NO339119B1

NO339119B1 - Method to distinguish between healthy tissue and tumor tissue

Info

Publication number: NO339119B1
Application number: NO20071092A
Authority: NO
Inventors: Mikkel Thaning
Original assignee: Zandt Rene Int; Ge Healthcare As
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2007-02-27
Publication date: 2016-11-04
Also published as: NO20071092L

Description

Oppfinnelsen gjelder en metode for tumor avbildning ved hjelp av<13>C-pyruvat som MR-avbildningsmiddel, metoden gjør det mulig å skille mellom tumorvev og friskt vev. The invention relates to a method for tumor imaging using<13>C-pyruvate as an MR imaging agent, the method makes it possible to distinguish between tumor tissue and healthy tissue.

Magnetresonansavbildning (MRI) er en avbildningsteknikk som er blitt særlig attraktiv for leger, siden dette gir mulighet for å avbilde en pasients kropp, eller deler av den, på en ikke-invasiv måte og uten at pasienten og det medisinske personellet utsettes for potensiell skadelig stråling som ved røntgenavbildning. På grunn av den høye kvaliteten på bildene, er MRI en gunstig bildeteknikk ved avbildning av bløtvev og organer, og den gir mulighet til å skille friskt vev fra sykt vev, f.eks. tumorer og lesjoner. Magnetic resonance imaging (MRI) is an imaging technique that has become particularly attractive to doctors, as it allows imaging of a patient's body, or parts of it, in a non-invasive manner and without exposing the patient and medical staff to potentially harmful radiation as in X-ray imaging. Due to the high quality of the images, MRI is a favorable imaging technique for imaging soft tissues and organs, and it allows to distinguish healthy tissue from diseased tissue, e.g. tumors and lesions.

Magnetresonansavbildning av tumorer kan utføres med eller uten MR-kontrastmidler. På et MR-bilde som tas uten kontrastmiddel, vil tumorer fra en størrelse på ca. 1-2 cm og større vises relativt klart. Kontrast-forsterket MRI gjør det imidlertid mulig å oppdage mye mindre vevsendringer, dvs. tumorer som er mye mindre. Dette gjør kontrast-forsterket MRI til et betydningsfullt verktøy for å oppdage tumorer på et tidlig stadium samt oppdagelse av metastaser. Magnetic resonance imaging of tumors can be performed with or without MR contrast agents. On an MR image taken without contrast agent, tumors from a size of approx. 1-2 cm and larger appear relatively clearly. However, contrast-enhanced MRI makes it possible to detect much smaller tissue changes, i.e. tumors that are much smaller. This makes contrast-enhanced MRI an important tool for detecting tumors at an early stage as well as detecting metastases.

Flere typer kontrastmidler er blitt brukt ved magnetresonansavbildning av tumorer. Vannløselige paramagnetiske metallkelater, f.eks. gadoliniumkelater som Omniscan™ (Amersham Health), er MR-kontrastmidler som er mye brukt. På grunn av den lave molekylærvekten, distribueres de hurtig i det ekstracellulære området (dvs. blod og interstitium) hvis de administrereres i vaskulaturet. De fjernes også relativt hurtig fra kroppen. Gadoliniumkelater er funnet særlig nyttige for å øke oppdagelseshyppigheten av metastaser og små tumorer, og for å forbedre tumorklassifisering - det sistnevnte ved å muliggjøre differensiering av vitalt tumorvev (velperfundert og/eller skadet blod-hjernebarriere) fra sentral nekrose og fra omkringliggende ødem eller makroskopisk ikke-affisert vev (se f.eks. C. Olaussen et al., Neuroradiology 1985; 27: 164-171). Several types of contrast agents have been used in magnetic resonance imaging of tumors. Water-soluble paramagnetic metal chelates, e.g. gadolinium chelates such as Omniscan™ (Amersham Health), are widely used MR contrast agents. Because of their low molecular weight, they are rapidly distributed in the extracellular space (ie, blood and interstitium) if administered into the vasculature. They are also removed relatively quickly from the body. Gadolinium chelates have been found particularly useful for increasing the detection rate of metastases and small tumors, and for improving tumor classification - the latter by enabling the differentiation of vital tumor tissue (well-perfused and/or damaged blood-brain barrier) from central necrosis and from surrounding edema or macroscopically not -affected tissue (see e.g. C. Olaussen et al., Neuroradiology 1985; 27: 164-171).

I motsetning til dette vil blodpool-MR-kontrastmidler, f.eks. superparamagnetiske jernoksidpartikler, bli værende i vaskulaturet over en lengre periode. Disse har vist seg å være svært nyttige for å forsterke kontrasten i leveren, men også for å oppdage unormal kapillærpermeabilitet, f.eks. "lekkasje" i kapillærvegger i tumorer, f.eks. som et resultat av angiogenese. In contrast, blood pool MRI contrast agents, e.g. superparamagnetic iron oxide particles, remain in the vasculature for a longer period of time. These have proven to be very useful for enhancing contrast in the liver, but also for detecting abnormal capillary permeability, e.g. "leakage" in capillary walls in tumors, e.g. as a result of angiogenesis.

Til tross for de ubestridte utmerkede egenskapene til ovennevnte kontrastmidler, er bruken av dem ikke helt uten risiko. Selv om paramagnetiske metallkelatkomplekser vanligvis har høye stabilitetskonstanter, er det mulig at toksiske metallioner frigis i kroppen etter administrasjon. Videre viser denne typen kontrastmidler dårlig spesifisitet. Despite the undisputed excellent properties of the above contrast agents, their use is not entirely without risk. Although paramagnetic metal chelate complexes usually have high stability constants, it is possible that toxic metal ions are released into the body after administration. Furthermore, this type of contrast agent shows poor specificity.

WO-A-99/35508 offentliggjør en metode for MR-undersøkelse av en pasient ved hjelp av en hyperpolarisert løsning med et høy-Ti-middel som MRI-avbildningsmiddel. Termen "hyperpolarisering" betyr forsterket kjernepolarisering av NMR-aktive kjerner som er til stede i høyT^midlet, dvs. kjerner med ikke-null kjernespinn, fortrinnsvis<13>C- eller<15>N-kjerner. Etter at kjernepolarisering av NMR-aktive kjerner er forsterket, øker populasjonsforskjellen mellom spinn i lav kjernespinntilstand og spinn i eksitert kjernespinntilstand for disse kjernene betydelig, og dermed forsterkes MR-signalintensiteten med en faktor på hundre og mer. Ved bruk av hyperpolarisert<13>C- og/eller<15>N-anriket høy-Trmiddel vil det ikke forekomme noe vesentlig interferens fra bakgrunnssignaler. Dette er fordi den naturlige forekomsten av<13>C og/eller<15>N er neglisjerbar. Dermed vil bildekontrasten bli fordelaktig høy. Flere mulige høy-T^midler egnet for hyperpolarisering og påfølgende bruk som MR-avbildningsmidler, er offentliggjort, deriblant, men ikke begrenset til, ikke-endogene og endogene forbindelser som acetat, pyruvat, oksalat eller glukonat, sukker som glukose eller fruktose, urea, amider, aminosyrer som glutamat, glysin, cystein eller aspartat, nukleotider, vitaminer som askorbinsyre, penicillinderivater og sulfonamider. Det er videre konstatert at intermediater i metabolske sykluser, f.eks. i sitronsyresyklusen, som fumarsyre og pyrodruesyre, er foretrukne avbildningsmidler ved avbildning av metabolsk aktivitet. WO-A-99/35508 discloses a method for MRI examination of a patient using a hyperpolarized solution with a high-Ti agent as the MRI imaging agent. The term "hyperpolarization" means enhanced nuclear polarization of NMR-active nuclei present in the high T^ medium, i.e., nuclei with non-zero nuclear spin, preferably <13>C or <15>N nuclei. After nuclear polarization of NMR-active nuclei is enhanced, the population difference between spins in the low nuclear spin state and spins in the excited nuclear spin state for these nuclei increases significantly, thus amplifying the MR signal intensity by a factor of a hundred or more. When using hyperpolarized<13>C- and/or<15>N-enriched high-Tr agent, no significant interference from background signals will occur. This is because the natural occurrence of <13>C and/or <15>N is negligible. Thus, the image contrast will be advantageously high. Several possible high-T^ agents suitable for hyperpolarization and subsequent use as MR imaging agents have been disclosed, including, but not limited to, non-endogenous and endogenous compounds such as acetate, pyruvate, oxalate or gluconate, sugars such as glucose or fructose, urea , amides, amino acids such as glutamate, glycine, cysteine or aspartate, nucleotides, vitamins such as ascorbic acid, penicillin derivatives and sulfonamides. It has also been established that intermediates in metabolic cycles, e.g. in the citric acid cycle, such as fumaric acid and pyruvic acid, are preferred imaging agents when imaging metabolic activity.

Artikkelen av Gould, P,; C- 13 MR tracers show potential for functional diagnostics, Diagnostic Imaging, online June 2004 (2004-06) XP002363324 beskriver en metode for å skille mellom friskt vev og tumor vev omfattende det å ta et direkte<13>C-MR bildet av<13>C-pyruvat og den<13>C-inneholdende metabolitter alanin og laktat fra et individ som er pre-administrert med en sammensetning som inneholder hyperolarisert13C-pyruvat. The article by Gould, P,; C- 13 MR tracers show potential for functional diagnostics, Diagnostic Imaging, online June 2004 (2004-06) XP002363324 describes a method for distinguishing between healthy tissue and tumor tissue comprising taking a direct<13>C-MR image of< 13>C-pyruvate and the<13>C-containing metabolites alanine and lactate from a subject pre-administered with a composition containing hyperolarized 13C-pyruvate.

EP 1 574 874 beskriver en fremgangsmåte for å måle hyperpolariserte substanser ved NMR ved bruk av kontinuerlig refokusert multiekko spektroskopisk avbildning. EP 1 574 874 describes a method for measuring hyperpolarized substances by NMR using continuous refocused multi-echo spectroscopic imaging.

Det må understrekes at signalet til et hyperpolarisert avbildningsmiddel svekkes på grunn av relaksasjon og fortynning ved administrasjon i pasientens kropp. Derfor må Ti -verdien for avbildningsmidler i biologiske væsker (f.eks. blod) være tilstrekkelig høy for å muliggjøre at midlet distribueres til målområdet i pasientens kropp i en høyt hyperpolarisert tilstand. It must be emphasized that the signal of a hyperpolarized imaging agent is weakened due to relaxation and dilution upon administration in the patient's body. Therefore, the Ti value of imaging agents in biological fluids (eg blood) must be sufficiently high to enable the agent to be distributed to the target area of the patient's body in a highly hyperpolarized state.

Overraskende har vi nå funnet en metode for MR-avbildning av tumorer som gjør det mulig å skille mellom tumorvev og friskt vev, hvor hyperpolarisert<13>C-pyruvat blir brukt som avbildningsmiddel. Surprisingly, we have now found a method for MR imaging of tumors that makes it possible to distinguish between tumor tissue and healthy tissue, where hyperpolarized<13>C-pyruvate is used as an imaging agent.

Foreliggende oppfinnelsen angår således en metode for å skille mellom friskt vev og tumorvev, den nevnte metoden omfatter: (a) opptak av et<13>C-MR-bildet av<13>C-pyruvat og dennes<13>C-holdige metabolitter alanin og laktat fra et individ som har fått pre-administrert en The present invention thus relates to a method for distinguishing between healthy tissue and tumor tissue, the said method comprises: (a) recording of a<13>C-MR image of<13>C-pyruvate and its<13>C-containing metabolites alanine and lactate from an individual who has been pre-administered a

sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, composition containing hyperpolarized<13>C-pyruvate,

(b) korrigering av laktatbildet for mengden av pyruvat og/eller alanin ved å (b) correcting the lactate image for the amount of pyruvate and/or alanine by

multiplisere laktatbildet med det inverterte pyruvat- og/eller laktatbildet, multiply the lactate image by the inverted pyruvate and/or lactate image,

der et høyt bildesignal fra nevnte korrigerte laktatbilde indikerer tumorvev. where a high image signal from said corrected lactate image indicates tumor tissue.

Hyperpolarisering av NMR-aktive<13>C-kjerner kan oppnås med forskjellige metoder (f.eks. beskrevet i WO-A-99/35508), foretrukne metoder er polariseringsoverføring fra en edelgass, "brute force", spinnavkjøling og DNP. For å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat, er det foretrukket å enten polarisere<13>C-pyruvat direkte eller å polarisere<13>C-pyrodruesyre og omdanne den polariserte<13>C-pyrodruesyren til polarisert<13>C-pyruvat, f.eks. ved nøytralisering med en base. Hyperpolarization of NMR active<13>C nuclei can be achieved by various methods (eg described in WO-A-99/35508), preferred methods being polarization transfer from a noble gas, brute force, spin cooling and DNP. To obtain hyperpolarized<13>C-pyruvate, it is preferred to either polarize<13>C-pyruvate directly or to polarize<13>C-pyruvic acid and convert the polarized<13>C-pyruvic acid into polarized<13>C- pyruvate, e.g. by neutralization with a base.

