KR20070053739A

KR20070053739A - 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성

Info

Publication number: KR20070053739A
Application number: KR1020077005378A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제이. 아담; 카라 엘. 피셔; 사이몬 알. 배일리; 크리스토퍼 오르비그
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2005-09-07
Publication date: 2007-05-25
Also published as: WO2006026855A1; AU2005282160A2; JP2008512360A; EP1797106A1; AU2005282160A1; CA2579355A1; US20060051291A1

Abstract

본 발명은 글루코사민과 같이 단순한 작용기를 갖는 당으로부터 향상된 방사 화학적 수율을 갖고 중성의 저분자량인 테크네튬-99m과 레늄-186으로 표지된 탄수화물 착화합물을 제조하거나 준비하는 방법을 제공한다. 특히 합성은 페로센 화합물을 레늄 또는 테크네늄 트리카르보닐 착화합물로 전환하기 위하여 싱글 리간드 트랜스퍼(SLT) 또는 더블 리간드 트랜스퍼(DLT) 반응에 의존한다. 페로센 화합물은 예를 들면, 티오, 아미노 그리고 알코올 작용기 등을 포함하는 다양한 작용기를 통해 당에 결합될 수 있으며, 이로써 물에 녹거나 혹은 비교적 물에 잘 녹지 않는 화합물을 포함하는 광범위한 방사성 동위원소로 표지된 당 착화합물을 제공한다.

Description

방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성{SYNTHESIS OF RADIOLABELED SUGAR METAL COMPLEXES}

본 발명은 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물(sugar metal complex)을 생산하는 방법과 그에 따라 생산된 방사성 동위원소로 표지된 물질에 관한 것이다.

핵의학 분야(nuclear medicine application)에서 방사성 동위원소로 표지된 탄수화물에 대한 관심이 점점 커져가고 있다. 이는 부분적으로 양전자 방출 단층촬영(Positron Emission tomography; PET)에서 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스(2-¹⁸F-fluoro-2-deoxy-glucose; FDG)의 영상제제(imaging agent)로서의 성공에 기인한다. 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스(FDG)의 성공은 부분적으로 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스가 심장의 상태와 종양 양자 모두를 영상화하는데 이용할 수 있다는 사실에 기인하며, 이는 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스(FDG)가 글루코오스 대사를 거치고 헥소키나제(hexokinase)에 대한 기질로 작용할 수 있기 때문이다. 이러한 성공은 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스(FDG)와 비슷한 성질 과 유용성을 가진 단일 광자 방출 글루코오스 유사물질을 단일광자 단층촬영(single-photon emission computed tomography :SPECT)에 사용할 수 있도록 개발할 수 있지 않을까 하는 의문을 일으켰다. 플루오르-18(¹⁸F)이 비교적 짧은 반감기(110분)를 가지기 때문에, 플루오르-18은 화학실험실이나 의학 시설의 경우, 가까운 거리에 가속기가 있어야 사용할 수 있는 한계가 있으며, 이로 인해 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스를 의학 분야에서 널리 사용하기에는 실용성이 떨어진다.

테크네튬-99m(^99mTc)은 단일광자 단층촬영(SPECT) 분야에서 가장 흔히 사용하는 동위원소로써, 널리 이용가능하며 상대적으로 저렴한 몰리브덴-99(⁹⁹Mo) 발생기로부터 ^99mTc-퍼테크네이트 나트륨(Na^99mTcO₄)의 형태로 생산된다. 주기율표의 제3 주기 전이금속으로 테크네튬 유사체인 레늄(Rhenium : Re)은 테크네튬과 비슷한 화학적 성질을 가지고 있으며 치료 핵의학에 적용 가능한 물리적 성질을 가진 방사성 동위원소를 방출하는 입자를 가지고 있다. 이런 이유 때문에, 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스의 생물학적 분포 및 유사한 레늄 화합물의 치료적 잠재성을 그대로 닮은 테크네튬-99m을 사용하는 단일광자 단층촬영(SPECT) 트레이서는 특히 유용할 수 있다. 테크네튬-99m이 영상 장치에 널리 사용됨에도 불구하고, 상기 동위원소가 시스템을 교란시킬 수 있는 킬레이트 또는 유기 금속 컨쥬게이트를 통해 분자에 부착되어야 하는 점에서 트레이서를 준비하는데 어려움이 있다.

테크네튬-99m과 같이 널리 이용가능한 동위원소를 기반으로 하는 단일광자 단층촬영(SPECT) 유사 장치들은 더 넓은 의학 사회에서 이러한 제재들이 이용될 수 있도록 하였다. 테크네튬(Tc)과 같은 족의 원소들 중에서 동위원소 레늄-186/188(^186/188Re)은 치료 전략을 개발하는데 있어서 유망하다. 치료적으로 유용한 β^-를 방출하는 방사성 원소의 경우, 반감기가 12시간 내지 5일인 것이 바람직하다. 또한, 1MeV β^-입자의 경우, 조직으로의 침투 깊이가 약 5mm정도이다. 만약 방사성 붕괴 가운데 일부가 100 내지 300keV의 감마 광자의 방출을 동반하면 방사성 원소의 행동을 감마 카메라를 사용하여 쉽게 추적할 수 있다.

신경학, 심장학 및 종양학에서 영상제제 및/또는 치료제제로 사용될 수 있는 개선된 특성을 지닌 방사성 금속과 탄수화물 유도체에 대한 상당한 관심과 개발의 필요성이 존재한다. 구체적으로, 당-페로세닐(sugar-ferrocenyl) 또는 당-킬레이트(sugar-chelate) 유도체의 형태로 테크네튬-99m과 레늄-186/188로 표지된 당을 합성할 수 있는 기술 개발에 대한 관심이 증대되고 있다.

