KR20070053750A

KR20070053750A - 진단용 화합물

Info

Publication number: KR20070053750A
Application number: KR1020077005792A
Authority: KR
Inventors: 마그네 솔바켄; 벤테 아르보; 알란 커쓰버트슨; 알렉산더 깁슨
Original assignee: 지이 헬스케어 에이에스; 지이 헬쓰케어 리미티드
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2005-09-14
Publication date: 2007-05-25
Also published as: US20110117016A1; IL181529A0; ATE404225T1; HK1118713A1; US20080095701A1; SI1791571T1; US8563600B2; RU2007108762A; NO20071880L; AU2005283904A1; CN101151054B; PT1791571E; JP2008516894A; WO2006030291A3; EP1791571B1; DE602005008996D1; NZ553384A; KR101243016B1; MX2007003019A; EP1791571A2

Abstract

본 발명은 화학식 III 또는 IIIa의 컨쥬게이트 또는 그의 염, 방사성 제약으로서의 그의 용도, 그의 제조 방법, 및 상기 방법에 사용되는 합성 중간체에 관한 것이다.

방사성불화 방법, 벡터, 연결기, 방사성 제약 조성물, 양전자 방출 단층촬영

Description

진단용 화합물 {DIAGNOSTIC COMPOUNDS}

본 발명은 신규 펩티드-기재 화합물, 및 양전자 방출 단층촬영 (PET)을 이용하는 진단 영상화에서의 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈관형성과 관련된 수용체, 특히 인테그린 수용체, 예를 들어 αvβ3 인테그린 수용체에 결합하는 표적화 벡터로서의 상기 펩티드-기재 화합물의 용도에 관한 것이다. 따라서, 상기 화합물은 진단 또는 요법, 예를 들어 악성 질병, 심장 질병, 자궁내막증, 염증-관련 질병, 류마티스 관절염 및 카포시 육종의 진단 또는 요법에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 펩티드-기재 화합물의 제조 방법 및 제조용 시약에 관한 것이다.

진단 영상화에서의 방사성표지 생물활성 펩티드의 적용은 핵 의학에서 중요해지고 있다. 특정 세포 유형과 선택적으로 상호작용하는 생물학적으로 활성인 분자는 방사성활성을 표적 조직에 전달하는데 유용하다. 예를 들어, 방사성표지 펩티드는 진단 영상화 및 방사성요법에서 방사성핵종의 종양, 경색 및 감염된 조직으로의 전달에 상당한 잠재성을 갖는다. 대략 110 분의 반감기를 갖는 ¹⁸F는 많은 수용체 영상화 연구에서 선택되는 양전자-방출 핵종이다. 따라서, ¹⁸F-표지된 생물활 성 펩티드는 광범위한 여러 질병의 정량적 검출 및 특징화를 위한 PET에서의 그의 유용성으로 인해 상당한 임상 잠재성을 갖는다.

신규 혈관은 혈관생성(vasculogenesis) 또는 혈관형성(angiogenesis)의 두가지 상이한 메카니즘에 의해 형성될 수 있다. 혈관형성은 존재하는 혈관으로부터의 분지형성에 의한 신규 혈관의 형성이다. 상기 프로세스를 위한 1차 자극은 조직 중 세포로의 영양소 및 산소의 부적합한 공급(저산소증)일 수 있다. 세포는 혈관형성 인자를 분비함으로써 반응할 수 있으며, 여기서 혈관형성 인자로는 많은 종류가 있으며, 한 예는 종종 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)라고 지칭되는 혈관형성 인자이다. 이들 인자는 기저막의 단백질을 분해하는 단백질 분해 효소, 뿐만 아니라 이들 잠재적 유해 효소의 작용을 제한하는 억제제의 분비를 개시한다.

혈관형성 인자의 다른 중요한 효과는 내피 세포의 이동 및 분할을 야기하는 것이다. 관강외 측면의 혈관 주위의 연속적 시트를 형성하는 기저막에 부착된 내피 세포는 유사분열하지 않는다. 혈관형성 인자에 대한 수용체로부터의 부착 및 신호의 손실의 조합된 효과는 내피 세포의 이동, 증식 및 그 자신의 재배열을 야기하며, 마지막으로 신규 혈관 주위의 기저막의 합성을 야기한다.

