KR20070061806A - 건강한 조직과 종양 조직을 구별하기 위한 ｍｒ 영상화방법 - Google Patents

건강한 조직과 종양 조직을 구별하기 위한 ｍｒ 영상화방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 조직과 건강한 조직을 구별할 수 있게 하는, MR 영상화제로서 초편극화된 13C-피루베이트를 사용하는 종양 영상화 방법에 관한 것이다.
MR 영상화제, 초편극화된 13C-피루베이트, 종양 영상화

Description

건강한 조직과 종양 조직을 구별하기 위한 ＭＲ 영상화 방법 {MR IMAGING METHOD FOR THE DISCRIMINATION BETWEEN HEALTHY AND TUMOUR TISSUE}
본 발명은 종양 조직과 건강한 조직을 구별할 수 있게 하는, MR 영상화제로서 초편극화된 13C-피루베이트를 사용하는 종양 영상화 방법에 관한 것이다.
자기 공명 (MR) 영상화 (MRI)는 비-침윤성 방식으로 환자의 신체 또는 그의 일부의 영상을 얻고, 환자 및 의료진이 X-선과 같이 잠재적으로 해로운 방사선에 노출되지 않도록 하기 때문에 의사들에게 특히 인기있는 영상화 기술이다. 그 고화질 영상 때문에 MRI는 연질 조직 및 기관에 선호되는 영상화 기술로, 이는 정상 및 질환이 생긴 조직, 예를 들어 종양 및 병소를 구별할 수 있게 한다.
MR 종양 영상화는 MR 조영제의 존재 또는 부재 하에 수행될 수 있다. 조영제 없이 찍은 MR 영상에서, 크기가 약 1 내지 2 센티미터 및 그보다 큰 종양은 상당히 뚜렷하게 나타날 것이다. 그러나, 조영-증강 MRI (contrast-enhanced MRI)는 훨씬 작은 조직 변화, 즉 훨씬 작은 종양을 검출할 수 있어, 조영-증강 MR 영상화는 초기 단계 종양 검출 및 전이의 검출을 위한 강력한 도구이다.
몇몇 유형의 조영제가 MR 종양 영상화에 사용되어 왔다. 수용성 상자성 금 속 킬레이트, 예를 들어 옴니스캔 (상표명; Omniscan; 아머샴 헬스 (Amersham Health))과 같은 가돌리늄 킬레이트는 MR 조영제로서 광범위하게 사용된다. 이들은 맥관 구조로 투여되는 경우, 분자량이 작기 때문에 세포외 공간 (즉, 혈액 및 간질)으로 신속하게 분포된다. 이들은 또한 신체로부터 비교적 신속하게 제거된다. 가돌리늄 킬레이트는 전이, 소종양의 검출률을 증가시키고 종양 분류를 개선시키는 데 특히 유용하다고 밝혀졌는데, 후자는 중심 괴저, 및 주변 부종 또는 거시적으로 포함되지 않는 조직으로부터 치명적 종양 조직 (혈뇌 장벽을 잘 관류시키고/시키거나 감손시킴)을 구별함으로써 가능하다 (예를 들어, 문헌 [C. Claussen et al., Neuroradiology 1985; 27: 164-171] 참조).
한편, 혈액 풀 MR 조영제, 예를 들어 초상자성 산화철 입자는 장기간 맥관구조 내에 보유된다. 이들은 간에서 조영을 증강시킬 뿐만 아니라, 모세혈관 투과성 비정상, 예를 들어 맥관형성의 결과로서 종양에서 "누출" 모세혈관 벽을 검출하는데 매우 유용하다는 것이 증명되었다.
상기 조영제의 명백하게 우수한 특성에도 불구하고, 이들의 사용에는 임의의 위험이 따를 수 있다. 상자성 금속 킬레이트 복합체는 일반적으로 지속적인 높은 안정성을 가졌지만, 투여 후 체내에서 독성 금속 이온이 방출될 수도 있다. 또한, 이러한 유형의 조영제는 불량한 특이성을 나타낸다.
제WO-A-99/35508호에는 MR 영상화제로서 고 T1 물질의 초편극화된 용액을 사용하는 환자의 MR 조사 방법이 개시되어 있다. 용어 "초편극화"는 고 T1 물질에 존 재하는 NMR 활성 핵, 즉 비-제로 핵 스핀이 있는 핵, 바람직하게는 13C- 또는 15N-핵의 핵 편극화를 증강시키는 것을 의미한다. NMR 활성 핵의 핵 편극화 증강시에, 이들 핵의 여기 및 기저 핵 스핀 상태 군의 차이는 상당히 증가하고, 그로 인해 MR 신호 강도는 100 이상의 계수만큼 증폭된다. 초편극화된 13C- 및/또는 15N-농축 고 T1 물질을 사용하는 경우, 13C 및/또는 15N의 자연 존재비가 무시할 정도이므로 배경 신호로부터 실질적으로 간섭받지 않을 것이고, 따라서 영상 조영은 유리하게 높아질 것이다. 초편극화 및 후속적으로 MR 영상화제로서 사용하기에 적합한 다양한 고 T1 물질이 개시되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 아세테이트, 피루베이트, 옥살레이트 또는 글루코네이트와 같은 비-내생 및 내생 화합물, 글루코스 또는 푸룩토스와 같은 당, 우레아, 아미드, 글루타메이트, 글리신, 시스테인 또는 아스파테이트와 같은 아미노산, 뉴클레오티드, 아스코르브산과 같은 비타민, 페니실린 유도체 및 술폰아미드를 비롯한 것이 있다. 푸마르산 및 피루브산과 같은 정상 대사 회로, 예컨대 시트르산 회로에서의 중간체는 대사 활성의 영상화에 대한 바람직한 영상화제이다.
초편극화된 영상화제의 신호는 이완 및 -환자의 체내로 투여되면- 희석에 의해 감쇠된다는 것이 문제가 되어 왔다. 따라서, 생체액 (예를 들어, 혈액)에서 영상화제의 T1 값은 물질이 환자 신체의 표적 부위에 고도로 초편극화된 상태로 분포할 수 있도록 충분히 길어야 한다.
본 발명자들은 놀랍게도 초분극화된 13C-피루베이트가 영상화제로 사용되는, 종양 조직과 건강한 조직을 구별할 수 있는 MR 종양 영상화 방법을 발견하였다.
따라서, 본 발명은
(a) 초편극화된 13C-피루베이트를 포함하는 조성물을 미리 투여한 대상체로부터 13C-피루베이트 및 그의 13C-함유 대사물질 알라닌, 락테이트 및 임의로 바이카보네이트의 13C-MR 영상을 직접 획득하는 단계;
(b) 피루베이트 및/또는 알라닌의 양에 대한 락테이트 신호를 임의로 수정하여 가중된 락테이트 대 피루베이트 및/또는 락테이트 대 알라닌 영상을 얻는 단계
를 포함하고, 여기서 상기 13C-영상에서 종양 조직은 가장 높은 락테이트 신호에 의해 나타나고/나타나거나, 단계 (b)에서 수정을 수행한 경우 고도로 가중된 락테이트 대 피루베이트 및/또는 락테이트 대 알라닌 신호에 의해 나타나는, 건강한 조직과 종양 조직을 구별하는 방법을 제공한다.
NMR 활성 13C-핵의 초편극화는 상이한 방법 (예를 들어 제WO-A-99/35508호에 기재됨)에 의해 달성될 수 있으며, 바람직한 방법은 희기체 (noble gas), "무작위 대입법 (brute force)", 스핀 냉동 및 DNP로부터의 편극화 이동이다. 초편극화된 13C-피루베이트를 얻기 위해, 13C-피루베이트를 직접 편극화시키거나, 또는 13C-피루브산을 편극화시키고, 예를 들어 염기로 중화시킴으로써 편극화된 13C-피루브산을 편극화된 13C-피루베이트로 전환시키는 것이 바람직하다.
