MX2007003019A - Compuestos de diagnostico. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a conjugados de formula (III) o (IIIa), o una sal de los mismos, su uso como radiofarmaceuticos, procedimientos para su preparacion, e intermediarios sinteticos utilizados en dichos procedimientos.

Description

COMPUESTOS DE DIAGNOSTICO La presente invención se refiere a nuevos compuestos basados en péptido y su uso para imagenología diagnóstica usando tomografía de emisión de positrones (PET). De manera más específica, la invención se refiere al uso de tales compuestos basados en péptido como vectores enfocadores que se unen a receptores asociados con angiogénesis, en particular receptores de integrina, por ejemplo, el receptor de avß3 integrina. Tales compuestos pueden ser usados de esta manera para diagnóstico o terapia de, por ejemplo, enfermedades malignas, enfermedades del corazón, endometriosis, enfermedades relacionadas con inflamación, artritis reumatoide y sarcoma de Kaposi. Se refiere además a métodos y reactivos para la producción de tales compuestos basados en péptido. La aplicación de péptidos bioactivos radiomarcados para imagenología diagnóstica está ganando importancia en medicina nuclear. Las moléculas biológicamente activas que pueden interactuar de manera selectiva con tipos específicos de células son útiles para la entrega de radioactividad a tejidos objetivo. Por ejemplo, los péptidos radiomarcados tienen potencial significativo para la entrega de radionúclidos de tumores, infartos y tejidos infectados para imagenología diagnóstica y radioterapia. 18F, con su vida media de aproximadamente 1 1 0 minutos, es el núclido emisor de positrones de elección para muchos estudios de imagenología de receptor. Por lo tanto, los péptidos bioactivos 18F-marcados tienen gran potencial clínico debido a su utilidad en PET para detectar de manera cuantitativa y caracterizar una amplia variedad de enfermedades. Los nuevos vasos sanguíneos pueden ser formados mediante dos mecanismos diferentes: vasculogénesis o angiogénesis. La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos al ramificar a partir de vasos existentes. El estímulo primario para este proceso puede ser suministro inadecuado de nutrientes y oxígeno (hipoxia) a células en un tejido. Las células pueden responder al secretar los factores angiogénicos, de los cuales existen muchos; un ejemplo, el cual es frecuentemente referido, es factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Estos factores inician la secreción de enzimas proteolíticas que descomponen las proteínas de la membrana de base, así como inhibidores que limitan la acción de estas enzimas potencialmente dañinas. El otro efecto prominente de factores angiogénicos es provocar que las células endoteliales migren y se dividan. Las células endoteliales que están unidas a la membrana de base, la cual forma una lámina continua alrededor de los vasos sanguíneos en el lado contralumenoal, no experimenta mitosis. El efecto combinado de pérdida de unión y señales de los receptores para factores angiogénicos es provocar que las células endoteliales se muevan, multipliquen y rearreglen ellas mismas, y finalmente sinteticen una membrana de base alrededor de los nuevos vasos. La angiogénesis es prominente en el crecimiento y remodelado de tejidos, incluyendo curación de heridas y procesos inflamatorios. Los tumores deben iniciar la angiogénesis cuando alcanzan un tamaño milimétrico, con el fin de mantener su velocidad de crecimiento. La angiogénesis es acompañada por cambios característicos en células endoteliales y su ambiente. La superficie de estas células es remodelada en preparación para migración y las estructuras crípticas están expuestas, donde la membrana de base es degradada, además de la variedad de proteínas, las cuales están involucradas para efectuar y controlar la proteólisis. En el caso de tumores, la red resultante de vasos sanguíneos es usualmente desorganizada, con la formación de ensortijamientos agudos y también desviaciones arteriovenosas. La inhibición de la angiogénesis también es considerada como una estrategia prometedora para terapia antitumor. Las transformaciones que acompañan la angiogénesis también son muy prometedoras para diagnóstico, siendo un ejemplo una enfermedad maligna, pero el concepto también muestra una gran promesa en inflamación y una variedad de enfermedades relacionadas con inflamación, incluyendo arterosclerosis, siendo los macrófagos de lesiones ateroscleróticas tempranas fuentes potenciales de factores angiogénicos. Muchos ligandos involucrados en la adhesión celular contienen la secuencia de tripéptido arginina-glicina-ácido aspártico (TGD). La secuencia RGD parece actuar como un sitio de reconocimiento primario entre los ligandos que presentan esta secuencia y receptores en la superficie de células. Generalmente se cree que las interacciones secundarias entre el ligando y receptor intensifican la especificidad de la interacción. Estas interacciones secundarias pudieran tener lugar entre porciones del ligando y receptor que están inmediatamente adyacentes a la secuencia de RGD o en sitios que están distantes de la secuencia de RGD. El enfocado eficiente e imagenología de receptores de integrina asociados con la angiogénesis in vivo demanda, por lo tanto, un vector basado en RGD, de alta afinidad, selectivo, que sea químicamente fuerte y estable. Adicionalmente, la ruta de excreción es un factor importante cuando se diseñan agentes de imagenología, con el fin de reducir los problemas con el soporte. WO 03/006491 describe compuestos basados en péptido, los cuales enfocan receptores de integrina asociados con la angiogénesis. Sin embargo, existe la necesidad de que tales compuestos basados en péptido adicionales tengan utilidad para técnicas de imagenología diagnóstica, tal como, PET. La solicitud internacional copendiente PCT/GB2004/001 052 describe métodos adecuados para marcar vectores biológicamente activos con 18F. Pero todavía existe la necesidad de compuestos basados en péptido, los cuales puedan ser preparados de manera rápida y eficiente y todavía tengan actividad biológica deseable.