최근에 단일광자 단층촬영(SPECT)으로 뇌 및 기타 기관들을 영상화하는데 사용될 수 있는 테크네튬-99m과 레늄-186/188로 표지된 유기 약품들, 예를 들어, 스테로이드, 트로판(tropane), 펩티드 등의 합성에 대한 여러 보고가 있어 왔다. 상당히 성공적인 성과로는 파킨슨병을 가진 환자를 영상 촬영하는데 사용될 수 있는 도파민 흡수 억제제인 ^99mTc-TRODTA의 생산을 들 수 있다. 상기 화합물은 동작 장애 를 연구하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET)의 영상제제로 사용되는 플루오르-18과 탄소-11(¹¹C)로 표지된 트로판 유사체에 대한 연구의 부수적인 생산물이다. 또한, 여러 센터의 연구자들은 도파민에 반응하는 시스템을 연구하기 위하여 트로판 양전자 방출 단층촬영 영상제제의 개발의 위해 수년 동안 노력해왔다. 상기 연구의 일환으로 테크네튬-99m의 유사체도 합성되었고, 이는 단일광자 단층촬영을 사용하는 더 넓은 의학 사회에서 상기와 같은 연구가 수행될 수 있도록 하였다. 놀랍게도, 상대적으로 고분자량의 금속 착화합물인 테크네튬-비스아미노에탄티올(Tc-(bis(aminoethanethiol)), Tc-BAT, C₄H₁₂N₂S₂OTc)이 트로판 유도체에 부착되는 경우에 약의 수용체 결합 능력이 파괴되지 않았다.

본 발명은 단순한 작용기를 가진 글루코사민(glucosamine)으로부터 합성되며, 향상된 방사 화학적 수율을 갖고 중성의 저분자량인 테크네튬-99m과 레늄-186이 표지된 탄수화물 착화합물을 제조하거나 준비하는 방법을 제공한다.

대표적인 결과물에 대한 분석은 0.1%의 트리플로로아세트산 수용액(용매 A)과 아세토니트릴(용매 B)로 이루어지는 용매를 사용하여 HPLC로 수행하였다. 시료들은 선형 기울기법(100%의 용매 A에서 100%의 용매 B)으로 분석하였다. 상기 HPLC의 분석 결과는 하기 도면에 반영하였다.

크롬-트리카르보닐(chromium-tricarbonyl) 잔기가 스테로이드의 방향족 고리에 결합되거나 또는 크롬-트리카르보닐 잔기가 사이클로펜타디에닐 크롬 트리카르보닐(cyclopentadienyl chromium tricarbonyl) 펜던트기(pendant group)의 형태로 17α위치에 결합하고 있는 β-에스트라디올(estradiol) 유도체의 레늄 카르보닐 착화합물은 에스트라디올 수용체에 대해 높은 친화도를 갖는 것으로 알려져 왔다. 테크네튬-99m으로 표지된 5-HT_1A 세로토닌(serotonine) 뇌 수용체 리간드는 테크네튬-트라카르보닐(technetium-tricarbonyl) 잔기를 5-HT_1A 세로토닌(serotonine) 뇌 수용체 리간드에 있는 중성의 두 자리 아민 리간드(N_^N') 부분에 킬레이트화를 통해 결합시켜 합성되어 왔다.

의약에서 테크네튬-99m의 다른 용도로는 더블 리간드 트랜스퍼(Double Ligand Transfer; DLT)(합성 Ⅰ) 또는 싱글 리간드 트랜스퍼(Single Ligand Transfer; SLT)(합성 Ⅱ 및 Ⅲ)를 달성하는 기술을 사용하여 사이클로펜타디에닐트리카르보닐-[^99mTc]-트로판 컨쥬게이트(cyclopentadienyltricarbonyl-[^99mTc]-tropane conjugate)를 표지하는 것을 들 수 있다. 아래에 예시한 바와 같이, 이들은 페로센(ferrocene) 화합물을 레늄- 또는 테크네튬-트리카르보닐 착화합물로 전환하여 제조된다. 방사성이 있는 레늄 또는 테크네튬의 유일하게 이용 가능한 화학적 형태는 퍼테크네이트(TcO₄ ^-) 또는 퍼레네이트(ReO₄ ^-)이기 때문에 다수의 레늄과 테크네튬 방사성 약제들은 5가의 산화 상태를 갖는 금속과의 무기 착화합물들이다. 상기 더 블

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

리간드 트랜스퍼(DLT)와 싱글 리간드 트랜스퍼(SLT) 반응은 이들 동위원소들의 퍼레네이트와 퍼테크네이트로부터 (사이클로펜타디에닐)트리카르보닐-테크네튬((cyclopentadienyl)tricarbonyl-technetium)과 (사이클로펜타디에닐)트리카르보닐-레늄((cyclopentadienyl)tricarbonyl-rhenium)의 유기금속 방사성 약제를 형성할 수 있는 가능성을 열었다. 상기 더블 리간드 트랜스퍼 반응의 격한 반응 조건 때문에 테크네튬 또는 레늄을 가지는 당-싸이클로펜타디에닐(Cp) 착화합물의 합성은 주로 하기에 도시된 간접적인 반응(합성 Ⅳ)에 의해 더 많은 성공을 거두었다.

Ⅳ

상기 합성 Ⅳ에서 M은 레늄 또는 테크네튬이다.

그러나 싱글 리간드 트랜스퍼 반응을 적용함으로써, 하기에 예시된 것처럼, 이소링크 보라노카보네이트 키트(ISOLINK boranocarbonate kit)를 사용하여 테크네튬의 당 금속 싸이클로펜타디에닐(Cp) 유도체를 50 내지 70%의 방사 화학적 수율로 합성하는 것이 가능해졌다.

V

페로센은 그것의 하나 또는 두 개의 사이클로펜타디에닐(cyclopentadienyl) 고리에 다양한 작용기를 가진 형태로 합성될 수 있다. 결과적으로, 예를 들면 하기에 예시된 12개의 컨쥬게이트들을 포함하는 페로세닐-당 컨쥬게이트가 성공적으로 제조될 수 있다. 상기 페로세닐-당 컨쥬게이트는 싱글 리간드 트랜스퍼 반응의 중요한 가능성을 제공한다.