En foretrukken måte å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat på, er polariseringsoverføring fra en hyperpolarisert edelgass. Edelgasser som har kjerner med kjernespinn forskjellig fra null, kan hyperpolariseres, dvs. har polarisering forsterket over likevektpolariseringen, f.eks. ved bruk av sirkulært polarisert lys. En hyperpolarisert edelgass, fortrinnsvis He eller Xe, eller en blanding av slike gasser, kan brukes til å oppnå hyperpolarisering i<13>C-kjerner. Hyperpolariseringen kan også oppnås ved hjelp av en isotopisk anriket hyperpolarisert edelgass, fortrinnsvis<3>He eller<129>Xe. Den hyperpolariserte gassen kan være i gassfasen, den kan være løst opp i en væske/løsning, eller den hyperpolariserte gassen kan tjene som en løsning. Alternativt kan gassen bli kondensert på en avkjølt fast overflate, og bli brukt i denne formen, eller den kan bli sublimert. Intensiv blanding av hyperpolarisert gass med forbindelser som skal polariseres, er foretrukket. Derfor, hvis<13>C-pyrodruesyre er polarisert, som er en væske ved romtemperatur, løses den hyperpolariserte gassen fortrinnsvis opp i en væske/løsning eller tjener som løsning. Hvis<13>C-pyruvat er polarisert, oppløses den hyperpolariserte gassen fortrinnsvis i en væske/løsning, som også løser opp pyruvat. A preferred way to obtain hyperpolarized<13>C-pyruvate is polarization transfer from a hyperpolarized noble gas. Noble gases that have nuclei with nuclear spin other than zero can be hyperpolarized, i.e. have polarization enhanced above the equilibrium polarization, e.g. using circularly polarized light. A hyperpolarized noble gas, preferably He or Xe, or a mixture of such gases, can be used to achieve hyperpolarization in<13>C nuclei. The hyperpolarization can also be achieved using an isotopically enriched hyperpolarized noble gas, preferably <3>He or <129>Xe. The hyperpolarized gas may be in the gas phase, it may be dissolved in a liquid/solution, or the hyperpolarized gas may serve as a solution. Alternatively, the gas may be condensed on a cooled solid surface, and be used in this form, or it may be sublimated. Intensive mixing of hyperpolarized gas with compounds to be polarized is preferred. Therefore, if<13>C-pyruvic acid is polarized, which is a liquid at room temperature, the hyperpolarized gas preferentially dissolves in a liquid/solution or serves as a solution. If<13>C-pyruvate is polarized, the hyperpolarized gas dissolves preferentially in a liquid/solution, which also dissolves pyruvate.

En annen foretrukken måte for å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat på, er at polariseringen blir overført til NMR-aktive kjerner ved termodynamisk likevekt ved en svært lav temperatur og høyt felt. Hyperpolarisering sammenlignet med operasjonsfeltet og temperatur på NMR-spektrometeret, blir påvirket av bruk av et svært høyt felt og en svært lav temperatur ("brute force"). Den magnetiske feltstyrken som blir brukt, bør være så høy som mulig, mest hensiktsmessig høyere enn 1 T, fortrinnsvis høyere enn 5 T, helst 15 T eller aller helst og særlig foretrukket 20 T eller mer. Temperaturen bør være svært lav, f.eks. 4,2 K eller mindre, fortrinnsvis 1,5 K eller mindre, helst 1,0 K eller mindre, særlig foretrukket 100 mK eller mindre. Another preferred way to obtain hyperpolarized<13>C-pyruvate is for the polarization to be transferred to NMR active nuclei at thermodynamic equilibrium at a very low temperature and high field. Hyperpolarization compared to the operating field and temperature of the NMR spectrometer is affected by the use of a very high field and a very low temperature ("brute force"). The magnetic field strength used should be as high as possible, most suitably higher than 1 T, preferably higher than 5 T, preferably 15 T or most preferably and particularly preferably 20 T or more. The temperature should be very low, e.g. 4.2 K or less, preferably 1.5 K or less, preferably 1.0 K or less, particularly preferably 100 mK or less.

En annen foretrukken måte for å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat, er spinnavkjølingsmetoden (spin refrigeration method). Denne metoden dekker spinnpolarisering av en fast forbindelse eller et system ved spinnavkjølingspolarisering. Systemet blir dopet med eller intensivt blandet med egnede paramagnetiske materialer, f.eks. Ni<2+>, lantanid eller actinidioner i krystallform med en symmetriakse av orden tre eller mer. Instrumenteringen er enklere enn det som er nødvendig ved DNP, det kreves ingen uniforme magnetiske felt siden det ikke anvendes noe resonanseksitasjonsfelt. Prosessen utføres ved fysisk rotering av prøven rundt en aksependikulær i retningen av det magnetiske feltet. Forutsetningen for denne metoden er at paramagnetiske typer har en høy anisotropisk g-faktor. Som et resultat av prøverotasjonen, vil den elektronparamagnetiske resonansen bli brakt i kontakt med kjernespinn som fører til en reduksjon i kjernespinntemperaturen. Prøverotasjon utføres inntil kjernespinnpolariseringen har nådd en ny likevekt. Another preferred way to obtain hyperpolarized<13>C-pyruvate is the spin refrigeration method. This method covers spin polarization of a solid compound or system by spin cooling polarization. The system is doped with or intensively mixed with suitable paramagnetic materials, e.g. Ni<2+>, lanthanide or actinide ions in crystal form with an axis of symmetry of order three or more. The instrumentation is simpler than that required for DNP, no uniform magnetic fields are required since no resonant excitation field is used. The process is carried out by physically rotating the sample around an axis perpendicular to the direction of the magnetic field. The prerequisite for this method is that paramagnetic types have a high anisotropic g-factor. As a result of the sample rotation, the electron paramagnetic resonance will be brought into contact with the nuclear spin leading to a decrease in the nuclear spin temperature. Sample rotation is performed until the nuclear spin polarization has reached a new equilibrium.

I et mer foretrukken utførelsesform er DNP-metoden (dynamisk kjernepolarisering) brukt til å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat. Polarisering er påvirket av en paramagnetisk forbindelse, det såkalte paramagnetiske midlet eller DNP-midlet. Under DNP-prosessen tilføres energi, normalt i form av mikrobølgestråling, som vil begynne å eksitere det paramagnetiske midlet. Ved svekking til grunntilstand oppstår en overføring av polarisering fra uparrede elektroner av det paramagnetiske midlet til NMR-aktive kjerner i prøven. Generelt brukes et moderat eller høyt magnetisk felt og en svært lav temperatur i DNP-prosessen, f.eks. ved å gjennomføre DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Eller det kan anvendes et moderat magnetisk felt og en hvilken som helst temperatur, der tilstrekkelig polariseringsforsterkning oppnås. DNP-teknikker er f.eks. beskrevet i WO-A-98/58272 og i WO-A-01/96895, begge er inkludert med referanse heri. For å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat ved DNP-metoden, kan enten<13>C-pyruvat og/eller<13>C-pyrodruesyre bli brukt som forbindelsen som skal polariseres. In a more preferred embodiment, the DNP (dynamic nuclear polarization) method is used to obtain hyperpolarized<13>C-pyruvate. Polarization is influenced by a paramagnetic compound, the so-called paramagnetic agent or DNP agent. During the DNP process, energy is supplied, normally in the form of microwave radiation, which will begin to excite the paramagnetic agent. When weakening to the ground state, a transfer of polarization occurs from unpaired electrons of the paramagnetic agent to NMR-active nuclei in the sample. In general, a moderate or high magnetic field and a very low temperature are used in the DNP process, e.g. by carrying out the DNP process in liquid helium and a magnetic field of approx. 1 T or more. Or a moderate magnetic field and any temperature can be used where sufficient polarization gain is achieved. DNP techniques are e.g. described in WO-A-98/58272 and in WO-A-01/96895, both of which are incorporated herein by reference. To obtain hyperpolarized<13>C-pyruvate by the DNP method, either<13>C-pyruvate and/or<13>C-pyruvate can be used as the compound to be polarized.

Om<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat blir brukt, er hovedsakelig avhengig av det paramagnetiske midlet som anvendes i DNP-prosessen. Hvis det paramagnetiske midlet er løselig i<13>C-pyrodruesyre, da brukes helst<13>C-pyrodruesyre og en flytende blanding - helst en flytende løsning - dannes av det paramagnetiske midlet og<13>C-pyrodruesyren. Hvis det paramagnetiske midlet ikke er løselig i<13>C-pyrodruesyre, da brukes<13>C-pyruvat og/eller<13>C-pyrodruesyre og minst én ko-løsemiddel til å danne en flytende blanding, helst en flytende løsning. Det er funnet at en vellykket DNP og dermed polariseringsnivået, er avhengig av forbindelsen som skal polariseres og det paramagnetiske midlet som er i intim kontakt med hverandre. Derfor er ko-løsemiddel helst en ko-løsemiddel eller ko-løsemiddellanding som løser opp begge, det paramagnetiske midlet og<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat. For<13>C-pyruvat er vann foretrukket som ko-løsemiddel. Whether<13>C-pyruvic acid and/or<13>C-pyruvate is used depends mainly on the paramagnetic agent used in the DNP process. If the paramagnetic agent is soluble in <13>C-pyruvic acid, then <13>C-pyruvic acid is preferably used and a liquid mixture - preferably a liquid solution - is formed of the paramagnetic agent and <13>C-pyruvic acid. If the paramagnetic agent is not soluble in<13>C-pyruvic acid, then<13>C-pyruvate and/or<13>C-pyruvic acid and at least one co-solvent are used to form a liquid mixture, preferably a liquid solution. It has been found that a successful DNP, and thus the level of polarization, is dependent on the compound to be polarized and the paramagnetic agent being in intimate contact with each other. Therefore, co-solvent is preferably a co-solvent or co-solvent landing that dissolves both, the paramagnetic agent and<13>C-pyruvic acid and/or<13>C-pyruvate. For<13>C-pyruvate, water is preferred as co-solvent.

Videre er det funnet at høyere polariseringsnivåer oppnås av DNP-metoden når blandingen ved avkjøling/frysing danner en glassprøve i stedet for en krystallisert prøve. Igjen, dannelsen av glass muliggjør en mer intim kontakt mellom det paramagnetiske midlet og forbindelsen som skal polariseres.<13>C-pyrodruesyre er en god glassdanner og brukes derfor helst i DNP-prosessen når det paramagnetiske midlet er løselig i<13>C-pyrodruesyre.13C-pyruvat er et salt, og en flytende blanding av en vannholdig løsning av<13>C-pyruvat og et paramagnetisk middel vil resultere i en krystallisert prøve ved frysing. For å unngå dette foretrekkes det å tilsette ytterligere ko-løsemiddler som er gode glassdannere, f.eks. glyserol, propandiol eller glykol. Furthermore, it has been found that higher polarization levels are obtained by the DNP method when the mixture on cooling/freezing forms a glass sample instead of a crystallized sample. Again, the formation of glass enables a more intimate contact between the paramagnetic agent and the compound to be polarized.<13>C-pyruvic acid is a good glass former and is therefore preferably used in the DNP process when the paramagnetic agent is soluble in<13>C- pyruvic acid.13C-pyruvate is a salt, and a liquid mixture of an aqueous solution of<13>C-pyruvate and a paramagnetic agent will result in a crystallized sample on freezing. To avoid this, it is preferred to add further co-solvents which are good glass formers, e.g. glycerol, propanediol or glycol.

Derfor, i en utførelsesform, blir<13>C-pyruvat oppløst i vann for å oppnå en vannholdig løsning og et paramagnetisk middel, glyserol og, eventuelt, en ytterligere ko-løsemiddel blir tilsatt for å danne en flytende blanding. I en foretrukken utførelsesform blir<13>C-pyrodruesyre, et paramagnetisk middel og en ko-løsemiddel kombinert for å danne en flytende blanding. I en ennå mer foretrukken utførelsesform blir<13>C-pyrodruesyre og et paramagnetisk middel kombinert for å danne en flytende blanding. Intensiv blanding av forbindelser kan videre utføres på flere måter kjent innen fagfeltet, f.eks. røring, røring ved virvelstrøm og ultralydbehandling. Therefore, in one embodiment, <13>C-pyruvate is dissolved in water to obtain an aqueous solution and a paramagnetic agent, glycerol and, optionally, an additional co-solvent are added to form a liquid mixture. In a preferred embodiment,<13>C-pyruvic acid, a paramagnetic agent and a co-solvent are combined to form a liquid mixture. In an even more preferred embodiment,<13>C-pyruvic acid and a paramagnetic agent are combined to form a liquid mixture. Intensive mixing of compounds can further be carried out in several ways known in the field, e.g. stirring, stirring by eddy current and ultrasonic treatment.

Den flytende blandingen fryses deretter, før DNP-prosessen utføres. Avkjøling/frysing kan oppnås ved bruk av metoder kjent innen fagfeltet, f.eks. ved frysing av den flytende blandingen i flytende nitrogen eller ved bare å plassere den i polarisereren der flytende helium vil fryse prøven. The liquid mixture is then frozen before the DNP process is carried out. Cooling/freezing can be achieved using methods known in the field, e.g. by freezing the liquid mixture in liquid nitrogen or by simply placing it in the polarizer where liquid helium will freeze the sample.

Som beskrevet tidligere, er dynamisk kjernepolarisering (DNP) en polariseringsmetode der polarisering av forbindelsen som skal polariseres, blir fremkalt av et DNP-middel, dvs. et paramagnetisk middel/forbindelse. As described earlier, dynamic nuclear polarization (DNP) is a polarization method where polarization of the compound to be polarized is induced by a DNP agent, i.e. a paramagnetic agent/compound.

Mange kjente paramagnetiske forbindelser kan brukes som DNP-middel, f.eks. overgangsmetaller som krom(V)-ioner, organiske frie radikaler som nitroksidradikaler, tritylradikaler eller magnetiske partikler. Slike DNP-midler blir f.eks. beskrevet i WOutførelsesform-A-99/35508, WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711 eller WO-A-96/39367. Many known paramagnetic compounds can be used as DNP agents, e.g. transition metals such as chromium(V) ions, organic free radicals such as nitroxide radicals, trityl radicals or magnetic particles. Such DNP funds are e.g. described in WO-A-99/35508, WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711 or WO-A-96/39367.

I en foretrukken utførelsesform, blir et tritylradikal fra formelen (I), In a preferred embodiment, a trityl radical of formula (I),

der there

M er hydrogen eller en ekvivalent av et kation, og M is hydrogen or an equivalent of a cation, and

R1 som er lik eller ulik, er en rett kjedet eller forgrenet, alternativt hydroksylert, CrCe-alkylgruppe eller en gruppe -(CH2)n-X-R2, der n er 1, 2 eller 3; R 1 , which may or may not be the same, is a straight chain or branched, optionally hydroxylated, C 1 -C 6 -alkyl group or a group -(CH 2 ) n -X -R 2 , where n is 1, 2 or 3;

X er O eller S, og X is O or S, and

R2 er en rett kjedet eller forgrenet, eventuelt hydroksylert, d-C4-alkylgruppe, R2 is a straight chain or branched, optionally hydroxylated, d-C4-alkyl group,

brukt som det paramagnetiske midlet for å oppnå<13>C-pyruvat ved hjelp av DNP-metoden. used as the paramagnetic agent to obtain<13>C-pyruvate by the DNP method.

