NO339119B1 - Metode for å skille mellom friskt vev og tumorvev - Google Patents

Description

Oppfinnelsen gjelder en metode for tumor avbildning ved hjelp av<13>C-pyruvat som MR-avbildningsmiddel, metoden gjør det mulig å skille mellom tumorvev og friskt vev.

Magnetresonansavbildning (MRI) er en avbildningsteknikk som er blitt særlig attraktiv for leger, siden dette gir mulighet for å avbilde en pasients kropp, eller deler av den, på en ikke-invasiv måte og uten at pasienten og det medisinske personellet utsettes for potensiell skadelig stråling som ved røntgenavbildning. På grunn av den høye kvaliteten på bildene, er MRI en gunstig bildeteknikk ved avbildning av bløtvev og organer, og den gir mulighet til å skille friskt vev fra sykt vev, f.eks. tumorer og lesjoner.

Magnetresonansavbildning av tumorer kan utføres med eller uten MR-kontrastmidler. På et MR-bilde som tas uten kontrastmiddel, vil tumorer fra en størrelse på ca. 1-2 cm og større vises relativt klart. Kontrast-forsterket MRI gjør det imidlertid mulig å oppdage mye mindre vevsendringer, dvs. tumorer som er mye mindre. Dette gjør kontrast-forsterket MRI til et betydningsfullt verktøy for å oppdage tumorer på et tidlig stadium samt oppdagelse av metastaser.

Flere typer kontrastmidler er blitt brukt ved magnetresonansavbildning av tumorer. Vannløselige paramagnetiske metallkelater, f.eks. gadoliniumkelater som Omniscan™ (Amersham Health), er MR-kontrastmidler som er mye brukt. På grunn av den lave molekylærvekten, distribueres de hurtig i det ekstracellulære området (dvs. blod og interstitium) hvis de administrereres i vaskulaturet. De fjernes også relativt hurtig fra kroppen. Gadoliniumkelater er funnet særlig nyttige for å øke oppdagelseshyppigheten av metastaser og små tumorer, og for å forbedre tumorklassifisering - det sistnevnte ved å muliggjøre differensiering av vitalt tumorvev (velperfundert og/eller skadet blod-hjernebarriere) fra sentral nekrose og fra omkringliggende ødem eller makroskopisk ikke-affisert vev (se f.eks. C. Olaussen et al., Neuroradiology 1985; 27: 164-171).

I motsetning til dette vil blodpool-MR-kontrastmidler, f.eks. superparamagnetiske jernoksidpartikler, bli værende i vaskulaturet over en lengre periode. Disse har vist seg å være svært nyttige for å forsterke kontrasten i leveren, men også for å oppdage unormal kapillærpermeabilitet, f.eks. "lekkasje" i kapillærvegger i tumorer, f.eks. som et resultat av angiogenese.

Til tross for de ubestridte utmerkede egenskapene til ovennevnte kontrastmidler, er bruken av dem ikke helt uten risiko. Selv om paramagnetiske metallkelatkomplekser vanligvis har høye stabilitetskonstanter, er det mulig at toksiske metallioner frigis i kroppen etter administrasjon. Videre viser denne typen kontrastmidler dårlig spesifisitet.

WO-A-99/35508 offentliggjør en metode for MR-undersøkelse av en pasient ved hjelp av en hyperpolarisert løsning med et høy-Ti-middel som MRI-avbildningsmiddel. Termen "hyperpolarisering" betyr forsterket kjernepolarisering av NMR-aktive kjerner som er til stede i høyT^midlet, dvs. kjerner med ikke-null kjernespinn, fortrinnsvis<13>C- eller<15>N-kjerner. Etter at kjernepolarisering av NMR-aktive kjerner er forsterket, øker populasjonsforskjellen mellom spinn i lav kjernespinntilstand og spinn i eksitert kjernespinntilstand for disse kjernene betydelig, og dermed forsterkes MR-signalintensiteten med en faktor på hundre og mer. Ved bruk av hyperpolarisert<13>C- og/eller<15>N-anriket høy-Trmiddel vil det ikke forekomme noe vesentlig interferens fra bakgrunnssignaler. Dette er fordi den naturlige forekomsten av<13>C og/eller<15>N er neglisjerbar. Dermed vil bildekontrasten bli fordelaktig høy. Flere mulige høy-T^midler egnet for hyperpolarisering og påfølgende bruk som MR-avbildningsmidler, er offentliggjort, deriblant, men ikke begrenset til, ikke-endogene og endogene forbindelser som acetat, pyruvat, oksalat eller glukonat, sukker som glukose eller fruktose, urea, amider, aminosyrer som glutamat, glysin, cystein eller aspartat, nukleotider, vitaminer som askorbinsyre, penicillinderivater og sulfonamider. Det er videre konstatert at intermediater i metabolske sykluser, f.eks. i sitronsyresyklusen, som fumarsyre og pyrodruesyre, er foretrukne avbildningsmidler ved avbildning av metabolsk aktivitet.

Artikkelen av Gould, P,; C- 13 MR tracers show potential for functional diagnostics, Diagnostic Imaging, online June 2004 (2004-06) XP002363324 beskriver en metode for å skille mellom friskt vev og tumor vev omfattende det å ta et direkte<13>C-MR bildet av<13>C-pyruvat og den<13>C-inneholdende metabolitter alanin og laktat fra et individ som er pre-administrert med en sammensetning som inneholder hyperolarisert13C-pyruvat.

EP 1 574 874 beskriver en fremgangsmåte for å måle hyperpolariserte substanser ved NMR ved bruk av kontinuerlig refokusert multiekko spektroskopisk avbildning.

Det må understrekes at signalet til et hyperpolarisert avbildningsmiddel svekkes på grunn av relaksasjon og fortynning ved administrasjon i pasientens kropp. Derfor må Ti -verdien for avbildningsmidler i biologiske væsker (f.eks. blod) være tilstrekkelig høy for å muliggjøre at midlet distribueres til målområdet i pasientens kropp i en høyt hyperpolarisert tilstand.

Overraskende har vi nå funnet en metode for MR-avbildning av tumorer som gjør det mulig å skille mellom tumorvev og friskt vev, hvor hyperpolarisert<13>C-pyruvat blir brukt som avbildningsmiddel.

Foreliggende oppfinnelsen angår således en metode for å skille mellom friskt vev og tumorvev, den nevnte metoden omfatter: (a) opptak av et<13>C-MR-bildet av<13>C-pyruvat og dennes<13>C-holdige metabolitter alanin og laktat fra et individ som har fått pre-administrert en

sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat,

(b) korrigering av laktatbildet for mengden av pyruvat og/eller alanin ved å

multiplisere laktatbildet med det inverterte pyruvat- og/eller laktatbildet,

der et høyt bildesignal fra nevnte korrigerte laktatbilde indikerer tumorvev.

Hyperpolarisering av NMR-aktive<13>C-kjerner kan oppnås med forskjellige metoder (f.eks. beskrevet i WO-A-99/35508), foretrukne metoder er polariseringsoverføring fra en edelgass, "brute force", spinnavkjøling og DNP. For å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat, er det foretrukket å enten polarisere<13>C-pyruvat direkte eller å polarisere<13>C-pyrodruesyre og omdanne den polariserte<13>C-pyrodruesyren til polarisert<13>C-pyruvat, f.eks. ved nøytralisering med en base.

