KR20070073905A

KR20070073905A - 염색된 마이크로스피어 및 염색된 마이크로스피어의개체군의 형성 방법

Info

Publication number: KR20070073905A
Application number: KR1020077010844A
Authority: KR
Inventors: 커트 디. 호팩커; 아난다 지. 루가드; 에발트 테르페트슈니그
Original assignee: 루미넥스 코포레이션
Priority date: 2004-10-12
Filing date: 2005-10-11
Publication date: 2007-07-10
Also published as: US20120035328A1; JP2008516074A; JP5285910B2; CN101044213B; EP1802710A2; WO2006044413B1; EP1802710B1; HK1114115A1; WO2006044413A2; CA2583531A1; WO2006044413A3; CN103951595A; EP2559738B1; US8361169B2; US8038734B2; CN103951595B; CN101044213A; US20060085925A1; EP2559738A1

Abstract

본 발명은 염색된 마이크로스피어를 형성하는 여러 방법을 제공한다. 그 중 한가지 방법은 마이크로스피어 존재하에 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 염료에 연결된 화학적 구조를 활성화시키는 것이다. 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 결합되고 이로 인해 염료는 중합체에 연결되며 염색된 마이크로스피어가 형성된다. 다른 방법은 분자에 연결된 염색된 마이크로스피어를 형성하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기한 것처럼 마이크로스피어를 염색하는 단계와 더불어 염색된 마이크로스피어의 외부 표면에 분자를 합성하는 단계를 포함한다. 염색된 마이크로스피어 개체군이 또한 제공된다. 상기 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 화학적 구조에 의해 그 염색된 각각의 마이크로스피어의 중합체에 연결된 염료를 포함한다. 염료로 인한 염색된 마이크로스피어 개체군의 염료 특성의 변화 계수는 약 10% 보다 더 작다.

마이크로스피어, 표면 특성, 에놀산, 친수성기, 전하 밀도

Description

염색된 마이크로스피어 및 염색된 마이크로스피어의 개체군의 형성 방법{METHODS FOR FORMING DYED MICROSPHERES AND POPULATIONS OF DYED MICROSPHERES}

본 발명은 일반적으로 염색된 마이크로스피어 및 염색된 마이크로스피어 개체군의 형성 방법에 관한 것이다. 특정의 실시 형태는 마이크로스피어 존재하에 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 염료에 연결된 화학적 구조(chemical structure)를 활성화시키는 단계를 포함하고, 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 결합되며 이로 인해 염료를 그 중합체에 연결하게 된다.

이하의 설명 및 실시 형태는 본 명세서에 포함되었으나 선행 기술로 인정되지 않을 것이다.

분광 분석 기술은 화학계 및 생물학계의 분석에 폭넓게 사용된다. 대부분 이러한 기술은 관심을 갖는 물질의 전자기 방사선의 흡수 또는 방출을 측정하는 것이다. 그 기술은 조합 화학 및 생물검정산업(biological assay industries)을 포함하 여 많은 분야에서 활용되는 기술인 마이크로어레이(microarray) 분야에 사용된다. 한 회사, 즉 텍사스주 오스틴에 위치한 루미넥스사(Luminex Corporation)는 생물검정이 여러 색깔의 형광 마이크로스피어의 표면에서 실행되는 장치를 개발하였다. 이러한 장치의 일 예는 본 명세서에 참조를 위해 통합된 Chandler 등의 미국 특허 No. 5,981,180에 기술되어 있다. 이러한 마이크로스피어는 검출 구역을 상대적으로 고속으로 통과할 때 각각의 마이크로스피어의 레이저 여기(laser excitation) 및 형광 검출에 의해 유체 유동 장치(fluid flow device)에서 검출된다. 이러한 측정값은 분석을 위해 쉽게 데이터베이스로 축적될 수 있다.

상기 언급한 장치에서, 형광 염료는 마이크로스피어에 흡수되고 및/또는 마이크로스피어 표면에 결합된다. 그 염료는 장치의 선택된 검출창(detection window)의 파장으로 빛을 방출하는 능력에 기초하여 선택된다. 또한, 검출창은 다수의 파장에 따라 일정한 간격을 두고 있으며 그 염료는 인접한 검출창 내에서 염료의 형광 신호의 겹침을 최소화하도록 계획된다. 일 실시 형태에서, 두 개의 검출창 및 두 개의 염료를 사용함으로써, 10개의 서로 다른 농도 각각에서, 형광적으로 구분되는 100개의 마이크로스피어 세트가 생길 것이다.

공유 및 비공유 반응에 의해 마이크로스피어를 염색하는 종래 방법은 다음과 같이 요약될 수 있다. 예를 들어, 염색된 마이크로스피어는 여러 방법에 의한 분산중합법(dispersion polymerization)을 통해 제조될 수 있다. 참조를 위해 기술된 Hovak, D. 등의 J. Polym. Sci., Part A, Polym. Chem., 33, 2961-2968, 1995에 기술된 것처럼, 염료는 중합화에 앞서 단량체에 용해될 수 있다. 마이크로스피어는 또한 입자를 부풀려 염료를 그 입자에 전달하는 유기용매를 사용하는 중합화 후에 염색될 수 있다. 이러한 염색 방법의 예는 참조를 위해 기재된 Ober의 미국 특허 No.4,613,559, Chandler 등의 미국 특허 No.6,514,295, No.6,528,165, No.6,599,331, No.6,632,526 및 No.6,649,414에 기술되어 있다.

반응성 염료의 공중합은 화학적으로 결합된 염료를 가진 입자를 획득하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 참조를 위해 기재된 Winnik, F.M. 등의 Eur.Polym.J., 23, 617-622, 1987에 기술되어 있다. 선택적으로, 입자 또는 미립담체(microcarrier)는 그것들 표면에 공유적으로 결합하는 형광 염료(또는 더 작은 염색 입자)에 의해 광학적으로 표시된다. 이러한 방법의 예는 참조를 위해 기재된 Sebestyen F. 등의 J. Pept. Science, 4, 294-299, 1998, Egner, B.J. 등의 J. Chem. Soc. Chem. Commum., 8, 735-736, 1977, Manthakumar, A 등의 Bioconj. Chem., 11, 282-292, 2000 및 Chandler 등의 미국 특허 No.6,268,222에 기술되어 있다.

카르빈 또는 니트렌에 의한 C-H 결합 삽입은 참조를 위해 기재된 Breslow, R., Scriven(Ed.), 아지드 및 니트렌(Azide and Nitrenes), Chapter 10, AP, 뉴욕, 1984에 기술된 것처럼, 두 유기 분자 사이의 안정적인 공유 결합을 형성하기 위한 바람직한 경로이다. 반응 중간체로서 니트렌을 사용하는 것은 참조를 위해 기재된 Autrey, R 등의 J. Am. Chem. Soc., 109, 5814, 1987에 기술된 것처럼, C-H 결합 삽입을 효율적으로 실행하는 새로운 시약의 개발에 대한 노력을 자극하였다. 퍼플루오로페닐 아지드(perfluorophenyl azides)(PFPA)는 그것의 비-플루오르화된(non- fluorinated) 동족체보다 향상된 C-H 삽입 효율을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 아지드의 예는 참조를 위해 기재된 Keana 등의 미국 특허 No.5,580,697, No.5,582,955, No.5,587,273, 및 No.6,022,597, 및 Rajagopalan 등의 미국 특허 공개 No.2003/0017164에 기술되어 있다.

그러나, 상기한 방법들은 다수의 결점을 가지고 있다. 예를 들어, 중합화에 앞서 단량체에 염료를 용해하는 것은 일반적으로 중합화 동안 염료에 의한 라디칼 사슬 말단으로 인해 변환을 감소시키고 복잡 분산(polydisperse) 입자(서로 다른 크기의 입자들의 혼합물)를 초래한다. 또한, 반응성 염료의 공중합화의 유용성은 라디칼 중합화 하에서 안정한 염료의 부족으로 인해 제한된다. 특히, 반응성 염료는 참조를 위해 기재한 Yates, M.Z. 등의 Langmuir, 16(11), 4757-4760, 2000에 기술된 것처럼, 중합화 동안 색깔을 변화시킬 수 있다.

따라서, 용매-속성(solvent-fast) 또는 유기 내성(organotolerant) 비드를 생산하기 위한 마이크로스피어에 대한 염료의 공유 결합에 관한 현재의 기술적 수준에서, 마이크로스피어를 공유적으로 염색하기 위한 적절한 방법에 대한 필요가 존재한다.

다수의 아지드기를 포함하는 여러 분자들은 중합체를 연결하기 위해 사용되었다. 열 및 빛은 아지드 모이어티를 반응성 니트렌기로 전환하기 위해 사용되었다. 예를 들어, 빛을 이용한 카르보닐 아지드의 전환은 참조를 위해 기재된 Urbain 등의 미국 특허 No.3,278,306에 기술되어 있다. 175℃에서 술포닐 아지드(sulfonyl azide)의 전환은 참조를 위해 기재된 Bostick 등의 미국 특허 No.3,507,829에 기술 되어 있다. 빛을 이용한 방향족 아지드의 전환은 참조를 위해 기재된 Clecak 등의 미국 특허 No.3,887,379에 기술되어 있다. 빛을 이용한 PFPA의 전환은 참조를 위해 기재된 Cai 등의 Chem. Mater., 2, 631, 1990에 기술되어 있다.