I en foretrukken utførelsesform er M hydrogen eller en ekvivalent av et fysiologisk tolererbart kation. Termen "fysiologisk tolererbart kation" angir et kation som tolereres av den levende humane eller den ikke-humane animalske kroppen. Fortrinnsvis er M hydrogen eller et alkalikation, et ammoniumion eller et organisk aminion, f.eks. meglumin. Aller helst er M hydrogen eller natrium. In a preferred embodiment, M is hydrogen or an equivalent of a physiologically tolerable cation. The term "physiologically tolerable cation" denotes a cation tolerated by the living human or non-human animal body. Preferably, M is hydrogen or an alkali cation, an ammonium ion or an organic amine ion, e.g. meglumine. Most preferably, M is hydrogen or sodium.

I en annen foretrukken er R1 lik eller ulik, fortrinnsvis lik, og er en rett kjedet eller forgrenet, eventuelt hydroksylert, d-d-alkylgruppe, aller helst metyl, etyl, isopropyl, hydroksymetyl eller hydroksyetyl. In another preferred R 1 is equal or different, preferably equal, and is a straight chain or branched, optionally hydroxylated, d-d-alkyl group, most preferably methyl, ethyl, isopropyl, hydroxymethyl or hydroxyethyl.

I en ytterligere foretrukken utførelsesform er R1 lik eller ulik, fortrinnsvis ulik og er - CH2-0-(d-d-alkyl), -(CH2)2-0-CH3, -(d-d-alkyl)-0-CH3, -CH2-S-(d-d-alkyl), - In a further preferred embodiment, R1 is the same or different, preferably different and is - CH2-0-(d-d-alkyl), -(CH2)2-0-CH3, -(d-d-alkyl)-0-CH3, -CH2- S-(d-d-alkyl), -

(CH2)2-S-CH3, -(d-C3-alkyl)-S-CH3, -CH2-0-CH3, -CH2-0-C2H5, -CH2-0-C2H4OH, - (CH2)2-S-CH3, -(d-C3-alkyl)-S-CH3, -CH2-0-CH3, -CH2-0-C2H5, -CH2-0-C2H4OH, -

CH2-CH2-O-CH3, -CH2-S-CH3, -CH2-S-C2H5, -CH2-S-C2H4OH or -CH2-CH2-S-CH3, aller helst -CH2-CH2-0-CH3. CH2-CH2-O-CH3, -CH2-S-CH3, -CH2-S-C2H5, -CH2-S-C2H4OH or -CH2-CH2-S-CH3, most preferably -CH2-CH2-0-CH3.

I en ennå mer foretrukken utførelsesform er M hydrogen eller natrium, og R1 er lik og er -CH2-CH2-0-CH3. In an even more preferred embodiment, M is hydrogen or sodium, and R 1 is equal to and is -CH 2 -CH 2 -O-CH 3 .

Tritylradikalene fra formelen (I) kan syntetiseres som detaljert beskrevet i WO-A-91/12024, WO-A-96/39367, WO 97/09633 and WO-A-98/39277. Kortfattet kan radikalene syntetiseres ved at tre molare ekvivalenter av en metalert monomerisk arylforbindelse med én molar ekvivalent av et passende beskyttet karboksylsyrederivat for å danne et trimerisk intermediat. Dette intermediatet er metalert og reagerer deretter med f.eks. karbondioksid for å resultere i et trikarboksyl-tritylkarbinol som i neste trinn blir behandlet med en sterk syre for å generere et triarylmetylkation. Dette kationet reduseres deretter for å danne det stabile tritylradikalet. The trityl radicals of formula (I) can be synthesized as described in detail in WO-A-91/12024, WO-A-96/39367, WO 97/09633 and WO-A-98/39277. Briefly, the radicals can be synthesized by reacting three molar equivalents of a metalated monomeric aryl compound with one molar equivalent of an appropriately protected carboxylic acid derivative to form a trimeric intermediate. This intermediate is metalated and then reacts with e.g. carbon dioxide to result in a tricarboxyl tritylcarbinol which in the next step is treated with a strong acid to generate a triarylmethyl cation. This cation is then reduced to form the stable trityl radical.

En flytende blanding som inneholder 13C-pyruvat og/eller13C-pyrodruesyre og eventuelt en løsemiddel fortrinnsvis inneholder 5 til 100 mM tritylradikaler fra formelen (I), helst 10 til 20 mM, særlig foretrukket 12 til 18 mM og aller helst 13 til 17 mM. Det er funnet at oppbygningstiden for polarisering i DNP-prosessen er kortere ved bruk av høyere mengder med radikaler, men det oppnåelige polariseringsnivået er lavere. Derfor må disse to effektene balanseres mot hverandre. A liquid mixture containing 13C-pyruvate and/or 13C-pyruvic acid and optionally a solvent preferably contains 5 to 100 mM trityl radicals from the formula (I), preferably 10 to 20 mM, particularly preferably 12 to 18 mM and most preferably 13 to 17 mM. It has been found that the build-up time for polarization in the DNP process is shorter when using higher amounts of radicals, but the achievable level of polarization is lower. Therefore, these two effects must be balanced against each other.

DNP-teknikker er f.eks. beskrevet i WO-A-98/58272 og i WO-A-01/96895, begge er inkludert med referanse heri. Generelt brukes et moderat eller høyt magnetisk felt og en svært lav temperatur i DNP-prosessen, f.eks. ved å gjennomføre DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Eller det kan anvendes et moderat magnetisk felt og en hvilken som helst temperatur, der tilstrekkelig polariseringsforsterkning oppnås. I en foretrukken utførelsesform av metoden, utføres DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Egnede polariseringsenheter er f.eks. beskrevet i WO-A-02/37132. I en foretrukken utførelsesform inneholder polariseringsenheten en kryostat og et polariseringshjelpemiddel, f.eks. et mikrobølgekammer koblet med en bølgeleder til en mikrobølgekilde i et borehull i midten som er omgitt av magnetfeltproduserende hjelpemidler, f.eks. en superledende magnet. Borehullet utvides vertikalt nedover til minst det nivået av en region P, nær den superledende magneten der det magnetiske feltet er tilstrekkelig høyt, f.eks. mellom 1 og 25 T, for at polarisering av<13>C-kjernene skal finne sted. Borehullet for prøven kan fortrinnsvis forsegles og kan evakueres til lave trykk, f.eks. trykk på 1 mbar eller mindre. Introduksjonshjelpemidlet for prøven (dvs. blandingen som inneholder det paramagnetiske midlet og13C-pyruvat og/eller<13>C-pyrodruesyre), f.eks. en avtakbar prøvetransporterende slange, kan føres inn i borehullet. Denne slangen kan føres inn fra toppen av borehullet ned i en posisjon inne i mikrobølgekammeret i region P. Region P er nedkjølt av flytende helium til en temperatur som er lav nok til at polarisering skal finne sted, fortrinnsvis temperaturer på 0,1-100 K, helst 0,5-10 K, aller helst 1-5 K. Introduksjonshjelpemidlet for prøven er fortrinnsvis forseglbart i øvre del, på en passende måte, for å opprettholde delvis vakuum i borehullet. En prøvebeholder, f.eks. et prøvebeger, kan flyttes på og tilpasses inne i den lave enden av introduseringshjelpemidlet for prøven. Prøvebeholderen er fortrinnsvis laget av et lettvektmateriale med en lav spesifikk varmekapasitet og gode kryogene egenskaper, f.eks. KelF (polyklorotrifluoroetylen) eller PEEK (polyetereterketon). Prøvebeholderen kan inneholde mer enn én prøve som skal polariseres. DNP techniques are e.g. described in WO-A-98/58272 and in WO-A-01/96895, both of which are incorporated herein by reference. In general, a moderate or high magnetic field and a very low temperature are used in the DNP process, e.g. by carrying out the DNP process in liquid helium and a magnetic field of approx. 1 T or more. Or a moderate magnetic field and any temperature can be used where sufficient polarization gain is achieved. In a preferred embodiment of the method, the DNP process is carried out in liquid helium and a magnetic field of approx. 1 T or more. Suitable polarization units are e.g. described in WO-A-02/37132. In a preferred embodiment, the polarization unit contains a cryostat and a polarization aid, e.g. a microwave chamber connected by a waveguide to a microwave source in a central borehole surrounded by magnetic field producing aids, e.g. a superconducting magnet. The borehole is extended vertically downward to at least the level of a region P, close to the superconducting magnet where the magnetic field is sufficiently high, e.g. between 1 and 25 T, for polarization of the<13>C nuclei to take place. The borehole for the sample can preferably be sealed and can be evacuated to low pressures, e.g. pressure of 1 mbar or less. The introduction aid for the sample (ie the mixture containing the paramagnetic agent and 13 C-pyruvate and/or<13>C-pyruvic acid), e.g. a removable sample-transporting hose can be inserted into the borehole. This tubing can be fed from the top of the borehole down into a position inside the microwave chamber in region P. Region P is cooled by liquid helium to a temperature low enough for polarization to take place, preferably temperatures of 0.1-100 K , preferably 0.5-10 K, most preferably 1-5 K. The introduction aid for the sample is preferably sealable in the upper part, in a suitable manner, to maintain partial vacuum in the borehole. A sample container, e.g. a sample cup, can be moved on and adjusted inside the low end of the sample introduction aid. The sample container is preferably made of a lightweight material with a low specific heat capacity and good cryogenic properties, e.g. KelF (polychlorotrifluoroethylene) or PEEK (polyether ether ketone). The sample container can contain more than one sample to be polarized.

Prøven settes inn i prøvebeholderen, senkes i det flytende heliumet og gjennomstråles med mikrobølger, fortrinnsvis ved en frekvens på ca. 94 GHz ved 200 mW. Polariseringsnivået kan overvåkes ved å oppnå fast form<13>C-NMR-signaler av prøven under mikrobølgebestrålingen, derfor foretrekkes bruk av en polariseringsenhet som inneholder hjelpemidler for å oppnå fast form<13>C-NMR-spektre i trinn b). Generelt oppnås en saturasjonskurve i et diagram som viser<13>C-NMR-signal vs. tid. Derfor er det mulig å avgjøre når det optimale polariseringsnivået er nådd. The sample is inserted into the sample container, immersed in the liquid helium and irradiated with microwaves, preferably at a frequency of approx. 94 GHz at 200 mW. The level of polarization can be monitored by obtaining solid-state<13>C-NMR signals of the sample during the microwave irradiation, therefore the use of a polarization unit containing aids to obtain solid-state<13>C-NMR spectra in step b) is preferred. In general, a saturation curve is obtained in a diagram showing<13>C-NMR signal vs. time. Therefore, it is possible to determine when the optimal polarization level has been reached.

Hvis hyperpolarisering utføres ved hjelp av en metode som krever at prøven skal være i fast form, f.eks. ved hjelp av DNP-metoden, må den faste prøven overføres til flytende tilstand for å anvendes i metoden ifølge oppfinnelsen. Den faste polariserte blandingen løses enten opp som beskrevet i WO-A-02/37132, eller smeltes som beskrevet i WO-A-02/36005. Oppløsning av den faste hyperpolariserte prøven er foretrukket, helst oppløsning i en buffer, fortrinnsvis en fysiologisk tolererbar buffer, for å oppnå en flytende sammensetning. Termen "buffer", slik den er brukt i denne søknaden, betegner én eller flere buffere, dvs. også blandinger av buffere. If hyperpolarization is performed using a method that requires the sample to be in solid form, e.g. using the DNP method, the solid sample must be transferred to a liquid state to be used in the method according to the invention. The solid polarized mixture is either dissolved as described in WO-A-02/37132, or melted as described in WO-A-02/36005. Dissolution of the solid hyperpolarized sample is preferred, preferably dissolution in a buffer, preferably a physiologically tolerable buffer, to obtain a liquid composition. The term "buffer", as used in this application, denotes one or more buffers, i.e. also mixtures of buffers.

Foretrukne buffere er fysiologisk tolererbare buffere, helst buffere som buffer i området mellom pH 7-8, f.eks. fosfatbuffere (KHzPCyNazHPC^), ACES, PIPES, imidazol/HCI, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS eller TRICIN. De mest foretrukne bufferne er fosfatbuffere og TRIS, aller helst TRIS. I en annen utførelsesform er det flere enn én av de ovennevnte foretrukne bufferne som blir brukt, dvs. en blanding av buffere. Preferred buffers are physiologically tolerable buffers, preferably buffers in the range between pH 7-8, e.g. phosphate buffers (KHzPCyNazHPC^), ACES, PIPES, imidazole/HCl, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS or TRICIN. The most preferred buffers are phosphate buffers and TRIS, most preferably TRIS. In another embodiment, more than one of the above-mentioned preferred buffers is used, i.e. a mixture of buffers.