En foretrukken måte å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat på, er polariseringsoverføring fra en hyperpolarisert edelgass. Edelgasser som har kjerner med kjernespinn forskjellig fra null, kan hyperpolariseres, dvs. har polarisering forsterket over likevektpolariseringen, f.eks. ved bruk av sirkulært polarisert lys. En hyperpolarisert edelgass, fortrinnsvis He eller Xe, eller en blanding av slike gasser, kan brukes til å oppnå hyperpolarisering i<13>C-kjerner. Hyperpolariseringen kan også oppnås ved hjelp av en isotopisk anriket hyperpolarisert edelgass, fortrinnsvis<3>He eller<129>Xe. Den hyperpolariserte gassen kan være i gassfasen, den kan være løst opp i en væske/løsning, eller den hyperpolariserte gassen kan tjene som en løsning. Alternativt kan gassen bli kondensert på en avkjølt fast overflate, og bli brukt i denne formen, eller den kan bli sublimert. Intensiv blanding av hyperpolarisert gass med forbindelser som skal polariseres, er foretrukket. Derfor, hvis<13>C-pyrodruesyre er polarisert, som er en væske ved romtemperatur, løses den hyperpolariserte gassen fortrinnsvis opp i en væske/løsning eller tjener som løsning. Hvis<13>C-pyruvat er polarisert, oppløses den hyperpolariserte gassen fortrinnsvis i en væske/løsning, som også løser opp pyruvat.

En annen foretrukken måte for å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat på, er at polariseringen blir overført til NMR-aktive kjerner ved termodynamisk likevekt ved en svært lav temperatur og høyt felt. Hyperpolarisering sammenlignet med operasjonsfeltet og temperatur på NMR-spektrometeret, blir påvirket av bruk av et svært høyt felt og en svært lav temperatur ("brute force"). Den magnetiske feltstyrken som blir brukt, bør være så høy som mulig, mest hensiktsmessig høyere enn 1 T, fortrinnsvis høyere enn 5 T, helst 15 T eller aller helst og særlig foretrukket 20 T eller mer. Temperaturen bør være svært lav, f.eks. 4,2 K eller mindre, fortrinnsvis 1,5 K eller mindre, helst 1,0 K eller mindre, særlig foretrukket 100 mK eller mindre.

En annen foretrukken måte for å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat, er spinnavkjølingsmetoden (spin refrigeration method). Denne metoden dekker spinnpolarisering av en fast forbindelse eller et system ved spinnavkjølingspolarisering. Systemet blir dopet med eller intensivt blandet med egnede paramagnetiske materialer, f.eks. Ni<2+>, lantanid eller actinidioner i krystallform med en symmetriakse av orden tre eller mer. Instrumenteringen er enklere enn det som er nødvendig ved DNP, det kreves ingen uniforme magnetiske felt siden det ikke anvendes noe resonanseksitasjonsfelt. Prosessen utføres ved fysisk rotering av prøven rundt en aksependikulær i retningen av det magnetiske feltet. Forutsetningen for denne metoden er at paramagnetiske typer har en høy anisotropisk g-faktor. Som et resultat av prøverotasjonen, vil den elektronparamagnetiske resonansen bli brakt i kontakt med kjernespinn som fører til en reduksjon i kjernespinntemperaturen. Prøverotasjon utføres inntil kjernespinnpolariseringen har nådd en ny likevekt.

I et mer foretrukken utførelsesform er DNP-metoden (dynamisk kjernepolarisering) brukt til å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat. Polarisering er påvirket av en paramagnetisk forbindelse, det såkalte paramagnetiske midlet eller DNP-midlet. Under DNP-prosessen tilføres energi, normalt i form av mikrobølgestråling, som vil begynne å eksitere det paramagnetiske midlet. Ved svekking til grunntilstand oppstår en overføring av polarisering fra uparrede elektroner av det paramagnetiske midlet til NMR-aktive kjerner i prøven. Generelt brukes et moderat eller høyt magnetisk felt og en svært lav temperatur i DNP-prosessen, f.eks. ved å gjennomføre DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Eller det kan anvendes et moderat magnetisk felt og en hvilken som helst temperatur, der tilstrekkelig polariseringsforsterkning oppnås. DNP-teknikker er f.eks. beskrevet i WO-A-98/58272 og i WO-A-01/96895, begge er inkludert med referanse heri. For å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat ved DNP-metoden, kan enten<13>C-pyruvat og/eller<13>C-pyrodruesyre bli brukt som forbindelsen som skal polariseres.

Om<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat blir brukt, er hovedsakelig avhengig av det paramagnetiske midlet som anvendes i DNP-prosessen. Hvis det paramagnetiske midlet er løselig i<13>C-pyrodruesyre, da brukes helst<13>C-pyrodruesyre og en flytende blanding - helst en flytende løsning - dannes av det paramagnetiske midlet og<13>C-pyrodruesyren. Hvis det paramagnetiske midlet ikke er løselig i<13>C-pyrodruesyre, da brukes<13>C-pyruvat og/eller<13>C-pyrodruesyre og minst én ko-løsemiddel til å danne en flytende blanding, helst en flytende løsning. Det er funnet at en vellykket DNP og dermed polariseringsnivået, er avhengig av forbindelsen som skal polariseres og det paramagnetiske midlet som er i intim kontakt med hverandre. Derfor er ko-løsemiddel helst en ko-løsemiddel eller ko-løsemiddellanding som løser opp begge, det paramagnetiske midlet og<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat. For<13>C-pyruvat er vann foretrukket som ko-løsemiddel.

Videre er det funnet at høyere polariseringsnivåer oppnås av DNP-metoden når blandingen ved avkjøling/frysing danner en glassprøve i stedet for en krystallisert prøve. Igjen, dannelsen av glass muliggjør en mer intim kontakt mellom det paramagnetiske midlet og forbindelsen som skal polariseres.<13>C-pyrodruesyre er en god glassdanner og brukes derfor helst i DNP-prosessen når det paramagnetiske midlet er løselig i<13>C-pyrodruesyre.13C-pyruvat er et salt, og en flytende blanding av en vannholdig løsning av<13>C-pyruvat og et paramagnetisk middel vil resultere i en krystallisert prøve ved frysing. For å unngå dette foretrekkes det å tilsette ytterligere ko-løsemiddler som er gode glassdannere, f.eks. glyserol, propandiol eller glykol.

Derfor, i en utførelsesform, blir<13>C-pyruvat oppløst i vann for å oppnå en vannholdig løsning og et paramagnetisk middel, glyserol og, eventuelt, en ytterligere ko-løsemiddel blir tilsatt for å danne en flytende blanding. I en foretrukken utførelsesform blir<13>C-pyrodruesyre, et paramagnetisk middel og en ko-løsemiddel kombinert for å danne en flytende blanding. I en ennå mer foretrukken utførelsesform blir<13>C-pyrodruesyre og et paramagnetisk middel kombinert for å danne en flytende blanding. Intensiv blanding av forbindelser kan videre utføres på flere måter kjent innen fagfeltet, f.eks. røring, røring ved virvelstrøm og ultralydbehandling.

Den flytende blandingen fryses deretter, før DNP-prosessen utføres. Avkjøling/frysing kan oppnås ved bruk av metoder kjent innen fagfeltet, f.eks. ved frysing av den flytende blandingen i flytende nitrogen eller ved bare å plassere den i polarisereren der flytende helium vil fryse prøven.

Som beskrevet tidligere, er dynamisk kjernepolarisering (DNP) en polariseringsmetode der polarisering av forbindelsen som skal polariseres, blir fremkalt av et DNP-middel, dvs. et paramagnetisk middel/forbindelse.

Mange kjente paramagnetiske forbindelser kan brukes som DNP-middel, f.eks. overgangsmetaller som krom(V)-ioner, organiske frie radikaler som nitroksidradikaler, tritylradikaler eller magnetiske partikler. Slike DNP-midler blir f.eks. beskrevet i WOutførelsesform-A-99/35508, WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711 eller WO-A-96/39367.

I en foretrukken utførelsesform, blir et tritylradikal fra formelen (I),

der

M er hydrogen eller en ekvivalent av et kation, og

R1 som er lik eller ulik, er en rett kjedet eller forgrenet, alternativt hydroksylert, CrCe-alkylgruppe eller en gruppe -(CH2)n-X-R2, der n er 1, 2 eller 3;

X er O eller S, og

R2 er en rett kjedet eller forgrenet, eventuelt hydroksylert, d-C4-alkylgruppe,

brukt som det paramagnetiske midlet for å oppnå<13>C-pyruvat ved hjelp av DNP-metoden.

