KR20070041605A - ＣｐＧ 함량을 변화시키는 것에 의해 유전자 발현을조절하는 방법 - Google Patents

ＣｐＧ 함량을 변화시키는 것에 의해 유전자 발현을조절하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070041605A
KR20070041605A KR1020077004967A KR20077004967A KR20070041605A KR 20070041605 A KR20070041605 A KR 20070041605A KR 1020077004967 A KR1020077004967 A KR 1020077004967A KR 20077004967 A KR20077004967 A KR 20077004967A KR 20070041605 A KR20070041605 A KR 20070041605A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
thr
nucleic acid
ser
val
Prior art date
Application number
KR1020077004967A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101222628B1 (ko
Inventor
프랑크 노트카
마르쿠스 그라프
도리스 라이캄
랄프 바그너
다비드 라브
Original Assignee
게네아르트 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35839637&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20070041605(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE200410037652 external-priority patent/DE102004037652B4/de
Priority claimed from DE102004037611A external-priority patent/DE102004037611B4/de
Application filed by 게네아르트 아게 filed Critical 게네아르트 아게
Publication of KR20070041605A publication Critical patent/KR20070041605A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101222628B1 publication Critical patent/KR101222628B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)
  • Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)
  • Control Of Electric Motors In General (AREA)

Abstract

본 발명은 CpG 디뉴클레오티드의 표적화된 삽입 또는 제거에 의한 방향성 발현 조절을 위한 핵산 변형에 관한 것이다. 본 발명은 또한 변형된 핵산 및 발현 벡터에 관한 것이다.
CpG 디뉴클레오티드, CpG 섬, 유전자 발현 조절, 표적화된 조절

Description

ＣｐＧ 함량을 변화시키는 것에 의해 유전자 발현을 조절하는 방법{Method for modulating gene expression by modifying the CpG content}
본 발명은 천연 유전자 및 합성 유전자 또는 기타 코딩 서열로부터 유래되고, 원래의 서열(original sequence)에 비해 코딩 영역에 감소되거나 또는 증가된 수의 CpG 디뉴틀레오티드를 갖는 변형된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현을 연구하고, 증가시키거나 또는 감소시키기 위하여, 특정한 경우에, 생체 분자(biomolecule)의 생산, DNA 백신 또는 유전자 치료법 작제물(gene therapy construct)의 효율 및 형질전환 동물 또는 식물의 질을 개선하기 위해 이용될 수 있다.
펩티드, 단백질 또는 RNA 분자 형태의 생체 분자의 제공은 생물공학 및 약학 분야에서 중요한 구성 요소이다. 재조합 기술에 의해 생산되거나 또는 생체 내에서 발현되는 단백질 및 RNA는 기본적인 메카니즘 및 관계를 연구하기 위해 이용되고, 또한 생물공학용 시약의 생산, 형질전환 동물 또는 식물의 생산, 또는 치료제 및 백신의 개발에서의 의학적 응용에서 이용된다. 응용 분야에 따라, 해당하는 분자의 발현 수준이 조절될 수 있어야 한다.
대부분의 경우에, 표준 생산 수준을 초과하는 증가가 바람직하다. 각 발현 시스템 또는 벡터는 한계를 가지며, 이것이 실제 생산량을 결정한다. 본 발명은 진 핵 세포에서 임의의 유전자의 발현을 조절할 수 있는 방법 및 응용에 관한 것이다. 특히, 달성가능한 유전자 발현이 현재까지 공지된 발현을 증가시키는 방법으로 달성될 수 있는 수준을 초과하므로, 본 발명은 임의의 유전자를 조절하기에 적합하다.
CpG 디뉴클레오티드는 진핵생물의 게놈에서 중요한 위치를 차지한다. 그들은 다른 디뉴클레오티드처럼 무작위로 분포되지 않고, 대신에 게놈의 넓은 범위(stretch)에 걸쳐 저빈도로 나타난다(under-represent). 또한, 이 영역들에서 CpG 디뉴클레오티드는 일반적으로 메틸화된다.
이에 대한 예외는 훨씬 높은 빈도의 CpG 디뉴클레오티드를 가지는 영역이며, 이 때문에 CpG 섬(CpG island)라 부른다. 이 CpG 섬의 특징적인 성질 및 CpG 디뉴클레오티드에 대한 추가적인 차이점은 그 섬에 있는 CpG 디뉴클레오티드는 일반적으로 메틸화된 형태로 존재하지 않는다는 점이다.
CpG 디뉴클레오티드의 과소 출현(under-representation)은 해당하는 뉴클레오티드의 화학적 변형에 의해 설명된다. 척추동물의 게놈에서, CpG 디뉴클레오티드의 시토신의 약 60-90%는 메틸화된 형태로 존재하고 이 메틸화된 시토신은 종종 탈아민화(deamination)에 의해 티민으로 변형된다(Shen et al., 1994). 이 과정의 결과, 시토신 및 구아노신의 빈도는 예상되는 통계적 분포보다 낮고, 약 40%이며, CpG 디뉴클레오티드의 비율은 예상되는 빈도의 약 20%에 불과하다(Bird, 1980; Sved et al., 1990; Takai et al., 2002).
CpG 섬은 CpG 디뉴클레오티드의 이와 같은 특수한 분포에 대한 예외를 형성한다(Antequera et al., 1993). CpG 섬은 주로 프로모터에 근접하여 위치하며, 전사된 영역으로 신장되거나 또는 심지어 엑손 내에 존재할 수 있다.
그들은 평균적인 유전자 영역에 비해 약 10배 더 높은 CpG 디뉴클레오티드 빈도(약 60-70% C+G 함량)를 특징으로 하고, 특히 그들은 일반적으로 비-메틸화된 CpG를 포함한다는 사실을 특징으로 한다(Wise et al., 1999). 모든 인간 유전자의 약 60%, 특히, 모든 항존(housekeeping) 유전자 및 약 50%의 조직-특이적 유전자가 CpG 섬과 관련된다(Antequera et al., 1993; Larson et al., 1992). CpG 섬은 특히, Gardiner-Garden M.& Frommer M(1997) J. Mol. Bio. 196, 261-282 및 Takai D. & Jones P.A. (2002) PNAS 99, 3740-3745에 기재되고, 정의되었다. 종래 기술에 다양한 정의들이 존재하기 때문에, 본 발명의 목적을 위해, CpG 섬은 하기와 같이 정의된다: CpG 섬은 55% 이상의 CpG 함량 및 0.65 이상의 (실제 CpG/예상 CpG) 비율을 갖는 500개 이상의 연속적인 염기쌍의 서열을 포함하고, 이는 프로모터와 연관된다(프로모터와 완전히 또는 부분적으로 중첩됨).
이와 같은 CpG 디뉴클레오티드의 특수한 분포 및 변형, 즉, i) 한편으로는, 과소 출현 및 메틸화되고, ii) 다른 한편으로는, 섬에서 집중되고 비메틸화된 분포 및 변형은 유전자 발현의 조절에서 중요한 제어 기능을 갖는다(도 1에 개략적으로 예시됨).
CpG 디뉴클레오티드는 세포 분화, 유전적 각인(genetic imprinting) 및 기타 진행과 관련하여, 초기 발생 단계에 유전자 발현의 조절에 관여된다. 다수의 연구 들이 진핵생물에서, 5'CpG3' 디뉴클레오티드의 메틸화(mCpG)가 척추동물 및 꽃 식물에서 유전자 발현에 대한 억제 효과를 갖는다는 것을 보여주었다(Hsieh, 1994; Kudo, 1998; Jones et al., 1998; Deng et al., 2001; Hisano et al., 2003 Li et al., 2004)(도 1A).
또한, 종양 연구에서, i) 특정 유전자, 종종 억제 유전자의 발현의 중단(switching off)이 CpG의 과메틸화(hypermethylation)에 의해 유발되나(Li et al., 2004; Kang et al., 2004; Ivanova et al., 2004; Wu et al., 2003), 또한 ii) 다른 유전자의 제어되지 않은 발현이 저메틸화(hypomethylation)와 관련된 것이라는 것을 입증하는 다수의 데이터가 있다(Akiyama et al., 2003; Yoshida et al., 2003).
메틸화에 의한 유전자 중단(gene switching off) 과정은 최종적으로 크로마틴 구조의 변화를 가져와서, 전사-약화 상태(transcription-weak state)를 형성하는 일련의 연결된 사건들(cascade of events)에 의해 설명된다. 유전자 내에서 5'-CpG-3'의 메틸화는 메틸화된 DNA 서열에 결합하고 동시에 히스톤 디아세틸라아제(MBD-HDAC) 및 전사 억제 단백질(transcriptioinal redresser protein)과 결합하는 단백질 복합체(주로, MeCP(메틸-CpG-결합 단백질) 및 MBD(메틸-CpG-결합 도메인 단백질) 단백질 패밀리로부터 유래됨)에 대한 잠재적인 결합 부위를 생성한다(Jones et al., 1998; Nan et al., 1998; Hendrich et al., 1998). 이 복합체들은 일반적으로 크로마틴의 재구성(restructuring)을 포함하며, 이는 전사 활성의 중단을 초래한다(Wade et al., 1999). 프로모터 영역에서의 메틸화는 또한 도입된 메틸기 때문에 필수적인 전사 인자들의 결합을 방해하는 것에 의해 직접적으로 유전자 발현의 중단을 가져올 수 있다(Deng et al., 2001).
전술된 종양 세포에서의 발현의 탈조절화(deregulation)는 일반적으로 전술된 CpG 섬에서의 메틸화 상태의 변화와 관련된다. 정상적인 세포에서, 활발하게 발현되는 유전자들은 주로 CpG 섬과 연관되며, 이들은 전혀 메틸화되지 않거나 또는 미미하게 메틸화된다(도 1B). 이 섬들에서 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화는 이 유전자들(종종, 종양 억제 유전자 또는 세포 주기 조절자 유전자)의 발현의 중단을 초래하고(도 1C), 그 결과, 이 세포들의 제어되지 않는 증식을 가져온다. 반대로, CpG 섬에서의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 때문에 불활성인 유전자는 탈메틸화에 의해 활성화된다.
