플의 형광도가 바뀌게 된다. 형광 단 및 상호 작용하는 분자 또는 부분의 결합은 "FRET" 쌍으로 알려져 있다. FRET-쌍의 두 구성원 사이의 에너지 전이는 상기 쌍의 제2 구성원의 흡광 스펙트럼이 상기 쌍의 제1 구성원의 발광 스펙트럼과 중첩되는 것이 요구된다.
FRET 검출법에서, 제1 프로브는 제1 프로브 형광 공여체 또는 수용체를 포함한다. 상기 제2 프로브는 제2 형광 공여체 또는 수용체를 포함한다. 제1 형광 공여체 또는 수용체 및 제2 형광 공여체 또는 수용체는, 미리 정해진 파장 또는 파장 밴드의 광을 통해서 형광 공여체의 활성화에 반응하여 서로 형광 공명 에너지 전이를 할 수 있는 형광 공여체 및 형광 수용체를 포함하는, 공여체/수용체 쌍을 형성하도록 선택된다.
형광 부분 및 쌍을 이루고 있는 상기 부분의 여기 및 발광 스펙트럼으로 형광 공여체 또는 형광 수용체인지를 결정한다. 형광 염료는 공여체 형광단의 발광 스펙트럼이 수용체 형광단의 여기 스펙트럼과 중첩되도록 선택된다. 또한, 일부 방법에서는, 높은 흡광 계수 및 낮은 형광 양자 수율을 갖는 공여체 형광단은, 공여체 형광단의 여기 파장에서 강하게 발광하지 않는 수용체 형광단과 쌍을 이룬다. 시아닌 공여체(예를 들어, CYA) 및 로다민 염료(예를 들어, R110, R6G, TAMRA 및 ROX)가 이러한 쌍의 예들이다. 또한 본 발명에서 개시하는 방법에서 유효하게 사용할 수 있는 공여체 및 수용체 쌍을 선택하는 데 도움이 되는 참고 지침서로는 [Fluorescence Spectroscopy(Pesce 등, Eds.) Marcel Dekker, New York, (1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Press, New York, (1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, New York, (1976); Indicators(Bishop, Ed.), Pergamon Press, Oxford, 19723; 및 Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene(1992)]를 포함한다.
형광 공명 에너지 전이의 효율성은 D×10-6에 비례하는 것으로 보고되었는데, 여기서 D는 공여체와 수용체 사이의 거리이다(문헌 [Forster, Z.Naturforsch A., 4;321-327(1949)] 참조). 따라서, 통상적으로 형광 공명 에너지 전이는 10∼70 Å의 거리에서 일어난다. 형광 공여체, 형광 수용체, 또는 형광 공여체 및 수용체(즉, 비율) 모두에서 발광하는 광을 검출하여 검출법을 수행한다. 일 구체예에서, 형광 공여체 및 형광 수용체는 모두 형광단이다. 제1 형광단은 적절한 파장 또는 파장 밴드의 광으로 활성화되며, 이는 특정 형광단의 기능이다. 다른 구체예에서, 형광 공여체는 형광단이며 형광 수용체는 소색단이고 검출은 형광단의 발광을 특정하여 수행한다.
일 구체예에서, 레티놀-RBP-TTR 복합체의 일 구성원을 형광 수용체로 표지화한다. 예를 들어, 형광 수용체 분자를 TTR 단백질 또는 폴리펩티드에 부착시켜서 이후 FRET 검출 수단으로 검출할 수 있다. 사용할 수 있는 대표적인 형광단은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 및 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드를 포함한다. 단백질은 ALEXA FLUOR®염료로도 표지화할 수 있는데, 이의 흡광 스펙트럼은 380 ㎚ 내지 480 ㎚이고 발광 스펙트럼은 520 ㎚ 내지 600 ㎚이다.
일 구체예에서, TTR이 수용체 형광단으로 표지화된, 레티놀-RBP-TTR 단백질 복합체는 275 ㎚ 내지 295 ㎚의 광으로 여기시키고, 330 ㎚ 내지 650 ㎚에서 발광 파장을 측정한다. 어떠한 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, RBP 상의 방향족 아미노산 기가 공여체 형광단으로 작용하고, 전자를 레티놀에 주어서, 수용체 및 공여체 형광단으로 모두 작용하는 것으로 여겨진다. 따라서, RBP 상의 활성화된 방향족 아미노산 기로부터 발광되는 대략 340 ㎚로 레티놀을 여기시키고, 이것이 대략 325 ㎚에서 흡광하며, 다음으로, 표지화된 TTR 상의 수용체 형광단 기를 여기시키는 대략 470 ㎚가 발광되어서, 수용체 형광단의 특징적인 발광 파장에서 FRET 검출이 가능하게 된다. 분석 환경에 따라서, 방향족 아미노산은 대략 280 ㎚의 파장 광을 흡광하며, 대략 325∼350 ㎚에서 발광한다.
도 2는 표지화한 TTR을 이용한 FRET 검출법을 나타내는 도면이다. RBP 및 레티놀의 흡광 및 여기 발광 스펙트럼은 도 2A, 2B 및 2Edp 나타내었다. 방향족 아미노산 잔기의 여기를 통한, RBP의 여기는 280 ㎚에서 일어나며 340 ㎚에서 발광이 일어난다. ALEXA FLUOR®430(도 2C-2E)로 표지화한 TTR의 흡광은 430 ㎚에서 일어나며, 540 ㎚에서 발광한다. 표지화한 레티놀-RBP-TTR 복합체를 280 ㎚에서 여기시, TTR 상의 수용체 ALEXA FLUOR®430에 대해서 FRET를 통해서 대략 540 ㎚ 파장에서 발광 방사선 신호가 검출된다(도 2E 참조).
다른 구체예에서, 수용체 형광단으로 TTR이 표지화된, 레티놀-RBP-TTR 단백질 복합체를 315 ㎚ 내지 345 ㎚ 사이의 광으로 여기시키고, 525 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광 파장을 측정한다(도 2 참조). 어떠한 이론에 구속되지는 않으나, 레티놀로부터 표지화한 TTR 상의 수용체 형광단으로의 에너지 전이가 발생하여, 수용체 형광단의 특징적인 발광 파장이 발생하는 것으로 판단된다(도 2E 참조).
분석 조건
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물의 예증적인 구체예는 샘플 내 레티놀-RBP-TTR 복합체를 검출 및/또는 정량화하기 위한 것으로, 이는 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성에 도움이 되는 조건이 요구된다. 일 구체예에서, 생리적 조건, 예를 들어, 인산 완충 염수(PBS) 또는 이의 동등물 내에서 RBP, TTR 및 레티놀을 항온 반응시킨다. 다르게, 시험관 내에서 생리적 조건과 가까운 기타 조건을 또한 사용할 수 있다. 다른 구체예에서는 적절한 용매, 예컨대 에탄올 또는 헥산 내(예를 들어, 문헌 [Ong.D.E., J.Biol.Chem., 259:1476-1482 (1984)] 참조)에서 항온 반응을 수행하거나, 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성을 가능하게 하는 기타 완충 제제 내에서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플에 디메닐설폭시드를 첨가하여 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 유력한 후보 조절 인자의 용해도를 증진시킬 수 있다. 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성을 불리하게 억제(단독으로)하지 않으면서 최대 적어도 8 부피%의 양으로 디메틸설폭시드를 첨가한다. 또한, 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성을 불리하게 억제(단독으로)하지 않으면서 필요할 때까지 신선하게 두거나 동결시킬 수 있다.