초편극화된 13C-피루베이트를 얻기 위한 바람직한 방식은 초편극화된 희기체로부터의 편극화 이동이다. 비-제로 핵 스핀을 갖는 희기체는 초편극화될 수 있는데, 이는, 예를 들어 편극화된 빛을 순환적으로 이용함으로써 평형 편극화보다 증강된 편극화일 수 있다. 초편극화된 희기체, 바람직하게는 He 또는 Xe, 또는 그러한 기체의 혼합물은 13C-핵의 효과적 초편극화에 사용될 수 있다. 초편극화는 동위원소 농축된 초편극화된 희기체, 바람직하게는 3He 또는 129Xe를 사용함으로써 달성될 수도 있다. 초편극화된 기체는 기체 상일 수 있거나, 액체/용매에 용해될 수 있거나, 또는 초편극화된 기체 그 자체는 용매로 작용할 수도 있다. 별법으로, 기체는 냉각된 고체 표면에 농축되어 이 형태로 사용되거나, 또는 승화될 수 있다. 초편극화된 기체와 편극화될 화합물의 친밀 혼합이 바람직하다. 따라서, 실온에서 액체인 13C-피루브산이 편극화되는 경우, 초편극화된 기체는 바람직하게는 액체/용매에 용해되거나, 또는 용매로 작용한다. 13C 피루베이트가 편극화되는 경우, 초편극화된 기체는 바람직하게는 피루베이트도 용해시키는 액체/용매에 용해된다.
초편극화된 13C-피루베이트를 얻기 위한 다른 바람직한 방식은 편극화를 매우 낮은 온도 및 높은 자기장에서 열역학적 평형에 의해 NMR 활성 핵으로 나누는 것이다. NMR 분광계의 자기장 및 온도의 조작에 비해 초편극화는 매우 높은 자기장 및 매우 낮은 온도 (무작위 대입법)를 이용하면 효과적이다. 사용된 자기장 강도는 가능한 높아야 하고, 적합하게는 1 T 초과, 바람직하게는 5 T 이상, 더욱 바람직하게는 15 T 이상, 특히 바람직하게는 20 T 이상이다. 온도는 매우 낮아야 하는데, 예를 들어 4.2 K 이하, 바람직하게는 1.5 K 이하, 더욱 바람직하게는 1.0 K 이하, 특히 바람직하게는 100 mK 이하이다.
초편극화된 13C-피루베이트를 얻기 위한 다른 바람직한 방식은 스핀 냉동 방법이다. 이 방법은 스핀 냉동 편극화에 의해 고체 화합물 또는 시스템의 스핀 편극화를 커버한다. 상기 시스템은 적당한 상자성 물질, 예컨대 3차 이상의 대칭축을 갖는 결정 형태의 Ni2+, 란타니드 또는 악티니드 이온을 첨가하거나, 친밀 혼합시킨다. 이 수단은 공명 여기 장이 적용되지 않기 때문에 획일적인 자기장이 필요하지 않아서 DNP에서 요구되는 것보다 단순하다. 이 공정은 자기장 방향에 대한 수직축 주변으로 샘플을 물리적으로 회전시킴으로써 수행된다. 이 방법에 대한 예비-필수조건은 상자성 종이 고도의 이방성 g-인자를 갖는 것이다. 샘플 회전의 결과, 전자 상자성 공명은 핵 스핀과의 접촉을 야기하여 핵 스핀 온도를 감소시킬 것이다. 핵 스핀 편극화가 새로운 평형에 도달할 때까지 샘플 회전을 수행한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, DNP (동적 핵 편극화) 방법은 초편극화된 13C-피루베이트를 얻기 위해 사용된다. 편극화는 상자성 화합물, 소위 상자성 물질 또는 DNP 물질에 의해 실시된다. DNP 공정 동안, 보통은 마이크로파 방사선의 형태인 에너지가 제공되며, 이는 초기에 상자성 물질을 여기시킬 것이다. 기저 상태로 감쇠됨과 동시에, 상자성 물질의 쌍을 이루지 않은 전자로부터 샘플의 NMR 활성 핵으로 편극화가 이동한다. 일반적으로, 중간 또는 높은 자기장 및 매우 낮은 온도가 DNP 공정에서 사용되는데, 예를 들어 액체 헬륨 및 약 1 T 이상의 자기장에서 DNP 공정을 수행한다. 별법으로, 충분한 편극화 증강을 달성할 수 있는 중간 자기장 및 임의의 온도가 사용될 수 있다. DNP 기술은 예를 들어, 둘 다 본원에 참고로 포함되는 제WO-A-98/58272호 및 제WO-A-01/96895호에 기술되어 있다. DNP 방법으로 초편극화된 13C-피루베이트를 얻기 위해, 13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산은 편극화될 화합물로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 13C-피루브산 및/또는 13C-피루베이트가 사용되는지는 주로 DNP 공정에서 사용된 상자성 물질에 따라 달라진다. 상자성 물질이 13C-피루브산에 용해되는 경우, 13C-피루브산이 사용되는 것이 바람직하고, 액체 혼합물, 바람직하게는 액체 용액이 상자성 물질 및 13C-피루브산에 의해 형성된다. 상자성 물질이 13C-피루브산에 용해되지 않는 경우, 13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산 및 1종 이상의 공용매를 사용하여 액체 혼합물, 바람직하게는 액체 용액을 형성한다. DNP의 성공, 즉 편극화 수준은 편극화될 화합물 및 상자성 물질이 서로 친밀 접촉되는 것에 따라 달라진다는 것이 밝혀졌다. 따라서 공용매는 바람직하게는 상자성 물질, 및 13C-피루브산 및/또는 13C-피루베이트를 모두 용해시키는 공용매 또는 공용매 혼합물이다. 13C-피루베이트에 대해, 물이 공용매로 사용되는 것은 바람직하다.
추가로, 보다 높은 수준의 편극화는 샘플 혼합물을 냉각/냉동시킬 때 결정화된 샘플보다 유리를 형성하는 경우의 DNP 방법에 의해 달성되는 것으로 밝혀졌다. 다시말해, 유리의 형성은 상자성 물질과 편극화될 화합물을 더욱 친밀 접촉시킨다. 13C-피루브산은 우수한 유리 형성체이므로, 상자성 물질이 13C-피루브산에 용해되는 경우에는 언제나 본 발명의 방법에서 사용되는 것이 바람직하다. 13C-피루베이트는 염이므로, 13C-피루베이트의 수용액과 상자성 물질의 액체 혼합물은 냉각과 동시에 결정화된 샘플을 생성할 것이다. 이를 방지하기 위해, 글리세롤, 프로판디올 또는 글리콜과 같은 우수한 유리 형성체인 추가의 공용매를 첨가하는 것이 바람직하다.
따라서 한 실시양태에서, 13C-피루베이트를 물에 용해시켜 수용액을 얻고, 상자성 물질, 글리세롤 및 임의로 추가 공용매를 첨가하여 액체 혼합물을 형성한다. 바람직한 실시양태에서, 13C-피루브산, 상자성 물질 및 공용매를 합하여 액체 혼합물을 형성한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 13C-피루브산 및 상자성 물질을 합하여 액체 혼합물을 형성한다. 화합물의 친밀 혼합은 당업계에 공지된 몇 가지 수단, 예컨대 교반, 볼텍싱 또는 음파처리 등에 의해 달성될 수 있다.
이어서, 액체 혼합물은 DNP 공정을 수행하기 전에 냉동시킨다. 액체 혼합물의 냉각/냉동은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 액체 혼합물을 액체 질소에서 냉동시키거나, 액체 헬륨이 샘플을 냉동시키도록 함으로써 그것을 단순히 편극화기에 단순히 놓아 달성될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 동적 핵 편극화 (DNP)는 편극화될 화합물의 편극화가 DNP 물질, 즉 상자성 물질/화합물에 의해 실시되는 편극화 방법이다.
다수의 공지된 상자성 화합물이 DNP 물질, 예를 들어 전이 금속, 예컨대 크롬 (V) 이온, 유기 유리 라디칼, 예컨대 니트록시드 라디칼, 트리틸 라디칼 또는 자기 입자로 사용될 수 있다. 그러한 DNP 물질은, 예를 들어 제WO-A-99/35508호, 제WO-A-88/10419호, 제WO-A-90/00904호, 제WO-A-91/12024호, 제WO-A-93/02711호 또는 제WO-A-96/39367호에 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 하기 화학식 (I)의 트리틸 라디칼은 상자성 물질로 사용되어 DNP 방법에 의해 13C-피루베이트를 수득한다.
Figure 112007017014217-PCT00001
식 중,
M은 수소 또는 1가의 양이온을 나타내고;
R1은 동일하거나 상이하며 직쇄 또는 분지쇄의 임의로 히드록실화된 C1-C6-알킬기 또는 -(CH2)n-X-R2기 (여기서, n은 1, 2 또는 3이고; X는 O 또는 S이고, R2는 직쇄 또는 분지쇄의 임의로 히드록실화된 C1-C4-알킬기임)를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, M은 수소 또는 생리학적으로 허용되는 1가의 양이온을 나타낸다. 용어 "생리학적으로 허용되는 양이온"은 인간 또는 인간 이외의 동물의 살아있는 신체에서 허용되는 양이온을 나타낸다. 바람직하게는, M은 수소 또는 알칼리 양이온, 암모늄 이온 또는 유기 아민 이온, 예를 들어 메글루민을 나타낸다. 가장 바람직하게는, M은 수소 또는 나트륨을 나타낸다.