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para radiofluoración que comprende la reacción de un compuesto de fórmula (I): ' vector I— O-NH, (I) en donde el vector comprende el fragmento: con un compuesto de fórmula (II): en donde: n es un entero de 0 a 20; m es un entero de 0 a 10; Y es hidrógeno, alquilo de C1-6 (tal como metilo), o fenilo para dar un compuesto de fórmula (M I): en donde m, n y Y son definidos como para el compuesto de fórmula (II) y el vector es como se define para el compuesto de fórmula (1). Esta reacción puede ser efectuada en un solvente adecuado, por ejemplo, en un amortiguador acuoso en el rango de pH 1 a 1 1 , de manera adecuada 2 a 1 1 , más convenientemente 2 a 6, y a una temperatura no extrema desde 5 hasta 1 00°C, de manera adecuada 20 hasta 70°C, de preferencia a temperatura ambiente. En un aspecto particular, el vector en la fórmula (l) o (lll) es de fórmula (A): en donde X7 es ya sea -NH2 o en donde a es un entero desde 1 hasta 10, de preferencia a es 1. El Enlazador que forma parte del vector en el compuesto de fórmula (l) es elegido para proporcionar buena farmacocinética in vivo, tal como características de excreción favorables en el conjugado resultante de fórmula (l l l). El uso de grupos enlazadores con diferentes lipofilicidades y o carga, puede cambiar significativamente la farmacocinética in vivo del péptido para adecuarse a la necesidad diagnóstica. Por ejemplo, donde es deseable para un conjugado de fórmula (I I I) eliminarse del cuerpo mediante excreción renal, se usa un enlazador hidrofílíco, y donde es deseable que la eliminación sea mediante excreción hepatobiliar, se usa un enlazador hidrofóbico. Se ha encontrado que los enlazadores que incluyen una porción de polietilenglicol retardan la eliminación en sangre, lo cual es deseable en algunos casos. El Enlazador que forma parte del vector en el compuesto de fórmula (I) es un grup hidrocarbilo de C1 -60, de manera adecuada un grupo hidrocarbilo de C1-30, incluyendo opcionalmente 1 a 30 heteroátomos, de manera adecuada 1 a 10 heteroátomos, tales como oxígeno o nitrógeno. Los grupos de Enlazador adecuados incluyen cadenas alquilo, alquenilo, alquinilo, anillos aromáticos, poliaromáticos y heteroaromáticos y polímeros comprendiendo unidades de etilenglicol, aminoácido o carbohidrato. De preferencia, el Enlazador que forma parte del vector en el compuesto de fórmula (I) comprende una subunidad de polietilenglicol, muy preferiblemente el Enlazador es de fórmula B: en donde b es un entero desde 2 hasta 20, y de preferencia 3 hasta 10, muy preferiblemente 5. El término "grupo hidrocarbilo" significa un substituyente orgánico que consiste de carbono e hidrógeno, tales grupos pueden incluir porciones saturadas, insaturadas o aromáticas. De acuerdo con esto, los compuestos preferidos de fórmula (I) son aquéllos de fórmula (la): en donde X7 es ya sea -NH2 o en donde a es un entero desde 1 hasta 10, de preferencia a es 1 y b es un entero desde 2 hasta 20 y es de preferencia 3 hasta 10, muy preferiblemente 5. Los compuestos preferidos de fórmula (11) son aquéllos donde m es 0, n es 0 y Y es hidrógeno. Los compuestos de fórmula (I) y (lll) pueden prepararse mediante métodos estándares de síntesis de péptido, por ejemplo, síntesis de péptido de fase sólida, por ejemplo, como se describe en Atherton, E. y Sheppard, R.C.; "Solid Phase Synthesis" (Síntesis de fase sólida); IRL Press; Oxford, 1989. La incorporación del grupo aminoxi en un compuesto de fórmula (I) puede lograrse mediante la formación de un enlace de amida estable formado por reacción de una función de amina de péptido con un ácido activado e introducido ya sea durante o siguiendo la síntesis de péptido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (I) y (la) como se define antes, teniendo uso como reactivos úitles para la producción de compuestos basados en péptido radiomarcados. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona conjugados radiomarcados de fórmula (ll l) o una sal de los mismos, como se define antes. Los compuestos preferidos de fórmula (lll) son aquéllos de fórmula (I lla): o una sal de los mismos, en donde X7 es ya sea -NH2 o en donde a es un entero desde 1 hasta 1 0, de preferencia a es 1 y b es un entero desde 2 hasta 20 y es de preferencia 3 hasta 10, muy preferiblemente 5. Un compuesto particularmente preferido de fórmula (lll) es: Sales adecuadas de los compuestos de fórmula (lll) y (Illa) incluyen sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, tales como aquéllas formadas a partir de ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, cítrico, tartárico, fosfórico, láctico, pirúvico, acético, trifluoroacético, succínico, oxálico, fumárico, maleico, oxalacético, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, bencenosulfónico e isoetiónicos. Los compuestos de fórmula (II) pueden prepararse a partir de los precursores correspondientes de fórmula (IV): o un derivado protegido de los mismos, en donde L es un grupo que sale de preferencia cuando m>1 , L es p-toluenosulfonato, trifluorometanosulfonato o metanosulfonato o un haluro, y cuando m es 0, L es sal de p-trialquil amonio o p-nitro, y Y, m y n son como se describe para el compuesto de fórmula (I I); por reacción con [18F]-fluoruro acuoso producido con ciclotrón, pre-activado adecuadamente mediante evaporación a partir