혈관형성은 상처 치유 및 염증 프로세스를 비롯하여 조직의 성장 및 재성형에 중요하다. 종양은 밀리미터 크기에 도달하면 그의 성장률을 유지하기 위하여 혈관형성을 개시해야 한다. 혈관형성은 내피 세포 및 그의 환경의 특징적 변화를 동반한다. 단백질 분해를 수행하고 제어하는데 관련된 여러 단백질 외에도, 이들 세포의 표면은 이동을 위한 생성에서 재성형되고, 잠재적 구조가 노출되며 여기서 기저막이 분해된다. 종양의 경우, 날카로운 꼬임 및 또한 동정맥 단락의 형성과 함께 혈관의 생성된 그물이 통상적으로 붕괴된다. 또한, 혈관형성의 억제는 항종양 요법을 위한 유망한 전략으로 여겨진다. 전환 동반 혈관형성은 또한 진단에 매우 유망하며, 한 예로는 악성 질병이 있으나, 그 개념은 또한 염증, 및 죽상경화증을 비롯한 다양한 염증-관련 질병에서 상당히 유망하며, 초기 죽상경화 병변의 대식세포는 혈관형성 인자의 잠재적 근원이다.

세포 유착과 관련된 많은 리간드는 트리펩티드 서열 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD)을 함유한다. RGD 서열은 상기 서열을 제공하는 리간드와 세포의 표면 상의 수용체 사이에서 1차 인식 부위로서 작용하는 것으로 보인다. 일반적으로, 상기 리간드와 수용체 간의 2차 상호작용은 상기 상호작용의 특이성을 향상시키는 것으로 여겨진다. 상기 2차 상호작용은 RGD 서열에 바로 인접한 수용체와 리간드의 잔기 간에 또는 RGD 서열과 거리가 먼 부위에서 일어날 수 있다.

따라서, 생체내 혈관형성과 관련된 인테그린 수용체의 효율적인 표적화 및 영상화는 화학적으로 강건하고 안정한, 선택적인 고친화성 RGD 기재 벡터를 필요로 한다. 또한, 배출의 경로는 조영제의 설계시 배경과의 문제점을 감소시키기 위하여 중요한 인자이다.

WO 03/006491호에는 혈관형성과 관련된 인테그린 수용체를 표적으로 하는 펩티드-기재 화합물이 기재되어 있다. 그러나, PET와 같은 진단 영상화 기술에 있어서 유용한 상기 펩티드-기재 화합물에 대한 필요성이 또한 존재한다. 동시 계류 중인 국제 출원 PCT/GB2004/001052호에는 ¹⁸F를 갖는 생물학적으로 활성인 벡터를 표지하는데 적합한 방법이 기재되어 있다. 그러나, 신속하고 효율적으로 제조될 수 있고 원하는 생물학적 활성도 갖는 펩티드-기재 화합물에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

제1 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 III의 화합물을 생성시키는 것을 포함하는 방사성불화 방법을 제공한다.

(상기 식에서, 벡터는 하기 단편

을 포함함)

(상기 식에서,

n은 0 내지 20의 정수이고,

m은 0 내지 10의 정수이고,

Y는 수소, C₁ _- ₆알킬 (예컨대, 메틸) 또는 페닐임)

(상기 식에서, m, n 및 Y는 화학식 II의 화합물에서 정의된 바와 같고, 벡터는 화학식 I의 화합물에서 정의된 바와 같음)

상기 반응은 적합한 용매, 예를 들어 pH가 1 내지 11, 적합하게는 2 내지 11, 보다 적합하게는 2 내지 6 범위인 수성 완충액에서 5 내지 100℃, 적합하게는 20 내지 70℃, 바람직하게는 주변 온도의 극도의 온도가 아닌 온도에서 수행할 수 있다.

한 특정 측면에서, 화학식 I 또는 III에서의 벡터는 하기 화학식 A의 화합물이다.

상기 식에서, X⁷는 -NH₂ 또는

(여기서, a는 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 a는 1임)이다.

화학식 I의 화합물에서의 벡터의 연결기 형성 부분은 얻어진 화학식 III의 컨쥬게이트에 양호한 생체내 약물동력학, 예컨대 유리한 배출 특징을 제공하도록 선택된다. 상이한 친지질성 및/또는 전하를 갖는 연결기의 사용은 펩티드의 생체내 약물동력학을 진단 요구성에 적합하도록 유의적으로 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 화학식 III의 컨쥬게이트가 신장 배출에 의해 신체로부터 제거되는 것이 바람직하면 친수성 연결기를 사용하고, 간담즙 배출에 의해 신체로부터 제거되는 것이 바람직하면 소수성 연결기를 사용한다. 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 함유하는 연결기는 몇몇의 환경에서 바람직한 혈액 클리어런스를 늦추는 것으로 밝혀졌다.

화학식 I의 화합물에서의 벡터의 연결기 형성 부분은 C₁ _-60 히드로카르빌기, 적합하게는 C₁ _-30 히드로카르빌기, 임의로 산소 또는 질소와 같은 헤테로원자를 1 내 지 30개, 적합하게는 1 내지 10개 함유하는 히드로카르빌기이다. 적합한 연결기로는 알킬쇄, 알케닐쇄, 알키닐쇄, 방향족 고리, 폴리방향족 고리, 헤테로방향족 고리, 및 에틸렌글리콜, 아미노산 또는 탄수화물 서브유닛을 포함하는 중합체가 있다. 바람직하게는, 화학식 I의 화합물에서의 벡터의 연결기 형성 부분은 폴리에틸렌 글리콜 서브유닛을 포함하며, 가장 바람직하게는 연결기는 하기 화학식 B의 화합물이다.