I en foretrukken utførelsesform er M hydrogen eller en ekvivalent av et fysiologisk tolererbart kation. Termen "fysiologisk tolererbart kation" angir et kation som tolereres av den levende humane eller den ikke-humane animalske kroppen. Fortrinnsvis er M hydrogen eller et alkalikation, et ammoniumion eller et organisk aminion, f.eks. meglumin. Aller helst er M hydrogen eller natrium.

I en annen foretrukken er R1 lik eller ulik, fortrinnsvis lik, og er en rett kjedet eller forgrenet, eventuelt hydroksylert, d-d-alkylgruppe, aller helst metyl, etyl, isopropyl, hydroksymetyl eller hydroksyetyl.

I en ytterligere foretrukken utførelsesform er R1 lik eller ulik, fortrinnsvis ulik og er - CH2-0-(d-d-alkyl), -(CH2)2-0-CH3, -(d-d-alkyl)-0-CH3, -CH2-S-(d-d-alkyl), -

(CH2)2-S-CH3, -(d-C3-alkyl)-S-CH3, -CH2-0-CH3, -CH2-0-C2H5, -CH2-0-C2H4OH, -

CH2-CH2-O-CH3, -CH2-S-CH3, -CH2-S-C2H5, -CH2-S-C2H4OH or -CH2-CH2-S-CH3, aller helst -CH2-CH2-0-CH3.

I en ennå mer foretrukken utførelsesform er M hydrogen eller natrium, og R1 er lik og er -CH2-CH2-0-CH3.

Tritylradikalene fra formelen (I) kan syntetiseres som detaljert beskrevet i WO-A-91/12024, WO-A-96/39367, WO 97/09633 and WO-A-98/39277. Kortfattet kan radikalene syntetiseres ved at tre molare ekvivalenter av en metalert monomerisk arylforbindelse med én molar ekvivalent av et passende beskyttet karboksylsyrederivat for å danne et trimerisk intermediat. Dette intermediatet er metalert og reagerer deretter med f.eks. karbondioksid for å resultere i et trikarboksyl-tritylkarbinol som i neste trinn blir behandlet med en sterk syre for å generere et triarylmetylkation. Dette kationet reduseres deretter for å danne det stabile tritylradikalet.

En flytende blanding som inneholder 13C-pyruvat og/eller13C-pyrodruesyre og eventuelt en løsemiddel fortrinnsvis inneholder 5 til 100 mM tritylradikaler fra formelen (I), helst 10 til 20 mM, særlig foretrukket 12 til 18 mM og aller helst 13 til 17 mM. Det er funnet at oppbygningstiden for polarisering i DNP-prosessen er kortere ved bruk av høyere mengder med radikaler, men det oppnåelige polariseringsnivået er lavere. Derfor må disse to effektene balanseres mot hverandre.

DNP-teknikker er f.eks. beskrevet i WO-A-98/58272 og i WO-A-01/96895, begge er inkludert med referanse heri. Generelt brukes et moderat eller høyt magnetisk felt og en svært lav temperatur i DNP-prosessen, f.eks. ved å gjennomføre DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Eller det kan anvendes et moderat magnetisk felt og en hvilken som helst temperatur, der tilstrekkelig polariseringsforsterkning oppnås. I en foretrukken utførelsesform av metoden, utføres DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Egnede polariseringsenheter er f.eks. beskrevet i WO-A-02/37132. I en foretrukken utførelsesform inneholder polariseringsenheten en kryostat og et polariseringshjelpemiddel, f.eks. et mikrobølgekammer koblet med en bølgeleder til en mikrobølgekilde i et borehull i midten som er omgitt av magnetfeltproduserende hjelpemidler, f.eks. en superledende magnet. Borehullet utvides vertikalt nedover til minst det nivået av en region P, nær den superledende magneten der det magnetiske feltet er tilstrekkelig høyt, f.eks. mellom 1 og 25 T, for at polarisering av<13>C-kjernene skal finne sted. Borehullet for prøven kan fortrinnsvis forsegles og kan evakueres til lave trykk, f.eks. trykk på 1 mbar eller mindre. Introduksjonshjelpemidlet for prøven (dvs. blandingen som inneholder det paramagnetiske midlet og13C-pyruvat og/eller<13>C-pyrodruesyre), f.eks. en avtakbar prøvetransporterende slange, kan føres inn i borehullet. Denne slangen kan føres inn fra toppen av borehullet ned i en posisjon inne i mikrobølgekammeret i region P. Region P er nedkjølt av flytende helium til en temperatur som er lav nok til at polarisering skal finne sted, fortrinnsvis temperaturer på 0,1-100 K, helst 0,5-10 K, aller helst 1-5 K. Introduksjonshjelpemidlet for prøven er fortrinnsvis forseglbart i øvre del, på en passende måte, for å opprettholde delvis vakuum i borehullet. En prøvebeholder, f.eks. et prøvebeger, kan flyttes på og tilpasses inne i den lave enden av introduseringshjelpemidlet for prøven. Prøvebeholderen er fortrinnsvis laget av et lettvektmateriale med en lav spesifikk varmekapasitet og gode kryogene egenskaper, f.eks. KelF (polyklorotrifluoroetylen) eller PEEK (polyetereterketon). Prøvebeholderen kan inneholde mer enn én prøve som skal polariseres.

Prøven settes inn i prøvebeholderen, senkes i det flytende heliumet og gjennomstråles med mikrobølger, fortrinnsvis ved en frekvens på ca. 94 GHz ved 200 mW. Polariseringsnivået kan overvåkes ved å oppnå fast form<13>C-NMR-signaler av prøven under mikrobølgebestrålingen, derfor foretrekkes bruk av en polariseringsenhet som inneholder hjelpemidler for å oppnå fast form<13>C-NMR-spektre i trinn b). Generelt oppnås en saturasjonskurve i et diagram som viser<13>C-NMR-signal vs. tid. Derfor er det mulig å avgjøre når det optimale polariseringsnivået er nådd.

Hvis hyperpolarisering utføres ved hjelp av en metode som krever at prøven skal være i fast form, f.eks. ved hjelp av DNP-metoden, må den faste prøven overføres til flytende tilstand for å anvendes i metoden ifølge oppfinnelsen. Den faste polariserte blandingen løses enten opp som beskrevet i WO-A-02/37132, eller smeltes som beskrevet i WO-A-02/36005. Oppløsning av den faste hyperpolariserte prøven er foretrukket, helst oppløsning i en buffer, fortrinnsvis en fysiologisk tolererbar buffer, for å oppnå en flytende sammensetning. Termen "buffer", slik den er brukt i denne søknaden, betegner én eller flere buffere, dvs. også blandinger av buffere.

Foretrukne buffere er fysiologisk tolererbare buffere, helst buffere som buffer i området mellom pH 7-8, f.eks. fosfatbuffere (KHzPCyNazHPC^), ACES, PIPES, imidazol/HCI, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS eller TRICIN. De mest foretrukne bufferne er fosfatbuffere og TRIS, aller helst TRIS. I en annen utførelsesform er det flere enn én av de ovennevnte foretrukne bufferne som blir brukt, dvs. en blanding av buffere.

Når<13>C-pyrodruesyre ble brukt som forbindelsen som skulle polariseres, omfatter oppløsningen også omdannelse av<13>C-pyrodruesyre til<13>C-pyruvat. For å oppnå dette må<13>C-pyroduresyre reagere med en base. I en annen utførelsesform reagerer<13>C-pyrodruesyre med en base for å omdanne den til<13>C-pyruvat, og deretter blir det tilsatt en buffer. I en annen foretrukken utførelsesform kombineres bufferen og basen i én løsning og denne løsningen blir tilsatt til<13>0-pyrodruesyre, løser den opp og omdanner den til<13>C-pyruvat samtidig. I en annen foretrukken utførelsesform er basen en vannholdig løsning av NaOH, Na2C03eller NaHC03, den mest foretrukne basen er NaOH. I en særlig foretrukken utførelsesform blir en løsning av TRIS-buffer som inneholder NaOH, brukt til å løse opp<13>C-pyrodruesyre og omdanne den til natriumsalt fra<13>C-pyruvat.