1970년대 초반에, Kodak은 부착된 술포닐 아지드 모이어티를 가진 여러 가지 염료(예를 들어, 아조(azo) 또는 퀴논(quinone) 염료)를 이용하여 소수성 중합체를 영구적으로 염색하는 일련의 특허를 양도받았다. 술포닐 아지드 모이어티는 열 또는 빛으로 발생된 니트렌 중간체를 통해서 염료 분자를 중합체 기질에 공유적으로 부착하기 위하여 사용되었다. 비처리된 염료 분자는 그 후에 세척될 수 있었다. 특히, Holstead 등의 영국 특허 No.1 344 991 및 No.1 344 992는 여러 가지 염료 및 광택제(brighteners)의 방향족 링에 직접적으로 부착된 술포닐 아지드 모이어티의 용도를 기술하고 있다. 염료가 박혀 있는 중합체(막 또는 섬유 형태)를 가열하거나 빛을 조사한 후, 염료는 중합체와 새로운 결합을 형성한다. Holstead 등의 영국 특허 No.1 344 993은 유사한 반응성 염료를 일종의 사진 물질로서 사용하는 방법을 기술한다. Shuttleworth의 영국 특허 No.1 406 996은 여러 가지 염료 분자에 연결기(linker group)를 통해서 벤젠 술포닉 아지드(benzene sulfonic azide)를 부착하여 반응성 염료를 제조하는 방법을 기술한다. Pullan의 영국 특허 No.1 412 963은 (술포닐 아지드를 포함하여) 여러 가지 반응성기를 가진 염료를 직물 또는 필름에 대한 전사 기록방식(transfer printing)에 사용하는 방법을 기술한다. 상기한 모든 영국 특허는 참조를 위해 본 발명에 기재된다.

다른 회사들은 Kuriki 등의 미국 특허 No. 3,695,821에 기술된 것처럼 술포 닐 아지드를 포함하는 염료를 섬유 및 입자의 급속 염색에 사용하는 방법 및 Kampfer 등의 미국 특허 No. 3,674,480에 기술된 것처럼 술포닐 아지드를 포함하는 염료를 사진 건조 복제(photographic dry copying)에 사용하는 방법을 특허로 등록하였다. 펜실베니아의 랭커스터에 위치한 Armstrong World, Inc.는 참조를 위해 기재된 Hoyle 등의 미국 특허 No. 4,322,211 및 No. 4,415,334, 및 Lenox 등의 미국 특허 No. 4,556,625에 기술된 것처럼, 노란색 및 갈색을 입자에 영구적으로 전달하는 화합물을 포함하는 술포닐 아지드의 사용 방법에 관한 특허를 1980년 초기에 받았다. 또한, 여러 연구 그룹은 참조를 위해 기재된 Ayyangar, N.R. 등의 염료 및 컬러리스트 학회 저널(Journal of the Society of Dyers and Colorists)(JSDC), 13-19 페이지 및 550-57 페이지, 1979, Griffiths, J. 등의 JSDC, 455-458 페이지, 1977, Griffiths, J. 등의 JSDC, 65-70 페이지, 1978, Milligan, B. 등의 JSDC, 352-356 페이지, 1978, 및 Desai, K.R. 등의 염료 및 색소(Dyes and Pigments), 23, 25-32 페이지, 1993에 기술된 것처럼, 중합체 섬유의 급속 건조를 위해 술포닐 아지드기를 사용하는 방법을 연구하였다.

술포닐 아지드에서 니트렌으로의 열분해에 대한 치환기의 효과는 참조를 위해 기재된 Katamancheva, I 등의 염료 및 색소(Dyes and Pigments), 13, 155-160 페이지, 1990, Ayyangar, N.R. 등의 Indian J. of Chemistry, 30B, 42-45 페이지, 1991, 및 Laffler, J.E. 등의 J. Org. Chem. 28, 902-906 페이지, 1963에 기술된 것처럼 연구되었다. 술포닐 아지드 반응의 기본 매커니즘에 대한 연구는 또한 참조를 위해 기재된 Abramovitch, R.A. 등의 Org. Chem. 40, 883-889 페이지, 1975, Abramovitch, R.A. 등의 Org. Chem. 42, 2920-2936 페이지, 1997, 및 Ulrich, J., J. Org. Chem. 40, 802-804 페이지, 1975에 기술된 것처럼 보고되었다.

어떤 생물학적 분석은 화학적으로 합성된 생체 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 또는 올리고당)의 부착을 필요로 한다. 이러한 생체 분자는 유기 용매에서 (염색되지 않은) 마이크로스피어 수지 상에 자동 합성에 의해 생산될 수 있다. 합성된 후, 생체 분자는 지지체로부터 분리되고 수용성 방법을 사용하여 염색된 마이크로스피어에 부착된다. 이러한 공정은 만약 합성이 염색된 마이크로스피어 상에서 직접적으로 실행될 수 있다면 더 간단하고 비용이 저렴할 것이다. 그러나, 현재 사용되는 마이크로스피어는 합성에 사용되는 유기 용매에 노출된다면 염료를 상실하는 경향을 나타낸다. 따라서, "유기저항(organotolerant)" 마이크로스피어, 또는 심지어 유기 용매에 노출되더라도 형광 특성을 보유하는 마이크로스피어가 바람직하다.

유기 용매에 대한 내성이 없는 마이크로스피어에 유기 저항성(organotolerance)을 전달하고자 하는 방법이 개발되었다. 예를 들어, Chandler의 미국 특허 No. 6,528,165는 염색된 마이크로스피어 상에서 형성될 때 유기 저항성을 염색된 마이크로스피어에 전달할 수 있는 실리콘 및 설탕에 기초한 코팅을 기술한다. 또한, 물 또는 수용성 용매에 상대적으로 낮은 용해도를 가지는 (항원 또는 약물 후보와 같은) 다른 분자들은 그 분자와 마이크로스피어 사이의 연결이 알콜성 용매 또는 디메틸 술폭사이드(DMSO) 용매에서 실행된다면 마이크로스피어에 더 쉽게 연결될 것이다.

여러 방법, 개체군(population) 실시 형태에 대한 이하의 설명은 어떠한 방식으로든지 첨부된 청구항을 제한하지 않는다.

일 실시 형태는 염색된 마이크로스피어를 형성하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 마이크로스피어 존재하에 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 염료에 연결될 화학적 구조를 활성화시키는 단계를 포함한다. 상기 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 결합하여 염료를 그 중합체에 연결하고 염색된 마이크로스피어를 형성한다. 비록 그 방법은 하나의 마이크로스피어에 대해서만 기술되지만, 이러한 방법은 다수의 마이크로스피어를 동시에 염색하기 위해서 사용될 수 있다.

일 실시 형태에서, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 110 ℃의 온도로 가열하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 50 ℃ 내지 약 80 ℃의 온도로 가열하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 중합체의 유리 전이 온도 이하로 가열하는 단계를 포함한다. 마이크로스피어는 바람직하게는 화학적 구조의 활성화 전(前)과 후(後)에 실질적으로 동일한 형태를 가진다. 또한, 염료는 바람직하게는 화학적 구조의 활성화 전(前)과 후(後)에 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 조성을 가진다.

바람직하게는, 화학적 구조 및 염료는 염색된 마이크로스피어가 유기 용매에 배치될 때 중합체로부터 떨어지지 않는다. 일 실시 형태에서, 중합체는 본질적으로 디비닐 벤젠(divinyl benzene)과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성된다. 즉 다시 말하면, 중합체는 주로 디비닐 벤젠과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성될 수 있다. 마이크로스피어는 또한 그 표면에 카르복실기 또는 아미노기와 같은 다른 적절한 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 마이크로스피어의 중합화에서 단량체로서 아크릴산 또는 메트아크릴산을 포함함으로써 발생할 수 있다. 일 실시 형태에서, 중합화에 연관된 약 1% 내지 약 10% 단량체는 표면 작용기가 연관된 단량체(surface-group-related monomers)일 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 염색된 마이크로스피어는 중합체 부착되거나 중합체 위에서 합성된 하나 이상의 작용기(예를 들어, 카르복실기,아미노기 등)를 포함하고, 하나 이상의 분자는 그 하나 이상의 작용기를 통해서 염색된 마이크로스피어에 부착될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 화학적 구조는 방향족 술포닐 아지드를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 화학적 구조는 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드(1,5-ethyl-di-amino-naphthalene-sulfonic azide)를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 반응 중간체는 술포닐 니트렌기(sulfonyl nitrene group)를 포함한다. 선택적으로, 반응 중간체는 카르벤기(carbene group) 또는 벤조페논 트리플렛(benzophenone triplet)를 포함할 수 있다.

다른 실시 형태에서, 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분에 의해 염료로부터 분리되는 작용기를 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분의 일측에 위치한 작용기를 포함하고, 염료는 상기 일측의 반대편인 비활성 부분의 다른 측면에 위치한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 마이크로스피어 존재하에 별개의 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 부가적인 별개의 염료에 연결된 보충적인 화학적 구조를 활성화시키는 단계를 포함한다. 별개의 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 결합하고 이로 인해 보충적인 별개의 염료는 중합체에 연결된다. 이러한 일 실시 형태에서, 별개의 염료는 보충적인 화학적 구조의 활성화 전과 후에 동일한 구조 및 조성을 가진다. 이러한 염료는 화학적 구조, 여기 특성(excitation characteristics), 방출 특성 등에서 다른 염료와 서로 다를 수 있다. 별개의 염료를 중합체에 연결하기 위해 사용되는 보충적인 화학적 구조는 원래의 염료를 중합체에 연결하기 위해 사용되는 화학적 구조와 동일할 수도 있고 서로 다를 수도 있다. 두 개의 서로 다른 염료는 중합체에 동시에 또는 연속적으로 연결될 수 있다. 또한, 두 개의 서로 다른 염료는 서로 다른 분량, 비율 또는 농도로 서로 다른 개체군(population)의 마이크로스피어 중합체에 연결될 수 있다. 상기한 본 발명의 각각의 실시 형태는 본 발명에서 기술되는 어떤 다른 단계(들)를 포함할 수 있다.