이 때 페로센은 당에 존재하는 티오(thio), 아미노(amino) 및/또는 알코올(alcohol) 작용기를 통해 당에 결합할 수 있다. 당이 충분히 보호되면, 유기물질에 녹는 페로센 유도체를 생산할 수 있고, 당이 보호되지 않으면 물에 녹는 컨쥬게이트를 생산할 수 있다.

금속 킬레이트를 통한 테크네튬-당과 레늄-당

쉬프 베이스(Schiff base) 착화합물에 기초한 수많은 당-금속 착화합물은 글루코사민으로부터 살리실알데하이드(salicylaldehyde) 또는 3-알데하이도-살리실 산(3-aldehydo-salicylic acid)을 사용하여 합성할 수 있다. 이들 리간드를 사용하면, 금속으로 구리(Cu), 아연(Zn) 또는 코발트(Co) 등을 사용하여 수많은 금속 착화합물을 형성할 수 있다. 그런 착화합물의 일반적인 예를 하기에서 보여준다. 하기 예에서 M은 금속을 나타낸다.

최근의 연구는 두 자리 리간드 시스템과 세 자리 리간드 시스템과 배위결합하는 fac-[^99mTc/Re-(CO)₃]+ 잔기의 적용을 통해 탄수화물이 테크네튬-99m과 레늄 동위원소로 표지화될 수 있다는 것을 입증하였다.

우리의 접근은 후속 반응에서 글루코오스에 방사성 동위원소인 테크네튬-99m 또는 레늄-186/188와 결합할 수 있는 펜던트 킬레이트 리간드를 결합시키는 것이다. 다른 방법으로는, 금속-킬레이트를 먼저 형성하고 나중에 이를 글루코오스에 결합시킬 수 있다. 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스의 성질과 유사하도록 하기 위해서, 글루코오스 분자의 성질에 대한 트레이서 그룹의 효과를 최소화하는 것이 필수적이다. 테크네튬-99m으로 표지화된 글루코오스 유도체의 존재는 상기 글루코오스 유도체가 이온이거나 또는 상대적으로 큰 분자량(예를 들면, 두개의 글루코오스 잔기)을 가지기 때문에 이 기준을 만족시키지 못한다. 다양한 낮은 원자가의 fac-{M(CO)₃} 코어(M=^99mTc^Ⅰ 또는 ¹⁸⁶Re^Ⅰ)는 이런 노력의 일환으로 사용되었다. 면이성질체 구조로 배위 결합한 카르보닐 리간드는 +1가의 산화 상태인 테크네튬을 안정화시키며, 이는 다른 중간 산화 상태의 테크네튬과 레늄을 안정화하는데 요구되는 복잡하고 종종 거대 고리 형태의 다자배위 리간드 구조의 형성을 미연에 방지한다. 단순한 질소(N) 또는 산소(O) 공여자(donor)를 갖는 중성 착화합물에서, fac-{M(CO)₃}의 코어는 생체 시스템에서 이점이 되는 지방 친화성을 가진다.

글루코사민 즉, 2-아미노-2-디옥시-D-글루코오스(2-amino-2-deoxy-D- glucose)는 아민이 잠재적인 배위결합 자리로 작용하는 동시에 다른 작용기의 결합(functionlization)을 위한 유용한 타깃으로 작용할 수 있기 때문에 글루코오실(glucosyl) 리간드를 위한 아주 좋은 기본뼈대(scaffold)이다. 또한, 문헌에는 N-작용기의 글루코사민이 글루코오스 전달자(glucose transporter: GLUT)와 헥소키나제에 대해 활성을 나타낸다는 것을 제안하는 많은 증거들이 있다. 상기 헥소키나제는 작용기가 아주 클 때에도 2-¹⁸F-플루오로-2-디옥시-글루코오스(FDG) 대사와 가장 밀접하게 관련이 있는 효소이다.

모든 용매와 화학품(Fisher, Aldrich)은 시약급(reagent grade)이고 특별한 경우가 아니라면 더 이상의 정제 없이 사용하였다. HL¹과 [NEt₄]₂[Re(CO)₃ ^-Br₃]는 이미 알려진 방법에 따라 제조하였다.

¹H와 ¹³CNMR 스펙트럼은 각각 400.132와 100.623MHz에서 브루커 AV-400(Bruker AV-400) 장비로 기록하였다. 준비된 화합물에 대한 표시된 케미칼 쉬프트(chemical shift)는 하기 표 1에 기록한다.

[표 1] HL²와 [(L²)Re(CO)₃]의 α-아노머(Anomer)들에 대한 ¹H 과 ¹³C{¹H} NMR 데이터(DMSO-d ₆ )(δppm)

	¹H NMR(δ, ppm)			¹³C{¹H} NMR(δ, ppm)
	HL²	[(L²)Re(CO)₃]	δ_착화합물-δ_리간드	HL²	[(L²)Re(CO)₃]	δ_착화합물-δ_리간드
C-1	5.11	5.22	0.11	90.4	87.5	-2.9
C-2	2.34	2.37	0.03	61.3	58.0	-3.3
C-3	3.52	3.66	0.14	72.4	79.8	7.4
C-4	3.06	3.20	0.14	71.0	70.6	-0.4
C-5	3.39	3.43	0.04	72.4	71.8	-0.6
C-6	3.4,3.6	3.4,3.6		61.5	59.8	-1.7
C-7	3.80	3.85,4.30		48.7	51.1	2.4
C-8				124.8	119.4	-5.4
C-9				157.5	163.2	5.7
C-10	6.7	6.35	-0.35	119.6	120.3	0.7
C-11	7.05	6.80	-0.25	128.9	129.1	0.2
C-12	6.7	6.45	-0.25	116.1	114.1	-2.0
C-13	7.05	6.95	-0.10	129.6	130.6	1.0

