DE10038641A1

DE10038641A1 - Pharmazeutische Zusammensetzungen mit Retinol

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Publication number: DE10038641A1
Application number: DE2000138641
Authority: DE
Inventors: Heinz Nau; Thomas Arnhold; Mohey M A Elmazar
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2002-02-14

Abstract

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die Retinol enthalten. Dabei wird Phytol verwendet zur Reduzierung und/oder Beseitigung der teratogenen Wirkung von Retinol (Vitamin-A) bzw. dessen Abkömmlingen.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Phytol zur Reduzierung und/oder Beseitigung der teratogenen Wirkung von Retinol.

Zudem betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Retinol und Phytol enthalten sowie entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen mit pharmakologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen. An die Stelle von Retinol und Phytol können auch deren Abkömmlinge treten.

Es bestehen Wechselwirkungen der all-trans-Retinsäure (all trans-RA)

oder ihres Vorläufers, dem Retinol (ROH),

mit dem natürlichen RXR-Liganden Phytansäure oder ihrem Vorgänger, dem Phytol (POH).

Retinol ist das Synonym für Vitamin-A-Alkohol. Der IUPAC-Name lautet all-trans-3,7-Dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-cyclohex-1-en- 1-yl)-nona-2,4,6,8-tetraen-1-ol.

Der oxidierte Metabolit des Retinols, die all-trans-Retinsäure, ist für das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und -repro duktion sowie für die embryonale Entwicklung essentiell (vgl. H. Nau, I. Chahoud, L. Dencker, E. J. Lammer, W. J. Scott (1994), Teratogenicity of vitamin A and retinoids. In: Vitamin A in health and disease (R. Blomhoff, ed.), S. 615-664. M. Dekker, New York; L. J. Gudas (1994). Retinoids and vertebrate development. J. Biol. Chem. 269: 15399-15402; M. Maden (1994). Vitamin A in embryonic development. Nutr. Rev. 52: 3-12). Dabei werden zwei bekannte Familien von nuklearen Rezeptoren für Schlüsselelemente in Bezug auf die Vermittlung der Wirkungen der Retinoide gehalten (D. J. Mangelsdorf, K. Umesono, R. M. Evans (1994). The retinoid receptors. In: The Retinoids. Biology, Chemistry and Medicine.)

Der RAR-Genfamilie, zu welcher die RARα-, RARβ- und RARγ- Subtypen sowie deren Isoformen gehören und der RXR-Genfamilie mit den RXRα-, RXRβ- und RXRγ-Subtypen sowie deren Isoformen scheint eine Schlüsselfunktion zuzukommen. Diese Rezeptoren sind Teil der Steroid-Schilddrüsenhormon-Hormonrezeptor- Superfamilie und fungieren als ligandaktivierte Transkriptionsfaktoren, welche die Expression einer Anzahl von Genen kontrollieren.

Sowohl all-trans-Retinsäure als auch Retinoidrezeptoren sind mit einer bestimmten räumlichen und zeitlichen Verteilung im embryonalen Gewebe zugegen (vgl. C. Thaller and G. Eichele (1987). Identification and spatial distribution of retinoids in the developing chick limb bud. Nature 327: 625-628) Retinol wird pharmazeutisch für unterschiedliche Indikationen bei Vitamin-A-Mangel, der ernährungsmäßig nicht behoben werden kann, verabfolgt. Dabei erfolgt die Einnahme in beträchtlichen Dosierungen (z. B. 30 000 I. E. pro Tag). Noch höher dosiert wird Retinol in Form des Retinolpalmitats verabfolgt, wenn es der Erhöhung der Empfindlichkeit maligner Tumoren für die radiologische und cytostatische Therapie dienen soll.

Ferner wird Retinol auch als Ophthalmikum verabfolgt. Auch hier dient es der Behandlung von Erscheinungen, die durch Vitamin-A- Mangel bedingt sind, wie trophische Störungen von Harn- und Bindehaut, Augenbrennen oder Tränenfilmstörungen.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, in welchen die teratogene Wirkung von Retinol und dessen Abkömmlingen herabgesetzt wird und es so ermöglicht wird, Retinol in höheren Dosen zu verwenden.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß den pharmazeutischen Zusammensetzungen oder ein Abkömmling des Phytols zur Reduzierung und/oder Beseitigung der teratogenen Wirkung von Retinol zugesetzt wird.

Als Abkömmlinge des Retinols (Vitamin A) sind insbesondere Retinal, 3-Dehydroretinol, Retinylpalmitat und retro- Retinolderivate zu verstehen. Die Abkömmlingen des Phytols sind insbesondere Phytansäure, Isophytol und Phytolaldehyd. Retinol und Phytol können in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in einem Gewichtsverhältnis von 100 : 1 bis 1 : 1 vorliegen.

Vitamin A ist in praktisch allen Multivitamin-Supplementen enthalten, die als Nahrungsergänzungsmittl vielfältig eingenommen werden. Die als nicht-teratogen angenommene Dosierung (10 000 I. E./Tag) liegt dabei relativ nahe an der zur Verhinderung von Mangelerscheinungen notwendigen Dosis (etwa 3000 I. E./Tag für Erwachsene). Ein Zusatz von Phytol könnte diesen "Sicherheitsabstand" deutlich vergrößern. Auch vom Konsum von Leber, die zwischen 20-60 mg Retinol (60 000-180 000 I. E.) pro 100 g Leber enthalten kann, wird während der Schwangerschaft abgeraten. Auch hier könnte zusätzliches Phytol die Sicherheit dieses ansonsten als gesund angesehenen Lebensmittel gewährleisten.