전술된 CpG 섬에서의 탈메틸화는 크로마틴 구조의 변화를 통해, 메틸화의 경우 유전자 중단에 유사한 전사-활성 상태를 초래한다. 구조적 변화 외에, 활성자 단백질 때문에, 발현의 활성화도 있을 수 있다. 인간 CpG 결합 단백질(hCGBP)은 그와 같은 세포 활성자 단백질(cellular activator protein)이다. HCGBP는 프로모터의 영역에 있는 비-메틸화된 CpG 디뉴클레오티드에 특이적으로 결합하며, 이 경우, 전사촉진제(transactivator)로서, 전사의 증가를 가져온다(Voo et al., 2000).
현재까지 유전자 내에서 CpG 서열의 메틸화는 전사를 하향조절한다는 지식이 과-발현되거나 또는 그 발현이 바람직하지 않은 유전자의 발현을 메틸화에 의해 방지하기 위해 이용되었다(Choi et al., 2004; Yao et al., 2003)(도 1A 참조).
이 지식의 또 다른 응용은 유전자 발현을 개선하기 위한 그와 같은 CpG 디뉴 클레오티드의 표적화된 제거이다(Chevalier-Mariette et al., 2003). 메틸화의 제거 및 그와 관련된 효과 때문에, 크로마틴 구조의 전사-불활성 상태로의 변화가 마찬가지로 방지된다(도 1D). 동 문헌에서, 생식선 세포(germ line cell) 및 그로부터 형성된 형질전환 마우스의 배에서, CpG 섬에 위치한 프로모터와 작동적으로 결합된 다양한 CpG 디뉴클레오티드 함량을 갖는 형질전환 유전자의 발현이 조사되었다. 이 특정한 경우에, 그렇지 않았다면 배 발생 동안 기존의 CpG 디뉴클레오티드의 신생(de novo) 메틸화(도 1D, 고 CpG 함량 형질변환 유전자)에 의해 예상되는 리포터 유전자의 전사 중단은 CpG 디뉴클레오티드의 제거에 의해 방지되었다(도 1D, CpG 불포함 형질전환 유전자). Chevalier-Mariette에 의한 문헌에서 그 메카니즘의 보다 상세한 연구는 유전자 발현의 방지는 유전자 내부(intragenic)의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 및 특히, 뒤이은 프로모터-연관 CpG 섬의 메틸화와 관련된다는 것을 보여주었다(도 1D, 고 CpG 함량 형질전환 유전자). 이와 같은 유전자 내 CpG 디뉴클레오티드를 갖지 않고 효율적으로 발현되지 않았던 리포터 유전자의 경우, CpG 섬은 메틸화되지 않았다는 것이 입증되었다(도 1D, CpG 불포함 형질전환 유전자). 저자들은 따라서 지속적인 생체 내 발현을 위해, CpG 디뉴클레오티드 함량은 프로모터 및 CpG 섬의 바로 인접한 부위에서 감소되어야 하는 것으로 결론내렸다.
유전자 발현의 증가는 마찬가지로 상응하는 벡터 작제물에서 프로모터의 완전한 CpG 섬 5'의 삽입(integration)에 의해 달성될 수 있다(WO 02081677)(도 1B 참조). hCGBP의 확인에서, CpG 디뉴클레오티드는 마찬가지로 리포터 유전자의 상응 하는 프로모터 영역으로 통합되고 리포터 활성의 증가가 확인되었다. 이와 같은 일시적인 세포 배양 테스트에서, 그러나, hCGBP는 마찬가지로 과-발현되었고 따라서 비-생리적(non-physiological)으로 상승된 농도로 존재했다(Voo et al., 2000).
C/G 함량이 mRNA 안정성에 영향을 미친다는 것이 이미 알려져 있다. 따라서, 예를 들면, Duan 및 Antezana(2003)는 CHO 세포에서 인간 유전자의 세 개의 상이한 변형의 발현은 결과적으로 mRNA 농도의 차이를 가져온다는 것을 보여주었다. 제1 변형에서, 인간 유전자 서열은 C/G 디뉴클레오티드의 수가 최대화되도록 변형되었다. 반면에, 제2 변형에서는 T/A 디뉴클레오티드의 수가 최대화되었다. 정상-상태(steady-state) 수준, 즉, mRNA의 양의 차이가 실험적으로 mRNA의 분해(breakdown)의 차이에서 기인하는 것일 수 있었다. 증가된 C/G 함량를 갖는 이차 구조의 안정화 때문에, 해당하는 mRNA는 야생형보다 덜 강하게 분해되고, 대응되게 T/A-고함량 mRNA는 야생형보다 훨씬 더 높은 정도로 분해되었다. 분석은 단백질 수준에서 수행되지 않았고, 또한 CpG 디뉴클레오티드의 증가 때문에 단백질 생산의 증가는 예상되지 않았고, 이는 mRNA의 이차 구조의 안정화가 해석(translation)에 부정적으로 영향을 미치기 때문이다.
Deml 등은 포유동물 세포에서 코돈-최적화된 발현을 위한 HIV-I Gag 유전자의 서열을 개시한다. CpG 디뉴클레오티드의 구체적 증가는 개시되지 않는다.
본 발명의 목적은 적어도 부분적으로 종래 기술의 단점들을 방지하는 유전자 발현의 표적화된 조절(targeted modulation) 방법을 제공하는 것이다.
이 목적은 하기의 단계들을 포함하는 유전자 발현의 표적화된 조절 방법에 의해 달성된다:
i. 발현될 표적 핵산 서열을 제공하는 단계.
ii. 유전자 발현을 증가시키기 위해 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)을 이용하여 상기 표적 핵산 서열에 존재하는 CpG 디뉴클레오티드의 수가 증가되거나, 또는 유전자 발현을 감소시키기 위해 CpG 디뉴클레오티드의 수가 감소되는 것인, 상기 표적 핵산 서열을 변형하는 단계,
iii. 적합한 전사 조절 서열과 작동적으로 결합된 적합한 발현 벡터에서 변형된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 상기 변형된 표적 핵산 서열을 클로닝하는 단계,
iv. 적합한 발현 시스템에서 상기 변형된 표적 핵산서열을 발현시키는 단계.
매우 놀랍게도, 본 발명의 방법을 이용한 경우, 종래 기술의 지식에 따라 예상되는 것과 정반대의 효과가 달성될 수 있다는 것이 확인되었다. 이는 본 발명의 방법으로, 표적 핵산 서열에서 CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가시키는 것에 의해, 이 표적 핵산 서열의 발현이 증가될 수 있고, 반면에 표적 핵산 서열에서 CpG 디뉴클레오티드의 수를 감소시키는 것에 의해, 그의 발현이 방지된다. 본 발명에 따르면, 해독 프레임(reading frame)에서 CpG 디뉴클레오티드의 수의 증가는 CpG 섬의 도입과 동등하지 않다. 해독 프레임에서 CpG 디뉴클레오티드의 증가는 i) 보다 작을 수 있는 염기 수(500개 미만) 및 ii) 프로모터 영역과의 중첩 부재 때문에, CpG 섬과 정의가 다르다.
발현 시스템은 세포일 수 있고, 또는 세포-불포함 시스템 또는 생체 외 시스템일 수 있다. 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템이 이용될 수 있으나, 바람직하게는 진핵생물 발현 시스템이 채택된다. 적합한 발현 시스템은 예를 들면, 세균 세포, 곤충 세포, 예를 들면, 바큘로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템, SF9 세포, 드로소필라-쉬나이더(Drosophila-Schneider) 세포, 식물 세포, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 피시아 안구스타(Pichia angusta), 피시아 파스토리스(Pichia patoris) 등; 및 조류(algae), 예를 들면, 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 포함한다. 적용가능한 식물 발현 시스템의 예는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 지 메이스(Zea mays)(옥수수), 니코티아나 토바코(Nicotiana tobacco)(담배), 오리자 사티바(Oryza sativa)(쌀), 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)(보리), 글리신 막스(Glycine max)(콩), 브라시카 종(Brassica sp)(양배추) 등을 포함한다. 바람직하게는, 척추동물 세포가 이용되고, 특히, 포유동물 세포, 특히, 인간 세포, 특히, 체세포가 이용되고, 생식선 세포는 이용되지 않는다. 특히 바람직하게는 발현 시스템은 낮은 수준의 메틸화를 갖는 시스템 또는 세포, 즉, 실질적으로 신생 메틸화는 일어나지 않는 시스템 또는 세포이다. 반면에, 특히 식물 및 동물에서 인간이 아닌 형질전환 개체를 생성하기 위해 본 방법을 이용하는 것이 가능하다.
본 발명은 따라서, 상세하게는 특히 진핵 세포에서 전사된 정보(transcript)의 발현 수준의 표적화된 변화 및/또는 단백질 생성의 표적화된 변화 방법에 관한 것이다. 본 방법은 전사될 DNA 서열의 해독 프레임의 변형을 특징으로 한다.
변형은 CpG 디뉴클레오티드의 비율의 변화와 관련되고, 이는 발현 수준과 상관관계를 갖는다.
인공적인 유전자 합성 기술은 이와 같은 가능성으로부터 선택된 임의의 뉴클레오티드 서열이 합성될 수 있게 한다. 유전자의 코딩 영역 내에서 발현 수준과 상관 관계를 같은 모티프를 변화시키는 것에 의해, 단백질 생성은 이 기술로, 상응하는 뉴클레오티드 서열의 선택에 의해 표적화된 방식으로 변조될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, CpG 디뉴클레오티드는 발현 수준에 직접적인 영향을 갖는 모티프로 확인되었다.