매스 스펙트럼(+ 이온)은 마크로매스 LCT(전자분사 이온화(electrospray ionization, ESI))를 사용하여 희석된 메탄올 용액에서 얻었다. 원소 분석은 카를로 에르바(Carlo Erba) 분석기기를 사용하여 브리티쉬 콜롬비아 화학부에서 수행하였다. HPLC 분석은 K02501 흡수 검출기, Kapintek사의 방사 분석 웰 카운터와 250 × 4mm의 면적을 갖는 Synergi 4㎛ C-18 Hydro-PR 분석 컬럼이 장착된 Knauer 사의 Wellchrom K-1001 HPLC로 수행하였다. HPLC 용매는 0.1%의 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid) 수용액(용매 A)과 아세토니크릴(acetonitrile)(용매 B)로 구성되었다. 샘플을 선형기울기법(linear gradient method)으로 30분에 걸쳐 용매 A 100%에서 용매 B 100%로 조절하면서 분석하였다. HPLC의 결과를 도면에 도시하였다.

N-(2'-하이드록시벤질)-2-아미노-2-디옥시-D-글루코오스(N-(2'-Hydroxylbenzyl)-2-amino-2-deoxy-D-glucose)(HL ² )의 합성

N-(2'-하이드록시벤질)-2-아미노-2-디옥시-D-글루코오스(HL²)는 하기의 방법에 의해 합성하였다. HL¹(1.00g, 3.53mmol)을 메탄올(60mL)에 용해시키고 10 중량%의 Pd/C(50mg)를 용액에 첨가하여 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 반응 혼합물을 가압된 수소 분위기(50 bar)하에서 24시간 동안 교반하고 나서 여과하여 정화하였다. 용매를 증발시켜 하기에 도시된 것과 같이 HL²(0.98g, 98%)를 수득하였다. ESI- MS:286([M+H]+). C₁₃H₁₉NO₆ㆍH₂O에 대해 계산된 분석값은 C, 51.48; H, 6.98 및 N, 4.62이며, 결정된 분석값은 각각 C, 51.50; H, 6.81 및 N, 4.60로 나타났으며 계산된 분석값과 거의 일치하였다.

트리카르보닐(N-2'-하이드록시벤질)-2-아미노-2-디옥시-D-글루코오스)레늄(Ⅰ)(tricarbonyl(N-2'-hydroxybenzyl)-2-amino-2-deoxy-D-glucose)rhenium(Ⅰ))(ReL ² (CO) ₃ )의 합성

하기에 도시된 트리카르보닐(N-2'-하이드록시벤질)-2-아미노-2-디옥시-D-글루코오스) 레늄(Ⅰ)(ReL²(CO)₃)은 [NEt₄]₂[Re(CO)₃Br₃](200mg, 0.26mmol), HL²(74mg, 0.26mmol)와 소듐 아세테이트 트리하이드레이트(sodium acetate trihydrate)(40mg, 0.32mmol)를 물(7mL)에 용해시키고 50℃에서 2시간 동안 교반하여 제조하였다. 그 후 용매를 진공 하에서 제거하고 잔여물을 디클로로메탄(CH₂Cl₂)(10mL)에 30분 동안 용해시켰다. 계속하여, 용매를 이동시켜 갈색 잔여물을 회수하였다. 이것을 컬럼 크로마토그래피(실리카, 5:1 CH₂Cl₂:CH₃OH)에 의하여 오프-화이트 파우더(58mg, 0.01mmol, 40%)로 정화하였다. ESI-MS: 556, 554([M+H]+), 578, 576([M+Na]+). C₁₆H₁₈NO₉ReㆍH₂O에 대해 계산된 값은 C, 33.57; H, 3.52 및 N, 2.45이고, 결정된 분석값은 각각 C, 33.55; H, 3.53 및 N, 2.75로 나타났으며, 계산된 분석값과 거의 일치하였다.

[(L²)Re(CO)₃]

방사선 표지화

Mallinckrodt사의 보라노카보네이트(boranocarbonate)키트인 "Isolink"를 사용하여 Na[^99mTcO₄](1mL, 100MBq)의 식염수 용액으로부터 [^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺를 준비하였다. 증가된 비활성과 레늄의 낮은 산화력 때문에 [¹⁸⁶Re(CO)₃(H₂O)₃]⁺는 테크네튬의 준비에 사용된 키트를 사용하여 얻을 수 없었다. Na[¹⁸⁶ReO₄](0.5mL, 100MBq)의 식염수 용액에 85%의 인산(H₃PO₄) 4.5㎕를 첨가하고 10분 동안 CO로 플러쉬(flush) 된 보론 암모니아(borane ammonia) 착화합물 3mg에 이 용액을 첨가하여 [¹⁸⁶Re(CO)₃(H₂O)₃]⁺를 준비하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 15분 동안 가열하고 상온으로 냉각하였다. 표지화는 상기 최종 용액 중의 하나의 시료(0.5mL)를 1mM 농도의 HL²가 포함된 PBS(pH7.4, 1mL)와 혼합하고 75℃에서 30분 동안 유지시켜(incubating) 달성하였다.

안정화 평가

[(L²)^99mTc(CO)₃(H₂O)](100㎕, 10MBq, 1mM의 HL²)을 PBS 중의 1mM의 히스티딘 또는 PBS 중의 1mM의 시스테인 900㎕에 첨가하였다. 상기 용액을 37℃로 유지시킨 후, 1시간, 4시간 및 24시간 때에 시료들을 채취하여 HPLC 분석을 하였다. 히스티딘 표지화는 [^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺를 포함하는 용액을 PBS 중의 1mM의 히스티딘 용액(pH7.4, 1mL)에 첨가하고 75℃에서 30 분간 유지시켜 달성하였다. HPLC 분석으로 하나의 방사성 동위원소로 표지된 산물이 형성된 것을 확인하였다.