상기 식에서, b는 2 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 b는 3 내지 10의 정수이고, 가장 바람직하게는 b는 5이다.

용어 "히드로카르빌기"는 탄소 및 수소로 이루어진 유기 치환기를 의미하며, 이러한 기는 포화, 불포화 또는 방향족 부분을 포함할 수 있다.

따라서, 바람직한 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ia의 화합물이다.

상기 식에서, X⁷는 -NH₂ 또는

(여기서, a는 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 a는 1이고, b는 2 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 b는 3 내지 10의 정수이고, 가장 바람직하게는 b는 5임)이다.

바람직한 화학식 II의 화합물은 m이 0이고, n이 0이고, Y가 수소인 화합물이다.

화학식 I 및 III의 화합물은 펩티드 합성, 예를 들어 고체-상 펩티드 합성의 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Atherton, E. and Sheppard, R.C.; "Solid Phase Synthesis"; IRL Press: Oxford, 1989]에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 아미녹시기의 화학식 I의 화합물에의 도입은 활성화된 산과 펩티드 아민 관능기의 반응에 의해 형성되고 펩티드 합성 도중에 또는 후에 도입되는 안정한 아미드 결합의 형성에 의해 성취할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 방사성표지 펩티드-기재 화합물의 제조에 유용한 시약으로서의 용도를 갖는 상기 정의된 화학식 I 및 Ia의 화합물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 화학식 III의 방사성표지 컨쥬게이트 또는 그의 염을 제공한다. 바람직한 화학식 III의 화합물은 하기 화학식 IIIa의 화합물 또는 그의 염이다.

상기 식에서, X⁷는 -NH₂ 또는

특히 바람직한 화학식 III의 화합물은 하기 화학식의 화합물이다.

화학식 III 및 IIIa의 화합물의 적합한 염으로는 제약상 허용되는 산 부가염, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 락트산, 피루브산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 숙신산, 옥살산, 푸마르산, 말레산, 옥살아세트산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 벤젠술폰산 및 이소에티온산으로부터 형성되는 산 부가염이 있다.

화학식 II의 화합물은 하기 화학식 IV의 상응하는 전구체 또는 그의 보호된 유도체로부터, 시클로트론 제조된 수성 [¹⁸F]-플루오라이드, 적합하게는 염기로부터 (예를 들어, 테트라부틸암모늄 또는 K₂CO₃/크립토픽스(Kryptofix)-222로부터) 증발에 의해 예비-활성화된 [¹⁸F]-플루오라이드와, 적합한 용매, 예컨대 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 또는 디메틸 술폭시드에서, 전형적으로 주변 온도 또는 승온에서, 예를 들어 140℃ 이하에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 식에서, L은 이탈기이고, 바람직하게는 m≥1이면 L은 p-톨루엔술포네이트, 트리플루오로메탄술포네이트 또는 메탄술포네이트, 또는 할라이드이고, m이 0이면 L은 p-트리알킬 암모늄염 또는 p-니트로이고, Y, m 및 n은 화학식 II의 화합물에서 정의된 바와 같다.

또한, 화학식 II의 화합물의 알데히드 또는 케톤 관능기는 그의 보호된 전구체, 예컨대 아세탈 또는 케탈로부터 간단한 산 처리 다음 불화에 의해 신속히 제조될 수 있다.

하기 시험관내 경쟁 결합 분석에 나타낸 바와 같이, 화학식 I 및 Ia의 화합물은 혈관형성과 관련된 수용체에 결합한다. 따라서, 이들 화합물은 혈관형성과 관련된 질병 및 상태의 치료, 생체내 진단 및 영상화에 유용할 수 있다.

용어 "혈관형성과 관련된 질병 및 상태"에는 하기 언급된 질병 및 상태가 포함된다. 이와 관련하여 WO 98/47541호도 언급되어 있다.

혈관형성과 관련된 질병 및 상태로는 상이한 형태의 암 및 전이, 예를 들어 유방, 피부, 결장직장, 췌장, 전립선, 폐 또는 난소 암이 있다.

혈관형성과 관련된 다른 질병 및 상태는 염증 (예를 들어, 만성 염증), 죽상경화증, 류마티스 관절염 및 치은염이다.