de una base (por ejemplo, a partir de tetrabutilamonio o K2CO3/Kryptofix-222), en un solvente adecuado, tal como acetonitrilo, N,N-dimetilformamida o sulfóxido de dimetilo, normalmente a temperatura ambiente o a temperatura elevada por ejemplo hasta 140°C. La función de aldehido o cetona de compuestos de fórmula (II) también pueden ser generados rápidamente a partir de sus precursores protegidos, tales como acétales o cetales, mediante tratamiento de ácido simple, siguiendo la fluoración. Como se muestra en el ensayo de unión de competencia in vitro a continuación, los compuestos de fórmula (I) y (la) se unen a receptores asociados con angiogénesis. De esta manera, estos compuestos pueden ser útiles para tratamiento, diagnóstico in vivo e imagenología de enfermedades y condiciones asociadas con angiogénesis. El término "enfermedades y condiciones asociadas con angiogénesis" incluye aquellas enfermedades y condiciones referidas a continuación. También se hace referencia a este respecto a WO 98/47541 . Las enfermedades y condiciones asociadas con angiogénesis incluyen diferentes formas de cáncer y metástasis, por ejemplo, cáncer de pecho, piel, colorrectal, pancreático, de próstata, pulmón u ovario. Otras enfermedades y condiciones asociadas con la angiogénesis son inflamación (por ejemplo, inflamación crónica), aterosclerosis, artritis reumatoide y gingivitis. Enfermedades y condiciones adicionales asociadas con la angiogénesis son malformaciones arteriovenosas, astrocitomas, coriocarcinomas, glioblastomas, gliomas, hemangiomas (niñez, capilar), hepatomas, endometrio hiperplástico, miocardio isquémico, endometriosis, sarcoma de Kaposi, degeneración macular, melanoma, neuroblastomas, enfermedad de arteria periférica ocluyente, osteoartritis, psoriasis, retinopatía (diabética, proliferativa), escleroderma, seminomas y colitis ulcerativa. La presente invención también proporciona una composición radiofarmacéutica que comprende una cantidad efectiva (por ejemplo, una cantidad efectiva para usarse en imagenología de PET in vivo) de un compuesto de fórmula general (lll) o (I l la) o una sal del mismo, como se define antes; junto con uno o más auxiliares, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Una modalidad preferida de la invención se refiere a un compuesto de fórmula general (l l l) o (Illa) o una sal del mismo, como se define antes, para usarse en medicina, en particular en el diagnóstico in vivo o imagenología, por ejemplo, mediante PET, de una enfermedad o condición asociada con la angiogénesis. Los conjugados radiomarcados de fórmula (lll) o (Illa) pueden ser administrados a pacientes para imagenología de PET en cantidades suficientes para producir la señal deseada, dosificaciones de radionúclido normales de 0.01 a 100 mCi, de preferencia 0.1 a 50 mCi, muy preferiblemente 1 a 20 mCi, normalmente serán suficientes para 70 kg de peso corporal. Los conjugados radiomarcados de fórmula (lll) o (Illa) pueden ser formulados, por lo tanto, para administración usando portadores o excipientes fisiológicamente aceptables en una manera completamente dentro de la habilidad de la técnica. Por ejemplo, los compuestos, opcionalmente con la adición de excipientes farmacéuticamente aceptables, pueden suspenderse o disolverse en un medio acuoso, con la solución o suspensión resultante siendo esterilizada entonces. Visto desde un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un conjugado radiomarcado de fórmula (lll) o (Illa) o una sal del mismo como se define antes, para la fabricación de un radiofarmacéutico para usarse en un método de imagenología in vivo, de manera adecuada PET, y de preferencia para imagenología de una enfermedad o condición asociada con angiogénesis; que involucra la adminsitración de dicho radiofarmacéutico a un cuerpo humano o animal y generación de una imagen de al menos parte de dicho cuerpo. Visto desde todavía un aspecto adicional, la invención proporciona un método para diagnóstico o imagenología in vivo de una enfermedad o condición asociada con angiogénesis que involucra administrar un radiofarmacéutico a dicho cuerpo, por ejemplo, en el sistema vascular y generar una imagen de al menos una parte de dicho cuerpo a la cual se ha distribuido dicho radiofarmacéutico usando PET, en donde dicho radiofarmacéutico comprende un conjugado radiomarcado de fórmula (lll) o (Illa) o una sal del mismo. Visto desde un aspecto adicional, la invención proporciona un método para monitorear el efecto de tratamiento de un cuerpo humano o animal con un medicamento para combatir una condición asociada con cáncer, de preferencia angiogénesis, por ejemplo, un agente citotóxico, comprendiendo dicho método adminsitrar a dicho cuerpo un conjugado radiomarcado de fórmula (lll) o (Illa) o una sal del mismo y detectar la captación de dicho conjugado por receptores celulares, de preferencia receptores de células endoteliales y en particular receptores avß3, efectuándose dicha adminstración y detección de manera opcional pero preferible, repetidamente, por ejemplo, antes, durante y después del tratamiento con dicho medicamento. Todavía en otra modalidad de la presente invención, se proporciona un kit para la preparación de un rastreador radiofluorado comprendiendo un grupo protésico de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (I). En uso de los kits, el compuesto de fórmula (II) sería adicionado al compuesto de fórmula (I) respectivamente, el cual puede ser disuelto adecuadamente en amortiguador acuoso (pH 1 -1 1 ). Después de la reacción a una tmeperatura no extrema durante 1 a 70 minutos, el péptido marcado puede ser purificado, por ejemplo, mediante extracción de fase sólida (SPE) o cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) y recolectarse.