Når<13>C-pyrodruesyre ble brukt som forbindelsen som skulle polariseres, omfatter oppløsningen også omdannelse av<13>C-pyrodruesyre til<13>C-pyruvat. For å oppnå dette må<13>C-pyroduresyre reagere med en base. I en annen utførelsesform reagerer<13>C-pyrodruesyre med en base for å omdanne den til<13>C-pyruvat, og deretter blir det tilsatt en buffer. I en annen foretrukken utførelsesform kombineres bufferen og basen i én løsning og denne løsningen blir tilsatt til<13>0-pyrodruesyre, løser den opp og omdanner den til<13>C-pyruvat samtidig. I en annen foretrukken utførelsesform er basen en vannholdig løsning av NaOH, Na2C03eller NaHC03, den mest foretrukne basen er NaOH. I en særlig foretrukken utførelsesform blir en løsning av TRIS-buffer som inneholder NaOH, brukt til å løse opp<13>C-pyrodruesyre og omdanne den til natriumsalt fra<13>C-pyruvat. When<13>C-pyruvic acid was used as the compound to be polarized, the resolution also includes conversion of<13>C-pyruvic acid to<13>C-pyruvate. To achieve this,<13>C-pyruduric acid must react with a base. In another embodiment,<13>C-pyruvic acid reacts with a base to convert it to<13>C-pyruvate, and then a buffer is added. In another preferred embodiment, the buffer and base are combined in one solution and this solution is added to <13>O-pyruvic acid, dissolving it and converting it to <13>C-pyruvate at the same time. In another preferred embodiment, the base is an aqueous solution of NaOH, Na 2 CO 3 or NaHCO 3 , the most preferred base being NaOH. In a particularly preferred embodiment, a solution of TRIS buffer containing NaOH is used to dissolve <13>C-pyruvic acid and convert it to the sodium salt of <13>C-pyruvate.

I en annen foretrukken utførelsesform inneholder bufferen eller - der det er anvendelig - den kombinerte buffer-/baseløsningen ytterligere én eller flere forbindelser som kan binde eller kompleksere frie paramagnetiske ioner, f.eks. kelatdannende midler som DTPA eller EDTA. Det er funnet at frie paramagnetiske ioner kan forårsake forkortning av T-i i den hyperpolariserte forbindelsen, noe som helst unngås. In another preferred embodiment, the buffer or - where applicable - the combined buffer/base solution further contains one or more compounds capable of binding or complexing free paramagnetic ions, e.g. chelating agents such as DTPA or EDTA. It has been found that free paramagnetic ions can cause shortening of T-i in the hyperpolarized compound, which is preferably avoided.

Oppløsningen kan utføres helst ved å bruke metodene og/eller enhetene offentliggjort i WO-A-02/37132. Hvis hyperpolariseringen ble utført ved hjelp av DNP-metoden, brukes det en oppløsningsenhet som enten er fysisk separert fra polarisereren, eller en del av et apparat som inneholder polarisereren og oppløsningsenheten. I en foretrukken utførelsesform utføres oppløsningen ved et elevert magnetisk felt for å forbedre relaksasjonen og opprettholde maksimal hyperpolarisering. Feltnoder bør unngås, og lave felt kan lede til forsterket relaksasjon til tross for tiltakene ovenfor. The dissolution may preferably be carried out using the methods and/or devices disclosed in WO-A-02/37132. If the hyperpolarization was performed using the DNP method, a resolution unit is used that is either physically separated from the polarizer, or part of an apparatus containing the polarizer and the resolution unit. In a preferred embodiment, the dissolution is performed at an elevated magnetic field to enhance relaxation and maintain maximal hyperpolarization. Field nodes should be avoided, and low fields can lead to enhanced relaxation despite the above measures.

Hvis hyperpolarisering utføres ved hjelp av DNP-metoden, fjernes det paramagnetiske midlet og/eller reaksjonsprodukter derav, helst fra den<13>C- pyruvatholdige løsningen. Det paramagnetiske midlet og/eller reaksjonsproduktene kan fjernes delvis, i all vesentlighet eller, ideelt, fullstendig. Fullstendig fjerning er foretrukket. Reaksjonsproduktene av for eksempel tritylradikalet fra formelen (I), kan være estere som kan være dannet etter reaksjon av pyrodruesyre med radikaler fra formelen (I) som inneholder hydroksygrupper. Metoder som kan brukes til å fjerne det paramagnetiske midlet og/eller reaksjonsprodukter derav, er kjent innen fagfeltet. Generelt er metoden som brukes, avhengig av det paramagnetiske midlets egenskaper og/eller dets reaksjonsprodukter. Ved oppløsning av den faste prøven etter polarisering kan radikalet presipitere, og det kan lett separeres fra den flytende sammensetningen ved filtrering. Hvis magnetiske partikler brukes som paramagnetiske midler, kan disse partiklene også enkelt fjernes ved filtrering. Hvis det ikke oppstår presipitering, kan det paramagnetiske midlet fjernes ved kromatografiske separasjonsteknikker, f.eks. væskefasekromatografi som reversert fase, rettlinjet fase eller ioneutvekslingskromatografi eller ved ekstraksjon. If hyperpolarization is performed using the DNP method, the paramagnetic agent and/or reaction products thereof are removed, preferably from the<13>C- pyruvate-containing solution. The paramagnetic agent and/or reaction products can be partially, substantially or, ideally, completely removed. Complete removal is preferred. The reaction products of, for example, the trityl radical from formula (I) can be esters which can be formed after reaction of pyruvic acid with radicals from formula (I) that contain hydroxy groups. Methods that can be used to remove the paramagnetic agent and/or reaction products thereof are known in the art. In general, the method used depends on the properties of the paramagnetic agent and/or its reaction products. Upon dissolution of the solid sample after polarization, the radical can precipitate, and it can be easily separated from the liquid composition by filtration. If magnetic particles are used as paramagnetic agents, these particles can also be easily removed by filtration. If precipitation does not occur, the paramagnetic agent can be removed by chromatographic separation techniques, e.g. liquid phase chromatography such as reversed phase, rectilinear phase or ion exchange chromatography or by extraction.

Siden tritylradikaler fra formelen (I) har et karakteristisk UV/synlig-absorpsjonsspektrum, er det mulig å bruke UV/synlig-absorpsjonsmåling som en metode for å kontrollere om den finnes i den flytende sammensetningen etter at den er fjernet. For å oppnå kvantitative resultater, dvs. konsentrasjonen av radikalet til stede i den oppløste hyperpolariserte prøven, kan det optiske spektrometeret kalibreres slik at absorpsjonen ved en spesifikk bølgelengde danner en prøve som produserer den motsvarende radikalkonsentrasjonen i prøven. Since trityl radicals of formula (I) have a characteristic UV/visible absorption spectrum, it is possible to use UV/visible absorption measurement as a method to check whether it is present in the liquid composition after it has been removed. To obtain quantitative results, i.e. the concentration of the radical present in the dissolved hyperpolarized sample, the optical spectrometer can be calibrated so that the absorption at a specific wavelength forms a sample that produces the corresponding radical concentration in the sample.

Den isotopiske anrikningen av<13>C-pyruvat brukt i metoden ifølge oppfinnelsen, - og/eller<13>C-pyrodruesyre som helst brukes til å oppnå hyperpolarisert<13>C-pyruvat ved hjelp av DNP-metoden - er fortrinnsvis minst 75 %, helst minst 80 % og særlig foretrukket minst 90 %, en isotopisk anrikning over 90 % er det beste og foretrekkes. Ideelt er en anrikning på 100%.13C-pyrudruesyre og/eller13C-pyruvat kan isotopisk anrikes ved C1-posisjon (i det følgende betegnet ^Crpyrodruesyre og<13>C1-pyruvat), ved C2-posisjon (i det følgende betegnet<13>C2-pyrodruesyre og13C2-pyruvat), ved C3-posisjon (i det følgende betegnet 13C3-pyrodruesyre og 13C3-pyruvat), ved C1- og C2-posisjon (i det følgende betegnet<13>C1l2-pyodruesyre og<13>C1l2-pyruvat), ved C1- og C3-posisjon (i det følgende betegnet<13>C1l3-pyrodruesyre og<13>C1l3-pyruvat), ved C2- og C3-posisjon (i det følgende betegnet 13C2,3-pyrodruesyre og<13>C2,3-pyruvat) eller ved C1-, C2- og C3-posisjon (i det følgende betegnet 13C-i ,23-pyrodruesyre og 13C1l23<-py>ruvat), med C1-posisjonen som den foretrukne posisjonen. The isotopic enrichment of <13>C-pyruvate used in the method according to the invention, - and/or <13>C-pyruvic acid which is preferably used to obtain hyperpolarized <13>C-pyruvate using the DNP method - is preferably at least 75 %, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90%, an isotopic enrichment above 90% is the best and preferred. An enrichment of 100% is ideal. 13C-pyruvic acid and/or 13C-pyruvate can be isotopically enriched at the C1 position (hereinafter referred to as ^Crpyruvic acid and <13>C1-pyruvate), at the C2 position (hereinafter referred to as <13 >C2-pyruvic acid and 13C2-pyruvate), at the C3 position (hereinafter referred to as 13C3-pyruvic acid and 13C3-pyruvate), at the C1 and C2 positions (hereinafter referred to as<13>C1l2-pyruvic acid and<13>C1l2 -pyruvate), at C1 and C3 positions (hereafter denoted<13>C1l3-pyruvic acid and<13>C1l3-pyruvate), at C2 and C3 positions (hereafter denoted 13C2,3-pyruvic acid and< 13>C2,3-pyruvate) or at the C1, C2 and C3 positions (hereinafter referred to as 13C-1,23-pyruvic acid and 13C1123<-py>ruvate), with the C1 position being the preferred position.

Flere metoder for syntesen av 13Crpyrudruesyre og13Crpyruvat er kjent innen fagfeltet. Kortfattet beskriver Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237 en synteserute som er avhengig av beskyttelse og aktivering av et karbonyl-holdig startmateriale som S,S-acetal, f.eks. 1,3-ditian eller 2-metyl-1,3-ditian. Ditian er metalert og reagerer med en metyl-holdig forbindelse og/eller<13>C02. Ved å bruke riktig isotopisk anriket<13>C-komponent som angitt i denne referansen, er det mulig å oppnå ^Crpyruvat, 13C2-pyruvat eller 13C1l2-pyruvat. Karbonylens funksjon blir deretter frigitt ved bruk av konvensjonelle metoder beskrevet i litteraturen. En annen synteserute starter fra eddiksyre som først omdannes til acetylbromid og som deretter reagerer med Cu<13>CN. Nitrilet som oppnås, omdannes til pyrodruesyre via amidet (se f.eks. S.H. Anker et al., J. Biol. Chem. 176 Several methods for the synthesis of 13Crpyruvic acid and 13Crpyruvate are known in the field. Briefly, Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237 describe a synthetic route that relies on the protection and activation of a carbonyl-containing starting material such as S,S-acetal, e.g. 1,3-dithiane or 2-methyl-1,3-dithiane. Dithiane is metalated and reacts with a methyl-containing compound and/or<13>CO2. By using the appropriate isotopically enriched<13>C component as indicated in this reference, it is possible to obtain ^Crpyruvate, 13C2-pyruvate or 13C112-pyruvate. The carbonyl function is then released using conventional methods described in the literature. Another synthesis route starts from acetic acid which is first converted to acetyl bromide and which then reacts with Cu<13>CN. The resulting nitrile is converted to pyruvic acid via the amide (see, e.g., S.H. Anker et al., J. Biol. Chem. 176

(1948), 1333 eller J. E. Thirkettle, Chem Commun. (1997), 1025). Videre kan<13>C-pyrodruesyre oppnås ved protonering av kommersielt tilgjengelig natrium-<13>C-pyruvat, f.eks. ved metoden beskrevet i patent 6,232,497 (USA). (1948), 1333 or J.E. Thirkettle, Chem Commun. (1997), 1025). Furthermore, <13>C-pyruvic acid can be obtained by protonation of commercially available sodium <13>C-pyruvate, e.g. by the method described in patent 6,232,497 (USA).

For å bli brukt i metoden ifølge oppfinnelsen, er det hyperpolariserte<13>C-pyruvatet gitt som en sammensetning som er egnet for administrasjon til en levende human kropp eller en ikke-human animalsk kropp. Sammensetningen inneholder helst en buffer eller en blanding av buffere som beskrevet ovenfor. Sammensetningen kan videre inneholde konvensjonelle farmasøytisk akseptable bærere, tilsetninger og blandingshjelpemidler. Derfor kan sammensetningen for eksempel inkludere stabilisatorer, osmolalitetsjusterende midler, solubiliseringsmidler og lignende. To be used in the method of the invention, the hyperpolarized<13>C-pyruvate is provided as a composition suitable for administration to a living human body or a non-human animal body. The composition preferably contains a buffer or a mixture of buffers as described above. The composition may further contain conventional pharmaceutically acceptable carriers, additives and mixing aids. Therefore, the composition can for example include stabilizers, osmolality adjusting agents, solubilizing agents and the like.

Pyruvat er en endogen forbindelse som er veldig godt tolerert av den humane kroppen, selv i høye konsentrasjoner. Som et mellomstoff i sitronsyresyklusen, spiller pyruvat en viktig metabolsk rolle i den humane kroppen. Pyruvat omdannes til ulike forbindelser: transaminering resulterer i alanin, via oksidativ dekarboksylering, pyruvat omdannes til acetyl-CoA og bikarbonat, reduksjonen av pyruvat resulterer i laktat og karboksylering i oksaloacetat. Pyruvate is an endogenous compound that is very well tolerated by the human body, even in high concentrations. As an intermediate in the citric acid cycle, pyruvate plays an important metabolic role in the human body. Pyruvate is converted into various compounds: transamination results in alanine, via oxidative decarboxylation, pyruvate is converted into acetyl-CoA and bicarbonate, the reduction of pyruvate results in lactate and carboxylation in oxaloacetate.