혈관형성과 관련된 추가의 질병 및 상태는 동정맥 기형, 성상세포종, 융모막 암종, 교모세포종, 신경교종, 혈관종 (소아혈관종, 모세혈관종), 간암, 자궁내막 증식증, 허혈성 심근, 자궁내막증, 카포시 육종, 황반 변성, 흑색종, 신경모세포종, 폐쇄성 말초 동맥 질병, 골관절염, 건선, 망막병증 (당뇨성 망막병증, 증식성 망막병증), 피부경화증, 정상피종 및 궤양성 결장염이다.

또한, 본 발명은 유효량 (예를 들어, 생체내 PET 영상화에서 사용하기에 효과적인 양)의 상기 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 화합물 또는 그의 염을; 1종 이상의 제약상 허용되는 아쥬반트, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 방사성 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 의학, 특히 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 생체내 진단 또는 영상화, 예를 들어 PET에 의한 생체내 진단 또는 영상화에서 사용하기 위한, 상기 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다.

화학식 III 또는 IIIa의 방사성표지 컨쥬게이트는 PET 영상화를 위해 목적 신호를 얻기에 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있으며, 0.01 내지 100 mCi, 바람직하게는 0.1 내지 50 mCi, 가장 바람직하게는 1 내지 20 mCi의 전형적인 방사성핵종 투여량은 통상적으로 신체 체중 70 kg에 대하여 충분할 것이다.

따라서, 화학식 III 또는 IIIa의 방사성표지 컨쥬게이트는 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 당업자에게 충분히 공지된 방법에 의해 투여용으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 화합물, 임의로 제약상 허용되는 부형제가 첨가된 화합물을 수성 매질에 현탁시키거나 용해시키고, 얻어진 용액 또는 현탁액 을 멸균시킬 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 생체내 영상화, 적합하게는 PET에 의한, 바람직하게는 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 영상화 방법에서 사용하기 위한 방사성 제약을 인간 또는 동물 신체에 투여하고 상기 신체 중 적어도 일부의 영상을 생성시키는 것을 포함하는, 생체내 영상화, 적합하게는 PET에 의한, 바람직하게는 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 영상화 방법에서 사용하기 위한 방사성 제약의 제조를 위한, 상기 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 방사성표지 컨쥬게이트 또는 그의 염의 용도를 제공한다.

또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 화학식 III 또는 IIIa의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 방사성 제약을 인간 또는 동물 신체에 예를 들어 혈관계로 투여하고, PET를 이용하여 상기 방사성 제약이 분포되는 상기 신체의 적어도 일부의 영상을 생성시키는 것을 포함하는, 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 생체내 진단 또는 영상화 방법을 제공한다.

또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 화학식 III 또는 IIIa의 방사성표지 컨쥬게이트 또는 그의 염을 인간 또는 동물 신체에 투여하고, 세포 수용체, 바람직하게는 내피 세포 수용체, 특히 αvβ3 수용체에 의한 상기 컨쥬게이트의 흡수를 검출하고, 임의로 바람직하게는 상기 투여 및 상기 검출을 반복적으로, 예를 들어 상기 약물에 의한 치료 전에, 도중에 및 후에 수행하는 것을 포함하는, 암과 관련된 상태, 바람직하게는 혈관형성을 방지하는 약물, 예를 들어 세포독성제에 의한 상기 신체의 치료 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 화학식 II의 인공기 및 화학식 I의 화합물을 포함하는 방사성불화 추적자의 제조용 키트를 제공한다.

키트의 사용에서, 화학식 II의 화합물을 적합하게는 수성 완충액 (pH 1 내지 11)에 용해될 수 있는 화학식 I의 화합물에 각각 첨가할 수 있다. 극도의 온도가 아닌 온도에서 1 내지 70 분 동안 반응시킨 후, 표지된 펩티드를, 예를 들어 고체-상 추출 (SPE) 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하고 수집할 수 있다.

본 발명은 하기 약어가 사용된 실시예에 의해 예시된다.

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

NMR: 핵 자기 공명

TFA: 트리플루오로아세트산

hr(s) : 시간(들)

min(s) : 분(들)

DMAP : 4-(디메틸아미노)피리딘

THF : 테트라히드로푸란

DCM : 디클로로메탄

DMF : N,N-디메틸포름아미드

TBAF: 테트라부틸암모늄 플루오라이드

MeOH: 메탄올

TLC: 박층 크로마토그래피

TIS: 트리이소프로필실란

DMSO: 디메틸술폭시드

PBS: 포스페이트 완충 염수

PyAOP :[7-아자벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트]

Boc: t-부톡시카르보닐

RT: 실온

실시예 1

4-트리메틸암모늄 벤잘데히드 트리플레이트 (화합물 1)의 제조

본 화합물을 문헌 [Haka et al, J. Labelled Cpds. & Radiopharms 1989 27(7) 823)]에 기재된 절차에 따라 합성하였다.

실시예 2

펩티드 전구체 (화합물 3)의 제조

펩티드인 화합물 2를 표준 펩티드 합성을 이용하여 합성하였다.