Es konnte gezeigt werden, daß all-trans-Retinsäure sowie Retinol als ihr natürlicher Vorläufer bei einer Vielzahl von Spezies teratogen wirken. Unter anderem konnte diese teratogene Wirkung auch bei Mäusen nachgewiesen werden (vgl. H. Nau, T. Chahoud, L. Dencker, E. J. Lammer, W. J. Scott (1994). Teratogenicity of vitamin A and retinoids. In: Vitamin A in health and disease (Blomhoff, R., ed.), S. 615-664. Marcel Dekker, New York).

Ferner konnte gezeigt werden (vgl. M. D. Collins, C. Eckhoff, I. Chahoud, G. Bochert, H. Nau (1992). 4-Methylpyrazole partially ameliorated the teratogenicity of retinol and reduced the metabolic formation of all-trans-retinoic acid in the mouse. Arch. Toxicol. 66: 652-659), daß durch das Unterbinden des metabolischen Schrittes der Oxidation des Retinols zur all trans-Retinsäure die teratogene Wirkung signifikant verringert werden kann. Entsprechende Studien wurden an Mäusen durchgeführt. Um den metabolischen Schritt der Oxidation zu verhindern, werden Alkoholdehydrogenaseinhibitoren, wie beispielsweise 4-Methylpyrazol eingesetzt.

Molekularstudien gaben zu der Vermutung Anlaß, daß für eine starke DNA-Bindung sowie der Transaktivierung der verantwortlichen Zielgene eine Heterodimerisierung eines ligandtragenden RAR mit einem RXR erfolgen muß (Zhang X-K and Pfahl M (1993). Regulation of retinoid and thyroid hormone action trough monodimeric and heterodimeric receptors. TEM 4: 156-162).

Desweiteren wurde nachgewiesen, daß RXR ein wichtiger Regulator ist, welcher zur Heterodimerisierung mit einem RAR keine vorherige Bindung eines Liganden benötigt (vgl. D. J. Mangelsdorf and R. M. Evans (1995). The RXR heterodimers and orphan receptors. Cell 83: 841-850)

Zur eingehenderen Untersuchung der Wirkungen der Retinoide bei der Entwicklung sowie der speziellen Funktionen der RAR- Subtypen wurden synthetische Retinoide verwendet, welche spezifisch an RARs binden und spezielle RARs transaktivieren (vgl. M. M. Elmazar, U. Reichert, B. Shroot, H. Nau (1996). Pattern of retinoid-induced teratogenic effects: possible relationship with relative selectivity for nuclear retinoid receptors RAR alpha, RAR beta, and RAR gamma. Teratology 53: 158-167).

Es konnte nachgewiesen werden, daß die Verabreichung des RARα selektiven Liganden Am580 an trächtige Mäuse die schwersten Defekte verursachte. Bei den beobachteten Defekten handelte es sich vor allem um Wirbelspalt (Spina bifida), abnorm kleine Oberkiefer (Mikrognathie) sowie Körperschäden. Der RARγ-Agonist CD437 ruft Mißbildungen wie Exenzephalie oder Gaumenspalte (Palatum fissum) hervor. Diese Ergebnisse zeigen, daß bestimmte teratogene Wirkungen von RARα-RXR-Heterodimeren und andere teratogene Wirkungen von RARγ-RXR-Heterodimeren ausgelöst werden. Der unselektive, natürliche Ligand all-trans-Retinsäure verursacht Körperschäden als auch Exenzephalie, wenn er am Tage der Gestation verabreicht wird.

Obwohl das Binden eines Liganden an ein RXR für die Bildung eines RAR-RXR-Heterodimers keine Voraussetzung ist, konnte gezeigt werden, daß die zusätzliche Verabreichung des synthetischen Agonisten LG1069 an trächtige Mäuse einen synergistischen Effekt verursacht und dadurch die teratogene Wirkung des selektiven RARα-Liganden Am580 als auch des unselektiven, natürlichen Liganden all-trans-Retinsäure oder dessen Vorgänger, dem Retinol, steigert. Die Verabreichung des RXR-Liganden allein führt zu keiner teratogenen Wirkung. Neben 9-cis-Retinsäure (9-cis-RA)

wurde nun auch Phytansäure (PA)

als ein weiterer natürlicher Ligand und Transaktivator von RXR identifiziert (vgl. P. K. LeMotte, S. Keidel, C. M. Apfel (1996). Phytanic acid is a retinoid X receptor ligand. Eur. J. Biochem. 236: 328-333). Phytansäure ist eine verzweigte Fettsäure und das Oxidationsprodukt von Phythol. Sie ist Teil der Chlorophyllmoleküle in Gemüse und Früchten. Phytansäure kommt in größeren Mengen im Fettgewebe von Wiederkäuern vor. Chlorophyll wird in den Mägen der Wiederkäuer durch Bakterien abgebaut, wobei das freigesetzte Phytol absorbiert und zu Phytansäure oxidiert wird (vgl. J. Avigan (1966). The presence of phytanic acid in normal human and animal plasma. Biochim. Biophys. Acta 116: 391-394). Daher können größere Mengen an Phytansäure in Milchprodukten wie Milch und Butter gefunden werden. Phytansäure ist auch im menschlichen Blut in µM-Konzentrationen vorhanden.

Bei einigen Krankheiten können extrem hohe Phytansäurekon zentrationen bis in den mM-Bereich gefunden werden. Dies ist beispielsweise bei der Refsum-Krankheit oder dem Zellweger- Syndrom der Fall. Hierbei verhindert eine Funktionsstörung die α-Oxidation der Phytansäure, was zu einer Anreicherung der Phytansäure im menschlichen Blut und Gewebe führt.

Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß Patienten, die an einer derartigen Krankheit leiden, ähnliche Symptome zeigen, wie sie bei Vitamin A-Mangel oder bei Hypervitaminose A (Schädigung durch Vitaminüberdosierung) auftreten. Bei den erwähnten Symptomen handelt es sich um Retinitis pigmentose und Ichthyosis (Fischschuppenkrankheit) (vgl. L. M. Kaufman (1998). A syndrome of retinitis pigmentosa, congenital ichthyosis, hypergonadotropic hypogonadism, small stature, mental retardation, cranial dysmorphism, and abnormal electroencephalogram. Ophthalmic. Genet. 19: 69-79; Stüttgen G (1982). Historical perspectives of tretinoln. J. Am. Acad. Dermatol. 15: 735-740).

Die gleichzeitige Verabreichung von Phytansäure und Am580 an trächtige Mäuse führte zu einem starken Anstieg von Am580- induzierten Mißbildungen, vor allem zu Mikrognathie (29 auf 98%) und Körperschäden (7 auf 98%). Obwohl Wirbelspalt (Spina bifida) als Mißbildung nicht auftritt, wenn Phytansäure oder Am580 alleine verabreicht wird, führt eine gemeinsame Gabe zu ca. 51% Mißbildungen der oben beschriebenen Art.

Es konnte nachgewiesen werden, daß in verschiedenen Spezies der Vorläufer Phytol zur Phytansäure bioaktiviert wird. Phytol ist ein Teil des weitverbreiteten Chlorophyllmoleküls und führt auch zu einer Steigerung der durch Am580 ausgelösten Teratogenität. Diese Steigerung der Teratogenität ist vergleichbar mit derjenigen, die beobachtet wird, wenn die synthetischen RXR-Agonisten AGN191701 oder LG1069 zusammen mit Am580 verabreicht werden.

Daher wurden die vorliegenden Versuche dahingehend konzipiert, daß mit ihnen festgestellt werden konnte, ob der natürliche RXR-Ligand Phytansäure oder Phytol als deren Vorgänger in der Lage ist, die teratogene Wirkung des natürlichen RAR-Liganden all-trans-Retinsäure oder Retinol als deren Vorläufer zu steigern. Um metabolische Wechselwirkungen dieser strukturell ähnlichen lipophilen Verbindungen zu untersuchen, wurde zusätzlich die Plasma-Pharmakokinetik bei nicht trächtigen Mäusen bestimmt. Die biologische Aktivierung des Retinols zu all-trans-Retinsäure und deren weiterer Metabolismus zu den Phase I Metaboliten all-trans-4-Oxoretinsäure

und all-trans-4-Hydroxyretinsäure,

als auch zu dem Phase II Metaboliten all-trans-Retinoyl-β-D glucuronid

wurde eingehend untersucht.

Versuchsbeschreibungen Laborative Vorsichtsmaßnahmen

Die Behandlung der Versuchstiere sowie die Entnahme von biologischem Material und sämtliche anderen Labortätigkeiten wurden in dunklen Räumen bei gedimmtem gelbem Licht durchgeführt, um Isomerisierung zu vermeiden.

Versuchstiere

Weibliche Mäuse (NMRI: Harlan-Winkelmann, Borchen, Germany 29-35 g) wurden zwischen Uhr 6 : 00 und Uhr 9 : 00 gedeckt. Die Versuchstiere mit Vaginalpfropf wurden aussortiert und die ersten 24 Stunden nach der Befruchtung wurden als Gestationstag 0 (GD 0) bezeichnet. Die Versuchstiere erhielten Nahrung (Altromin, 1324 Diät, Lage, Germany) und Wasser ad libitum und wurden unter kontrollierten Bedingungen bei Raumtemperatur (21 ± 1°C) und 55 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit einem 12stündigen Tag-Nacht-Zyklus gehalten. Der Tagzyklus lag zwischen Uhr 10 : 00 und Uhr 22 : 00.

Chemikalien

Phytol (3,7,11,15-Tetramethyl-hexadek-2-en-1-ol), Phytansäure (3,7,11,15-Tetramethyl-hexadekansäure), all-trans-Retinsäure, Retinol und Cremophor EL sind kommerziell erhältlich. Soweit nicht anders angegeben, wurden Standardretinoide für HPLC von Sigma bezogen. 14-Hydroxy-4,14-retro-retinol und Anhydroretinol wurden von DR. F. Derguini überlassen (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA). 4-Oxoretinsäure und 4- Hydroxyretinsäureisomere wurden von Hoffmann-La Roche (Basel, Schweiz und Nutley, NJ, USA) zur Verfügung gestellt. Retinylester (außer Retinylpalmitat) und das Retinoyl-β-D glucuronid wurden in unseren Labors hergestellt. Methanol und Isopropanol hatten HPLC Reinheit und wurden von Roth (Karlsruhe) bezogen. Ethanol und Ammoniumacetat war kommerziell bei Merck (Darmstadt) erhältlich. β-Glucuronidase aus E. coli (EC 3.2.1.31) wurde von Boehringer Mannheim bezogen.

Verabreichung von Wirkstoffen

Gruppen von Mäusen wurde eine einzelne orale Dosis von entweder Phytansäure (PA, 100 mg/kg), Phytol (POH, 500 mg/kg), all trans-Retinsäure (RA, 20 mg/kg) oder Retinol (ROH, 50 mg/kg) durch gastrische Intubation am 8,25ten Gestationstag (GD 8,25) verabreicht. Bei den Kombinationsexperimenten wurde den Versuchstieren Retinsäure oder Retinol zusammen mit Phytansäure oder mit Phytol verabreicht. Dabei wurde jeder Wirkstoff in 25% Cremophor EL in destilliertem Wasser suspendiert. Die Konzentration des Wirkstoffs wurde so eingestellt, daß jedem Versuchstier eine 5 ml/kg Dosis verabreicht werden konnte. Zum Zwecke der pharmakokinetischen Untersuchungen wurden nicht trächtige Mäuse entsprechend behandelt.

