NO338547B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en flytende sammensetning omfattende hyperpolarisert 13C-pyruvat, sammensetningen og anvendelse av den for fremstilling av hyperpolarisert 13C-pyruvat - Google Patents

Description

Oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av en flytende sammensetning omfattende hyperpolarisert<13>C-pyruvat, sammensetningen og anvendelse av den for fremstilling av hyperpolarisert<13>C-pyruvat.

Magnetresonansavbildning (MRI) er en avbildningsteknikk som er blitt særlig attraktiv for leger, siden dette gir mulighet for å avbilde en pasients kropp, eller deler av den, på en ikke-invasiv måte og uten at pasienten og det medisinske personellet utsettes for potensiell skadelig stråling som ved røntgenfotografering. På grunn av den høye kvaliteten på bildene, er MRI en gunstig bildeteknikk ved avbildning av mykvev og organer, og den gir mulighet til å skille friskt vev fra sykt vev, f.eks. tumorer og lesjoner.

Magnetresonansavbildning av tumorer kan utføres med eller uten MR-kontrastmidler. På et MR-bilde som tas uten kontrastmiddel, vil tumorer fra en størrelse på ca. 1-2 cm og større vises relativt klart. Kontrast-forsterket MRI gjør det imidlertid mulig å oppdage mye mindre vevsendringer, dvs. tumorer som er mye mindre. Dette gjør kontrast-forsterket MRI til et betydningsfullt verktøy for å oppdage tumorer på et tidlig stadium samt oppdagelse av metastaser.

Flere typer kontrastmidler er blitt brukt ved magnetresonansavbildning av tumorer. Vannløselige paramagnetiske metallchelater, f.eks. gadoliniumchelater som Omniscan™ (Amersham Health), er MR-kontrastmidler som er mye brukt. På grunn av den lave molekylærvekten, distribueres de hurtig i det ekstracellulære området (dvs. blod og interstitium) hvis de administrereres i vaskulaturet. De fjernes også relativt hurtig fra kroppen. Gadoliniumchelater er funnet særlig nyttige for å øke oppdagelseshyppigheten av metastaser og små tumorer, og for å forbedre tumorklassifisering - det sistnevnte ved å muliggjøre differensiering av vitalt tumorvev (velperfusert og/eller skadet blod-hjernebarriere) fra sentral nekrose og fra omkringliggende ødem eller makroskopisk ikke-involvert vev (se f.eks. C. Olaussen et al., Neuroradiology 1985; 27: 164-171).

I motsetning til dette vil blodpool-MR-kontrastmidler, f.eks. superparamagnetiske jernoksidpartikler, bli værende i vaskulaturet over en lengre periode. Disse har vist seg å være svært nyttige for å forsterke kontrasten i leveren, men også for å oppdage kapillær permeabilitetsabnormitet, f.eks. "lekkasje" i kapillærvegger i tumorer, f.eks. som et resultat av angiogenese.

Til tross for de ubestridte utmerkede egenskapene til ovennevnte kontrastmidler, er bruken av dem ikke helt uten risiko. Selv om paramagnetiske metallchelatkomplekser vanligvis har høye stabilitetskonstanter, er det mulig at toksiske metallioner frigis i kroppen etter administrasjon. Videre viser denne typen kontrastmidler dårlig spesifisitet.

WO-A-99/35508 offentliggjør en metode for MR-undersøkelse av en pasient ved hjelp av en hyperpolarisert løsning med et høy-TVmiddel som MRI-avbildningsmiddel. Termen "hyperpolarisering" betyr forsterket kjernepolarisering av NMR-aktive kjerner som er til stede i høy-T^midde!, dvs. kjerner med kjernespinn forskjellig fra null, fortrinnsvis<13>C- eller<15>N-kjerner. Etter at kjernepolarisering av NMR-aktive kjerner er forsterket, øker populasjonsforskjellen mellom spinn i lav kjernespinntilstand og spinn i eksiterte kjernespinntilstand for disse kjernene betydelig, og dermed forsterkes MR-signalintensiteten med en faktor på hundre og mer. Ved bruk av hyperpolarisert<13>C- og/eller<15>N-anriket høy-Trmiddel vil det ikke forekomme noe vesentlig interferens fra bakgrunnssignaler. Dette er fordi den naturlige forekomsten av<13>C og/eller<15>N er neglisjerbar. Dermed vil bildekontrasten bli fordelaktig høy. Flere mulige høy-T^midler egnet for hyperpolarisering og påfølgende bruk som MR-avbildningsmidler, er offentliggjort, deriblant, men ikke begrenset til, ikke-endogene og endogene forbindelser som acetat, pyruvat, oksalat eller glukonat, sukker som glukose eller fruktose, urea, amider, aminosyrer som glutamat, glysin, cystein eller aspartat, nukleotider, vitaminer som askorbinsyre, penicillinderivater og sulfonamider. Det er videre konstatert at intermediater i metabolske sykluser, f.eks. i sitronsyresyklusen, som fumarsyre og pyrodruesyre, er foretrukne avbildningsmidler ved avbildning av metabolsk aktivitet.

Det må understrekes at signalet til et hyperpolarisert avbildningsmiddel svekkes på grunn av relaksasjon og - ved administrasjon i pasientens kropp - fortynning. Derfor må T-, -verdien for avbildningsmidler i biologiske væsker (f.eks. blod) være tilstrekkelig lang for å muliggjøre at midlet distribueres til målområdet i pasientens kropp i en høyt hyperpolarisert tilstand. I tillegg til at avbildningsmidlet har en høy Trverdi, er det svært gunstig å oppnå et høyt polariseringsnivå.

Flere hyperpolarisingsteknikker er offentliggjorte i WO-A-99/35508, én av dem er den dynamiske kjernepolariseringsteknikken (DNP-teknikken) der polariseringen av prøven fremkalles av en paramagnetisk forbindelse, det såkalte paramagnetiske midlet eller DNP-midlet. Under DNP-prosessen tilføres energi, normalt i form av mikrobølgestråling, som vil i første omgang eksitere det paramagnetiske midlet. Ved svekking til grunntilstand oppstår en overføring av polarisering fra uparrede elektroner av det paramagnetiske midlet til NMR-aktive kjerner i prøven. Generelt brukes et moderat eller høyt magnetisk felt og en svært lav temperatur i DNP-prosessen, f.eks. ved å gjennomføre DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Eller det kan anvendes et moderat magnetisk felt og en hvilken som helst temperatur, der tilstrekkelig polariseringsforsterkning oppnås. DNP-teknikker er f.eks. beskrevet i WO-A-98/58272 og i WO-A-01/96895.

Det paramagnetiske midlet spiller en avgjørende rolle i DNP-prosessen, og valg av det har en betydelig virkning på polariseringsnivået som oppnås. Flere ulike paramagnetiske midler - i WO-A-99/35508 angitt som "OMRI-kontrastmidler" - er kjent, f.eks. oksygen-baserte, svovel-baserte eller karbon-baserte organiske frie radikaler eller magnetiske partikler som det refereres til i WO-A-99/35508, WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711 eller WO-A-96/39367.

Wolber J et al.: Nuclear Instruments & Methods in Physics Research. Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors, and Associated Equipment, Elsevier BV NorthHolland, NL, vol. 526, nr 1-2, Juni 2004, side 173-181 beskriver høyt polariserte kjernespin i løsning ved anvendelse av DNP.

Overraskende, har vi nå funnet en forbedret fremgangsmåte for å fremstille en flytende sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, som gjør det mulig å få hyperpolarisert<13>C-pyruvat med et bemerkelsesverdig høyt polariseringsnivå. Det er videre funnet at en slik sammensetning, er spesielt egnet ved in vivo MR-avbildning.

Derfor, i et aspekt, frembringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille en flytende sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, den nevnte fremgangsmåte omfatter:

a) fremstilling av en flytende blanding som inneholder et radikal med formelen (I),<13>C-pyrudruesyre og/eller<13>C-pyruvat og frysing av blandingen,

der

M er hydrogen eller en ekvivalent av et kation, og

R1 som er lik eller ulik, er en rettkjedet eller forgrenet,

hydroksylert og/eller alkoksylert CrC^hydrokarbongruppe

b) forsterking av<13>C-kjernepolarisering av pyrodruesyre og/eller pyruvat i blandingen via DNP c) tilsetning av en buffer og en base til den fryste blandingen for å løse den opp og for å omdanne<13>C-pyrodruesyre til et<13>C-pyruvat for å oppnå en flytende

sammensetning eller, når bare<13>C-pyruvate brukes i trinn a), tilsetning av en buffer til den fryste blandingen for å løse den opp for å oppnå en flytende

sammensetning

d) eventuelt, fjerning av radikalet og/eller reaksjonsprodukter derav, fra den flytende sammensetningen

Termen "hyperpolarisert" og "polarisert" brukes om hverandre i det følgende og betegner en polarisering til et nivå over det som er funnet ved romtemperatur og 1 T.