Det er nå funnet at omdannelse av hyperpolarisert<13>C-pyruvat til hyperpolarisert<13>C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat (ved kun<13>Crpyruvat,<13>C12-pyruvat eller 13Ci,23-pyruvat) og hyperpolarisert<13>C-alanin, kan bli brukt til å skille mellom tumorvev og friskt vev i in vivo MR-avbildning. Dette er overraskende siden man må huske at Ti av hyperpolariserte forbindelser svekkes på grunn av relaksasjon og fortynning.<13>C-pyruvat har en T-i-relaksasjon i humant fullblod ved 37 °C av ca. 42 s. Omdannelsen av hyperpolarisert13C-pyruvat til hyperpolarisert13C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin er imidlertid funnet å være rask nok til å tillate signalsporing fra opphavsforbindelsen til<13>C-pyruvat og dennes metabolitter. Mengden alanin, bikarbonat og laktat er avhengig av den metabolske statusen for vevet under undersøkelsen. MR-signalintensiteten fra hyperpolarisert<13>C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin er relatert til mengden av disse forbindelsene og graden av polarisering som er igjen ved tidspunktet for sporing. Som følge av overvåking av omdannelsen av hyperpolarisert<13>C-pyruvat til hyperpolarisert13C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin, er det mulig å studere metabolske prosesser in vivo i den humane kroppen eller den ikke-humane animalske kroppen ved bruk av ikke-invasiv MR-avbildning. It has now been found that conversion of hyperpolarized<13>C-pyruvate to hyperpolarized<13>C-lactate, hyperpolarized<13>C-bicarbonate (by only<13>Crpyruvate,<13>C12-pyruvate or 13Ci,23-pyruvate ) and hyperpolarized<13>C-alanine, can be used to distinguish between tumor tissue and healthy tissue in in vivo MR imaging. This is surprising since one must remember that the Ti of hyperpolarized compounds weakens due to relaxation and dilution.<13>C-pyruvate has a T-i relaxation in human whole blood at 37 °C of approx. 42 pp. However, the conversion of hyperpolarized13C-pyruvate to hyperpolarized13C-lactate, hyperpolarized<13>C-bicarbonate and hyperpolarized<13>C-alanine is found to be fast enough to allow signal tracing from the parent compound to<13>C-pyruvate and its metabolites. The amount of alanine, bicarbonate and lactate depends on the metabolic status of the tissue during the examination. The MR signal intensity from hyperpolarized<13>C-lactate, hyperpolarized<13>C-bicarbonate, and hyperpolarized<13>C-alanine is related to the amount of these compounds and the degree of polarization remaining at the time of tracking. As a result of monitoring the conversion of hyperpolarized<13>C-pyruvate to hyperpolarized13C-lactate, hyperpolarized<13>C-bicarbonate and hyperpolarized<13>C-alanine, it is possible to study metabolic processes in vivo in the human body or the non-human animal body using non-invasive MR imaging.

Det er funnet at MR-signalamplituder fra de forskjellige pyruvat-metabolittene, er avhengige av vevstype. Det unike metabolske toppmønsteret som dannes av alanin, laktat, bikarbonat og pyruvat, kan brukes som fingeravtrykk for metabolske tilstander av vevet under undersøkelse, hvilket gjør det mulig å skille mellom friskt vev og tumorvev. Dette gjør sammensetningen som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, til et utmerket middel for in vivo MR-avbildning av tumorer. It has been found that MR signal amplitudes from the different pyruvate metabolites are dependent on tissue type. The unique metabolic peak pattern formed by alanine, lactate, bicarbonate and pyruvate can be used as a fingerprint for metabolic states of the tissue under investigation, making it possible to distinguish between healthy tissue and tumor tissue. This makes the composition containing hyperpolarized<13>C-pyruvate an excellent agent for in vivo MR imaging of tumors.

Generelt plasseres den som undersøkes, f.eks. pasient eller dyr, i MR-magneten. Tilegnede<13>C-MR RF-spoler er plassert for å dekke området som er av interesse. In general, the person being examined is placed, e.g. patient or animal, in the MR magnet. Dedicated<13>C-MR RF coils are positioned to cover the region of interest.

Sammensetningen som inneholder<13>C-pyruvat administreres parenteralt, fortrinnsvis intravenøst, intraarterielt eller direkte i området eller organet av interesse. Dose og konsentrasjon av sammensetningen som anvendes i metoden i henhold til oppfinnelsen vil være avhengig av en rekke faktorer, f.eks. toksisitet, evne til å nå et organ og administrasjonsruten. Generelt administreres sammensetningen i en konsentrasjon på opptil 1 mmol pyruvat per kg kroppsvekt, fortrinnsvis 0,01 til 0,5 mmol/kg, helst 0,1 til 0,3 mmol/kg. Administrasjonshastigheten er fortrinnsvis mindre enn 10 ml/s, helst mindre enn 6 ml/min og aller helst fra 5 ml/s til 0,1 ml/s. I mindre enn 400 s etter administrasjonen, fortrinnsvis mindre enn 120 s, helst mindre enn 60 s etter administrasjonen, særlig foretrukket 20 til 50 s etter administrasjonen og aller helst 30 til 40 s etter administrasjonen, en MR-avbildningssekvens brukes til å kode volumet som er av interesse, i en kombinert frekvens og på en spatial selektiv måte. Dette vil resultere i metabolske avbildninger av<13>C-laktat,<13>C-alanin og13C-pyruvat og helst i metabolske avbildninger av<13>C-laktat,<13>C-alanin,13C-bikarbonat og13C-pyruvat. Innenfor den samme tidsperioden kan det tas et protonbilde med eller uten et proton MRI-kontrastmiddel for å oppnå anatomisk og/eller perfusjonsinformasjon. The composition containing <13>C-pyruvate is administered parenterally, preferably intravenously, intra-arterially or directly into the area or organ of interest. Dose and concentration of the composition used in the method according to the invention will depend on a number of factors, e.g. toxicity, ability to reach an organ and the route of administration. In general, the composition is administered at a concentration of up to 1 mmol pyruvate per kg body weight, preferably 0.01 to 0.5 mmol/kg, most preferably 0.1 to 0.3 mmol/kg. The rate of administration is preferably less than 10 ml/s, preferably less than 6 ml/min and most preferably from 5 ml/s to 0.1 ml/s. For less than 400 s after the administration, preferably less than 120 s, preferably less than 60 s after the administration, particularly preferably 20 to 50 s after the administration and most preferably 30 to 40 s after the administration, an MR imaging sequence is used to encode the volume which is of interest, in a combined frequency and in a spatially selective manner. This will result in metabolic images of <13>C-lactate, <13>C-alanine and 13C-pyruvate and preferably in metabolic images of <13>C-lactate, <13>C-alanine, 13C-bicarbonate and 13C-pyruvate. Within the same time period, a proton image can be taken with or without a proton MRI contrast agent to obtain anatomical and/or perfusion information.

Kodingen av volumet av interesse, kan oppnås ved å bruke såkalt spektroskopisk avbildningssekvens som beskrevet i f.eks. T.R. Brown et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 3523-3526 (1982); A.A. Maudsley, et al., J. Magn. Res 51, 147-152 The coding of the volume of interest can be achieved by using so-called spectroscopic imaging sequence as described in e.g. T.R. Brown et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. USA 79, 3523-3526 (1982); A.A. Maudsley, et al., J. Magn. Res 51, 147-152

(1983). Spektroskopiske bildedata inneholder et antall volumelementer der hvert element inneholder et fullt<13>C-MR-spektrum.<13>C-pyruvat og dennes13C-metabolitter har alle en unik posisjon i et<13>C-MR-spektrum og resonansfrekvensene kan brukes til å identifisere dem. Integralet fra toppunktet på dens resonansfrekvens er direkte koblet til henholdsvis mengden<13>C-pyruvat og dennes13C-metabolitter. Når mengden av<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt er estimert ved hjelp av for eksempel tilpasningsrutiner for tidsområder som beskrevet f.eks. i L. Vanhamme et al., J Magn Reson 129, 35-43 (1997), kan bilder bli generert for<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt der en fargekode eller gråkode representerer mengden<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt som måles. (1983). Spectroscopic imaging data contain a number of volume elements where each element contains a full<13>C-MR spectrum.<13>C-pyruvate and its 13C metabolites all have a unique position in a<13>C-MR spectrum and the resonance frequencies can be used to identify them. The integral from the peak of its resonance frequency is directly connected to the amount of<13>C-pyruvate and its 13C-metabolites, respectively. When the amount of<13>C-pyruvate and each<13>C-metabolite is estimated using, for example, adaptation routines for time ranges as described e.g. in L. Vanhamme et al., J Magn Reson 129, 35-43 (1997), images can be generated for <13>C-pyruvate and each <13>C metabolite where a color code or gray code represents the amount of <13>C -pyruvate and each<13>C metabolite measured.

Selv om spektroskopiske avbildningsmetoder har vist seg å være verdifulle i produksjonen av metabolske bilder ved hjelp av alle typer MR-kjerner f.eks.1H,31P,<23>Na, gjør mengden av repetisjoner som skal til for å kode det spektroskopiske bildet i sin helhet, denne fremgangsmåten mindre egnet for hyperpolarisert<13>C. Man må være nøyaktig for å sikre at hyperpolariserte<13>C- signaler er tilgjengelige under hele MR-datainnsamlingen. På bekostning av redusert signal til støy, kan dette oppnås ved å redusere RF-pulsvinkelen som brukes i hvert fasekodetrinn. Høyere matrisestørrelser krever flere fasekodetrinn og lengre skannetider. Although spectroscopic imaging methods have been shown to be valuable in the production of metabolic images using all types of MR nuclei e.g.1H,31P,<23>Na, the amount of repetitions required to encode the spectroscopic image in in its entirety, this method less suitable for hyperpolarized<13>C. Care must be taken to ensure that hyperpolarized<13>C signals are available throughout the MR data acquisition. At the expense of reduced signal to noise, this can be achieved by reducing the RF pulse angle used in each phase coding stage. Higher matrix sizes require more phase code steps and longer scan times.

Avbildningsmetoder basert på pionerarbeid av P. C. Lauterbur (Nature, 242, 190-191, (1973) og P. Mansfield (J. Phys. C. 6, L422-L426 (1973)), antyder at anvendelse av en utlesingsgradient under datainnsamlingen vil tillate høyere signal til støy-bilder eller ekvivalente, høyere spatiale oppløsningsbilder. Disse avbildningsmetodene i deres grunnform vil imidlertid ikke være tilgjengelige til å produsere separate bilder for 13C-pyruvat og dennes<13>C-metabolitter, men et bilde som inneholder signalene for<13>C-pyruvat og alle dennes13C-metabolitter, dvs. identifikasjon av spesifikke metabolitter er ikke mulig. Imaging methods based on pioneering work by P. C. Lauterbur (Nature, 242, 190-191, (1973) and P. Mansfield (J. Phys. C. 6, L422-L426 (1973)), suggest that application of a readout gradient during data acquisition will allow higher signal to noise images or equivalent, higher spatial resolution images However, these imaging methods in their basic form will not be available to produce separate images for 13C-pyruvate and its<13>C metabolites, but an image containing the signals for<13 >C-pyruvate and all its 13C metabolites, i.e. identification of specific metabolites is not possible.

I en foretrukken utførelsesform brukes bildesekvenser som vil gjøre bruk av multiekko for å kode frekvensinformasjonen. Sekvenser som kan produsere separate vann- og fett-<1>H-bilder er for eksempel beskrevet i G. Glover, J Magn Reson Imaging 1991;1:521-530 og S. B. Reeder et al., MRM 51 35-45 (2004). Siden metabolitter som skal spores og som sådan har kjente MR-frekvenser, kan fremgangsmåten som blir drøftet i referansen ovenfor, anvendes til direkte avbildning av<13>C-pyruvat,<13>C-alanin og 13C-laktat og fortrinnsvis 13C-pyruvat, 13C-alanin,<13>C-laktat og<13>C-bikarbonat. Denne prosedyren gjør mer effektiv bruk av det hyperpolariserte<13>C-MR-signalet ved at det gir en bedre signalkvalitet sammenlignet med den klassiske spektroskopiske avbildningsteknikken, en høyere spatial oppløsning og raskere innsamlingstid. In a preferred embodiment, image sequences are used which will make use of multi-echo to encode the frequency information. Sequences that can produce separate water and fat <1>H images are described, for example, in G. Glover, J Magn Reson Imaging 1991;1:521-530 and S. B. Reeder et al., MRM 51 35-45 (2004 ). Since metabolites to be tracked and as such have known MR frequencies, the method discussed in the reference above can be used for direct imaging of <13>C-pyruvate, <13>C-alanine and 13C-lactate and preferably 13C-pyruvate , 13C-alanine,<13>C-lactate and<13>C-bicarbonate. This procedure makes more efficient use of the hyperpolarized<13>C-MR signal by providing a better signal quality compared to the classical spectroscopic imaging technique, a higher spatial resolution and faster acquisition time.

Tumorvev karakteriseres ofte med en økt perfusjon og høyere metabolsk aktivitet. Prosessen med å øke vaskulære bed, angiogenese, forårsakes av celler som på grunn av sine høyere metabolske behov og/eller sine store avstander fra en kapillær, ikke er i stand til å få nok substrater som kan gi dem den energien de trenger for å opprettholde energihomeostase. Det er i dette området, hvor celler har problemer med å produsere nok energi, en markert endring i metabolsk mønster er forventet. Vev som har problemer med å opprettholde energihomeostase vil endre sin energimetabolisme som særlig resulterer i en økt laktatproduksjon. Overraskende nok er det mulig å gjøre denne endringen i metabolismen synlig ved hjelp av hyperpolarisert<13>C-pyruvat innfor det korte MR-avbildningstidsvinduet som er tilgjengelig, dvs. bruke det høye<13>C-laktatsignalet i tumorområdet til å skille tumoren fra friskt vev. Siden perfusjonen er heterogen i tumorvevet, foretrekkes det å korrigere13C-laktatsignalet for mengden pyruvat (<13>C-pyruvatsignal) tilgjengelig i samme region. Ved denne korrigeringen oppnås et vektet laktat over pyruvat-bilde. Dette vil gjøre det mulig å fremheve områder i vevet med et relativt høyt laktatsignal med hensyn til pyruvatsignalet, og dermed forbedre muligheten til å skille mellom tumorvev og friskt vev. Tumor tissue is often characterized by increased perfusion and higher metabolic activity. The process of increasing vascular beds, angiogenesis, is caused by cells that, due to their higher metabolic needs and/or their large distances from a capillary, are not able to obtain enough substrates that can give them the energy they need to maintain energy homeostasis. It is in this area, where cells have problems producing enough energy, that a marked change in metabolic pattern is expected. Tissues that have problems maintaining energy homeostasis will change their energy metabolism, which in particular results in increased lactate production. Surprisingly, it is possible to make this change in metabolism visible using hyperpolarized<13>C-pyruvate within the short MR imaging time window available, i.e. using the high<13>C-lactate signal in the tumor area to distinguish the tumor from fresh tissue. Since the perfusion is heterogeneous in the tumor tissue, it is preferred to correct the 13C-lactate signal for the amount of pyruvate (<13>C-pyruvate signal) available in the same region. With this correction, a weighted lactate over pyruvate image is obtained. This will make it possible to highlight areas in the tissue with a relatively high lactate signal with respect to the pyruvate signal, thus improving the ability to distinguish between tumor tissue and healthy tissue.

