KR20070074461A - 면역반응 측정용 담체, 면역반응 측정용 장치 및 면역반응측정방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은, 균일하고 또한 고밀도로 항체를 포착하여, 측정물을 고감도로 검출 가능하고, 저비용으로 효율적으로 조제 가능한 면역반응 측정용 담체, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 구비한 면역반응 측정장치, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 사용한 면역반응 측정방법을 제공하는 것에 있다.
즉 본 발명은, 면역원성을 갖지 않는 피검물질 X, 면역원성을 갖는 고분자물질 Z, 상기 피검물질 X 및 상기 고분자물질 Z를 결합하는 링커 Y로 되는 X-Y-Z로 표시되는 복합체를 사용하여 제작된 상기 피검물질 X에 대한 항체 X´를 포착하기 위해 사용되고, 상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조, 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 분자 중에 갖는 것을 특징으로 하는 면역반응 측정용 담체에 관한 것이다. 또한, 상기 면역반응 측정용 담체를 구비한 면역반응 측정장치, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 사용한 면역반응 측정방법에 관한 것이다.
면역반응 측정용 담체, 면역반응 측정용 장치, 면역반응 측정방법, 면역원성
Description
도 1a는 실시예 1에 있어서, 코튼(면)으로 되는 면역반응 측정용 담체(immune reation measurement carrier)를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1b는 실시예 1에 있어서, 셀룰로오스(cellulose)로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1c는 실시예 1에 있어서, 셀룰로오스로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1d는 실시예 1에 있어서, 셀룰로오스로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1e는 실시예 1에 있어서, 셀룰로오스로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1f는 실시예 1에 있어서, 셀룰로오스로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2a는 실시예 1에 있어서, 폴리올레핀으로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2b는 실시예 1에 있어서, 폴리올레핀으로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2c는 실시예 1에 있어서, 폴리에스테르로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2d는 실시예 1에 있어서, 폴리에스테르로 되는 면역반응 측정용 담체를 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 실시예에 있어서 작성한 PCB(카네크롤 300)의 검량선(檢量線)과, 각 농도에 있어서의 면역반응 측정용 담체의 사진을 나타내는 그래프이다.
본 발명은, 항체량의 측정에 사용되는 면역반응 측정용 담체, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 구비한 면역반응 측정용 장치, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 사용한 면역반응 측정방법에 관한 것이다.
PCB(폴리염화비페닐)는, 안정성이나 절연성(絶緣性)이 높기 때문에, 변압기 및 콘덴서 등의 전기 절연재, 및 열매체(熱媒體) 등으로서 널리 사용되어 왔지만, 인체나 환경으로의 유해성이 확인됨으로써 제조나 사용이 금지되었다. PCB는, 난분해성으로 환경 중에 잔류하여, 식물 연쇄(食物連鎖)를 통하여 생물에 축적되고, 인간의 건강이나 생태계에 영향을 미치는 성질을 갖는 잔류성 유기 오염물질의 대표적인 화학물질로서 규제되고 있으며, PCB를 포함하는 폐기물은, 적정하게 처리될 때까지, 생활환경의 보전상 지장이 없도록 보관하는 것이 의무화되어 있다.
그러나, 적정처리가 행하여지지 않고 보관되어 있던 PCB 폐기물은, 보관의 장기화에 의해, 분실(紛失)이나 누설(漏洩)의 발생이 문제시되어, 2001년에 「폴리염화비페닐 폐기물의 적정한 처리의 추진에 관한 특별조치법」(PCB 특조법)이 시행되었다. 이 PCB 특조법에 의해, 15년 이내에 모든 PCB 폐기물의 적정처리가 의무화되었다.
예를 들면, 절연유(絶緣由)의 경우, 보관되어 있는 절연유 이외에도, 과거에 있어서 PCB를 절연유로서 사용해 온 변압기에 있어서 치환된 대체 절연유도, 상기 변압기 내에 미량으로 잔류한 PCB에 오염되어 있는 것이 알려져 있고, 이와 같은 변압기 중 대체 절연유도 포함하여, 무수한 전기기기에 사용되고 있는 절연유를 검사하여, 신속하게 처리의 필요성의 유무를 명확하게 할 필요가 있다. 또한, 처리를 행한 PCB 폐기물에 대하여, 처리 후의 PCB 잔류농도, 환경 중의 PCB 농도를 검사하는 것도 매우 중요하다.
종래, PCB 등의 환경오염물질의 분석방법으로서는, 예를 들면, 공정법(公定法)으로서, 고분해능 가스 크로마토그래프-고분해능 질량 분석(HRGC-HRMS)이나, 전자 포획형 검출기 부착 가스 크로마토그래프법(GC-ECD법)이 사용되고 있다(「절연유 중의 폴리염화비페닐(PCB)의 분석방법 규정」(전기기술기준 조사위원회 편집, 사단법인 일본전기협회 발행, 1991년 9월 30일 발행) 참조). 이들의 방법은 분해능이 높고, 또한 정량 하한(下限)도 낮지만, 분석에 필요로 하는 시간이 길고, 분석의 방해가 되는 협잡(夾雜)성분을 제거하는 시료의 조작이 번잡하며, 비용 부담이 크다고 하는 문제가 있다. 이 때문에, 간편하고 신속한 분석방법으로, 측정 현장에서 간편, 용이하게 측정 가능한 방법이 요구되어 왔다.
이에 대하여, 간편하고 신속한 분석방법으로서, 항원항체반응을 이용한 면역학적 측정법(이뮤노어세이(immunoassay))이 제안되어 있다. 이뮤노어세이 중, 가장 일반적인 측정방법은, 효소 면역측정법(ELISA)이다. 상기 ELISA법으로서는, 라디오이뮤노어세이(radioimmunoassay)(RIA), 형광 이뮤노어세이(FIA), 엔자임 이뮤노어세이(enzyme immunoassay)(EIA, ELISA) 등이 알려져 있다.
그러나, 상기 ELISA법에서는, 피검물질의 검출에 특수한 기기를 필요로 하거나, 시료의 전처리나 측정에 장시간을 필요로 하는 등의 문제점이 있다. 이 때문에, 조작이 간단한 이뮤노크로마토법(immunochromato method)이 제안되고 있다.
그러나, 상기 ELISA법, 및 이뮤노크로마토법에 있어서는, 검출에 근본적인 문제가 있다. 양쪽 방법에 있어서, 가장 고감도의 검출감도를 얻기 위해서는, 피검물질을 담체상에서 2분자의 항체로 끼워 넣는, 이른바 일반적으로 알려진 샌드위치법을 사용하지만, 피검물질이, 상기 PCB류와 같이 저분자 화합물인 경우는, 샌드위치법이 성립되지 않는다. 이는, 피검물질인 항원이 저분자이기 때문에, 생체 고분자인 항체가 피검물질에 결합하면, 항체의 결합부위에 피검물질이 묻혀져 버려, 다른 항체가 결합할 수 없게 되기 때문이다.
이 때문에, 통상 ELISA법, 및 이뮤노크로마토법을 대표로 하는 이뮤노어세이의 대부분의 경우가, 샌드위치법이 아니라, 경합법(競合法)을 채용하고 있다.
경합법은, 상기 피검물질을 검출할 때에, 피검물질인 상기 저분자 화합물과, 상기 저분자 화합물 또는 상기 저분자 화합물에 대한 유사 화합물을, 항체에 대한 결합에 있어서 경합시키는 방법이다. 그러나, 이 경합법은, 항체에 대하여 시료 중의 피검물질과 피검물질의 유사 화합물이 경합적으로 결합하는 결과, 본래의 항체가 갖는 결합능력까지의 검출감도를 얻기 어렵다고 하는 원리적인 단점이 있다.
상기 ELISA법 이외의 방법으로서는, 플로우 쓰루(flow-through) 면역측정법이 알려져 있다.