Et radikal med formelen (I) er brukt i en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen

der

M er hydrogen eller en ekvivalent av et kation, og

R1 som er lik eller ulik, er en rettkjedet eller forgrenet

hydroksylert og/eller alkoksylert CrC^hydrokarbongruppe.

I det følgende er termen "radikal" brukt for radikalet med formelen (I).

I en foretrukken utførelsesform er M hydrogen eller en ekvivalent av et fysiologisk tolererbart kation. Termen "fysiologisk tolererbart kation" angir et kation som tolereres av den levende humane kroppen eller den ikke-humane animalske kroppen. Fortrinnsvis er M hydrogen eller et annet alkalikation, et ammoniumion eller et organisk aminion, f.eks. meglumin. Aller helst er M hydrogen eller natrium.

I en annen foretrukken utførelsesform er R1 lik eller ulik, og er hydroksymetyl eller hydroksyetyl. I en annen foretrukken utførelsesform er R1 den lik eller ulik, og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert Ci-C^hydrokarbongruppe, fortrinnsvis -CH2-0-(CrC3-alkyl), -(CH2)2-0-CH3eller -(CrC3-alkyl)-0-CH3. I en annen foretrukken utførelsesform er R1 lik eller ulik, og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert C-r C4-hydrokarbongruppe som bærer en terminal hydroksylgruppe, fortrinnsvis -CH2-0-C2H4OH eller -C2H4-0-CH2OH. I en ennå mer foretrukken utførelsesform er R1 lik og er en rettkjedet alkoksylert CrC^hydrokarbongruppe, fortrinnsvis metoksy, - CH2-OCH3, -CH2-OC2H5eller -CH2-CH2-OCH3, aller helst -CH2-CH2-OCH3.

I den mest foretrukne utførelsesform er M hydrogen eller natrium, og R1 er lik og er

-CH2-CH2-OCH3.

Syntesen av radikalene kjent innen fagfeltet og er offentliggjort i WO-A-91/12024, WO-A-96/39367, WO 97/09633 og WO-A-98/39277. Kortfattet kan radikalene syntetiseres ved at tre molare ekvivalenter av en metalert monomerisk arylforbindelse reagerer med en molar ekvivalent av et passende beskyttet karboksylsyrederivat for å danne et trimerisk intermediat. Dette intermediatet er metalert og reagerer deretter med f.eks. karbondioksid for å resultere i et trikarboksyl-tritylkarbinol som i neste trinn blir behandlet med en sterk syre for å generere et triarylmetylkation. Dette kationet reduseres deretter for å danne det stabile tritylradikalet.

Den isotopiske anrikningen av<13>C-pyrudruesyre og/eller13C-pyruvat brukt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er fortrinnsvis minst 75 %, helst minst 80 % og aller helst minst 90 %, en isotopisk anrikning over 90 % er det beste og foretrekkes. Ideelt er en anrikning på 100%.13C-pyrudruesyre og/eller13C-pyruvat kan isotopisk anrikes ved C1-posisjon (i det følgende betegnet ^Ci-pyrodruesyre og 13Ct pyruvat), ved C2-posisjon (i det følgende betegnet<13>C2-pyrodruesyre og13C2-pyruvat), ved C3-posisjon (i det følgende betegnet<13>C3-pyrodruesyre og<13>C3-pyruvat), ved C1- og C2-posisjon (i det følgende betegnet<13>C1l2-pyodruesyre og<13>C1l2-pyruvat), ved C1- og C3-posisjon (i det følgende betegnet<13>C1l3-pyrodruesyre og<13>C1l3-pyruvat), ved C2- og C3-posisjon (i det følgende betegnet<13>C2,3-pyrodruesyre og<13>C2,3-pyruvat) eller ved C1-, C2- og C3-posisjon (i det følgende betegnet<13>C1l23-pyrodruesyre og<13>C1l2,3-pyruvat); fortrinnsvis C1-posisjon.

Flere metoder for syntesen av ^Crpyrodruesyre er kjent innen fagfeltet. Kortfattet beskriver Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237 en synteserute som er avhengig av beskyttelse og aktivering av et karbonyl-holdig startmateriale som S,S-acetal, f.eks. 1,3-ditian eller 2-metyl-1,3-ditian. Ditian er metalert og reagerer med en metyl-holdig forbindelse og/eller<13>C02. Ved å bruke riktig isotopisk anriket<13>C-komponent som angitt i denne referansen, er det mulig å oppnå<13>C-i-pyruvat,<13>C2-pyruvat eller13C1l2-pyruvat. Karbonylens funksjon blir deretter frigitt ved bruk av konvensjonelle metoder beskrevet i litteraturen. En annen synteserute starter fra eddiksyre som først omdannes til acetylbromid og som deretter reagerer med Cu<13>CN. Nitrilet som oppnås, omdannes til pyrodruesyre via amidet (se f.eks. S.H. Anker et al., J. Biol. Chem. 176 (1948), 1333 eller J. E. Thirkettle, Chem Commun. (1997), 1025). Videre kan<13>C-pyrodruesyre oppnås ved protonering av kommersielt tilgjengelig natrium-<13>C-pyruvat, f.eks. ved metoden beskrevet i patent 6,232,497 (USA).

Om<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat brukes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er hovedsakelig avhengig av radikalet som anvendes. Hvis radikalet er løselig i<13>C-pyrodruesyre, da brukes helst<13>C-pyrodruesyre og en flytende blanding, helst en flytende løsning, lages av radikalet og<13>C-pyrodruesyren. Hvis radikalet ikke er løselig i<13>C-pyrodruesyre, da brukes<13>C-pyruvat og/eller<13>C-pyrodruesyre og minst én ko-løsemiddel til å lage en flytende blanding, helst en flytende løsning. Det er funnet at en vellykket polarisering i trinn b) og dermed polariseringsnivået, er avhengig av at forbindelsen som skal polariseres og radikalet er i intim kontakt med hverandre. Derfor er ko-løsemidel helst en ko-løsemiddel eller ko-løsemiddelblanding som løser opp begge, radikalet og<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat. For<13>C-pyruvat er vann foretrukket som ko-løsemiddel..

Videre er det funnet at høyere polariseringsnivåer i trinn b) oppnås når blandingen ved avkjøling/frysing danner en glassprøve i stedet for en krystallisert prøve. Igjen, dannelsen av glass muliggjør en mer intim kontakt mellom radikalet og forbindelsen som skal polariseres.<13>C-pyrodruesyre er en god glassdanner og brukes derfor helst i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen når radikalet er løselig i<13>C-pyrodruesyre.<13>C-pyruvat er et salt, og en flytende blanding av en vannholdig løsning av<13>C-pyruvat og et radikal vil resultere i en krystallisert prøve ved frysing. For å unngå dette foretrekkes det å tilsette ytterligere ko-løsemiddler som er gode glassdannere, f.eks. glyserol, propandiol eller glykol.

Derfor, i en utførelsesform løses<13>C-pyruvat i vann for å oppnå en vannholdig løsning og et radikal, glyserol og alternativt en ytterligere ko-løsemiddel tilsettes for å danne en flytende blanding i henhold til trinn a) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I en foretrukken utførelsesform er<13>C-pyrodruesyre, et radikal og en ko-løsemiddel kombinert for å danne en flytende blanding i henhold til trinn a) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I en særlig foretrukken utførelsesform er<13>C-pyrodruesyre og et radikal kombinert for å danne en flytende blanding i henhold til trinn a) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Intensiv blanding av forbindelser kan utføres på flere måter kjent innen fagfeltet, f.eks. røring, røring ved virvelstrøm og ultralydbehandling.

Den flytende blandingen i trinn a) i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis 5 til 100 mM radikal, helst 10 til 20 mM radikal, særlig foretrekkes 12 til 18 mM radikal og aller helst 13 til 17 mM radikal. Det er funnet at oppbygningstiden for polarisering i trinn b) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir kortere ved bruk av større mengder radikal, det oppnåelige polariseringsnivået er imidlertid lavere. Derfor må disse to effektene balanseres mot hverandre.