TTR 및 RBP를 포함하는 정제한 단백질 성분들을 본 발명에서 개시하는 바와 결합하여 사용할 수 있다. TTR 및 RBP를 정제하는 방법의 예는 문헌 [Berni 등, Anal.Biochem., 150:273-277(1985); Peterson, P.A., J.Biol.Chem., 246:34-43(1971); Berni 및 Lamberti, Comp.Biochem. Physiol., 94B:79-83(1989); Ong.D.E., J.Biol.Chem., 259:1476-1482(1984)]를 참조할 수 있으며, 이를 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 정제 방법은 천연 샘플에 비해서 샘플 내 바람직한 단백질의 양에 어떠한 개선점이 있는 것을 포함한다(예를 들어, 천연 샘플이 1.5 %의 바람직한 단백질을 함유하면, 정제 방법은 천연 샘플에서 유래한 샘플 내 바람직한 단백질의 양을 1.5 %보다 많이 증가시키는 단계를 포함한다). 다르게는, 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물의 성분들은 포유 동물에서 유래한 생물학적 샘플에서 자연적으로 발생하는 것일 수 있다. 예를 들어, 표지화한 TTR을 표유 동물 유래의 생물학적 샘플에 첨가하여서, 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물에 따라 유력한 후보 조절 인자를 시험할 수 있다. 상기 포유 동물은 바람직하게 인간이나, 기타 포유 동물, 예컨대 영장류, 말, 개, 양, 염소, 토끼, 생쥐 또는 래트도 사용할 수 있다. 생물학적 샘플은 이에 제한되는 것은 아니지만, 혈장, 혈액, 소변, 배설물, 누액 또는 타액 등을 포함한다.
레티놀-RBP-TTR 복합체의 형성시, 유력한 후보 조절 인자를 반응 믹스에 첨가하고 표지의 활성, 예를 들어 형광 강도를 모니터링하면서 복합체의 파괴를 모니터한다. 예를 들어, 첨가한 조절 인자가 없는 반응 혼합물과 비교하여 형광도가 감소하는 것은 조절 인자에 의해 복합체가 파괴되었음을 의미하는 것이다. 반대로, 형광 활성에 변화가 없는 것은 레티놀-RBP-TTR 복합체가 파괴되지 않았음을 의미한다. 유력한 후보 조절 인자의 첨가는 복합체 형성 전, 형성 동안, 또는 그 후에 일어날 수 있다.
본 발명에서 개시하는 조성물 및 화합물은 고상 지지체 상에 부착된, 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 구성원으로 이루어진 시약을 사용하는 분석법에서도 사용할 수 있다. 예를 들어, RBP 또는 표지화한 TTR을 바이오틴에 부착시키고, 이어서 스트렙트/아미딘으로 개질되거나 코팅된 고상 지지체에 결합시킬 수 있다. 다르게는, RBP 또는 표지화한 TTR을 유도시키고 고체 상 지지체의 표면위의 활성 기와 접합시킬 수 있다. 결합 분석용으로 단백질 또는 펩티드를 유도하는 예는 미국 특허 제4,478,946호; 제,169,756호에서 확인할 수 있으며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드는 양자택일적으로 고체 상 위에 흡착될 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드의 커플링 또는 흡착은 고체 상의 표면에 노출된 결합 부위의 비특이적 블록킹이 후속될 수 있다.
상기 고체 상은 테스트 튜브 벽이나 마이크로타이터 플레이트일 수 있고, 또는 유리나 실리콘 슬라이드일 수 있으며, 마이크로어레이, 마이크로칩 또는 기타 반도체 또는 단백질 또는 펩티드를 고체 상에 부착시키기 위한 미세분석 플랫폼일 수 있다. 다르게는, 상기 고체 상은 또는 아카고스, 폴리스티렌, 라텍스, 반도체성 물지 및 폴리메타크릴레이트를 포함하는 비드(나노입자, 미세입자, 자성 비드 등)일 수 있다.
상기 분석법은 분석 성분들이나 산물 중 어떠한 것을 분리하거나(불균일) 또는 분리하지 않고(균일) 수행할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 반응을 용액 상에서 수행할 수 있는 균일 분석법에서 구체적인 용도를 확인하였다. 이 분석법에서 표지화된 레티놀, RBP, 또는 TTR 구성원이 자유 표지로 임의 해리되는 것은 상기 분석법의 감도를 떨어뜨릴 수 있는데, 예를 들어, 표지화하지 않은 TTR이 측정하려는 조절 인자의 존재 또는 양과 관련되어 있는 표지화된 TTR과 결합에 대해 경쟁할 수 있기 때문이다.
비균일 분석법은 일반적으로 하나 이상의 분리 단계를 포함하며 이는 경쟁적이거나 비경쟁적일 수 있다. 다양한 경쟁 및 비경쟁적인 비균일 분석법 형태는 미국 특허 제5,089,390호에 개시되어 있으며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 통상적인 경쟁적 비균일 분석법에서, 분석물이 결합할 수 있는 항원을 갖는 지지체를 샘플 및 검출가능한 표지, 예컨대 효소("접합체"), 형광 부분 또는 방사선 동위원소 표지와 접합된 분석물을 함유하는 매질과 접촉시킨다. 샘플 내 분석물은 항체 결합에 대해 접합체와 경쟁하게 된다. 지지체와 배지를 분리시킨 후, 지지체 또는 배지이 표지 활성도를 통상의 방법으로 특정하고 샘플 내 분석물의 양과 연관시킨다.
통상의 비경쟁적 샌드위치 분석법은 미국 특허 제4,486,530호에 개시되어 있는 분석법으로 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 이 방법에서, 샌드위치 복합체, 예를 들어 면역 복합체를 분석 매질에 형성시킨다. 상기 복합체는 분석물, 분석물에 결합하는 1차 항체, 또는 결합 구성원 및 2차 항체, 또는 분석물이나 분석물의 복합체에 결합하는 결합 구성원을 포함한다. 다음으로, 샌드위치 복합체를 검출하고, 샘플내 분석물의 존재 및/또는 양과 관련시킨다. 이후 상기 샌드위치 복합체를 표지 복합체 존재를 통해서 검출하는 데 이때 1차 항체 및 2차 항체 모두나, 결합 구성원은 표지 또는 표지와 결합할 수 있는 대체물을 함유한다.