다른 실시 형태는 분자에 연결된 염색된 마이크로스피어의 형성 방법에 관한 것이다. 그 방법은 마이크로스피어 존재하에 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 염료에 연결될 화학적 구조를 활성화 시키는 단계를 포함한다. 상기 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 결합하여 염료를 그 중합체에 연결하고 염색된 마이크로스피어를 형성한다. 이러한 방법은 또한 염색된 마이크로스피어의 외부 표면에서 분자를 합성하는 단계를 포함한다. 비록 그 방법은 하나의 마이크로스피어에 대해서만 기술되었지만, 다수의 염색된 마이크로스피어를 동시에 형성하기 위해 사용될 수 있고, 그 각각의 염색된 마이크로스피어는 적어도 하나의 분자에 연결될 수 있다. 또한, 비록 그 방법은 하나의 분자에 대하여 기술되었지만, 하나 이상의 서로 다른 분자(예를 들어, 다수의 서로 다른 생체 분자)를 각각의 염색된 마이크로스피어에 연결하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시 형태에서, 분자를 합성하는 단계는 염색된 마이크로스피어를 유기 용매에 배치하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 염색된 마이크로스피어는 합성 전후에 동일한 염료 특성을 가진다. 일 실시 형태에서, 염색된 마이크로스피어의 외부 표면에서 합성된 분자는 생체 분자이다. 다른 실시 형태에서, 그 분자는 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 또는 올리고당을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 염색된 마이크로스피어의 외부 표면에서 합성된 분자는 유기 분자(예를 들어, 약물 후보)이다. 일부 실시 형태에서, 분자는 실질적으로 수용성 용매에 불용성이다. 다른 실시 형태에서, 분자를 합성하는 단계는 염색된 마이크로스피어를 수용성 용매에 배치하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 110 ℃의 온도로 가열하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 50 ℃ 내지 약 80 ℃의 온도로 가열하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 중합체의 유리 전이 온도 이하로 가열하는 단계를 포함한다. 마이크로스피어는 바람직하게는 화학적 구조의 활성화 전(前)과 후(後)에 실질적으로 동일한 형태를 가진다. 또한, 염료는 바람직하게는 화학적 구조의 활성화 전(前)과 후(後)에 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 조성을 가진다.

바람직하게는, 화학적 구조 및 염료는 염색된 마이크로스피어가 유기 용매에 배치될 때 중합체로부터 떨어지지 않는다. 일 실시 형태에서, 중합체는 본질적으로 디비닐 벤젠(divinyl benzene)과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성된다. 즉 다시 말하면, 중합체는 주로 디비닐 벤젠과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성될 수 있다. 일 실시 형태에서, 염색된 마이크로스피어는 중합체 부착된 하나 이상의 작용기(예를 들어, 카르복실기,아미노기 등)를 포함하고, 하나 이상의 분자는 그 하나 이상의 작용기를 통해서 염색된 마이크로스피어에 부착될 수 있고, 또는 그 염색된 마이크로스피어 상에서 합성될 수 있다

일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 마이크로스피어 존재하에 별개의 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 부가적인 별개의 염료에 연결된 보충적인 화학적 구조를 활성화시키는 단계를 포함한다. 별개의 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 결합하고 이로 인해 보충적인 별개의 염료는 중합체에 연결된다. 이러한 일 실시 형태에서, 별개의 염료는 보충적인 화학적 구조의 활성화 전과 후에 동일한 구조 및 조성을 가진다. 이러한 염료는 화학적 구조, 여기 특성(excitation characteristics), 방출 특성 등에서 다른 염료와 서로 다를 수 있다. 부가적인 별개의 염료를 중합체에 연결하기 위해 사용되는 보충적인 화학적 구조는 원래의 염료를 중합체에 연결하기 위해 사용되는 화학적 구조와 동일할 수도 있고 서로 다를 수도 있다. 둘 이상의 서로 다른 염료는 중합체에 동시에 또는 연속적으로 연결될 수 있다. 또한, 둘 이상의 서로 다른 염료는 서로 다른 분량, 비율 또는 농도로 서로 다른 개체군의 마이크로스피어 중합체에 연결될 수 있다. 상기한 본 발명의 각각의 실시 형태는 본 발명에서 기술되는 어떤 다른 단계(들)를 포함할 수 있다.

다른 실시 형태는 염색된 마이크로스피어의 개체군(population)에 관한 것이다. 각각의 염색된 마이크로스피어의 개체군은 화학적 구조에 의해 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 염료를 포함한다. 염료에서 기인한 염색된 마이크로스피어 개체군의 염색 특성에서 변화 계수는 약 10% 이하이다. 일 실시 형태에서, 변화 계수는 각각의 염색된 마이크로스피어의 여기(excitation)에서 각각의 염색된 마이크로스피어에 의해 방출되는 신호의 변화 계수이다. 다른 실시 형태에서, 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 염료의 분량은 실질적으로 동일하다.

일부 실시 형태에서, 각각의 염색된 마이크로스피어 개체군은 별개의 화학적 구조에 의해 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 보충적인 별개의 염료를 포함한다. 이러한 일 실시 형태에서, 보충적인 별개의 염료에 기인한 염색된 마이크로스피어 개체군의 염료 특성의 변화 계수는 약 10% 이하이다. 두 개의 서로 다른 염료는 다른 분량, 비율 또는 농도로 서로 다른 개체군의 마이크로스피어의 중합체에 연결될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 그 각각의 염색된 마이크로스피어의 외부 표면에서 합성된 생체 분자를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 그 각각의 염색된 마이크로스피어의 외부 표면에서 합성된 유기 분자를 포함한다.

다른 실시 형태에서, 각각의 염색된 마이크로스피어는 염료가 중합체에 부착되기 전과 후에 실질적으로 동일한 형태를 가진다. 다른 실시 형태에서, 염료는 그 염료가 중합체에 부착되기 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 동일한 조성을 가진다. 다른 실시 형태에서, 화학적 구조 및 염료는 염색된 마이크로스피어 개체군이 유기 용매에 배치될 때 중합체로부터 떨어지지 않는다.

일 실시 형태에서, 중합체는 본질적으로 디비닐 벤젠(divinyl benzene)과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성된다. 또한, 각각의 염색된 마이크로스피어는 중합체 부착된 하나 이상의 작용기를 포함하고, 하나 이상의 분자는 그 하나 이상의 작용기를 통해서 각각의 염색된 마이크로스피어에 부착될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 화학적 구조는 방향족 술포닐 아지드를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 화학적 구조는 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드(1,5-ethyl-di-amino-naphthalene-sulfonic azide)를 포함한다. 염색된 마이크로스피어 개체군의 각각의 실시 형태는 상기한 것처럼 형상되고, 구성되며 및/또는 형성될 수 있다. 또한, 상기한 것처럼 형성되었지만 하나 이상의 염료를 서로 다른 분량, 비율, 또는 농도로 가진 다수의 개체군은 그 형광 특성(예를 들어, 형광 파장(들), 형광 강도, 또는 형광 강도의 비율)에 의해 서로 간에 구별될 수 있고, 다수의 분석물을 위한 샘플의 다양한 분석과 같은 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 이하의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 더욱 더 명확해질 것이다.

본 발명은 여러 가지 변형 및 대안적인 형태가 가능하지만, 그 특정 실시 형태는 도면의 일 예로서 예시되고 이하에서 상세히 기술될 것이다. 그러나, 도면 및 상세한 설명은 본 발명을 특정 형태로 제한하기 위한 것은 아니며, 오히려 본 발명은 첨부된 청구항에서 청구되는 것처럼 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 모든 변형, 등가물 및 대안들을 포함한다.

비록 본 방법 및 개체군 실시 형태는 형광 염료에 관하여 기술되었지만, 본 발명의 방법 및 개체군은 하나 이상의 측정 가능하고 현저한 특징을 마이크로스피어에 전달하기 위해 사용될 수 있는 관련 분야에 공지된 어떤 다른 분자(들)와 함께 사용되거나 포함할 수 있다. 또한, 많은 서로 다른 형광 염료는 관련 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에서 "형광 염료(fluorescent dye)"라는 용어는 관련 분야에 공지된 모든 형광 염료를 포함하기 위한 것이다.

비록 실시 형태들은 마이크로스피어에 관하여 기술되었지만, 그 실시 형태는 상기한 반응 중간체가 공유적으로 결합할 수 있는 물질로 형성된 관련 분야에 공지된 어떠한 물질(예를 들어, 마이크로스피어, 비드(beads), 입자 등)과 함께 사용되거나 이를 포함할 수 있다.

일반적으로 본 발명에서는 유기 내성(organotolerant)을 가진 염색된 마이크로스피어의 생산 방법이 기술된다. 마이크로스피어는 일반적으로 형광 염료로 염색되고 그 염색된 마이크로스피어는 텍사스의 오스틴에 위치한 Luminex사로부터 상업적으로 구입할 수 있는 Luminex 100 장치 및 관련 분야에 공지된 다른 측정 장치에서 여기원(예를 들어, 레이저 조명)에 노출될 때 선택된 형광 특성(예를 들어, 형광 파장(들), 형광 강도, 형광 강도의 비율 등)을 나타낸다. 상기한 본 발명의 방법에서, 염료는 반응 중간체를 형성하기 위하여 빛 또는 열에 의해 활성화되는 화학적 구조에 연결되고 그 반응 중간체는 화학적 구조가 마이크로스피어의 중합체(예를 들어, 중합체 기질)에 공유적으로 결합되도록 하며 결과적으로 염료를 마이크로스피어의 중합체에 부착한다.