I en annen foretrukken utførelsesform inneholder bufferen eller - der det er anvendelig - den kombinerte buffer-/baseløsningen ytterligere én eller flere forbindelser som kan binde eller kompleksere frie paramagnetiske ioner, f.eks. kelatdannende midler som DTPA eller EDTA. Det er funnet at frie paramagnetiske ioner kan forårsake forkortning av T-i i den hyperpolariserte forbindelsen, noe som helst unngås.

Oppløsningen kan utføres helst ved å bruke metodene og/eller enhetene offentliggjort i WO-A-02/37132. Hvis hyperpolariseringen ble utført ved hjelp av DNP-metoden, brukes det en oppløsningsenhet som enten er fysisk separert fra polarisereren, eller en del av et apparat som inneholder polarisereren og oppløsningsenheten. I en foretrukken utførelsesform utføres oppløsningen ved et elevert magnetisk felt for å forbedre relaksasjonen og opprettholde maksimal hyperpolarisering. Feltnoder bør unngås, og lave felt kan lede til forsterket relaksasjon til tross for tiltakene ovenfor.

Hvis hyperpolarisering utføres ved hjelp av DNP-metoden, fjernes det paramagnetiske midlet og/eller reaksjonsprodukter derav, helst fra den<13>C- pyruvatholdige løsningen. Det paramagnetiske midlet og/eller reaksjonsproduktene kan fjernes delvis, i all vesentlighet eller, ideelt, fullstendig. Fullstendig fjerning er foretrukket. Reaksjonsproduktene av for eksempel tritylradikalet fra formelen (I), kan være estere som kan være dannet etter reaksjon av pyrodruesyre med radikaler fra formelen (I) som inneholder hydroksygrupper. Metoder som kan brukes til å fjerne det paramagnetiske midlet og/eller reaksjonsprodukter derav, er kjent innen fagfeltet. Generelt er metoden som brukes, avhengig av det paramagnetiske midlets egenskaper og/eller dets reaksjonsprodukter. Ved oppløsning av den faste prøven etter polarisering kan radikalet presipitere, og det kan lett separeres fra den flytende sammensetningen ved filtrering. Hvis magnetiske partikler brukes som paramagnetiske midler, kan disse partiklene også enkelt fjernes ved filtrering. Hvis det ikke oppstår presipitering, kan det paramagnetiske midlet fjernes ved kromatografiske separasjonsteknikker, f.eks. væskefasekromatografi som reversert fase, rettlinjet fase eller ioneutvekslingskromatografi eller ved ekstraksjon.

Siden tritylradikaler fra formelen (I) har et karakteristisk UV/synlig-absorpsjonsspektrum, er det mulig å bruke UV/synlig-absorpsjonsmåling som en metode for å kontrollere om den finnes i den flytende sammensetningen etter at den er fjernet. For å oppnå kvantitative resultater, dvs. konsentrasjonen av radikalet til stede i den oppløste hyperpolariserte prøven, kan det optiske spektrometeret kalibreres slik at absorpsjonen ved en spesifikk bølgelengde danner en prøve som produserer den motsvarende radikalkonsentrasjonen i prøven.

Den isotopiske anrikningen av<13>C-pyruvat brukt i metoden ifølge oppfinnelsen, - og/eller<13>C-pyrodruesyre som helst brukes til å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat ved hjelp av DNP-metoden - er fortrinnsvis minst 75 %, helst minst 80 % og særlig foretrukket minst 90 %, en isotopisk anrikning over 90 % er det beste og foretrekkes. Ideelt er en anrikning på 100%.13C-pyrudruesyre og/eller13C-pyruvat kan isotopisk anrikes ved C1-posisjon (i det følgende betegnet ^Crpyrodruesyre og<13>C1-pyruvat), ved C2-posisjon (i det følgende betegnet<13>C2-pyrodruesyre og13C2-pyruvat), ved C3-posisjon (i det følgende betegnet 13C3-pyrodruesyre og 13C3-pyruvat), ved C1- og C2-posisjon (i det følgende betegnet<13>C1l2-pyodruesyre og<13>C1l2-pyruvat), ved C1- og C3-posisjon (i det følgende betegnet<13>C1l3-pyrodruesyre og<13>C1l3-pyruvat), ved C2- og C3-posisjon (i det følgende betegnet 13C2,3-pyrodruesyre og<13>C2,3-pyruvat) eller ved C1-, C2- og C3-posisjon (i det følgende betegnet 13C-i ,23-pyrodruesyre og 13C1l23<-py>ruvat), med C1-posisjonen som den foretrukne posisjonen.

Flere metoder for syntesen av 13Crpyrudruesyre og13Crpyruvat er kjent innen fagfeltet. Kortfattet beskriver Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237 en synteserute som er avhengig av beskyttelse og aktivering av et karbonyl-holdig startmateriale som S,S-acetal, f.eks. 1,3-ditian eller 2-metyl-1,3-ditian. Ditian er metalert og reagerer med en metyl-holdig forbindelse og/eller<13>C02. Ved å bruke riktig isotopisk anriket<13>C-komponent som angitt i denne referansen, er det mulig å oppnå ^Crpyruvat, 13C2-pyruvat eller 13C1l2-pyruvat. Karbonylens funksjon blir deretter frigitt ved bruk av konvensjonelle metoder beskrevet i litteraturen. En annen synteserute starter fra eddiksyre som først omdannes til acetylbromid og som deretter reagerer med Cu<13>CN. Nitrilet som oppnås, omdannes til pyrodruesyre via amidet (se f.eks. S.H. Anker et al., J. Biol. Chem. 176

(1948), 1333 eller J. E. Thirkettle, Chem Commun. (1997), 1025). Videre kan<13>C-pyrodruesyre oppnås ved protonering av kommersielt tilgjengelig natrium-<13>C-pyruvat, f.eks. ved metoden beskrevet i patent 6,232,497 (USA).

For å bli brukt i metoden ifølge oppfinnelsen, er det hyperpolariserte<13>C-pyruvatet gitt som en sammensetning som er egnet for administrasjon til en levende human kropp eller en ikke-human animalsk kropp. Sammensetningen inneholder helst en buffer eller en blanding av buffere som beskrevet ovenfor. Sammensetningen kan videre inneholde konvensjonelle farmasøytisk akseptable bærere, tilsetninger og blandingshjelpemidler. Derfor kan sammensetningen for eksempel inkludere stabilisatorer, osmolalitetsjusterende midler, solubiliseringsmidler og lignende.

Pyruvat er en endogen forbindelse som er veldig godt tolerert av den humane kroppen, selv i høye konsentrasjoner. Som et mellomstoff i sitronsyresyklusen, spiller pyruvat en viktig metabolsk rolle i den humane kroppen. Pyruvat omdannes til ulike forbindelser: transaminering resulterer i alanin, via oksidativ dekarboksylering, pyruvat omdannes til acetyl-CoA og bikarbonat, reduksjonen av pyruvat resulterer i laktat og karboksylering i oksaloacetat.

Det er nå funnet at omdannelse av hyperpolarisert<13>C-pyruvat til hyperpolarisert<13>C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat (ved kun<13>Crpyruvat,<13>C12-pyruvat eller 13Ci,23-pyruvat) og hyperpolarisert<13>C-alanin, kan bli brukt til å skille mellom tumorvev og friskt vev i in vivo MR-avbildning. Dette er overraskende siden man må huske at Ti av hyperpolariserte forbindelser svekkes på grunn av relaksasjon og fortynning.<13>C-pyruvat har en T-i-relaksasjon i humant fullblod ved 37 °C av ca. 42 s. Omdannelsen av hyperpolarisert13C-pyruvat til hyperpolarisert13C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin er imidlertid funnet å være rask nok til å tillate signalsporing fra opphavsforbindelsen til<13>C-pyruvat og dennes metabolitter. Mengden alanin, bikarbonat og laktat er avhengig av den metabolske statusen for vevet under undersøkelsen. MR-signalintensiteten fra hyperpolarisert<13>C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin er relatert til mengden av disse forbindelsene og graden av polarisering som er igjen ved tidspunktet for sporing. Som følge av overvåking av omdannelsen av hyperpolarisert<13>C-pyruvat til hyperpolarisert13C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin, er det mulig å studere metabolske prosesser in vivo i den humane kroppen eller den ikke-humane animalske kroppen ved bruk av ikke-invasiv MR-avbildning.