EJEMPLOS La invención es ilustrada a manera de ejemplos, en los cuales se usan las siguientes abreviaturas: HPLC: cromatografía líquida de alto rendimiento NMR: resonancia magnética nuclear TFA: ácido trifluoroacético h(s): hora(s) min(s): minuto(s) DMAP: 4-(dimetilamino)piridina THF: tetrahidrofurano DCM: diclorometano DMF: N,N-dimetilformam¡da TBAF: fluoruro de tetrabutilamonio MeOH: metanol TLC: cromatografía de capa fina TIS: triisopropilsilano DMSO: sulfóxido de dimetilo PBS: solución salina amortiguada con fosfato PyAOP: [hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1 -iloxitris(pirrolidino)fosfonio] Boc: t-butoxicarbonilo RT: temperatura ambiente Ejemplo 1 - Preparación de triflato de 4-trimetilamonio benzaldehído (compuesto 1 ) 1 Este compuesto fue sintetizado de acuerdo con el procedimiento descrito por Haka et al (J. Labelled Cpds.& Radiopharms 1989 27(7) 823) .

Ejemplo 2 - Preparación de precursor de péptido (Compuesto 3) El péptido, Compuesto 2, fue sintetizado usando la sítnesis de péptido estándar. (a) 1 , 17-diazido-3,6,9, 12-15-pentaoxaheptadecano Una solución de hexaetilenglicol seco (25 g, 88 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (22.3 g, 195 mmol) en THF seco (125 ml), se mantuvo bajo argón y se enfrió a 0°C en un baño de hielo/agua. Una solución de trietilamina (19.7 g, 195 mmol) en THF seco (25 ml) se adicionó en forma de gotas durante 45 min. Después de 1 h, el baño refrescante se removió y la reacción se agitó durante otras 4 h. El agua (55 ml) se adicionó entonces a la mezcla, seguido por carbonato ácido de sodio (5.3 g, a pH 8) y azida de sodio (12.7 g, 195 mmol). Se removió THF mediante destilación y la solución acuosa se sometió a reflujo druante 24 h (se formaron dos capas). La mezcla se enfrió, se adicionó éter (100 ml) y la fase acuosa se saturó con cloruro de sodio. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con éter (4 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 50 ml) y se secaron (MgSO4). La filtración y evaporación del solvente dieron 26 g (89%) de un aceite amarillo. El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. (b) 17-azido-3,6,9, 12, 15-pentaoxaheptadecanamina A una suspensión agitada vigorosamente de 1 , 17-diazido-3,6,9, 12, 15-pentaoxaheptadecano (25 g, 75 mmol) en 5% HCl (200 mi), se adicionó una solución de trifenilfosflna (19.2 g, 73 mmol) en éter (150 ml) durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 24 h adicionales. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 40 ml). La fase acuosa se enfrió en un baño de hielo/agua y el pH se ajustó a 12 mediante adición de hidróxido de potasio sólido. La fase acuosa se concentró y el producto se captó en diclorometano (150 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró dando 22 g (95%) de un aceite amarillo. El producto fue identificado mediante espectrometría de masa de electroatomización (ESI-MS) (MH+ calculado: 307.1 9; encontrado 307.4). El aceite crudo fue usado en el siguiente paso sin purificación adicional. (c) Acido 23-azido-5-oxo-6-aza-3,9, 12, 15, 18,21 -hexaoxatricosanoico A una solución de 17-azido-3,6,9, 12, 15~pentaoxaheptadecanamina (15 g, 50 mmol) en diclorometano (100 ml) se adicionó anhídrido diglicólico (Acros, 6.4 g, 55 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche. La reacción se monitoreó mediante análisis ESI-MS, y se adicionaron más reactivos para impulsar la reacción a terminación. La solución se concentró para dar un residuo amarillo, el cual se disolvió en agua (250 ml). El producto fue aislado a partir de la fase acuosa mediante extracción continua con diclorometano durante la noche. El secado y evaporación del solvente dieron un rendimiento de 18 g (85%). El producto fue caracterizado mediante análisis de ESI-MS (MH+ calculado: 423.20; encontrado 423.4). El producto fue usado en el siguiente paso sin purificación adicional. (d) Acido 23-amino-5-oxo-6-aza-3,9, 12,15, 18,21 -hexaoxatricosanoico Se disolvió ácido 23-azido-5-oxo-6-aza-3,9, 12, 15, 18,21 -hexaoxatricosanoico (9.0 g, 21 mmol) en agua (50 ml) y se redujo usando H2(g)-Pd/C (10%). La reacción se corrió hasta que el análisis de ESI-MS mostró una conversión completa al producto deseado (MH+ calculado: 397.2; encontrado 397.6). El producto crudo fue usado en el siguiente paso sin purificación adicional. (e) Acido (Boc-aminooxi)acetil-PEG(6)-diglicólico Una solución de diciclohexicarbodiimida (515 mg, 2.50 mmol) en dioxano (2.5 mi) se adicionó en forma de gotas a una solución de ácido (Boc-aminooxi)acético (477 mg, 2.50 mmol) y N-hidroxisuccinimida (287 mg, 2.50 mmol) en dioxano (2.5 mi). La reacción se agitó a RT durante 1 h y se filtró. El filtrado se transfirió a un recipiente de reacción conteniendo una solución de ácido 23-amino-5-oxo-6-aza-3,9, 12,15,1 8,21 -hexaoxatricosanoico (1 .0 g, 2.5 mmol) y N-metilmorfolina (278 µl, 2.50 mmol) en agua (5 ml). La mezcla se agitó a RT durante 30 min. El análisis de ESI-MS mostró conversión completa al producto deseado (MH+ calculado: 570.28; encontrado 570.6). El producto crudo fue purificado mediante HPLC preparatoria (columna: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21 .20 mm, detección: 214 nm, gradiente: 0-50% B durante 60 min, donde A = H2O/0.1 % TFA y B = acetonitrilo/0.1 % TFA, velocidad de flujo: 10 ml/min) dando 500 mg (38%) de producto puro. El producto se analizó mediante HPLC (columna: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) , 50 x 2.00 mm, detección: 214 nm, gradiente: 0-50% B durante 1 0 min, donde A = H2O/0.1 % TFA y B = acetonitrilo/0.1 % TFA, velocidad de flujo: 0.75 ml/min, Rt = 5.52 min). Se realizó confirmación adicional mediante análisis de NMR. (f) Conjugación de ácido (Boc-aminooxi)acetil-PEG(6)-diglicólico a Compuesto 2 Se disolvieron ácido (Boc-aminooxi)acetil-PEG(6)-diglicólico (0.15 mmol, 85 mg) y PyAOP (0.13 mmol, 68 mg) en DMF (2 ml). Se adicionó N-metilmorfolina (=.20 mmol, 20 µl) y la mezcla se agitó durante 10 min.