상기 플로우 쓰루 면역측정법으로서는, 예를 들면, 피검물질을 포함하는 시료 중에, 상기 피검물질에 대한 항체를 반응시키고, 상기 시료 중에 있어서 상기 피검물질을 결합하고 있지 않은 프리(free)의 상기 항체를 검출함으로써, 상기 시료 중의 피검물질의 검출을 행하는 방법이 제안되어 있다(예를 들면, 일본국 특허공개 제2004-138550호 공보 참조). 또한, 피측정물을 포착하기 위한 포착 시약(예를 들면, 피측정물이 항체인 경우, 상기 항체가 특이적으로 인식하는 항원 또는 의사(擬似) 항원이고, 피측정물이 항원인 경우, 상기 항원을 특이적으로 인식하는 항체)을 고정화한 담체 상에, 상기 피측정물을 포함하는 시료를 공급하고, 상기 시료가 상기 담체를 통과할 때에, 상기 포착 시약에 포착된 상기 피측정물을 임의의 방법으로 검출하는 방법이 제안되어 있다(예를 들면, 일본국 특허공개 제2005-214670호 공보 참조).
그러나, 상기 플로우 쓰루 면역측정법에 있어서도, 상기 ELISA법과 동일하게, 시료액 중의 피측정물 또는 포착 시약의 사이에 경합적인 결합이 일어나기 때문에, 본래 항체가 갖는 결합능력까지의 검출감도는 얻어지지 않고 있다.
상기 플로우 쓰루 면역측정법에서는, 상기 담체와 상기 시료의 접촉시간을 매우 짧게 함으로써, 상기 담체 상에 고정한 피측정물 또는 포착 시약(예를 들면, 피측정물이 항체인 경우, 상기 항체가 특이적으로 인식하는 항원 또는 의사 항원이고, 피측정물이 항원인 경우, 상기 항원을 특이적으로 인식하는 항체)과, 상기 시료액 중의 피측정물 또는 포착 시약 사이에 경합적인 결합이 일어나기 어려워지고, 그 결과 양호한 검출감도가 얻어진다고 생각된다.
상기의 방법에 있어서는, 담체와 시료는 순간적으로밖에 접촉하지 않기 때문에, 검출의 감도나 정량성(定量性)을 확보하기 위해서는, 한정된 시간에 많은 피측정물 또는 포착 시약을 포착 가능한 담체가 필요해진다. 이 때문에, 고밀도로 상기 피측정물 또는 포착 시약을 고정화한 상기 담체가 요구된다. 균일하고 또한 고밀도로 효율적으로 상기 피측정물 도는 포착 시약이 고정화되고, 피측정물을 고감도로 검출 가능하며, 저비용으로 효율적으로 조제 가능한 면역반응 측정용 담체가 필요해지지만, 이와 같은 담체는 그 중요성이 인식되고 있지 않기 때문에, 아직 개발되고 있지 않아, 현존하고 있지 않은 것이 실정이다.
한편, 담체에 대하여, 피측정물 또는 포착 시약의 고정방법의 개량이 제안되어 있지만, 근본적으로는 고정방법의 개량에는 한계가 있고, 고정이라고 하는 조작이 행하여지는 한 고정하는 피측정물 또는 포착 시약의 비용이나 고정 자체의 비용이나 시간이 걸린다고 하는 문제가 있다. 이는 이뮤노어세이 공통의 문제이다.
본 발명은 종래에 있어서의 상기 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은, 균일하고 또한 고밀도로 항체를 포착하고, 피측정물을 고감도로 검출 가능하며, 저비용으로 효율적으로 조제 가능한 면역반응 측정용 담체, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 구비한 면역반응 측정용 장치, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 사용한 면역반응 측정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자 등이 예의 검토를 거듭한 결과, 저분자량 물질에 대한 항체로서, 상기 저분자량 물질, 링커와, 면역원성을 갖는 고분자량 물질로 되는 항체 조제용 화합물을 사용하여 제작된 항체는, 담체에 의사 항원을 고정하는 처리를 행하지 않는 경우일지라도, 상기 링커 일부의 구조, 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 분자 중에 갖는 담체에는 포착되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 본 발명자에 의한 상기 사실을 토대로 한 것으로서, 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서는, 이하와 같다. 즉,
<1> 피검물질 X, 면역원성을 갖는 고분자물질 Z와, 상기 피검물질 X 및 상기 고분자물질 Z를 결합하는 링커 Y로 되는 X-Y-Z로 표시되는 복합체를 사용하여 제작된 상기 피검물질 X에 대한 항체 X´를 포착하기 위해 사용되고,
상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조, 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 분자 중에 갖는 것을 특징으로 하는 면역반응 측정용 담체이다.
<2> <1>에 있어서, 피검물질 X에 대한 항체 X´가, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 이들의 혼합물 중 어느 하나인 면역반응 측정용 담체이다.
<3> <1> 내지 <2> 중 어느 하나에 있어서, 링커 Y가, 하기 구조식 Ⅰ 및 Ⅱ 중 어느 하나로 표시되는 구조를 갖는 면역반응 측정용 담체이다.
[구조식 1]
[구조식 Ⅱ]
단, 상기 구조식 Ⅰ 및 Ⅱ 중, n은 1~20의 정수를 나타낸다.
<4> <3>에 있어서, 셀룰로오스, 부식산(humic acid), 니트로셀룰로오스, 리그닌 설폰산(lignin sulphonic acid), 알킬벤젠, 알킬페놀, 및 이들 유도체 중 적어도 어느 하나로 되는 면역반응 측정용 담체이다.
<5> <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 있어서, 섬유체로 되는 면역반응 측정용 담체이다.
<6> <1> 내지 <5> 중 어느 하나에 있어서, n종(단, n은 2 이상의 자연수)의 피검물질 X1~Xn, 면역원성을 갖는 고분자물질 Z, 상기 피검물질 X 및 상기 고분자물질 Z를 결합하는 링커 Y로 되는 n종의 복합체를 사용하여 제작된 상기 피검물질 X1~Xn에 대한 n종의 항체를 포착하는 면역반응 측정용 담체이다.
<7> <1> 내지 <6> 중 어느 하나의 면역반응 측정용 담체를 구비하는 것을 특징으로 하는 면역반응 측정용 장치이다.
<8> <7>에 있어서, 면역반응 측정용 담체를 수용하고, 빛이 통과 가능한 관통구멍(貫通孔)이 형성되어 되는 측정용 셀과,
상기 측정용 셀에 수용된 상기 면역반응 측정용 담체에 빛을 조사하는 발광부(發光部)와,
상기 발광부로부터 상기 면역반응 측정용 담체에 조사된 빛 중, 상기 측정용 셀에 수용된 상기 면역반응 측정용 담체를 투과하는 투과광(透過光)을 수광(受光)하여, 수광된 상기 투과광의 광량(光量)을 측정하는 수광부,
를 구비한 투과 광량 측정장치를 구비하는 면역반응 측정용 장치이다.
<9> <8>에 있어서, 투과 광량 측정수단이, 발광부와 수광부 사이에 설치되어 조사광의 조사방향으로 관통됨과 동시에, 내면이 면역반응 측정용 담체에 의해 반사된 빛을 반사하도록 구성되어 있는 반사통(反射筒)을 구비하는 면역반응 측정용 장치이다.
<10> <8> 내지 <9> 중 어느 하나에 있어서, 수광부에서 측정된 투과광의 광량에 대해서, 기준이 되는 광량으로부터 상대 흡광도를 계산하는 상대 흡광도 계산부를 구비하는 면역반응 측정용 장치이다.