Den flytende blandingen i trinn a) ifølge fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen blir fryst før polariseringen i trinn b) utføres. Avkjøling/frysing kan oppnås ved bruk av metoder kjent innen fagfeltet, f.eks. ved frysing av den flytende blandingen i flytende nitrogen eller ved bare å plassere den i polarisereren der flytende helium vil fryse prøven.

I trinn b) iølge fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen blir<13>C-kjernepolariseringen av<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvate forsterket via DNP. Som beskrevet tidligere, er dynamisk kjernepolarisering (DNP) er en polariseringsmetode der polarisering av forbindelsen som skal polariseres, blir fremkalt av et DNP-middel, dvs. en paramagnetisk forbindelse. Når det gjelder fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir polariseringen fremkalt av radikalet som brukes. Under DNP-prosessen tilføres energi, fortrinnsvis i form av mikrobølgestråling, som i første omgang eksiterer radikalet. Ved svekking til grunntilstand forekommer det en overføring av polarisering fra det uparrede elektronet i radikalet til 13C-kjernene av13C-pyrodruesyren og/eller 13C-pyruvatet.

DNP-teknikker er f.eks. beskrevet i WO-A-98/58272 og i WO-A-01/96895. Generelt brukes et moderat eller høyt magnetisk felt og en svært lav temperatur i DNP-prosessen, f.eks. ved å gjennomføre DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Eller det kan anvendes et moderat magnetisk felt og en hvilken som helst temperatur, der tilstrekkelig polariseringsforsterkning oppnås. I en foretrukken utførelsesform ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, utføres DNP-prosessen i flytende helium og et magnetisk felt på ca. 1 T eller mer. Egnede polariseringsenheter for å utføre trinn b) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er f.eks. beskrevet i WO-A-02/37132. I en foretrukken utførelsesform inneholder polariseringsenheten en kryostat og et polariserings-hjelpemiddel, f.eks. et mikrobølgekammer koblet med en bølgeleder til en mikrobølgekilde i et borehull i midten som omgitt av magnetfeltproduserende hjelpemidler, f.eks. en superledende magnet. Borehullet utvides vertikalt ned til minst det nivået av en region P, nær den superledende magneten der det magnetiske feltet er tilstrekkelig høyt, f.eks. mellom 1 og 25 T, for at polarisering av<13>C-kjernene skal finne sted. Borehullet for prøven kan fortrinnsvis forsegles og kan evakueres til lave trykk, f.eks. trykk på 1 mbar eller mindre. Introduksjonshjelpemidlet for prøven (dvs. den fryste blandingen fra trinn a) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen), f.eks. en avtakbar prøvetransporterende slange, kan føres inn i borehullet. Denne slangen kan føres inn fra toppen av borehullet ned i en posisjon inne i mikrobølgekammeret i region P. Region P er nedkjølt av flytende helium til en temperatur som er lav nok til at polarisering skal finne sted, fortrinnsvis temperaturer på 0,1-100 K, helst 0,5-10 K, aller helst 1-5 K. Introduksjonshjelpemidlet for prøven er fortrinnsvis forseglbart i øvre del, på en passende måte, for å opprettholde delvis vakuum i borehullet. En prøvebeholder, f.eks. et prøvebeger, kan flyttes på og tilpasses inne i den lave enden av introduseringshjelpemidlet for prøven. Prøvebeholderen er fortrinnsvis laget av et lettvektmateriale med en lav spesifikk varmekapasitet og gode kryogene egenskaper, f.eks. KelF (polyklorotrifluoroetylen) eller PEEK (polyetereterketon). Prøvebeholderen kan inneholde mer enn én prøve som skal polariseres.

Prøven settes inn i prøvebeholderen, senkes i det flytende heliumet og gjennomstråles med mikrobølger, fortrinnsvis ved en frekvens på ca. 94 GHz ved 200 mW. Polariseringsnivået kan overvåkes ved å oppnå fast form<13>C-NMR-signaler av prøven under mikrobølgebestrålingen, derfor foretrekkes bruk av en polariseringsenhet som inneholder hjelpemidler for å oppnå fast form<13>C-NMR-spektre ifølge trinn b). Generelt oppnås en saturasjonskurve i et diagram som viser<13>C-NMR-signal vs. tid. Derfor er det mulig å avgjøre når det optimale polariseringsnivået er nådd.

I trinn c) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen løses den fryste polariserte blandingen opp i en buffer, fortrinnsvis en fysiologisk tolererbar buffer, for å oppnå en flytende sammensetning. Termen "buffer", slik den er brukt i denne søknaden, betegner én eller flere buffere, dvs. også blandinger av buffere.

Foretrukne buffere er fysiologisk tolererbare buffere, helst buffere som buffer i området mellom pH 7-8, f.eks. fosfatbuffere (KH2P04/Na2HP04), ACES, PIPES, imidazol/HCI, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS eller TRICIN. De mest foretrukne bufferne er fosfatbuffere og TRIS, aller helst TRIS. I en annen utførelsesform er flere enn én av de ovennevnte foretrukne bufferne blitt brukt, dvs. en blanding av buffere.

Når<13>C-pyrodruesyre ble brukt i forbindelsen som skulle polariseres, omfattet trinn

c) også omdannelse av13C-pyrodruesyre til 13C-pyruvat. For å oppnå dette må<13>C-pyroduresyre reagere med en base. I en utførelsesform reagerer<13>C-pyrodruesyre

med en base for å omdanne den til 13C-pyruvat, og deretter blir det tilsatt en buffer. I en annen foretrukken utførelsesform kombineres bufferen og basen i én løsning og denne løsningen blir tilsatt til<13>C-pyrodruesyre, løser den opp og omdanner den til<13>C-pyruvat samtidig. I en foretrukken utførelsesform er basen en vannholdig løsning av NaOH, Na2C03eller NaHC03, den mest foretrukne basen er NaOH. I en særlig foretrukken utførelsesform blir en løsning av TRIS-buffer som inneholder NaOH, brukt til å løse opp13C-pyrodruesyre og omdanne den til natriumsalt fra<13>C-pyruvat.

I en annen foretrukken utførelsesform inneholder bufferen eller - der det er anvendelig - den kombinerte buffer-/baseløsningen ytterligere én eller flere forbindelser som kan binde eller kompleksere frie paramagnetiske ioner, f.eks. chelatdannende midler som DTPA eller EDTA. Det er funnet at frie paramagnetiske ioner kan forårsake forkortning av T1i den hyperpolariserte forbindelsen, noe som helst unngås.

Oppløsningen kan utføres helst ved å bruke metodene og/eller enhetene offentliggjort i WO-A-02/37132. Kortfattet brukes det en oppløsningsenhet som enten er fysisk separert fra polarisereren, eller en del av et apparat som inneholder polarisereren og oppløsningsenheten. I en foretrukken utførelsesform utføres trinn c) ved et elevert magnetisk felt for å forbedre relaksasjonen og opprettholde maksimal hyperpolarisering. Feltnoder bør unngås, og lave felt kan lede til forsterket

relaksasjon til tross for tiltakene ovenfor.

I det eventuelle trinnet d) ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fjernes radikalet og/eller reaksjonsprodukter derav, fra den flytende sammensetningen oppnådd i trinn c). Radikalet og/eller reaksjonsproduktene kan fjernes delvis, i all vesentlighet eller, ideelt, fullstendig. Fullstendig fjerning er foretrukket når den flytende sammensetningen brukes på humane pasienter. Reaksjonsproduktene av radikalet kan være estere som kan være dannet ved reaksjon av pyrodruesyre med radikaler med formelen (I) som inneholder hydroksygrupper. I en foretrukken utførelsesform ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er trinn d) obligatorisk. Metoder som kan brukes til å fjerne radikalet og/eller reaksjonsprodukter derav, er kjent innen fagfeltet. Vanligvis er metoden som brukes, avhengig av radikalets egenskaper og/eller dens reaksjonsprodukter. Ved oppløsning av den fryste blandingen ifølge trinn c) kan radikalet presipitere, og det kan lett separeres fra den flytende sammensetningen ved filtrering. Hvis det ikke oppstår presipitering, kan radikalet fjernes ved kromatografiske separasjonsteknikker, f.eks. væskefasekromatografi som reversert fase eller ioneutvekslingskromatografi eller ved ekstraksjon.

Siden radikaler med formelen (I) har et karakteristisk UV/synlig-absorpsjonsspektrum, er det mulig å bruke UV/synlig-absorpsjonsmåling som en metode for å kontrollere om den finnes i den flytende sammensetningen etter at den er fjernet. For å oppnå kvantitative resultater, dvs. konsentrasjonen av radikalet til stede i den flytende blandingen, kan det optiske spektrometeret kalibreres slik at absorpsjonen ved en spesifikk bølgelengde danner en prøve av den flytende samensetningen som produserer den motsvarende radikalkonsentrasjonen i prøven. Fjerning av radikalet og/eller reaksjonsproduktene derav, er spesielt foretrukket hvis den flytende sammensetningen blir brukt som et kontrastmiddel ved in vivo MR-avbilding av en human kropp eller en ikke-human animalsk kropp.