Ved korrigering for pyruvatsignalet blir både laktat- og pyruvatbilder normalisert til maksimalverdi i hvert individuelle bilde. Dernest multipliseres det normaliserte laktatbildet med det inverterte pyruvatbildet, f.eks. det maksimale pyruvatsignalet i bildet minus pyruvatnivået for hver piksel. I det siste trinnet multipliseres intermediatresultatet oppnådd i operasjonen ovenfor, med det opprinnelige laktatbildet. When correcting for the pyruvate signal, both lactate and pyruvate images are normalized to the maximum value in each individual image. Next, the normalized lactate image is multiplied by the inverted pyruvate image, e.g. the maximum pyruvate signal in the image minus the pyruvate level for each pixel. In the last step, the intermediate result obtained in the above operation is multiplied by the original lactate image.

For å fremheve områder med endret metabolisme kan det høye<13>C-laktatsignalet sammen med et redusert<13>C-alaninsignal brukes i en lignende operasjon som beskrevet i avsnittet ovenfor, hvorved et vektet laktat over alanin-bilde oppnås. Overraskende nok blir identifikasjon av tumorområdet, dvs. muligheten til å skille mellom tumorvev og friskt vev forbedret av denne korrigeringen også. Ved korrigering for alaninsignalet er både laktat- og alaninbilder normalisert til maksimalverdi i hvert individuelle bilde. Dernest multipliseres det normaliserte laktatbildet med det inverterte alaninbildet, f.eks. det maksimale alaninsignalet i bildet minus alaninnivået for hver piksel. I det siste trinnet multipliseres intermediatresultatet oppnådd i operasjonen ovenfor, med det opprinnelige laktatbildet. På en lignende måte kan<13>C-bikarbonatsignalet også inkluderes i analysen. Videre kan et protonbilde innsamlet med eller uten et proton MRI-kontrastmiddel, inkluderes i analysen for å oppnå anatomisk og/eller perfusjonsinformasjon. To highlight areas of altered metabolism, the high<13>C-lactate signal together with a reduced<13>C-alanine signal can be used in a similar operation as described in the section above, whereby a weighted lactate over alanine image is obtained. Surprisingly, identification of the tumor area, i.e. the ability to distinguish between tumor tissue and healthy tissue, is improved by this correction as well. When correcting for the alanine signal, both lactate and alanine images are normalized to the maximum value in each individual image. Next, the normalized lactate image is multiplied by the inverted alanine image, e.g. the maximum alanine signal in the image minus the alanine level for each pixel. In the last step, the intermediate result obtained in the above operation is multiplied by the original lactate image. In a similar way, the<13>C-bicarbonate signal can also be included in the analysis. Furthermore, a proton image acquired with or without a proton MRI contrast agent can be included in the analysis to obtain anatomical and/or perfusion information.

I en annen foretrukken utførelsesform administreres sammensetningen som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, gjentatte ganger, og tillater dermed dynamiske studier. Dette er videre en fordel med metoden i henhold til oppfinnelsen sammenlignet med andre MR-avbildningsmetoder som anvender MR-avbildningsmidler som, på grunn av sin relativt lange sirkulasjon i pasientens kropp, ikke tillater dynamiske studier. In another preferred embodiment, the composition containing hyperpolarized<13>C-pyruvate is administered repeatedly, thereby allowing dynamic studies. This is a further advantage of the method according to the invention compared to other MR imaging methods that use MR imaging agents which, due to their relatively long circulation in the patient's body, do not allow dynamic studies.

Metoden i henhold til oppfinnelsen kan videre brukes ved in vivo MR-tumorklassifisering. De samme metabolske bildene og/eller metabolsk vektede bildene som beskrevet i tidligere avsnitt, kan brukes til dette formålet med egnede "cut off'-kategorier definert, avhengig av tumorstørrelsen og metabolsk aktivitet. The method according to the invention can also be used for in vivo MR tumor classification. The same metabolic images and/or metabolically weighted images as described in previous sections can be used for this purpose with suitable 'cut off' categories defined, depending on the tumor size and metabolic activity.

Videre kan metoden i henhold til oppfinnelsen brukes ved in vivo MR-tumorbehandlingsovervåking, f.eks. ved å overvåke direkte endringer i metabolismemønsteret for tumorer ved behandling med terapeutiske antitumormidler og/eller strålingsbehandling eller i forbindelse med en hvilken som helst type intervensjonsteknikk, med eller uten noen form for ablasjon, dvs. kjemisk ablasjon kombinert med radiofrekvenser, mikrobølger eller ultralyd. Furthermore, the method according to the invention can be used for in vivo MR tumor treatment monitoring, e.g. by directly monitoring changes in the metabolic pattern of tumors when treated with therapeutic antitumor agents and/or radiation therapy or in conjunction with any type of interventional technique, with or without any form of ablation, i.e. chemical ablation combined with radio frequencies, microwaves or ultrasound.

Tumor MR-avbildning i henhold til metoden for oppfinnelsen kan påvirkes og forbedres ved å klargjøre pasienten eller dyret på en måte som vil forstyrre proteinmetabolismen, lipidmetabolismen eller energimetabolismen generelt. Måter å oppnå dette på er kjent innen fagfeltet, f.eks. med abrosia (f.eks over natten), glukoseinfusjon osv. Tumor MR imaging according to the method of the invention can be influenced and improved by preparing the patient or animal in a way that will disturb protein metabolism, lipid metabolism or energy metabolism in general. Ways to achieve this are known in the field, e.g. with ragweed (e.g. overnight), glucose infusion, etc.

I en foretrukken utførelsesform kan metoden i henhold til oppfinnelsen brukes ved in vivo MR-abvbildning av tumorer, tumorbehandlingsovervåking og/eller tumorklassifisering av hjernetumorer, brysttumorer, colontumorer, lungetumorer, nyretumorer, hode- og nakketumorer, muskeltumorer, ovarietumorer, magetumorer, spiserørstumorer, bukspyttkjerteltumorer og prostatatumorer. Det er videre funnet at metoden i henhold til oppfinnelsen er særlig nyttig ved in vivo MR-prostatatumoravbildning, dvs. prostatatumordiagnostisering og/eller prostatatumorklassifisering og/eller prostatatumorbehandlingsovervåking. In a preferred embodiment, the method according to the invention can be used for in vivo MR imaging of tumors, tumor treatment monitoring and/or tumor classification of brain tumors, breast tumors, colon tumors, lung tumors, kidney tumors, head and neck tumors, muscle tumors, ovarian tumors, stomach tumors, esophageal tumors, pancreatic tumors and prostate tumors. It has further been found that the method according to the invention is particularly useful for in vivo MR prostate tumor imaging, i.e. prostate tumor diagnosis and/or prostate tumor classification and/or prostate tumor treatment monitoring.

Når en mann kommer til lege med symptomer på smerte eller ubehag i urinveien, mistenkes prostatakreft. Hvis mannen er over 50 år, utføres en PSA-test (Prostate Specific Antigen). Prostatakreft mistenkes på grunnlag av en forhøyet PSA og/eller abnormal DRE (Digital Rectal Examination). Hvis PSA-testen er positiv, sendes pasienten til en spesialist (en urolog) for diagnostisering ved hjelp av ultralydledet biopsi. Av de to millioner biopsiprosedyrene som blir utført i USA og Europa hvert år, er henholdsvis 5 av 6 og 2 av 3 negative. Når det blir oppdaget på et tidlig stadium, er femårsoverlevelseshyppigheten for disse pasientene 100%. Siden prostatakreft er den mest vanlige krefttypen og den andre hyppigste årsaken til kreftdød hos menn, er det stor medisinsk etterspørsel etter en metode for diagnostisering av prostatatumorer som er i stand til å oppdage prostatatumorer på et tidlig stadium, og som kan være til hjelp i å redusere antall biopsiprosedyrer. When a man comes to the doctor with symptoms of pain or discomfort in the urinary tract, prostate cancer is suspected. If the man is over 50, a PSA (Prostate Specific Antigen) test is performed. Prostate cancer is suspected on the basis of an elevated PSA and/or abnormal DRE (Digital Rectal Examination). If the PSA test is positive, the patient is sent to a specialist (a urologist) for diagnosis using an ultrasound-guided biopsy. Of the two million biopsy procedures performed in the US and Europe each year, 5 out of 6 and 2 out of 3 are negative, respectively. When detected at an early stage, the five-year survival rate for these patients is 100%. Since prostate cancer is the most common type of cancer and the second most common cause of cancer death in men, there is a great medical demand for a prostate tumor diagnosis method that is capable of detecting prostate tumors at an early stage and can be helpful in reduce the number of biopsy procedures.

<13>C-avbildning av prostata krever en sende-mottaksvolum-<13>C-RF-spole, fortrinnsvis en sendevolum-<13>C-RF-spole kombinert med en endorektal RF-spole for kun MR-mottak, og helst brukes en sende-mottaks-faset arrayvolum-<13>C-RF-spole kombinert med en endorektal<13>C-RF-spole for kun MR-mottak. Særlig foretrukket er spoler som utfører innsamlingen av et<1>H-prostatabilde mulig etter<13>C-avbildningen. <13>C imaging of the prostate requires a transmit-receive volume-<13>C-RF coil, preferably a transmit-volume-<13>C-RF coil combined with an endorectal RF coil for MR reception only, and preferably a transmit-receive phased-array volume<13>C-RF coil combined with an endorectal<13>C-RF coil is used for MR reception only. Particularly preferred are coils which perform the collection of a<1>H prostate image possible after the<13>C imaging.

Eksempler Examples

Eksempel 1: Syntese av tris(8-karboksy-2,2,6,6-(tetra(metoksyetyl)benzo-[1,2-4,5']bis-(1,3)ditiol -4-yl)metylnatriumsalt 10 g (70 mmol) tris(8-karboksy-2,2,6,6-(tetra(hydroksyetyl)benzo- [1,2-4,5']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt som er blitt syntetisert i henhold til eksempel 7 av WO-A1-98/39277, ble suspendert i 280 ml dimetylacetamid under en argonatmosfære. Natriumhydrid (2,75 g) etterfulgt av metyliodid (5,2 ml) ble tilført og reaksjonen som er svakt eksotermisk, fikk fortsette 1 time i et 34 °C vannbad i 60 min. Tilsetningen av natriumhydrid og metyliodid ble gjentatt to ganger, i samme mengde for hver av forbindelsene, og etter den siste tilsetningen ble det rørt i blandingen ved romtemperatur i 68 timer. Deretter ble det tilsatt i 500 ml vann. pH-en ble justert til pH > 13 ved hjelp av 40 ml 1 M NaOH (aq), og det ble rørt i blandingen ved omgivelsestemperatur i 15 timer for hydrolyse av de formede metylesterne. Blandingen ble deretter omdannet til syre ved hjelp av 50 ml 2 M HCI (aq) til en pH på ca. 2 og 3 ganger det ekstraherte etylacetatet (500 ml og 2 x 200 ml). Den kombinerte organiske fasen ble tørket over Na2S04, og deretter evaporert til tørr tilstand. Råproduktet (24 g) ble renset ved forberedende HPLC ved bruk av acetonitril/vann som eluenter. De innsamlede fraksjonene ble evaporert for å fjerne acetonitril. Den gjenværende vannfasen ble ekstrahert med etylacetat, og den organiske fasen ble tørket over Na2S04og deretter evaporert til tørr tilstand. Vann (200 ml) ble tilsatt restproduktet, og pH-en ble nøye justert med 0,1 M NaOH (aq) til 7. Restproduktet oppløses langsomt under denne prosessen. Etter nøytralisering ble den vannholdige løsningen frysetørret. Example 1: Synthesis of tris(8-carboxy-2,2,6,6-(tetra(methoxyethyl)benzo-[1,2-4,5']bis-(1,3)dithiol -4-yl)methyl sodium salt 10 g (70 mmol) tris(8-carboxy-2,2,6,6-(tetra(hydroxyethyl)benzo-[1,2-4,5']-bis-(1,3)-dithiol-4- yl)methyl sodium salt which has been synthesized according to Example 7 of WO-A1-98/39277 was suspended in 280 ml of dimethylacetamide under an argon atmosphere. Sodium hydride (2.75 g) followed by methyl iodide (5.2 ml) was added and the reaction, which is slightly exothermic, was allowed to proceed for 1 h in a 34 °C water bath for 60 min. The addition of sodium hydride and methyl iodide was repeated twice, in the same amount for each of the compounds, and after the last addition the mixture was stirred at room temperature for 68 h. Then it was added to 500 mL of water. The pH was adjusted to pH > 13 with 40 mL of 1 M NaOH (aq), and the mixture was stirred at ambient temperature for 15 h to hydrolyze the formed the methyl esters The mixture was then converted to acid using 50 ml 2 M HCI (aq) to a pH of approx. 2 and 3 times the extracted ethyl acetate (500 ml and 2 x 200 ml). The combined organic phase was dried over Na 2 SO 4 , then evaporated to dryness. The crude product (24 g) was purified by preparative HPLC using acetonitrile/water as eluents. The collected fractions were evaporated to remove acetonitrile. The remaining aqueous phase was extracted with ethyl acetate, and the organic phase was dried over Na 2 SO 4 and then evaporated to dryness. Water (200 mL) was added to the residue and the pH was carefully adjusted with 0.1 M NaOH (aq) to 7. The residue slowly dissolved during this process. After neutralization, the aqueous solution was freeze-dried.