샌드위치 분석법은 항원 및 수용체 분석물을 검출하는 대부분에서 사용한다. 이 분석법에서, 분석물은 두 수용체 부분, 또는 분석물에 특이적인 항체에 의해 결합한다. 한 접근법에서, 지지체에 커플링되어 있거나, 아니면 불용성 결합기로 알려진 결합 구성원 또는, 표지화하지 않은 항체의 처음 항온 반응은 분석물을 함유하고 있는 것으로 의심되는 샘플을 포함하는 매질과 접촉시킨다. 세척 및 분리 단계 후, 상기 지지체를 일반적으로 표지를 함유하는 2차 항체 또는 결합 구성원을 함유하는 매질과, 2차 항온 반응 기간 동안 접촉시킨다. 상기 지지체를 이후 세척하고 매질과 분리하며 매질 또는 지지체에서 표지의 존재를 확인한다. 표지의 존재 및 양은 분석물의 존재 및 양과 관련있다. 이 방법의 구체적인 설명을 위해서 미국 특허 제Re29,169호및 4,474,878호를 참조할 수 있으며, 관련 부분을 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
상기 샌드위치 분석법의 다양한 변형법에서, 적절한 매질 내 샘플을 분석물을 위해 표지화한 항체 또는 결합 구성원과 접촉시키고 일정 시간 기간 동안 항온 반응시킨다. 이후, 상기 매질을 분석물을 위한 2차 항체, 또는 결합 구성원이 결합된 지지체와접촉시킨다. 항온 반응 시간후, 상기 지지체를 매질과 분리하고 세척하여 결합하지 않은 시약들을 제거한다. 분석물의 존재 또는 양과 관련된 표지의 존재에 대해 지지체 또는 매질을 검사한다. 보다 구체적인 설명은 미국 특허 제4,098,876호를 참조할 수 있으며, 관련 부분을 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
다른 변형 방법에서, 샘플, 지지체에 결합한 1차 항체(또는 결합 구성원) 및 표지화한 항체(또는 표지화한 결합 구성원)를 매질과 배합하여 단일 항온 반응 단계로 항온 반응시킨다. 분리, 세척 단계 및 표지에 대한 검사는 상술한 바와 같다. 보다 구체적인 설명은 미국 특허 제4,244,940호를 참조할 수 있으며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킬 수 있다.
균일 분석법은 분석 성분의 분리를 요구하지 않으며, 고효율 분석법에 특히 유용하다. 따라서, 일 구체예에서는 TTR-RBP-레티놀 복합체 형성의 조절 인자를 검출 및/또는 정량화하기 위한 균일 분석법을 제공한다. 구체적으로, 형광 공명 에너지 전이 분석법은 균일 분석법 형태를 따를 수 있다. 형광 공명 에너지 전이에서, 형광 신호는 공여체 형광 부분과 수용체 형광 부분 사이에서 에너지 전이 이벤트가 일어나지 않으면 검출되지 않는다. 따라서, 결합 이벤트가 없으면, 표지화한 성분 및 표지화하지 않은 성분을 분리를 위한 최소 필요성이 존재한다. 유사하게, 어떤 제제가 혼합물에 첨가되었을 때 복합체 형성이 일어난 후 복합체에 어떠한 변동(perturbation)이 없으면 표지화한 성분 및 표지화하지 않은 성분 사이의 분리가 최소한 요구된다. 따라서, 다른 면에서 TTR, RBP 및 레티놀의 복합체 형성 파괴의 FRET 검출법을 이용한 균일 분석법 형태가 제공된다.
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물은 또한 상술한 모든 비균일 분석법에 대한 응용법을 가지며, 즉 조절 인자를 첨가한 후에 결합의 파괴를 모니터할 수 있다. 예를 들어, 불용성 결합 구성원. 표지화한 TTR이나 RBP는 본 발명에서 개시한 바에 따라서, 표지화한 TTR 또는 RBP 상의 비스-바이오틴 화합물을 보유한 지지체에 결합되어 있는 아미딘과 배합하여 형성시킬 수 있다. 이는 표지화한 TTR-RBP-레티놀 복합체의 형성 전, 동안, 또는 그 후에 수행할 수 있다. TTR-RBP-레티놀 복합체 형성의 유력한 후보 조절 인자를 이후 첨가할 수 있으며, 파괴가 일어나면 확인하기 위한 형광도를 모니터한다. 다르게는, 또는 이와 조합하여서, 표지화한 TTR또는 RBP를 또한 고체 기질과 결합시키고, 이후 조절 인자를 TTR-RBP-레티놀 복합체의 다른 성분과 함께 첨가한다.
조절 인자 활성의 생체 내 검출
상기 개시한 시험관 내 방법뿐만 아니라, 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물은 또한 TTR-RBP-레티놀 복합체 형성의 조절 인자 활성의 생체 내 검출 및/또는 정량화와 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 표지화한 TTR을 개체에 주입할 수 있는데, 이때 후보 조절 인자를 표지화한 TTR의 주입 전, 동안 또는 이후에 부가할 수 있다. 상기 개체는 포유 동물, 예컨대 인간일 수 있으나, 기타 포유 동물, 예컨대 영장류, 말, 개, 양, 염소, 토끼, 생쥐 또는 래트를 사용할 수도 있다. 생물한적 샘플을 이후 상기 개체로 부터 얻어서 표지를 검출한다. 생물학적 샘플은 이에 제한되지는 않으나, 혈장, 혈액, 소변, 배설물, 점액, 조직, 누액 또는 타액을 포함한다.
표지의 측정
본 발명에서 개시하는 표지화 시약은 표지의 성질에 따라서, 당 분야의 당업자에게 공지인 통상의 방법을 사용하여 이룰 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 개시하는 형광 방법을 사용할 수 있는 디바이스의 일례를 나타내는 개략적인 도면을 도 3에 나타내었다. 상기 도면에 기술한 다양한 거울 및 렌즈는 설명의 목적으로 나타낸 것이며 본 발명에서 개시하는 검출법, 측정법 및 분석 방법용으로 사용할 수 있는 디바이스의 디자인을 이에 제한하려고 제공하는 것은 아니다. 일련의 거울 및 렌즈를 포함할 수 있는, 이중-회절격자 발광 분광계를 이어서 통과하는 광이 공급원(본 발명의 다른 부분에서 기술함)으로부터 제공된다. 또한 이중-회절격자 발광 분광계는 이중-회절격자 발광 분광계를 통과하는 광의 특성과 관련된 임의 정보를 기록할 수 있으며, 거울 및 렌즈의 기능을 제어할 수 있는 마이크로프로세서 및 연합된 소프트웨어가 포함된다. 샘플과 접촉하기 전에 광을 측정, 제어 및/또는 조작하기 위한 기타 방법 및 디자인을 상기 디바이스에 사용할 수 있다.
이중-회절 격자 발광 분광계를 통과한 후, 광은 샘플 구획을 통과하며; 도 3의 경우, 비록 다른 디자인도 본 발명에서 개시하는 디바이스의 범주내로 고려할 수 있지만, 샘플 구획은 T-박스 샘플 구획 모듈로 표시하였다. 일련의 렌즈 및 거울이 또한 상기 샘플 모듈 내에 배열될 수 있다. 또한, 상기 샘플 모듈은 이중-회절 격자 분광계 내에 존재하는데; 즉, 샘플 구획은 개별 모듈로 존재할 필요가 없다. 샘플 구획 모듈의 성분 및 특성은 마이크로프로세서 및 연합 소프트웨어를 사용하거나, 또한 유사 디바이스를 사용할 수 있으며, 또한 보다 직접적으로는 디바이스의 최종 사용자에 따라 제어되거나, 모니터되고/되거나 기록될 수 있다. 공급된 광이 샘플과 상호 작용한 후, 샘플 유래의 최종 광(반사, 발광, 투과 등에 의함)을 더 분석할 수 있다. 공급 광원의 일부를 또한 참조 빔으로 사용할 수 있는데, 이 경우 참조 빔은 샘플과 접촉시키지 않는다. 도 3에 개략적으로 나타낸 디바이스의 일례에서, 최종 광(본 발명에서는 또한 측정 광 및 수용광이라고도 함)은 샘플 구획 내에 존재하는 일련의 거울 및 렌즈를 더 통과할 수 있고; 또한, 최종 광의 일부는 다른 디바이스나 장치로 보내질 수도 있다.