Det beskrives en sammesetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, fortrinnsvis hyperpolarisert natrium<13>C-pyruvat og en buffer valgt fra en gruppe som inneholder fosfatbuffer og TRIS.

utførelsesform Det hyperpolariserte<13>C-pyruvatet et polariseringsnivå på minst 10 %, mer foretrukket minst 15 %, særlig foretrukket minst 20 % og mest foretrukket mer enn 20 %.

Det er funnet at slike sammensetninger er utmerkede avbildningsmidler for in vivo MR-avbildning, særlig for in vivo MR-studier av metabolske prosesser og for in vivo MR-avbildning av tumorer, og en sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat og en buffer valgt fra en gruppe som inneholder fosfatbuffer og TRIS kan anvendes som MR-avbildningsmiddel, danner et annet aspekt av oppfinnelsen.

Sammensetningen er helst produsert ifølge fremgangsmåten ifølge krav 1, helst ved bruk av<13>C-pyruvat i trinn a) ifølge fremgangsmåten ifølge krav 1 og et radikal med formelen (I) der M er et hydrogen eller et fysiologisk tolerererbart kation og R1 er lik og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert CrC-hydrokarbongruppe, helst metoksy, -CH2-OCH3, -CH2-OC2H5eller -CH2-CH2-OCH3, og trinn d) er obligatorisk. I en særlig foretrukken utførelsesform er sammensetningen av oppfinnelsen produsert ifølge fremgangsmåten ifølge krav 1 hvor i trinn a)<13>C-pyruvat og et radikal med formelen (I) der M er hydrogen og R1 er lik og er -CH2-CH2-OCH3er brukt og trinn d) er obligatorisk.

Sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, helst hyperpolarisert natrium<13>C-pyruvat og en buffer valgt fra en gruppe som inneholder fosfatbuffer og TRIS kan anvendes for fremstilling av et MR-avbildningsmiddel for in wVo-studier av metabolske prosesser i den humane kroppen eller den ikke-humane animalske kroppen.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er bruk av en sammensetning som inneholder hyperpolarisert<13>C-pyruvat, fortrinnsvis hyperpolarisert natrium-<13>C-pyruvat og en buffer valgt fra en gruppe som inneholder fosfatbuffer og TRIS, for å produsere et MR-avbildningsmiddel for in vivo tumor avbildning i den humane kroppen eller den ikke-humane animalske kroppen, fortrinnsvis for in wVo-turmordiagnostisering og/eller tumorklassifisering og/eller tumorbehandlingsovervåkning, helst for in vivo-prostatatumordiagnostisering og/eller prostatatumorklassifisering og/eller prostatatumorbehandlingsovervåking.

Sammensetningen i henhold til oppfinnelsen kan brukes som et "konvensjonelt" MR-avbildningsmiddel, dvs. gi kontrastforsterkning for anatomisk avbildning. En annen fordel med sammensetningen i henhold til oppfinnelsen, er at pyruvat er en endogen forbindelse som er svært godt tolerert av den humane kroppen, selv i høye konsentrasjoner. Som et intermediat i sitronsyresyklusen, spiller pyruvat en viktig metabolsk rolle i den humane kroppen. Pyruvat omdannes til ulike forbindelser: transaminering resulterer i alanin, via oksidativ dekarboksylering, pyruvat omdannes til acetyl-CoA og bikarbonat, reduksjonen av pyruvat resulterer i laktat og karboksylering i oksaloacetat.

Det er nå funnet at omdannelse av hyperpolarisert<13>C-pyruvat til hyperpolarisert<13>C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat (ved kun<13>Crpyruvat,<13>C12-pyruvat eller<13>Ci,23-pyruvat) og hyperpolarisert<13>C-alanin kan brukes i in vivo MR-studier av metabolske prosesser i den humane kroppen. Dette er overraskende siden man må huske at T1av hyperpolariserte forbindelser svekkes på grunn av relaksasjon og fortynning.<13>C-pyruvat har en TVrelaksasjon i humant fullblod ved 37 °C av ca. 42 s, omdannelsen av hyperpolarisert<13>C-pyruvat til hyperpolarisert<13>C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin er imidlertid funnet å være rask nok til å tillate signalsporing fra opphavsforbindelsen til<13>C-pyruvat og dennes metabolitter. Mengden alanin, bikarbonat og laktat er avhengig av den metabolske statusen for vevet under undersøkelsen. MR-signalintensiteten fra hyperpolarisert<13>C-laktat, hyperpolarisert<13>C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin er relatert til mengden av disse forbindelsene og graden av polarisering som er igjen ved tidspunktet for sporing. Ved å monitore omdannelsen av hyperpolarisert<13>C-pyruvat til hyperpolarisert 13C-laktat, hyperpolarisert13C-bikarbonat og hyperpolarisert<13>C-alanin, er det mulig å studere metabolske prosesser in vivo i den humane kroppen eller den ikke-humane animalske kroppen ved bruk av ikke-invasiv MR-avbildning.

Det er funnet at MR-signalamplituder fra de forskjellige pyruvat-metabolittene, er avhengige av vevstype. Det unike metabolske toppmønsteret som dannes av alanin, laktat, bikarbonat og pyruvat, kan brukes som fingeravtrykk for metabolske tilstander av vevet under undersøkelse, hvilket gjør det mulig å skille mellom friskt vev og tumorvev. Dette gjør sammensetningen i henhold til oppfinnelsen til et utmerket middel for in vivo MR-avbildning av tumorer

Generelt ved MR-avbildning i forbindelse med sammensetningen i henhold til oppfinnelsen plasseres den som undersøkes, f.eks. en pasient eller et dyr, i MR-magneten. Tilegnede<13>C-MR RF-spoler er plassert for å dekke området som er av interesse.

Sammensetningen omfattende hyperpolarisert<13>C-pyruvat og en buffer valgt fra gruppen som inneholder fosfatbuffer og TRIS, administreres parenteralt, fortrinnsvis intravenøst, intraarterielt eller direkte i området eller organet som er av interesse. Dose og konsentrasjon av sammensetningen i henhold til oppfinnelsen vil være avhengig av en rekke faktorer, f.eks. toksisitet, evne til å nå et organ og administrasjonsruten. Generelt administreres sammensetningen i en konsentrasjon på opptil 1 mmol pyruvat per kg kroppsvekt, fortrinnsvis 0,01 til 0,5 mmol/kg, helst 0,1 til 0,3 mmol/kg. Administrasjonshastigheten er fortrinnsvis mindre enn 10 ml/s, helst mindre enn 6 ml/min og aller helst fra 5 ml/s til 0,1 ml/s. I mindre enn 400 s etter administrasjonen, fortrinnsvis mindre enn 120 s, helst mindre enn 60 s etter administrasjonen, særlig foretrukket 20 til 50 s etter administrasjonen og aller helst 30 til 40 s etter administrasjonen, en MR-avbildningssekvens brukes til å kode volumet som er av interesse, i en kombinert frekvens og på en spatial selektiv måte. Dette vil resultere i metabolske avbildninger av<13>C-laktat,<13>C-alanin og 13C-pyruvat og helst i metabolske avbildninger av13C-laktat,<13>C-alanin, 13C-bikarbonat og13C-pyruvat. Innenfor den samme tidsperioden kan det tas et protonbilde med eller uten et proton MRI-kontrastmiddel for å oppnå anatomisk og/eller perfusjonsinformasjon.

Kodingen av volumet av interesse, kan oppnås ved å bruke såkalt spektroskopisk avbildningssekvens som beskrevet i f.eks. T.R. Brown et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 3523-3526 (1982); A.A. Maudsley, et al., J. Magn. Res 51, 147-152

(1983). Spektroskopiske bildedata inneholder et antall volumelementer der hvert element inneholder et fullt<13>C-MR-spektrum. 13C-pyruvat og dennes13C-metabolitter har alle en unik posisjon i et<13>C-MR-spektrum og resonansfrekvensene kan brukes til å identifisere dem. Integralet fra toppunktet på dens resonansfrekvens er direkte koblet til henholdsvis mengden<13>C-pyruvat og dennes 13C-metabolitter. Når mengden av<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt er estimert ved hjelp av tilpasningsrutiner for tidsområder som beskrevet f.eks. i L. Vanhamme et al., J Magn Reson 129, 35-43 (1997), kan bilder bli generert for13C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt der en fargekode eller gråkode representerer mengden<13>C-pyruvat og hver<13>C-metabolitt som måles.