Untersuchung der Föten

Am 18. Gestationstag (GD 18) wurden die trächtigen Versuchs tiere durch zervikale Dislokation getötet. Implantations stellen, Resorptionen und lebende Föten wurden gezählt. Die lebenden Föten wurden einzeln gewogen und auf äußerliche Mißbildungen untersucht. Die Ergebnisse der Kombinations experimente wurden mittels des "two-tailed unpaired" Student-t- Testes (Gewicht des Fötus) oder des Fisher Exact Testes (Mißbildungen) mit den entsprechenden Versuchen verglichen, bei denen nur Retinsäure oder Retinol verabreicht wurde. Sämtliche Berechnungen wurden mit der GraphPad InStat-2-Software erstellt.

Pharmakokinetische Studien

Retinsäure oder Retinol wurde alleine oder in Kombination mit Phytansäure oder Phytol nicht trächtigen Mäusen verabreicht (n=3 pro Gruppe und Zeitintervall). Einzelne Blutproben von ungefähr 100 bis 150 µl wurden den Mäusen aus der retro orbitalen Nebenhöhle unter kurzzeitigen Etherbetäubung entnommen. Dazu wurden heparinisierte Kapillaren verwendet. Das Blutplasma wurde durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 4°C und 1500 g gewonnen und bis zur Analysierung bei -78°C gelagert. Die Zeitintervalle für die Blutabnahme betrugen 0.5, 1.0, 2.0 und 4.0 Stunden nach der alleinigen Verabreichung von Retinsäure oder der gleichzeitigen Gabe von Retinsäure zusammen mit Phytansäure oder Phytol. Die Zeitabstände für die Blutentnahme betrugen 2.0, 4.0, 8.0 und 12.0 Stunden nach der alleinigen Gabe von Retinol bzw. der kombinierten Verabreichung von Retinol zusammen mit Phytansäure oder Phytol. Blutproben von unbehandelten Mäusen (n=5) wurden zusätzlich entnommen, um den endogenen Retinoidspiegel zu bestimmen. Die Maximalkonzentrationen (C_max) entsprechen den beobachteten Werten und die Flächen unter der Konzentrations-Zeit-Kurve wurden berechnet. Der Vergleich der Konzentrationswerte erfolgte mittels des "unpaired" Student's-t-Testes. Dabei wurden P-Werte von < 0,05 als signifikant erachtet.

HPLC-Analyse

Die Plasmaproben wurden mit einem dreifachen Volumen an Isopropanol extrahiert und danach einer Festphasenextraktion entsprechend dem von Collins beschriebenen Verfahren (vgl. M. D. Collins, C. Eckhoff, I. Chahoud, G. Bochert, H. Nau (1992). 4-Methylpyrazole partially ameliorated the teratogenicity of retinol and reduced the metabolic formation of all-trans retinoic acid in the mouse. Arch. Toxicol. 66: 652-659) unterzogen. Zur Bestimmung der Retinoide im Plasma wurde eine Abwandlung des von Eckhoff und Nau (vgl. C. Eckhoff and H. Nau (1990). Identification and quantitation of all-trans- and 13- cis-retinoic acid and 13-cis-4-oxoretinoic acid in human plasma. J. Lipid Res. 31: 1445-1454) beschriebenen HPLC- Verfahrens angewandt. Das abgewandelte Verfahren verwendet einen Lineargradienten, welcher bei einer 42,5%igen wäßrigen 60 mM Ammoniumacetatlösung mit 57.5% Methanol beginnt und innerhalb von 11 Minuten bei einer 5%igen wäßrigen Ammoniumacetatlösung mit 95% Methanol endet. Um Retinol und Retinsäureester in einem einzigen Chromatographiedurchlauf zu bestimmen, wird der Methanolgehalt bei 11,2 Minuten auf 100% gesteigert und bis 25 Minuten bei dieser Konzentration belassen (vgl. G. Tzimas, J. O. Sass, W. Wittfoht, M. M. Elmazar, K. Ehlers, H. Nau (1994). Identification of 9,13-dicis-retinoic acid as a major plasma metabolite of 9-cis-retinoic acid and limited transfer of 9-cis-retinoic acid and 9,13-dicis-retinoic acid to the mouse and rat embryos. Drug Metab. Dispos. 22: 928-936). Die Ausgangskonzentrationen des Gradienten werden sodann bei 26 Minuten wieder erreicht. Die Detektion erfolgte durch die kontinuierliche gleichzeitige Messung der UV-Absorption des Eluates bei 340 und 356 nm. Die Absorptionsmessung erfolgte mit einem Shimadzu SPD 10 AV Detektor (Kyoto, Japan). Aufgrund der nur kleinen zur Verfügung stehenden Blutproben, wurden die Messungen mit 25 µl-Proben anstelle der im Originalverfahren beschriebenen 100 µl-Proben durchgeführt (vgl. M. D. Collins, C. Eckhoff, I. Chahoud, G. Bochert, H. Nau (1992). 4-Methyl pyrazole partially ameliorated the teratogenicity of retinol and reduced the metabolic formation of all-trans-retinoic acid in the mouse. Arch. Toxicol. 66: 652-659). Aufgrund der kleineren Probenvolumen ergaben sich folgende Mindestkonzentrationen für die Detektionsmessung der Retinoide:

9-cis-Retinsäure	2,8 ng/ml
all-trans-4-Oxoretinsäure	2,8 ng/ml
13-cis-4-Oxoretinsäure	2,8 ng/ml
13-cis-Retinsäure	2,0 ng/ml
all-trans-Retinsäure	2,0 ng/ml
all-trans-Retinoyl-β-D-glucuronid	4,0 ng/ml
14-HRR	5,0 ng/ml
Retinsäureseter	20,0 ng/ml
Anhydroretinol	20,0 ng/ml

Fraktionen mit Glucuroniden wurden gesammelt, zur Trockene eingeengt, in Puffer aufgenommen und einer Hydrolyse mittels β- Glucuronidase unterzogen. Die erhaltenen Retinoide wurden erneut nach dem Verfahren von Sass et al. (vgl. J. O. Sass, G. Tzimas, H. Nau (1994). 9-cis-retinoyl-beta-D-glucuronide is a major metabolite of 9-cis-retinoic acid [published erratum appears in Life Sci 1994; 54(17): PL311]. Life Sci. 54: L69-L74) chromatographiert und bestimmt.