Det er funnet at MR-signalamplituder fra de forskjellige pyruvat-metabolittene, er avhengige av vevstype. Det unike metabolske toppmønsteret som dannes av alanin, laktat, bikarbonat og pyruvat, kan brukes som fingeravtrykk for metabolske tilstander av vevet under undersøkelse, hvilket gjør det mulig å skille mellom friskt vev og tumorvev. Dette gjør sammensetningen som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, til et utmerket middel for in vivo MR-avbildning av tumorer.

Generelt plasseres den som undersøkes, f.eks. pasient eller dyr, i MR-magneten. Tilegnede<13>C-MR RF-spoler er plassert for å dekke området som er av interesse.

Sammensetningen som inneholder<13>C-pyruvat administreres parenteralt, fortrinnsvis intravenøst, intraarterielt eller direkte i området eller organet av interesse. Dose og konsentrasjon av sammensetningen som anvendes i metoden i henhold til oppfinnelsen vil være avhengig av en rekke faktorer, f.eks. toksisitet, evne til å nå et organ og administrasjonsruten. Generelt administreres sammensetningen i en konsentrasjon på opptil 1 mmol pyruvat per kg kroppsvekt, fortrinnsvis 0,01 til 0,5 mmol/kg, helst 0,1 til 0,3 mmol/kg. Administrasjonshastigheten er fortrinnsvis mindre enn 10 ml/s, helst mindre enn 6 ml/min og aller helst fra 5 ml/s til 0,1 ml/s. I mindre enn 400 s etter administrasjonen, fortrinnsvis mindre enn 120 s, helst mindre enn 60 s etter administrasjonen, særlig foretrukket 20 til 50 s etter administrasjonen og aller helst 30 til 40 s etter administrasjonen, en MR-avbildningssekvens brukes til å kode volumet som er av interesse, i en kombinert frekvens og på en spatial selektiv måte. Dette vil resultere i metabolske avbildninger av<13>C-laktat,<13>C-alanin og13C-pyruvat og helst i metabolske avbildninger av<13>C-laktat,<13>C-alanin,13C-bikarbonat og13C-pyruvat. Innenfor den samme tidsperioden kan det tas et protonbilde med eller uten et proton MRI-kontrastmiddel for å oppnå anatomisk og/eller perfusjonsinformasjon.

Kodingen av volumet av interesse, kan oppnås ved å bruke såkalt spektroskopisk avbildningssekvens som beskrevet i f.eks. T.R. Brown et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 3523-3526 (1982); A.A. Maudsley, et al., J. Magn. Res 51, 147-152

(1983). Spektroskopiske bildedata inneholder et antall volumelementer der hvert element inneholder et fullt<13>C-MR-spektrum.<13>C-pyruvat og dennes13C-metabolitter har alle en unik posisjon i et<13>C-MR-spektrum og resonansfrekvensene kan brukes til å identifisere dem. Integralet fra toppunktet på dens resonansfrekvens er direkte koblet til henholdsvis mengden<13>C-pyruvat og dennes13C-metabolitter. Når mengden av<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt er estimert ved hjelp av for eksempel tilpasningsrutiner for tidsområder som beskrevet f.eks. i L. Vanhamme et al., J Magn Reson 129, 35-43 (1997), kan bilder bli generert for<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt der en fargekode eller gråkode representerer mengden<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt som måles.

Selv om spektroskopiske avbildningsmetoder har vist seg å være verdifulle i produksjonen av metabolske bilder ved hjelp av alle typer MR-kjerner f.eks.1H,31P,<23>Na, gjør mengden av repetisjoner som skal til for å kode det spektroskopiske bildet i sin helhet, denne fremgangsmåten mindre egnet for hyperpolarisert<13>C. Man må være nøyaktig for å sikre at hyperpolariserte<13>C- signaler er tilgjengelige under hele MR-datainnsamlingen. På bekostning av redusert signal til støy, kan dette oppnås ved å redusere RF-pulsvinkelen som brukes i hvert fasekodetrinn. Høyere matrisestørrelser krever flere fasekodetrinn og lengre skannetider.

Avbildningsmetoder basert på pionerarbeid av P. C. Lauterbur (Nature, 242, 190-191, (1973) og P. Mansfield (J. Phys. C. 6, L422-L426 (1973)), antyder at anvendelse av en utlesingsgradient under datainnsamlingen vil tillate høyere signal til støy-bilder eller ekvivalente, høyere spatiale oppløsningsbilder. Disse avbildningsmetodene i deres grunnform vil imidlertid ikke være tilgjengelige til å produsere separate bilder for 13C-pyruvat og dennes<13>C-metabolitter, men et bilde som inneholder signalene for<13>C-pyruvat og alle dennes13C-metabolitter, dvs. identifikasjon av spesifikke metabolitter er ikke mulig.

I en foretrukken utførelsesform brukes bildesekvenser som vil gjøre bruk av multiekko for å kode frekvensinformasjonen. Sekvenser som kan produsere separate vann- og fett-<1>H-bilder er for eksempel beskrevet i G. Glover, J Magn Reson Imaging 1991;1:521-530 og S. B. Reeder et al., MRM 51 35-45 (2004). Siden metabolitter som skal spores og som sådan har kjente MR-frekvenser, kan fremgangsmåten som blir drøftet i referansen ovenfor, anvendes til direkte avbildning av<13>C-pyruvat,<13>C-alanin og 13C-laktat og fortrinnsvis 13C-pyruvat, 13C-alanin,<13>C-laktat og<13>C-bikarbonat. Denne prosedyren gjør mer effektiv bruk av det hyperpolariserte<13>C-MR-signalet ved at det gir en bedre signalkvalitet sammenlignet med den klassiske spektroskopiske avbildningsteknikken, en høyere spatial oppløsning og raskere innsamlingstid.

Tumorvev karakteriseres ofte med en økt perfusjon og høyere metabolsk aktivitet. Prosessen med å øke vaskulære bed, angiogenese, forårsakes av celler som på grunn av sine høyere metabolske behov og/eller sine store avstander fra en kapillær, ikke er i stand til å få nok substrater som kan gi dem den energien de trenger for å opprettholde energihomeostase. Det er i dette området, hvor celler har problemer med å produsere nok energi, en markert endring i metabolsk mønster er forventet. Vev som har problemer med å opprettholde energihomeostase vil endre sin energimetabolisme som særlig resulterer i en økt laktatproduksjon. Overraskende nok er det mulig å gjøre denne endringen i metabolismen synlig ved hjelp av hyperpolarisert<13>C-pyruvat innfor det korte MR-avbildningstidsvinduet som er tilgjengelig, dvs. bruke det høye<13>C-laktatsignalet i tumorområdet til å skille tumoren fra friskt vev. Siden perfusjonen er heterogen i tumorvevet, foretrekkes det å korrigere13C-laktatsignalet for mengden pyruvat (<13>C-pyruvatsignal) tilgjengelig i samme region. Ved denne korrigeringen oppnås et vektet laktat over pyruvat-bilde. Dette vil gjøre det mulig å fremheve områder i vevet med et relativt høyt laktatsignal med hensyn til pyruvatsignalet, og dermed forbedre muligheten til å skille mellom tumorvev og friskt vev.

Ved korrigering for pyruvatsignalet blir både laktat- og pyruvatbilder normalisert til maksimalverdi i hvert individuelle bilde. Dernest multipliseres det normaliserte laktatbildet med det inverterte pyruvatbildet, f.eks. det maksimale pyruvatsignalet i bildet minus pyruvatnivået for hver piksel. I det siste trinnet multipliseres intermediatresultatet oppnådd i operasjonen ovenfor, med det opprinnelige laktatbildet.