놀랍게도, 일반적으로 수용되는 의견과는 대조적으로, 본 발명에 따른 방식에 의한 CpG 디뉴클레오티드의 도입은 발현의 감소 대신, 유전자 발현의 증가를 가져온다는 것이 확인되었다. 반대로, CpG의 제거는 유전자 발현의 감소를 가져온다.
본 발명에서 "유전자 발현(gene expression)"이라는 용어는 전사 및 번역(translation)을 모두 포함하고, 특히, 이 용어는 단백질 생성을 포함하는 것으로 이해된다.
핵산 수준에서 이 변화들은 바람직하게는 신생 유전자 합성에 의한 인위적 유전자의 생성에 의해 본 발명의 범위 내에 도입되고, 이때, 상응하는 유전자가 코드하는 아미노산 서열은 바람직하게는 변화되지 않는다. 신생 유전자 합성 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. CpG 함량의 변화는 바람직하게는 침묵 돌연변이(silent mutation) 또는 유전자 생성물의 활성을 파괴하지 않는 돌연변이에 의해 수행된다. 변형된 표적 핵산 서열은 실시예에서 기재되는 바와 같이, 예를 들면, 단계적(stepwise) PCR에 의해 긴 올리고뉴클레오티드로부터 생성되거나, 또는 통상적인 유전자 합성의 경우, 전문 공급업체(예를 들면, Geneart GmbH, Qiagen AG)에 주문할 수 있다.
놀랍게도, 상응하는 유전자의 발현은 CpG 디뉴클레오티드의 수를 적절하게 선택하는 것에 의해 부정적으로(보다 작은 수의 CpG) 또는 긍정적으로(CpG의 증가된 수) 영향받을 수 있고, 코돈-최적화 유전자(codon-optimized gene)로 달성될 수 있는 발현율을 훨씬 더 초과할 수 있다. 발현은 CpG 디뉴클레오티드의 수의 증가가 RNA 및 코돈 최적화를 희생하고 이루어지는 경우, 예기치 않게 발현이 증가될 수 있다. 바람직하게는, 표적 핵산 서열의 변형에서 CpG 섬이 도입되지 않고, 바람직하게는 변형된 표적 핵산 서열은 CpG 섬과 연관되지 않는다. 발현에 대한 영향이 실무율 원칙(all-or-nothing principle)에 따라 작동되는, 한정된 CpG 섬에 대한 한계 결정(delimitation)에 의해, 본 발명에서 발현 수준과 CpG 디뉴클레오티드의 수 간에 상관관계가 확인된다.
유전자의 발현을 위해, 이 변형들은 바람직하게는 코딩된 아미노산 서열이 변형되지 않도록 도입된다. 이상적인 경우에, 해당하는 유전자의 핵산 서열만이 그 발현 수준에 영향을 미쳐야 한다. 유전자 코드는 축퇴성을 갖기 때문에, 특정한 아미노산 서열에 대해 복수의 대응되는 핵산 서열을 선택하는 것이 가능하다.
전술된 방법에 대한 한계 설정에 의해, 1) 전사된 정보를 코딩하는 영역은 변형되고, 이에 의해 이 방법은 벡터 및 기타 유전자 기술 조건들과 독립적으로 이용될 수 있고, 2) 발현 수준의 증가를 위해, CpG 디뉴틀레오티드의 수가 증가되어야 한다. 이와 관련하여 추가적으로 도입되는 CpG는 메틸화되지 않는다.
바람직하게는, 발현될 표적 핵산 서열의 서열 대비 CpG 디뉴클레오티드의 수는 원하는 발현 수준에 따라, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 훨씬 더 바람직하게는 8개 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10개 이상, 훨씬 더 바람직하게는 15개 이상, 및 발현된 표적 핵산 서열의 길이에 따라 최대 20개, 또는 그 이상, 특히 30-50개, 또는 100개 이상 증가되거나 또는 감소된다.
바람직하게는 발현될 표적 핵산의 서열에 비해 CpG 디뉴클레오티드의 수는 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 특히 바람직하게는 100% 이상, 및 특히, 200% 이상, 또는 5 배 또는 10배(factor of 5 or 10)만큼 증가된다.
CpG가 제거되는 경우, 유전자 코드의 범위 내에서 제거될 수 있는 모든 CpG를 제거하는 것이 바람직하다. 그러나, 보다 적은 CpG, 예를 들면, 10%, 50% 또는 75%가 또한 제거될 수 있고, 이 제거는 원하는 발현 수준에 의존적이다.
본 발명의 범위 내에서, 놀랍게도, CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가 또는 감소시키는 것은 유전자 발현의 단계적 조절을 가능하게 한다는 것이 확인되었다. 투여량 효과(dose effect)가 놀랍게도 관찰되었다. 이는 유전자 발현의 수준은 보다 많거나 또는 보다 적은 CpG 디뉴클레오티드의 추가 또는 제거에 의해 조절될 수 있다는 것을 의미한다.
이미 기술된 바와 같이, 발현될 표적 핵산 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 최대 수의 CpG 디뉴클레오티드가 도입 또는 제거될 수 있도록 유전자 코드의 축퇴성을 이용하는 것이 가능하고 바람직하다. 도입될 CpG 디뉴클레오티드의 최대 수는 바람직하게는 사전에 정해진 아미노산 서열의 축퇴성 코돈의 변형 가능성에 의해 제한된다.
반면에, 원하는 경우, CpG 디뉴클레오티드의 수는 훨씬 더 증가될 수 있고, 이에 의해 대응되는 아미노산 서열이 변화되더라도 가능하다. 이 경우, 펩티드 또는 단백질의 기능이 저해되지 않도록 주의를 기울여야 한다.
유전자 코드의 축퇴성의 종류에 따라, CpG 디뉴클레오티드는 코돈 내에서 제거되거나 또는 첨가되고 또는 코돈과 중첩될 수 있다.
발현될 표적 핵산에서 CpG 디뉴클레오티드의 수의 변화 외에, 후자는 유전자 발현의 원하는 정도에 따라, 핵산 수준에서 더 변화될 수 있다. 예를 들면, 유전자 발현의 증가를 목적으로 하는 경우, CpG 디뉴클레오티드의 수는 바람직하게는, 추가적인 CpG 디뉴클레오티드의 도입 때문에, 번역에 불리한 효과를 가질 수 있는 mRNA의 보다 강하게 발현된 이차 구조, 또는 발현에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 추가적인 모티프, 예를 들면, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프(splice-activating motif), 엔도뉴클레아제 인식 부위 등과 같은 불리한 효과가 일어나지 않는 방식으로 증가되어야 한다. 반면에, 물론 유전자 발현을 감소시키기 위해 CpG 디뉴클레오티드의 수가 감소되는 경우, CpG 디뉴클레오티드를 특이적으로, 핵산 서열의 변형 후에 이와 같은 모티프를 가져올 부위에서 제거하는 것이 가능하다.
또한, CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가 또는 감소시키는 것 외에, 유전자 발현이 촉진 또는 억제되거나 또는 감소되도록 핵산 최적화를 수행하는 것이 가능하고 또한 바람직하다.
그와 같은 최적화는 따라서, 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프, 예를 들면, 이차 구조-안정화 서열, 증가된 자가-상동성(self-homology)을 갖는 영역, 천연 유전자에 대해 증가된 상동성을 갖는 영역, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열(adenine-rich sequence) 단계들, 엔도뉴클레아제 인식 부위 등의 삽입 또는 제거이다. 그러나, 최적화의 또 다른 가능한 방법은 원하는 발현 시스템에 대한 코돈 선택을 각 경우에 최적화하는 데 있다.
이는, 본 발명의 범위 내에서, 또한 CpG 디뉴클레오티드의 삽입 외에, 코돈 선택이 최적화되거나 또는 더 악화되면, 발현이 증가되거나 또는 감소될 수 있다는 을 의미한다. 본 발명에 따른 발현-최적화 작제물은 예를 들면, 코돈 분포가 이용되는 발현 시스템에서와 동일하도록 선택하는 것에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 진핵생물 발현 시스템은 포유동물 시스템, 바람직하게는 인간 시스템이다. 바람직하게는, 따라서, 코돈 최적화는 인간 유전자의 코돈 선택에 조화된다. 바람직하게는, 이와 관련하여, RNA의 전반적인 안정화 및 최적의 코돈 선택을 보장하기 위해, 포유동물 세포에서 가장 빈번하게 이용되는 코돈 선택이나 또는 가장 빈번하게 이용되는 것의 옆에 위치한 코돈 선택이 이용된다(Ausubel et al., 1994). 훨씬 더 바람직하게는, 핵산 서열은 유전자 최적화기(optimiser) 기술을 이용하여 최적 발현을 위한 것으로 변형된다(DE 102 60 805.9 또는 PCT/EP03/14850).
코돈 최적화와 대비하여, 발현 시스템에서 거의 사용되지 않는 "열등한(poor)" 코돈이 또한 CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가시키기 위해 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 이종기원의(heterologous) 표적 핵산 서열이 또한 이용될 수 있다. "이종기원의 표적 핵산 서열(heterologous target nucleic acid sequence)"라는 표현은 표적 핵산 서열의 기원 및 발현 시스템의 기원을 의미한다. 바람직하게는, 따라서, 표적 핵산 서열 및 발현 시스템은 상호 간에 이종기원이며, 즉, 그들은 상이한 종으로부터 유래되고 및/또는 야생형 표적 핵산 서열의 코돈 선택은 발현 시스템의 것과 상이한 서열이다. 본 발명에서 "이종기원의(heterologous)"이라는 용어는 코돈 선택에 대한 차이점을 포함한다. 코돈 선택은 유전자 코드의 축퇴성의 범위 내에서 개별 종의 선호되는 코돈 사용을 의미한다.