Selv om spektroskopiske avbildningsmetoder har vist seg å være verdifulle i produksjonen av metabolske bilder ved hjelp av alle typer MR-kjerner f.eks.1H,31P,<23>Na, gjør mengden av repetisjoner som skal til for å kode det spektroskopiske bildet i sin helhet, denne fremgangsmåten mindre egnet for hyperpolarisert<13>C. Man må være nøyaktig for å sikre at hyperpolariserte<13>C- signaler er tilgjengelige under hele MR-datainnsamlingen På bekostning av redusert signal til støy, kan dette oppnås ved å redusere RF-pulsvinkelen som brukes i hvert fasekodetrinn. Høyere matrisestørrelser krever flere fasekodetrinn og lengre skannetider.

Avbildningsmetoder basert på pionerarbeid av P. C. Lauterbur (Nature, 242, 190-191, (1973) og P. Mansfield (J. Phys. C. 6, L422-L426 (1973)), antyder at anvendelse av en utlesingsgradient under datainnsamlingen vil tillate høyere signal til støy-bilder eller ekvivalente, høyere spatiale oppløsningsbilder. Disse avbildningsmetodene i deres grunnform vil imidlertid ikke være tilgjengelige til å produsere separate bilder for13C-pyruvat og dennes<13>C-metabolitter, men et bilde som inneholder signalene for<13>C-pyruvat og alle dennes13C-metabolitter, dvs. identifikasjon av spesifikke metabolitter er ikke mulig.

I en foretrukken utførelsesform brukes bildesekvenser som vil gjøre bruk av multiekko for å kode frekvensinformasjonen. Sekvenser som kan produsere separate vann- og fett-1 H-bilder er for eksempel beskrevet i G. Glover, J Magn Reson Imaging 1991;1:521-530 og S. B. Reeder et al., MRM 51 35-45 (2004). Siden metabolitter som skal spores og som sådan har kjente MR-frekvenser, kan fremgangsmåten som blir drøftet i referansen ovenfor, anvendes til direkte avbildning av pyruvat, alanin og laktat, og fortrinnsvis pyruvat, alanin, laktat og bikarbonat, og gjør en mer effektiv bruk av det hyperpolariserte<13>C-MR-signalet, ved at det gir en bedre signalkvalitet sammenlignet med den klassiske spektroskopiske avbildningsteknikken, en høyere spatial oppløsning og raskere innsamlingstid.

Tumorvev karakteriseres ofte med en økt perfusjon og høyere metabolsk aktivitet. Prosessen med å øke vaskulære bed, angiogenese, forårsakes av celler som på grunn av sine høyere metabolske behov og/eller sine store avstander fra en kapillær, ikke er i stand til å få nok substrater som kan gi dem den energien de trenger for å opprettholde energihomeostase. Det er i dette området, hvor celler har problemer med å produsere nok energi, en markert endring i metabolsk mønster er forventet. Vev som har problemer med å opprettholde energihomeostase vil endre sin energimetabolisme som særlig resulterer i en økt laktatproduksjon. Overraskende nok er det mulig å gjøre denne endringen i metabolismen synlig ved hjelp av hyperpolarisert<13>C-pyruvat innfor det korte MR-avbildningstidsvinduet som er tilgjengelig, dvs. bruke det høye<13>C-laktatsignalet i tumorområdet til å skille tumoren fra friskt vev. Siden perfusjonen er heterogen i tumorvevet, foretrekkes det å korrigere13C-laktatsignalet for mengden pyruvat (<13>C-pyruvatsignal) tilgjengelig i samme region. Dette vil gjøre det mulig å fremheve områder i vevet med et relativt høyt laktatsignal med hensyn til pyruvatsignalet, og dermed forbedre muligheten til å skille mellom tumorvev og friskt vev.

Ved korrigering for pyruvatsignalet blir både laktat- og pyruvatbilder normalisert til maksimalverdi i hvert individuelle bilde. Dernest multipliseres det normaliserte laktatbildet med det inverterte pyruvatbildet, f.eks. det maksimale pyruvatsignalet i bildet minus pyruvatnivået for hver piksel. I det siste trinnet multipliseres intermediatresultatet oppnådd i operasjonen ovenfor, med det opprinnelige laktatbildet.

For å fremheve områder med endret metabolisme, kan det høye<13>C-laktatsignalet sammen med et redusert<13>C-alaninsignal brukes i en lignende operasjon som beskrevet i avsnittet ovenfor. Overraskende nok blir identifikasjon av tumorområdet, dvs. muligheten til å skille mellom tumorvev og friskt vev forbedret av denne korrigeringen også. Ved korrigering for alaninsignalet er både laktat- og alaninbilder normalisert til maksimalverdi i hvert individuelle bilde. Dernest multipliseres det normaliserte laktatbildet med det inverterte alaninbildet, f.eks. det maksimale alaninsignalet i bildet minus alaninnivået for hver piksel. I det siste trinnet multipliseres intermediatresultatet oppnådd i operasjonen ovenfor, med det opprinnelige laktatbildet. På en lignende måte kan<13>C-bikarbonatsignalet også inkluderes i analysen. Videre kan et proton bilde innsamlet med eller uten et proton MRI-kontrastmiddel, inkluderes i analysen for å oppnå anatomisk og/eller perfusjonsinformasjon.

I en annen foretrukken utførelsesform administreres sammensetningen i henhold til oppfinnelsen gjentatte ganger, og tillater dermed dynamiske studier. Dette er en videre fordel med sammensetningen sammenlignet med andre MR-avbildningsmidler som, på grunn av sin relativt lange sirkulasjon i pasientens kropp, ikke tillater dynamiske studier.

Sammensetningen i henhold til oppfinnelsen er videre nyttig som et avbildningsmiddel for vivo MR-tumorklassifisering. De samme metabolske bildene og/eller metabolske forholdsbildene som beskrevet i tidligere avsnitt, kan brukes til dette formålet med egnede "cut off'-kategorier definert, avhengig av tumorstørrelsen og metabolsk aktivitet.

Videre er sammensetningen i henhold til oppfinnelsen nyttig som et avbildningsmiddel ved in vivo MR-tumorbehandlingsovervåkning, f.eks. ved å overvåke direkte endringer i metabolismemønsteret for tumorer ved behandling med terapeutiske antitumormidler og/eller strålingsbehandling eller i forbindelse med en hvilken som helst type intervensjonsteknikk, med eller uten noen form for ablasjon, dvs. kjemisk ablasjon kombinert med radiofrekvenser, mikrobølger eller ultralyd. MR-avbildning av tumorer kan påvirkes og forbedres ved å klargjøre pasienten eller dyret på en måte som vil forstyrre proteinmetabolismen, lipidmetabolismen eller energimetabolismen generelt. Måter å oppnå dette på er kjent innen fagfeltet, f.eks. med abrosia (f.eks over natten), glukoseinfusjon osv.

I en foretrukken utførelsesform er sammensetningen i henhold til oppfinnelsen nyttig som et avbildningsmiddel ved in vivo MR-avbildning av tumorer, tumorbehandlingsovervåking og tumorklassifisering av hjernetumorer, brysttumorer, colontumorer/colo-rektale tumorer, lungetumorer, nyretumorer, hode- og nakketumorer, muskeltumorer, magetumorer, spiserørtumorer, ovarietumorer, bukspyttkjerteltumorer og prostatatumorer. Det er videre funnet at sammensetningen i henhold til oppfinnelsen er spesielt nyttig som et avbildningsmiddel for in vivo MR-prostatatumoravbildning, dvs. prostatatumordiagnostisering og/eller prostatatumorklassifisering og/eller prostatatumorbehandlingsovervåking.

Når en mann kommer til lege med symptomer på smerte eller ubehag i urinveien, mistenkes prostatakreft. Hvis mannen er over 50 år, utføres en PSA-test (Prostate Specific Antigen). Prostatakreft mistenkes på grunnlag av en forhøyet PSA og/eller abnormal DRE (Digital Rectal Examination). Hvis PSA-testen er positiv, sendes pasienten til en spesialist (en urolog) for diagnostisering ved hjelp av ultralydledet biopsi. Av de to millioner biopsiprosedyrene som blir utført i USA og Europa hvert år, er henholdsvis 5 av 6 og 2 av 3 negative. Når det blir oppdaget på et tidlig stadium, er femårsoverlevelseshyppigheten for disse pasientene 100%. Siden prostatakreft er den mest vanlige krefttypen og den andre hyppigste årsaken til kreftdød hos menn, er det stor medisinsk etterspørsel etter en metode for diagnostisering av prostatatumorer som er i stand til å oppdage prostatatumorer på et tidlig stadium, og som kan være til hjelp i å redusere antall biopsiprosedyrer.