Eksempel 2: Produksjon av en sammensetning som inneholder hyperpolarisert13C-pyruvat med DNP-metoden ved bruk av13C-Example 2: Production of a composition containing hyperpolarized 13 C-pyruvate by the DNP method using 13 C-

pyrodruesyre og tritylradikal fra eksempel 1 pyruvic acid and trityl radical from example 1

En 20 mM løsning ble laget ved å løse opp 5,0 mg av radikalet fra eksempel 1 i<13>Ci-pyrodruesyre (164 ul). Prøven ble blandet til homogenitet, og et aliquot av løsningen (41 mg) ble plassert i et prøvebeger og satt i DNP-polarisereren. A 20 mM solution was made by dissolving 5.0 mg of the radical from Example 1 in<13>Ci-pyruvic acid (164 µl). The sample was mixed to homogeneity, and an aliquot of the solution (41 mg) was placed in a sample cup and placed in the DNP polarizer.

Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz). Etter 2 timer ble polariseringen stoppet, og prøven ble oppløst ved hjelp av en oppløsningsenhet i henhold til WO- A-02/37132 i en vannholdig løsning av natriumhydroksid og tris(hydroksymetyl)-aminometan (TRIS), for å gi en nøytral løsning av hyperpolarisert natrium<13>d-pyruvat. Den oppløste prøven ble raskt analysert med<13>C-NMR for å fastsette polariseringen og en 19,0 %<13>C polarisering ble oppnådd. The sample was polarized under DNP conditions at 1.2 K in a magnetic field of 3.35 T under microwave irradiation (93.950 GHz). After 2 hours, the polarization was stopped and the sample was dissolved using a dissolution unit according to WO-A-02/37132 in an aqueous solution of sodium hydroxide and tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS), to give a neutral solution of hyperpolarized sodium<13>d-pyruvate. The dissolved sample was quickly analyzed by<13>C-NMR to determine the polarization and a 19.0%<13>C polarization was obtained.

Eksempel 3: Produksjon av en sammensetning som inneholder hyperpolarisert13C-pyruvat med DNP-metoden ved bruk av13C-Example 3: Production of a composition containing hyperpolarized 13 C-pyruvate by the DNP method using 13 C-

En 15 mM løsning ble laget ved å løse opp radikalet fra eksempel 1 (209,1 mg) i en blanding av<13>d-pyrudruesyre (553 mg) og umerket pyrudruesyre (10,505 g). Prøven ble blandet til homogenitet, og et aliquot av løsningen (2,015 g) ble plassert i et prøvebeger og satt i DNP-polarisereren. A 15 mM solution was made by dissolving the radical from Example 1 (209.1 mg) in a mixture of <13>d-pyruvic acid (553 mg) and unlabeled pyruvic acid (10.505 g). The sample was mixed to homogeneity, and an aliquot of the solution (2.015 g) was placed in a sample cup and placed in the DNP polarizer.

Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz). Etter 4 timer ble polariseringen stoppet, og prøven ble oppløst ved hjelp av en oppløsningsenhet i henhold til WO-A-02/37132 i en vannholdig løsning av natriumhydroksid og tris(hydroksymetyl)-aminometan (TRIS), for å gi en nøytral løsning av hyperpolarisert natrium 13Cr pyruvat med en total pyruvatkonsentrasjon på 0,5 M i 100 mM TRIS-buffer. I serier med oppløsningsenheten ble det koblet til en kromatografisk kolonne. Kolonnen består av en innsats (D = 38 mm; h = 10 mm) som inneholder hydrofobisk pakkemateriale (Bondesil-C18, 40UM Delenummer:12213012) som leveres av Varian. Den oppløste prøven ble tvunget gjennom kolonnen som selektivt adsorberte radikalet. Den filtrerte løsningen ble raskt analysert med<13>C-NMR for å fastsette polariseringen, og en 16,5 %<13>C-polarisering ble oppnådd. Restproduktet for radikalkonsentrasjonen ble deretter analysert med et UV-spektrofotometer ved 469 nm og ble fastsatt til under påvisningsgrensen på 0,1 uM. The sample was polarized under DNP conditions at 1.2 K in a magnetic field of 3.35 T under microwave irradiation (93.950 GHz). After 4 hours, the polarization was stopped and the sample was dissolved using a dissolution unit according to WO-A-02/37132 in an aqueous solution of sodium hydroxide and tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS), to give a neutral solution of hyperpolarized sodium 13Cr pyruvate with a total pyruvate concentration of 0.5 M in 100 mM TRIS buffer. In series with the dissolution unit, it was connected to a chromatographic column. The column consists of an insert (D = 38 mm; h = 10 mm) containing hydrophobic packing material (Bondesil-C18, 40UM Part number: 12213012) supplied by Varian. The dissolved sample was forced through the column which selectively adsorbed the radical. The filtered solution was quickly analyzed by<13>C-NMR to determine the polarization, and a 16.5%<13>C polarization was obtained. The residue of the radical concentration was then analyzed with a UV spectrophotometer at 469 nm and was determined to be below the detection limit of 0.1 µM.

Eksempel 4: Produksjon av hyperpolarisert<13>C-pyruvat med DNP-metoden ved bruk av<13>C-pyrodruesyre og Tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksy-etoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-']bis(1,3)ditiol-4-yl)metyl-natriumsalt Example 4: Production of hyperpolarized<13>C-pyruvate by the DNP method using<13>C-pyruvic acid and Tris(8-carboxy-2,2,6,6-tetra(hydroxy-ethoxy)methyl-benzo[ 1,2-d:4,5-']bis(1,3)dithiol-4-yl)methyl sodium salt

Tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksy-etoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt ble syntetisert som beskrevet i eksempel 29 i WO-A-97/09633. Tris(8-carboxy-2,2,6,6-tetra(hydroxy-ethoxy)methyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1,3)-dithiol-4- yl)methyl sodium salt was synthesized as described in Example 29 of WO-A-97/09633.

En 20 mM løsning ble laget ved å løse opp tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksyetoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt i ^d-pyrodruesyre (83,1 mg). Prøven ble blandet til homogenitet, plassert i et prøvebeger og satt inn i DNP-polarisereren. Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz).<13>C-NMR-signalet fra prøven ble oppnådd ved hjelp av et Varian lnova-200 NMR-spektrometer. DNP-forsterkning ble kalkulert fra en enhet med termisk likevekt13C-NMR signal og forsterket NMR-signal. 16 %13C-polariseringen ble oppnådd. A 20 mM solution was made by dissolving tris(8-carboxy-2,2,6,6-tetra(hydroxyethoxy)methyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1 ,3)-Dithiol-4-yl)methyl sodium salt in d-pyruvic acid (83.1 mg). The sample was mixed to homogeneity, placed in a sample cup and inserted into the DNP polarizer. The sample was polarized under DNP conditions at 1.2 K in a magnetic field of 3.35 T under microwave irradiation (93.950 GHz).<13>C-NMR signal from the sample was obtained using a Varian lnova-200 NMR spectrometer. DNP gain was calculated from a unit of thermal equilibrium 13 C-NMR signal and amplified NMR signal. The 16% 13 C polarization was obtained.

Eksempel 5: MR-avbildning av tumor ved bruk av en sammensetning som Example 5: MR imaging of tumor using a composition which

inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat som avbildningsmiddel contains hyperpolarized<13>C-pyruvate as an imaging agent

5.1 Tumor animalsk modell og tumorklargjøring 5.1 Tumor animal model and tumor preparation

R3230AC er et adenokarsinom mammae hos rotte som kan opprettholdes hos Fischer 344 hunnrotter. For å etablere en animalsk tumormodell ble en fryst ampulle med R32030-celler som inneholder RPMI 1640, 10 % FBS og 10 % DMSO raskt tinet opp i 37 °C. Deretter ble celleløsningen overført til FBS, og økende volumer med RPMI 1640 ble tilført. Til slutt ble cellesuspensjonen overført til en 25 cm<2>vekstkolbe, og lagt i en inkubator på 37 °C, 5 % C02. Vekstmediet ble byttet annen hver dag. På dagen for infeksjon av rotte ble fjerning av cellene utført enten med mekanisk kraft eller ved bruk av trypsin. Cellene ble vasket ved bruk av fosfatbuffer uten kalsium og magnesium. Trypsin (0,05 % trypsin i 0,02 % EDTA) ble tilført i 2-5 min. Deretter ble 5 ml FBS tilsatt og cellene ble overført i et glassbeger som inneholdt RPMI 1640 med FCS og antibiotika (100IU/ml penicillin, 100 I U/ml streptomysin og 2,5 ug/ml amfotericin B). Celleløsningen ble sentrifugert og cellepelleten ble resuspendert i 20 ml RPMI med FBS og antibiotika, sentrifugering og resuspensjon ble gjentatt. Cellene ble deretter aliquotert to ampuller som inneholdt 4 x 10<6>celler/ml RPMI 1640. For å oppnå donortumorer ble Fischer 344 hunnrotter (Charles River, 180-200 g) gitt bedøvelse og 0,3 ml av cellesuspensjonen ble injisert subkutant i lyskeregionen på begge sider. 15 og 22 dager senere, ble deler av tumoren klargjort som beskrevet i F.A. Burgener et al., Invest Radiol 22/6 (1987), 472-478; S. Saini et al., J. Magn. Reson. 129/1 (1997), 35-43). To innsnitt ble gjort på ventralt abdomen på Fischer mottakerhunnrottene. En tumordel ble innsatt i hver lomme, og innsnittene ble lukket. Rottene ble brakt til avbildning 12-14 dager etter tumorinnpoding. R3230AC is a rat mammary adenocarcinoma that can be maintained in female Fischer 344 rats. To establish an animal tumor model, a frozen vial of R32030 cells containing RPMI 1640, 10% FBS, and 10% DMSO was rapidly thawed at 37 °C. Then the cell solution was transferred to FBS, and increasing volumes of RPMI 1640 were added. Finally, the cell suspension was transferred to a 25 cm<2> growth flask, and placed in an incubator at 37 °C, 5% CO 2 . The growth medium was changed every other day. On the day of rat infection, removal of the cells was performed either by mechanical force or by using trypsin. The cells were washed using phosphate buffer without calcium and magnesium. Trypsin (0.05% trypsin in 0.02% EDTA) was added for 2-5 min. Then 5 ml of FBS was added and the cells were transferred into a glass dish containing RPMI 1640 with FCS and antibiotics (100 IU/ml penicillin, 100 I U/ml streptomycin and 2.5 µg/ml amphotericin B). The cell solution was centrifuged and the cell pellet was resuspended in 20 ml RPMI with FBS and antibiotics, centrifugation and resuspension were repeated. The cells were then aliquoted into two vials containing 4 x 10<6>cells/ml RPMI 1640. To obtain donor tumors, female Fischer 344 rats (Charles River, 180-200 g) were anesthetized and 0.3 ml of the cell suspension was injected subcutaneously into the groin region on both sides. 15 and 22 days later, sections of the tumor were prepared as described in F.A. Burgener et al., Invest Radiol 22/6 (1987), 472-478; S. Saini et al., J. Magn. Reason. 129/1 (1997), 35-43). Two incisions were made on the ventral abdomen of the female Fischer recipient rats. A tumor part was inserted into each pocket, and the incisions were closed. The rats were brought for imaging 12-14 days after tumor inoculation.

5.2 Rotteklargjøring og proton-MR-avbildning 5.2 Rat preparation and proton MR imaging

Veide rotter ble gitt bedøvelse ved bruk av isofluran (2-3 %) og lagt på et varmebord for å sikre en kroppstemperatur på rundt 37 °C. Et kateter ble introdusert i halevenen og inn i arteria carotis communis sinistra. Rottene ble transportert til MR-maskinen og plassert på en hjemmelaget pute som ble oppvarmet til ca. 37 °C ved hjelp av sirkulerende FC-104 Fluorinert. Denne væsken vil ikke forårsake bakgrunnssignaler ved<1>H- og<13>C-MR-avbildning. Bedøvelse ble fortsatt ved hjelp av 1-2 % isofluran levert via en lang slange i et åpent pustesystem ved en hastighet på 0,4 l/min. Arteriekateteret ble koblet til via en T-tube til en trykkregistrator og en pumpe som leverer saltløsning (hastighet 0,15 l/min) for å unngå kateterklumping. Rottene ble plassert i en MR-spole (Rapid Biomedical, Germany) og avbildet ved hjelp av en standard proton MR-avbildningssekvens for å få anatomisk informasjon og for å bestemme tumorens beliggenhet. Weighed rats were anesthetized using isoflurane (2-3%) and placed on a warming table to ensure a body temperature of around 37 °C. A catheter was introduced into the tail vein and into the left carotid artery. The rats were transported to the MRI machine and placed on a home-made pad that was heated to approx. 37 °C using circulating FC-104 Fluorinated. This fluid will not cause background signals in<1>H and<13>C MR imaging. Anesthesia was maintained using 1-2% isoflurane delivered via a long tube in an open breathing system at a rate of 0.4 L/min. The arterial catheter was connected via a T-tube to a pressure recorder and a pump delivering saline solution (rate 0.15 L/min) to avoid catheter clumping. The rats were placed in an MR coil (Rapid Biomedical, Germany) and imaged using a standard proton MR imaging sequence to obtain anatomical information and to determine tumor location.