발현 벡터로서, 임의의 적합한 발현 벡터가 이용될 수 있다. 그와 같은 벡터는 바람직하게는 진핵 세포에서의 발현에 적합하다. 발현대상인 변형된 표적 핵산 서열은 적합한 전사 제어 서열 및 가능하게는 추가적인 조절자 요소들과 작동적으로 결합되도록 벡터 내로 클로닝된다. 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있는 적합한 프로모터가 그와 같은 전사 제어 서열일 수 있다.
구성적 활성의(constitutively active) 프로모터는 바람직하게는 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터 및 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV 40)으로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다. 유도성 프로모터는 테트라사이클린-의존성 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 어려움 없이 응용에 따라 다른 적합한 프로모터, 예를 들면, 세포 기원의 프로모터를 선택할 수 있다.
이와 관련하여, 원칙적으로 종래 기술에서 공지된 임의의 유도성 프로모터 시스템은 적합하다. 예를 들면, 천연 또는 인공의 유도성 프로모터, 예를 들면, 테트라사이클린에 의해 유도가능한 프로모터(Tet on/ Tet off 시스템)가 이용될 수 있다. 또한, 유도성의 바이러스 프로모터가 이용될 수 있다.
바람직하게는, 유도성 프로모터는 전사활성(transactive) 인자에 의해 유도될 수 있다. 바이러스 전사활성 인자에 의해 유도될 수 있는 바이러스 유도성 프로모터(viral inducible promoter)는 임의의 바이러스로부터 유래될 수 있다. 이 목적을 위해, 바람직하게는 레트로바이러스, HCV(헤파티티스 C 바이러스), HBV(헤파티티스 B 바이러스), HSV(헤르페스 심플렉스 바이러스), EBV(엡스테인-바르 바이러스), SV 40(시미안 바이러스 40), AAV(아데노-관련 바이러스), 아데노바이러스, 파필로마 바이러스 또는 에볼라 바이러스의 서열들이 이용된다. 이와 관련하여 이용되는 전사활성 인자들은 따라서, 예를 들면, 하기의 바이러스 인자들로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다: NS5A(HCV), HB X(HBV). VP16/ICP4(EBV), EBNA1/Rta(EBV), ART(HHV8), 라아지 T-항원(SV40), Rep78/68(AAV), E1A(아데노바이러스), E2(파필로마 바이러스) 및 VP30(에볼라 바이러스).
바이러스 전사활성 인자에 의해 유도될 수 있는 유도성 프로모터로서, 바람직하게는 레트로바이러스 LTR 프로모터 또는 그의 기능성 부분 서열이 이용된다. 따라서, 바람직하게는 전사활성 인자는 레트로바이러스 Tat 또는 Tax 단백질이다. LTR 프로모터는 HIV-1, HIV-2, SIV, HTLV 및 LTR 프로모터를 갖는 기타 관련된 레트로바이러스의 LTR로부터 선택될 수 있다. 특히, 렌티바이러스 프로모터(lentiviral promoter), 특히, HIV의 프로모터가 바람직하다.
바람직하게는 본 발명의 범위 내에서 이용되는 전사 조절 서열, 즉, 예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서 등은 CpG 섬과 관련되지 않는다.
또한, 발현될 표적 핵산에서 CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가시키는 것 외에, 벡터 상에 존재하는 남은 서열 또는 그의 부분에서 CpG 디뉴클레오티드의 수를 감소시키는 것이 가능하다. 이와 관련하여, 이 남은 벡터 서열 또는 그의 부분에 있는 CpG 디뉴클레오티드가 완전히 제거될 수 있다. 바람직하게는, 이는 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여 아미노산 서열을 유지하면서 수행될 수 있다. 또한, 이 서열들에서 CpG 디뉴클레오티드의 부분적인 제거, 예를 들면, 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 15% 이상, 특히 바람직하게는 25% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 50%, 및 가장 특히 바람직하게는 75% 이상의 제거가 일어날 수 있다. 바람직하게는, 가능하다면, 모든 CpG가 제거된다.
따라서, 응용(발현의 저지(silence) 또는 증가)에 따라, 선택된 코돈 최적화와 독립적으로 CpG 디뉴클레오티드의 수가 변화될 수 있다.
대부분의 경우에, 해독 프레임으로부터 CpG의 완전한 제거가 가능하다. 코딩된 아미노산 서열은 상향적으로 한정되며, 즉, CpG의 수를 증가시킨다.
표적 핵산 서열은 RNA, 그의 유도체 또는 모방체(mimetic), 펩티드, 또는 폴리펩티드, 변형된 펩티드 또는 폴리펩티드, 단백질 또는 변형된 단백질을 코딩할 수 있다.
표적 핵산 서열은 또한 상이한 야생형 서열의 키메라 및/또는 조립된(assembled) 서열일 수 있고, 예를 들면, 융합 단백질 또는 모자이크-형 조립된 폴리진 작제물(polygene construct)을 코드할 수 있다. 표적 핵산 서열은 또한 합성 서열을 코딩할 수 있다. 이와 관련하여, 핵산 서열을 합성적으로 예를 들면, 컴퓨터 모델을 이용하여 모델링할 수 있다.
발현될 표적 핵산 서열은 바람직하게는 임의의 단백질, 예를 들면 재조합 단백질, 인위적 폴리펩티드, 융합 단백질 및 그 등가물에 대한 유전자의 서열일 수 있다. 진단용 및/또는 치료용 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질이 선호된다. 펩티드/단백질은 예를 들면, i) 인간 효소(예를 들면, 아스파라기나아제, 아데노신 디아미나아제, 인슐린, tPA, 응고 인자, 비타민 K 에폭시드 리덕타아제), 호르몬(예를 들면, 에리트로포이에틴, 여포-자극 호르몬, 에스트로겐) 및 기타 인간기원의 단백질(예를 들면, 골형성 단백질, 항트롬빈)과 같은 치료용 단백질의 생성, ii) 백신으로 이용될 수 있는, 바이러스 단백질, 세균 단백질, 또는 기생균으로부터 유래되는 단백질(HIV, HBV, HCV, 인플루엔자, 보렐리아, 헤모필루스, 메닌고콕코스, 안트락스, 보툴린 독소, 디프테리아 독소, 테타누스 독소, 플라스모디움, 등) 또는 iii) 진단용 테스트 시스템의 제조를 위해 이용될 수 있는 단백질(예를 들면, 혈액형 항원, HLA 단백질)의 생성을 위해 이용될 수 있다.
추가적인 가능성으로서, 인접한 세포의 자연적인 방어 메카니즘을 작동시킬 수 있거나 또는 적합한 항원과 조합되어, 특정한 면역 반응을 증폭시킬 수 있는 메신저 물질(사이토카인/케모카인), 예를 들면, G-CSF, GM-CSF, 인터루킨, 인터페론, PDGF, TNF, RANTES 또는 MIP1α 또는 그의 도메인, 단편 또는 변이체를 생성하는 유전자가 선택될 수 있다.
추가적으로 가능성 있는 용도는 예를 들면, 효소(폴리머라아제, 프로테아제, 등)와 같은 생물공학 응용을 위한 단백질의 생산에 있다.
발현될 표적 핵산은 또한 세포에서 그의 발현 후에 분자적 스위치 분자로서 다른 유전자의 발현을 작동시키거나 중단시키는 조절자 유전자일 수 있다. 그와 같은 조절자 유전자로서, 예를 들면 신호 전달 경로의 구성성분 또는 전사인자로 이용될 수 있다. 이와 관련하여, "발현"이라는 용어는 표적 핵산의 전사 및 가능하게는 전사에 의해 수득된 RNA의 번역을 포함한다.
마지막으로, 발현될 표적 핵산은 기능성 RNA(예를 들면, 리보자임, 데코이(decoy) 또는 siRNA)일 수 있고, 바람직하게는 치료용 또는 효소용 목적을 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 서열로부터 유래된, 전사가 가능한 영역을 갖는 변형된 핵산으로서, 상기 전사가 가능한 영역은 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여, 상기 야생형 서열에 비해 CpG 디뉴클레오티드의 수가 증가되도록 변형되는 것인 변형된 핵산에 관한 것이다. 변형된 핵산은 전술된 바와 같은 발현 시스템에서 발현될 수 있고, 전사가 가능한 영역은 이용된 발현 시스템과 관련하여 코돈-최적화되고, 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여, 야생형 서열로부터 유래된 상기 코돈-최적화된 서열에 비해 CpG 디뉴클레오티드의 수가 증가되도록 변형된다.
본 발명의 의미 내에서 야생형 서열은 자연적으로 발생하는 핵산 서열이다.
이미 전술된 바와 같이, 그러나, 표적 핵산 서열이 상이한 야생형 서열들로부터 조립된, 조립된 유전자 서열을 코딩할 수 있다. 그와 같은 경우, 야생형 서열은 본 발명의 의미 내에서 변형(CpG 디뉴클레오티드의 수의 증가 또는 감소)되지 않은 서열을 의미한다.
본 발명에 따른 핵산에서 CpG 디뉴클레오티드의 수는 전술된 바와 같이, 수개의 CpG 디뉴클레오티드만큼 증가될 수 있다. 바람직하게는 그 수는 유전자 코드의 축퇴성의 범위 내에서 가능한 최대 수까지 증가된다.