글루코사민을 살리실알데하이드 HL¹과 중합시켜 형성한 쉬프 베이스(Schiff base)를 ^99mTc(Ⅴ)을 포함하는 전이 금속에 대한 리간드로써 미리 조사하였다. [M(CO)₃(H₂O)₃]+(상기에서 M은 ^99mTc 또는 ¹⁸⁶Re)에 대한 "냉각된" 대체물로 시작 물질 [NEt₄]₂[Re(CO)_3-Br₃]를 사용하여 착화합물 [L¹Re(CO)₃)](ESIMS(+)에서 관찰된 것과 같음)을 합성하였다. 그러나 상기 이민(imine)과 상기 착화합물은 가수분해에 대해 불안정하고 수용성 표지 화학의 경우에는 적당하지 않다고 입증되었다. 가수분해 문제를 피하기 위하여, 우리는 HL¹을 가수분해에 대해 저항성이 더 강한 아민 페놀 HL²(N-(2'-하이드록시벤질)-2-아미노-2-디옥시-D-글루코오스, 계획1)로 환원시켰다. HL¹의 촉매 수소화를 통하여 후속적인 방사선 표지 연구에 대하여 충분한 순도를 갖는 HL²가 98%의 수율로 수득되었다. [NEt₄]₂[Re(CO)₃Br₃] 및 NaOAc와 HL²의 물에서의 반응과 컬럼 크로마토그래피를 이용한 정제로 화합물 [(L²)(Re)(CO)₃]가 40%의 수율로 생산되었다. 분자 이온은 ESIMS에 의해 [((L²)Re(CO)₃)+H]⁺인 것으로 확인되었고 벌크 샘플(bulk sample)의 형성은 원소 분석에 의해 확인하였다. ¹H NMR 스펙트럼(CD₃OD)으로 관찰한 아노메릭 비율(α/β)은 HL²에 대한 1.9에서 착화합물에 대한 1.1로 변화를 보였으며, 이는 착화합물화가 두 아노머 사이의 열역학적 안정성에 있어서의 차이를 감소시킴을 의미한다.

용해도 추론을 위하여 상세한 NMR 분석을 수행하였으며, 표 1에 나타낸 바와 같이 DMSO-d ₆ 용액을 이용하여 수행하였다. 상기 착화합물의 ¹H NMR 스펙트럼(DMSO-d ₆ )은 매우 변형되는데, HL²의 NMR 스페트럼과 비교할 시, 방향족 레조넌스(aromatic resonance)를 벗어난 쉬프트(shift)와 브로드닝(broadening)은 바라던 대로 페놀 "암(arm)"이 {Re^Ⅰ(CO)₃} 잔기와의 결합에 참여했다는 것을 나타낸다. 각 아노머에 대해 메틴(methine)기의 양성자 시그널이 더블렛(doublet)으로의 갈라지는 것(splitting)은 메틴기에 있는 양성자가 착화합물의 형성에 있어 동일하지 않다는 것을 의미한다. 리간드 N과 O 주게(doner) 원자의 결합은 부분이성질체의 화학적 환경에 있는 두 양성자를 강하게 묶어 고리에 메틴기를 결합시킨다. HL²의 C1 양성자들에 의한 시그널과 비교 시 두 아노머에서 모두 당의 C1 양성자들에 의한 시그널은 다운필드(downfield)로 쉬프트 되었다. 당의 C2 양성자들에 의한 피크는 모두 잘 분석되고 HL²의 C2 양성자들에 의한 피크와 비교하면 또한 두 아노머에서 다소 다운필드로 쉬프트되었다. 스펙트럼에서 작은 이질적인 피크는 다른 부수적인 종이 적어도 하나 존재한다는 것을 나타낸다.

착화합물의 샘플을 하루 밤 동안 CD₃OD 또는 DMSO-d ₆ 에 두었을 때, 착화합물의 샘플은 갈색이 되고 피크들의 상대적인 강도도 증가하는데 이는 이들이 분해 산물로부터 발생한다는 것을 나타낸다. 상기 시그널은 착화합물화 되지 않은 HL²의 쉬 프트와 관련이 없다. 부수적인 종들은 착화합물의 HPLC에서 자외선 /광학분광기에 의해 분석되고, 이들은 시간이 지남에 따라 더 중요해진다. 착화합물의 ¹³C {¹H}NMR 스펙트럼은 α-아노머에 대해서는 전부 확인되었고, β- 아노머에 대해서는 부분적으로 확인되었다(표 1에 나타낸 것과 같음).

레늄 카르보닐들은 대칭성의 부족에서 예상할 수 있는 바와 같이 196 내지 198ppm에서 세 개의 예리한 레조넌스(resonance)를 보여준다. 두 아노머에서 페놀의 CO와 CH₂ 링커로 인한 피크는 HL²의 피크값에서 다운필드로 명백하게 이동되는데 이는 레늄이 페놀의 O와 글루코사민의 N 둘 다에 결합되었다는 것을 나타낸다.

두 아노머에서 C1과 C2 시그널은 착화합물에서 업필드(upfield)로 쉬프트되는데, 이는 아마도 헥소오즈 구조에서 분자 배치(conformational)의 변화를 반영하는 것이다. 이것의 결과로 α-아노머는 불안정화 될 수 있고 따라서 HL²의 아노머의 비율과 비교하면 아노머의 비율이 변한다. α-아노머에서 C3 시그널은 다운필드로 7.74ppm만큼 쉬프트하는데 이는 글루코사민의 C3 하이드록시가 예상된 용매 분자의 위치에서 중심의 레늄과 결합하고 있다는 것을 나타낸다. 불행하게도 β-아노머에 대한 C3는 확인되지 않는데 이는 DMSO 용액에서 아노머의 낮은 농도 때문이다.