Ergebnisse Teratogene Wirkungen von Phytansäure oder Phytol

Eine einzelne Dosis von Phytansäure (100 mg/kg) oder Phytol (500 mg/kg), welche am GD 8,25 verabreicht wurde, führte zu einer Resorptionsrate von 20% (Phytansäure) bzw. 3% (Phytol) (s. Tabelle 1). Das Fötengewicht betrug 1,18 ± 0,13 g (bei Phytansäure) und 1,26 ± 0,13 g (bei Phytol). Die lebenden Föten zeigten keine sichtbaren Mißbildungen. Im Vergleich mit den Kontrollwerten dieser Mäusegattung (vgl. M. M. Elmazar, R. Ruhl, U. Reichert, B. Shroot, H. Nau (1997). RARalpha-mediated teratogenicity in mice is potentiated by an RXR agonist and reduced by an RAR antagonist: dissection of retinoid receptor induced pathways. Toxicol. Appl. Pharmacol. 146: 21-28) mit 4%iger Resorption und einem Fötengewicht von 1, 2 ± 0,13 g: Die Phytansäuregruppe zeigte eine höhere Resorptionsrate und die Phytolgruppe ein höheres Fötengewicht.

Teratogene Wirkung von Retinsäure alleine oder in Verbindung mit Phytansäure oder Phytol:
Retinsäure wurde oral am GD 8,25 mit einer Dosis von 20 mg/kg Körpergewicht verabreicht (s. Fig. 1). Retinsäure führte zu einer verstärkten Resorption (RS, 44%). Äußerliche Mißbildungen der lebenden Föten waren angeborenes Fehlen der Ohren (Anotie, EA = 12%), Körperschäden (TD = 22%) und Exenzephalie (EX = 17%). Wirbelspalt trat hingegen nur selten auf (SB = 2%) und Mikrognathie (MG) konnte nicht beobachtet werden. Das fötale Gewicht lag bei 1,18 ± 0,13 g.

Die zusätzliche Gabe von Phytansäure führte nur zu einer unwesentlichen Reduzierung der Resorption auf 35%. Als Mißbildungen der lebenden Föten traten angeborenes Fehlen der Ohren (Anotie, EA = 23%) als auch Exenzephalie (EX = 20%) auf. Die Exenzephalierate lag nur geringfügig höher und die Rate der Körperschäden (TD = 20%) mit 20% nur unwesentlich unter dem Versuchsergebnis, ohne die zusätzliche Gabe von Phytansäure. Wirbelspalt und Mikrognathie traten nur in einem einzigen Fall auf. Das fötale Gewicht lag bei 1,17 ± 0,13 g.

Die zusätzliche Gabe von Phytol führte jedoch zu einer merklichen Reduzierung der Resorption auf 31% (P<0,05). Die Mißbildungsrate konnte drastisch reduziert werden. Das angeborene Fehlen der Ohren trat nur noch mit 4% (EA = 4%) und Exenzephalie mit 14% (EX = 14%) auf. Wirbelspalt und Mikrognathie konnten in keinem einzigen Fall nachgewiesen werden. Das fötale Gewicht lag bei 1,18 ± 0,12 g.

Teratogene Wirkungen des Retinols alleine oder in Verbindung mit Phytansäure oder Phytol.

Die orale Verabreichung (50 mg/kg am GD 8,25) von Retinol führte zu einer hohen Resorptionsrate von 39% (s. Fig. 2). Sichtbare Mißbildungen bei den lebenden Föten waren vor allem das angeborene Fehlen der Ohren (EA = 21%) und Exenzephalie (EX = 28%). Körperschäden traten nur zu einem Prozent auf (TD = 1%) und nur in einem einzigen Fall. Wirbelspalt und Mikrognathie konnten nicht beobachtet werden. Das Gewicht der Föten lag bei 1,23 ± 0,14 g.

Die gleichzeitige Gabe von Phytansäure mit Retinol führte zu einer drastischen Abnahme der Resorption auf nur noch 18% (P<0,001). Zudem konnten keinerlei äußere Mißbildungen an den Föten festgestellt werden. Das Gewicht der Föten betrug 1,23 ± 0,10 g.

Die gemeinsame Verabreichung von Phytol und Retinol führte zu einer unerwartet hohen Reduzierung der Resorption auf nur noch 5% (P<0,001). Keinerlei äußere Mißbildungen konnten an den Föten nachgewiesen werden. Das Fötengewicht lag bei 1,29 ± 0,13 g und damit merklich höher (P<0,01) als in dem Fall der alleinigen Verabreichung von Retinol.

Endogene Retinoide im Plasma der Maus

Retinol (180,1 ± 26,4 ng/ml) Retinylpalmitate / Retinyloleat (116,4 ± 41,4 ng/ml) und Retinylstearat (52,1 ± 24,6 ng/ml) wurden im Plasma der unbehandelten, nicht trächtigen Mäuse (n = 5) nachgewiesen. Zusätzlich konnte in zwei Plasmaproben Retinyllinoleat (16,8 ± 4,1 ng/ml) gefunden werden.