도 3에서, 샘플 구획 내의 일련의 선택적인 거울 및 렌즈를 통과한 후, 최종 광은 이중-회절 격자 발광 분광계를 통과하는데, 이는 일련의 렌즈 및 거울을 더 포함할 수 있다. 이중-회절 격자 발광 분광계의 사용으로, 상기 이중-회절 격자 발광 분광계는 이중-회절 격자 발광 분광계를 통과하는 광의 특성과 관련된 임의 정보를 기록할 수 있으며, 거울 및 렌즈의 기능을 제어할 수 있는 마이크로프로세서 및 관련 소프트웨어를 포함할 수 있다. 샘플과 접촉한 후 광을 조작, 제어 및/또는 측정할 수 있는 기타 방법 및 디자인을 상기 디바이스에서 사용할 수 있다. 도 3에 개략적으로 나타낸 디바이스의 최종 단계에서, 최종 광은 최종 광의 특성을 기록하기 위한 장치의 일부로 사용할 수 있는, 광전자 증배기 튜브와 상호작용한다. 최종 광의 특성을 기록, 보관 및 분석하기 위한 방법은 본 발명에서 기술하며 도 3에 개락적으로 나타낸 디바이스에 도입할 수 있다. 상기 디바이스는 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 다양한 시간 측정 디바이스, 초퍼(chopper), 및 관련 하드웨어, 마이크로프로세서, 데이타 저장 디바이스, 및 소프트웨어 등을 포함하는 일련의 측정을 가능하게 하는 수단을 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, 측정은 단지 한번 할 수 있거나; 복수 측정하거나, 바람직하게는 동일 샘플에 대해 2회 이상 수행할 수 있다. 복수 측정할 경우, 후속 측정시 짧은 지연 시간이 일어날 수 있다. 일 구체예에서, 예를 들어, 후속 측정 전에 10 초 이상이 주어질 수 있다. 다른 구체예에서, 유력한 후보 조절 인자의 부재시 예를 들어 레티놀-RBP-표지화 TTR 샘플을 분리하여 측정함으로서 비특이적 배경 형광값을 고려할 수 있다.
본 발명에서 개시하는 방법에 적절한 디바이스는 조사 단계, 검출 단계, 정보 저장 단계, 검출 단계의 이미지, 데이타 또는 정보의 조작 또는 디컨볼루팅 단계 등을 제어할 수 있는 소프트웨어를 포함한다.
화학 발광, 방사선 동위원소 표지 및 기타 표지 화합물의 예는 미국 특허 제4,618,485호; 제5,981,202호에서 확인할 수 있으며, 관련 부분을 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
고효율 분석법
본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물은 또한 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물과 관련하여 다수의 조절 인자를 빠르게 스크리닝할 수 있는 고효율 분석법에 관한 것이다. 상기 분석법은 레티놀-RBP-표지화 TTR 복합체의 유력한 후보 조절 인자를 검출 및/또는 정량화하는데, 이때 유력한 후보 조절 인자 또는 치료 후보제제는 복합체 형성 전, 동안 또는 후에 첨가한다. 상기 언급한 라이브러리 화합물을 포함하는, 조절 인자 또는 제제에 의한 결합 억제는 TTR 단백질 또는 폴리펩티드에 부착된 광학적으로 검출가능한 표지의 양을 변화시키셔, 상기 표지화한 TTR 또는 RBP는 선택적으로 고상 지지체에 부착시킨다. 조절 정도는 용액 내 표지의 양을 측정하여 결정하거나, 또는 부착된 TTR 또는 RBP의 경우에는 고상 지지체에 부착한 표지의 양을 측정하여 결정한다. 이들 양은 조절 인자가 없는 경우에 존재하는 표지의 양과 비교한다. 마이크로타이터 플레이트 형광 리더 또는 마이크로칩 어레이 형광 리더를 포함하는 고효율 광학 디바이스를 사용하여 측정법을 수행한다. 상기 분석법은 균일한 방법인데, 즉 개별 세포 또는 고상 지지체의 스캐닝을 통해서 결합한 표지의 양이 구별되기 때문에, 결합하지 않은 표지를 제거하기 위한 분리 단계가 필요하지 않다. 다르게는, 상기 분석법은 임의의 자유 성분, 예를 들어, 복합체를 이루지 않는 표지화한 TTR을 제거하는 세척 단계를 포함하는 비균일법일 수 있다. 상기 방법은 시험 화합물을 저용량, 및 소량으로 사용하여 분석시 예외적인 감도 및 고효율을 이룰 수 있게 한다.
키트
다른 구체예에서, 본 발명에서 개시하는 방법 및 조성물을 사용하여 조절 인자를 스크리닝하기 위한 분석법을 수행할 수 있는 키트를 제공한다. 상기 키트는 TTR 프로브 및 상기 TTR 단백질 또는 폴리펩티드를 표지화할 수 있는 수단을 포함한다. 상기 TTR은 본 발명에서 개시하는 구체예들에 따라서, 형광 수용체 부분을 포함하는, 형광 분자로 표지화할 수 있다. 다르게는, 상기 키트는 RBP 및 레티놀을 포함하며, 상기 TTR은 고상 지지체에 부착시키거나(또는 결합하거나 흡착시킨) 자유 상태일 수 있다.
치료 방법, 용량 및 병용 요법
환자의 황반 또는 망막 변성증 및 이영양증에 대한 다양한 치료제 및 치료 요법이 존재하는데, 광역학 치료법(PDT), 저용량 방사선 요법, 망막하 수술법, RPE 이식법, 망막 전위 수술법, 드루젠의 레이저 치료법, all-trans-레티날 및 13-cis-레티날의 유도체를 포함하는, 레티닐 유도체의 유효량을 함유하는 약물 치료법 등을 포함한다.
기타 방법을 황반 변성증 및 이영양증, 망막 변성증, 및 지도상 위축증을 치료하는데 사용할 수 있다. 따라서, 화학식 I의 화합물의 치료학적 유효량을 황반 변성증(노인성 황반 변성증의 습성 형태 및 건성 형태를 모두 포함), 황반 이영양증, 망막 변성증 및/또는 지도상 위축증을 앓고 있는 인간에게 투여하여 이러한 병태를 치료할 수 있다. 따라서, 펜레티니드 및 이의 활성 대사 산물을 그러한 방식으로 투여할 수 있다. 이러한 치료 방법, 용량, 약학 제제 및 추가 실험에 대한 구체적인 설명은 2004년 6월 23일 출원된 미국 가출원 제60/582,293호 및 2004년 8월18일 출원된 미국 가출원제60/602,675호, 2004년 11월 4일 출원된 미국 가출원 제60/625,532호, 2004년 11월19일 출원된 미국 가출원 제60,629,695호, 2005년 3월11일 출원된 미국 가출원 제60/660,904호, 및 2005년 4월 18일 출원된 미국 가출원 제60/672,405호를 참고할 수 있으며, 이들의 개시 내용을 전체적으로 본 발명에 포함시킨다.