(a) 1,17-디아지도-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸

건조 THF (125 mL) 중 건조 헥사에틸렌 글리콜 (25 g, 88 mmol) 및 메탄술포닐 클로라이드 (22.3 g, 195 mmol)의 용액을 아르곤하에 유지하고, 빙/수 조에서 0℃로 냉각시켰다. 건조 THF (25 mL) 중 트리에틸아민 (19.7 g, 195 mmol)의 용액을 45 분에 걸쳐서 적가하였다. 1 시간 후, 냉각 조를 제거하고, 반응물을 추가 4 시간 동안 교반하였다. 그 후, 물 (55 mL)을 혼합물에 첨가한 다음, 탄산수소나트륨 (5.3 g, pH 8로) 및 아지드화나트륨 (12.7 g, 195 mmol)을 첨가하였다. THF를 증류에 의해 제거하고, 수용액을 24 시간 동안 환류하였다 (두 층이 형성되었음). 혼합물을 냉각시키고, 에테르 (100 mL)를 첨가하고, 수성상을 염화나트륨으로 포화시켰다. 상기 상을 분리하고, 수성상을 에테르 (4 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수 (2 x 50 mL)로 세척하고 건조시켰다 (MgSO₄). 용매를 여과하고 증발 시켜 황색 오일 26 g (89％)을 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

(b) 17-아지도-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸아민

격렬하게 교반한 5％ HCl (200 mL) 중 1,17-디아지도-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸 (25 g, 75 mmol)의 현탁액에 에테르 (150 mL) 중 트리페닐포스핀 (19.2 g, 73 mmol)의 용액을 3 시간에 걸쳐서 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가 24 시간 동안 교반하였다. 상을 분리하고, 수성상을 디클로로메탄 (3 x 40 mL)으로 추출하였다. 수성상을 빙/수 조에서 냉각시키고, 고체 수산화칼륨을 첨가하여 pH를 12로 조정하였다. 수성상을 농축시키고, 생성물을 디클로로메탄 (150 mL)에 녹였다. 유기상을 건조시키고 (Na₂SO₄) 농축시켜 황색 오일 22 g (95％)을 수득하였다. 생성물을 전기분무 질량 분광분석법(ESI-MS)에 의해 확인하였다 (MH⁺ 계산치: 307.19; 실측치 307.4). 조 오일을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

(c) 23-아지도-5-옥소-6-아자-3,9,12,15,18,21-헥사옥사트리코산산

디클로로메탄 (100 mL) 중 17-아지도-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸아민 (15 g, 50 mmol)의 용액에 디글리콜산 무수물 (아크로스(Acros), 6.4 g, 55 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. ESI-MS 분석에 의해 반응을 모니터링하고, 추가로 시약을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 용액을 농축시켜 황색 잔류물을 수득하였으며, 이를 물 (250 mL)에 용해시켰다. 생성물을 수성상으로부터 디클 로로메탄으로 밤새 연속적으로 추출하여 단리하였다. 용매를 건조시키고 증발시켜 18 g (85％)의 수율을 얻었다. 생성물을 ESI-MS 분석에 의해 특징화하였다 (MH⁺ 계산치: 423.20; 실측치 423.4). 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

(d) 23-아미노-5-옥소-6-아자-3,9,12,15,18,21-헥사옥사트리코산산

23-아지도-5-옥소-6-아자-3,9,12,15,18,21-헥사옥사트리코산산 (9.0 g, 21 mmol)을 물 (50 mL) 용해시키고, H₂(g)-Pd/C (10％)을 사용하여 환원시켰다. ESI-MS 분석이 목적 생성물 (MH⁺ 계산치: 397.2; 실측치 397.6)로 완전히 전환되었는 것을 나타낼 때까지 반응을 진행시켰다. 조 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

(e) (Boc-아미노옥시)아세틸-PEG(6)-디글리콜산

디옥산 (2.5 mL) 중 디시클로헥실카르보디이미드 (515 mg, 2.50 mmol)의 용액을 디옥산 (2.5 mL) 중 (Boc-아미노옥시)아세트산 (477 mg, 2.50 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (287 mg, 2.50 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 여과하였다. 여과물을 물 (5 mL) 중 23-아미노-5-옥소-6-아자-3,9,12,15,18,21-헥사옥사트리코산산 (1.0 g, 2.5 mmol) 및 N-메틸모르폴린 (278 ㎕, 2.50 mmol)의 용액을 함유하는 반응 용기로 이동시켰다. 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. ESI-MS 분석은 목적 생성물 (MH⁺ 계산치: 570.28; 실 측치 570.6)로 완전히 전환되었다는 것을 나타내었다.