본 발명은 또한 적합한 전사 제어 서열과 작동적으로 결합된 본 발명에 따른 전술된 변형된 핵산을 포함하는, 발현 벡터를 제공한다. 벡터는 바람직하게는 진핵 세포에서 임의의 DNA 서열의 발현을 증가시키기 위해 이용된다. 벡터는 바람직하게는 공지된 벡터로부터 유래된다. 본 발명에 따른 변형된 핵산 서열과 상이한 벡터의 서열 영역에서, CpG 디뉴클레오티드의 수는 바람직하게는 감소된다. 바람직하게는 나머지 벡터 서열 또는 그의 일부에서 CpG 디뉴클레오티드의 수는 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 15% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 25% 이상, 특히 50% 이상 및 가장 특별하게 바람직하게는 75% 이상 감소된다.
CpG의 감소는 바람직하게는 전술된 바와 같은 개별 벡터 모듈(항생제 내성 유전자, 선택 마커, 다중 클로닝 부위, 등)의 인공적 유전자 합성에 의해 달성된다. 개별 모듈은 기능성 벡터를 형성하기 위해, 단일 제한 부위(singular restriction site)를 이용하여 필수적이고, 불변(non-alterable)인 모듈(복제 원점, 폴리아데닐화 부위, 바이러스 프로모터, 등)의 상응하는 DNA 단편들과 함께 조립된다. 벡터는 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 알파 바이러스 등) 기원 또는 세균 기원, 또는 나형(naked) DNA(발현 플라스미드)일 수 있다.
벡터의 모듈식 구성(modular construction)은 또한 개별 모듈에 대해 신속하고 용이하게 달성되는 변형을 가능하게 한다. 모듈의 수는 응용에 따라 변화되고 조정될 수 있다.
세포 내에서 안정한 삽입을 위해, 진핵세포 선택 마커(예를 들면, 히그로마이신, 제오신 등에 대한 내성 유전자; GFP, LNGFR, 등과 같은 선택 리포터; 또는 방향성 재조합(directed recombination)을 위한 재조합 서열)가 이용될 수 있고, 이때 상응하는 유전자 서열은 가능한 한 CpG 함량에 대해 감소될 수 있다. 유전자 요법에서의 응용을 위해, 면역자극 모티프를 억제하는 서열(예를 들면, 면역-억제성 CpG 모티프)이 도입될 수 있다. 따라서, 면역화, 예를 들면, 백신접종, 또는 항체 생산에의 적용을 위해, 면역자극인자를 포함하는 서열(예를 들면, 면역자극성 CpG 모티프)가 삽입될 수 있다.
본 발명에서의 이용에 바람직한 벡터는 서열번호 27에 예시된 벡터이다.
본 발명은 또한 전술된 바와 같은 표적 핵산 또는 벡터(바람직하게는 DNA 작제물의 형태로)을 포함하는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포를 제공하며, 상기 핵산 또는 상기 벡터는 전사가 가능한 형태로 존재한다. 세포들은 바람직하게는 체세포이고 또는 보다 바람직하게는 기본적으로 신생 메틸화를 수행하지 않는 세포들이다.
DNA 작제물은 예를 들면, 에피좀으로 존재하거나 또는 염색체로 안정적으로 삽입될 수 있다. 이와 관련하여, 세포 내에 하나 이상의 카피가 존재할 수 있다. 상기 DNA 작제물을 도입하기 위해, 바이러스(예를 들면, 아데노 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 알파 바이러스 등) 기원 또는 세균 기원 또는 나형 DNA(발현 플라스미드)의 유전자 페리(gene ferry)가 이용될 수 있다.
본 발명은 또한
a) 야생형 서열로부터 유래된, 전사가 가능한 영역을 갖는 변형된 핵산 서열로서, 상기 변형된 핵산 서열은 상기 야생형 서열에 비해 증가 또는 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 가지며, 전사제어 서열과 작동적으로 결합된 것인 변형된 핵산 서열, 및
b) 상기 a)가 발현될 수 있는, 세포 또는 세포-불포함(cell-free) 발현 환경으로부터 선택된 발현 환경으로서, 증가된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 변형된 핵산 서열의 발현의 경우, 상기 발현 시스템은 증가된 발현을 보이고, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 변형된 핵산 서열의 발현의 경우, 감소된 발현을 보이는 것인 발현 환경을 포함하는 발현 시스템을 제공한다.
본 발명은 따라서, 표적 핵산 서열의 발현을 증가 또는 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 발현이 증가되는 경우, 바람직하게는 5% 이상, 보다 바람직하게는 10% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 30% 이상, 특별하게는 50% 이상 및 가장 특별하게는 100-400% 이상의 발현의 증가가 달성되어야 한다. 발현될 표적 핵산 서열의 길이 및 도입될 수 있는 CpG 디뉴클레오티드의 수에 따라, 2, 3, 5, 또는 심지어 10 내지 20, 또는 가능하게는 100 내지 200배(factor)의 발현 증가가 또한 달성될 수 있다.
발현의 감소를 원하는 경우, 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30%, 훨씬 더 바람직하게는 50% 이상 및 특별하게는 75% 이상의 발현의 감소, 다른 말로, 예를 들면 전사량의 감소가 수행되어야 한다. 바람직하게는 발현은 검출 한계에 접근해야 한다.
이미 상세하게 설명된 바와 같이, 전사의 수준은 유전자 내의 CpG 디뉴클레오티드의 수에 의존한다. 이는 보다 긴 유전자의 경우 또는 CpG 디뉴클레오티드를 도입할 보다 많은 가능성을 갖는 유전자에서, 보다 높은 수준의 발현이 달성된다는 것을 의미한다. 반대로, 본 발명에 따라 가능한 모든 CpG 디뉴클레오티드의 제거 및 응용에 따라, 검출의 한계까지의 제거의 표적화된 제거에 의해 발현을 유의성 있게 감소시킬 수 있다.
본 발명은 추가적으로 본 발명에 따른 변형된 핵산 및/또는 벡터에 기초한 약제 및 진단제를 제공한다. 변형된 핵산 및 벡터는 진단, 치료 및/또는 유전자 요법 응용, 특히, 또한 백신의 생산에서 이용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 방법 및 본 발명에 따른 발현 시스템, 핵산 서열, 벡터 및 세포는 DNA 백신의 생산을 위해 이용될 수 있다. 통상적인 사백신 및 생백신에 대한 대안으로, "나형" 플라스미드 DNA에 기초한 백신의 개발이 점차 중요해지고 있다. DNA 백신의 장점은 세포에서 DNA의 흡수 및 항원의 진정한 생산(변형 포함) 및 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응의 효율적인 활성화에 있다. 이와 관련하여, 유도된 면역 반응의 수준은 생산된 항원의 양 및 따라서 DNA 작제물의 발현량과 상관된다. 임의의 항원의 발현이 코딩 서열에 CpG 디뉴클레오티드의 축적에 의해 증가될 수 있다면, 그 결과, 면역계의 활성화 및 그에 따른 보호 효과가 개선된다.
도 1:
메틸화에 의한 유전자 발현의 조절(종래 기술)
A: CpG 디뉴클레오티드의 메틸화는 유전자 발현의 중단(switching off)을 초래한다.
B: CpG 섬은 메틸화 및 그와 관련된 중단으로부터 보호한다.
C: CpG 섬의 이차적인 저메틸화는 유전자 중단을 초래한다.
D: 이차적인 저메틸화는 해독 프레임에서 CpG 디뉴클레오티드를 감소시키는 것에 의해 방지될 수 있다.
도 2:
안정적으로 형질감염된 세포에서의 GFP 발현 분석
A 및 B: 안정적으로 형질감염된 Flp-In 293T 및 CHO 세포의 장기적인 유동 세포측정법(flow cytometry) 분석. Y 축은 GFP에 따른 형광 강도(GFP-conditioned fluorescence intensity)(MFI "평균 형광 강도")를 나타내고, X 축은 형질감염 후 경과된 주의 수로 표현된 측정 시점을 나타낸다.
A: huGFP 및 △CpG-GFP 재조합 293T 세포의 FACS 분석
B: huGFP 및 △CpG-GFP 재조합 CHO 세포의 FACS 분석
C: 안정된 세포주의 형광 현미경 이미지
도 3:
안정적으로 형질감염된 세포에서의 GFP 단백질 검출.
GFP 해독 프레임의 발현 분석.
huGFP 또는 △CpG-GFP 유전자를 안정적으로 세포 게놈으로 삽입한 재조합 Flp-In CHO 세포를 용해시키고, 유전자의 발현을 통상적인 면역블롯(immunoblot) 분석에서 검출하였다. huGFP, △CpG-GFP 및 모조 시료(mock sample)의 플롯이 표시된다. 양자의 다중클론 세포 배양(폴리)으로부터 단일클론 세포주를 수립하였다(△CpG-GFP에 대한 모노. 14 및 7 및 huGFP에 대한 모노. 10 및 9). 모조 세포(mock cell)는 변하지 않는 초기 세포 모집단에 해당한다.
도 4:
안정한 세포의 특정한 전사된 정보(transcript)의 정량적 결정. 세포질 RNA 표본(preparation)으로부터 특정한 히그로마이신-내성 유전자 및 gfp RNA의 실시간 PCR 분석. CHO 세포(히그로마이신-내성 A 및 gfp B) 및 293T 세포(히그로마이신-내 성 C 및 gfp B)에 대한 LC 분석의 실시한 PCR 분석이 도시된다. PCR 사이클의 수(X 축) 및 형광 강도(Y 축)가 도시된다. huGFP 산물 및 △CpG-GFP 산물 및 프라이머 이량체(primer dimer)에 대한 구체적인 동역학적 결과(Kinetics)가 도시된다.