개인에게 유용함을 제공하도록 사용할 수 있는 추가의 병용 방법으로는 특정 안과 병태와 관련되어 있는 것으로 알려진 돌인변이 유전자를 개체가 보유했는지 확인하기 위한 유전자 검사의 사용을 포함한다. 예를 들어서, 인간 ABCA4 유전자에 존재하는 결함은 스타르가르트, 추상체-간상체 이영양증, 노인성 황반 변성증 및 망막 색소 변성증을 포함하는 4 종의 개별 망막 표현형과 연관되어 있는 것으로 여겨지고 있다. 이러한 환자들은 본 발명에서 개시한 방법에서 치료학적 및/또는 예방적 혜택을 찾기를 기대할 것이다.
또한, 상기 언급한 성분들뿐만 아니라, 본 발명에서 개시하는 제제는 약학 제제 분야에서 사용하는 하나 이상의 선택적인 보조 성분, 즉, 희석제, 완충제, 향미제, 착색제, 결합체, 표면 활성제, 농축제, 윤활제, 현탁제, 보존제(항산화제 포함) 등을 더 포함할 수 있다.
이하 본 발명에서 개시하는 방법을 실시하기 위한 성분, 과정 및 절차들은 상기 언급한 것들과 상응한다. 이하의 절차들은 레티놀 결합의 조절 이자를 검출 및 스크리닝하기 위한 과정의 특정 바람직한 구체예를 통해 설명한다. 특별하게 설명하지 않는 임의의 방법, 물질, 시약 또는 부형제등은 분석 및 스크리닝 분야의 당업자에게 공지이며 이용가능한 것이다.
실시예 1 : TTR의 표지화
TTR(Sigma Chemical Co.)을 인산 완충 염수(PBS) 완충제(pH7.2)에 용해시키고, 단백질 농도는 약 2 내지 3 ㎎/㎖로 조정하였다. 표지화하기 전, 샘플의 pH를 올리기 위해서 10 %(v/v)의 1 M NaHCO3(pH 8.3)를 첨가하였다.
ALEXA FLUOR? 430(Molecular Probes) 스톡 용액(DMSO 내 존재)의 4 배 몰 초과량을 상기 단백질 용액에 첨가하였다. 혼합물을 암실에서 Nutator 상에서 상온으로 항온 반응시켰다. 30 분 후, 형광 프로브의 다른 분취물을 제1 분취물과 대략 동일한 양으로 첨가하였다. 혼합물을 30 분 더 항온 반응시켰다.
ALEXA FLUOR? 430 표지화한-TTR을 Econo-Pac 10DG 탈염 컬럼(Bio-Rad)을 사용하여 자유 프로브와 분리하였다. 단백질 분획을 농축시키고 자유 프로브의 잔여량을 Centricon YM-3(Millipore) 농축 디바이스를 사용하여 더욱 제거하였다.
280 내지 434 ㎚에서 표지화 단백질 용액의 흡광도를 분광형광계를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도는 다음의 식으로 산출하였다.
수학식 1
Figure 112007040817382-PCT00003
여기서 0.28은 280 ㎚에서 프로브 흡광도를 계산하기 위한 보정계수이고, 77,600 cm-1M-1은 TTR의 몰 흡광 계수이다.
(a) 표지화 정도는 다음의 식으로 산출한다.
수학식 2
Figure 112007040817382-PCT00004
여기서 16,000 cm-1M-1은 434 ㎚에서 ALEXA FLUOR? 430의 몰 흡광 계수이다.
실시예 2 : TTR 및 RBP 결합의 형광 측정
1 uM TTR 또는 ALEXA FLUOR? 430-표지화한 TTR의 3 ㎖을 PBS 완충제 내에 제조하고 3 ㎖-형광 큐벳에 넣었다. Jobin-Yvon Fluorolog 3 분광 형광 분석계를 사용하여, 여기 파장이 280 ㎚에서는 발광 스펙트럼은 290 ㎚ 내지 650 ㎚에서 측정하였고, 여기 파장이 330 ㎚에서는 발광 스펙트럼은 340 ㎚ 내지 650 ㎚에서 측정하였다. 분광 형광 분석계는 1.5 ㎚로 맞추었다.
농축된 홀로-RBP(RBP에 레티놀 결합) 스톡 용액의 소량의 분취물을 이후 연속적으로 TTR 용액에 첨가하였다. RBP의 최종 농도는 각각 0.33 uM, 0.67 uM, 1 uM, 1.33 uM, 1.67 uM 및 2 uM이었다. 각각 첨가한 후, 샘플을 혼합하고 상온에서 20 분간 항온 반응시켰다. 형광 스펙트럼은 상기와 같이 측정하였다. 발광에 관여하는 RBP 값은 적절한 농도에서 RBP 블랭크 값을 사용하여 측정한 스펙트럼에서 삭감하였다.
상이한 RBP 대 TTR 비율에서, 두 개의 발광 피크, 330 ㎚에서 TTR 단백질 발광(280 ㎚에서 여기), 및 540 ㎚에서 Alexa Fluor 430 발광(330 ㎚에서 여기)이 특히 모니터되었다.
실시예 3 : 방향족 아미노산 켄칭의 비교
RBP-TTR 상호 작용을 검출하기 위해 현재 사용되는 방법은 RBP가 상승 농도로 존재시 TTR 단백질(방향족 아미노산) 형광의 켄칭에 의존한다. 조혈청의 분석은 혈청 내 다른 간섭 단백질이 존재하기 때문에 본 발명의 분석에서는 허용하지 않는다. 따라서, RBP는 TTR 결합 분석 전에 조혈청에서 정제해야한다. 이는 고효율 스크리닝에 적용하기에는 시간 소모적인 과정이다. 이 기술을 사용하여 얻어지는 데이터의 일례를 도 4A에 나타내었다. 도 4A에서, 레티놀-RBP-비표지화 TTR 복합체의 형광 발광은 280 ㎚에서 여기시켜 측정하였다. 그래프 내 다른 곡선은 샘플 혼합물에 첨가된 증가 농도의 RBP를 나타낸다. RBP의 양이 보다 많을 때, 높은 농도의 RBP는 비표지화한 TTR과 복합체를 형성하고, 복합체를 형성한 RBP는 점차 TTR 상의 방향족 아미노산 형광 신호를 켄칭한다.