조 생성물을 정제용 HPLC (컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 5μ C18 (2) 250 x 21.20 mm, 검출: 214 nm, 기울기: 60 분에 걸쳐서 0 내지 50％ B (여기서, A = H₂O/0.1％ TFA 및 B = 아세토니트릴/0.1％ TFA), 유량: 10 mL/min)에 의해 정제하여 순수한 생성물 500 mg (38％)을 수득하였다.

생성물을 HPLC (컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2), 50 x 2.00 mm, 검출: 214 nm, 기울기: 10 분에 걸쳐서 0 내지 50％ B (여기서, A = H₂O/0.1％ TFA 및 B = 아세토니트릴/0.1％ TFA), 유량: 0.75 mL/min, Rt = 5.52 분)에 의해 분석하였다. NMR 분석에 의해 추가로 확인하였다.

(f) (Boc-아미노옥시)아세틸-PEG(6)-디글리콜산의 화합물 2로의 컨쥬게이션

(Boc-아미노옥시)아세틸-PEG(6)-디글리콜산 (0.15 mmol, 85 mg) 및 PyAOP (0.13 mmol, 68 mg)를 DMF (2 mL)에 용해하였다. N-메틸모르폴린 (0.20 mmol, 20 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 10 분 동안 교반하였다. DMF (4 mL) 중 화합물 2 (0.100 mmol, 126 mg) 및 N-메틸모르폴린 (0.20 mmol, 20 ㎕)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 25 분 동안 교반하였다. 추가의 N-메틸모르폴린 (0.20 mmol, 20 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 추가 15 분 동안 교반하였다. DMF를 진공하에 증발시키고, 생성물을 10％ 아세토니트릴-물에 녹이고, 정제용 HPLC (컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250 x 21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 기울기: 40 분에 걸쳐서 5 내지 50％ B (여기서, A = H₂O/0.1％ TFA 및 B = 아세토니트릴/0.1％ TFA), 유량: 10 mL/min)에 의해 정제하여 반-순수한 생성물 100 mg을 수득하였다. TFA를 HCOOH로 대체한 제2 정제 단계 (기울기: 0 내지 30％ B, 다른 조건은 상기와 동일한 조건임)에 의해 89 mg (50％)을 수득하였다. 생성물을 HPLC (컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50 x 2 mm, 검출: UV 214 nm, 기울기: 10 분에 걸쳐서 0 내지 30％ B (여기서, A = H₂O/0.1％ HCOOH 및 B = 아세토니트릴/0.1％ HCOOH), 유량: 0.3 mL/min, Rt: 10.21 분)에 의해 분석하였다. ESI-MS를 이용하여 추가로 생성물을 특징화하였다 (MH₂ ² ⁺ 계산치: 905.4, 실측치: 906.0).

실시예 3

18F-플루오로벤잘데히드의 화합물 3으로의 화학선택적 라이게이션에 의한 화합물 4의 수득

TFA 함유 5％ 물을 펩티드 10 mg에 첨가함으로써 펩티드 3을 탈보호하였다. 물 1 ml 중 Boc-탈보호된 펩티드 (5.9 mg, 0.0044 mmol)을 아세토니트릴 1 ml 중 4-플루오로 벤잘데히드 (화합물 1) (1.1 mg, 0.94 ㎕, 0.0089 mmol)에 첨가하였다. 혼합물의 pH는 3.5였다. 70℃에서 45 분 후, 혼합물을 역상 정제용 크로마토그래 피 (페노메넥스 루나 C18 컬럼, 00G-4253-N0; 용매: A= 물 + 0.1％ TFA / B= CH3CN + 0.1％ TFA, 기울기: 30 분에 걸쳐서 10 내지 40％ B; 유량 5.0 ml/분; 214 nm에서 검출)에 의해 2회 정제하여 순수한 화합물 2.0 mg (32％)을 수득하였다 (분석용 HPLC: 페노메넥스 루나 C18 컬럼, 00G-4252-E0; 용매: A = 물 + 0.1％ TFA / B = CH₃CN + 0.1％ TFA, 기울기: 20 분에 걸쳐서 10 내지 50％ B; 유속 1.0 ml/분; 체류 시간 16.3 분, 214 및 254 nm에서 검출). 질량 분광분석법을 이용하여 추가로 특징화하여 m/z 값 1437.2. [M-H⁺]을 얻었다.