도 5:
일시적인 형질감염 후 MIP1alpha 발현 분석. 형질감염된 H1299 세포들의 세포 용해액 및 상층액의 대표적인 ELISA 분석. H1299 세포들을 각각 야생형 및 최적화된 쥐 MIP1alpha 작제물 15㎍으로 형질감염시켰다. 세포 상층액 및 세포 용해액에서 개별적인 단백질 농도를 상응하는 표준 곡선을 이용하여 통상적인 ELISA 테스트로 정량하였다. 착색된(shaded) 막대는 두 개의 독립적인 배치(batch)에 대한 각 경우의 총 단백질 농도의 평균값을 표시하고, 착색되지 않은(empty) 막대는 표준 편차에 해당한다. 개방 해독 프레임(open reading frame)의 CpG 디뉴클레오티드의 수를 X 축에 표시하고, pg/ml로 표시된 총 단백질 농도를 Y 축에 표시한다. Wt는 개별적인 야생형 유전자의 발현 작제물을 의미한다.
도 6:
일시적인 형질감염 후 MIP1alpha 및 GM-CSF 발현 분석. 형질감염된 H1299 세포들의 상층액의 대표적인 ELISA 분석. H1299 세포들을 각각 야생형 및 최적화된 인간 MIP1alpha 작제물 (A) 및 GM-CSF 작제물(B) 15㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 세포 배양의 상층액에서 개별적인 단백질 농도를 상응하는 표준 곡 선을 이용하여 통상적인 ELISA 테스트로 정량하였다. 착색된 막대는 두 개의 독립적인 배치에 대한 평균값을 표시하고, 착색되지 않은 막대는 표준 편차에 해당한다. 개방 해독 프레임의 CpG 디뉴클레오티드의 수를 X 축에 표시하고, pg/ml로 표시된 총 단백질 농도를 Y 축에 표시한다. Wt는 개별적인 야생형 유전자의 발현 작제물을 의미한다.
도 7:
이용된 발현 플라스미드의 도식적 예시.
A: P-smallsyn 플라스미드의 플라스미드 맵
B: 서열의 PC-ref. 모듈 및 기원의 플라스미드 맵이 도시된다(야생형 "Wt"는 흑색으로, 합성은 회색으로 도시됨).
도 8:
일시적인 형질감염 후 HIV-1 p24 검출. P-smallsyn 및 Pc-ref 벡터의 발현 분석. H1299 세포를 특정된 작제물로 형질감염시키고 통상적인 면역블롯 분석에 의해 단백질 생성을 검출하였다. HIV-1 p24 형질감염된 H1299 세포의 세포 용해액의 분석. R/p24, s/p24 및 모조-형질감염된 시료의 도표 및 분자량(precision plus 단백질 표준, Bio-Rad)이 도시된다. 모조 형질감염(mock transfection)은 원래의 pcDNA3.1 플라스미드에 의한 형질감염에 해당한다.
도 9:
다양한 발현 작제물의 HIV-1 p24 발현 분석. 독립적인 더블 배치(independent double batch)로 H1299 세포를 각각의 경우에 15㎍의 R/p24, R/p24△CpG, s24 및 s/p24△CpG 작제물 및 pcDNA3.1(모조 대조구)로 형질감염시켰다. 세포 용해액에서 개별적인 p24 단백질 농도는 상응하는 표준 곡선을 이용한 통상적인 면역블롯 분석(A) 및 ELISA 테스트(B)에 의해 정량하였다. 착색된 막대는 각 경우 두 개의 독립적인 배치에 대한 세포 용해액에서 p24 농도(㎍/ml)의 평균값을 나타낸다.
실시예 1
상이한 CpG 함량을 갖는 GFP 리포터 유전자의 제조
CpG 디뉴클레오티드의 수가 상이한, 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자의 두 개의 변이체를 제조하였다. huGFP 유전자는 60개의 CpG를 가지며, △CpG-GFP 유전자는 CpG를 포함하지 않았다. CpG-고갈된 유전자인 △CpG-GFP는 인공적으로 작제하였다. △CpG-GFP의 설계에서, 드문 코돈이나 스플라이싱 부위(splicing site) 또는 폴리(A) 신호 부위와 같은 부정적으로 작용하는 시스-활성 인자(cis-active element)가 도입되지 않도록 주의하였다. 코돈 선택의 질의 척도인, 코돈 적응 지수(codon adaptation index: CAI)는 CpG의 고갈에 의해 매우 조금 변하였다(CAI(huGFP)=0.95; CAI(△CpG-GFP)=0.94). 이와 관련하여 GFP의 코딩 아미노산 서열은 변하지 않았다. 서브-클로닝을 위해 추가적인 인터페이스를 삽입하였다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시된다.
서열을 인터페이스 HindIII 및 Bam HI을 이용하여 발현 벡터 pcDNA/5FRT(Invitrogen)으로 클로닝되고, 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 프로모터(early promoter)/인핸서의 전사 제어 하에 배치된 완전한 합성 유전자(Geneart GmbH)로서 제조하였다("pc △CpG-GFP").
유사한 발현 플라스미드의 생성을 위해, CpG 분포는 변하지 않았으나, 인간화된(humanised) GFP 유전자(huGFP)의 코딩 영역을 상업적으로 수득가능한 벡터로부터 올리고뉴클레오티드 huGFP-1 및 huGFP-2를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭하고, 유사하게 인터페이스 HindIII 및 Bam HI을 이용하여 발현 벡터 pcDNA/5FRT로 클로닝하였다("pc-huGFP", 서열번호 3 및 서열번호 4).
GFP 유전자 변이체를 갖는 안정된 세포주의 제조
안정한 재조합 세포의 신속한 수립 및 선택을 위해 Invitrogen의 Flp-In 시스템을 이용하였다. 이 시스템의 추가적인 주요한 장점은 하나의 카피의 형질전환 유전자를 표적 세포의 정의된 유전자 자리(locus)로 삽입하는 방향성 삽입(directed integration)이다. 이 기술은 따라서 임의의 형질전환 유전자의 발현의 정량적 비교를 위한 최상의 조건을 제공하고, 이는 표적 세포의 생리적 인자 및 유전적 인자가 거의 동일하기 때문이다. 추가적인 확실성을 얻기 위해, 두 개의 상이한 포유동물 세포들을 이 비교 연구를 위해 선택하였다. Fip-In CHO 및 Fip-In 293T 세포주를 Invitrogen으로부터 수득하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 세포주들을 L-글루타민, 10% 불활성화된 우태아 혈청, 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/ml)로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium high glucose)(293T) 및 HAMs F12(CHO)에서 배양하였다. 합류(confluence)가 달성된 후에 세포들을 1:10의 비로 서브-클로닝하였다.
제조사의 설명에 따라, 안정적으로 형질감염된 세포의 수립을 수행하였다. 6-웰 배양 디쉬에 2.5 x 105 개의 세포들을 접종하고 24시간 후에 1.5 ㎍의 전이(transfer) 플라스미드 및 13.5 ㎍의 pOG44로 칼슘 포스페이트 공침법(co-precipitation)(Graham and Eb. 1973)에 의해 형질감염시켰다. 293T의 경우 100 ㎍/ml의 히그로마이신, CHO 세포의 경우, 500 ㎍/ml의 히그로마이신으로 90%를 초과하는 비율의 GFP 양성 세포들을 선택하였다. GFP 양성 세포의 수는 통상적인 유동 세포측정법 분석에 의해 모든 세포주에 대해 결정하였다.
GFP 발현의 결정
리포터 작제물의 발현은 유동 세포측정기(Becton-Dickinson)에서 GFP-매개 녹색 자가형광(autofluorescence)의 정기적 측정에 의해 16개월의 기간 동안 결정하였다. 평균 형광 강도의 데이터가 도 2A(293T 세포) 및 2B(CHO 세포)에 요약된다. 전체 측정기간 동안 두 세포주 모두에서 huGFP 발현은 800(293T) 및 700(CHO)의 평균 형광 강도로 비교적 일정했다. 감소된 수의 CpG를 갖는 △CpG-GFP 리포터 작제물도 마찬가지로 전체 측정 기간 동안 일정한 형광 강도를 보였다. 그러나, 평균 형광 강도는 huGFP에 비해 10-20배(293T) 및 6-9배(CHO)만큼 감소되었다. GFP-매개 형광의 감소는 또한 형광 현미경에 의해 검출할 수 있었다(도 2C).
GFP-매개 형광의 감소에는 다양한 요인들(단백질의 불안정, RNA의 감소된 핵으로부터의 이동(export), 보다 낮은 전사율, 등)이 관여될 수 있기 때문에, 추가적인 웨스턴 블롯 분석 및 정량적인 실-시간 PCR을 수행하였다.
면역 블롯에 의한 단백질 검출을 위해, 안정된 형질감염 CHO 세포들을 냉각된 PBS(10 mM Na2HP4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)로 2회 세척하고 냉각된 PBS에서 떼어내고, 300g에서 10분간 원심분리하고 얼음 상에서 용해용 완충액(lysis buffer)(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5% 트리톤 X-100(w/v))으로 30분간 용해시켰다. 세포 용해액의 불용성 성분을 10000 g 및 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 상층액에서 단백질의 총량은 제조사의 설명서에 따라 Bio-Rad 단백질 분석(Bio-Rad, Munich)을 수행하여 결정하였다. 2x 시료 완충액(Laemmli, 1970)의 동일한 용량을 시료에 첨가하고 95℃에서 5분간 가열하였다. 세포 용해액으로부터 40 ㎍의 총 단백질을 12.5% SDS/폴리아크릴아미드 겔(Laemmlie, 1970)을 통해 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 전기이동(electrotransfer)시키고 단일클론 GFP-특이적 항체(BD-Bioscience) 및 이차 항체인 HRP(Horseradish peroxidase) 결합된 항체로 검출하고, 색원체 염색(chromogenic staining)에 의해 확인하였다. 웨스턴 블롯에 의한 단백질 검출은 FACS 측정으로부터 얻은 데이터에 의해 확인하였다. 두 유 전자 변이체에 대해, 전장(full-length) GFP 단백질을 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에서 검출하였고; 처리 또는 단백질분해효소에 의한 분해(proteolytic degradation)에서는 차이점이 검출되지 않았다(도 3).