이러한 방법의 일 실시 형태는 마이크로스피어의 존재하에 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 염료에 연결된 화학적 구조를 활성화시키는 단계를 포함한다. 염료가 부착되는 화학적 구조는 그 화학적 구조의 활성화 동안 마이크로스피어 내에 위치할 수 있다. 화학적 구조 및 그 화학적 구조에 연결된 염료는 관련 분야에 공지된 어떠한 적절한 방법을 이용하여 화학적 구조의 활성화 전에 마이크로스피어에 통합될 수 있다. 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 결합되고 그로 인해 염료를 (화학적 구조를 통해서) 중합체에 연결하고 염색된 마이크로스피어를 형성한다. 이러한 방식으로, 염색된 마이크로스피어는 염색된 마이크로스피어의 표면에 위치한 염료에 대비되도록 마이크로스피어 내(예를 들어, 마이크로스피어의 중합체 기질 내)에 위치한 염료를 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 실시 형태는 현재 사용되는 것과는 다른 염료 구조 및 염색 공정을 사용하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 실시 형태는 하나 이상의 화학적 구조에 연결된 하나 이상의 염료를 팽창한 마이크로스피어에 첨가하여 경화시킴으로써(예를 들어, 화학적 구조(들)를 활성화 시켜 마이크로스피어의 중합체와 공유적으로 반응하는 반응 중간체(들)를 형성함으로써) 마이크로스피어에 염료를 영구적으로 고정하는 단계를 포함한다. 화학적 구조 및 그것에 연결된 염료를 화학적 구조의 활성화 전에 마이크로스피어로 통합하기 위해 마이크로스피어를 팽창시키는 것은 참조를 위해 기재된 Chandler 등의 미국 특허 No. 6,514,295, No. 6,599,331, 및 No. 6,632,526에 기술된 것처럼 실행될 수 있다.

상기한 것처럼, 술포닐 아지드는 여러 가지 염료는 천연 및 합성 중합체(필름 또는 섬유)에 공유적으로 부착하기 위해 사용되었다. 그러나, 이러한 화학적 구조는 개체군의 마이크로스피어에 의해 방출되는 형광 신호의 밀한(tight)(즉, 낮은) 변화 계수(%CV)를 제공하기 위해 사용되고 낮은 %CV는 화학적 구조 활성화 및 본 발명의 방법을 이용하는 중합체와의 반응 후에 계속 유지될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 밀한 형광 %CV는 마이크로스피어에 의해 방출되는 형광의 %CV가 정확성에 직접적으로 영향을 미치는 다수 분석물의 샘플의 복합 분석과 같은 용도를 위해 특히 바람직하며, 이러한 정확성으로 마이크로스피어가 속하는 개체군 및 마이크로스피어 상의 반응물은 확인될 수 있다(예를 들어, %CV가 감소함에 따라, 마이크로스피어의 분류 정확성은 증가한다). 또한, 마이크로스피어의 형광 %CV를 감소시키는 것은 어떤 하나의 개체군에 대응하는 분류 공간이 더 작으면 더 많은 마이크로스피어 개체군이 분류 공간에 포함될 수 있기 때문에 일반적으로 더 많은 마이크로스피어 개체군이 단일 분석 또는 실험에 사용되게 한다.

염료에 연결된 술포닐 아지드는 활성화될 수 있으며 활성화된 술포닐 아지드는 마이크로스피어의 중합체와 반응하여 루미넥스(Luminex) 100 장치 및 다른 유식세포분석기(flow cytometer) 뿐만 아니라 마이크로스피어의 측정을 위해 형성된 어떤 다른 측정 장치와 양립할 수 있는 유기 내성(organotolerant) 비드 세트(즉, 유기 용매 또는 유기 용매를 포함하는 용매 혼합물에 노출되더라도 형광 특성(예를 들어, 형광 강도)의 변화를 나타내지 않는 비드 세트)를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 장점 중 하나는 본 발명의 방법으로 염색된 마이크로스피어가 하나 이상의 유기 용매에 노출되더라도 그 형광 특성에 변화(예를 들어, 형광 강도의 감소)를 나타내지 않는다는 것이다. 즉, 다시 말하면 화학적 구조 및 그 화학적 구조에 연결된 염료는 염색된 마이크로스피어가 유기 용매에 배치되거나 또는 유기 용매를 포함하는 용매 혼합물과 접촉할 때 중합체로부터 떨어지지 않고 마이크로스피어로부터 이동하지 않는다.

본 발명의 방법은 또한 술포닐 아지드 및 다른 및/또는 부가적인 반응성 작용기(다른 니트렌, 카르벤 등)가 생기도록 활성화될 수 있는 다른 화학적 구조뿐만 아니라 열 및/또는 광화학 작용에 의해 활성화될 수 있는 화학적 구조를 사용하여 실행될 수 있다. 본 발명에서 기술된 에틸-디-아미노-나프탈렌-술폰산(ethyl-야amino-naphthalene-sulfonic acid)(EDANS)기는 또한 다른 방향족 구조로 보충되거나 치환될 수 있고, 이는 화학적 구조의 활성화 온도를 변경할 수 있다. 이러한 방식으로, 상기한 본 발명의 방법에서 사용되는 화학적 구조는 방향족 술포닐 아지드, 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드, 또는 관련 분야에 알려진 어떤 다른 적절한 화학적 구조를 포함할 수 있다. 즉, 다시 말하면 본 발명의 방법은 EDANS기를 포함하는 화학적 구조를 제외한 화학적 구조로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 실시 형태는 다른 비드 염색법에 관련하여 사용될 수 있다.

마이크로스피어의 염색에 유용하도록, 이하의 일반적인 가이드라인은 화학적 구조 및 염색법의 변수 또는 조건을 선택하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로스피어의 선택된 형광 특성을 획득하기 위하여, 마이크로스피어의 중합체에 부착된 염료의 백분위 수득률은 바람직하게는 실질적으로 일정하고 또한 높다. 샘플 개체군의 마이크로스피어에 의해 방출되는 형광 신호(예를 들어, 어느 하나의 마이크로스피어 개체군이 다른 마이크로스피어 개체군과 구별될 수 있도록 측정 가능한 특색있는 특징을 마이크로스피어에 부여하는 형광 신호)의 분류를 위한 밀한 %CV를 획득하기 위하여, 각각의 화학적 구조는 바람직하게는 공유 결합 후에 실질적으로 한 개체군의 각각의 마이크로스피어의 균일한 염색이 행해지도록 실질적으로 동일한 정도로 활성화된다.

화학적 구조들은 또한 활성화 단계 동안, 마이크로스피어에 통합된 모든 서로 다른 화학적 구조들이 실질적으로 동일한 조건 및 실질적으로 동일한 정도로 반응하도록 선택될 수 있다. 이러한 방식으로, 염색된 마이크로스피어의 특징들(예를 들어, 형광 신호)은 상대적으로 쉽고 정확하게 조절될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서 사용되는 염료의 발색소는 활성화 조건하에서 바람직하게는 안정적이다(예를 들어, 자외선(UV)은 일부 발색소를 과도하게 또는 특이적으로 광표백(photobleach)할 수 있다). 마이크로스피어는 또한 본 발명에서 기술된 방법에서 사용하기 위해 선택된 활성화 조건하에서 안정적이다(예를 들어, 과열은 마이크로스피어를 녹이고 그 구형 형상을 상실하게 할 수 있다).

마이크로스피어의 내부는 본질적으로 디비닐 벤젠과 가교 결합된 폴리스티렌과 같은 중합체로 구성될 수 있으며, 그 중합체는 공유 결합에 대하여 상당히 비활성인 기질이다. 따라서, 화학적 구조는 반응 중간체가 그 화학적 구조 및 화학적 구조에 연결된 염료를 마이크로스피어의 이러한 중합체 및 다른 중합체의 C-H 또는 C-C 결합에 삽입을 유발하도록 충분히 반응성이 있도록 선택될 수 있다. 또한, 마이크로스피어의 표면에 있는 카르복실레이트 및/또는 다른 작용기는 바람직하게는 마이크로스피어의 염색 후에 생체 분자 또는 다른 분자(예를 들어, 유기 분자, 약물 후보 등)에 연결을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 기술된 염색법은 이하에 도시된 1,5-EDANS의 술포닐 아지드 형태와 같은 화학적 구조를 사용하여 실행될 수 있다.

상기 반응의 첫 번째 단계에서 도시된 것처럼, 1,5-EDANS의 자유 아미노기는 1,5-EDANS을 염료 분자에 연결하기 위해 사용된다. 그 염료 분자는 관련 분야에 알려진 어떤 적절한 염료 분자를 포함할 수 있다. 이러한 일 실시 형태에서, 염료는 1,5-EDANS 아지드의 자유 아미노기에 연결될 수 있는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르기, 이소시아네이트기와 같은 아민 반응기를 포함한다. 비록 상기의 실시 형태에서 하나의 염료 분자가 하나의 화학적 구조 분자에 연결되었지만, 하나 이상의 염료 분자가 각각의 화학적 구조 분자에 연결되게 하거나 또는 하나 이상의 화학적 구조가 각각의 염료에 연결되게 하는 화학적 구조들이 다른 실시 형태에서 사용될 수 있다.

이러한 반응의 두 번째 단계에서 도시된 것처럼, 염료에 연결된 1,5-EDANS 아지드는 마이크로스피어의 중합체에 통합될 수 있다(즉, 마이크로스피어의 중합체 기질에 배치될 수 있다). 이러한 두 번째 단계에서 도시된 것처럼, 중합체에 통합된 화학적 구조를 약 110℃의 온도를 가열하는 것은 1,5-EDANS 아지드에 반응성의 술포닐 니트렌기를 만드는 질소 분출 반응을 일으키고, 따라서 마이크로스피어의 중합체와 공유 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 110℃의 온도를 가열하는 단계를 포함할 수 있다.

실질적인 반응 중간체만이 중합성 마이크로스피어의 C-H 결합과 같은 지방성 C-H 결합과 반응할 수 있다. 이러한 반응 중간체의 예로는 카르벤, 니트렌, 및 벤조페논 트리플렛이 있다(예를 들어, 참조를 위해 기재된 형광 프로프 및 연구 결과물의 분자 프로프 핸드북(Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products), 9판, R.P. Haugland, Ed. sec 5.3 참조). 따라서, 본 발명의 방법 중에서 형성된 반응 중간체는 니트렌기, 카르벤기, 벤조페논 트리플렛, 또는 관련 분야에 알려진 어떤 적절한 작용기를 포함할 수 있다. 벤조페논은 단지 UV로만 활성화된다.