For å fremheve områder med endret metabolisme kan det høye<13>C-laktatsignalet sammen med et redusert<13>C-alaninsignal brukes i en lignende operasjon som beskrevet i avsnittet ovenfor, hvorved et vektet laktat over alanin-bilde oppnås. Overraskende nok blir identifikasjon av tumorområdet, dvs. muligheten til å skille mellom tumorvev og friskt vev forbedret av denne korrigeringen også. Ved korrigering for alaninsignalet er både laktat- og alaninbilder normalisert til maksimalverdi i hvert individuelle bilde. Dernest multipliseres det normaliserte laktatbildet med det inverterte alaninbildet, f.eks. det maksimale alaninsignalet i bildet minus alaninnivået for hver piksel. I det siste trinnet multipliseres intermediatresultatet oppnådd i operasjonen ovenfor, med det opprinnelige laktatbildet. På en lignende måte kan<13>C-bikarbonatsignalet også inkluderes i analysen. Videre kan et protonbilde innsamlet med eller uten et proton MRI-kontrastmiddel, inkluderes i analysen for å oppnå anatomisk og/eller perfusjonsinformasjon.

I en annen foretrukken utførelsesform administreres sammensetningen som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, gjentatte ganger, og tillater dermed dynamiske studier. Dette er videre en fordel med metoden i henhold til oppfinnelsen sammenlignet med andre MR-avbildningsmetoder som anvender MR-avbildningsmidler som, på grunn av sin relativt lange sirkulasjon i pasientens kropp, ikke tillater dynamiske studier.

Metoden i henhold til oppfinnelsen kan videre brukes ved in vivo MR-tumorklassifisering. De samme metabolske bildene og/eller metabolsk vektede bildene som beskrevet i tidligere avsnitt, kan brukes til dette formålet med egnede "cut off'-kategorier definert, avhengig av tumorstørrelsen og metabolsk aktivitet.

Videre kan metoden i henhold til oppfinnelsen brukes ved in vivo MR-tumorbehandlingsovervåking, f.eks. ved å overvåke direkte endringer i metabolismemønsteret for tumorer ved behandling med terapeutiske antitumormidler og/eller strålingsbehandling eller i forbindelse med en hvilken som helst type intervensjonsteknikk, med eller uten noen form for ablasjon, dvs. kjemisk ablasjon kombinert med radiofrekvenser, mikrobølger eller ultralyd.

Tumor MR-avbildning i henhold til metoden for oppfinnelsen kan påvirkes og forbedres ved å klargjøre pasienten eller dyret på en måte som vil forstyrre proteinmetabolismen, lipidmetabolismen eller energimetabolismen generelt. Måter å oppnå dette på er kjent innen fagfeltet, f.eks. med abrosia (f.eks over natten), glukoseinfusjon osv.

I en foretrukken utførelsesform kan metoden i henhold til oppfinnelsen brukes ved in vivo MR-abvbildning av tumorer, tumorbehandlingsovervåking og/eller tumorklassifisering av hjernetumorer, brysttumorer, colontumorer, lungetumorer, nyretumorer, hode- og nakketumorer, muskeltumorer, ovarietumorer, magetumorer, spiserørstumorer, bukspyttkjerteltumorer og prostatatumorer. Det er videre funnet at metoden i henhold til oppfinnelsen er særlig nyttig ved in vivo MR-prostatatumoravbildning, dvs. prostatatumordiagnostisering og/eller prostatatumorklassifisering og/eller prostatatumorbehandlingsovervåking.

Når en mann kommer til lege med symptomer på smerte eller ubehag i urinveien, mistenkes prostatakreft. Hvis mannen er over 50 år, utføres en PSA-test (Prostate Specific Antigen). Prostatakreft mistenkes på grunnlag av en forhøyet PSA og/eller abnormal DRE (Digital Rectal Examination). Hvis PSA-testen er positiv, sendes pasienten til en spesialist (en urolog) for diagnostisering ved hjelp av ultralydledet biopsi. Av de to millioner biopsiprosedyrene som blir utført i USA og Europa hvert år, er henholdsvis 5 av 6 og 2 av 3 negative. Når det blir oppdaget på et tidlig stadium, er femårsoverlevelseshyppigheten for disse pasientene 100%. Siden prostatakreft er den mest vanlige krefttypen og den andre hyppigste årsaken til kreftdød hos menn, er det stor medisinsk etterspørsel etter en metode for diagnostisering av prostatatumorer som er i stand til å oppdage prostatatumorer på et tidlig stadium, og som kan være til hjelp i å redusere antall biopsiprosedyrer.

<13>C-avbildning av prostata krever en sende-mottaksvolum-<13>C-RF-spole, fortrinnsvis en sendevolum-<13>C-RF-spole kombinert med en endorektal RF-spole for kun MR-mottak, og helst brukes en sende-mottaks-faset arrayvolum-<13>C-RF-spole kombinert med en endorektal<13>C-RF-spole for kun MR-mottak. Særlig foretrukket er spoler som utfører innsamlingen av et<1>H-prostatabilde mulig etter<13>C-avbildningen.

Eksempler

Eksempel 1: Syntese av tris(8-karboksy-2,2,6,6-(tetra(metoksyetyl)benzo-[1,2-4,5']bis-(1,3)ditiol -4-yl)metylnatriumsalt 10 g (70 mmol) tris(8-karboksy-2,2,6,6-(tetra(hydroksyetyl)benzo- [1,2-4,5']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt som er blitt syntetisert i henhold til eksempel 7 av WO-A1-98/39277, ble suspendert i 280 ml dimetylacetamid under en argonatmosfære. Natriumhydrid (2,75 g) etterfulgt av metyliodid (5,2 ml) ble tilført og reaksjonen som er svakt eksotermisk, fikk fortsette 1 time i et 34 °C vannbad i 60 min. Tilsetningen av natriumhydrid og metyliodid ble gjentatt to ganger, i samme mengde for hver av forbindelsene, og etter den siste tilsetningen ble det rørt i blandingen ved romtemperatur i 68 timer. Deretter ble det tilsatt i 500 ml vann. pH-en ble justert til pH > 13 ved hjelp av 40 ml 1 M NaOH (aq), og det ble rørt i blandingen ved omgivelsestemperatur i 15 timer for hydrolyse av de formede metylesterne. Blandingen ble deretter omdannet til syre ved hjelp av 50 ml 2 M HCI (aq) til en pH på ca. 2 og 3 ganger det ekstraherte etylacetatet (500 ml og 2 x 200 ml). Den kombinerte organiske fasen ble tørket over Na2S04, og deretter evaporert til tørr tilstand. Råproduktet (24 g) ble renset ved forberedende HPLC ved bruk av acetonitril/vann som eluenter. De innsamlede fraksjonene ble evaporert for å fjerne acetonitril. Den gjenværende vannfasen ble ekstrahert med etylacetat, og den organiske fasen ble tørket over Na2S04og deretter evaporert til tørr tilstand. Vann (200 ml) ble tilsatt restproduktet, og pH-en ble nøye justert med 0,1 M NaOH (aq) til 7. Restproduktet oppløses langsomt under denne prosessen. Etter nøytralisering ble den vannholdige løsningen frysetørret.

Eksempel 2: Produksjon av en sammensetning som inneholder hyperpolarisert13C-pyruvat med DNP-metoden ved bruk av13C-

pyrodruesyre og tritylradikal fra eksempel 1

En 20 mM løsning ble laget ved å løse opp 5,0 mg av radikalet fra eksempel 1 i<13>Ci-pyrodruesyre (164 ul). Prøven ble blandet til homogenitet, og et aliquot av løsningen (41 mg) ble plassert i et prøvebeger og satt i DNP-polarisereren.

Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz). Etter 2 timer ble polariseringen stoppet, og prøven ble oppløst ved hjelp av en oppløsningsenhet i henhold til WO- A-02/37132 i en vannholdig løsning av natriumhydroksid og tris(hydroksymetyl)-aminometan (TRIS), for å gi en nøytral løsning av hyperpolarisert natrium<13>d-pyruvat. Den oppløste prøven ble raskt analysert med<13>C-NMR for å fastsette polariseringen og en 19,0 %<13>C polarisering ble oppnådd.