추가의 바람직한 실시양태에서, R1은 동일하거나 상이하며, 바람직하게는 동일하며 직쇄 또는 분지쇄 임의로 히드록실화 C1-C4-알킬기, 가장 바람직하게는 메틸, 에틸, 이소프로필, 히드록시메틸 또는 히드록시에틸을 나타낸다.
추가의 바람직한 실시양태에서, R1은 동일하거나 상이하고, 바람직하게는 동일하며 -CH2-O-(C1-C3-알킬), -(CH2)2-O-CH3, -(C1-C3-알킬)-O-CH3, -CH2-S-(C1-C3-알킬), -(CH2)2-S-CH3, -(C1-C3-알킬)-S-CH3, -CH2-O-CH3, -CH2-O-C2H5, -CH2-O-C2H4OH, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-S-CH3, -CH2-S-C2H5, -CH2-S-C2H4OH 또는 -CH2-CH2-S-CH3, 가장 바람직하게는 -CH2-CH2-O-CH3을 나타낸다.
더욱 바람직한 실시양태에서, M은 수소 또는 나트륨을 나타내고, R1은 동일 하며 -CH2-CH2-O-CH3을 나타낸다.
화학식 (I)의 트리틸 라디칼은 제WO-A-91/12024호, 제WO-A-96/39367호, 제WO 97/09633호 및 제WO-A-98/39277호에 상세하게 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. 간단하게는, 라디칼은 금속화된 단량체 아릴 화합물의 3 몰 당량을 적당하게 보호된 카르복실산 유도체의 1 몰 당량과 반응시켜 삼량체인 중간체를 형성함으로써 합성될 수 있다. 이 중간체를 금속화시키고, 후속적으로, 예를 들어 이산화탄소와 반응시켜 트리-카르복실 트리틸 카비놀을 생성하고, 추가 단계에서 이를 강산으로 처리하여 트리아릴메틸 양이온을 생성한다. 이어서, 이 양이온을 환원시켜 안정한 트리틸 라디칼을 형성한다.
13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산 및 임의로 용매를 포함하는 액체 혼합물은 바람직하게는 화학식 (I)의 트리틸 라디칼 5 내지 100 mM, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 mM, 특히 바람직하게는 12 내지 18 mM, 가장 바람직하게는 13 내지 17 mM로 함유한다. DNP 공정에서 편극화 형성 시간은 보다 많은 양의 라디칼을 사용하여 짧아지지만, 달성가능한 편극화 수준은 낮아지는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이들 두 효과는 서로 균형이 맞아야 한다.
DNP 기술은, 예를 들어 제WO-A-98/58272호 및 제WO-A-01/96895호에 기재되어 있으며, 둘 다 본원에 참고로 포함된다. 일반적으로, 중간 또는 높은 자기장 및 매우 낮은 온도가 DNP 공정에서 사용되는데, 예를 들어 액체 헬륨, 및 약 1 T 또는 그 이상의 자기장에서 DNP 공정을 수행한다. 별법으로, 중간 자기장 및 충분한 편 극화 증강을 달성하는 임의의 온도가 이용될 수 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, DNP 공정은 액체 헬륨 및 약 1 T 또는 그 이상의 자기장에서 수행된다. 본 발명의 방법의 단계 b)를 수행하기 위한 적합한 편극화 단위는, 예를 들어 제WO-A-02/37132호에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 편극화 단위는 크리오스태트 및 편극화 수단, 예를 들어 자기장 생성 수단 (예컨대, 초전도 자석)에 둘러싸인 중심 보어 (bore) 내의 마이크로파 공급원에 도파관에 의해 연결된 마이크로파 챔버를 포함한다. 보어는 13C 핵의 편극이 일어나게 하기 위해 자기장 강도가 충분히 높은, 예를 들어 1 내지 25 T인 초전도 자석 근처의 영역 P의 수준 이상까지 수직적으로 아래로 연장된다. 샘플 보어는 바람직하게는 밀봉가능하고, 낮은 압력, 예를 들어 1 mbar 또는 그 미만의 압력까지 배기될 수 있다. 샘플 (즉, 상자성 물질 및 13C-피루베이트 및/또한 13C-피루브산을 포함하는 혼합물) 도입 수단, 예컨대 제거가능한 샘플 수송 튜브가 보어 내에 함유될 수 있고, 이 튜브는 보어의 상부에서 영역 P의 마이크로파 챔버 내의 위치로 아래로 삽입될 수 있다. 영역 P는 액체 헬륨에 의해 편극화가 일어나기에 충분한 낮은 온도, 바람직하게는 0.1 내지 100 K, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10 K, 가장 바람직하게는 1 내지 5 K의 온도로 냉각된다. 샘플 도입 수단은 바람직하게는 상부 말단에서 적당한 임의의 방식으로 밀봉되어 보어에서 부분 진공이 보유된다. 샘플-보유 용기, 예컨대 샘플-보유 컵은 샘플 도입 수단의 하부 말단 내부에 제거가능하게 장착될 수 있다. 샘플-보유 용기는 바람직하게는 낮은 비열용량 및 우수한 극저온 특성을 갖는 경량 물질, 예를 들어 KeIF (폴리클로로트리플루오로에틸렌) 또는 PEEK (폴리에테르에테르케톤)로 제조된다. 샘플 용기는 편극화될 하나 이상의 샘플을 보유할 수 있다.
액체 헬륨에 침지되고, 바람직하게는 200 mW에서 진동수 약 94 GHz인 마이크로파로 방사된 샘플-보유 용기에 샘플을 삽입한다. 편극화 수준은 마이크로파 방사 동안 샘플의 고체 상태 13C-NMR 신호를 얻음으로써 모니터링할 수 있으므로, 단계 b)에서 고체 상태 13C-NMR 스펙트럼을 획득하기 위한 수단을 함유하는 편극화 단위를 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 포화 곡선은 13C-NMR 신호 대 시간을 나타내는 그래프로 얻어진다. 따라서, 최적 편극화 수준에 도달하는 때를 결정할 수 있다.
초편극화가 고체 상태인 샘플이 필요한 방법, 예를 들어 DNP 방법에 의해 수행되는 경우, 고체 샘플은 본 발명의 방법에서 이용하기 위해 액체 상태로 전이되어야 한다. 고체 편극화된 혼합물은, 예를 들어 제WO-A-02/37132호에 기재된 바와 같이 용해되거나, 예를 들어 제WO-A-02/36005호에 기재된 바와 같이 용융된다. 고체 초편극화된 샘플의 용해는 바람직하며, 더욱 바람직하게는 완충액, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충액 중에서 용해되어 액체 조성물을 수득한다. 본원의 문맥에서 용어 "완충액"은 하나 이상의 완충액, 즉 완충액의 혼합물을 나타낸다.
바람직한 완충액은 생리학적으로 허용되는 완충액, 더욱 바람직하게는, 예를 들어 인산염 완충액 (KH2PO4/Na2HPO4), ACES, PIPES, 이미다졸/HCl, BES, MOPS, HEPES, TES, 트리스 (TRIS), HEPPS 또는 TRICIN과 같은 약 pH 7 내지 8의 범위인 완충액이다. 더욱 바람직한 완충액은 인산염 완충액 및 트리스이며, 가장 바람직한 것은 트리스이다. 다른 실시양태에서, 상기 언급된 바람직한 완충액 중 하나 이상, 즉 완충액의 혼합물이 사용된다.
13C-피루브산이 편극화될 화합물에서 사용되는 경우, 용해는 13C-피루브산의 13C-피루베이트로의 전환도 포함한다. 이를 달성하기 위해, 13C-피루브산을 염기와 반응시킨다. 한 실시양태에서, 13C-피루브산을 염기와 반응시켜 이를 13C-피루베이트로 전환시키고, 후속적으로 완충액을 첨가한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 완충액 및 염기를 한 용액에 합하고, 이 용액을 13C-피루브산에 첨가하면 이는 용해되면서 동시에 13C-피루베이트로 전환된다. 바람직한 실시양태에서, 염기는 NaOH, Na2CO3 또는 NaHCO3의 수용액이고, 가장 바람직한 염기는 NaOH이다. 특히 바람직한 실시양태에서, NaOH를 함유하는 트리스 완충액의 용액을 사용하여 13C-피루브산을 용해시키고, 이를 13C-피루베이트의 나트륨염으로 전환시킨다.