대부분의 니트렌 및 카르벤은 상대적으로 빠른 단분자층 재배열 반응을 받으며, 그 니트렌 및 카르벤 상대물보다 덜 반응적인 종(species)를 생산한다. 따라서, 이러한 반응 중간체는 바람직하게는 염색될 마이크로스피어 존재하에(예를 들어, 마이크로스피어에 통합된 후에) 형성되고, 그 결과 이러한 작용기들은 단분자층 반응이 발생하기 전에 마이크로스피어(들)의 중합체와 반응할 수 있다. 그러나, 술포닐 아지드는 단분자층 재배열 반응을 받지 않으므로 술포닐 아지드 존재하에 마이크로스피어의 중합체와 같은 분자와 "피할 수 없이" 반응하게 된다.

본 발명의 일 실시 형태에서 이러한 화학적 구조를 사용함으로써 이미 존재하는 염색법 및 이미 사용되는 염료에 비해 다수의 장점을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시 형태에서 활성화에 의해 화학적 구조에 생긴 반응기는 염색 발색소의 일부가 아니다. 따라서, 그 반응기의 반응성은 부착된 염료의 구조와는 관계가 없으므로 유기 내성의 염색된 마이크로스피어를 생산하기 위해 사용될 수 있는 형광 염료의 수 및 형태를 증가시킨다. 또한, 반응기는 각 염료를 위해 새로운 합성을 계획할 필요없이 많은 서로 다른 염료에 연결될 수 있는 화학적 구조에 통합될 수 있다. 또한, 1,5-치환된 나프탈렌 코어는 반응성 술포닐 니트렌이 염료 분자로부터 멀리 떨어져(즉, 거리를 두고) 위치하게 함으로써 그 니트렌이 마이크로스피어의 중합체 가닥 대신 부착된 염료와 반응할 기회를 줄이고 최소화한다. 이러한 방식으로, 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분에 의해 염료로부터 분리된 작용기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분의 일측에 위치한 작용기를 포함한다. 염료는 비활성 부분의 다른 방향, 즉 반대 방향에 위치할 수 있다.

또한, 중간체 니트렌은 현재 사용되는 마이크로스피어의 중합체의 유리 전이 온도 및 현재 사용되는 염료의 분해 온도보다 실질적으로 낮은 약 110℃로 이상의 온도로 화학적 구조를 가열함으로써 발생할 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 화학적 구조를 활성화 시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 중합체의 유리 전이 온도 이하의 온도로 가열하는 단계를 포함한다. 염색될 마이크로스피어는 화학적 구조의 활성화 전과 후에 동일한 형태(예를 들어, 구형)를 가질 것이다.

구조-반응성 관계 및 공유 결합 염색에 대한 영향은 이상적인 반응성 염료(즉, 염료에 연결된 화학적 구조)의 개발을 위해 조사될 것이다. 예를 들어, 술포닐 아지드 방향족 링을 변경하는 것은 염색된 마이크로스피어에 실행될 측정에서 최소 스펙트럼 간섭으로 더 낮은 온도에서 반응하는 화학적 구조를 제공할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 나프탈렌 링에 대한 보충적인 치환은 반응 온도를 본 발명에서 기술한 실시 형태에서 이상적일 수 있는 온도(예를 들어, 약 50℃ 내지 80℃의 온도)로 줄일 수 있다. 이러한 방식으로, 화학적 구조를 활성화시키는 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 50℃ 내지 80℃의 온도로 가열하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 반응을 설계하는 것은 술포닐 아지드의 반응 모드를 결정함으로써 실행될 수 있다(모든 반응이 공유 결합을 유도하는 것은 아니다). 예를 들어, 아지드 용액은 톨루엔 용액에서 가열될 수 있고(폴리스티렌의 단순 방식), 생성물은 분리되고 특징지워질 수 있다.

이하의 도식은 염료에 연결된 화학적 구조를 생산하기 위해 사용되었던 본 발명의 방법에 유용한 합성 반응을 개략적으로 나타낸다.

상기한 반응은 염료에 연결된 술포닐 아지드를 생산한다. 상기 실시 형태에서 염료 분자는 여기(exitation)되자마자 루미넥스(Luminex)100 장치의 분류 채널 1(CL1)의 검색창에 형광 파장 또는 파장들을 방출하는 염료 분자이다. 그러나, 관련 분야에 알려진 어떤 적절한 염료도 상기한 화학적 구조에 연결될 수 있다. 비록 상기한 실시 형태에서 하나의 염료 분자만이 하나의 화학적 구조에 연결되었지만, 하나 이상의 염료 분자가 각각의 화학적 구조 분자에 연결되거나 또는 하나 이상의 화학적 구조가 각각의 염료에 연결되는 화학적 구조는 본 발명의 실시 형태에서 사용될 수 있다.

마이크로스피어는 상기한 반응에 의해 생산된 염료에 연결된 술포닐 아지드로 염색된다. 가열 후에, 비처리된 염료는 마이크로스피어로부터 테트라하이드로퓨란(THF) 및 메탄올로 세착된다. 마이크로스피어의 세척은 관련 분야에 알려진 어떤 적절한 방법으로 실행될 수 있다. 루미넥스(Luminex) 100 장치로 측정된 염색된 마이크로스피어의 CL1/분류 채널 2(CL2) 산점도(scatterplot)는 도 1에 도시되어 있다. 도 1에 도시된 것처럼, 이러한 실험의 결과로부터 방향족 술포닐 아지드는 염료에 연결된 그 방향족 아지드가 통합되는 염색된 건조한 마이크로스피어를 단순히 가열함으로써 형광 염료를 폴리스티렌 중합체에 부착하기 위해 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 결과적으로 생성된 비드 개체군은 8%의 CL1에 대한 %CV를 가졌다.

일부 실시 형태에서, 상기한 염색법은 마이크로스피어(들)의 존재하에 서로 다른 중간체를 형성하기 위해 열 또는 빛을 이용하여 부가적인 별개의 염료에 연결된 별개의 화학적 구조를 활성화시키는 단계를 포함한다. 별개의 반응 중간체는 마이크로스피어(들)의 중합체에 공유적으로 결합함으로써 부가적인 별개의 염료를 중합체에 연결한다. 부가적인 화학적 구조는 다른 염료에 연결된 화학적 구조와 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들어, 두 개의 모든 염료는 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드 분자에 연결될 수 있다. 선택적으로, 서로 다른 염료는 서로 다른 방향족 술포닐 아지드에 연결될 수 있다. 부가적인 별개의 염료는 바람직하게는 화학적 구조의 활성화 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 조성을 가진다. 이러한 방식으로, 화학적 구조의 활성화 및 마이크로스피어에 대한 화학적 구조의 부착은 염료를 변경하지 않을 것이다. 두 개의 서로 다른 염료는 중합체에 동시에 또는 순차적으로 연결될 수 있다. 또한, 두 개의 서로 다른 염료는 서로 다른 분량, 비율 또는 농도로 서로 다른 개체군의 마이크로스피어의 중합체에 연결될 수 있다. 또한, 두 개 이상의 서로 다른 염료는 상기한 방법을 이용하여 마이크로스피어에 연결될 수 있다.

마이크로스피어의 표면에 공유적으로 연결된 올리고서열(oligosequences)을 가진 이러한 방법으로 생성된 유기 내성 비드는 복합 혼성화 분석을 위한 용도로 상당한 관심을 받고 있다. 특히, 올리고뉴클레오티드는 유기 내성의 염색된 마이크로스피어 상에서 직접적으로 (및 가능하게는 자동적으로) 합성될 수 있다. 형광 마이크로스피어 상에서 직접적인 (및 선택적으로 자동적인) 올리고-합성은 DNA 합성 수지 상에 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계, DNA 합성 수지로부터 올리고뉴클레오티드를 "분리"하는 단계, 및 그 올리고뉴클레오티드를 형광 염색된 마이크로스피어에 "부착"하는 단계를 포함하는 현재 사용되는 뉴클레오티드-연결 마이크로스피어의 제조 방법에 비해 그 마이크로스피어의 제조 비용을 줄일 것이다. 올리고뉴클레오티드는 관련 분야에 공지된 어떠한 적절한 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 사용하여 상기한 실시 형태의 방법에 따라 형성된 마이크로스피어의 표면 상에서(예를 들어, 마이크로스피어의 표면에 있는 작용기를 통해서) 합성될 수 있다.

따라서, 일 실시 형태에서 본 발명의 방법은 마이크로스피어(들)가 상기한 것처럼 염색된 후에 그 마이크로스피어(들)의 외부 표면 상에서 분자를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 분자를 합성하는 단계는 염색된 마이크로스피어를 유기 용매 또는 유기 용매를 포함하는 용매 혼합물에 배치하는 단계를 포함한다. 다른 염색된 마이크로스피어와 달리, 본 발명의 마이크로스피어는 유기 용매에 배치될 때 염료 특성을 상실하지 않을 것이다. 이러한 것처럼, 염색된 마이크로스피어는 합성 전과 후에 실질적으로 동일한 염료 특성을 가질 것이다. 마이크로스피어(들) 상에서 합성된 분자는 생체 분자일 수 있다. 예를 들어, 생체 분자는 부착 반응이 유기 용매에서 실행된다면 형광 마이크로스피어에 더 쉽게 부착될 수 있는 관련 분야에 알려진 수용성이 낮은 어떠한 생체 분자일 수 있다. 또한, 그 생체 분자는 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 또는 올리고당을 포함할 수 있다. 마이크로스피어(들) 상에서 합성된 올리고뉴클레오티드, 펩티드 및 올리고당은 관련 분야에 공지된 어떠한 적절한 분자를 포함할 수 있다.