전사 활성을 명백하게 하기 위해, 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에 대해 정량적인 실-시간 PCR(Light Cycle, Roche)을 수행하였다. 세포들로부터 세포질 RNA를 준비하고(RNeasy, Quiagen) DNase(500 U Rnase-불포함 DNase/20 ㎍ RNA)로 처리하였다. 1 ㎍의 DNase-처리된 RNA를 역전사를 위한 매트릭스(matrix)로 이용하였다(Random Primed, p(dN)6, 1ST strand C-DNA synthesis kit for RT-PCR). 결과물인 PCR 산물을 희석하여 라이트 사이클러(Light Cycler: LC) 분석(SYBR, Roche)을 위해 이용하였다. 내부 대조구(internal control)로서, 세포 게놈으로 삽입된 히그로마이신-내성 유전자의 RNA 양을 측정하였다. 그 결과가 도 4에 요약된다. 히그로마이신-내성 유전자의 RNA 양은 모든 측정된 작제물에서 차이를 보이지 않았다(도 4A: CHO 세포 및 도 4C: 293T 세포). 그러나, GFP RNA의 결과는 단백질 발현의 결과와 매우 잘 상관되었다(GFP 형광 강도). CpG-고갈 작제물의 경우, 라이트 사이클러 데이터의 정량화 후에, 초기 작제물(intial construct) 대비, CHO 세포에서 약 7배 적은 양의 세포질 RNA의 양이 검출되고 293T 세포에서 약 30배 적은 양의 세포질 RNA의 양이 검출되었다(도 4D).
실시예 2
상이한 CpG 함량을 갖는 쥐 Mip1alpha 유전자의 제조
본 실시예에서, 쥐 Mip1alpha 유전자의 핵산 서열을 코딩 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서, 상이한 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 일련의 작제물을 제조하기 위해 변형시켰다. 이 목적을 위해, 쥐 MIP1alpha 유전자 산물의 아미노산 서열을 인간 세포의 코돈 선택을 이용하여 합성 MIP1alpha-코딩 해독 프레임으로 역 번역하였다. 일련의 작제물에서, 우발적으로 형성된 CpG 디뉴클레오티드를 서열로부터 단계적으로 제거하고, 그러나, 발현에 부정적으로 영향을 미칠 것으로 예상되는 드문 코돈이 도입되지 않게 하였다. 또한, CpG 디뉴클레오티드-최적화된 Mip1alpha 유전자 작제물을 제조하였고, 이 작제물은 코돈-최적화된 작제물보다 두배 많은 CpG 디뉴클레오티드를 포함했다. 이 경우, 가능한 한 많은 CpG 디뉴클레오티드를 도입하기 위해, 코돈 선택의 열화(deterioration)를 의도적으로 고려하였다. 종래 기술에 따르면, 이 유전자 작제물은 그의 보다 열등한 코돈 선택 때문에 코돈-최적화된 유전자 작제물보다 낮은 발현을 가질 것으로 예상될 것이다.
이 유전자 변이체들을 긴 올리고뉴클레오티드 및 단계적 PCR을 이용하여, 완전히 합성적인 해독 프레임으로서 제조하고 발현 벡터로 클로닝하였다. 제조된 MIp1alpha 벡터 변이체는 쥐 MIP1alpha의 발현 수준과 완전히 상이했다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 포유동물의 세포에서 가장 낮은 빈도의 CpG를 갖는 변이체가 가장 열등하게 발현되고, CpG의 증가는 Mip1alpha 발현의 증가를 동반할 것이라는 것은 예상하지 못했을 것이다. 특히, 코돈 선택의 열화를 감수하고 도입된 가능한 최대 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 작제물이 코돈-최적화된 유전자에 비해 훨씬 강한 발현을 보였다는 것은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 예상하지 못했을 것이다.
CpG 디뉴클레오티드의 수가 상이한 쥐 Mip1alpha 유전자의 변이체를 실시예 1에 기술된 바와 같이 합성에 의해 제조하고 인터페이스 HindIII 및 NotI을 이용하여 발현 벡터 pcDNA3.1에 서브-클로닝하였다. 인위적으로 제조된 유전자는 각 경우에 포유동물 시스템에 대한 코돈 선택에 대해 조화시켰다. CpG 디뉴클레오티드를 제거하는 경우, 드문 포유동물 코돈은 이용하지 않았고, 반면에, 정상적인 코돈 적응으로 달성되는 디뉴클레오티드의 수를 초과하여 CpG 디뉴클레오티드를 삽입하는 경우, 드문 코돈을 의도적으로 이용하였다.
코돈 최적화되었으나 상이한 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 작제물은 전반적으로 0.9를 초과하는 CAI 값을 가지며, 약간만 상이했다. 야생형 유전자 및 CpG 디뉴클레오티드 최적화된 유전자(42개의 CpG)의 CAI 값은 반면에 매우 낮았다(0.8 미만). 종래 기술에 따르면, 야생형 유전자 및 CpG 디뉴클레오티드 최적화된 유전자보다 상당히 낮은 발현이나, 코돈-최적화된 유전자의 유사한 발현이 기대되었다. 작제물의 확인, CpG의 수 및 CAI 값이 표 1에 표시된다. 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 서열번호 5/6 내지 서열번호 13/14에 표시된다. 야생형 서열에 해당하는 유사한 발현 작제물(야생형 기준(reference) 작제물)은 CpG 분포에 있어서는 변하지 않았다. 코딩 영역을 cDNA 클론(RZPD로부터 수득됨)으로부터의 올리고뉴클레오티드 mamip-1 및 mamip-2를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭하고 인터페이스 HindIII 및 NotI을 이용하여 발현 벡터 pcDNA3.1에 클로닝하였다("pc- mamip-wt", 서열번호 15, GenBank Accession Number AA071899).
Mip1alpha 발현 확인
케모카인(chemokine) 발현을 정량하기 위해, 인간 H1299 세포를 개별적인 발현 작제물로 형질감염시키고 세포 및 세포 배양 상층액의 단백질 양을 상용 ELISA 테스트 키트에 의해 측정하였다.
6-웰 세포 배양 디쉬에 1.5 x 105 개의 인간 폐 육종 세포들(H1299)을 접종하고 24시간 후에 15 ㎍의 상응하는 발현 플라스미드로 칼슘 포스페이트 공침법에 의해 형질감염시켰다. 세포 및 세포 배양 상층액을 형질감염 48시간 후에 채취하였다. 형질감염된 세포들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 용해시키고 Bio-Rad 단백질 분석으로 세포 용해액의 총 단백질 양을 결정하였다. 불용성 세포 구성성분을 4℃에서 10000g로 15분간 원심분리하여 세포 배양 상층액으로부터 제거하였다.
세포 용해액 및 희석된 세포 배양 상층액으로부터의 1-5 ㎍의 총 단백질로부터, 제조사의 설명서에 따라 상업적으로 수득 가능한 ELISA 분석(R&D Systems)을 수행하여 MiP1alpha의 발현을 확인하였다. 검출가능한 MiP1alpha의 총량은 GFP 발현 작제물 및 p24 발현 작제물의 데이터에 유사한 방식으로, 해독 프레임의 CpG의 수와 상관관계를 가졌다. 데이터를 표 1에 요약한다. 작제물의 수는 처음으로 코딩 영역 내의 CpG의 수와 발현의 수준간의 관계에 대한 상세한 평가를 가능하게 하였다.
사이토카인 ELISA에 의한 평가의 대표적인 결과가 도 5에 도시된다. 착색된 막대는 두 개의 독립적인 형질감염 배치의 평균 값을 나타내고, 착색되지 않은 막대는 개별적인 표준 편차를 나타낸다.
야생형 작제물 대비 두 개의 독립적인 일시적 형질감염 실험(더블 배치로)의 상대적인 단백질 양이 표 1에 표시된다. 이 결과는 그와 같은 모티프의 추가적인 도입과 상관되어, 코돈 매칭(codon matching)의 열화에도 불구하고, 야생형 유전자 및 코돈-최적화된 유전자 대비 CpG 디뉴클레오티드의 감소에 따른 단백질 발현의 현저한 감소 및 CpG 증가에 따른 단백질 발현의 현저한 증가를 보여준다.
표 1: 쥐 MIP1alpha 유전자의 발현 비교
작제물 서열번호 발현* 표준편차** CpG 수 CAI***
pc-maMIP wt 15 100% 4% 8 0.76
pc-maMIP 0 5 2% 9% 0 0.92
pc-maMIP 2 7 8% 27% 2 0.93
pc-maMIP 4 9 7% 33% 4 0.93
pc-maMIP 13 11 146% 5% 13 0.97
pc-maMIP 42 13 246% 4% 42 0.72
* 야생형 작제물(maMIP wt)의 단백질 총량 대비 두 테스트(더블 배치)로부터의 단백질 양의 백분율 평균값
** 표준편차
*** 코돈 적응 지수(Codon Adaptation Index)
실시예 3
상이한 CpG 함량을 갖는 인간 및 쥐 사이토카인 유전자의 제조
지금까지 수득된 결과 및 해석을 더 확인하기 위해, 야생형 유전자와 CpG 디뉴클레오티드의 수가 상이한, 인간 MIP1alpha 유전자, 인간 GM-CSF 유전자, 인간 IL-15 유전자 및 쥐 GM-CSF 유전자의 변이체를 실시예 2에서와 유사한 방식으로 인위적으로 작제하고 인터페이스 HindIII 및 NotI을 이용하여 발현 벡터 pcDNA3.1로 서브-클로닝하였다. 작제물의 식별, CpG의 수 및 CAI 값이 표 2에 표시된다. 야생형 서열(wt) 및 변화된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 서열의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 서열번호 17/18 내지 서열번호 23/24 및 서열번호 48/49 내지 서열번호 54/55에 표시된다. 발현 작제물을 상응하는 cDNA 클론(RZPD로부터 수득됨)으로부터의 올리고뉴클레오티드 humip-1 및 humip-2, hugm-1 및 hugm-2, huil-1 및 huil-2, magm-1 및 magm-2를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭하고 인터페이스 HindIII 및 NotI을 이용하여, 발현 벡터 pcDNA3.1에 클로닝하였다("pc-huMiP-wt", GenBank Accession Number NM_021006, "pc-huGM-wt", GenBank Accession Number M11220, "pc-huIL-wt", GenBank Accession Number BC018149, "pc-muGM-wt", GenBank Accession Number NM_049969+편차(with a deviation)).