다른 바람직한 실시양태에서, 완충액 또는 -적용가능하다면- 합한 완충액/염기 용액은 결합할 수 있는 하나 이상의 화합물, 또는 착체 유리 상자성 이온, 예를 들어 DTPA 또는 EDTA와 같은 킬레이팅제를 추가로 포함한다. 유리 상자성 이온은, 피하는 것이 바람직한 초편극화된 화합물의 T1의 단축을 야기할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
용해는 바람직하게는 제WO-A-02/37132호에 개시된 방법 및/또는 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 초분극화가 DNP 방법에 의해 수행되는 경우, 용해 단위는 편극화기로부터 물리적으로 분리되거나, 편극화기 및 용해 단위를 함유하는 장치의 일부로 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 용해는 상승된 자기장에서 수행되어 이완을 증진시키고, 최대의 초편극화를 유지시킨다. 자기장 노드 (node)는 피해야하며, 상기 측정에도 불구하고 낮은 자기장이 이완을 증진시킬 수 있다.
초분극화가 DNP 방법에 의해 수행되는 경우, 상자성 물질 및/또는 그의 반응 생성물은 바람직하게는 용액을 함유하는 13C-피루베이트로부터 제거된다. 상자성 물질 및/또는 반응 생성물은 부분적으로, 실질적으로 또는 이상적으로는 완전히 제거될 수 있고, 완전한 제거가 바람직하다. 예를 들어, 화학식 (I)의 트리틸 라디칼의 반응 생성물은, 피루브산을 히드록시기를 포함하는 화학식 (I)의 라디칼과 반응시키는 경우에 형성될 수 있는 에스테르일 수 있다. 상자성 물질 및/또는 그의 반응 생성물을 제거하기 위해 사용가능한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 적용가능한 방법은 상자성 물질 및/또는 그의 반응 생성물의 성질에 따라 달라진다. 편극화 후에 고체 샘플을 용해시키면 라디칼이 침전될 수 있고, 이는 여과에 의해 액체 조성물로부터 용이하게 분리될 수 있다. 자기 입자가 상자성 물질로 사용되는 경우, 이들 입자는 여과에 의해 더욱 용이하게 제거된다. 침전이 생 기지 않는 경우, 상자성 물질은 크로마토그래피 분리 기술, 예를 들어 액체상 크로마토그래피, 예를 들면 역상 또는 순상 크로마토그래피, 또는 이온 교환 크로마토그래피, 또는 추출에 의해 제거될 수 있다.
화학식 (I)의 트리틸 라디칼이 특징적인 UV/가시광선 흡수 스펙트럼을 갖기 때문에, 제거 후에 액체 조성물에 존재하는 것을 확인하는 방법으로 UV/가시광선 흡수 측정을 이용할 수 있다. 정량적 결과, 즉 용해된 초편극화된 샘플에 존재하는 라디칼의 농도를 얻기 위해, 광학 분광계는 샘플의 특정 파장 형태에서의 흡수가 샘플에서 상응하는 라디칼 농도를 수득하는 방식으로 조정될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 13C-피루브산 및/또는 바람직하게는 DNP 방법에 의해 초편극화된 13C-피루베이트를 얻기 위해 사용되는 13C-피루베이트의 동위원소 농축은 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상이며, 90％ 초과의 동위원소 농축이 가장 바람직하다. 이상적으로는, 농축은 100％이다. 13C-피루브산 및/또는 13C-피루베이트는 C1-위치 (하기 제시된 13C1-피루브산 및 13C1-피루베이트), C2-위치 (하기 제시된 13C2-피루브산 및 13C2-피루베이트), C3-위치 (하기 제시된 13C3-피루브산 및 13C3-피루베이트), C1- 및 C2-위치 (하기 제시된 13C1,2-피루브산 및 13C1,2-피루베이트), C1- 및 C3-위치 (하기 제 시된 13C1,3-피루브산 및 13C1,3-피루베이트), C2- 및 C3-위치 (하기 제시된 13C2,3-피루브산 및 13C2,3-피루베이트) 또는 C1-, C2- 및 C3-위치 (하기 제시된 13C1,2,3-피루브산 및 13C1,2,3-피루베이트)에서 동위원소 농축될 수 있으며; C1-위치가 바람직하다.
13C1-피루브산의 합성을 위한 몇몇 방법이 당업계에 공지되어 있다. 간단하게는, 문헌 [Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231 -237]에는 S,S-아세탈, 예를 들어 1,3-디티안 또는 2-메틸-1,3-디티안인 카르보닐-함유 출발 물질의 보호 및 활성화에 따라 달라지는 합성 경로가 기술되어 있다. 디티안은 금속화되고, 메틸-함유 화합물 및/또는 13CO2와 반응한다. 이 문헌에 개략된 바와 같이 적절한 동위원소 농축된 13C-성분을 사용함으로써 13C1-피루베이트, 13C2-피루베이트 또는 13C1,2-피루베이트를 얻을 수 있다. 카르보닐 관능기는 문헌에 기재된 종래의 방법을 사용하여 후속적으로 유리된다. 상이한 합성 경로는 아세트산으로부터 출발하며, 이는 우선 아세틸 브로마이드로 전환된 후, Cu13CN과 반응한다. 이와 같이 수득한 니트릴은 아미드를 통해 피루브산으로 전환된다 (예를 들어, 문헌 [S. H. Anker et al., J. Biol. Chem. 176 (1948), 1333] 또는 [J. E. Thirkettle, Chem Commun. (1997), 1025] 참조). 추가로, 13C-피루브산은 상업적으로 입수가능한 나트륨 13C-피루베이트에, 예를 들어 미국 특허 제6,232,497호에 기재된 방법에 의해 양자를 부가함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위해, 초편극화된 13C-피루베이트는 살아있는 인간 또는 인간 이외의 동물에게 투여하기에 적합한 조성물로 제공된다. 조성물은 바람직하게는 상기 기술된 완충액 또는 완충액 혼합물을 포함한다. 조성물은 종래의 제약상 허용되는 담체, 부형제 및 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은, 예를 들어 안정화제, 삼투압 조절제, 가용화제 등을 포함할 수 있다.
피루베이트는 인간 신체에서 높은 농도에서도 매우 잘 허용되는 내생 화합물이다. 시트르산 회로에서 전구체로서, 피루베이트는 인간 신체의 대사에서 중요한 역할을 한다. 피루베이트는 상이한 화합물로 전환되는데: 그 트랜스아민화는 산화성 탈카르복실화를 통해 알라닌을 생성하고, 피루베이트는 아세틸-CoA 및 바이카보네이트로 전환되는데, 피루베이트의 환원은 락테이트, 및 옥살로아세테이트에서의 그의 카르복실화를 초래한다.
초편극화된 13C-피루베이트의 초편극화된 13C-락테이트, 초편극화된 13C-바이카보네이트 (13C1-피루베이트, 13C1,2-피루베이트 또는 13C1,2,3-피루베이트의 경우에서만) 및 초편극화된 13C-알라닌으로의 전환은 생체내 MR 영상화를 이용하여 종양 조 직과 건강한 조직의 구별을 위해 사용될 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 놀랍게도, 초편극화된 화합물의 T1은 이완 또는 희석으로 인해 감쇠된다는 것을 명심해야 한다. 13C1-피루베이트는 37℃의 인간의 총 혈액에서 약 42초의 T1 이완을 갖지만, 초편극화된 13C-피루베이트의 초편극화된 13C-락테이트, 초편극화된 13C-바이카보네이트 및 초편극화된 13C-알라닌으로의 전환은 13C-피루베이트 모 화합물 및 그의 대사물질로부터의 신호 검출이 가능할 정도로 충분히 빠르다는 것이 밝혀졌다. 알라닌, 바이카보네이트 및 락테이트의 양은 검사되는 조직의 대사 상태에 따라 달라진다. 초편극화된 13C-락테이트, 초편극화된 13C-바이카보네이트 및 초편극화된 13C-알라닌의 MR 신호 강도는 검출 시간에서 남겨진 이들 화합물의 양 및 편극화 정도와 관련이 있으므로, 초편극화된 13C-피루베이트의 초편극화된 13C-락테이트, 초편극화된 13C-바이카보네이트 및 초편극화된 13C-알라닌으로의 전환을 모니터링함으로써 비-침윤성 MR 영상화를 이용하여 인간 또는 인간 이외의 동물 신체에서 생체내 대사 과정을 연구하는 것이 가능하다.