다른 실시 형태에서, 생체 분자는 유기 분자(예를 들어, 약물 후보)를 포함할 수 있다. 따라서, 약물 발견에 기초한 유전체학을 위한 성공적인 시약은 본 발명에서 기술된 공유적으로 염색된 마이크로스피어를 사용하여 생성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생체 분자는 실질적으로 수용성 용매에 불용성인 어떠한 분자를 포함할 수 있다.

선택적으로, 생체 분자의 합성은 염색된 마이크로스피어를 수용성 용매에 배치하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 그 분자는 수용성 용매 및 유기 용매 둘 다에서 상기한 것처럼 염색된 마이크로스피어 상에서 합성될 수 있으므로 실질적으로 마이크로스피어의 유용성을 증가시킨다. 명백하게도, 미리 합성된 분자는 또한 관련 분야에 공지된 어떤 적절한 방법을 사용하여 본 발명에서 기술된 염색된 마이크로스피어에 부착될 수 있다.

다른 실시 형태는 염색된 마이크로스피어의 개체군에 관한 것이다. 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 화학적 구조에 의해 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 염료를 포함한다. 그 염료 및 화학적 구조는 본 발명에서 기술된 어떤 염료 및 화학적 구조를 포함할 수 있다. 염료에 기인하는 염색된 마이크로스피어의 개체군의 염료 특성의 변화 계수는 약 10% 보다 작다. 상기 변화 계수는 각각의 염색된 마이크로스피어가 여기되자마자 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어로부터 방출된 신호(예를 들어, 형광 강도)의 변화 계수일 수 있다. 이러한 방식으로, 변화 계수는 염색된 마이크로스피어의 분류 신호에서 변화 계수일 수 있다. 염료는 다른 분량 또는 농도로 별개의 개체군의 마이크로스피어의 중합체에 연결될 수 있다.

일 실시 형태에서, 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 염료의 양은 실질적으로 동일하다. 일부 실시 형태에서, 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 또한 부가적인 화학적 구조에 의해 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 부가적인 별개의 염료를 포함한다. 이러한 일 실시 형태에서, 부가적인 별개의 염료에 기인하는 염색된 마이크로스피어의 개체군의 염료 특성에서의 변화 계수는 약 10% 보다 작다. 두 개의 서로 다른 염료는 서로 다른 개체군의 마이크로스피어의 중합체에 서로 다른 분량, 비율 또는 농도로 연결될 수 있다. 또한, 둘 이상의 서로 다른 염료는 서로 다른 분량, 비율 또는 농도로 서로 다른 개체군의 마이크로스피어의 중합체에 연결될 수 있다.

각각의 염색된 마이크로스피어는 바람직하게는 염료가 중합체에 부착되기 전과 후에 실질적으로 동일한 형상을 가진다. 또한, 염료는 그 염료가 중합체에 부착되기 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 조성을 가진다. 바람직하게는, 화학적 구조 및 염료는 염색된 마이크로스피어의 개체군이 유기 용매에 배치될 때 중합체로부터 분리되지 않는다. 화학적 구조는 방향족 술포닐 아지드를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 화학적 구조는 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드를 포함할 수 있다. 그러나, 화학적 구조는 본 발명에서 기술된 어떤 다른 적절한 구조를 포함할 수 있다.

중합체는 디비닐 벤젠과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성될 수 있다. 마이크로스피어의 중합체는 또한 관련 분야에 알려진 어떤 적절한 중합체이거나 또는 선택적으로 포함할 수 있다. 마이크로스피어는 또한 그 마이크로스피어의 표면에 카르복실기 또는 아미노기와 같은 다른 적절한 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 마이크로스피어의 중합화에서 단량체로서 아크릴산 또는 메트아크릴산을 포함함으로써 마이크로스피어의 표면에 형성될 수 있다. 일 실시 형태에서, 중합화 반응에 연관된 약 1% 내지 약 10%의 단량체는 표면 작용기와 연관된 단량체일 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 염색된 마이크로스피어는 중합체에 부착된 하나 이상의 작용기(예를 들어, 카르복실기, 아미노기 등)을 포함하고 하나 이상의 분자는 상기의 하나 이상의 작용기를 통해서 염색된 마이크로스피어에 부착될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 그 외부 표면에 합성된 생체 분자를 포함할 수 있다. 생체 분자는 상기한 어떤 생체 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 그 외부 표면에 합성된 유기 분자를 포함할 수 있다. 유기 분자는 상기한 어떤 적절한 유기 분자를 포함할 수 있다. 상기한 염색된 마이크로스피어의 개체군의 각각의 실시 형태는 상기한 것처럼 배열되고, 구성되며 및/또는 형성될 수 있다. 또한, 상기한 염색된 마이크로스피어의 개체군의 실시 형태는 상기한 실시 형태의 방법의 모든 장점을 가진다.

도 1은 본 발명에서 기술된 방법 실시예에 의해 염색된 마이그로스피어에 대한 루미넥스(Luminex) 100 장치의 분류 채널 1(CL1)/분류 채널 2(CL2)에 의해 생성된 신호의 좌표를 도시한 도면.

도 2는 본 발명에서 기술된 방법에 의해 형성된 마이크로스피어 및 마이크로스피어 개체군을 사용하여 실험을 수행하는데 사용될 수 있는 측정 시스템의 한 예를 나타내는 개략도.

이하의 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며 단지 예시의 목적으로 기술된다. 이하의 실시예에 기술된 모든 시약은 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)에서 구입된 것이고(그렇지 않은 경우 주를 달았다) 구입하자마자 사용되었다.

실시예 1 : N-(

- 카르복시헥실 )-2,3,3- 트리메틸인돌리니움 요오드화물(N-(

-carboxylhexyl)-2,3,3-trimethylindolinium iodide )

20 mL의 아세토니트릴의 2,3,3-트리메틸인돌레닌 2.45 g(15.4 mmole)을 6-브로모헥사노익산(6-bromohexanoic acid) 3.00 g에 첨가한 다음, 그 용액을 환류하에 14시간 동안 가열하였다. 진공에서 농축한 후에, 잔류물을 탈이온수 100 mL 및 에틸 아세테이트 25 mL에 넣었다. 수용성 부분을 에틸 아세테이트 25 mL로 2번 더 세척하였다. 수용성 부분을 진공에서 농축한 후, 건조한 디에틸 에테르 50 mL를 그 잔류물에 첨가하였다. 4℃에서 이틀 후에, 여과에 의해 자줏빛 고체로서 N-(

-카르복시헥실)-2,3,3-트리메틸인돌리니움 요오드화물 1.62 g(30%)를 획득하였다.

실시예 2 : 2,4-비스[N-(

- 카르복시헥실 )-1,3,3- 트리메틸 -2- 인돌리닐리덴 -메틸] 시클로부텐디일리움 -1,3- 디올레이트 (2,4- bis [N-

- carboxyhexyl )-1,3,3- trimethyl -2- indolinylidene - methyl ] cyclobutenediylium -1,3- diolate )

톨루엔 25 mL 및 부탄올 25 mL에 존재하는 (실시예 1에서 제조된) N-(

-카르복시헥실)-2,3,3-트리메틸인돌리니움 요오드화물 0.80 g(2.25 mmole) 및 3,4-디히드록시-3-시클로부텐-1,2-디온(3,4-dihydroxy-3-cyclobutene-1,2-dione) 0.13 g(1.12 mmole)의 용액을 Dean-Stark 트랩으로 15시간 환류시켰다. 상기 용액을 진공에서 농축하였고, 잔류물을 클로로포름에서 0-5% 메탄올로 용리되는 클로로포름으로 채워진 실리카 겔 컬럼 슬러리에 충전하였다. 푸른색의 분획을 진공에서 농축하여 푸른색의 오일을 생산하였다. 상기 푸른색의 오일을 무수 에탄올 10 mL에 용해하고 진공에서 농축하여 금빛의 고체 0.44 g(31%)를 생산하였다.

실시예 3 : tert - 부톡시카르보닐(t-BOC)로 보호되는 1,5- EDANS

메탄올 50 mL에 존재하는 5-(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌술폰산(1,5-EDANS, 7.42 mmole) 1.98 g 및 중탄산나트륨(33.0 mmole) 2.78 g을 디-tert-부틸디카르보네이트(16.4 mmole) 3.59 에 첨가하고 초음파 세척기(bath soniator)로 5시간 동안 혼합하였다. 여과 후에, 상기 용액을 진공에서 농축하고 잔류물을 헥산 20 mL를 사용하여 가루로 만들어 여과 후에 황갈색 고체로서 t-BOC로 보호되는 1,5-EDANS 2.92 g을 제공하였다.

실시예 4 : t- BOC 로 보호되는 1,5- EDANS 아지드

(실시예 3에서 제조된) t-BOC로 보호되는 1,5-EDANS 1.55 g(4.0 mmole)을 탈이온수 10 mL에 첨가하였다. 모든 고체를 용해한 후, 40% 테트라부틸암모늄 수산화물 2.7 mL(4.1 mmole)를 첨가하였다. 혼합물을 클로로포름으로 추출하고, (무수) 황산 마그네슘으로 건조시킨 다음 진공에서 농축하여 결정화 거품을 만들었다. 클로로포름 100 mL에 용해된 상기 거품에 디메틸포름아미드 120 ㎕ 및 티오닐 클로라이드(thionyl chloride) 4 mL를 첨가하였다. 3.5 시간 동안 환류시킨 후에, 그 용액을 얼음 20 g 및 (포화된) 염화 암모늄 10 mL에 부었다. 생성된 용액을 클로로포름으로 재빨리 추출하고, (무수) 황산 마그네슘으로 건조시킨 다음 진공에서 농축하여 정제하지 않고 바로 사용할 수 있는 진한 노란색 오일인 t-BOC로 보호되는 1,5-EDANS 클로라이드 2.67 g를 수득하였다.