실시예 4

¹⁸F-화합물 4의 방사성합성

방법 1

¹⁸F-플루오라이드 (370 MBq 이하)를 크립토픽스 222 (아세토니트릴 0.5 ml 중 5 mg) 및 탄산칼륨 (물 중 0.1M 용액 50 ㎕)의 존재하에 N₂하에 110℃로 20 분 동안 가열함으로써 공비증류하여 건조시켰다. 상기 시간 동안 아세토니트릴 3 x 0.5 ml을 첨가하고 증발시켰다. 40℃ 미만으로 냉각시킨 후, 트리메틸암모늄 벤잘데히드 트리플레이트 (DMSO 0.4 ml 중 1 mg)의 용액을 첨가하였다. 반응 용기를 밀봉하고, 90℃로 15 분 동안 가열하여 표지하였다. 한편, 화합물 3 (6 mg)을 5 분 동안 실온에서 TFA (200 ㎕) 중 5％ 물로 처리하였다. 그 후, 용매를 진공하에 제거하였다. 탈보호된 펩티드를 pH 4의 0.1M NH₄OAc 완충액 (0.4 ml)에 재용해하 고, 반응 용기에서 4-¹⁸F-플루오로벤잘데히드와 합하였다. 반응 용기를 밀봉하고, 70℃로 15 분 동안 가열하여 컨쥬게이션시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 생성물을 정제용 방사성 HPLC (컬럼 페노메넥스 루나 C18(2) 5 μm 10 x 100 mm, 용매: A = 물/0.1％ TFA 및 B = 아세토니트릴/0.1％ TFA; 기울기 5 분에 걸쳐서 15 내지 25％ B; 12 분 동안 25％ B; 10 분에 걸쳐서 25 내지 50％ B; 유속 4.0 ml/min, 210 및 254 nm에서 UV 검출)에 의해 수득하였다. 생성물 분획을 물 (10 ml)로 희석하고, 셉팩(SepPak) C18-플러스 카트리지 (EtOH 10 ml 및 H₂O 20 ml로 조건화함) 상에 로딩하였다. 화합물 4를 에탄올 (1 ml)에 용리시켰다. 에탄올을 진공하에 제거하고, 화합물 4를 PBS에서 제제화하였다.

방법 2

a) ¹⁸F-플루오로벤잘데히드의 방사성합성

¹⁸F-플루오라이드 (370 MBq 이하)를 크립토픽스 222 (아세토니트릴 0.5 ml 중 5 mg) 및 탄산칼륨 (물 중 0.1M 용액 50 ㎕)의 존재하에 N₂하에 110℃로 20 분 동안 가열함으로써 공비증류하여 건조시켰다. 상기 시간 동안 아세토니트릴 3 x 0.5 ml을 첨가하고 증발시켰다. 40℃ 미만으로 냉각시킨 후, 트리메틸암모늄 벤잘데히드 트리플레이트 (DMSO 0.4 ml 중 1 mg)의 용액을 첨가하였다. 반응 용기를 밀봉하고, 90℃로 15 분 동안 가열하여 표지하였다. 조 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물을 첨가하여 희석시켰다. 혼합물을 이온 교환 카트리지를 통해 순 서대로 통과시키고 (에탄올 (또는 아세토니트릴) 및 물로 예비조건화함), 아세토니트릴/물 혼합물에 용리시켰다. 용리액을 C18 셉팩을 이용하여 농축시키고, 플루오로벤잘데히드를 아세토니트릴에 용리시켰다.

b) 화합물 3 및 4-¹⁸F-플루오로벤잘데히드의 컨쥬게이션

화합물 3을 TFA 중 5％ 물로 5 분 동안 실온에서 처리하였다. 그 후, 용매를 진공하에 증발시켜 제거하였다. 펩티드를 pH 4의 0.1M NH₄OAc 완충액 (0.5 ml)에 재용해하고, 반응 용기에서 4-¹⁸F-플루오로벤잘데히드와 합하였다. 반응 용기를 밀봉하고, 70℃로 15 분 동안 가열하여 컨쥬게이션시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 생성물을 정제용 방사성 HPLC (방법 1에 기재됨) 또는 SPE에 의해 수득하였다.

생물학적 데이타

결합 연구

αvβ3 인테그린 수용체를 발현시키는 것으로 공지된 세포막 제조를 이용하여, 경쟁 리간드로서 ¹²⁵I-에키스타틴 및 F-19 표지된 펩티드를 사용하여 경쟁 결합 연구를 수행하였다. 프리즘™ 소프트웨어를 이용하여 결합 곡선을 얻고, K_i를 계산하였다.

화합물 4는 K_i 값이 10 nM이었다.

루이스 폐 종양에서의 생체분포

마우스 (수컷 C57BL/6, 약 25 g)의 안쪽 오른쪽 넓적다리에 루이스 폐 암종 (LLC) 세포 (0.1 mL, 1x10⁷ 세포/배지 mL)를 피하로 주입하였다. 동물을 종양 성장에 대하여 15 일까지 모니터링하였으며, 상기 시간은 모델 발달 중에 혈관형성의 최고 수준을 나타내는 시간을 선택하였다.