Eksempel 3: Produksjon av en sammensetning som inneholder hyperpolarisert13C-pyruvat med DNP-metoden ved bruk av13C-

pyrodruesyre og tritylradikal fra eksempel 1

En 15 mM løsning ble laget ved å løse opp radikalet fra eksempel 1 (209,1 mg) i en blanding av<13>d-pyrudruesyre (553 mg) og umerket pyrudruesyre (10,505 g). Prøven ble blandet til homogenitet, og et aliquot av løsningen (2,015 g) ble plassert i et prøvebeger og satt i DNP-polarisereren.

Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz). Etter 4 timer ble polariseringen stoppet, og prøven ble oppløst ved hjelp av en oppløsningsenhet i henhold til WO-A-02/37132 i en vannholdig løsning av natriumhydroksid og tris(hydroksymetyl)-aminometan (TRIS), for å gi en nøytral løsning av hyperpolarisert natrium 13Cr pyruvat med en total pyruvatkonsentrasjon på 0,5 M i 100 mM TRIS-buffer. I serier med oppløsningsenheten ble det koblet til en kromatografisk kolonne. Kolonnen består av en innsats (D = 38 mm; h = 10 mm) som inneholder hydrofobisk pakkemateriale (Bondesil-C18, 40UM Delenummer:12213012) som leveres av Varian. Den oppløste prøven ble tvunget gjennom kolonnen som selektivt adsorberte radikalet. Den filtrerte løsningen ble raskt analysert med<13>C-NMR for å fastsette polariseringen, og en 16,5 %<13>C-polarisering ble oppnådd. Restproduktet for radikalkonsentrasjonen ble deretter analysert med et UV-spektrofotometer ved 469 nm og ble fastsatt til under påvisningsgrensen på 0,1 uM.

Eksempel 4: Produksjon av hyperpolarisert<13>C-pyruvat med DNP-metoden ved bruk av<13>C-pyrodruesyre og Tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksy-etoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-']bis(1,3)ditiol-4-yl)metyl-natriumsalt

Tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksy-etoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt ble syntetisert som beskrevet i eksempel 29 i WO-A-97/09633.

En 20 mM løsning ble laget ved å løse opp tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksyetoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt i ^d-pyrodruesyre (83,1 mg). Prøven ble blandet til homogenitet, plassert i et prøvebeger og satt inn i DNP-polarisereren. Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz).<13>C-NMR-signalet fra prøven ble oppnådd ved hjelp av et Varian lnova-200 NMR-spektrometer. DNP-forsterkning ble kalkulert fra en enhet med termisk likevekt13C-NMR signal og forsterket NMR-signal. 16 %13C-polariseringen ble oppnådd.

Eksempel 5: MR-avbildning av tumor ved bruk av en sammensetning som

inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat som avbildningsmiddel

5.1 Tumor animalsk modell og tumorklargjøring

R3230AC er et adenokarsinom mammae hos rotte som kan opprettholdes hos Fischer 344 hunnrotter. For å etablere en animalsk tumormodell ble en fryst ampulle med R32030-celler som inneholder RPMI 1640, 10 % FBS og 10 % DMSO raskt tinet opp i 37 °C. Deretter ble celleløsningen overført til FBS, og økende volumer med RPMI 1640 ble tilført. Til slutt ble cellesuspensjonen overført til en 25 cm<2>vekstkolbe, og lagt i en inkubator på 37 °C, 5 % C02. Vekstmediet ble byttet annen hver dag. På dagen for infeksjon av rotte ble fjerning av cellene utført enten med mekanisk kraft eller ved bruk av trypsin. Cellene ble vasket ved bruk av fosfatbuffer uten kalsium og magnesium. Trypsin (0,05 % trypsin i 0,02 % EDTA) ble tilført i 2-5 min. Deretter ble 5 ml FBS tilsatt og cellene ble overført i et glassbeger som inneholdt RPMI 1640 med FCS og antibiotika (100IU/ml penicillin, 100 I U/ml streptomysin og 2,5 ug/ml amfotericin B). Celleløsningen ble sentrifugert og cellepelleten ble resuspendert i 20 ml RPMI med FBS og antibiotika, sentrifugering og resuspensjon ble gjentatt. Cellene ble deretter aliquotert to ampuller som inneholdt 4 x 10<6>celler/ml RPMI 1640. For å oppnå donortumorer ble Fischer 344 hunnrotter (Charles River, 180-200 g) gitt bedøvelse og 0,3 ml av cellesuspensjonen ble injisert subkutant i lyskeregionen på begge sider. 15 og 22 dager senere, ble deler av tumoren klargjort som beskrevet i F.A. Burgener et al., Invest Radiol 22/6 (1987), 472-478; S. Saini et al., J. Magn. Reson. 129/1 (1997), 35-43). To innsnitt ble gjort på ventralt abdomen på Fischer mottakerhunnrottene. En tumordel ble innsatt i hver lomme, og innsnittene ble lukket. Rottene ble brakt til avbildning 12-14 dager etter tumorinnpoding.

5.2 Rotteklargjøring og proton-MR-avbildning

Veide rotter ble gitt bedøvelse ved bruk av isofluran (2-3 %) og lagt på et varmebord for å sikre en kroppstemperatur på rundt 37 °C. Et kateter ble introdusert i halevenen og inn i arteria carotis communis sinistra. Rottene ble transportert til MR-maskinen og plassert på en hjemmelaget pute som ble oppvarmet til ca. 37 °C ved hjelp av sirkulerende FC-104 Fluorinert. Denne væsken vil ikke forårsake bakgrunnssignaler ved<1>H- og<13>C-MR-avbildning. Bedøvelse ble fortsatt ved hjelp av 1-2 % isofluran levert via en lang slange i et åpent pustesystem ved en hastighet på 0,4 l/min. Arteriekateteret ble koblet til via en T-tube til en trykkregistrator og en pumpe som leverer saltløsning (hastighet 0,15 l/min) for å unngå kateterklumping. Rottene ble plassert i en MR-spole (Rapid Biomedical, Germany) og avbildet ved hjelp av en standard proton MR-avbildningssekvens for å få anatomisk informasjon og for å bestemme tumorens beliggenhet.

5.3<13>C-MR-avbildning

Basert på protonfrekvensen funnet av MR-systemet ble MR-frekvensen for 13Cr alanin beregnet i henhold til følgende ligning: Frekvens<13>C-i-alanin = 0,25144 x [(systemfrekvens proton x 1,00021) - 0,000397708]

Frekvensen beregnet posisjonerte MR-signalene som oppstod fra<13>C-i-alanin i resonans med<13>Crlaktat til venstre og 13Crpyruvat resonerer til høyre for 13Cr alanin. En ikke-lokalisert MR-spektroskopisekvens ble kjørt for å sikret at 13C-MR-spole og systemets MR-frekvens var satt opp på riktig måte.<13>C-bildelokasjonen ble plassert for å dekke tumoren (snittykkelse 10 mm, i plan pikselstørrelse 5x5 mm<2>). I rekonstruksjonsfasen ble bildedataene null-fyllt for å resultere i en oppløsning på 2,5 x 2,5 x 10 mm<3>.<13>C-rpyruvat i TRIS-buffer (90 mM) ble injisert i en dose på 10 ml/kg i en periode på 12 s med minimum volum på 2 ml i halevenen og 30 s etter injeksjonsstart (dvs. 18 s etter avslutning av injeksjonen), ble den kjemiske overgangen<13>C-MR-sekvens startet.