<13>C-avbildning av prostata krever en sende-mottaksvolum-<13>C-RF-spole, fortrinnsvis en sendevolum-<13>C-RF-spole kombinert med en endorektal RF-spole for kun MR-mottak, og helst brukes en sende-mottaks-faset arrayvolum-<13>C-RF-spole kombinert med en endorektal<13>C-RF-spole for kun MR-mottak. Særlig foretrukket er spoler som utfører innsamlingen av et<1>H-prostatabilde mulig etter<13>C-avbildningen.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er en sammensetning som inneholder<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat og radikalet med formelen (I).

I en foretrukken utførelsesform inneholder den nevnte sammensetningen et radikal med formelen (I) der M er hydrogen eller et ekvivalent av et fysiologisk tolererbart kation. Fortrinnsvis er M hydrogen eller et annet alkalikation, et ammoniumion eller et organisk aminion, f.eks. meglumin. Aller helst representerer M hydrogen eller natrium.

I en annen foretrukken utførelsesform innholder den nevnte sammensetningen et radikal med formelen (I) der R1 er lik eller ulik, og er hydroksymetyl eller hydroksyetyl. I en annen foretrukken utførelsesform er R1 lik eller ulik, og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert C^C^hydrokarbongruppe, fortrinnsvis -CH2-0-(C-rQralkyl), -(CH2)2-0-CH3eller -(CrCs-alkyO-O-CHs. I en annen foretrukken utførelsesform er R1 lik eller ulik, og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert C-r C4-hydrokarbongruppe som bærer en terminal hydroksylgruppe, fortrinnsvis -CH2-0-C2H4OH eller -C2H4-0-CH2OH. I en ennå mer foretrukken utførelsesform er R1 lik og er en rettkjedet alkoksylert C1-C4-hydrokarbongruppe, fortrinnsvis metoksy, - CH2-OCH3, -CH2-OC2H5eller -CH2-CH2-OCH3, aller helst -CH2-CH2-OCH3.

I en særlig foretrukken utførelsesform inneholder den nevnte sammensetningen et radikal med formelen (I) der M er hydrogen eller natrium, og R1 er lik og er -CH2-CH2-OCH3.

I en annen foretrukken utførelsesform inneholder den nevnte sammensetning<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat med en isotopisk anrikning på minst 75 %, fortrinnsvis 80 % og mer foretrukken minst 90 %, og mest foretrukken en isotopisk anrikning på over 90 %. Ideelt er en anrikning på 100 %.<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat kan isotopisk anrikes ved C1-posisjon, ved C2-posisjon, ved C3-positsjon, ved C1- og C2-posisjon, ved C1- og C3-posisjon, ved C2- og C3-posisjon eller ved C1-, C2- og C3-posisjon, med C1-posisjonen som den foretrukne posisjonen.

I en særlig foretrukken utførelsesform inneholder den nevnte sammensetningen<13>C-pyrodruesyre og radikalet med formelen (I) der M er hydrogen eller natrium og R1 er lik og er -CH2-CH2-OCH3, mest foretrukket inneholder den nevnte sammensetningen<13>C-pyrodruesyre og radikalet med formelen (I) der M er hydrogen eller natrium og R1 er lik og er -CH2-CH2-OCH3.

Sammensetningen i henhold til oppfinnelsen som inneholder<13>C-pyroduresyre og/eller<13>C-pyruvat og radikalet med formelen (I) er særlig nyttig for produksjon av hyperpolarisert<13>C-pyruvat, f.eks. for produksjon av hyperpolarisert13C-pyruvat i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Derfor er et annet aspekt av oppfinnelsen bruk av sammensetningen som inneholder<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat og radikalet med formelen (I) for produksjon av hyperpolarisert<13>C-pyruvat.

Radikalene med formelen (I) der M er hydrogen eller natrium og R1 er lik og er - CH2-CH2-OCH3, ble funnet å være særlig gunstig for bruk i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen på grunn av følgende egenskaper: de er løselig i<13>C-pyrodruesyre og stabile når de løses opp heri. Videre viser de høy polariseringseffektivitet i trinn b) av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og er stabile under oppløsningstrinnet c), også når en base brukes i dette trinnet. De kan enkelt fjernes i trinn d) av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved f.eks. filtrering ved hjelp av hydrofobisk filtermateriale.

Radikalene som anvendes ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres som beskrevet i Eksempel 1. Kortfattet kan radikalene syntetiseres ved at tre molare ekvivalenter av en metalert monomerisk arylforbindelse reagere med en molar ekvivalent av et passende beskyttet karboksylsyrederivat for å danne et trimerisk intermediat. Dette intermediatet er metalert og reagerer deretter med f.eks. karbondioksid for å resultere i et trikarboksyl-tritylkarbinol som i neste trinn blir behandlet med en sterk syre for å generere et triarylmetylkation. Dette kationet reduseres deretter for å danne det stabile tritylradikalet.

Radikalene kan anvendes som paramagnetisk middel for hyperpolarisering av forbindelser i en DNP-prosess.

Eksempler

Eksempel 1: Syntese av tris(8-karboksy-2,2,6,6-(tetra(metoksyetyl)benzo-[1,2-4,5']bis-(1,3)ditiol -4-yl)metylnatriumsalt 10 g (70 mmol) tris(8-karboksy-2,2,6,6-(tetra(hydroksyetyl)benzo- [1,2-4,5']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt som er blitt syntetisert i henhold til eksempel 7 av WO-A1-98/39277, ble suspendert i 280 ml dimetylacetamid under en argonatmosfære. Natriumhydrid (2,75 g) etterfulgt av metyliodid (5,2 ml) ble tilført og reaksjonen som er svakt eksotermisk, fikk fortsette 1 time i et 34 °C vannbad i 60 min. Tilsetningen av natriumhydrid og metyliodid ble gjentatt to ganger, i samme mengde for hver av forbindelsene, og etter den siste tilsetningen ble det rørt i blandingen ved romtemperatur i 68 timer. Deretter ble det tilsatt i 500 ml vann. pH-en ble justert til pH > 13 ved hjelp av 40 ml 1 M NaOH (aq), og det ble rørt i blandingen ved omgivelsestemperatur i 15 timer for hydrolyse av de formede metylesterne. Blandingen ble deretter omdannet til syre ved hjelp av 50 ml 2 M HCI (aq) til en pH på ca. 2 og 3 ganger det ekstraherte etylacetatet (500 ml og 2 x 200 ml). Den kombinerte organiske fasen ble tørket over Na2S04, og deretter evaporert til tørr tilstand. Råproduktet (24 g) ble renset ved forberedende HPLC ved bruk av acetonitril/vann som eluenter. De innsamlede fraksjonene ble evaporert for å fjerne acetonitril. Den gjenværende vannfasen ble ekstrahert med etylacetat, og den organiske fasen ble tørket over Na2S04og deretter evaporert til tørr tilstand. Vann (200 ml) ble tilsatt restproduktet, og pH-en ble nøye justert med 0,1 M NaOH (aq) til 7. Restproduktet oppløses langsomt under denne prosessen. Etter nøytralisering ble den vannholdige løsningen frysetørret.

Eksempel 2: Produksjon av hyperpolarisert<13>C-pyruvat ved hjelp av13C-

pyrodrue syre og radikalet i eksempel 1

En 20 mM løsning ble laget ved å løse opp 5,0 mg av radikalet fra eksempel 1 i ^Ci-pyrodruesyre (164 ul). Prøven ble blandet til homogenitet, og et aliquot av løsningen (41 mg) ble plassert i et prøvebeger og satt i DNP-polarisereren.

Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz). Etter 2 timer ble polariseringen stoppet, og prøven ble oppløst ved hjelp av en oppløsningsenhet i henhold til WO-A-02/37132 i en vannholdig løsning av natriumhydroksid og tris(hydroksymetyl)-aminometan (TRIS), for å gi en nøytral løsning av hyperpolarisert natrium<13>Ci- pyruvat. Den oppløste prøven ble raskt analysert med<13>C-NMR for å fastsette polariseringen og en 19,0 %<13>C-polarisering ble oppnådd.