<11> 피검물질 X에 대한 항체 X´를 첨가한 피검시료를, <1> 내지 <6> 중 어느 하나의 면역반응 측정용 담체에 공급하여,
상기 피검시료 중에 있어서 상기 피검물질 X와 결합되어 있지 않은 상기 항체 X´를, 상기 면역반응 측정용 담체 상에 포착하고,
상기 항체 X´의 포착량을 측정하여, 상기 포착량으로부터 상기 피검시료 중 의 상기 피검물질 X의 농도를 구하는 것을 특징으로 하는 면역반응 측정방법이다.
<12> <11>에 있어서, 피검물질 X를 포함하는 피검시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 항체 포착량과, 피검물질 X를 포함하지 않는 기준시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 항체 포착량으로부터 상대 항체 포착량을 계산하여, 상기 상대 항체 포착량으로부터 상기 피검시료 중의 상기 피검물질 X의 농도를 구하는 면역반응 측정방법이다.
<13> 피검물질 X에 대한 항체 X´가 표지물질을 갖고, 상기 표지물질에 유래하는 발색(發色)을 측정하는 <11> 내지 <12> 중 어느 하나의 면역반응 측정방법이다. 여기에서 「발색을 측정하는」이란, 상기 표지물질이 발하는 색을 검출하는 것을 포함하고, 상기 표지물질의 변색이나 정색(呈色) 등의 색채의 변화를 검출하는 태양도 포함하는 것으로 한다.
<14> <11> 내지 <13> 중 어느 하나에 있어서, 면역반응 측정용 담체 상에 포착된 항체 X´를, 표지물질을 갖는 2차 항체와 반응시키는 면역반응 측정방법이다.
<15> <11> 내지 <14> 중 어느 하나에 있어서, 면역반응 측정용 담체에 있어서의 항체의 포착량이, 광학적으로 검지(檢知) 가능한 면역반응 측정방법이다.
<16> <11> 내지 <15> 중 어느 하나에 있어서, 표지물질이 효소, 방사성 동위원소, 형광물질, 및 착색 미립자 중 어느 하나인 면역반응 측정방법이다.
<17> <12> 내지 <16> 중 어느 하나에 있어서, 표지물질이 금 콜로이드인 면역반응 측정방법이다.
<18> <11> 내지 <17> 중 어느 하나에 있어서, 피검물질이 PCB, 다이옥신, 호 르몬, 비타민류, 농약, 및 중금속 중 어느 하나인 면역반응 측정방법이다.
<19> <11> 내지 <18> 중 어느 하나에 있어서, <7> 내지 <10> 중 어느 하나의 면역반응 측정장치를 사용하는 면역반응 측정방법이다.
<20> <19>에 있어서, 측정용 셀에 수용된 면역반응 측정용 담체에 빛을 조사하고, 조사된 빛 중, 상기 측정용 셀에 수용된 상기 면역반응 측정용 담체를 투과한 투과광을 수광하여, 수광 광량을 측정하는 면역반응 측정방법이다.
<21> <19> 내지 <20> 중 어느 하나에 있어서, 면역반응 측정용 담체에 단색광(monochromatic light)을 조사하여, 피검물질 X를 포함하는 피검시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 투과광과, 피검물질 X를 포함하지 않는 기준시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 투과광으로부터 상대 흡광도를 계산하는 면역반응 측정방법이다.
본 발명에 의하면, 균일하고 또한 고밀도로 항체를 포착하여, 피측정물을 고감도로 검출 가능하고, 저비용으로 효율적으로 조제 가능한 면역반응 측정용 담체, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 구비한 면역반응 측정용 장치, 및 상기 면역반응 측정용 담체를 사용한 면역반응 측정방법을 제공할 수 있다.
(면역반응 측정용 담체)
본 발명의 면역반응 측정용 담체는, 피검물질 X, 면역원성을 갖는 고분자물질 Z, 상기 피검물질 X 및 상기 고분자물질 Z를 결합하는 링커 Y로 되는 X-Y-Z로 표시되는 복합체(이하, 「항체 조제용 화합물」이라고 하는 경우가 있다)를 사용하여 제작된 상기 피검물질 X에 대한 항체 X´를 포착하기 위해 사용되고, 상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조, 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 분자 중에 갖는다.
<항체 조제용 화합물>
상기 항체 조제용 화합물은, 상기 피검물질 X에 대한 항체 X´를 제작하기 위해 사용되는 복합체로서, 상기 항체 조제용 화합물에 의해 제작되는 항체 X´는, 상기 피검물질 X에 대한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 및 이들의 혼합물 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 피검물질 X로서는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 환경오염물질 등의 저분자량의 유해물질이어도 되고, 비타민 유사 물질 등의 저분자량의 유용물질이어도 되며, 구체적으로는, PCB류, 다이옥신, 천연 또는 환경호르몬, 농약, 중금속(킬레이트 복합체) 등을 들 수 있다.
상기 고분자물질 Z로서는, 면역응답을 유도 가능한 한, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들면, 다당류, 단백질, 핵산, 생물 또는 환경 유래의 미립자 등이 바람직하고, 이들 중에서도 단백질이 보다 바람직하다.
상기 단백질로서는, 예를 들면, 구멍삿갓조개 유래 헤모시아닌(hemocyanin)(KLH), 난백 알부민(OVA), 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민, 소 감마 글로불린 등을 들 수 있다.
상기 링커 Y로서는, 상기 피검물질 X와 상기 고분자물질 Z를 연결 가능하다면, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들면, 상 기 고분자물질 Z와 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성의 관능기를 적어도 1종류 함유하며, 또한, 1~20개의 탄소 분자사슬을 갖는 화합물이 바람직하고, 예를 들면, 하기 구조식 Ⅰ~Ⅲ로 표시되는 구조를 갖는 화합물을 들 수 있다.
이들 중에서도 하기 구조식 Ⅰ 및 Ⅱ로 표시되는 구조를 갖는 화합물이 바람직하고, 상기 면역반응 측정용 담체도 그의 구조 중에 하기 구조식 Ⅰ 및 Ⅱ로 표시되는 구조 중 적어도 일부, 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 갖는 것이 바람직하다.
[구조식 Ⅰ]
단, 상기 구조식 Ⅰ 중, n은 1~20의 정수를 나타낸다.
[구조식 Ⅱ]
단, 상기 구조식 Ⅱ 중, n은 1~20의 정수를 나타낸다.
[구조식 Ⅲ]
또한, 상기 구조식 Ⅰ 및 Ⅱ로 표시되는 구조의 아날로그로서는, 예를 들면,
·O(CH2)LONH2(단, L은 1 이상의 정수를 나타낸다.)
·OCO(CH2)LONH2(단, L은 1 이상의 정수를 나타낸다.)
·CH3(CH2)nCH(CH2)mCH3(단, n 및 m은, 각각 n+m≥2를 만족하는 정수를 나타낸다.)
등을 들 수 있다.
상기 항체 조제용 화합물의 조제방법으로서는, 특별히 제한은 없고, 공지의 합성방법에 의해 조제할 수 있으며, 예를 들면, 상기 링커 Y와 상기 피검물질 X로 되는 화합물(이하, 「합텐(hapten) 화합물」이라고 한다)을 합성하고, 이것을, 상기 고분자물질 Z를 포함하는 용액 중에 첨가하여, 상기 링커 Y의 반응성의 관능기 반응기를 상기 고분자물질 Z에 결합시킴으로써 조제하는 방법을 들 수 있다.
얻어진 상기 항체 조제용 화합물은, 필요에 따라서 반응액을 면역원으로서 사용하는 데에 적합한 중성 용액으로 치한하고, 여과나 투석 등의 공지의 방법에 의해 정제하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 항체 조제용 화합물이, n종(단, n은 2 이상의 자연수)의 피검물질 X1~Xn, 면역원성을 갖는 고분자물질 Z, 상기 피검물질 X 및 상기 고분자물질 Z를 결합하는 상기 링커 Y로 되는 n종의 복합체인 경우, 상기 n종의 항체 조제용 화합물을 사용하여 제작된 상기 피검물질 X1~Xn에 대한 n종의 항체 X´1~X´n은, 상기 링커 Y가 동일한 화합물인 한, 상기 링커 Y가 갖는 구조 중 적어도 일부를 그의 구조 중에 갖는 상기 면역반응 측정용 담체에 포착될 수 있다.