디메틸포름아미드 22 mL에 용해된 상기 노란색 오일에 소디움 아지드 0.38 g(5.8 mmole) 및 탈이온수 1 mL로 만들어진 용액을 5분 동안 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 21.5 시간 동안 교반한 후, 그 용액을 클로로포름 50 mL로 취해 진공 에서 농축하고, 탈이온수로 세척한 다음 무수 황산 마그네슘으로 건조하며 진공에서 농축하여 t-BOC로 보호되는 1,5-EDANS 아지드 0.68 g(43%)를 수득하였다.

실시예 5 : 1,5- EDANS 아지드

염화 메틸렌 10 mL에 존재하는 (실시예 4에서 제조된) t-BOC로 보호되는 1,5-EDANS 아지드 0.2 g(0.51 mmole)에 0℃에서 염화 메틸렌 1 mL에 존재하는 트리플루오로아세트산 65 ㎕를 5분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 교반된 용액을 16시간 동안 실온으로 가열하였고 1시간 동안 환류시켰다. 그 용액을 염화 메틸렌 40 mL로 희석하였고 포화된 중탄산나트륨 10 mL로 네 번 세척한 다음 진공에서 농축하여 노란색 오일인 1,5-EDANS 아지드 0.16 g을 수득하였다.

실시예 6

클로로포름 2 mL에 존재하는 (실시예 5에서 제조된) 1,5-EDANS 아지드 12 ㎎(0.04 mmole) 및 (실시예 2에서 제조된) 2,4-비스[N-(

-카르복시헥실)-1,3,3-트리메틸-2-인돌리닐리덴-메틸]시클로부텐디일리움-1,3-디올레이트 13 ㎎(0.02 mmole)에 디시클로헥실카로브디이미드(dicyclohexylcarbodiimide) 18 ㎎(0.09 mmole) 및 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole) 3.5 ㎎을 첨가하였다. 15시간 동안 교반한 후, 용액을 여과하였고, 여과물을 진공에서 농축하여 정제없이 사용되는 푸른색 잔류물을 수득하였다.

실시예 7 : 유기 내성( organotolerant ) 마이크로스피어

카르복실화된 가교 결합된 폴리스티렌 마이크로스피어(직경 5.6 ㎛, Polymer Laboratories, Ltd., Shropshire, United Kingdom, 또는 Bangs Laboratories, Inc., Fishers, Indiana로부터 구입 가능)를 Chandler 등의 미국 특허 No. 6,514,295, No. 6,599,331, 및 No. 6,632,526에 기술된 공정을 이용하여 실시예 6에서 제조된 푸른색 잔류물로 포화시켰다.

5 mL 원뿔형 플라스크에서 메탄올에 염색된 마이크로스피어를 분산시키고 진공에서 농축하였다. 질소 대기하에서 마이크로스피어를 오일 수조(oil bath)에서 110℃로 13시간 동안 가열하였다. 그런 다음 마이크로스피어를 테트라하이드로퓨란으로 세 번, 메탄올로 한 번 및 탈이온수로 한 번 세척하였다. 세척수는 원심분리 및 디켄팅(decantation)으로 제거하였다. 마지막으로 저장 및 테스트를 위해 마이크로스피어를 탈이온수에 저장하였다.

도 2는 본 발명에서 기술된 염색된 마이크로스피어를 이용한 실험을 실행하기 위해 사용될 수 있는 측정 장치의 일 예이다. 도 2는 일정한 비율로 도시된 것은 아니다. 특히, 도면에서 일부 구성 부분의 크기는 그 구성 부분을 강조하기 위하여 실제보다 크게 도시하였다. 디지털 신호 처리기(DSP)와 같은 일부 구성 부분은 명확히 하기 위하여 도면에 포함시키지 않았다.

도 2에서, 측정 장치는 마이크로스피어(10)가 흐르는 큐벳(12)의 단면에 따른 면을 따라 도시되었다. 상기 마이크로스피어(10)는 본 발명의 실시 형태에 따라 염색된 마이크로스피어이다. 일 실시 형태에서, 큐벳은 표준 유식세포분석기(flow cytometer)에서 사용되는 것과 같은 표준 석영 큐벳일 수 있다. 그러나, 검사 또는 수송 챔버는 적절한 것이라면 어떤 형태이든 간에 분석용 샘플을 전달하기 위해 사용될 수 있다.

상기 측정 장치는 광원(14)을 포함한다. 상기 광원(14)은 레이저와 같은 관련 분야에 공지된 적절한 광원을 포함할 수 있다. 광원은 청색빛 또는 녹색빛과 같은 하나 이상의 파장을 가진 빛을 방출하도록 형성될 수 있다. 광원(14)은 마이크로스피어가 큐벳을 통과하여 흐를 때 그 마이크로스피어를 비추도록 형성될 수 있다. 빛의 조사(illumination)는 마이크로스피어가 하나 이상의 파장 또는 파장 밴드를 가진 형광 빛을 방출하도록 유도한다. 일부 실시 형태에서, 상기 측정 장치는 광원으로부터의 빛을 마이크로스피어 또는 유로형상(flowpath)에 집중시키기 위한 하나 이상의 렌즈(도시하지 않음)를 포함할 수 있다. 상기 측정 장치는 또한 하나 이상의 광원을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 광원은 서로 다른 파장을 가진 빛(예를 들어, 청색빛 및 녹색빛)으로 마이크로스피어를 비추도록 형성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 광원은 마이크로스피어를 서로 다른 방향에서 비추도록 형성될 수 있다.

마이크로스피어로부터 전방으로 산란한 빛은 폴드형 거울(18) 또는 빛의 방향을 변화시키는 다른 구성 요소에 의해 검출 장치(16)로 향하게 된다. 선택적으로, 상기 검출 장치(16)는 전방으로 산란한 빛의 방향의 일직선에 배치될 수 있다. 이러한 방식으로, 폴드형 거울 또는 빛의 방향을 변화시키는 다른 구성 요소는 측정 장치에 포함되지 않을 수 있다. 일 실시 형태에서, 전방으로 산란한 빛은 도 2에 도시된 것처럼, 광원(14)에 의한 빛의 조사 방향으로부터 약 180 도 정도의 각도에서 마이크로스피어에 의해 산란된 빛일 수 있다. 전방으로 산란한 빛의 각도는 광원에 의한 빛의 조사 방향에 정확히 180 도가 될 수 없으며 광원으로부터의 입사 빛은 검출 장치의 감광성 표면에 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 전방으로 산란한 빛은 광원에서 조사된 빛의 방향으로부터 180도 보다 작거나 큰 각도에서 마이크로스피어에 의해 산란된 빛(예를 들어, 약 170도, 약 175도, 약 185도, 또는 약 190도에서 산란된 빛)일 수 있다.

광원에서 조사된 빛의 방향으로부터 약 90도의 각도에서 마이크로스피어에 의해 산란되거나 및/또는 방출된 빛 역시 수집될 수 있다. 일 실시 형태에서, 이러한 산란된 빛은 하나 이상의 광선분산기(beam splitter) 또는 색선별거울(dichroic mirror)에 의해 하나 이상의 광선(beams)으로 분산될 수 있다. 예를 들어, 빛의 조사 방향에 대하여 약 90도의 각도에서 산란된 빛은 광선분산기(20)에 의해 두 개의 서로 다른 광선으로 분리될 수 있다. 두 개의 서로 다른 광선은 또 다른 광선분산기(22, 24)에 의해 다시 분리되어 네 개의 서로 다른 광선을 생산한다. 각각의 광선은 하나 이상의 검출기를 포함하는 서로 다른 검출 장치로 향하게 된다. 예를 들어, 네 개의 광선 중 하나는 검출 장치 중 어느 하나의 검출 장치(26)로 향할 수 있다. 상기 검출 장치(26)는 마이크로스피어에 의해 산란된 빛을 검출하도록 형성될 수 있다.

다른 세 개의 광선들도 각각의 검출 장치(28, 30, 32)로 향하게 된다. 상기 검출 장치들(28, 30, 32)은 마이크로스피어에 의해 방출된 형광을 검출하도록 형성될 수 있다. 각각의 검출 장치는 서로 다른 파장 또는 서로 다른 영역의 파장의 형광을 검출하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 검출 장치 중 어느 하나는 녹색 형광을 검출하도록 형성될 수 있다. 다른 검출 장치는 또한 노랑-오렌지색 형광을 검출 하도록 형성될 수 있고, 다른 검출 장치는 적색 형광을 검출하도록 형성될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 스펙트럼 필터들(34, 36, 38)은 각각의 측정 장치(28, 30, 32)에 연결될 수 있다. 상기 스펙트럼 필터는 검출 장치가 검출하고자 하는 특정 파장의 형광을 제외한 다른 형광을 차단하도록 형성될 수 있다. 또한, (도시하지 않은) 하나 이상의 렌즈는 각각의 검출 장치에 광학상으로 연결될 수 있다. 상기 렌즈는 산란된 빛이나 방출된 형광을 검출기의 감광성 표면에 집중시키도록 형성될 수 있다.

검출기의 출력 전류는 그 검출기에 영향을 미치는 형광에 비례하고 전류 펄스를 생산한다. 상기 전류 펄스는 전압 펄스로 전환되고, 저대역으로 필터링되며, A/D 변환기에 의해 디지털화된다. ADSP는 형광의 크기를 나타내는 숫자를 제공하기 위해 펄스 이하의 영역을 적분한다.

일부 실시 형태에서, 마이크로스피어에 의해 방출된 형광에서 발생한 출력 신호는 마이크로스피어의 정체 및 그 마이크로스피어의 표면에서 발생하였거나 발생한 반응에 관한 정보를 측정하기 위해 처리될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 출력 신호는 마이크로스피어의 정체를 결정하기 위해 사용될 수 있고, 다른 출력 신호는 마이크로스피어의 표면에서 발생하였거나 발생한 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 마이크로스피어의 정체는 둘 이상의 서로 다른 검출창에서 발생한 출력 신호의 비율에 기초하여 결정될 수 있다.