Una solución de Compuesto 2 (0.100 mmol, 126 mg) y N-metilmorfolina (0.20 mmol, 20 µl) en DMF (4 ml) se adicionó y la mezcla de reacción se agitó durante 25 min. Se agregó N-metilmorfolina adicional (0.20 mmol, 20 µl) y la mezcla se agitó durante otros 15 min. Se evaporó DMF a vacío y el producto se tomó en 10% acetonitrilo-agua y se purificó mediante HPLC preparatoria (columna: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21 .20 mm, detección: UV 214 nm, gradiente: 5-50% B durante 40 min, donde A = H2O/0.1 % TFA y B = acetonitrilo/0.1 % TFA, velocidad de flujo: 10 ml/min), dando 100 mg de producto semi-puro. Un segundo paso de purificación donde TFA fue reemplazado por HCOOH (gradiente: 0-30% B, lo demás mismas condiciones que antes), proporcionó 89 mg (50%). El producto se analizó mediante HPLC (columna: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, gradiente: 0-30% B durante 10 min, donde A = H2O/0.1 % HCOOH y B = acetonitrilo/0.1 % HCOOH, velocidad de flujo: 0.3 ml/min, Rt: 10.21 min). Se realizó caracterización de producto adicional usando ESI-MS (MH22+ calculado: 905.4, encontrado: 906.0) Ejemplo 3 - Ligado quimioselectivo de 18F-fluorobenzaldehído a Compuesto 3 para dar el Compuesto 4 La desprotección de péptido 3 fue realizada mediante la adición de TFA conteniendo 5% de agua a 10 mg de péptido. El péptido Boc-desprotegido (5.9 mg, 0.0044 mmol) en 1 ml de agua se adicionó a 4-fluoro benzaldehído (Compuesto 1 ) (1 .1 mg, 0.94 µl, 0.0989 mmol) en 1 ml de acetonitrilo. El pH de la mezcla fue 3.5. Después de 45 minutos a 70 grados, la mezcla se purificó mediante cromatografía preparatoria de fase inversa dos veces (columna Phenomenex Luna C18, 00G-4253-N0; solventes: A = agua + 0.1 % TFA / B = CH3CN + 0.1 % TFA, gradiente: 10-40% B durante 30 min; flujo 5.0 ml/minuto; detectado a 214 nm), dando 2.0 mg (32%) de compuesto puro (HPLC analítica: columna Phenomenex Luna C1 8, 00G-4252-E0; solventes: A = agua + 0.1 % TFA / B = CH3CN + 0.1 % TFA, gradiente: 10-50% B durante 20 min; flujo 1 .0 ml/minuto; tiempo de retención de 16.3 minutos, detectado a 214 y 254 nm). La caracterización adicional se realizó usando espectrometría de masa, dando valor m/z 1437.2. [M-H+].