Eksempel 3: Produksjon av hyperpolarisert13C-pyruvat ved hjelp av13C-

pyrodrue syre og radikalet i eksempel 1

En 15 mM løsning ble laget ved å løse opp radikalet fra eksempel 1 (209,1 mg) i en blanding av ^Crpyrudruesyre (553 mg) og umerket pyrudruesyre (10,505 g). Prøven ble blandet til homogenitet, og et aliquot av løsningen (2,015 g) ble plassert i et prøvebeger og satt i DNP-polarisereren.

Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz). Etter 4 timer ble polariseringen stoppet, og prøven ble oppløst ved hjelp av en oppløsningsenhet i henhold til WO-A-02/37132 i en vannholdig løsning av natriumhydroksid og tris(hydroksymetyl)-aminometan (TRIS), for å gi en nøytral løsning av hyperpolarisert natrium 13Ct pyruvat med en total pyruvatkonsentrasjon på 0,5 M i 100 mM TRIS-buffer. I serier med oppløsningsenheten ble det koblet til en kromatogråfisk kolonne. Kolonnen består av en innsats (D = 38 mm; h = 10 mm) som inneholder hydrofobisk pakkemateriale (Bondesil-C18, 40UM Delenummer:12213012) som leveres av Varian. Den oppløste prøven ble tvunget gjennom kolonnen som selektivt adsorberte radikalet. Den filtrerte løsningen ble raskt analysert med<13>C-NMR for å fastsette polariseringen, og en 16,5 %<13>C-polarisering ble oppnådd. Restproduktet for radikalkonsentrasjonen ble deretter analysert med et UV-spektrofotometer ved 469 nm og ble fastsatt til under påvisningsgrensen på 0,1 uM.

Eksempel 4: Produksjon av hyperpolarisert13C-pyruvat ved hjelp av13C-

pyrodrue og tris(8-karboksy-2,2,6,6-(tetra(hydroksy-etoksy)-metylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)ditiol-4-yl)metylnatriumsalt

Tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksy-etoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt ble syntetisert som beskrevet i eksempel 29 i WO-A-97/09633.

En 20 mM løsning ble laget ved å løse opp tris(8-karboksy-2,2,6,6-tetra(hydroksyetoksy)metyl-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis-(1,3)-ditiol-4-yl)metylnatriumsalt i ^Crpyrodruesyre (83,1 mg). Prøven ble blandet til homogenitet, plassert i et prøvebeger og satt inn i DNP-polarisereren. Prøven ble polarisert under DNP-forhold ved 1,2 K i et magnetisk felt på 3,35 T under bestråling med mikrobølger (93,950 GHz).<13>C-NMR-signalet fra prøven ble oppnådd ved hjelp av et Varian lnova-200 NMR-spektrometer. DNP-forsterkning ble kalkulert fra en enhet med termisk likevekt13C-NMR signal og forsterket NMR-signal. 16 %13C-polariseringen ble oppnådd.

Eksempel 5: Tumoravbildning ved bruk av hyperpolarisert<13>C-pyruvat som

avbildnings middel

5.1 Tumor animalsk modell og tumorklargjøring

R3230AC er et adenokarsinom mammae hos rotte som kan opprettholdes hos Fischer 344 hunnrotter. For å etablere en animalsk tumormodell ble en fryst ampulle med R32030-celler som inneholder RPMI 1640, 10 % FBS og 10 % DMSO raskt tinet opp i 37 °C. Deretter ble celleløsningen overført til FBS, og økende volumer med RPMI 1640 ble tilført. Til slutt ble cellesuspensjonen overført til en 25 cm<2>vekstkolbe, og lagt i en inkubator på 37 °C, 5 % C02. Vekstmediet ble byttet annen hver dag. På dagen for infeksjon av rotte ble fjerning av cellene utført enten med mekanisk kraft eller ved bruk av trypsin. Cellene ble vasket ved bruk av fosfatbuffer uten kalsium og magnesium. Trypsin (0,05 % trypsin i 0,02 % EDTA) ble tilført i 2-5 min. Deretter ble 5 ml FBS tilsatt og cellene ble overført i et glassbeger som inneholdt RPMI 1640 med FCS og antibiotika (100IU/ml penicillin, 100 I U/ml streptomysin og 2,5 ug/ml amfotericin B). Celleløsningen ble sentrifugert og cellepelleten ble resuspendert i 20 ml RPMI med FBS og antibiotika, sentrifugering og resuspensjon ble gjentatt. Cellene ble deretter aliquotert to ampuller som inneholdt 4 x 10<6>celler/ml RPMI 1640. For å oppnå donortumorer ble Fischer 344 hunnrotter (Charles River, 180-200 g) gitt bedøvelse og 0,3 ml av cellesuspensjonen ble injisert subkutant i lyskeregionen på begge sider. 15 og 22 dager senere, ble deler av tumoren klargjort som beskrevet i F.A. Burgener et al., Invest Radiol 22/6 (1987), 472-478; S. Saini et al., J. Magn. Reson. 129/1 (1997), 35-43). To innsnitt ble gjort på ventralt abdomen på Fischer mottakerhunnrottene. En tumordel ble innsatt i hver lomme, og innsnittene ble lukket. Rottene ble brakt til avbildning 12-14 dager etter tumorinnpoding.

5.2 Rotteklargjøring og proton-MR-avbildning

Veide rotter ble gitt bedøvelse ved bruk av isofluran (2-3 %) og lagt på et varmebord for å sikre en kroppstemperatur på rundt 37 °C. Et kateter ble introdusert i halevenen og inn i arteria carotis communis sinistra. Rottene ble transportert til MR-maskinen og plassert på en hjemmelaget pute som ble oppvarmet til ca. 37 °C ved hjelp av sirkulerende FC-104 Fluorinert. Denne væsken vil ikke forårsake bakgrunnssignaler ved<1>H- og<13>C-MR-avbildning. Bedøvelse ble fortsatt ved hjelp av 1-2 % isofluran levert via en lang slange i et åpent pustesystem ved en hastighet på 0,4 l/min. Arteriekateteret ble koblet til via en T-tube til en trykkregistrator og en pumpe som leverer saltløsning (hastighet 0,15 l/min) for å unngå kateterklumping. Rottene ble plassert i en MR-spole (Rapid Biomedical, Germany) og avbildet ved hjelp av en standard proton MR-avbildningssekvens for å få anatomisk informasjon og for å bestemme tumorens beliggenhet.

5.3<13>C-MR-avbildning

Basert på protonfrekvensen funnet av MR-systemet ble MR-frekvensen for<13>d-alanin beregnet i henhold til følgende ligning: Frekvens<13>Cralanin = 0,25144 x [(systemfrekvens proton x 1,00021) - 0,000397708]

Frekvensen beregnet posisjonerte MR-signalene som oppstod fra<13>Ci-alanin i resonans med<13>d-laktat til venstre og<13>d-pyruvat resonerer til høyre for<13>d-alanin. En ikke-lokalisert MR-spektroskopisekvens ble kjørt for å sikret at 13C-MR-spole og systemets MR-frekvens var satt opp på riktig måte.<13>C-bildelokasjonen ble plassert for å dekke tumoren (snittykkelse 10 mm, i plan pikselstørrelse 5x5 mm<2>). I rekonstruksjonsfasen ble bildedataene null-fyllt for å resultere i en oppløsning på 2,5 x 2,5 x 10 mm<3>.<13>d-pyruvat i TRIS-buffer (90 mM) ble injisert i en dose på 10 ml/kg i en periode på 12 s med minimum volum på 2 ml i halevenen og 30 s etter injeksjonsstart (dvs. 18 s etter avslutning av injeksjonen), ble den kjemiske overgangen<13>C-MR-sekvens startet.

5.4 Analyse av MR-avbildningsdata

MR-avbildning resulterte i en matrise som inneholdt 16x16 elementer, der hvert element eller voxel/piksel inneholdt et<13>C-MR-spektrum. I rekonstruksjonsfasen var matrisen null-fylt til 32 x 32, en matematisk operasjon som hjelper å forbedre spatial oppløsning. Datasetet som skulle analyseres inneholdt 1024 spektra som ble eksportert til Dicom<®->format (DICOM er det registrerte varemerket for National Electrical Manufacturers Association for standardpublikasjoner angående digital kommunikasjon av medisinsk informasjon) for ytterligere analyse. Ca. halvparten av disse spektra inneholdt ikke MR-signaler siden posisjonen til disse voxelene var utenfor dyret. En plassering innenfor dyret viste voxler med høye pyruvatsignaler og uvesentlige laktat- og alaninsignaler ("blodpool") mens andre voxler viste pyruvat, alanin og laktat ved omtrent samme intensitet.