상기 n종의 피검물질 X1~Xn으로서는, 예를 들면, n종의 PCB류의 이성체(異性體) 등을 들 수 있고, 상기 n종의 항체 조제용 화합물로서는, 하기 구조식으로 표 시되는 복합체를 들 수 있다.
<면역반응 측정용 담체>
본 발명의 면역반응 측정용 담체는, 항원물질(의사 항원)로서 상기 피검물질 X 및 그의 유사체 모두 첨가되어 있지 않고, 상기 피검물질 X 및 그의 유사체 모두 고정하는 처리가 행하여져 있지 않다.
상기 면역반응 측정용 담체로서는, 상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조, 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 분자 중에 갖는 한, 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 상기 구조식 Ⅰ 및 Ⅱ로 표시되는 구조 중 적어도 일부의 구조 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 갖는 화합물로서는, 예를 들면, 하기 구조식 A 및 B로 표시되는 다당류(예를 들면, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스), 하기 구조식 C~E로 표시되는 벤젠 골격을 갖는 화합물(예를 들면, 알킬벤젠, 알킬페놀 등), 리그닌(lignin), 리그닌 설폰산, 부식산, 및 이들의 유도체를 들 수 있다.
[구조식 A]
단, 상기 구조식 A 중, M은 O(CH2)LONH2를 나타내고, L은 1 이상의 정수를 나타낸다.
[구조식 B]
단, 상기 구조식 B 중, N은, OCO(CH2)LONH2를 나타내고, L은 1 이상의 정수를 나타낸다.
[구조식 C]
단, 상기 구조식 C 중, M은, O(CH2)LONH2를 나타내고, L은 1 이상의 정수를 나타내며, Q는 OH 및 SO3Na 중 어느 하나를 나타낸다.
[구조식 D]
단, 상기 구조식 D 중, N은 OCO(CH2)LONH2를 나타내고, L은 1 이상의 정수를 나타내며, Q는 OH 및 SO3Na 중 어느 하나를 나타낸다.
[구조식 E]
단, 상기 구조식 E 중, R은 CH3(CH2)nCH(CH2)mCH3를 나타내고, n 및 m은, 각각 n+m≥2를 만족하는 정수를 나타내며, Q는 OH 및 SO3Na 중 어느 하나를 나타낸다.
또한, 상기 구조식 Ⅲ로 표시되는 구조 중 적어도 일부의 구조 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 갖는 화합물로서는, 예를 들면, 폴리벤젠, 폴리벤젠비닐, 아미노벤젠설폰산염 리그닌, 폴리페놀 등을 들 수 있다.
상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조 및 그의 아날로그 중 어느 하나가 존재하지 않는 분자에, 상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 적절히 부가해도 되고, 상기 부가는, 상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조, 및 그의 아날로그 중 어느 하나인 화합물, 단백질, 핵산, 폴리머, 및 이들의 복합체 중 어느 하나를, 물리적(원자간력(原子間力), 소수(疎水)), 전기적, 화학적(수소(水素)결합, 배위(配位)결합, 공유(共有)결합)에 의한 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
상기 면역반응 측정용 담체로서는, 시료와 균일한 접촉이 가능하다면, 형상이나 재질에 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들면, 섬유체로 되는 것이 바람직하고, 다수의 섬유를 고밀도로 갖는 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 섬유체로서는, 예를 들면, 여과지, 흡습지(吸濕紙), 직물, 편물, 부직포 등을 들 수 있다.
상기 면역반응 측정용 담체는, 상기 섬유를 목적의 형상으로 성형하여 조제해도 되고, 시트형상의 섬유체를 목적의 사이즈 및 형상으로 공지의 방법으로 재단(裁斷)이나 펀칭함으로서 조제해도 된다.
또한, 상기 면역반응 측정용 담체의 형상으로서는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들면, 박막상(薄膜狀), 디스크상, 미립자상, 침상(針狀), 평판상(平板狀) 등의 형상이 바람직하다.
더욱이, 상기 면역반응 측정용 담체의 통기성(通氣性)으로서는, 펌프나 원심 등의 물리적인 수단, 및 전기영동 등의 전기화학적인 수단 등에 의해, 통액(通液)되는 시료가 균일한 유속으로 통과하는 한, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들면, 1~100 ㎤/㎠/분이 바람직하다.
상기 면역반응 측정용 담체는, 일정 유속으로 통액됨으로써, 포착되는 상기 항체 X´의 양이 누적적으로 증가한다. 포착되는 상기 항체 X´의 양으로서는, 평 형상태에 있어서, 첨가한 항체의 총량의 0.01~10%인 것이 바람직하다.
(면역반응 측정용 장치)
본 발명의 면역반응 측정용 장치는, 본 발명의 면역반응 측정용 담체를 구비하는 한, 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 플로우 쓰루식 검출장치, 이뮤노크로마토그래피식 장치, 분광광도계, 마이크로플레이트 리더장치(microplate reader device), 형광광도계, 전기화학 계측장치, 자기·자성 측정장치, 굴절 측정장치 등을 들 수 있지만, 이들 중에서도 플로우 쓰루식 검출장치인 것이 바람직하다.
본 발명의 면역반응 측정용 장치는, 예를 들면, 후술하는 본 발명의 면역반응 측정방법에 적합하게 이용할 수 있다.
상기 면역반응 측정용 장치로서는, 예를 들면,
면역반응 측정용 담체를 수용하고, 빛이 통과 가능한 관통구멍이 형성되어 되는 측정용 셀과,
상기 측정용 셀에 수용된 상기 면역반응 측정용 담체에 빛을 조사시키는 발광부와,
상기 발광부로부터 상기 면역반응 측정용 담체에 조사된 빛 중, 상기 측정용 셀에 수용된 상기 면역반응 측정용 담체를 투과하는 투과광을 수광하여, 수광된 상기 투과광의 광량을 측정하는 수광부로 되는 투과 광량 측정장치를 구비하는 장치가 적합하게 사용된다.
상기 장치를 사용한 면역반응 측정방법으로서는, 예를 들면, 상기 면역반응 측정용 담체를 수납한 상기 측정용 셀 안에, 상기 피검물질 X에 대한 상기 항체 X ´를 첨가한 피검시료를 송액(送液)함으로써, 상기 피검시료 중에 있어서 피검물질 X와 결합하고 있지 않은 상기 항체 X´를 상기 면역반응 측정용 담체 상에 포착하여, 그 포착량으로부터 간접적으로 상기 피검시료 중의 상기 피검물질 X의 농도를 구하는 방법을 들 수 있고, 피검물질 X와 피검물질 X에 대한 항체 X´를 포함하는 피검시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 항체 포착량과, 항체 X´만을 포함하는 기준시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 항체 포착량으로부터 상대 포착량을 계산하여, 상기 상대 포착량으로부터 상기 피검시료 중의 상기 피검물질 X의 농도를 구하는 방법을 들 수 있다.