Ejemplo 4: Radiosíntesis de 18F-compuesto 4 Método 1 18F-Fluoruro (hasta 370MBq) se secó azeotrópicamente en la presencia de Kryptofix 222 (5 mg en 0.5 ml de acetonitrilo) y carbonato de potasio (50 µl 0.1 M solución en agua) al calentar bajo N2 a 1 10°C durante 20 min. Durante este tiempo se adicionaron 3x0.5 ml de acetonitrilo y se evaporó. Después de enfriar a <40°C, se adicionó una solución de triflato de trimetilamonio benzaldehído (1 mg en 0.4 ml de DMSO). El recipiente de reacción se selló y calentó a 90°C durante 15 min para efectuar el marcado. Mientras tanto, el Compuesto 3 (6 mg) fue tratado con 5% de agua en TFA (200 µl) durante 5 min a RT. Los solventes fueron removidos entonces a vacío. El péptido desprotegido se redisolvió en amortiguador NH4OAc 0.1 M, pH4 (0.4 ml) y se combinó con 4-18F-fIuorobenzaldehído en el recipiente de reacción. El recipiente de reacción se selló y calentó a 70°C durante 15 min para efectuar la conjugación. Después de enfriar a temperatura ambiente, el producto fue obtenido mediante radio HPLC preparatoria (columna Phenomenex Luna C18(2) 5 µm 10 x 100 mm, solventes: A = agua/0.1 % TFA y B = acetonitrilo/0.1 % TFA; gradiente 15-25% B durante 5 min; 25%B durante 12 min; 25-50% B durante 10 min; flujo 4.0 ml/min, detección UV a 210 y 254 nm). La fracción de producto se diluyó con agua (1 0 ml) y se cargó sobre un cartucho SepPak C18-plus (acondicionado con 10 ml de EtOH y 20 ml de H2O). El Compuesto 4 fue levigado en etanol (1 ml). El etanol se removió a vacío y el compuesto 4 fue formulado en PBS.