5.3<13>C-MR-avbildning 5.3<13>C-MR imaging

Basert på protonfrekvensen funnet av MR-systemet ble MR-frekvensen for 13Cr alanin beregnet i henhold til følgende ligning: Frekvens<13>C-i-alanin = 0,25144 x [(systemfrekvens proton x 1,00021) - 0,000397708] Based on the proton frequency found by the MR system, the MR frequency of 13Cr alanine was calculated according to the following equation: Frequency<13>C-i-alanine = 0.25144 x [(system frequency proton x 1.00021) - 0.000397708]

Frekvensen beregnet posisjonerte MR-signalene som oppstod fra<13>C-i-alanin i resonans med<13>Crlaktat til venstre og 13Crpyruvat resonerer til høyre for 13Cr alanin. En ikke-lokalisert MR-spektroskopisekvens ble kjørt for å sikret at 13C-MR-spole og systemets MR-frekvens var satt opp på riktig måte.<13>C-bildelokasjonen ble plassert for å dekke tumoren (snittykkelse 10 mm, i plan pikselstørrelse 5x5 mm<2>). I rekonstruksjonsfasen ble bildedataene null-fyllt for å resultere i en oppløsning på 2,5 x 2,5 x 10 mm<3>.<13>C-rpyruvat i TRIS-buffer (90 mM) ble injisert i en dose på 10 ml/kg i en periode på 12 s med minimum volum på 2 ml i halevenen og 30 s etter injeksjonsstart (dvs. 18 s etter avslutning av injeksjonen), ble den kjemiske overgangen<13>C-MR-sekvens startet. The frequency calculated positioned the MR signals arising from<13>C-i-alanine in resonance with<13>Crlactate to the left and 13Crpyruvate resonating to the right of 13Cr alanine. A non-localized MR spectroscopy sequence was run to ensure that the 13C MR coil and system MR frequency were set up correctly. The <13>C image location was positioned to cover the tumor (slice thickness 10 mm, in planar pixel size 5x5 mm<2>). In the reconstruction phase, the image data were zero-filled to result in a resolution of 2.5 x 2.5 x 10 mm<3>.<13>C-rpyruvate in TRIS buffer (90 mM) was injected at a dose of 10 ml /kg for a period of 12 s with a minimum volume of 2 ml in the tail vein and 30 s after the start of the injection (i.e. 18 s after the end of the injection), the chemical transition<13>C-MR sequence was started.

5.4 Analyse av MR-avbildningsdata 5.4 Analysis of MR imaging data

MR-avbildning resulterte i en matrise som inneholdt 16x16 elementer, der hvert element eller voxel/piksel inneholdt et<13>C-MR-spektrum. I rekonstruksjonsfasen var matrisen null-fylt til 32 x 32, en matematisk operasjon som hjelper å forbedre spatial oppløsning. Datasetet som skulle analyseres inneholdt 1024 spektra som ble eksportert til Dicom<®->format (DICOM er det registrerte varemerket for National Electrical Manufacturers Association for standardpublikasjoner angående digital kommunikasjon av medisinsk informasjon) for ytterligere analyse. Ca. halvparten av disse spektra inneholdt ikke MR-signaler siden posisjonen til disse voxelene var utenfor dyret. En plassering innenfor dyret viste voxler med høye pyruvatsignaler og uvesentlige laktat- og alaninsignaler ("blodpool") mens andre voxler viste pyruvat, alanin og laktat ved omtrent samme intensitet. MR imaging resulted in a matrix containing 16x16 elements, where each element or voxel/pixel contained a<13>C-MR spectrum. In the reconstruction phase, the matrix was zero-filled to 32 x 32, a mathematical operation that helps improve spatial resolution. The data set to be analyzed contained 1024 spectra that were exported to Dicom<®> format (DICOM is the registered trademark of the National Electrical Manufacturers Association for standards publications regarding the digital communication of medical information) for further analysis. About. half of these spectra did not contain MR signals since the position of these voxels was outside the animal. One location within the animal showed voxels with high pyruvate signals and insignificant lactate and alanine signals ("blood pool") while other voxels showed pyruvate, alanine, and lactate at approximately the same intensity.

Amplitudene for pyruvat, alanin og laktat ble estimert ved hjelp av domenetilpasningsprosedyrer som inkluderte følgende: Nullsekvensfasen er konstant over datasettet, den første sekvensfasen er 1,4 ms, linjebredden eller dempning i tidsområdet kan variere mellom 0,5 og 3 ganger gjennomsnittsbredden av hele datasettet for hver metabolitt uavhengig, og frekvensen kan variere med 20 hz i begge retninger med hensyn til gjennomsnittlig frekvens over hele datasettet før den høyeste toppen, som må identifiseres av brukeren. The amplitudes for pyruvate, alanine and lactate were estimated using domain fitting procedures that included the following: the zero sequence phase is constant across the data set, the first sequence phase is 1.4 ms, the line width or attenuation in the time domain can vary between 0.5 and 3 times the average width of the entire data set for each metabolite independently, and the frequency can vary by 20 hz in either direction with respect to the average frequency over the entire data set before the highest peak, which must be identified by the user.

Amplituder for laktat, alanin og pyruvat ble omordnet i en matrise og omprøvet til å samsvare med oppløsningen av protonet anatomiske MR-bilde.<13>C-MR-bilder ble projisert på anatomiske bilder ved hjelp av en automatisk prosedyre for å oppnå et operator-uavhengig resultat. Resultatene ble vist i bildesett som inneholder det anatomiske protonbildet til tumoren i rotten, det metabolske<13>C-bilde for pyruvat, laktat og alanin projisert på det anatomiske bildet, bilder som viser hver piksel Amplitudes for lactate, alanine, and pyruvate were rearranged in a matrix and resampled to match the resolution of the protonated anatomical MR image.<13>C-MR images were projected onto anatomical images using an automatic procedure to obtain an operator - independent result. The results were displayed in image sets containing the anatomical proton image of the tumor in the rat, the metabolic<13>C image for pyruvate, lactate and alanine projected onto the anatomical image, images showing each pixel

a) ([laktatjnormx ([pyruvat]max- [pyruvat])n0rm) x [laktat] og a) ([lactatejnormx ([pyruvate]max- [pyruvate])n0rm) x [lactate] and

b) ([laktat]norm x ([alanin]max - [alanin])norm) x [laktat] b) ([lactate]norm x ([alanine]max - [alanine])norm) x [lactate]

der termen "[....]norm representerer den normaliserte amplituden, dvs. skalert til where the term "[...]norm represents the normalized amplitude, i.e. scaled to

den høyeste verdien i det metabolske bildet og [laktat] amplituden beregnet. the highest value in the metabolic picture and the [lactate] amplitude calculated.

Et vellykket resultat for diskriminering av tumorvev og friskt vev i et metabolsk<13>C-MR-bildet ble definert som høyeste laktatsignal i tumorområdet eller en høyt vektet ratiolaktat over pyruvat i tumorområdet samt en høyt vektet laktat over alanin-ratio på den samme piksellokasjonen. A successful result for the discrimination of tumor tissue and healthy tissue in a metabolic<13>C-MR image was defined as the highest lactate signal in the tumor area or a high weighted lactate over pyruvate ratio in the tumor area as well as a high weighted lactate over alanine ratio at the same pixel location .

5.5 Biologisk analyse 5.5 Biological analysis

Tumorområder ble visuelt undersøkt for å oppdage tegn på blødning. Tumorer ble frigjort fra rottekroppene, veid og delt i to. Tumorens innside ble undersøkt visuelt og vurdert for homogenitet, nekrose og blødning. Tumorvevet ble oppbevart i 4 % formalin. Tumor areas were visually examined to detect signs of bleeding. Tumors were released from the rat carcasses, weighed and bisected. The inside of the tumor was examined visually and assessed for homogeneity, necrosis and bleeding. The tumor tissue was stored in 4% formalin.

En tumor-bærende rotte ble ansett som egnet for evaluering hvis følgende kriterier ble oppfylt: tumorvekt > 100 mg, ingen synlige nekroser eller cyster i tumorens innside, en kroppstemperatur over 35 °C og et gjennomsnittlig arterielt blodtrykk over 60 mmHg ved MR-undersøkelse. A tumor-bearing rat was considered suitable for evaluation if the following criteria were met: tumor weight > 100 mg, no visible necrosis or cysts within the tumor, a body temperature above 35 °C and a mean arterial blood pressure above 60 mmHg on MRI.

5.6 Resultater 5.6 Results

Totalt 30 ulike tumorer ble avbildet hos 18 rotter. 1 rotte og 3 tumorer oppfylte ikke de biologiske kriteriene beskrevet i foregående avsnitt 5.5. De gjenværende 26 tumorene hos 17 rotter var homogene og hadde en massiv ikke-nekrotisk innside. Gjennomsnittlig polarisering av<13>C-i-pyruvat ved injeksjon var 21,2 ± 2,9% A total of 30 different tumors were imaged in 18 rats. 1 rat and 3 tumors did not fulfill the biological criteria described in previous section 5.5. The remaining 26 tumors in 17 rats were homogeneous and had a massive non-necrotic interior. Mean polarization of<13>C-i-pyruvate upon injection was 21.2 ± 2.9%

(middelverdi ± SD) og pH var 8,08 ±0,14 (middelverdi ± SD). (mean ± SD) and pH was 8.08 ±0.14 (mean ± SD).

Figur 1 viser et typisk sett med bilder av en avbildet rotte med (1) protonreferansebilde, der piler indikerer tumorlokasjonene, (2)<13>C-pyruvatbilde, (3)<13>C-laktatbilde (4)<13>C-alaninbilde (5)<13>C-laktatbilde korrigert for<13>C-pyruvat og (6)<13>C-laktatbilde korrigert for<13>C-alanin. Bildene (2) til (6) er slått sammen med protonreferansebildet. Figur 2 viser det samme settet med bilder, men med bildene (2) til (6) som ikke er slått sammen med det anatomiske protonbildet. Figure 1 shows a typical set of images of an imaged rat with (1) proton reference image, where arrows indicate the tumor locations, (2)<13>C-pyruvate image, (3)<13>C-lactate image (4)<13>C- alanine image (5)<13>C-lactate image corrected for<13>C-pyruvate and (6)<13>C-lactate image corrected for<13>C-alanine. Images (2) to (6) are merged with the proton reference image. Figure 2 shows the same set of images, but with images (2) to (6) not merged with the anatomical proton image.

Som et resultat er tumorlokasjonen som indikert av et høyt pyruvatsignal (2), på grunn av høy metabolsk aktivitet. Laktatsignaiet (3) identifiserer imidlertid den korrekte lokasjonen av tumoren. Alanin er synlig i skjelettmusklene og er fraværende i tumorvevet (4). Pyruvat- og alaninkorrigerte laktatbilder, (5) og (6), resulterer også i en utmerket kontrast for tumoren. As a result, the tumor location is as indicated by a high pyruvate signal (2), due to high metabolic activity. However, the lactate signal (3) identifies the correct location of the tumor. Alanine is visible in skeletal muscle and is absent in tumor tissue (4). Pyruvate- and alanine-corrected lactate images, (5) and (6), also result in excellent contrast for the tumor.

Det ble derfor demonstrert at tumorlokasjonen i de metabolske bildene er indikert av et høyt laktatsignal, et høyt laktatsignal korrigert for pyruvat og et høyt laktatsignal korrigert for alanin. It was therefore demonstrated that the tumor location in the metabolic images is indicated by a high lactate signal, a high lactate signal corrected for pyruvate and a high lactate signal corrected for alanine.

Analysen for metabolske<13>C-MR-bilder avslørte en metabolsk kontrast i tumorområdet i The analysis for metabolic<13>C-MR images revealed a metabolic contrast in the tumor area i

• 24 av 26 tumorer for laktatsignalet • 24 out of 26 tumors for the lactate signal

• 26 av 26 tumorer for laktatsignalet, pyruvatkorrigert (5,5,,a)) • 26 of 26 tumors for the lactate signal, pyruvate corrected (5,5,,a))

• 26 av 26 tumorer for laktatsignalet, alaninkorrigert (5,5, a)) • 26 of 26 tumors for the lactate signal, alanine corrected (5.5, a))

Den totale suksessraten for dette studiet var 26 av 26, eller 100 %. The overall success rate for this study was 26 out of 26, or 100%.

Med dette studiet ble det demonstrert at tumorer kan identifiseres ved bruk av hyperpolarisert<13>Crpyruvat som når området av interesse (tumor) i løpet av en tidsperiode som gjør det mulig å avbilde forbindelsen og dennes metabolitter. With this study, it was demonstrated that tumors can be identified using hyperpolarized<13>Crpyruvate that reaches the area of interest (tumor) during a time period that allows imaging of the compound and its metabolites.

Claims

1. Method for distinguishing between healthy tissue and tumor tissue, said method comprising: (a) recording a<13>C-MR image of<13>C-pyruvate and its<13>C-containing metabolites alanine and lactate from a subject who has been pre-administered a composition containing hyperpolarized<13>C-pyruvate, (b) correcting the lactate image for the amount of pyruvate and/or alanine by multiplying the lactate image by the inverted pyruvate and/or lactate image; where a high image signal from said corrected lactate image indicates tumor tissue.

2. The method according to claim 1 in which hyperpolarized<13>C-pyruvate is obtained by hyperpolarizing<13>C-pyruvic acid and/or<13>C-pyruvate using the DNP method.

3. The method according to claim 1 or 2 wherein the composition containing <13>C-pyruvate further contains one or more buffers selected from the group containing phosphate buffer (KHzPOVNazHPCM), ACES, PIPES, imidazole/HCI, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS and TRICIN.

4. Method according to claim 1 or 2 in which imaging sequences using multi-echo to encode frequency information are used to record the 13C images according to step a).

5. Method according to claim 1 or 2 in which the<13>C images according to step a) are recorded less than 400 s after administration of the composition containing<13>C-pyruvate.

6. Method according to claim 1 or 2 in which a proton image is additionally recorded with or without a proton MRI contrast agent.

7. Method according to claims 1 to 7 where the said correction is performed by (i) normalizing lactate and pyruvate and/or alanine images to the maximum value in each individual image (ii) multiplying the normalized lactate image with the inverted pyruvate and/or the alanine image; and (iii) multiplying the results of step (ii) by the original lactate image.

8. The method according to claims 1 to 7 where the tumor is a brain tumor, breast tumor, colon tumor, lung tumor, kidney tumor, head and neck tumor, muscle tumor, ovarian tumor, stomach tumor, pancreatic tumor, esophageal tumor or prostate tumor.

9. Method according to claims 1 to 8 for in vivo monitoring of MR tumor treatment and/or tumor classification.