DMSO가 물 또는 메탄올보다 덜 극성이기 때문에, DMSO는 일반적으로 β-아노머에 존재하는 불안정한 쌍극자 모멘트(dipole moment)를 안정화시킬 수 없다. C1 입체구조는 레늄과 배위결합하는 C3 하이드록시의 구조 의존적인 성향에 거의 영향 을 주지 않으며 따라서 두 아노머는 유사한 세자리 리간드 결합 방법으로 레늄과 결합 할 것으로 예상된다. HL²의 [^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺와 [¹⁸⁶Re(CO)_3-(H₂O)₃]⁺로 표지화는 HPLC에 의해 측정된 것처럼 각각 95± 2%와 94± 3%의 평균 방사 화학적 수율로 달성된다(도 1에 도시된 바와 같이). 표준화된"냉각된"레늄 착화합물(t_R=17.9분)을 가지는 방사성 동위원소로 표지된 산물을 동시 투입하여 방사성 동위원소로 표지된 착화합물이 [(L²)^99mTc(CO)₃](t_R=17.9분)과 [(L²)¹⁸⁶Re(CO)₃](t_R=18.2분)인 것을 확인하였다.

^99mTc 착화합물의 생체 안정성의 가능성에 대한 예비 평가인 시스테인/히스티딘 챌린지 실험(challenge experiment)을 수행하였다. 전형적인 테스트에서 방사성 동위원소로 표지된 착화합물을 1mM의 시스테인 또는 1mM의 히스티딘을 포함하는 37℃의 인산 완충 수용액(pH 7.4)에서 유지하고, 시료를 1시간, 4시간과 24시간인 때에 채취하였다(하기의 표 2에 나타난 것과 같이). HPLC 분석은 상기 착화합물이 4시간째의 시료가 오직 30% 미만이 변하지 않은 채로 남아있어 히스티딘 또는 시스테인 용액에서 오직 짧은 시간동안만 안정하다는 것을 보여주었다. [^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺ 표지된 히스티딘은 히스티딘 챌린지 실험의 주요 분해 산물인 것으로 나타났다.

[표 2] 1mM의 시스테인 또는 1mM의 히스티딘에서 1시간, 4시간 및 24시간 동 안 유지된 후에 남아있는 [(L²)⁹⁹ ^mTc(CO)₃]의 백분율

	남아있는 [(L ²)^99mTc(CO)₃]의 백분율(%)
	1시간	4시간	24시간
시스테인에서 유지	88	28	검출안됨
히스티딘에서 유지	50	24	4

착화합물의 불안정성은 특히, 2차 아미노기와 탄수화물의 하이드록시기와 같은 주게 원자(donor atom)의 상대적으로 약한 결합 능력으로 인한 것일 수 있다. 착화합물의 안정성을 증가시키기 위한 변형을 고려하였을 때, 우연한 세 자리 결합으로부터 세 자리 리간드와 연성의 {M(CO)₃} 중심에 대한 더 높은 친화도를 가진 결합 그룹을 포함하는 리간드를 조사하게 되었다.

상기의 불안정성의 문제를 다루기 위해서, 글루코사민-디피코릴아민(glucosamine-dipicolylamine) 컨쥬게이트가 하기에 예시된 바와 같이 개발되었다(합성Ⅵ).

VI

이 디피코릴아민 유도체는 하기에 예시된 바와 같이 테크네튬-99m과 레늄- 186과 안정한 착화합물을 형성하였다.

24시간 이후에 시스테인 히스티딘 챌린지 실험을 수행하였을 때 실제로 이들 화합물에 변화가 없었으며, 이는 이들 착화합물이 굉장히 안정하다는 것을 나타낸다. 다른 길이의 스페이서 암(spacer arm)을 가지는 다른 세 자리 결합 탄수화물 리간드를 또한 하기 도들에서 볼 수 있는 것과 같이 개발되었다.

링커의 합성

n = 1-10

a : R¹= R²=Bn

b : R¹=H; R²=Fmoc

c : R¹=H; R²=Boc

반응조건 : (i)벤즈알데하이드, NaBH(OAc)₃, DCE 또는 Fmoc-Cl, NaHCO₃, 디옥산(dioxane) 또는 Boc₂O, Et₃N, DCM; (ii)SO₃-피리딘 착화합물, Et₃N, DMSO 또는 데스-마틴 퍼요오디난(Dess-Martine periodinane), DCM

n = 1-10

a : R¹=R²=Bn

b : R¹=H; R²=Fmoc

c : R¹=H; R²=Boc

반응조건: 벤즈알데하이드, NaBH(OAc)₃, DCE 또는 Fmoc-Cl, NaHCO₃, 디옥산 또는 Boc₂O, Et₃N, DCM

당 전구체의 합성

반응조건 : (i)3a/3b/3c, NaBH(OAc)₃, MeOH; (ii)H₂, Pd(OH)₂, EtOH 또는 TFA, DCM 또는 피페리딘, DMF; (iii)5a/5b/5c, DCC, HOBT, DMF

리간드의 합성

반응조건 : (i)2-피리딘카르복시알데하이드(2-pyridinecarboxaldehyde)/1-벤질-2-이미다졸카르복시알데하이드(1-benzyl-2-imidazolecarboxaldehyde)/1-메틸-2-이미다졸-카르복시알데하이드/이미다졸카르복시알데하이드/살리실알데하이드(salicylaldehyde)/ 17/18/19/20, NaBH(OAc)₃, MeOH; (ii)2-피리딘-카르복시알데하이드/1-벤질-2-이미다졸카르복시알데하이드/1-메틸-2-이미다졸-카르복시알데하이드/이미다졸-2-카르복시알데하이드/살리실알데하이드/ 17/18/19/20/3b-1, NaBH(OAc)₃, MeOH 또는 BrCH₂CO₂Et, Na₂CO₃, CH₃CN; (iii)a. KOH, H₂O; b. 피페리딘, 3b-1 유도체에 대한 DMF