상이한 피루베이트 대사물질로부터 생긴 MR 신호 진폭은 조직 유형에 따라 달라진다는 것이 밝혀졌다. 알라닌, 락테이트, 바이카보네이트 및 피루베이트에 의해 형성된 독특한 대사 피크 패턴은 검사되는 조직의 대사 상태에 대한 지문 (fingerprint)으로서 사용될 수 있으므로, 건강한 조직과 종양 조직의 구별이 가능 하다. 이는 초편극화된 13C-피루베이트를 포함하는 조성물이 생체내 MR 종양 영상화를 위한 우수한 제제가 되도록 한다.
일반적으로, 검사 대상체, 예를 들어 환자 또는 동물을 MR 자석에 위치시킨다. 전용 13C-MR RF-코일은 해당 영역을 덮도록 위치시킨다.
13C-피루베이트를 포함하는 조성물은 비경구, 바람직하게는 정맥내, 동맥내, 또는 해당 영역 또는 기관으로 직접 투여된다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량 및 농도는 독성, 기관 표적화 능력 및 투여 경로를 비롯한 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 조성물은 체중 1 kg 당 피루베이트 1 mmol까지, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mmol, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.3 mmol의 농도로 투여된다. 투여 속도는 바람직하게는 10 ml/초 미만, 더욱 바람직하게는 6 ml/초 미만, 가장 바람직하게는 5 ml/초 내지 0.1 ml/초이다. 투여 후 400초 미만, 바람직하게는 120초 미만, 더욱 바람직하게는 투여 후 60초 미만, 특히 바람직하게는 투여 후 20 내지 50초, 가장 바람직하게는 투여 후 30 내지 40초에서, MR 영상화 연쇄는 합한 진동수 및 공간 선택적 방식으로 해당 부피를 코딩하는 데 적용된다. 이는 13C-락테이트, 13C-알라닌 및 13C-피루베이트의 대사 영상, 더욱 바람직하게는 13C-락테이트, 13C-알라닌, 13C-바이카보네이트 및 13C-피루베이트의 대사 영상을 초래할 것이다. 동일한 기간의 시간 내에, 해부학적 및/또는 관류 정보를 얻기 위해 양성자 MRI 조영제의 존재 또는 부재 하에 양성자 영상이 얻어질 수 있다.
해당 부피의 코딩은, 예를 들어 문헌 [T.R. Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3523-3526 (1982)]; [A.A. Maudsley, et al., J. Magn. Res 51 , 147-152 (1983)]에 기재된 바와 같이 소위 분광 영상화 연쇄를 이용함으로써 달성될 수 있다. 분광 영상 데이터는 다수의 부피 요소를 함유하며, 각 요소는 완전한 13C-MR 스펙트럼을 함유한다. 13C-피루베이트 및 그의 13C-대사물질은 모두 13C-MR 스펙트럼에서 그들의 독특한 위치를 가지며, 이들의 공명 진동수는 이들을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 그의 공명 진동수에서 피크의 적분은 각각 13C-피루베이트 및 그의 13C-대사물질의 양과 직접 연관된다. 13C-피루베이트 및 각각의 13C-대사물질의 양이, 예를 들어 문헌 [L. Vanhamme et al., J Magn Reson 129, 35-43 (1997)]에 기재된 바와 같이 시간 영역 적합 경로 (time domain fitting routine)를 이용하여 측정되는 경우, 영상은 13C-피루베이트 및 각각의 13C-대사물질에 대해 생성될 수 있고, 여기서 유색 코딩 또는 그레이 코딩은 측정된 13C-피루베이트 및 각각의 13C-대사물질의 양을 표시한다.
분광 영상화 방법이 모든 종류의 MR 핵, 예를 들어 1H, 31P, 23Na를 사용하여 대사 영상을 생성하는 데 있어서 이들의 가치는 증명되었지만, 분광 영상을 완전히 코딩하기 위해 필요한 반복량은 이러한 접근법이 초편극화된 13C에 대해 덜 적합하 도록 한다. 모든 MR 데이터를 획득하는 동안 초편극화된 13C-신호를 이용할 수 있도록 하기 위해서는 주의가 필요하다. 감소된 잡음 대 신호의 손실을 보면서, 이는 모든 상 코딩 단계 (phase encoding step)에서 적용되는 RF-펄스 각도를 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 보다 큰 매트릭스 크기는 보다 많은 상 코딩 단계 및 보다 긴 스캔 시간이 필요하다.
데이터를 획득하는 동안 판독 경사를 적용하는 것을 포함하는, 문헌 [P. C. Lauterbur (Nature, 242, 190-191, (1973)] 및 [P. Mansfield (J. Phys. C. 6, L422-L426 (1973))]에 의해 선행된 기술에 기초한 영상화 방법은 더 높은 신호 대 잡음 영상 또는 등가물, 보다 높은 공간 해상도 영상을 나타낼 것이다. 그러나, 기초적 형태에서 이들 영상화 방법은 13C-피루베이트 및 그의 13C-대사물질에 대한 분리된 영상이 아닌 13C-피루베이트 및 그의 모든 13C-대사물질의 신호를 함유하는 영상을 형성하므로, 특정 대사물질의 확인은 가능하지 않다.
바람직한 실시양태에서, 영상화 연쇄는 다중-에코를 사용하여 진동수 정보에 대해 코딩할 수 있도록 사용된다. 분리된 물 및 지방 1H-영상을 생성할 수 있는 연쇄는, 예를 들어 문헌 [G. Glover, J Magn Reson Imaging 1991;1 :521-530] 및 [S. B. Reeder et al., MRM 51 35-45 (2004)]에 기재되어 있다. 검출될 대사물질 및 그에 따른 이들의 MR 진동수가 공지되어 있으므로, 상기 참조문헌에서 논의된 접근법은 13C-피루베이트, 13C-알라닌 및 13C-락테이트, 바람직하게는 13C-피루베이트, 13C-알라닌, 13C-락테이트 및 13C-바이카보네이트의 영상을 직접 획득하기 위해 적용될 수 있다. 이 절차는 초편극화된 13C-MR 신호의 사용이 종래의 분광 영상화 기술과 비교하여 보다 효과적이 되도록 하여, 보다 우수한 신호질, 보다 높은 공간 해상도 및 보다 빠른 획득 시간을 제공한다.
종양 조직은 증가된 관류 및 보다 높은 대사 작용에 의해 종종 특성화된다. 세포의 보다 높은 대사 요구 및/또는 세포의 모세혈관으로부터의 보다 먼 거리는 에너지 항상성 유지에 필요한 에너지를 제공할 수 있는 충분한 기질을 갖출 수 없게 하기 때문에, 이들 세포에 의해 혈관 그물 (vascular bed)이 증가되는 공정, 즉 맥관형성이 야기된다. 세포가 충분한 에너지를 생산하는 데 문제가 있는 영역에서는 대사 패턴에서 현저한 변화가 기대된다. 에너지 항상성 유지에 문제가 있는 조직은 그의 에너지 대사를 특히 락테이트 생산이 증가하도록 변경시킬 것이다. 놀랍게도, 짧은 MR 영상화 시간 창 (window) 내에 이용가능한 초편극화된 13C-피루베이트를 사용하여 대사에서의 이러한 변화를 가시화시키는 것이 가능한데, 다시말해 종양 영역에서 높은 13C-락테이트 신호를 이용하여 건강한 조직으로부터 종양을 구별할 수 있다. 관류는 종양 조직에서 이질적이므로, 동일한 영역에서 이용가능한 피루베이트 (13C-피루베이트 신호)의 양에 대한 13C-락테이트 신호를 수정하는 것이 바람직하다. 이러한 수정에 의하여, 가중된 락테이트 대 피루베이트 영상이 얻어진다. 이는 피루베이트 신호에 대해 상대적으로 높은 락테이트 신호를 갖는 조직 에서 영역을 강조하므로, 종양 조직과 건강한 조직의 구별을 증진시킨다.
피루베이트 신호를 수정하기 위해, 락테이트 및 피루베이트 영상 둘 다 각각의 개별 영상에서 최대값으로 표준화시킨다. 두 번째로, 표준화된 락테이트 영상은, 예를 들어 영상내 최대 피루베이트 신호에서 모든 화소 (pixel)에 대한 피루베이트 수준을 뺀, 역전된 피루베이트 영상으로 곱한다. 마지막 단계로, 상기 조작에서 얻어진 중간 결과를 원래의 락테이트 영상으로 곱한다.