Método 2 a) Radiosíntesis de 18F-fluorobenzaldehído 18F-fluoruro (hasta 370MBq) es secado azeotrópicamente en la presencia de Kryptofix 222 (5 mg en 0.5 ml de acetonitrilo) y carbonato de potasio (50 µl solución 0.1 M en agua) al calentar bajo N2 a 1 10°C durante 20 min. Durante este tiempo se adicionaron 3 x 0.5 ml y se evaporaron. Después de enfriar a <40°C, se adiciona una solución de triflato de trimetilamonio benzaldehído (1 mg en 0.4 ml de DMSO). El recipiente de reacción es sellado y calentado a 90°C durante 15 min para efectuar el marcado. La mezcla de reacción cruda es enfriada a temperatura ambiente y se diluyó mediante adición de agua. La mezcla se pasará secuencialmente a través de cartuchos de intercambio iónico (preacondicionados con etanol (o acetonitrilo) y agua) y se levigó en una mezcla de acetonitrilo/agua. El levigado será concentrado usando un C18 Seppak, y el fluorobenzaldehído será levigado en acetonitrilo. b) Conjugación de Compuesto 3 y 4-18F-fluorobenzaIdehído El Compuesto 3 es tratado con 5% de agua en TFA durante 5 min a temperatura ambiente. Los solventes son removidos entonces mediante evaporación bajo vacío. El péptido es redisuelto en amortiguador de NH4OAc 0.1 M, pH 4 (0.5 ml) y se combinó con 4-18F-fluorobenzaldehído en el recipiente de reacción. El recipiente de reacción es sellado y calentado a 70°C durante 15 min para efectuar la conjugación. Después de enfriar a temperatura ambiente, el producto es obtenido mediante radio HPLC preparatoria (como se describe para el método 1 ) o mediante SPE.

Datos biológicos Estudios de unión Usando preparaciones de membrana celular conocidas por expresar el receptor de avß3 integrina, se realizaron estudios de unión competetiva usando 1 5l-equistatina y los péptidos marcados con F-19 como ligando de competencia. Se obtuvieron curvas de unión y K,'s calculados usando programa de cómputo PrismM R.

El Compuesto 4, tuvo un valor de K¡ de 10 nM.

Biodistribución en tumores de pulmón de Lewis Se inyectaron sub-cutáneamente ratones (macho C57BL/6, ca. 25 g) en el muslo derecho interno con células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) (0.1 ml, 1 x107 células/ml en medio). Los animales fueron monitoreados por crecimiento de tumor durante hasta 15 días, con este tiempo seleccionado durante el desarrollo de modelo, ya que mostró el nivel más alto de angiogénesis. Para determinar la biodistribución de 18F-compuesto, se inyectaron animales portando tumores con el artículo de prueba (0.1 ml, 5-10 MBq/ml) como un bolo intravenoso vía la vena de la cola. En varios momentos post-inyección a los animales se les practicó la eutanasia. Se disecaron músculo, ríñones, orina, pulmón, hígado, estómago, intestino delgado, intestino grueso, tiroide, tumor y se tomó una muestra de sangre. Los tejidos disecados y muestra de sangre se pesaron y contaro (sistema de contador gamma automático de Wallac). Al menos tres anímale por punto en el tiempo fueron estudiados. Los resultados son expresados como% id y % id por gramo de tejido.