5.4 Analyse av MR-avbildningsdata

MR-avbildning resulterte i en matrise som inneholdt 16x16 elementer, der hvert element eller voxel/piksel inneholdt et<13>C-MR-spektrum. I rekonstruksjonsfasen var matrisen null-fylt til 32 x 32, en matematisk operasjon som hjelper å forbedre spatial oppløsning. Datasetet som skulle analyseres inneholdt 1024 spektra som ble eksportert til Dicom<®->format (DICOM er det registrerte varemerket for National Electrical Manufacturers Association for standardpublikasjoner angående digital kommunikasjon av medisinsk informasjon) for ytterligere analyse. Ca. halvparten av disse spektra inneholdt ikke MR-signaler siden posisjonen til disse voxelene var utenfor dyret. En plassering innenfor dyret viste voxler med høye pyruvatsignaler og uvesentlige laktat- og alaninsignaler ("blodpool") mens andre voxler viste pyruvat, alanin og laktat ved omtrent samme intensitet.

Amplitudene for pyruvat, alanin og laktat ble estimert ved hjelp av domenetilpasningsprosedyrer som inkluderte følgende: Nullsekvensfasen er konstant over datasettet, den første sekvensfasen er 1,4 ms, linjebredden eller dempning i tidsområdet kan variere mellom 0,5 og 3 ganger gjennomsnittsbredden av hele datasettet for hver metabolitt uavhengig, og frekvensen kan variere med 20 hz i begge retninger med hensyn til gjennomsnittlig frekvens over hele datasettet før den høyeste toppen, som må identifiseres av brukeren.

Amplituder for laktat, alanin og pyruvat ble omordnet i en matrise og omprøvet til å samsvare med oppløsningen av protonet anatomiske MR-bilde.<13>C-MR-bilder ble projisert på anatomiske bilder ved hjelp av en automatisk prosedyre for å oppnå et operator-uavhengig resultat. Resultatene ble vist i bildesett som inneholder det anatomiske protonbildet til tumoren i rotten, det metabolske<13>C-bilde for pyruvat, laktat og alanin projisert på det anatomiske bildet, bilder som viser hver piksel

a) ([laktatjnormx ([pyruvat]max- [pyruvat])n0rm) x [laktat] og

b) ([laktat]norm x ([alanin]max - [alanin])norm) x [laktat]

der termen "[....]norm representerer den normaliserte amplituden, dvs. skalert til

den høyeste verdien i det metabolske bildet og [laktat] amplituden beregnet.

Et vellykket resultat for diskriminering av tumorvev og friskt vev i et metabolsk<13>C-MR-bildet ble definert som høyeste laktatsignal i tumorområdet eller en høyt vektet ratiolaktat over pyruvat i tumorområdet samt en høyt vektet laktat over alanin-ratio på den samme piksellokasjonen.

5.5 Biologisk analyse

Tumorområder ble visuelt undersøkt for å oppdage tegn på blødning. Tumorer ble frigjort fra rottekroppene, veid og delt i to. Tumorens innside ble undersøkt visuelt og vurdert for homogenitet, nekrose og blødning. Tumorvevet ble oppbevart i 4 % formalin.

En tumor-bærende rotte ble ansett som egnet for evaluering hvis følgende kriterier ble oppfylt: tumorvekt > 100 mg, ingen synlige nekroser eller cyster i tumorens innside, en kroppstemperatur over 35 °C og et gjennomsnittlig arterielt blodtrykk over 60 mmHg ved MR-undersøkelse.

5.6 Resultater

Totalt 30 ulike tumorer ble avbildet hos 18 rotter. 1 rotte og 3 tumorer oppfylte ikke de biologiske kriteriene beskrevet i foregående avsnitt 5.5. De gjenværende 26 tumorene hos 17 rotter var homogene og hadde en massiv ikke-nekrotisk innside. Gjennomsnittlig polarisering av<13>C-i-pyruvat ved injeksjon var 21,2 ± 2,9%

(middelverdi ± SD) og pH var 8,08 ±0,14 (middelverdi ± SD).

Figur 1 viser et typisk sett med bilder av en avbildet rotte med (1) protonreferansebilde, der piler indikerer tumorlokasjonene, (2)<13>C-pyruvatbilde, (3)<13>C-laktatbilde (4)<13>C-alaninbilde (5)<13>C-laktatbilde korrigert for<13>C-pyruvat og (6)<13>C-laktatbilde korrigert for<13>C-alanin. Bildene (2) til (6) er slått sammen med protonreferansebildet. Figur 2 viser det samme settet med bilder, men med bildene (2) til (6) som ikke er slått sammen med det anatomiske protonbildet.

Som et resultat er tumorlokasjonen som indikert av et høyt pyruvatsignal (2), på grunn av høy metabolsk aktivitet. Laktatsignaiet (3) identifiserer imidlertid den korrekte lokasjonen av tumoren. Alanin er synlig i skjelettmusklene og er fraværende i tumorvevet (4). Pyruvat- og alaninkorrigerte laktatbilder, (5) og (6), resulterer også i en utmerket kontrast for tumoren.

Det ble derfor demonstrert at tumorlokasjonen i de metabolske bildene er indikert av et høyt laktatsignal, et høyt laktatsignal korrigert for pyruvat og et høyt laktatsignal korrigert for alanin.

Analysen for metabolske<13>C-MR-bilder avslørte en metabolsk kontrast i tumorområdet i

• 24 av 26 tumorer for laktatsignalet

• 26 av 26 tumorer for laktatsignalet, pyruvatkorrigert (5,5,,a))

• 26 av 26 tumorer for laktatsignalet, alaninkorrigert (5,5, a))

Den totale suksessraten for dette studiet var 26 av 26, eller 100 %.

Med dette studiet ble det demonstrert at tumorer kan identifiseres ved bruk av hyperpolarisert<13>Crpyruvat som når området av interesse (tumor) i løpet av en tidsperiode som gjør det mulig å avbilde forbindelsen og dennes metabolitter.

Claims (9)

1. Metode for å skille mellom friskt vev og tumorvev, den nevnte metoden omfatter: (a) opptak av et<13>C-MR-bildet av<13>C-pyruvat og dennes<13>C-holdige metabolitter alanin og laktat fra et individ som har fått pre-administrert en sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, (b) korrigering av laktatbildet for mengden av pyruvat og/eller alanin ved å multiplisere laktatbildet med det inverterte pyruvat- og/eller laktatbildet, der et høyt bildesignal fra nevnte korrigerte laktatbilde indikerer tumorvev.

2. Metoden i henhold til krav 1 hvori hyperpolarisert<13>C-pyruvat er oppnådd ved hyperpolarisering av<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat ved hjelp av DNP-metoden.

3. Metoden i henhold til krav 1 eller 2 hvori sammensetningen som inneholder<13>C-pyruvat videre inneholder én eller flere buffere valgt fra gruppen som inneholder fosfatbuffer (KHzPOVNazHPCM), ACES, PIPES, imidazol/HCI, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS og TRICIN.

4. Metode i henhold til krav 1 eller 2 hvori avbildningssekvenser som bruker multiekko til å kode for frekvensinformasjon, er brukt for å ta opp 13C-bildene ifølge trinn a).

5. Metode i henhold til krav 1 eller 2 hvori<13>C-bildene ifølge trinn a) er tatt opp mindre enn 400 s etter administrasjon av sammensetningen som inneholder<13>C-pyruvat.

6. Metode i henhold til krav 1 eller 2 hvori det i tillegg tas opp protonbilde med eller uten et proton-MRI-kontrastmiddel.

7. Metode i henhold til krav 1 til 7 der den nevnte korrigeringen er utført ved å (i) normalisere laktat- og pyruvat- og/eller alaninbilder til maksimal verdi i hvert individuelle bilde (ii) multiplisere det normalisert laktatbilde med det inverterte pyruvat-og/eller alaninbildet; og (iii) multiplisere resultatene ifølge trinn (ii) med det opprinnelige laktatbildet.

8. Metoden i henhold til krav 1 til 7 der tumoren er en hjernetumor, brysttumor, colontumor, lungetumor, nyretumor, hode- og nakke-tumor, muskeltumor, ovarietumor, magetumor, bukspyttkjerteltumor, spiserørstumor eller prostatatumor.

9. Metode i henhold til krav 1 til 8 for in vivo overvåking av MR-tumorbehandling og/eller tumorklassifisering.