Plasma-Pharmakokinetik der all-trans-Retinsäure und deren Metaboliten in nicht trächtigen Mäusen nach der Verabreichung von Retinsäure alleine oder zusammen mit Phytansäure oder Phytol (s. Tabelle 2).

Fig. 3 zeigt das charakteristische Chromatogramm einer Plasmaprobe, welche eine Stunde nach der Gabe von Retinsäure entnommen wurde. All-trans-Retinsäure (7), 9-cis-Retinsäure (6) und 13-cis-Retinsäure (5) wurden durch Co-Elution mit authentischen Retinoiden identifiziert. Zusätzlich wurden die Metaboliten der Phase I, all-trans-4-Hydroxyretinsäure (2) und all-trans-4-Oxoretinsäure (1) als auch die Metaboliten der Phase II, 13-cis-Retinoyl-β-D-glucuronid (3) und all-trans- Retinoyl-β-D-glucuronid (4) bestimmt. Die Bestimmung der Glucuronide wurde durch Behandlung der entsprechenden Eluate mit β-Glucuronidase und anschließender Bestimmung der Retinsäureisomere bestätigt. Das Auftreten von all-trans-4- Hydroxyretinsäure (2) wurde zusätzlich durch LC-MS-MS (Daten nicht angegeben) bestimmt.

Die Plasmakinetik von all-trans-Retinsäure nach der alleinigen Gabe von Retinsäure oder der gleichzeitigen Verabreichung mit Phytansäure oder Phytol ist in Fig. 4 dargestellt. Nach der Behandlung mit Retinsäure alleine wurde gefunden, daß der Plasmaspielgel der all-trans-Retinsäure innerhalb einer Stunde auf 5020 ± 3644 ng/ml ansteigt und innerhalb von 4 Stunden auf ½ C_max abfällt.

Die gleichzeitige Gabe von Phytansäure und Retinsäure führte zur Herabsetzung des C_max-Wertes der all-trans-Retinsäure auf 4297 ± 1513 ng/ml (s. Tabelle 2), obwohl der Unterschied nicht signifikant war. Trotzdem war die Eliminierung von all-trans- Retinsäure im Vergleich mit der alleinigen Verabreichung von Retinsäure schneller. Ein ähnliches kinetisches Verhalten der all-trans-Retinsäure konnte bei der gleichzeitigen Verabreichung von Retinsäure mit Phytol beobachtet werden. Der C_max-Wert lag etwas niedriger bei 3333 ± 1019 ng/ml.

In Tabelle 2 werden C_max-Werte als auch AUC_0-4h-Werte ausgewählter Retinoidmetaboliten miteinander verglichen. Obwohl die C_max- als auch die AUC_0-4h-Werte durch die gemeinsame Verabreichung von Retinsäure zusammen mit Phytansäure oder Phytol gesenkt wurden, konnte ein signifikanter Unterschied nur bei all-trans-4-Oxoretinsäure beobachtet werden.

Plasma-Pharmakokinetik von Retinol und seinen Metaboliten in nicht trächtigen Mäusen nach der Verabreichung von Retinol alleine oder zusammen mit Phytansäure oder Phytol (s. Tabelle 3 und Fig. 5).

Nach der Gabe von Retinol konnten als Retinoidmetaboliten im Plasma hauptsächlich Retinol selbst als auch Retinylester wie Retinylpalmitat/Retinyloleat (nicht trennbar durch HPLC- Verfahren), Retinylstearat und Retinyllinoleat nachgewiesen werden. Ein oxidativer Metabolismus des Retinols konnte durch das Auftreten von Retinsäureisomeren (all-trans-Retinsäure, 13- cis-Retinsäure und 9-cis-Retinsäure) belegt werden. Desweiteren führte der Metabolismus zur Bildung von all-trans-4- Oxoretinsäure und all-trans-Retinoyl-β-D-glucuronid. Zusätzlich konnten auch retro-Retinoide wie Anhydroretinol und das 14- Hydroxy-4,14-retro-retinol nachgewiesen werden (Daten nicht angegeben). Die Plasmakinetik von Retinol ist in Fig. 5A abgebildet. Nach der alleinigen Gabe von Retinol stieg der Retinolspiegel im Plasma innerhalb von 2 Stunden auf das Zehnfache (C_max = 2045 ± 609 ng/ml) an und fiel danach langsam innerhalb von 12 Stunden auf den 1,Sfachen Wert der oben angegebenen endogenen Konzentration. Die Kinetiken des Retinols sind vergleichbar mit denen, wo Retinol zusammen mit Phytansäure verabreicht wurde, obwohl die Maximalkonzentration geringfügig niedriger lag (C_max 1648 ± 177 ng/ml). Die gleichzeitige Gabe von Phytol und Retinol führte jedoch zu einer unerwarteten Beeinflussung der Kinetik des Retinols. Die Retinolkonzentration stieg innerhalb von 2 Stunden auf das 2,5fache an, verblieb für weitere 8 Stunden bei diesem Wert und stieg anschließend innerhalb von 12 Stunden langsam auf den C_max-Wert (C_max = 519 ± 167 ng/ml) an. Desweiteren zeigt Fig. 5B und Tabelle 3, daß der oxidative Metabolismus von Retinol zu all-trans-Retinsäure offensichtlich durch die gleichzeitige Verabreichung von Phytansäure oder Phytol inhibiert wird. Die zusätzliche Gabe von Phytansäure reduziert den Plasma-AUC von all-trans-Retinsäure um ein Drittel, während die gleichzeitige Verabreichung von Phytol fast vollständig die Bildung von all trans-Retinsäure blockiert. Bei dieser Versuchsreihe konnte nur nach 2 Stunden in einem einzigen Fall ein sehr geringer Plasmaspiegel an all-trans-Retinsäure nachgewiesen werden. Zusätzlich konnten bei diesen Versuchen weder all-trans-4- Oxoretinsäure noch all-trans-Retinoyl-β-D-glucuronid nachgewiesen werden. Die Konzentrationen an Retinylpalmitat/Re tinyloleat wurden ebenfalls herabgesetzt, jedoch nur merklich bei der gleichzeitigen Gabe von Retinol und Phytol.