La Tabla 1 muestra la biodistribución de Compuesto 4 en el modelo de tumor de pulmón de Lewis de ratón. Datos resumidos contra tiempo. Datos promedio (n>3) de 5 experimentos independientes, presentados como promedio (SD).

Tabla 1 Como comparación, la biodistribución de Compuesto 5 en el modelo de tumor de pulmón de Lewis de ratón se muestra en la Tabla 2. Datos resumidos contra tiempo. Datos promedio (n>3) de 5 experimentos independientes, presentados como promedio (SD).

Tabla 2 La porción de PEG adicional en el Compuesto 4 imparte características in vivo significativamente más favorables. De manera específica, la actividad restante presente en tejidos de soporte, tales como, sangre, músculo, pulmón e hígado para el compuesto 4 después de 120 minutos, es substancialmente menor que para el compuesto 5. Subsecuentemente, las proporciones de tumopsoporte son significativamente mejores permitiendo así la imagenología.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la radiofluoración que comprende la reacción de un compuesto de fórmula (I): vector -0~NH„ (i) en donde el vector comprende el fragmento: con un compuesto de fórmula (II): en donde: n es un entero de 0 a 20; m es un entero de 0 a 10; Y es hidrógeno, alquilo de d-6 (tal como metilo), o fenilo para dar un compuesto de fórmula (lll): en donde m, n y Y son definidos como para el compuesto de fórmula (II) y el vector es como se define para el compuesto de fórmula (I).

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el vector en la fórmula (I) y (l ll) es de fórmula (A): en donde X7 es ya sea -NH2 o en donde a es un entero desde 1 hasta 10, de preferencia a es 1.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el compuesto de fórmula (I) es de fórmula (la): en donde X7 es ya sea -NH2 o en donde a es un entero desde 1 hasta 10; de preferencia a es 1 o b es un entero desde 2 hasta 20 y es de preferencia 3 hasta 10, muy preferiblemente 5.

4. Un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 o 2.

5. Un compuesto de fórmula (la) como se define en la reivindicación 3.

6. Un compuesto de fórmula (lll) o una sal del mismo como se define en la reivindicación 1 o 2.

7. Un compuesto de fórmula (I lla): o una sal del mismo, en donde X7 es ya sea -NH2 o en donde a es un entero desde 1 hasta 1 0, de preferencia a es 1 y b es un entero desde 2 hasta 20 y de preferencia es 3 hasta 1 0, muy preferiblemente 5.

8. Un compuesto de fórmula (ll l), la cual es:

9. Una composición radiofarmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula (lll) o (Illa) o una sal del mismo, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8; junto con uno o más auxiliares, excipientes o diluyentes farmcaéuticamente aceptables.

10. Un compuesto de fórmula (lll) o (Illa) o una sal del mismo, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para usarse en medicina, en particular en el diagnóstico o imagenología in vivo, por ejemplo, mediante PET, de una enfermedad o condición asociada con la angiogénesis. 1 1 . El uso de un conjugado radiomarcado de fórmula (lll) o (I lla) o una sal del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para la fabricación de un radiofarmacéutico para usarse en un método de imagenología ¡n vivo, de manera adecuada PET, y de preferencia para formar la imagen de una enfermedad o condición asociada con angiogénesis; que involucra la administración de dicho radiofarmacéutico a un cuerpo humano o animal y la generación de una imagen de al menos parte de dicho cuerpo. 12. Un método para el diagnóstico o imagenología in vivo de una enfermedad o condición asociada con angiogénesis, que involucra administrar un radiofarmacéutico a dicho cuerpo, por ejemplo, en el sistema vascular y generar una imagen de al menos una parte de dicho cuerpo al cual se ha distribuido dicho radiofarmacéutico usando PET, en donde dicho radiofarmacéutico comprende un compuesto de fórmula (l ll) o (I lla) o una sal del mimso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8. 13. Un método para monitorear el efecto de tratamiento de un cuerpo humano o animal con un medicamento para combatir una condición asociada con cáncer, de preferencia angiogénesis, comprendiendo dicho método administrar a dicho cuerpo un compuesto de fórmula (lll) o (Illa) o una sal del mismo, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y detectar la captación de dicho compuesto por receptores celulares, siendo efectuada dicha administración y detección de manera opcional pero preferible, en forma repetida.