비록 도 2는 서로 다른 염료 특성을 가진 마이크로스피어를 구별하기 위한 두 개의 서로 다른 검출창을 가진 두 개의 검출 장치를 포함하도록 도시되었지만, 본 발명의 측정 장치는 둘 이상의 이러한 검출창(즉, 3개의 검출창, 4개의 검출창 등)을 포함할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 상기 측정 장치는 광선분사기 및 다른 검출창을 가진 검출 장치를 부가적으로 더 포함할 수 있다. 또한, 스펙트럼 필터 및/또는 렌즈는 각각의 보충 검출 장치에 연결될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 측정 장치는 마이크로스피어의 표면에서 반응한 서로 다른 물질을 구별하기 위해 형성된 둘 이상의 검출 장치를 포함할 수 있다. 서로 다른 반응 물질은 마이크로스피어의 염료 특성과는 서로 다른 염료 특성을 가질 수 있다.

본 발명에서 기술된 표면이 변형된 마이크로스피어에 대한 측정을 실행하기 위해 사용될 수 있는 측정 장치의 다른 예는 Chandler 등의 미국 특허 No. 5,981,180, Chandler의 미국 특허 No.6,046,807, No.6,139,800, No.6,366,354 B1, No.6,411,904 B1, Chandler 등의 미국 특허 No.6,449,562 B1 및 No.6,524,793에 기술되어 있다. 본 발명의 측정 장치는 또한 상기 특허에 기술된 것처럼 형성될 수 있다. 또한, 본 발명에 기술된 마이크로스피어 실시 형태가 사용될 수 있는 검사 및 실험은 상기 특허에 기술된 어떤 검사 및 실험 및 관련 분야에 공지된 어떤 다른 검사 및 실험을 포함할 수 있다.

본 발명에 관한 지식을 가지고 있는 관련 분야의 숙련된 자는 본 발명이 마이크로스피어의 표면 특성을 변경하는 방법을 제공한다는 것을 인식할 것이다. 관련 분야의 숙련된 자는 본 발명의 상세한 설명으로부터 다수의 변형 및 다른 실시 형태가 가능함을 알 것이다. 따라서, 이러한 상세한 설명은 단지 본 발명을 설명하고 예시하기 위한 것이며 관련 분야의 숙련된 자에게 본 발명의 목적을 설명하기 위한 것이다. 본 명세서에 기술된 발명의 형태는 현재 바람직한 실시 형태로 취급되는 것이다. 구성 요소 및 물질들은 본 발명에서 기술된 것들로 치환될 수 있고, 공정은 역전될 수 있으며, 본 발명의 어떤 특징들은 독립적으로 활용될 수 있다. 이러한 모든 사항은 관련 분야의 숙련된 자에게는 명확한 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 구성 요소의 변화는 첨부된 청구항에 기술되어 있다.

Claims

마이크로스피어의 존재하에 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 염료에 연결된 화학적 구조를 활성화시키는 활성화 단계를 포함하는 염색된 마이크로스피어의 형성 방법에 있어서,

상기 반응 중간체는 마이크로스피어 내의 중합체에 공유적으로 부착됨으로써 염료를 상기 중합체에 연결시켜 염색된 마이크로스피어를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 활성화 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 110 ℃까지 가열하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 활성화 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 50 ℃ 내지 약 80 ℃까지 가열하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 활성화 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 중합체의 유리 전이 온도 이하의 온도까지 가열하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 마이크로스피어는 상기 활성화 단계의 전과 후에 실질적으로 동일한 형상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 염료는 상기 활성화 단계 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 조성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 화학적 구조 및 염료는 상기 염색된 마이크로스피어가 유기 용매 내에 배치될 때 중합체로부터 분리되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 중합체는 본질적으로 디비닐 벤젠과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 염색된 마이크로스피어는 중합체에 부착된 하나 이상의 작용기를 포함하고, 하나 이상의 분자는 상기 하나 이상의 작용기를 통해서 염색된 마이크로스피 어에 부착될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 화학적 구조는 방향족 술포닐 아지드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 화학적 구조는 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 반응 중간체는 술포닐 니트렌기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 반응 중간체는 카르벤기 또는 벤조페논 트리플렛을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분에 의해 염료로부터 분리되는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분의 일측에 위치한 작용기를 포함하고, 상기 염료는 실질적으로 상기 일측의 반대인 비활성 부분의 다른 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 마이크로스피어 존재하에 별개의 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 부가적인 별개의 염료에 연결된 부가적인 화학적 구조를 활성화 시키는 단계를 더 포함하고, 상기 별개의 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 부착되어 부가적인 별개의 염료를 중합체에 연결하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서,

상기 부가적인 별개의 염료는 상기 활성화 단계 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 조성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
마이크로스피어 존재하에 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 염료에 연결된 화학적 구조를 활성화시키는 활성화 단계로서, 상기 반응 중간체는 마이크로스피어 내의 중합체에 공유적으로 부착됨으로써 염료를 상기 중합체 에 연결시켜 염색된 마이크로스피어를 형성하는, 활성화 단계; 및

상기 염색된 마이크로스피어의 외부 표면상에 분자를 합성하는, 합성 단계;를 포함하는 분자에 연결된 염색된 마이크로스피어의 형성 방법.
제18항에 있어서,

상기 합성 단계는 염색된 마이크로스피어를 유기 용매에 배치하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 합성 단계는 염색된 마이크로스피어를 유기 용매에 배치하는 단계를 포함하고, 상기 염색된 마이크로스피어는 상기 합성 단계의 전과 후에 실질적으로 동일한 염료 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 분자는 생체 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 분자는 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 또는 올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 분자는 유기 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 분자는 수용성 용매에 실질적으로 불용성인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 합성 단계는 염색된 마이크로스피어를 수용성 용매에 배치하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 활성화 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 110 ℃까지 가열하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 활성화 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 약 50 ℃ 내지 약 80 ℃까지 가열하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 활성화 단계는 염료에 연결된 화학적 구조를 중합체의 유리 전이 온도 이하의 온도까지 가열하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 마이크로스피어는 상기 활성화 단계의 전과 후에 실질적으로 동일한 형상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 염료는 상기 활성화 단계 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 조성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법
제18항에 있어서,

상기 화학적 구조 및 염료는 상기 염색된 마이크로스피어가 유기 용매에 배치될 때 중합체로부터 분리되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 중합체는 본질적으로 디비닐 벤젠과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 염색된 마이크로스피어는 중합체에 부착된 하나 이상의 작용기를 포함 하고 상기 분자는 상기 하나 이상의 작용기를 통해서 염색된 마이크로스피어에 부착될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 화학적 구조는 방향족 술포닐 아지드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 화학적 구조는 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 반응 중간체는 술포닐 니트렌기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 반응 중간체는 카르벤기 또는 벤조페논 트리플렛을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분에 의해 염료로부터 분리되는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 반응 중간체는 화학적 구조의 비활성 부분의 일측에 위치한 작용기를 포함하고, 상기 염료는 실질적으로 상기 일측의 반대인 비활성 부분의 다른 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 마이크로스피어 존재하에 별개의 반응 중간체를 형성하기 위하여 열 또는 빛을 사용하여 부가적인 별개의 염료에 연결된 부가적인 화학적 구조를 활성화 시키는, 활성화 단계를 더 포함하고, 상기 별개의 반응 중간체는 마이크로스피어의 중합체에 공유적으로 부착되어 부가적인 별개의 염료를 중합체에 연결하는 것을 특징으로 하는 방법.
제40항에 있어서,

상기 부가적인 별개의 염료는 상기 활성화 단계 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 조성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
염색된 마이크로스피어의 개체군으로서, 상기 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 화학적 구조에 의해 각각의 염색된 마이크로스피어 내의 중합체에 부 착된 염료를 포함하고, 염료에 기인하는 염색된 마이크로스피어 개체군의 염료 특성의 변화 계수는 약 10% 보다 작은 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 변화 계수는 각각의 염색된 마이크로스피어가 여기되자마자 각각의 염색된 마이크로스피어로부터 방출되는 신호의 변화 계수인 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 염료의 양은 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 부가적인 화학적 구조에 의해 각각의 염색된 마이크로스피어의 중합체에 부착된 부가적인 별개의 염료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 개체군.
제45항에 있어서,

상기 부가적인 별개의 염료에 기인하는 염색된 마이크로스피어의 개체군의 염료 특성의 변화 계수는 약 10% 보다 작은 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 그 외부 표면 상에 합성된 생체 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 개체군의 각각의 염색된 마이크로스피어는 그 외부 표면 상에 합성된 유기 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 각각의 염색된 마이크로스피어는 염료가 중합체에 부착되기 전과 후에 실질적으로 동일한 형상을 가지는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 염료는 그 염료가 중합체에 부착되기 전과 후에 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 조성을 가지는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 화학적 구조 및 염료는 상기 염색된 마이크로스피어의 개체군이 유기 용매에 배치될 때 중합체로부터 분리되지 않는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 중합체는 본질적으로 디비닐 벤젠과 가교 결합된 폴리스티렌으로 구성되는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 각각의 염색된 마이크로스피어는 그 마이크로스피어의 중합체에 부착된 하나 이상의 작용기를 더 포함하고 상기 하나 이상의 분자는 상기 하나 이상의 작용기를 통해서 각각의 염색된 마이크로스피어에 부착될 수 있는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 화학적 구조는 방향족 술포닐 아지드를 포함하는 것을 특징으로 하는 개체군.
제42항에 있어서,

상기 화학적 구조는 1,5-에틸-디-아미노-나프탈렌-술포닉 아지드를 포함하는 것을 특징으로 하는 개체군.