상기 측정용 셀의 소재로서는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 투광성 소재여도 되고, 비투광성 소재여도 된다. 상기 측정용 셀에는 빛이 통과 가능한 관통구멍이 형성되어 있기 때문에, 상기 측정용 셀을 투광성 소재로 구성할 필요는 없고, 그 때문에, 상기 측정용 셀에 흠집이 나거나 오염되더라도, 빛의 통과로(通過路)에 영향을 미치지 않으며, 측정의 오차가 생기지 않는 점에서 유리하다. 그 중에서도, 상기 측정용 셀의 소재로서는, 비투광성 소재인 것이 차광성(遮光性)을 갖기 때문에, 덮개 등에 의해 차광할 필요가 없는 점에서 바람직하다. 상기 비투광성 소재로서는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, ABS 수지(아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 수지), PP(폴리프로필렌), PE(폴리에틸렌), PS(폴리스티렌), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PET(폴리에틸렌테레프탈레이트), PPE(폴리페닐렌에테르), 나일론, PA(폴리아미드), PC(폴리카보네이트), POM(폴리아세탈), PBT(폴리부틸렌테레프 탈레이트), PPS(폴리페닐렌 설피드), PEEK(폴리에테르 에테르 케톤(polyether ether ketone)), LCP(액정 폴리머), 플루오르 수지, 우레탄 수지, 엘라스토머, PF(페놀 수지), MF(멜라민 수지), FRP(유리 섬유 강화 플라스틱) 등을 들 수 있다.
상기 측정용 셀에 있어서, 상기 관통구멍으로서는, 빛이 통과 가능한 구멍이라면, 그 사이즈 등에 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
상기 측정용 셀에 있어서, 상기 면역반응 측정용 담체는, 상기 측정용 셀 내에 수용되어 있으면 특별히 제한은 없고, 상기 관통구멍을 통과하는 빛이 적어도 상기 면역반응 측정용 담체의 일부에 조사되도록, 목적에 따라서 적절히 배치된다. 그 중에서도 상기 면역반응 측정용 담체는, 상기 관통구멍으로부터 탈락(脫落)되지 않도록, 상기 관통구멍 내에 고정되어 있는 것이 바람직하다. 상기 고정방법으로서는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 관통구멍의 내벽(內壁)에 힘을 가하는 상기 면역반응 측정용 담체 자체의 힘에 의해, 상기 관통구멍에 고정되어 있어도 되고, 또한, 상기 관통구멍의 내벽에 홈(溝)을 형성하여, 그 홈에 상기 면역반응 측정용 담체의 바깥 둘레(外周)를 맞댐으로써 고정되어 있어도 된다.
상기 측정용 셀은, 상기 면역반응 측정용 담체와 함께 일체형(一體型) 디스포저블 셀(disposable cell)의 태양으로 해도 되고, 상기 면역반응 측정용 담체만을 교환 가능한 구조로서, 반복 사용 가능한 태양으로 해도 된다.
상기 측정용 셀은, 상기한 바와 같이 관통구멍을 갖기 때문에, 상기 관통구멍에 상기 피검시료를 송액하는 것만으로, 용이하게 상기 면역반응 측정용 담체에 피검시료를 통액시킬 수 있지만, 더욱이, 상기 측정용 셀에 탈착(脫着) 가능하게 접속된 통액수단에 의해, 피검시료가 상기 면역반응 측정용 담체에 통액되도록 구성되어 있어도 된다. 상기 통액수단으로서는, 예를 들면, 상기 면역반응 측정용 담체에 대하여 상기 피검시료가 균일하게 통액되도록, 상기 피검시료를 가압(加壓)하여, 상기 면역반응 측정용 담체로 송액하는 수단 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 측정용 셀에, 시린지(syringe), 펌프, 원심분리장치 등을 접속하고, 상기 피검시료를 가압하여 송액하는 수단 등을 들 수 있다. 또한, 상기 통액수단은, 추가로 유량을 제어하는 제어부를 구비하여, 가압의 동작을 제어할 수 있는 것이어도 된다.
상기 발광부로서는, 적어도 광원을 구비하여, 상기 측정용 셀 중의 상기 면역반응 측정용 담체에 빛을 조사 가능한 것이라면, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 상기 광원으로서는, 예를 들면, 레이저, 발광 다이오드, 할로겐 램프, 텅스텐 램프 등을 들 수 있다. 또한, 상기 발광부는, 두개 이상의 상기 광원을 갖고 있어도 된다.
상기 발광부로부터 발광되는 빛으로서는, 하나의 단색광(單色光)이어도 되고, 복색광(複色光)이어도 되며, 또한, 두개 이상의 단색광이어도 되지만, 상기 면역반응 측정용 담체에 조사되는 빛으로서는, 하나의 단색광인 것이 바람직하고, 그 때문에, 상기 발광부로부터 발광되는 빛이 복색광 또는 두개 이상의 단색광인 경우에는, 상기 발광부는, 상기 복색광 또는 두개 이상의 단색광 중, 하나의 단색광만을 선택할 수 있고, 또한 그 선택하는 단색광을 변경하는 것이 가능한, 단색광 선 택부를 구비하는 것이 바람직하다.
상기 단색광 선택부에 의하면, 상기 발광부로부터 발광된 복색광 또는 두개 이상의 단색광을, 하나의 단색광으로서 상기 면역반응 측정용 담체에 조사할 수 있고, 더욱이 그 단색광을 다른 단색광으로 변경함으로써, 예를 들면, 상기 면역반응 측정용 담체에 부착된 두개 이상의 발색물질의 투과 광량을 측정할 수 있다.
상기 수광부로서는, 상기 발광부로부터 상기 면역반응 측정용 담체에 조사된 빛 중, 상기 면역반응 측정용 담체(상기 피검시료가 통액된 부분)를 투과한 투과광을 수광하여, 수광된 광량을 측정 가능한 것이라면, 특별히 제한은 없으며, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
상기 면역반응 측정용 담체로부터의 투과광이, 복색광 또는 두개 이상의 단색광인 경우에는, 상기 수광부는, 하나의 단색광만을 선택할 수 있고, 또한, 그 선택하는 단색광을 변경하는 것이 가능한, 단색광 선택부를 구비하는 것이 바람직하다.
상기 단색광 선택부에 의하면, 상기 면역반응 측정용 담체를 투과한 복색광 또는 두개 이상의 단색광을, 하나의 단색광으로서 수광할 수 있고, 추가로 그 단색광을 다른 단색광으로 변경함으로써, 예를 들면, 상기 면역반응 측정용 담체에 부착된 두개 이상의 발색물질의 투과 광량을 측정할 수 있다.
상기 면역반응 측정용 장치는, 상기 수광부에 의해 수광된 광량을, 전기신호의 신호강도로서 계측 가능한 측정수단을 구비하는 것이 바람직하다. 상기 측정수단은, 예를 들면, 상기 수광부와 접속됨으로써, 상기 수광부에 의해 수광된 광량 을, 전기신호의 신호강도로서 변환하여 출력할 수 있다.
또한, 상기 면역반응 측정용 장치는, 상기 발광부와 상기 수광부 사이에, 반사통을 구비하는 것이 바람직하다. 상기 반사통은, 상기 면역반응 측정용 담체를 내포하도록, 상기 발광부로부터 조사되는 빛의 조사방향으로 관통하고, 그 내면이 상기 면역반응 측정용 담체로부터의 반사광을 반사하도록 구성된다. 상기 반사통을 구비함으로써, 상기 면역반응 측정용 담체에 의해 반사된 빛을 수속(收束)할 수 있기 때문에, 측정감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 면역반응 측정용 장치는, 상기 수광부에서 측정된 투과광의 광량에 대해서, 기준이 되는 광량으로부터 상대 흡광도를 계산하는 상대 흡광도 계산부를 구비하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 상기 면역반응 측정용 담체에 빛을 조사하여, 상기 피검물질 X를 포함하는 피검시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 투과광과, 상기 피검물질 X를 포함하지 않는 기준시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 투과광으로부터 상대 흡광도를 계산하는 상대 흡광도 계산부를 구비하는 것이 보다 바람직하다.
상기 면역반응 측정용 장치에 있어서는, 플로우식으로 함으로써, 피검시료(액상(液相))와 상기 면역반응 측정용 담체(고상(固相))의 접촉시간이 짧고, 피검시료 중의 상기 항체를 플로우에 의해 연속적으로 포착하기 때문에, 액상 중의 결합 평형상태를 깨뜨리지 않고 측정할 수 있으며, 이에 따라, 감도의 저하, 및 측정을 복잡하게 하는 액상과 고상의 경합반응을 회피할 수 있다.