변경된 대사를 갖는 영역을 강조하기 위해, 감소된 13C-알라닌 신호와 관련하여 높은 13C-락테이트 신호는 상기 단락에서 기재된 바와 유사한 조작에서 사용될 수 있으며, 이로써 가중된 락테이트 대 알라닌 영상이 얻어진다. 놀랍게도, 종양 영역의 확인, 즉 종양 조직과 건강한 조직의 구별은 이러한 수정에 의해 더욱 개선된다. 알라닌 신호를 수정하기 위해, 락테이트 및 알라닌 영상은 둘 다 각각의 개별 영상에서 최대값으로 표준화시킨다. 두 번째로, 표준화된 락테이트 영상은, 예를 들어 영상내 최대 알라닌 신호에서 모든 화소에 대한 알라닌 수준을 뺀 역전된 알라닌 영상으로 곱한다. 마지막 단계로, 상기 조작에서 얻어진 중간 결과는 원래의 락테이트 영상으로 곱한다. 유사한 방식으로, 13C-바이카보네이트 신호는 분석에서 더 잘 포함될 수 있다. 추가로 본원의 양성자 MRI 조영제 없이 획득된 양성자 영상은 해부학적 및/또는 관류 정보를 얻기 위해 분석에서 포함될 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 초편극화된 13C-피루베이트를 포함하는 조성물 은 반복적으로 투여되므로, 동적 연구를 가능하게 한다. 이는 환자의 신체에서 이들의 상대적으로 긴 순환으로 인해 그러한 동적 연구를 불가능하게 하는 MR 영상화제를 이용하는 다른 MR 종양 영상화 방법에 비하여 본 발명에 따른 방법의 추가의 장점이다.
본 발명에 따른 방법은 생체내 MR 종양 병기결정을 위해 추가로 이용될 수 있다. 상기 단락에 기재된 바와 동일한 대사 영상 및/또는 대사 가중 영상은 이러한 목적을 위해 종양 크기 및 대사 작용에 따라 달라지는 것으로 정의되는 적당한 절단 카테고리로 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 방법은 항종양제 요법으로 치료 및/또는 방사선 치료와 동시에, 또는 임의의 종류의 절제, 즉 라디오 진동수, 마이크로파 또는 초음파와 조합한 화학적 절제의 존재 또는 부재 하에 임의의 유형의 중재 기술과 함께, 예를 들어 종양의 대사 패턴에 직접적인 변화를 모니터링함으로써 생체내 MR 종양 요법을 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.
환자 또는 동물을 단백질 대사, 지질 대사 또는 일반적으로 에너지 대사를 혼란스럽게 할 방식으로 준비시킴으로써, 본 발명의 방법에 따른 종양 MR 영상화는 영향을 받고 증진될 수 있다. 이를 달성하기 위한 방식은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 단식 (예를 들어, 밤새), 포도당 주입 등이 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 뇌 종양, 유방 종양, 결장 종양, 폐 종양, 신장 종양, 두경부 종양, 근육 종양, 난소 종양, 위 종양, 췌장 종양, 식도 종양 및 전립선 종양의 생체내 MR 종양 영상화, 종양 요법 모니터링 및/ 또는 종양 병기결정을 위해 이용된다. 본 발명에 따른 방법은 생체내 MR 전립선 종양 영상화, 즉 전립선 종양 진단 및/또는 전립선 종양 병기결정 및/또는 전립선 종양 요법 모니터링을 위해 특히 유용하다는 것이 추가로 밝혀졌다.
남성이 비뇨기 통증 또는 불편감의 증상으로 의사에게 진찰을 받는 경우, 전립선암이 의심된다. 이 남성이 50세 이상인 경우, 전립선 특이적 항원 (PSA) 시험을 수행한다. 전립선암은 상승된 PSA 및/또는 비정상 직장수지검사 (Digital Rectal Examination; DRE)에 기초하여 의심된다. PSA 시험이 양성인 경우, 환자는 초음파 유도된 생검을 이용한 진단을 위해 전문의 (비뇨기전문의)에게 보내진다. 미국 및 유럽에서 매년 수행된 2백만 생검의 각각 5/6 및 2/3가 음성이다. 초기 단계에서 검출되는 경우, 이들 환자에 대한 5년 생존율은 100％이다. 전립선암은 가장 흔한 암이며 남성의 암 사망 원인 중 2위이므로, 초기 단계에서 전립선 종양을 검출할 수 있고, 생검 절차의 수를 줄이는 데 도움을 줄 수 있는 전립선 종양의 진단 방법에 대한 의학적 요구가 강력하다.
전립선의 13C-영상화는 송-수신 볼륨 13C-RF-코일이 필요하며, 바람직하게는, 송신 볼륨 13C-RF-코일이 수신만 되는 MR 직장내 RF-코일과 함께 사용되고, 더욱 바람직하게는, 송-수신 위상 배열 볼륨 13C-RF-코일이 수신만 되는 MR 직장내 13C-RF-코일과 함께 사용된다. 13C-영상화 후에 1H-전립선 영상의 획득을 가능하게 하는 코일이 특히 바람직하다.
실시예 1 : 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-(테트라(메톡시에틸)벤조-[1,2-4,5']비스-(1,3)디티올-4-일)메틸 나트륨염의 합성
제WO-A1-98/39277호의 실시예 7에 따라 합성된 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-(테트라(히드록시에틸)벤조-[1,2-4,5']비스(1,3)-디티올-4-일)메틸 나트륨염 10 g (70 mmol)을 아르곤 대기 하에 디메틸아세트아미드 280 ml에 현탁시켰다. 수소화나트륨 (2.75 g)에 이어 메틸 요오다이드 (5.2 ml)를 첨가하고, 약간 발열되는 반응을 34℃의 수조에서 60분 동안 진행되도록 두었다. 수소화나트륨 및 메틸 요오다이드의 첨가를 각각 화합물의 동일한 양으로 2회 반복하고, 최종 첨가 후에 혼합물을 실온에서 68시간 동안 교반한 후, 물 500 ml에 부었다. 1 M NaOH (수성) 40 ml를 첨가하여 pH 13 초과로 pH를 조정하고, 혼합물을 주변 온도에서 15시간 동안 교반하여 형성된 메틸 에스테르를 가수분해시켰다. 이어서, 혼합물을 2 M HCl (수성) 50 ml를 사용하여 pH 약 2로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출 (500 ml 및 2 x 200 ml)하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 증발 건조시켰다. 조 생성물 (24 g)을 용리액으로 아세토니트릴/물을 사용한 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 획득된 분획을 증발시켜 아세토니트릴을 제거하였다. 나머지 수상을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 증발 건조시켰다. 물 (200 ml)을 잔류물에 첨가하고, 0.1 M NaOH (수성)를 조심스럽게 첨가하여 pH를 7로 조정하고, 이 공정 동안 잔류물을 서서히 용해시켰다. 중화 후, 수용액을 냉동 건조시켰다.
실시예 2: 13 C-피루브산 및 실시예 1의 트리틸 라디칼을 사용하여 DNP 방법에 의해 초편극화된 13 C-피루베이트를 포함하는 조성물의 제조
13C1-피루브산 (164 ㎕) 중에 실시예 1의 라디칼 5.0 mg을 용해시킴으로써 20 mM 용액을 제조하였다. 샘플을 균질 혼합하고, 용액의 분취량 (41 mg)을 샘플 컵에 담고, DNP 편극화기에 삽입하였다.
샘플을 마이크로파 (93.950 GHz)로 방사 하에 3.35 T 자기장의 1.2 K에서 DNP 조건 하에 편극화시켰다. 2시간 후, 편극화를 중지시키고, 샘플을 수산화나트륨 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)의 수용액 중에서 제WO-A-02/37132호에 따른 용해 장치를 사용하여 용해시켜 초편극화된 나트륨 13C1-피루베이트의 중성 용액을 생성하였다. 용해된 샘플을 13C-NMR로 신속하게 분석하여 편극화를 평가하고, 19.0％ 13C 편극화를 얻었다.
실시예 3: 13 C-피루브산 및 실시예 1의 트리틸 라디칼을 사용하여 DNP 방법에 의해 초편극화된 13 C-피루베이트를 포함하는 조성물의 제조
13C1-피루브산 (553 mg)과 표지되지 않은 피루브산 (10.505 g)의 혼합물 중에 실시예 1의 라디칼 (209.1 mg)을 용해시킴으로써 15 mM 용액을 제조하였다. 샘플 을 균질 혼합하고, 용액의 분취량 (2.015 g)을 샘플 컵에 담고, DNP 편극화기에 삽입하였다.