일상적인 결합 분석법의 한계를 극복하기 위해서, 고효율 분석법은 RBP-TTR 상호작용의 역학을 조사하도록 개발하였다(도 4B 참조). 이 분석법에서 시판중인 TTR을 레티노이드 단백질 복합체가 결합했을 때(즉, 레티놀-RBP에)만 여기하는 형광 프로브로 개질시켰다. 따라서, 조혈청 내 존재하는 비특이적 단백질 및/또는 비결합 레티노이드-단백질 종이 RBP-표지하한 TTR 복합체의 검출을 방해하지 않는다. 또한, 상기 분석법은 2 내지 3배 감도가 높고 검출 및 정량화를 위해서 보다 역동적인 범위 및 직선성을 갖는 것으로 확인되었다. 두 기술의 직접 비교를 나타내었다(도 5). 상기 분석법은 고수율 형태로 다수 샘플의 스크리닝을 촉진할 수 있도록 96-웰 플레이트에 맞출 수 있다.
실시예4 : 혈청 레티놀 농도, 및 안구 레티노이드 및 A2E에 대한 혈청 HPR 농도 관련성의 생체내 분석
시험관 내 분석에서, LRAT 활성의 억제를 통해 all-trans 레티닐 에스테르 풀이 최종 저하되었으며, 따라서 11-cis-레티놀도 저하되었다. 시락 회로에서 HPR의 역할을 더 알아보기 위해서, 생쥐의 생체내 HPR의 효능을 조사하였다. 따라서, HPR을 28일 기간 동안 ABCA4이 없는 돌연변이 생쥐에게 투여하였다(5~20 ㎎/㎏, i.p. DMSO 내). 대조구 생쥐는 DMSO 운반체만 투여하였다. 치료 기간의 종결시, 혈청 내 레티놀 및 HPR 농도 및 안구 조직 내 레티노이드 함량을 측정하였다. 혈청 HPR 증가에 따라서 혈청 레티놀이 상당히 감소하는 것으로 관찰되었다. 이러한 효과는 안구 레티노이드 및 A2E(독성 레티노이드-계 형광단)의 적절한 저하와 연관되어 있다. 따라서, 측정한 레티노이드, 및 A2E 각각에 대해 산출한 감소 퍼센트는 거의 동일하다(도 6 참조). 이러한 결과는 전신 투여시 시각 회로 단백질(예를 들어, LRAT)에 HPR이 제한적인 효과를 나타내는 것을 의미하며; 대신 이러한 결과는 HPR의 전신 투여에 의한 안구 레티노이드 및 A2E의 감소는 혈청 레티놀 농도의 감소에 의해 발생하는 것임을 나타낸다. 전신 투여한 HPR이 안구 LRAT를 억제한다면, 안구 레티노이드 및 A2E의 감소가 혈청 레티놀 감소보다 커야할 것이다.
ABCA4가 없는 생쥐에서 관찰된 HPR의 효과가 유전적인 돌연변이에 의한 것이 아님을 확인하기 위해서, HPR(20 ㎎/㎏, i.p. DMSO 내)을 5일간 야생형 생쥐에게 투여하였다. 대조구 생쥐는 DMSO 운반체만을 투여하였다. HPR 치료 마지막 날, 상기 생쥐의 시각 회로가 시각 발색단을 생성하도록 “자극”하기 위해서 일정한 광원(10분간 1000룩스)에 노출시켰다. 조사시킨 후 곧바로, 상기 동물을 희생시켜서 혈청 및 안구 조직 내 레티노이드 농도를 확인하였다. 그 데이터는 레티닐 에스테르나 시각 발색단의 합성이 유의하게 억제되지 않았음을 보여준다. 사전 실험에서, HPR은 혈청 레티놀(~55 %), 안구 레티놀(~40 %) 및 안구 레티날(~30 %)을 유의하게 감소시켰었다. HPR이 치료 기간(~5 uM) 동안 안구 조직 내에 축적되지만, LRAT 또는 Rpe65/이성질체화 효소의 활성에 대한 어떠한 효과도 관찰되지 않았다.
RBP4-/- 생쥐와 ABCA4-/- 생쥐의 유전적 교차를 수행하여 혈청 및 안구 조직 내 레티놀 농도의 매개에서 RBP의 역학을 조사하였다. 이러한 교차의 제1 세대 유래의 생쥐(즉, RBP4/ABCA4+/-)는 투여 용량이 10 ㎎/㎏일 때 HPR 실험에서 관찰되었던 것과 같이 상당한 농도로 RBP-레티놀 감소가 나타났다(혈청 RBP-레티놀의 ~50~60 % 감소). 게다가 RBP4/ABC4=/- 생쥐는 안구 레티놀도 이에 적합하게 감소하는 것으로 나타났다(~60 % 감소)이러한 발견은 HPR과 RBP-레티놀의 약리학적 조절 동안 얻은 데이터와 일관성이 있었으며, 따라서 A2E-계 형광단이 비례적으로 감소하게 될 것임을 강하게 시사하고 있다.
시험관 내 분석동안 관찰된 LRAT 활성의 억제는 HPR의 단시간(acute) 및 장시간(chronic) 용량을 투여받은 생쥐에서는 관찰되지 않았다. 이러한 생체 내 및 시험관 내 관찰 결과의 차이는 시험관 내 대 생체 내의 시각 회로 효소에 대한 HPR의 상이한 접근성에 의한 것일 것이다. 즉, 시험관 내 분석법에서, HPR은 기질의 첨가 및 분석 개시전에 효소 공급 물질과 미리 항온 반응시킨다. HPR은 사전 항온 반응 및 분석 기간 동안 시각 회로 단백질과 보다 용이하게 접근할 수 있어서 상기와 같은 관찰 결과가 생기게 된다. 생체 내의 상황은 이와 매우 다르다. 시각 회로의 모든 효소 단백질들은 자연 상태에서 소수성이므로, HPR과 같은 작은 극성 분자의 접근이 상당히 방해받게 될 것이다.
실시예 6 : RBP/TTR 상호 작용 검출용 고효율 분석법
혈청 레티놀 및 RBP의 감소는 독성 리포푸신 형광단의 동시적인 감소와 관련되어 있다. RBP-TTR 상호 작용에 영향을 주는 화합물은 안구에서 형광단 농도에 직접적으로 영향을 줄 것이기 때문에, RBP와 TTR의 상호작용을 방해하는 소분자에 대하 고효율 스크리닝법을 개발하였다. 이 스크리닝법은 복합체를 형성했을 때 고유한 형광 공명 에너지 전이(FRET) 에 관여하는 TTR 및 RBP의 프로브-표지화 형태를 사용한다. RBP-TTR 상호 작용을 간섭하는 화합물은 FRET를 방해한다. 이러한 유형의 분석 과정 중 얻어진 샘플 스펙트럼을 도 8에 나타내었다. 이 데이터는 HPR(1 uM)의 부재(직선) 및 존재(점선) 시 RBP-TTR(0.5 uM 표지화하지 않은 RBP +0.5 uM Alexa430-TTR)의 상호 작용을 나타낸다. 상기 샘플을 37℃에서 30분간 항온 반응시키고 330 ㎚ 광으로 조사하였다. 발광 스펙트럼은 400~600 ㎚의 범위에서 관찰되었다. HPR은 RBP에 결합하고 TTR과 상호 작용을 방해하는데, 이겨시 이러한 HRP의 특성을 이용하여 RBP-TTR 상호 작용의 억제를 검출하기 위한 상기 스크리닝법의 능력을 검증하였다. HPR의 존재는 복합체가 상실되었음을 의미하는 레티놀 및 TTR-프로브 형광도의 유의한 감소와 관련되어 있다. 추가적으로, 상기 분석법의 디자인은 RBP와 상호 작용하는 화합물 대 TTR과 상호 작용하는 화합물의 구별을 가능하게 한다. 따라서, 2 종의 여기 에너지(각각 단백질 및 레티놀에 대해서 280 ㎚㎚ 및 330 ㎚)를 사용하고 레티놀 및 TTR-프로브 형광의 동시 모니터링을 위한 수단을 제공하여서, 추정되는 소분자의 “표적”을 쉽게 결정할 수 있다.