또한, 상기 항체의 연속 포착이 가능하기 때문에, 액상 중의 항원과 항체의 결합이, 항체의 친화성 지배(親和性支配)가 될 때까지, 구체적으로는 상기 항체 자체의 평형해리정수(平衡解離定數) 이하까지 상기 항체의 농도를 낮게 할 수 있고, 추가로 검출에 필요한 감도가 얻어질 때까지, 신호값을 증폭시킬 수 있다.
(면역반응 측정방법)
본 발명의 면역반응 측정방법은, 상기 피검물질 X에 대한 상기 항체 X´를 첨가한 피검시료를, 본 발명의 면역반응 측정용 담체에 공급하고, 상기 피검시료 중에 있어서 상기 피검물질 X와 결합하고 있지 않은 상기 항체 X´를, 상기 면역반응 측정용 담체 상에 포착하여, 상기 항체의 양을 측정하는 방법이다.
본 발명의 면역 측정방법은, 본 발명의 면역반응 측정용 담체를 사용하는 방법으로서, 본 발명의 면역반응 측정용 장치를 사용하여 적합하게 실시할 수 있다.
상기 면역반응 측정용 담체에 포착된 항체량의 측정방법으로서는, 상기 피검물질 X에 대한 항체 X´가 표지물질을 갖는 항체인 경우, 상기 항체 X의 표지물질로부터 발하여지는 시그널을 측정하는 방법, 상기 항체 X´에 대한 표지물질을 갖는 2차 항체를 사용하는 경우에는, 상기 2차 항체의 표지물질로부터 발하여지는 시그널을 측정하는 방법을 들 수 있다.
상기 시그널을 측정하는 방법으로서는, 특별히 제한은 없고, 상기 표지물질의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 표지물질이 효소인 경우, 상기 효소와 기질(基質)을 반응시킨 후, 반응 생성물의 반사 흡광도, 형광 흡광도, 발광강도 등을 측정하는 방법을 들 수 있고, 상기 표지물질이 방사성 동위체인 경우는, 시그널로서 방사선량을 측정하는 방법, 상기 표지물질이 형광물질인 경우, 시그널로서 형광강도를 측정하는 방법, 상기 표지물질이 발광물질인 경우, 시그널로서 발광강도를 측정하는 방법, 상기 표지물질이 착색 미립자인 경우, 시그널로서 착색에 의해 변화하는 투과 광량을 측정하는 방법, 상기 표지물질이 전기화학적인 반응을 나타내는 물질인 경우, 시그널로서 전류나 전압 및 전위변화를 측정하는 방법, 상기 표지물질이 전자 스핀을 나타내는 물질인 경우, 시그널로서 전자스핀공명(electro spin resonance)의 스펙트럼 변화를 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
이들의 측정된 시그널은, 예를 들면, 1초마다 측정하여, 컴퓨터 등에 기록하고, 최종적으로 얻어진 잔존 시그널값과, 베이스 라인값과의 차를 측정값으로서 볼트 단위로 표시하는 방법이 바람직하다.
상기 표지물질로서는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들면, 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 티로시나아제(tyrosinase), 갈락토시다아제(galactosidase), 루시페라아제(luciferase), 글루코오스 산화효소 등의 효소, I125, I131, H3 등의 방사성 동위체, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 유로퓸 킬레이트(europium chelate), 플루오레세인(fluorescein) 등의 이소시아네이트 유도물질 등의 형광물질, 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 아크리디늄 설폰산, 루시페린(luciferin), NAD 옥시드레덕타아제(NAD oxidereductase), 루시게닌(lucigenin), 로핀(lophine), 금 콜로이드, 셀레늄 콜로이드(selenium colloid), 착색 라텍스, 자성 미립자 등의 착색 미립자, 피페리딘-N-옥시드 유도체, 피롤리딘(pyrrolidine)-N-옥시드 유도체, 옥사졸리딘-N-옥시드 유도체와 같은 프리 라디컬(free radical)을 나타내는 물질 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 상기 표지물질이 착색 미립자인 태양이 바람직하고, 상기 면역반응 측정방법으로서는, 착색에 의해 변화하는 투과 광량을 시그널로서 측정하는 방법이 바람직하다.
여기에서, 상기 n종의 피검물질 X1~Xn에 대한 n종의 항체 X´1~X´n은, 동일한 시료 중에 첨가하여, 상기 면역반응 측정용 담체 상에 동시에 항체 X´1~X´n을 포착하고, 그 포착량으로부터 상기 피검물질 X´1~X´n의 양을 총량으로서 정량해도 된다. 이에 따라, 동족체나 이성체를 다수 포함하는 피검물질을 총량으로서 정량할 때, 단일 항체에서는 곤란하였던 정확한 정량이 1회의 측정으로 가능해진다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 면역반응 측정방법은, 액상과 고상의 경합반응을 회피하여, 축적효과에 의해, 측정시의 항체 농도를 상기 항체 자체가 갖는 평형해리정수 이하로 설정할 수 있기 때문에, 동일 용액 중의 복수의 항원항체반응이, 각각의 평형해리정수에 의존하여, 동시에 또한 비의존적으로 일어난다. 따라서, 피검물질이 n종 있더라도, n종 항체의 항원항체반응의 총합으로서 파악할 수 있다.
또한, n종의 항체가 갖는 각각의 항원에 대한 결합 친화성을 바꿈으로써, n종 항원의 동족체나 이성체의 구성비(함유량비)를 명확하게 할 수 있다.
이 경우, 예를 들면, 상기 시료 중의 피검물질이 X1과 X2인 경우, X1에 결합 하는 항체 X´1, X2에 결합하는 항체 X´2, X1, 및 X2 모두에 결합하는 항체를 혼합한다. 상기 피검물질 X1과 X2가 동일한 농도인 경우, 측정조건의 설계에 의해 X1에 결합하는 항체에 유래하는 신호와, X2에 결합하는 항체에 유래하는 신호를 동일하게 할 수 있다. 또한, 그 총합이 상기 피검물질 X1과 X2에 결합하는 항체에 유래하는 신호가 되지만, X1과 X2의 농도가 각각 상이할 때, X1에 결합하는 항체에 유래하는 신호와, X2에 결합하는 항체에 유래하는 신호는 상이하다. X1에 결합하는 항체에 유래하는 신호와, X2에 결합하는 항체에 유래하는 신호가 상이해도, 농도의 총합은 X1과 X2에 결합하는 항체에 유래하는 신호로부터 구해지기 때문에, 이와 같이, 첨가하는 항체의 결합 특이성을 선택함으로써 n종의 피검물질 X1~Xn의 구성비(함유량비)를 추정할 수 있다.
더욱이, 항체 X´1~X´n을 단독으로 첨가한 n종의 시료를 준비하고, 각 시료에 있어서의 항체의 포착량을 정량하여, 상기 포착량으로부터 상기 피검물질의 양을 정량해도 된다. 이에 따라, 동족체나 이성체를 다수 포함하는 피검물질의 조성을 평가할 때, 동일한 면역반응 측정용 담체를 사용하여 항체의 포착량이나 피검물질의 양을 정량할 수 있다. 이 경우, 측정은 병렬적으로 동시에 측정도 가능하고, 병렬측정의 결과로부터, 상기와 같이 피검물질 X1~Xn의 구성비(함유량비)를 추정하는 것도 가능하다.
본 발명의 면역반응 측정용 담체는, ELISA법, 이뮤노크로마토법 등의 종래의 이뮤노어세이를 위한 담체로서의 적용도 가능하다고 생각되어, 매우 넓은 응용범위를 갖는다.