¹⁸F-화합물의 생체분포를 결정하기 위하여, 종양-함유 동물의 꼬리 정맥을 통해 정맥내 볼루스로 시험 제품 (0.1 mL, 5 내지 10 MBq/mL)을 주입하였다. 주입 후 여러 시간에서 동물을 안락사시켰다. 근육, 신장, 소변, 폐, 간, 위, 소장, 대장, 갑상선, 종양을 절제하고, 혈액 샘플을 취하였다. 절제된 조직 및 혈액 샘플의 중량을 측정하고, 계수하였다 (월락(Wallac) 오토매틱 감마 카운터 시스템). 시점 당 3 마리 이상의 동물을 연구하였다. 결과를 ％id 및 조직 그램 당 ％id로서 나타내었다.

하기 표 1은 마우스 루이스 폐 종양 모델에서의 화합물 4의 생체분포를 나타낸다. 시간에 따라 데이타를 요약하였다. 5개의 독립적 실험의 평균 데이타 (n>3)를 평균 (SD)으로서 나타내었다.

비교로서, 마우스 루이스 폐 종양 모델에서의 화합물 5의 생체분포를 하기 표 2에 나타낸다. 시간에 따라 데이타를 요약하였다. 5개의 독립적 실험의 평균 데이타 (n>3)를 평균 (SD)으로서 나타내었다.

화합물 4에서의 추가 PEG 잔기는 상당히 보다 유리한 생체내 특징을 제공한다. 구체적으로, 120 분 후 화합물 4에 대한 배경 조직, 예컨대 혈액, 근육, 폐 및 간에 존재하는 남은 활성은 실질적으로 화합물 5보다 낮다. 결과적으로, 종양:배경 비율은 상당히 우수하여 영상화를 가능하게 한다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 III의 화합물을 생성시키는 것을 포함하는 방사성불화 방법.

<화학식 I>

(상기 식에서, 벡터는 하기 단편

을 포함함)

<화학식 II>

(상기 식에서,

n은 0 내지 20의 정수이고,

m은 0 내지 10의 정수이고,

Y는 수소, C₁ _- ₆알킬 (예컨대, 메틸) 또는 페닐임)

<화학식 III>

(상기 식에서, m, n 및 Y는 화학식 II의 화합물에서 정의된 바와 같고, 벡터는 화학식 I의 화합물에서 정의된 바와 같음)
제1항에 있어서, 화학식 I 및 III에서의 벡터가 하기 화학식 A의 화합물인 방법.

<화학식 A>

상기 식에서, X⁷는 -NH₂ 또는

(여기서, a는 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 a는 1임)이다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 Ia의 화합물 인 방법.

<화학식 Ia>

상기 식에서, X⁷는 -NH₂ 또는

(여기서, a는 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 a는 1이고, b는 2 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 b는 3 내지 10의 정수이고, 가장 바람직하게는 b는 5임)이다.
제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 화합물.
제3항에 정의된 화학식 Ia의 화합물.
제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 III의 화합물 또는 그의 염.
하기 화학식 IIIa의 화합물 또는 그의 염.

<화학식 IIIa>

상기 식에서, X⁷는 -NH₂ 또는

(여기서, a는 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 a는 1이고, b는 2 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 b는 3 내지 10의 정수이고, 가장 바람직하게는 b는 5임)이다.
하기 화학식 III의 화합물.

<화학식 III>
유효량의 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 화합물 또는 그의 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 아쥬반트, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 방사성 제약 조성물.
의학, 특히 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 생체내 진단 또는 영상화, 예를 들어 PET에 의한 생체내 진단 또는 영상화에서 사용하기 위한, 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 화합물 또는 그의 염.
생체내 영상화, 적합하게는 PET에 의한, 바람직하게는 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 영상화 방법에서 사용하기 위한 방사성 제약을 인간 또는 동물 신체에 투여하고 상기 신체 중 적어도 일부의 영상을 생성시키는 것을 포함하는, 생체내 영상화, 적합하게는 PET에 의한, 바람직하게는 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 영상화 방법에서 사용하기 위한 방사성 제약의 제조를 위한, 제6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 방사성표지 컨쥬게이트 또는 그의 염의 용도.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 방사성 제약을 인간 또는 동물 신체에 예를 들어 혈관계로 투여하고, PET를 이용하여 상기 방사성 제약이 분포되는 상기 신체의 적어도 일부의 영상을 생성시키는 것을 포함하는, 혈관형성과 관련된 질병 또는 상태의 생체내 진단 또는 영상화 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 III 또는 IIIa의 화합물 또는 그의 염을 인간 또는 동물 신체에 투여하고, 세포 수용체에 의한 상기 화합물의 흡수를 검출하고, 임의로 바람직하게는 상기 투여 및 상기 검출을 반복적으로 수행하는 것을 포함하는, 암과 관련된 상태, 바람직하게는 혈관형성을 방지하는 약물에 의한 상기 신체의 치료 효과를 모니터링하는 방법.