샘플을 마이크로파 (93.950 GHz)로 방사 하에 3.35 T 자기장의 1.2 K에서 DNP 조건 하에 편극화시켰다. 4시간 후, 편극화를 중지시키고, 샘플을 수산화나트륨 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)의 수용액 중에서 제WO-A-02/37132호에 따른 용해 장치를 사용하여 용해시켜 100 mM 트리스 완충액 중 총 피루베이트 농도가 0.5 M인 초편극화된 나트륨 13C1-피루베이트의 중성 용액을 생성하였다. 상기 용해 장치에 연속하여, 크로마토그래피 컬럼을 연결하였다. 소수성 팩킹 물질 (본데실 (Bondesil)-C18, 40UM 파트 번호:12213012)을 함유하는 카트리지 (D = 38 mm; h = 10 mm)로 구성된 컬럼은 바리안 (Varian)사에서 공급한다. 용해된 샘플을 라디칼을 선택적으로 흡착하는 컬럼에 통과시킨다. 여과된 용액을 13C-NMR로 신속하게 분석하여 편극화를 평가하고, 16.5％ 13C 편극화를 얻었다. 잔류 라디칼 농도를 후속적으로 469 nm에서 UV 분광광도계로 분석하고, 검출 제한이 0.1 μM 미만이 되도록 결정하였다.
실시예 4: 13 C-피루브산 및 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸-벤조[1,2-d:4,5-d']비스(1,3)디티올-4-일)메틸 나트륨염을 사용하여 DNP 방법에 의해 초편극화된 13 C-피루베이트의 제조
트리스(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸-벤조[1,2-d:4,5- d']-비스-(1,3)-디티올-4-일)메틸 나트륨염을 제WO-A-97/09633호의 실시예 29에 기재된 바와 같이 합성하였다.
트리스(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸-벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3)-디티올-4-일)메틸 나트륨염을 13C1-피루브산 (83.1 mg)에 용해시킴으로써 20 mM 용액을 제조하였다. 샘플을 균질 혼합하고, 샘플 컵에 넣고, DNP 편극화기에 삽입하였다. 샘플을 마이크로파 (93.950 GHz)로 방사 하에 3.35 T 자기장의 1.2 K에서의 DNP 조건 하에 편극화시켰다. 바리안 이노바 (Varian Inova)-200 NMR 분광계를 사용하여, 샘플로부터의 13C-NMR 신호를 획득하였다. 열 평형 13C-NMR 신호 및 증강된 NMR 신호의 측정으로부터 DNP 증강을 계산하였다. 16％ 13C 편극화를 얻었다.
실시예 5: 영상화제로서 초편극화된 13 C-피루베이트를 포함하는 조성물을 사용한 종양 영상화
5.1 종양 동물 모델 및 종양 준비
R3230AC는 암컷 피셔 (Fischer) 344 래트에서 유지될 수 있는 래트 유선암종이다. 동물 종양 모델을 구성하기 위해, RPMI 1640, 10％ FBS 및 10％ DMSO를 함유하는 R32030 세포의 냉동된 바이알을 37℃에서 신속하게 녹였다. 이후에, 세포 용액을 FBS로 옮기고, RPMI 1640의 증가한 부피를 첨가하였다. 최종적으로, 세포 현탁액을 25 cm2의 성장 플라스크로 옮기고, 37℃의 5％ CO2 하의 인큐베이터에 넣었다. 성장 배지를 매일 교체시켰다. 래트에게 감염시키는 날, 기계적 힘 또는 트립신으로 세포의 제거를 수행하였다. 세포는 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충액을 사용하여 세척하였다. 트립신 (0.02％ EDTA 중 0.05％ 트립신)을 2 내지 5분 동안 첨가하였다. 이어서, FBS 5 ml를 첨가하고, 세포를 RPMI 1640과 FCS 및 항생물질 (페니실린 100 IU/ml, 스트렙토마이신 100 IU/ml 및 앰포테리신 B 2.5 ㎍/ml)이 든 비커에 옮겼다. 세포 용액을 원심분리하고, 세포 펠렛을 FBS 및 항생물질과 함께 RPMI 20 ml에 재현탁시키고, 원심분리 및 재현탁을 반복하였다. 이어서, 세포를 4 x 106 세포/ml RPM1 1640을 함유한 바이알에 분취하였다. 종양 제공자를 얻기 위해, 암컷 피셔 344 래트 (찰스 리버 (Charles River), 180 내지 200 g)를 마취시키고, 세포 현탁액 0.3 ml를 양쪽 서혜부에 피하 주사하였다. 15 및 22일 후, 종양 조각을 문헌 [F.A. Burgener et al., Invest Radiol 22/6 (1987), 472-478]; [S. Saini et al., J. Magn. Reson. 129/1 (1997), 35-43)]에 기재된 바와 같이 준비하였다. 수용체인 암컷 피셔 래트의 복부상에 두 절개부를 만들었다. 종양 조각을 각 포켓에 삽입하고, 절개를 닫았다. 래트를 종양 부가 후 12 내지 14일에 영상화하였다.
5.2 래트 준비 및 양성자 MR 영상화
중량을 잰 래트를 이소플루란 (2 내지 3％)을 사용하여 마취시키고, 약 37℃의 체온을 유지하기 위해 가열된 테이블 상에 두었다. 카테터를 꼬리 정맥 및 왼 쪽 온목동맥에 도입하였다. 래트를 MR 기계로 옮기고, FC-104 플루오르이너트 (Fluorinert)를 순환시키기 위해 대략 37℃로 가열된 홈-빌트 (home-built) 패드 상에 두었다. 이 액체는 1H- 및 13C-MR 영상화에서 배경 신호를 증가시키지 않을 것이다. 마취는 폐 튜브를 통해 0.4 L/분의 속도에서 개방-호흡 시스템으로 전달되는 1 내지 2％ 이소플루란으로 지속시켰다. 동맥 카테터를 T-튜브를 통해 압력 기록계 및 염수 전달 펌프 (속도 0.15 L/분)로 연결하여 카테터의 응고를 막았다. 래트를 래트 MR 코일 (래피드 바이오메디칼 (Rapid Biomedical, Germany))에 위치시키고, 표준 양성자 MR 영상화 연쇄를 사용하여 영상화하여 해부학적 정보를 얻고 종양의 위치를 결정하였다.
5.3 13 C-MR 영상화
MR 시스템에 의해 밝혀진 양성자 진동수에 기초하여, 13C1-알라닌에 대한 MR 진동수를 하기 방정식에 따라 계산하였다:
진동수 13C1-알라닌 = 0.25144 x [(시스템 진동수 양성자 x 1.00021) - 0.000397708]
계산된 진동수는 13C1-알라닌으로부터 생긴 MR 신호가 13C1-알라닌의 왼쪽에 13C1-락테이트 공명, 오른쪽에 13C1-피루베이트 공명으로 위치시켰다. 정위화되지 않 은 MR 분광 연쇄를 작동시켜 13C-MR 코일 및 시스템 MR 진동수가 정확하게 설치되도록 하였다. 13C-영상 위치를 종양을 덮도록 위치시켰다 (슬라이스 두께 10 mm, 평면 화소 크기 5 x 5 mm2). 재구성 상에서, 영상 데이터를 제로화 (zero-filled)시켜 해상도 2.5 x 2.5 x 10 mm3으로 하였다. 트리스 완충액 중 13C1-피루베이트 (90 mM)를 10 ml/kg의 투여량으로 꼬리 정맥으로 최소 부피 2 ml로 12초 동안 주사하고, 주사 시작 30초 후 (즉, 주사를 마친 후 18초), 화학적 이동 13C-MR 연쇄를 시작하였다.
5.4 MR 영상화 데이터의 분석
MR 영상화 결과, 각 요소 또는 용적 요소 (voxel)/화소가 13C-MR 스펙트럼을 함유하는 16 x 16 요소를 함유하는 매트릭스를 생성하였다. 재구성 상에서, 매트릭스를 공간 해상도를 증진시키는 데 도움이 되는 수학적 조작인 32 x 32로 제로화시켰다. 1024 스펙트럼을 함유한 분석할 데이터세트를 추가의 분석을 위해 디콤 (등록상표; Dicom) 포맷에 이출시켰다 (디콤 (DICOM)은 의학 정보의 디지털 커뮤니케이션과 관련한 표준 간행물에 대한 국제 전기 제조자 협회 (National Electrical Manufacturers Association)의 등록된 상표명임). 이들 스펙트럼의 약 절반은 MR 신호를 함유하지 않았는데, 이들 용적 요소의 위치가 동물의 외부이기 때문이다. 동물 내의 위치에서의 용적 요소는 높은 피루베이트 신호, 및 무시할만한 락테이트 및 알라닌 신호 (혈액 풀)를 나타내었으나, 다른 용적 요소는 피루베이트, 알라닌 및 락테이트를 거의 동일한 강도로 나타내었다.