본 발명의 면역반응 측정방법은, 면역반응 측정용 담체 상에 포착된 항체량으로부터, 피검시료 중의 피검물질의 양을 구하는 방법인 것이 바람직하고, 이하에 그 예를 나타낸다.
상기 표지물질로부터 발생한 시그널의 측정에 있어서는, 어떤 농도의 상기 항체 X´를 상기 면역반응 측정용 담체에 결합시킨 경우의 시그널 강도(블랭크, 예를 들면 「F0」으로 한다)를 측정해둔다. 이어서, 피검시료에, 상기 블랭크 측정시와 동일한 농도의 상기 항체 X´를 첨가한 혼합액을, 상기 면역반응 측정용 담체에 공급하고, 미결합의 상기 항체 X´를 결합시킨 경우의 시그널 강도(예를 들면, 「F1」으로 한다)를 측정한다.
여기에서, 상기 피검시료 중에 피검물질 X가 존재할 때, 상기 항체 X´는 상기 피검시료 중의 피검물질 X와 결합하기 때문에, 상기 면역반응 측정용 담체와 결합하는 미결합의 상기 항체 X´의 양은 적어진다. 따라서, 시그널 강도가 F1<F0이 될 때, 상기 피검시료 중에 피검물질 X가 존재한다고 판단할 수 있다.
F1의 저하비율이, 상기 피검시료 중에 포함되는 상기 피검물질 X의 양과 상관관계를 갖기 때문에, 기지의 농도의 피검물질 X를 사용하여, 미리 검량선을 작성해둠으로써, F1의 저하비율에 따라서 상기 피검물질 X의 정량을 행할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해서 설명하지만, 본 발명은 이 실시예에 조금 도 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
(1) 항체의 제작
피검물질 PCB에 대한 항PCB 단일클론 항체를 조제하기 위해, 3염소화물 PCB(3염화비페닐)를, 링커를 매개로 하여 캐리어 단백질(구멍삿갓조개 유래의 헤모시아닌(이하, 「KLH」로 표시한다))에 결합한 복합체를 합성하였다.
상기 복합체를 항원으로서, 마우스(Bulb/c, 암컷, 5주령)에 면역하였다.
초회면역은, 상기 항체 조제용 화합물(단백질량으로서 약 0.3 ㎎)을 완전 애주번트(complete adjuvant)에 혼합 후, 피하주사하였다. 상기 초회면역의 2주 후와 4주 후에, 동량의 상기 항체 조제용 화합물을, 불완전 애주번트(incomplete adjuvant)에 혼합 후, 피하주사하였다. 그 다음, 1주 이상 경과한 후, 동량(同量)의 상기 항체 조제용 화합물을, 복강(腹腔) 또는 미부(尾部) 정맥에 주사하고, 그 4~5일 후에 비장(脾臟)을 적출(摘出)하였다.
적출한 상기 비장으로부터 조제한 비장세포를, 골수종세포(myeloma cell)와 함께 폴리에틸렌 글리콜 용액 중에서 2분간 혼합하여, 세포 융합을 행하였다.
융합반응 후의 융합세포를 배양하고, 세포 융합으로부터 2주 이상 경과한 하이브리도마(hybridoma)의 배양상청을 사용하여, 목적의 항PCB 단일클론 항체의 유무를 스크리닝하여, 항PCB 단일클론 항체를 생산하는 안정한 하이브리도머를 얻었다. 상기 하이브리도머를 배양하고, 배양상청을 정제하여, 항PCB 단일클론 항체를 얻었다.
(2) 면역반응 측정용 담체
상기 항PCB 단일클론 항체의 제작에 사용한 복합체에 있어서, 상기 링커는, 하기 구조식 Ⅳ로 표시되는 구조를 갖고 있었다.
[구조식 Ⅳ]
따라서, 상기 구조식 Ⅳ와 유사한 구조를 분자 중에 갖는 섬유체로서, 코튼(면) 및 셀룰로오스를 선택하고, 이들의 섬유체로 되는 필터를 직경 약 5 ㎜의 원형상으로 잘라내어, 담체(본 발명의 면역반응 측정용 담체)를 조제하였다.
또한, 비교대상으로서, 상기 구조식 Ⅳ와 유사한 구조를 분자 중에 갖지 않는 섬유체로서, 폴리올레핀, 및 폴리에스테르를 선택하고, 이들의 섬유체로 되는 필터를 동일하게 하여 잘라내어, 담체를 조제하였다.
-항체 포착성의 평가-
상기 항PCB 단일클론 항체를 통상적인 방법에 의해 금 콜로이드로 표지하고, 소 혈청 알부민을 1 g/L 포함하는 생리식염수에 용해하여, 1 nM 정도의 항체 용액을 얻었다.
이어서, 상기 담체를, 상기 항체 용액을 통액 가능한 홀더(측정용 셀)에 설치하였다. 상기 홀더(측정용 셀)에는 직경 3 ㎜의 구멍부(穴部)가 설치되어 있고, 접속된 주사기로부터, 상기 담체를 통하여 상기 항체 용액을 통액시킬 수 있다.
상기 담체의 항체 포착성의 평가는, 상기 항체 용액 2 mL를 주사기에 넣고, 접속된 펌프에 의해 0.85 mL/분의 일정 유속으로 통액시킴으로써 행하였다. 상기 항체 용액을 통액시킨 후, 동일한 유속으로 상기 항체를 포함하지 않는 소 혈청 알부민을 1 g/L 포함하는 생리식염수에 1 mL를 통액시킨 후, 상기 홀더(측정용 셀)의 투과 광량을 측정하였다.
또한, 항체 용액을 통액시키기 전에, 동일한 용량으로 소 혈청 알부민을 1 g/L 포함하는 생리식염수에 1 mL를 통액시키고, 측정기로 투과 광량을 측정하여, 항체액 통과 전후의 투과 광량의 변화를, 항체 포착성의 지표로 하였다. 투과 광량의 측정은, 상기 홀더(측정용 셀)를 끼우는 위치에 광원과 포토다이오드(photodiode)를 갖고, 상기 담체를 통과하는 빛의 투과를 전기신호로서 계측할 수 있는 장치를 사용하여 행하였다. 따라서, 포착되는 항체량이 많을수록, 표지 금 콜로이드에 유래하는 막 상의 적색이 짙어지고, 신호값으로서는 작아진다.
결과를 도 1a~f, 및 도 2a~d에 나타낸다.
(3) 피검물질(PCB)의 정량
PCB 함유 절연유를 하기의 방법에 의해 처리하여, 피검시료를 조제하였다. 또한, 상기 PCB 함유 절연유는, PCB를 포함하지 않는 절연유에, 카네크롤-300(GL 사이언스사제)을 여러 가지의 농도로 첨가하고, 기지의 농도의 PCB를 포함하는 절연유로서 조제하였다.
규조토 칼럼(Extrelut NT3, Merk사제)과 실리카겔 칼럼(SepPak Silica Plus, Waters사제)을 연결하여, 1 mL의 25% 발연황산(fuming sulfuric acid) 및 2 mL의 농황산(濃硫酸)을 상기 규조토 칼럼에 순차적으로 첨가하고, 15분간 방치하였다.
이어서, 1.5 g의 무수 황산나트륨을 규조토 칼럼에 중층(重層)한 후, 0.5 g 의 상기 피검시료(PCB 함유 절연유)를 첨가하고, 칼럼 내에 침투시키기 위해 1 mL의 n-헥산을 추가로 첨가하였다. 5분간 방치하고, 상기 피검시료 중의 절연유 성분의 분해를 촉진시킨 후, 전개를 행하였다.