Ergebnisse

Synergistische Potentiale von synthetischen Retinoid-X- Rezeptorliganden bei Retinsäurerezeptor-vermittelten Wirkungen konnten im Genassay, im Zelisystem und in Bezug auf die Teratogenität im Zebrafisch, im Xenopus und in Embryos von Mäusen und Ratten nachgewiesen werden (vgl. M. M. Elmazar, R. Ruhl, U. Reichert, B. Shroot, H. Nau (1997). RARalpha-mediated teratogenicity in mice is potentiated by an RXR agonist and reduced by an RAR antagonist: dissection of retinoid receptor induced pathways. Toxlcol. Appl. Pharmacol. 146: 21-28). In P19 embryokarzinomen Zellen konnte die synergistische Wirkungsweise eines RXR-Liganden bei der Transskription eines RARß-Gens nur bei der Verwendung von suboptimalen Konzentrationen eines RAR-Ligenden beobachtet werden. Weder selektive Liganden für RARα, RARβ oder RARγ noch solche für RXR waren in der Lage, die Expression der Zielgene in P19 oder P9 embryokarzinomen Zellen zu beeinflussen, wenn sie alleine und in geringen Konzentrationen verabreicht wurden (vgl. B. Roy, R. Taneja, P. Chambon (1995). Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Mol. Cell Biol. 15: 6481-6487). Andererseits konnte die gleichzeitige Gabe von RAR- und RXR-Liganden die Expression der Zielgene als auch die Zelldifferenzierung beeinflussen.

Synergistische Wirkungen des natürlichen RXR-Liganden

Phytansäure oder deren Vorgänger Phytol auf Effekte, welche durch den natürlichen RAR-Liganden all-trans-Retinsäure oder deren Vorläufer Retinol vermittelt werden, sind bisher nicht beschrieben.

Neuere Studien zeigen, daß all-trans-Retinsäure-vermittelte als auch Retinol-induzierte Teratogenität bei Mäusen durch die zusätzliche Gabe des synthetischen RXR-Liganden LG1069 vervielfacht wird. Zudem belegen neuere Studien, daß embryotoxische Wirkungen des synthetischen RARα-Liganden Am580 durch die zusätzliche Verabreichung von Phytansäure oder deren Vorgänger Phytol vervielfacht werden.

Ferner zeigen die neuen Studien, daß die Embryotoxizität oder die Teratogenität des natürlichen RAR-Liganden all-trans- Retinsäure nicht durch den natürlichen RXR-Liganden Phytansäure oder deren Vorgänger Phytol gesteigert wird. Überraschend konnte jedoch festgestellt werden, daß die gleichzeitige Gabe von Retinol, dem Vorläufer der all-trans-Retinsäure, zusammen mit Phytansäure oder Phytol zu einer drastischen Reduzierung der Retinol-induzierten teratogenen Wirkungen führt.

Untersuchungen der Pharmakokinetik und des Metabolismus offenbaren, daß Phytansäure oder Phytol auch einen Einfluß auf die Kinetik der all-trans-Retinsäure haben könnten. Desweiteren ergeben die Untersuchungen, daß der oxidative Metabolismus der verabreichten all-trans-Retinsäure zu all-trans-4-Oxoretinsäure durch die gleichzeitige Gabe von Phytansäure oder Phytol gestört wird.

Eine Erklärung für diese unerwarteten Teratologieergebnisse könnte sein, daß die Reduzierung des all-trans- Retinsäurespiegels eine Kompensation der synergistischen Effekte der zusätzlich verabreichten Phytansäure oder des Phytols zur Folge hat. Andererseits könnte vermutet werden, daß Phytansäure auch ein Ligand für den Peroxisom-Proliferator aktivierten Rezeptor α (PPARa) darstellt. Man könnte vermuten, daß Phytansäure bei der Anwesenheit von selektiven, synthetischen RAR-Liganden als RXR-Ligand wirkt, aber bei der Anwesenheit des nicht selektiven, natürlichen RAR-Liganden all trans-Retinsäure als PPARα-Ligand agiert. Ferner konnte nachgewiesen werden, daß 9-cis-Retinsäure ein Metabolit der all-trans-Retinsäure im Plasma von Mäusen ist. Zudem konnte bei den Versuchen festgestellt werden, daß 9-cis-Retinsäure die RXR-Homodimerisierung im Verhältnis zur RAR-RXR- Heterodimerisierung begünstigt. Daraus kann gefolgert werden, daß die Anwesenheit des RXR-Liganden 9-cis-Retinsäure zu einer hochgradig kompetitiven Situation führt, welche synergistische Effekte unmöglich macht.

Das überraschendste Ergebnis war jedoch die Beobachtung, daß die zusätzliche Verabreichung von Phytansäure oder Phytol weitgehend den Retinol-induzierten teratogenen Effekt unterbunden hat oder teilweise gänzlich verhinderte.

Die Pharmakokinetik des Retinols ist in Fig. 5A dargestellt. Die Pharmakokinetik des Retinols als auch der Retinylester zeigen eindeutig veringerte C_max- und AUC-Werte des Retinols bei der gleichzeitigen Gabe von Phytol.