실시예 7 : 384-웰 플레이트 형태에 분석법을 적용 및 최적화함
다수의 시험 화합물의 스크리닝을 촉진하기 위해서, RBP-TTR 분석법을 384-웰 플레이트 형태에 적용하였다. 이러한 변화는 용해도 및 검출 감도를 유지시키기 위한 최소 분석 용량 및 시약 농도의 재 평가가 요구된다. 384-웰 플레이트 형태에서, 이 분석법은 0.5 uM 아포-RBP, 0.5 uM TTR, 2~8 uM 시험 화합물 및 1 uM 레티놀을 사용한 50 ㎕ 용량에서 효과적으로 수행할 수 있다. 최소 형광 배경값, 최고의 광학 투명도 및 최적의 웰 디자인을 보유한 마이크로플레이트는 Corning model #3711인 것으로 확인되었다.
디메틸 설폭시드(DMSO)를 사용하여 RBP-TTR 분석 혼합물에 시험 화합물을 전달하게 된다. 또한, 특정 화합물을 사용하여 관찰되는 억제능의 역학 특성을 결정 하기 위해서, 시험 화합물은 다양한 농도로 평가된다. 고효율 분석법에서 이러한 목적을 얻을 수 있는 가장 편리한 방법은 고정된 화합물 농도의 용량을 증가시켜 첨가하는 것이다. 이러한 방법은 분석 혼합물내 DMSO의 농도를 증가시키게 된다. 따라서, DMSO의 증가 농도에 대한 RBP-TTR 분석의 내성을 결정하기 위한 시험을 수행하였다. 최대 8 %(v/v) 농도의 DMSO는, RBP-TTR 억제능에 대한 양성 대조구로 사용하였던, HPR의 존재 유무와 상관없이 RBP-TTR 상호 작용에 영향이 없는 것으로 확인되었다.
TTR-AlexaFluor 430의 생성에 대해 중요하게 고려할 것은 RBP에 대한 TTR의 고유 친화성을 상쇄하지 않으면서 TTR 단백질을 유효하게 표지화하기 위해 요구되는 AlexaFluor 430의 양( 및 최적 표지화를 위한 특정 조건)이다. 이러한 문제는 AlexaFluor 430의 mol%의 증가는 비용 증가를 의미하므로 경제적인 문제와 연관된다. RBP 결합에 영향을 주지않으면서 TTR을 효과적으로 표지화하는데 요구되는 AlexaFluor 430의 최소 몰 %를 결정하기 위한 시험을 수행하였다. 4량체 TTR의 1몰을 표지화하는데 1.7 몰%의 AlexaFluor 430이 요구되는 것으로 확인되었다.
RBP-TTR 분석법의 고효율성을 더 높이기 위해서, 시험 화합물은 마스터 플레이트에 한번 첨가하고 레티놀 첨가 및 분석법 수행 전 최대 2주간 -20℃에서 상기 플레이트를 보관하게 된다. 본 분석법은 이러한 조건에서 매우 안정적이다. -20℃에서 2 주간 보관 후 어떠한 감도 손실도 관찰되지 않았다.
실시예 8 : 통상의 기술과 분석법의 비교 및 검증
크로마토그래피 및 분광 분석법을 통해서 HPR이 RBP-TTR 상호 작용의 효과적 인 억제제임이 확인되었다(문헌 [Radu, RA, Han Y, Bui TV, Nusinowitz S, Bok D, Lichter J, Widder K, Travis GH 및 Mata NL; Reductions in Serum Vitamin A Arrest Accumulation of Toxic Retinal Fluorophores: A Potential Therapy for Treatment of Lipofuscin-based Retinal Diseases, Invest Ophthalmol. Vis Sci., in press (2005)] 참조). 따라서, RBP-TTR 상호 작용의 억제제를 검출하는 고효율 분석법의 성능을 검증하기 위한 양성 대조구로 HPR을 사용할 수 있다. 따라서, 고효율 분석법을 평가하기 위해서, 실시예 7에서 특정한 조건을 사용하여, 다양한 농도(0~4 uM)의 HPR을 사용하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 고효율 분석법은 HPR 처럼, RBP-TTR 상호 작용을 억제하는 화합물을 검출하는데 효과적이다.
생리학적으로, RBP-레티놀의 높은 정상(steady-state) 농도를 획득하기 위해서, RBP-레티놀은 TTR과 복합체를 형성해야한다. 이러한 상호 작용은 사구체 여과에 내성이 있는 고분자 크기의 복합체를 형성시키며 간 이외의 표적 조직에 레티놀을 전달할 수 있게 한다. RBP-TTR 상호 작용의 억제에 의해서 비교적 작은 크기의 RBP-리간드 복합체는 사구체 여과를 통해 손실될 수 있기 때문에 순환하는 RBP를 감소시키게 된다. 따라서 순환하는 RBP의 감소는 순환하는 레티놀의 감소를 야기한다. 이러한 효과는 몇몇 연구자들에 의해서 생체 내 HPR에 대해 확립되었다. 이 효과는 또한 all-trans 및 13-cis-레티노산을 사용한 생체 내에서도 관찰되었다(예를 들어, 문헌 [Berni R, Clerici M, Malpeli G, Cleris L, Formelli F; Retinoids: in vitro interaction with retinol-binding protein and influence on plasma retinol, FASEB J. (1993) 7:1179-84)] 참조).
이러한 효과의 기초를 이루는 작용 기전은 RBP-TTR 상호 작용의 파괴를 통해 설명할 수 있다. 이러한 가능성을 확인하고 RBP-TTR 스크리닝을 더욱 검증하기 위해서 HPR 분석에 특이적인 조건을 사용하여, all-trans 레티노산 및 13-cis-레티노산의 효과를 시험하였다. 얻어진 결과(도 10)는 전체적으로 생체 내 데이터와 일관성이 있었다. 이러한 발견은 RBP-TTR 상호작용에 대한 공지의 생리학적 억제제를 검출하기 위한 상기 분석법의 능력을 더욱 검증시킨 것이다.