5 mL의 n-헥산을 첨가하고, 액면(液面)이 무수 황산나트륨층까지 내려간 것을 확인한 후, 10 mL의 n-헥산을 추가로 첨가하여, 용출액(溶出液)의 전량(全量)을 가지형 플라스크에 회수하였다. 상기 용출액에 0.5 mL의 디메틸설폭시드(이하, 「DMSO」라고 한다)를 첨가하고, 30℃의 탕욕(湯浴) 중에서, 회전식 농축증발기(rotary evaporator)로 n-헥산을 제거하였다. 잔액(殘液)을 마이크로 튜브에 옮겨 원심분리(2000 rpm, 5분간)하고, DMSO층을 분취(分取)하여 피검시료(전처리액)로 하였다.
항체 용액은, 상기 항PCB 단일클론 항체를 통상적인 방법에 의해 금 콜로이드로 표지하고, 소 혈청 알부민을 1 g/L 포함하는 생리식염수에 용해하여, 1 nM 정도의 항체 용액을 조제하였다.
상기 피검시료(전처리액)를 100배 희석이 되도록 상기 항체 용액에 첨가하고, 측정용 용액을 조제하였다.
셀룰로오스의 섬유체로 되는 필터를 직경 약 5 ㎜의 원형상으로 잘라내어 조제한 상기 면역반응 측정용 담체를, 상기 항체 용액을 통액 가능한 홀더(측정용 셀)에 설치하였다. 측정장치는, 상기 항체 포착성의 평가에서 사용한 것과 동일한 장치를 사용하였다.
상기 측정용 용액 2 mL를 주사기에 넣고, 접속된 펌프에 의해 0.85 mL/분의 일정 유속으로 통액시킴으로써 행하였다. 상기 항체 용액을 통액시킨 후, 동일한 유속으로 상기 항체를 포함하지 않는 소 혈청 알부민을 1 g/L 포함하는 생리식염수에 1 mL를 통액시킨 후, 상기 홀더(측정용 셀)의 투과 광량을 시그널로서 측정하였다.
대조로서, PCB를 포함하지 않고, 소 혈청 알부민을 1 g/L 포함하는 생리식염수를 통액시켰을 때의 투과 광량을 측정해두어, 상기 투과 광량을 100%로 한 투과 광량의 시그널 비율(%)을, 상기 피검시료 중의 PCB 농도의 지표로 하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3의 결과로부터, 항PCB 단일클론 항체를 포착하기 위한 의사 항원을 항체에 고정화하는 처리를 행하지 않고, 상기 면역반응 측정용 담체에 의해 항PCB 단일클론 항체를 포착할 수 있으며, 상기 항체량으로부터, 정확하게 피검물질의 농도를 정량할 수 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 종래의 의사 항원을 담체에 고정화하는 처리를 행한 경우에 비하여, 담체 조제의 비용 및 시간을 삭감할 수 있는 동시에, 고밀도로 항체를 포착할 수 있는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 면역반응 측정용 항체는, 균일하고 또한 고밀도로 항체를 포착하여, 피측정물을 고감도로 검출 가능하고, 저비용으로 효율적으로 조제 가능하기 때문에, 각종 이뮤노어세이용 담체로서 적합하게 사용할 수 있으며, 특히, 저분자량 물질에 대한 항체로서, 상기 저분자량 물질, 링커, 면역원성을 갖는 고분자량 물질 로 되는 항체 조제용 화합물을 사용하여 제작된 항체의 포착에 유용하기 때문에, 예를 들면, 환경오염물질 등의 저분자량의 유해물질이나, 비타민 유사 물질 등의 저분자량의 측정에 적합하다.
또한, 본 발명의 면역반응 측정장치는, 본 발명의 면역반응 측정용 담체를 구비하기 때문에, 각종 이뮤노어세이에 적합하고, 예를 들면, 환경오염물질 등의 저분자량의 유해물질이나, 비타민 유사 물질 등의 저분자량의 측정에 적합하다.
더욱이, 본 발명의 면역반응 측정방법은, 본 발명의 면역반응 측정용 담체 및 본 발명의 면역반응 측정장치를 사용하기 때문에, 각종 이뮤노어세이에 적합하고, 예를 들면, 환경오염물질 등의 저분자량의 유해물질이나, 비타민 유사 물질 등의 저분자량의 측정에 적합하다.
Claims (14)
- 피검물질 X, 면역원성을 갖는 고분자물질 Z, 상기 피검물질 X 및 상기 고분자물질 Z를 결합하는 링커 Y로 되는 X-Y-Z로 표시되는 복합체를 사용하여 제작된 상기 피검물질 X에 대한 항체 X´를 포착하기 위해 사용되고,상기 링커 Y가 갖는 적어도 일부의 구조, 및 그의 아날로그 중 어느 하나를 분자 중에 갖는 것을 특징으로 하는 면역반응 측정용 담체.
- 제1항에 있어서, 피검물질 X에 대한 항체 X´가, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 및 이들의 혼합물 중 어느 하나인 면역반응 측정용 담체.
- 제3항에 있어서, 셀룰로오스, 부식산, 니트로셀룰로오스, 리그닌 설폰산, 알킬벤젠, 알킬페놀, 및 이들의 유도체 중 적어도 어느 하나로 되는 면역반응 측정용 담체.
- 제1항에 있어서, 섬유체로 되는 면역반응 측정용 담체.
- 제1항에 있어서, n종(단, n은 2 이상의 자연수)의 피검물질 X1~Xn, 면역원성을 갖는 고분자물질 Z, 상기 피검물질 X 및 상기 고분자물질 Z를 결합하는 링커 Y로 되는 n종의 복합체를 사용하여 제작된 상기 피검물질 X1~Xn에 대한 n종의 항체 X´1~X´n을 포착하는 면역반응 측정용 담체.
- 제1항의 면역반응 측정용 담체를 구비하는 것을 특징으로 하는 면역반응 측정용 장치.
- 제7항에 있어서, 면역반응 측정용 담체를 수용하고, 빛이 통과 가능한 관통구멍이 형성되어 되는 측정용 셀과,상기 측정용 셀에 수용된 상기 면역반응 측정용 담체에 빛을 조사하는 발광부와,상기 발광부로부터 상기 면역반응 측정용 담체에 조사된 빛 중, 상기 측정용 셀에 수용된 상기 면역반응 측정용 담체를 투과하는 투과광을 수광하여, 수광된 상기 투과광의 광량을 측정하는 수광부,를 구비한 투과 광량 측정장치를 구비하는 면역반응 측정용 장치.
- 피검물질 X에 대한 항체 X´를 첨가한 피검시료를, 제1항의 면역반응 측정용 담체에 공급하고,상기 피검시료 중에 있어서 상기 피검물질 X와 결합하고 있지 않은 상기 항체 X´를, 상기 면역반응 측정용 담체 상에 포착하여,상기 항체 X´의 포착량으로부터 상기 피검시료 중의 상기 피검물질 X의 농도를 구하는 것을 특징으로 하는 면역반응 측정방법.
- 제9항에 있어서, 피검물질 X를 포함하는 피검시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 항체 포착량과, 피검물질 X를 포함하지 않는 기준시료를 공급한 상기 면역반응 측정용 담체의 항체 포착량으로부터 상대 항체 포착량을 계산하여, 상기 상대 항체 포착량으로부터 상기 피검시료 중의 상기 피검물질 X의 농도를 구하는 면역반응 측정방법.
- 제9항에 있어서, 피검물질 X에 대한 항체 X´가 표지물질을 갖고, 상기 표지물질에 유래하는 발색을 측정하는 면역반응 측정방법.
- 제9항에 있어서, 면역반응 측정용 담체 상에 포착된 항체를, 표지물질을 갖는 2차 항체과 반응시키는 면역반응 측정방법.
- 제9항에 있어서, 표지물질이 효소, 방사성 동위원소, 형광물질, 및 착색 미립자 중 어느 하나인 면역반응 측정방법.
- 제9항에 있어서, 피검물질이 PCB, 다이옥신, 호르몬, 비타민류, 농약, 및 중금속 중 어느 하나인 면역반응 측정방법.
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