Baxter et al. konnte belegen, daß Phytol über die lymphatische Route absorbiert wird (vgl. J. H. Baxter, D. Steinberg, C. E. Mize, J. Avigan (1967). Absorption and metabolism of uniformly 14C-labeled phytol and phytanic acid by the intestine of the rat studied with thoracic duct cannulation. Biochim. Biophys. Acta 137: 277-290). Daher erscheint eine Wechselwirkung bei der Absorption und ein weiterer Transport der Retinoide in Chylomikronen wahrscheinlich. Fig. 5B belegt, daß die zusätzliche Gabe von Phytansäure oder Phytol abermals den oxidativen Metabolismus von Retinol zum aktivierten Liganden all-trans-Retinsäure herabsetzt. Bei der gemeinsamen Verabreichung von Retinol und Phytol war die Bildung von all trans-Retinsäure nahezu nicht nachweisbar. Somit scheinen die metabolischen Wechselwirkungen für die Reduzierung der Teratogenität des Retinols verantwortlich zu sein.

In vitro Studien des Metabolismus des Phytols zeigen, daß die biologische Umwandlung von Phytansäure in den mitochondrialen und mikrosomalen Bereichen der Rattenleber über das Intermediat der Phytensäure verläuft.

Cytosolische Bereiche weisen hingegen keine Aktivität auf. Desweiteren wurde herausgefunden, daß mikrosomale Enzyme der Familie der kurzkettigen Alkoholdehydrogenasen (SCAD: short chain alcohol dehydrogenase) als Retinol-Dehydrogenasen in der Leber der Ratten fungieren (vgl. K. C. Posch, M. H. Boerman, R. D. Burns, J. L. Napoli (1991). Holocellular retinol binding protein as a substrate for microsomal retinal synthesis. Biochemistry 30: 6224-6230).

Es ist noch nicht bekannt, ob Phytol und Retinol von denselben Enzymen metabolisiert werden oder ob es sich um verschiedene Alkohol-Dehydrogenasen handelt. Soweit bisher bekannt ist, wird die zweistufige Oxidation des Retinols über das Retinal zur all-trans-Retinsäure sowie die Hydroxylierung in Position 4 bei der all-trans-Rerinsäure durch Isoformen des P450 Enzymes vermittelt (vgl. A. B. Roberts, L. C. Lamb, M. B. Sporn (1980). Metabolism of all-trans-retinoic acid in hamster liver microsomes: oxidation of 4-hydroxy- to 4-keto-retinoic acid. Arch. Biochem. Biophys. 199: 374-383). Der Abbau der Phytansäure durch α-Oxidation scheint sich hauptsächlich in den Peroxisomen abzuspielen (vgl. G. A. Jansen, S. J. Mihalik, P. A. Watkins, H. W. Moser, C. Jakobs, S. Denis, R. J. Wanders (1996). Phytanoyl-CoA hydroxylase is present in human liver, located in peroxisomes, and deficient in Zellweger syndrome: direct, unequivocal evidence for the new, revised pathway of phytanic acid alpha-oxidation in humans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 205-210).

Figurenbeschreibung

Fig. 1 Teratogene Wirkungen bei Mäusen nach oraler Verabreichung von RA (20 mg/kg) alleine oder zusammen mit PA (100 mg/kg) oder POH (500 mg/kg) am GD 8.25. (RS = Resorption, 5B = Wirbelspalt (spina bifida), MG = Mikrognathie, EA = Fehlen der Ohren, TD = Körperschäden, EX = Exenzephalie).

Fig. 2 Teratogene Wirkungen bei Mäusen nach oraler Verabreichung von ROH (50 mg/kg) alleine oder zusammen mit PA (100 mg/kg) oder POH (500 mg/kg) am GD 8.25. (RS = Resorption, 5B = Wirbelspalt (spina bifida), MG = Mikrognathie, EA = Fehlen der Ohren, TD = Körperschäden, EX = Exenzephalie).

Fig. 3 HPLC Chromatogramm von einer Plasmaprobe der Maus nach 1 Stunde nach Verabreichung von RA. Peak 1: all-trans-4-oxo-RA, Peak 2: all-trans-4-hydroxy-RA, Peak 3: 13-cis-RAG, Peak 4: all-trans- RAG, Peak 5: 13-cis-RA, Peak 6: 9-cis-RA, Peak 7: all-trans-RA.

Fig. 4 Plasmakinetik von all-trans-RA in nicht trächtigen Mäusen nach oraler Gabe von RA (20 mg/kg) alleine oder zusammen mit PA (100 mg/kg) oder POH (500 mg/kg).

Fig. 5 Plasmakinetik von Retinol (A) sowie der gebildeten all-trans-RA (B) in nicht trächtigen Mäusen nach oraler Gabe von ROH (50 mg/kg) alleine oder zusammen mit PA (100 mg/kg) oder POH (500 mg/kg).

Abkürzungen

AUC: Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve
C_max

: Maximum-Konzentration
PA: Phytansäure
POH: Phytol
RA: Retinsäure
RAG: Retinoyl-β-D-glukuronide
RAR: Retinsäure-Rezeptor
ROH: Retinol
RXR: Retinoid-X-Rezeptor
SCAD: Kurzketten-Alkohol-Dehydrogenase

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem Gehalt an Retinol (Vitamin A) oder einem Abkömmling des Retinols zusammen mit pharmakologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Phytol oder einem Abkömmling des Phytols.

2. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abkömmlinge des Retinols (Vitamin A), Retinal, 3-Dehydroretinol, Retinylpalmitat, Retinyloleat oder retro- Retinolderivate sind.

3. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Abkömmlinge des Phytols Phytansäure, Isophytol oder Phytolaldehyd sind.

4. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Retinol. Phytol in einem Gewichtsverhältnis von 100 : 1 bis 1 : 1 vorliegen.

5. Verwendung von Phytol bzw. einem Abkömmling des Phytols, wie Phytansäure, Isophytol und Phytolaldehyd zur Reduzierung oder Beseitigung der teratogenen Wirkung von Retinol und dessen Abkömmlingen.