3b-1

17 18 9 20

	R ³	R ⁴		R ³	R ⁴
11a/ 12a
11b/ 12b
11c/ 12c
11d/ 12d
11e/ 12e
11f/ 12f
11g/ 12g
11h/ 12h
11i/ 12i
13a/ 14a			15a/ 16a
13b/ 14b			15b/ 16b
13c/ 14c			15c/ 16c
13d/ 14d			15d/ 16d
13e/ 14e			15e/ 16e
13f/ 14f			15f/ 16f
13g/ 14g			15g/ 16g
13h/ 14h			15h/ 16h
13i/ 14i			15i/ 16i
13j/ 14j			15j/ 16j
13k/ 14k			15k/ 16k
13l/ 14l			15l/ 16l
13m/ 14m			15m/ 16m
13n/ 14n			15n/ 16n
13o/ 14o			15o/ 16o
13p/ 14p			15p/ 16p
13q/ 14q			15q/ 16q
13r/ 14r			15r/ 16r
13s/ 14s			15s/ 16s
13t/ 14t			15t/ 16t
13u/ 14u			15u/ 16u
13v/ 14v			15v/ 16v
13w/ 14w			15w/ 16w
13x/ 14x			15x/ 16x
13y/ 14y			15y/ 16y
13z/ 14z			15z/ 16z
13 aa / 14 aa			15 aa / 16 aa
13 ab / 14 ab			15 ab / 16 ab
13 ac / 14 ac			15 ac / 16 ac
13 ad / 14 ad			15 ad / 16 ad
1 ae / 14 ae			15 ae / 16 ae
13 af / 14 af			15 af / 16 af
13 ag / 14 ag			15 ag / 16 ag
13 ah / 14 ah			15 ah / 16 ah
13 ai / 14 ai			15 ai / 16 ai
13 aj / 14 aj			15 aj / 15 aj
13 ak / 14 ak			15 ak / 16 ak
13 al / 14 al			15 al / 16 al
13 am / 14 am			15 am / 16 am
13 an / 14 an			15 an / 16 an
13 ao / 14 ao			15 ao / 16 ao
13 ap / 14 ap			15 ap / 15 ap
13 aq / 14 aq			15 aq / 16 aq
13 ar / 14 ar			15 ar / 16 ar
13 as / 14 as			15 as / 16 as
13 at / 14 at			15 at / 16 at
13 au / 14 au			15 au / 16 au
13 av / 14 av			15 av / 16 av
13 aw / 14 aw			15 aw / 16 aw
13 ax / 14 ax			15 ax / 16 ax
13 ay / 14 ay			15 ay / 16 ay
13 az / 14 az			15 az / 16 az
13 ba / 14 ba			15 ba / 16 ba

물질: 모든 용매와 반응물은 정제 없이 그대로 사용했다. 1에서 n=1-5, 7 및 8 ; 2b에서 n=1, 2 및 5; 2c에서 n=1-5; 4에서 n=0-7, 9 및 10; 5b/5c에서 n=2-7 및 10이고 상업적으로 이용가능(Acros, Aldrich, TCI, Fluka). 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 3c 형태의 화합물들은 White, J.D.와 Hasen, J.D.의 논문 Org. Chem, 2005, 70의 1963-1967에 설명되어 있는 대로 준비하였고, 5a는 Breitenmoser, R.A와 Heimgartner, H.의 논문 Helv.Chim.Acta 2001, 84의 786-796에 설명된 대로 제조하였다. 상기 참조 문헌의 내용은 본 발명에 포함된다. 다양한 알려진 화합물 6(Silva, 1999), 17(Lim, 2005), 18과 20은 Chang, C.J.등의 Inorg. Chem.(2004), 43, 6744-6799 및 Chang, C.J.과 Jaworski, J. 등의 Proc.Natl. Acad. Sci.(2004) 101, 1129-1134에 따라 제조되었고 19는 Nolan, E 등의 J. Inorg. Chem(2004), 43, 2624-2635에 설명된 대로 제조하였다. 물론 본 분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 화합물 및 이와 관련된 화합물을 생산하기 위한 추가적인 합성 및/또는 준비 기술을 개발할 수 있을 것이다.

2a를 제조하는 일반적인 과정

1, 2-디클로로에탄(1, 2-dichloroethane)에 포함된 에탄올아민(ethanlamine)에 벤즈알데하이드를 첨가하고 N₂하의 주위온도에서 교반하였다. 이후, 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride)를 첨가하고 반응물을 일정 시간 동안 교반하였다. 탄산나트륨(Na₂CO₃) 수용액을 첨가하여 반응을 멈춘 후, 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 반응물을 분획하고 수용액 부분을 추출하였다. 결합된 유기 추출물은 브라인(brine)으로 세척하고 황산마그네슘(MgSO₄)으로 건조시켰다. 결과물인 용액을 회전증발(rotary evaporation)로 건조시키고 2a를 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 수득하였다.

2b를 제조하는 일반적인 과정

에탄올아민(ethanolamine)과 탄산수소나트륨(NaHCO₃)을 포함하는 1,4-디옥산(1,4-dioxane)의 용액에 Fmoc-Cl을 첨가하고 N₂하의 주위온도에서 교반하였다. 반응물을 일정시간동안 교반한 후 생성된 고체는 거르고, 여과액을 회전증발로 건조시켰다. 2b를 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 수득하였다.

2c를 제조하는 일반적인 과정

에탄올아민과 트리에틸아민(Et₃N)을 포함하는 디클로로메탄 용액에 Fmoc-Cl를 첨가하고 N₂하의 주위온도에서 교반하였다. 반응물을 일정시간 동안 교반하고 회전증발로 건조시켰다. 생성된 오일(oil)을 디클로로메탄에 녹이고 수용성의 탄산나트륨 브라인으로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매는 감압하에서 제거하고 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 2c를 수득하였다.

7을 제조하는 일반적인 과정

정제된(freebased) 1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-디옥시-글루코사민 6(1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-glucosamine 6)(탄산나트륨 수용액에 6HCl을 용해시키고 디클로로메탄으로 추출한 후 건조시켜서 제조됨)에 금방 제조된 3a를 첨가한다. 제조된 용액을 N₂하의 주위온도에서 교반하고 NaBH(OAc)₃를 첨가하였다. 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 완결하고 제조된 혼합물을 분획하였다. 수용액 부분을 디클로로메탄으로 더 추출하였다. 결합되어 있는 유기물을 브라인으로 세척하고 황산마그네슘으로 건조하였다. 회전 증발 후 컬럼 크로마토그래피로 순수한 7a를 수득하였다.