Amplitudene for pyruvat, alanin og laktat ble estimert ved hjelp av domenetilpasningsprosedyrer som inkluderte følgende: Nullsekvensfasen er konstant over datasettet, den første sekvensfasen er 1,4 ms, linjebredden eller dempning i tidsområdet kan variere mellom 0,5 og 3 ganger gjennomsnittsbredden av hele datasettet for hver metabolitt uavhengig, og frekvensen kan variere med 20 hz i begge retninger med hensyn til gjennomsnittlig frekvens over hele datasettet før den høyeste toppen, som må identifiseres av brukeren.

Amplituder for laktat, alanin og pyruvat ble omordnet i en matrise og om prøvet til å samsvare med oppløsningen av protonet anatomiske MR-bilde.<13>C-MR-bilder ble projisert på anatomiske bilder ved hjelp av en automatisk prosedyre for å oppnå et operator-uavhengig resultat. Resultatene ble vist i bildesett som inneholder det anatomiske protonbildet til tumoren i rotten, det metabolske<13>C-bilde for pyruvat, laktat og alanin projisert på det anatomiske bildet, bilder som viser hver piksel

a) ([laktatjnormx ([pyruvat]max- [pyruvat])n0rm) x [laktat] og

b) ([laktat]norm x ([alanin]max - [alanin])n0rm) x [laktat]

der termen "[....]norm representerer den normaliserte amplituden, dvs. skalert til

den høyeste verdien i det metabolske bildet og [laktat] amplituden beregnet.

Et vellykket resultat for diskriminering av tumorvev og friskt vev i et metabolsk<13>C-MR-bildet ble definert som høyeste laktatsignal i tumorområdet eller en høyt vektet ratiolaktat over pyruvat i tumorområdet samt en høyt vektet laktat over alanin-ratio på den samme piksellokasjonen.

5.5 Biologisk analyse

Tumorområder ble visuelt undersøkt for å oppdage tegn på blødning. Tumorer ble frigjort fra rottekroppene, veid og delt i to. Tumorens innside ble undersøkt visuelt og vurdert for homogenitet, nekrose og blødning. Tumorvevet ble oppbevart i 4 % formalin.

En tumor-bærende rotte ble ansett som egnet for evaluering hvis følgende kriterier ble oppfylt: tumorvekt > 100 mg, ingen synlige nekroser eller cyster i tumorens innside, en kroppstemperatur over 35 °C og et gjennomsnittlig arterielt blodtrykk over 60 mmHg ved MR-undersøkelse.

5.6 Resultater

Totalt 30 ulike tumorer ble avbildet hos 18 rotter. 1 rotte og 3 tumorer oppfylte ikke de biologiske kriteriene beskrevet i foregående avsnitt 5.5. De gjenværende 26 tumorene hos 17 rotter var homogene og hadde en massiv ikke-nekrotisk innside. Gjennomsnittlig polarisering av<13>C-rpyruvat ved injeksjon var 21,2 ± 2,9%

(middelverdi ± SD) og pH var 8,08 ±0,14 (middelverdi ± SD).

Figur 1 viser et typisk sett med bilder av en avbildet rotte med (1) protonreferansebilde, der piler indikerer tumorlokasjonene, (2)<13>C-pyruvatbilde, (3)<13>C-laktatbilde (4)<13>C-alaninbilde (5)<13>C-laktatbilde korrigert for<13>C-pyruvat og (6)<13>C-laktatbilde korrigert for<13>C-alanin. Bildene (2) til (6) er slått sammen med protonreferansebildet. Figur 2 viser det samme settet med bilder, men med bildene (2) til (6) som ikke er slått sammen med det anatomiske protonbildet.

Som et resultat er tumorlokasjonen som indikert av et høyt pyruvatsignal (2), på grunn av høy metabolsk aktivitet. Laktatsignalet (3) identifiserer imidlertid den korrekte lokasjonen av tumoren. Alanin er synlig i skjelettmusklene og er fraværende i tumorvevet (4). Pyruvat- og alaninkorrigerte laktatbilder, (5) og (6), resulterer også i en utmerket kontrast for tumoren.

Det ble derfor demonstrert at tumorlokasjonen i de metabolske bildene er indikert av et høyt laktatsignal, et høyt laktatsignal korrigert for pyruvat og et høyt laktatsignal korrigert for alanin.

Analysen for metabolske<13>C-MR-bilder avslørte en metabolsk kontrast i tumorområdet i

• 24 av 26 tumorer for laktatsignalet

• 26 av 26 tumorer for laktatsignalet, pyruvatkorrigert (5,5, a))

• 26 av 26 tumorer for laktatsignalet, alaninkorrigert (5,5, a))

Den totale suksessraten for dette studiet var 26 av 26, eller 100 %.

Med dette studiet ble det demonstrert at hyperpolarisert<13>Crpyruvat når området av interesse (tumor) i løpet av en tidsperiode som gjør det mulig å avbilde forbindelsen, at forbindelsen og dennes metabolitter kan avbildes og at metabolsk kontrast kan oppnås.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en flytende sammensetning omfattende hyperpolarisert<13>C-pyruvat,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: a) fremstilling av en flytende blanding som inneholder et radikal med formelen (I),<13>C-pyrudruesyre og/eller<13>C-pyruvat og frysing av blandingen

der M er hydrogen eller en ekvivalent av et kation, og R1 som er lik eller ulik, er en rettkjedet eller forgrenet hydroksylert og/eller alkoksylert CrC-hydrokarbongruppe b) forsterking av<13>C-kjernepolarisering av pyrodruesyre og/eller pyruvat i blandingen via dynamisk kjernepolarisering (DNP) c) tilsetning av en buffer og en base til den fryste blandingen for å løse den opp og for å konvertere13C-pyrodruesyre til et13C-pyruvat for å oppnå en flytende sammensetning eller, når bare<13>C-pyruvate brukes i trinn a), tilsetning av en buffer til den fryste blandingen for å løse den opp for å oppnå en flytende sammensetning d) eventuelt, fjerne radikalet og/eller reaksjonsprodukter derav, fra den flytende sammensetningen.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 hvori radikalet er et radikal med formelen (I), der M er hydrogen eller en ekvivalent av et fysiologisk tolererbart kation, og R1 er lik eller ulik og er hydroksymetyl, hydroksyetyl, eller R1 er lik eller ulik og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert C1-C4-hydrokarbongruppe som bærer en terminal hydroksylgruppe, eller R1 er lik eller ulik og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert C1-C4-hydrokarbongruppe.

3. Metoden i henhold til krav 2 hvori R1 er lik og er en rettkjedet eller forgrenet alkoksylert CrCrhydrokarbongruppe, fortrinnsvis metoksy, -CH2-OCH3, -CH2-OC2H5eller -CH2-CH2-OCH3.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 til 3 hvori<13>C-pyrodruesyre og/eller13C-pyruvat er isotopisk anriket ved C1-posisjon, ved C2-posisjon, ved C3-posisjon, ved C1- og C2-posisjon, ved C1- og C3-posisjon, ved C2- og C3-posisjon eller ved C1-, C2- og C3-posisjon, fortrinnsvis ved C1-posisjon.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 til 4 hvori den isotopiske anrikningen av<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat er minst 75 %, fortrinnsvis minst 90 %.

6. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 5 hvori bufferen er en buffer valgt fra gruppen som inneholder fosfatbuffer, ACES, PIPES, imidazol/HCI, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS og TRICIN, fortrinnsvis valgt fra gruppen som inneholder fosfatbuffer og TRIS.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 1-6 hvori<13>C-pyrodruesyre brukes i trinn a) og hvori trinn c), bufferen og basen, er kombinert i én løsning.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 1-6 hvori<13>C-pyrodruesyre er brukt i trinn a) og basen er NaOH.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 1-8 hvori trinn d) er obligatorisk.

10. Fremgangsmåte i henhold til krav 9 for fremstilling av en sammensetning for bruk som avbildningsmiddel ved in vivo MR-avbildning, for en human kropp eller en ikke-human animalsk kropp.

11. Sammensetningkarakterisert vedat den omfatter<13>C-pyrodruesyre og/eller<13>C-pyruvat og et radikal med formelen (I).

12. Sammensetning i henhold til krav 11 omfattende<13>C-pyrodruesyre og et radikal med formelen (I), der M er hydrogen eller natrium og R1 er lik og er - CH2-CH2-OCH3.

13. Anvendelse av en sammesetning i henhold til krav 11 og 12 for fremstilling av hyperpolarisert<13>C-pyruvat.