실시예 9 : 통상의 방법과의 비교
두 단백질 사이의 복합체 형성을 검출하기 위해 사용되는 현행 고효율 방법론들은 형광 기술을 사용하는데 제한적이다. 대중적인 방법은 형광 이등방법(fluorescence anisotropy)이다. 이 방법은 분자 체적(또는 크기) 변화를 측정하는 것이며 RBP-레티놀 및 TTR 사이의 상호 작용을 측정하는 분석 시험에서 성공적으로 사용되었다(예를 들어, 문헌 [van Jaarsveld PP 등, J. Biol.Chem., 248:4698-705(1973); Kopelman M 등, Biochim Biophys Acta. 439:449-60(1976); Malpeli G, 등 Biochim Biophys Acta., 1294:48-54(1996)] 참조). 이러한 방법에서, 레티놀의 형광 발광을 0 및 90도 각도에서, TTR의 부재 및 존재시에 모니터한다. 이 방법이 매우 감도가 있지만, 정량적이지는 않다. 따라서, 산출된 값은 모든 RBP-TTR 결합 정도에 대해 동일하게 된다. 상기 분석법에서 존재하는 TTR에 대한 RBP-레티놀의 100 %의 결합과 단지 10 %만이 결합한 경우를 구별할 수 없다. 이러한 이방성 방법의 단점은 도 11에 나타내었다. 여기에, RBP-TTR 상호 작용에 대한 HPR의 효과를 우리의 일반적인 FRET(고효율) 분석법과 통상의 형광 이방성 방법을 사용하여 측정하였다.
RBP-TTR 상호 작용에 영향을 주는 화합물을 스크리닝하기 위한 형광 이방성 방법의 기술적 난점뿐만 아니라, 근자외선(UV) 범위에서 검출하는 형광 이방성 방법을 제공하는 고효율 성능을 갖는 이용가능한 시판중인 기구가 매우 드물다. 한편, FRET는 모든 통상의 형광 마이크로플레이트 리더에서도 사용할 수 있다.
본 발명에서 개시하고 청구하는 모든 방법은 본 발명의 개시물의 관점에서 과도한 실험없이 실시 및 수행할 수 있다. 당 분야의 당업자라면 본 발명의 개념, 정신 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련성이 있는 임의 제제를 동일하거나 유사한 결과를 얻을 경우에는 본 발명에서 개시한 제제를 대체하여 사용할 수 있음은 분명하다. 모든 유사한 대체물 및 변형물은 당 분야의 당업자라면 본 발명에 첨부된 청구항에서 한정하는 본 발명의 정신, 범위 및 개념내에 속한다는 것을 알 것이다.

Claims (26)

  1. 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하는 조성물로서, 상기 표지화한 TTR은 형광 부분에 부착된 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀에 의해 형성된 복합체를 더 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 후보 치료 제제를 더 포함하는 조성물.
  4. 황반 변성증 또는 이영양증(dystrophy)의 치료를 위한 치료 제제를 동정하는 방법으로서,
    a. 레티놀-RBP-표지화한 TTR 복합체를 형성시키기에 충분한 조건하에서 하나 이상의 후보 치료 제제, 표지화한 TTR, RBP 및 레티놀을 포함하는 샘플을 항온 반응시키는 단계; 및
    b. 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 후보 치료 제제는 항온 반응 후 상기 복합체의 발광 스펙트럼을 감소시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서, TTR 표지는 형광 부분인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 형광 부분은 수용체(acceptor) 형광 부분인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 복합체는 형광 공명 에너지 전이를 통해 탐지하는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 형광 부분은 380 ㎚ 내지 480 ㎚에서 흡광하고 520 ㎚ 내지 600 ㎚에서 발광하는 것인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 형광 부분은 N-((2-(아이오도아세트옥시)에틸)-N-메틸)아미노)-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 4-디헥사데실아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥산산, 숙신이미딜 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)헥사노에이트, 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아미드, N-(5-아미노펜틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, N, N'-디메틸-N-(아이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아민, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄술포네이트, 1-(2,3-에폭시프로필)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 트리플루오로메탄술포네이트, 1-(3-(숙신이미딜옥시카르보닐)벤질)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 브로마이드, 3-(4-카르복시벤조일)퀴놀린-2-카르복스알데 히드, 3-(2-퍼로일)퀴놀린-2-카르복스알데히드 및 ALEXA FLUOR®염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 형광 부분은 ALEXA FLUOR®염료인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 여기 파장은 275 ㎚ 내지 295 ㎚이고 발광 파장은 330 ㎚ 내지 650 ㎚에서 측정하는 것인 방법.
  12. 제7항에 있어서, 여기 파장은 315 ㎚ 내지 345 ㎚이고, 발광 파장은 525 ㎚ 내지 600 ㎚에서 측정하는 것인 방법.
  13. 제4항에 있어서, 후보 치료 제제는 소분자인 방법.
  14. 제4항에 있어서, 후보 치료 제제는 레티닐 유도체인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 레티닐 유도체는 N-(4-히드록시페닐)레틴아미드, N-(4-메톡시페닐)레틴아미드, 또는 에틸레틴아미드인 방법.
  16. 황반 변성증 또는 이영양증을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 제4항 의 방법을 사용하여 동정한 레티놀-RBP-TTR 복합체 형성의 조절 인자(modulator)를 치료학적 유효량으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 치료 제제는 소분자인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 치료 제제는 레티닐 유도체인 방법.
  19. 레티놀, RBP, 및 TTR을 포함하는 복합체 형성의 조절 인자로서, 레티놀, RBP 및 표지화한 TTR을 포함하는 복합체의 형성도 조절하는 조절 인자.
  20. 제19항에 있어서, TTR은 형광으로 표지화한 것인 복합체.
  21. 제19항에 있어서, 복합체는 시험관 내 샘플에 존재하는 것인 조절 인자.
  22. 제19항에 있어서, 복합체는 생체 내 샘플에 존재하는 것인 조절 인자.
  23. 제19항에 있어서, 레티닐 유도체인 것인 조절 인자.
  24. 인간의 황반 변성증을 치료하는 방법으로서, 레티놀-레티놀 결합 단백질(RBP)-트랜스타이레틴(TTR) 복합체의 형성을 억제하는 화합물을 치료학적 유효량 으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 화합물은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 활성 대사 산물, 약학적으로 허용가능한 프로드러그 또는 용매화물인 방법;
    [화학식 I]
    Figure 112007040817382-PCT00005
    상기 식에서, X1는 NR2, O, S, CHR2로 이루어진 군으로부터 선택되고; R1은 (CHR2)x-L1-R3이며, 여기서 x는 0, 1, 2, 또는 3이고; L1은 단일 결합이거나 -C(O)-이며; R2는 수소, (C1-C4)알킬, F, (C1-C4)플루오로알킬, (C1-C4)알콕시, -C(O)OH, -C(O)-NH2, -(C1-C4)알킬아민, -C(O)-(C1-C4)알킬, -C(O)-(C1-C4)플루오로알킬, -C(O)-(C1-C4)알킬아민, 및 -C(O)-(C1-C4)알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분이며; R3는 수소이거나 (C2-C7)알케닐, (C2-C7)알키닐, 아릴, (C3-C7)시클로알킬, (C5-C7)시클로알케닐, 및 복소환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 1∼3의 독립적으로 선택되는 치환기로 임의 치환되는 부분이며, 단 x가 0이고 L1이 단일 결합일 때 R3는 H가 아니다.
  26. 제25항에 있어서, X1는 NR2이고; R1은 (CHR2)x-L1-R3이며, 여기서 x는 0이고; L1은 단일 결합이며; R2는 수소이고; R3는 단일-치환된 아릴인 것인 방법.
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