피루베이트, 알라닌 및 락테이트에 대한 진폭은 시간 영역 적합 절차를 사용하여 측정되었으며, 이는 하기를 포함한다: 0-차 상은 데이터세트에 대해 일정하고, 1-차 상은 1.4 ms이며, 시간 영역에서 선 폭 또는 감폭은 독립적인 각각의 대사물질에 대한 전체 데이터세트의 평균 선 폭인 0.5 내지 3 배로 다양하고, 진동수는 가장 높은 피크에 대한 전체 데이터세트에서 발견된 평균 진동수와 관련하여 두 방향 모두에서 20 Hz로 다양할 수 있으며, 이는 사용자에 의해 확인되어야 한다.
락테이트, 알라닌 및 피루베이트에 대한 진폭은 매트릭스에서 재정렬되고, 다시 샘플링되어 양성자 해부학적 MR 영상의 해상도와 매치된다. 13C-MR 영상은 자동화 절차를 이용하여 해부학적 영상으로 투사하여 조작-독립적 결과를 얻었다. 결과는 모든 화소에 대해 나타나는, 래트에서 종양의 해부학적 양성자 영상, 해부학적 영상으로 투사된 피루베이트, 락테이트 및 알라닌에 대한 대사 13C-영상을 함유하는 영상 세트로 보여졌다.
a) ([락테이트]norm x ([피루베이트]max- [피루베이트])norm) x [락테이트] 및
b) ([락테이트]norm x ([알라닌]max- [알라닌])norm) x [락테이트]
여기서, 용어 "[.... ]norm"은 표준화된 진폭, 즉 대사 영상에서 가장 높은 값으로 기준화한 것을 나타내고, [락테이트]는 계산된 진폭을 나타낸다.
대사 13C-MR 영상에서 종양 조직과 건강한 조직의 구별에 대한 성공적 결과는 종양 영역에서 가장 높은 락테이트 신호 또는 종양 영역에서 락테이트 대 피루베이트의 높은 가중비, 및 동일한 화소 위치에서 락테이트 대 알라닌의 높은 가중비로 정의된다.
5.5 생물학적 분석
종양 부위를 가시적으로 조사하여 출혈 흔적을 검출하였다. 종양을 래트 신체에서 떼어내고, 중량을 재고, 반으로 잘랐다. 종양 내부를 가시적으로 조사하여 균질, 괴저 및 출혈을 평가하였다. 종양 조직을 4％ 포르말린에 저장하였다.
종양-함유 래트는, MR 조사 시간에서 종양 중량이 100 mg 초과이고, 종양 내부에서 괴저 또는 낭종이 보이지 않으며, 35℃ 이상의 체온 및 60 mm Hg 이상의 평균 동맥 혈압의 척도를 만족시키는 경우에 평가하기에 적당하다고 고려된다.
5.6 결과
래트 18마리에서 총 30개의 상이한 종양을 영상화하였다. 래트 1마리 및 3개의 종양이 상기 단락 5.5에 기재된 생물학적 기준에 미치지 못하였다. 나머지 래트 17마리에서의 26개 종양은 균질하고, 비-괴저성 덩어리 내부를 가졌다. 주사 시간에서 13C1-피루베이트의 평균 편극화는 21.2 ± 2.9％ (평균값 ± SD)이고, pH는 8.08 ± 0.14 (평균값 ± SD)이었다.
도 1은 (1) 양성자 참조 영상 (화살표는 종양 위치를 나타냄), (2) 13C-피루베이트 영상, (3) 13C-락테이트 영상, (4) 13C-알라닌 영상, (5) 13C-피루베이트에 대해 수정된 13C-락테이트 영상 및 (6) 13C-알라닌에 대해 수정된 13C-락테이트 영상이 있는 하나의 영상화된 래트 영상의 전형적 세트를 나타낸다. 영상 (2) 내지 (6)은 양성자 참조 영상과 융합되었다.
도 2는 영상의 동일한 세트를 나타내지만, 영상 (2) 내지 (6)은 해부학적 양성자 영상과 융합되지 않았다.
결과적으로, 종양 위치는 높은 대사 활성으로 인한 높은 피루베이트 신호 (2)에 의해 나타났다. 그러나, 락테이트 신호 (3)는 궁극적으로 종양의 수정된 위치를 확인시켰다. 알라닌은 골격 근육에서 보이고, 종양 조직 (4)에는 없었다. 피루베이트 및 알라닌 수정된 락테이트 영상 (5) 및 (6)은 종양에 대한 더욱 우수한 조영을 야기하였다.
따라서, 대사 영상에서 종양 위치는 높은 락테이트 신호, 피루베이트에 대해 수정된 높은 락테이트 신호 및 알라닌에 대해 수정된 높은 락테이트 신호에 의해 나타났다.
대사 13C-MR 영상의 분석은 하기와 같이 종양 영역에서 대사 조영을 나타냈다.
ㆍ 락테이트 신호에 대해 24/26 종양
ㆍ 피루베이트 수정된 (5.5, a) 락테이트 신호에 대해 26/26 종양
ㆍ 알라닌 수정된 (5.5, b) 락테이트 신호에 대해 26/26 종양.
이 연구에 대한 총 성공률은 26/26, 즉 100％였다.
이러한 연구로, 화합물 및 그의 대사물질을 영상화시킬 수 있는 시간 내에 해당 영역 (종양)에 도달하는 초편극화된 13C1-피루베이트를 사용하여 종양이 확인될 수 있다는 것이 증명되었다.

Claims (11)

  1. (a) 초편극화된 13C-피루베이트를 포함하는 조성물을 미리 투여한 대상체로부터 13C-피루베이트 및 그의 13C-함유 대사물질 알라닌, 락테이트 및 임의로 바이카보네이트의 13C-MR 영상을 직접 획득하는 단계;
    (b) 피루베이트 및/또는 알라닌의 양에 대한 락테이트 신호를 임의로 수정하여 가중된 락테이트 대 피루베이트 및/또는 락테이트 대 알라닌 영상을 얻는 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 13C-영상에서 종양 조직은 가장 높은 락테이트 신호에 의해 나타나고/나타나거나, 단계 (b)에서 수정을 수행한 경우 고도로 가중된 락테이트 대 피루베이트 및/또는 락테이트 대 알라닌 신호에 의해 나타나는, 건강한 조직과 종양 조직을 구별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 초편극화된 13C-피루베이트가 DNP 방법에 의해 13C-피루브산 및/또는 13C-피루베이트를 초편극화시킴으로써 얻어지는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 13C-피루베이트를 포함하는 조성물이 인산염 완충액 (KH2PO4/Na2HPO4), ACES, PIPES, 이미다졸/HCl, BES, MOPS, HEPES, TES, 트리스 (TRIS), HEPPS 또는 TRICIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 완충액을 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다중에코를 사용하여 진동수 정보에 대해 코딩하는 영상화 연쇄가 단계 a)에서 직접 13C-영상을 획득하기 위해 사용되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서의 직접 13C-영상이 13C-피루베이트를 포함하는 조성물의 투여 후 400초 미만에서 획득되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 양성자 MRI 조영제의 존재 또는 부재 하에 부가적 양성자 영상이 획득되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 가중된 락테이트 대 바이카보네이트 영상을 얻기 위해 바이카보네이트의 양에 대해 락테이트 신호를 수정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 단계 b)의 수정이 수행되는 경우, 상기 13C-영상에서 종양 조직이 가장 높은 락테이트 신호, 고도로 가중된 락테이트 대 피루베이트 및/또는 락테이트 대 알라닌 및/또는 락테이트 대 바이카보네이트 신호에 의해 나타나는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 필수적인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수정이
    (i) 락테이트 및 피루베이트 및/또는 알라닌 및/또는 바이카보네이트 영상을 각각의 개별적 영상에서 최대값으로 표준화시키는 단계;
    (ii) 표준화된 락테이트 영상을 역전된 피루베이트 및/또는 알라닌 및/또는 바이카보네이트 영상으로 곱하는 단계; 및
    (iii) 단계 (ii)의 결과를 원래의 락테이트 영상으로 곱하는 단계
    에 의해 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 뇌 종양, 유방 종양, 결장 종양, 폐 종양, 신장 종양, 두경부 종양, 근육 종양, 난소 종양, 위 종양, 췌장 종양, 식도 종양 또는 전립선 종양인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 MR 종양 요법 모니터링 및/또는 종양 병기결정 (staging)을 위한 방법.
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