9를 제조하는 일반적인 과정

아르곤(Ar) 하에서 5a를 포함하는 디클로로메탄의 차가운 용액에 DCC를 첨가하고 DMF에 포함된 HOBT를 첨가하였다. 일정시간 동안 낮은 온도를 유지한 후에, 염형태가 아닌 1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-디옥시-글루코사민 6을 첨가하였다. 그리고 나서 반응물을 상온으로 가열하고 추가적인 시간동안 교반하였다. 부산물인 고체는 거르고 여과액은 감압하에서 농축한 후 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 9a를 수득하였다.

7a/9a로부터 8/10을 제조하는 일반적인 방법

7a가 포함된 메탄올 용액에 Pd(OH)₂를 첨가하였다. 1기압하에서 H₂로 환원하였다. 반응 혼합물을 메탄올로 미리 세척한 셀라이트(celite) 패드를 통해 여과하고 용매를 회전 증발시켜 8을 수득하였다.

7b/9b로부터 8/10을 제조하는 일반적인 방법

7b를 디클로로메탄에 용해시키고 TFA를 첨가하였다. 생성된 용액을 N₂ 하의 주위 온도에서 일정시간동안 교반하였다. 용액을 회전 증발로 건조시키고 잔여물을 디클로로메탄에 녹인 후, 수용성의 탄산수소나트륨의 브라인으로 세척하고 황산마그네슘을 사용하여 건조시켰다. 용매를 증발시키고 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 8을 수득하였다.

7c/9c로부터 8/10을 제조하는 일반적인 방법

7c를 DMF에 용해시키고 피페리딘(piperidine)을 첨가하였다. 생성된 용액을 N₂하의 주위 온도에서 짧은 시간동안 교반하고 회전 증발로 건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 순수한 8을 수득하였다.

8/10으로부터 11/12를 제조하는 일반적인 방법

8a가 포함된 1,2-디클로로에탄 용액에 2-피리딘카르복시알데하이드(2- pyridinecarboxaldehyde)를 첨가하였다. 생성된 용액을 N₂하의 주위온도에서 짧은 시간동안 교반하고 NaBH(OAc)₃를 첨가하였다. 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 완결하였다. 수용액 부분은 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 결합된 추출물들을 브라인으로 세척하고 황산마그네슘을 사용하여 건조시켰다. 회전 증발로 컬럼 크로마토그래피로 분리될 정제되지 않은 11a를 수득하였다.

11/12로부터 13/14를 제조하는 일반적인 방법

11a가 포함된 1,2-디클로로에탄 용액에 살리실알데하이드를 첨가하였다. 생성된 용액을 N₂하의 주위 온도에서 짧은 시간 동안 교반하고 NaBH(OAc)₃를 첨가하였다. 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 완결하였다. 수용액 부분은 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 결합된 추출물들을 브라인으로 세척하고 황산마그네슘을 사용하여 건조시켰다. 용매를 회전 증발로 제거하여 컬럼 크로마토그래피로 분리되어질 정제되지 않은 13e를 수득하였다.

13/14로부터 15/16을 제조하는 일반적인 방법

13e가 포함된 메탄올 용액에 1M의 수산화칼륨(KOH)을 첨가하였다. 생성된 용액을 주위 온도에서 일정시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1M의 염산으로 중화하고 감압하에서 건조시켰다. 잔여물을 물에 녹이고 REXYN(H)를 통과시켰다. 용매를 증발시켜 15e를 수득하였다.

종합하면, 중성의 저분자량이며 테크네튬-99m와 레늄-186으로 표지화된 탄수화물 착화합물을 단순한 작용기의 글루코사민으로부터 높은 방사 화학적 수율로 생산하였다. HL²는 구리-62/62(^62/64Cu)와 갈륨-67/68(^67/68Ga)에 대한 리간드로써 시험중이고 테크네튬-99m와 레늄-186/188에 대한 다른 탄수화물을 포함하는 리간드가 연구 중이다.

많은 참조 문헌은 본 출원이 우선권을 주장하는 가출원에서 확인되었다. 화합물을 합성하는데 있어 통상의 지식을 가진 자들의 공로인 합성, 분리 및 특징적인 과정에 관한 지식에 있어서, 본 발명은 본 분야의 통상의 지식을 가진 자들이 충분히 발명을 실시할 수 있을 정도로 개시하고 있음에도 불구하고, 각각의 참조 문헌들은 본 발명에 전적으로 포함된다. 본 발명을 실시하는데 있어 필수적으로 여겨지는 열거된 참조 문헌에 개시된 어떤 물질도 통상의 기술의 수준에서 진보되지 않은 정도에서 새로운 물질의 도입 없이 본 출원에 포함된다.

Claims

당(sugar) 전구체를 합성하는 단계;

킬레이트 리간드(chelating ligand)를 합성하는 단계;

상기 당 전구체와 상기 킬레이트 리간드를 반응시켜 당-금속 착화합물(sugar-metal complex)을 형성하는 단계; 및

상기 당-금속 착화합물을 방사성 동위원소로 표지(labeling)하여 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물을 얻는 단계를 포함하는 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성 방법.
제1항에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 테크네튬-99m(^99mTc) 또는 레늄(Re) 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성 방법.
제1항에 있어서, 상기 당-금속 착화합물은 두 자리 배위(bidentate) 또는 세 자리 배위(tridentate) 리간드 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성 방법.
제1항에 있어서, 상기 킬레이트 리간드는 철(Fe)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성 방법.
제1항에 있어서, 상기 킬레이트 리간드는 페로센(ferrocene)인 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성 방법.
제1항에 있어서, 상기 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물은 물에 녹는 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성 방법.
제1항에 있어서, 상기 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물은 물에 녹지 않는 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소로 표지된 당-금속 착화합물의 합성 방법.