사이토카인 발현 확인
사이토카인 발현을 정량하기 위해, 인간 세포를 개별적인 발현 작제물로 형질감염시키고 세포 배양 상층액의 단백질 양을 상용 ELISA 테스트 키트에 의해 측정하였다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, H1299 세포들을 15㎍의 상응하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 세포 배양 상층액을 채취하였다. 불용성 세포 구성성분을 원심분리에 의해 세포배양 상층액으로부터 제거하였 다.
희석된 세포 배양 상층액으로부터, 인간 MIP1alpha, 인간 GM-CSF 및 IL-15 및 쥐 GM-CSF의 발현을 각 경우에 상업적으로 입수 가능한 ELISA 키트로 확인하였다(MIP1alpha의 경우 R&D Systems; GM-CSF 및 IL-15의 경우 BD Pharmingen). 전술된 발현 작제물의 데이터에 유사한 방식으로, 배양 상층액에서 검출가능한 사이토카인의 총량은 해독 프레임의 CpG 수와 상관관계를 가졌다. 그 데이터가 표 2에 요약된다. 사이토카인 ELISA에 의한 평가의 대표적인 결과가 도 6에 도시된다. 착색된 막대는 두 개의 독립적인 형질감염 배치의 평균값을 나타내고, 착색되지 않은 막대는 개별적인 표준편차를 나타낸다. 각 경우, 야생형 작제물 대비 일시적인 형질감염 실험(더블 배치)으로부터의 상대적인 단백질 양이 표 2에 표시된다. 실시예 2의 결과에 유사하게, 이 결과들은 또한 야생형 유전자 대비 그와 같은 모티프의 추가적인 도입과 상관관계를 갖는, 단백질 생성의 현저한 증가를 확인한다.
표 2: 인간 사이토카인/케모카인 유전자의 발현 비교
작제물 서열번호 발현* CpG 수 CAI**
pc-huMiP wt 21 100% 8 0.76
pc-huMiP 43 17 393% 43 0.72
pc-huGM wt 23 100% 10 0.82
pc-huGM 63 19 327% 63 0.70
pc-huIL wt 56 100% 3 0.65
pc-huIL 21 52 313% 21 0.98
pc-muGM wt 58 100% 11 0.75
pc-muGM 62 54 410% 62 0.75
* 상응하는 야생형 작제물(wt로 표시함)의 단백질 총량 대비, 더블 배치로 수행된 한 실험으로부터의 단백질 양의 백분율 평균값
** 코돈 적응 지수(Codon Adaptation Index)
실시예 4
발현을 증가시키기 위해 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 플라스미드의 제조
플라스미드 pcDNA5(Invitrogen)의 핵산 서열을 CpG 디뉴클레오티드의 수가 최대한 감소된 모듈방식으로(modularly) 작제된 플라스미드의 제조를 위한 기초로 이용하였다. 암피실린 내성 유전자(bla)를 코딩하는 DNA 서열을 실시예 1에 기재된 바와 같이 합성에 의해 제조하고, 제한효소 ClaI 및 BglII를 이용하여 서브-클로닝하였다. 이때, CpG의 수는 72에서 2로 감소되었다. 마찬가지로, 다중 클로닝 부위를 재설계하고, 합성적으로 작제하여, 제한효소 SacI 및 PmeI을 이용하여 서브 클로닝하고, 이에 의해 CpG의 수는 11에서 1로 감소하였다. CMV 프로모터(31개의 CpG), BGH 폴리아데닐화 부위(3개의 CpG) 및 pUC 복제 원점(45개의 CpG)을 변화없이 상기 플라스미드에 삽입시켰다. 히그로마이신-내성 카세트를 결실시켰다. CMV 프로모터를 3' 및 5'에 ClaI 및 SacI을 첨가한, 올리고뉴클레오티드 CMV-1 및 CMV-2에 의한 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. 유사한 방식으로, pUC ori-1을 올리고뉴클레오티드 ori-1(XmaI 인터페이스를 포함함) 및 ori-2(BglII 인터페이스를 포함함)에 의한 PCR로 증폭하고, BGH 폴리아데닐화 부위를 올리고뉴클레오티드 pa-1(PmeI) 및 pa-2(XmaI)으로 PCR에 의해 증폭하고, 상응하는 제한효소를 이용하여 서브-클로닝하였다. 플라스미드 pcDNA5를 모든 PCR 반응에서 주형으로 이용하였다. 이 플라스미드의 구조는 도 7A에 도식적으로 도시되고("P-smallsyn") 그의 완전한 서열은 서열번호 25로 표시된다.
벡터의 CpG의 수가 전사된 정보의 발현 수준에 미치는 영향을 조사하기 위해, 기준 벡터(reference vector)를 대조구로 이용하기 위해 변형시켰다. 각각 5' 말단에 NsiI 제한 인터페이스를 도입한, 올리고뉴클레오티드 ref-del-1 및 ref-del-2를 이용한 PCR 증폭, NsiI에 의한 절단 및 라이게이션에 의해, 플라스미드 pcDNA5로부터 히그로마이신-내성 카세트를 제거하였다(도 6B, "Pc-ref" 참조).
HIV-1으로부터 유래된 p24 캡시드(capsid) 단백질을 테스트 전사 정보로 이용하였다. 인간 세포에서 발현을 위해 이미 최적화된 p24의 코딩 영역을 HIV-1 syngag 작제물로부터의 올리고뉴클레오티드 p24-1 및 p24-2를 이용한 PCR에 의해 증폭하고(Graf et al., 2000) 인터페이스 HindIII 및 Bam HI을 이용하여 두 개의 비교 벡터로 클로닝하였다("R/p24" 및"s/p24").
상이한 벡터 배경에서 HIV-1 p24 발현 확인
벡터의 CpG 수의 영향을 전사된 정보의 발현으로부터 확인하기 위해, 작제물 R/p24 및 s/p24를 일시적으로 인간 세포로 형질감염시키고 p24의 발현을 분석하였다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, H1299 세포들을 15㎍의 상응하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 세포를 채취하였다. 형질감염된 세포들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 용해시키고 Bio-Rad 단백질 분석으로 상층액의 총 단백질 양을 결정하였다.
50㎍의 세포 용해액으로부터의 총 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 단일클론 p24-특이적 항체, 13-5에 의한 웨스턴 블롯 분석으로 테스트하였다(Wolf et al., 1990)(도 8). 두 개의 독립적인 형질감염 배치에서, smallsyn 작제물(s/p24)의 형질감염 후에, 현저하게 더 높은 p24 발현을 검출하였다.
상이한 CpG 함량을 갖는 HIV p24 유전자의 제조
CpG 디뉴클레오티드의 수가 상이한, HIV-1으로부터 유래한 캡시드 단백질 유전자 p24의 두 개의 변이체를 제조하였다. syn p24 유전자는 38개의 CpG를 가졌고, 반면에 p24△CpG는 CpG를 전혀 포함하지 않았다. CpG-고갈 유전자 p24△CpG를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인위적으로 작제하고 인터페이스 HindIII 및 Bam HI을 이용하여 발현 벡터 P-smallsyn(실시예 4에 기재됨)("s/p24△CpG") 및 기준 벡터 Pc-ref("R/p24△CpG")로 클로닝하였다. p24△CpG 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 서열번호 26/27로 표시된다. 실시예 4에 기재된, 플라스미드 R/p24 및 s/p24를 기준 작제물로 이용하였다.
HIV-1 p24 발현
벡터 및 삽입물(전사 정보)에서 CpG 수의 영향을 확인하기 위해, 작제물 R/p24, R/p24△CpG, s/p24 및 s/p24△CpG를 일시적으로 인간 세포로 형질감염시키고 p24의 발현을 분석하였다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, H1299 세포들을 15㎍의 상응하는 플라스미드 로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 용해시키고 Bio-Rad 단백질 분석으로 상층액의 총 단백질 양을 결정하였다.
50㎍의 세포 용해액으로부터의 총 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 단일클론 p24-특이적 항체, 13-5에 의한 웨스턴 블롯 분석으로 p24의 발현에 대해 테스트하였다(도 9A). 실시예 4에서 이미 입증된 바와 같이, 동일한 형질전환 유전자에서 CpG-고갈 벡터 P-smallsyn의 이용은 p24 생성의 가시적 증가를 가져왔다(R/p24와 s/p24의 비교). GFP 및 사이토카인/케모카인 발현 작제물의 데이터와 유사하게, 동일한 벡터 배경을 이용한, 세포 용해액에서 검출가능한 p24의 양은 해독 프레임 내의 CpG의 수와 상관관계를 가졌다(R/p24 및 R/p24△CpG 및 s/p24 및 s/p24△CpG). 데이터는 p24-특이적 ELISA 테스트에서 확인하였다(도 9B). 38개의 CpG를 갖는 작제물은 CpG 불포함 작제물(p24△CpG)에 비해 약 2.5배(Pc-ref) 또는 약 25%(P/smallsyn) 많은 양의 p24를 가졌다. 그 결과가 도 9에 도시된다.
단백질 생성과 CpG 디뉴클레오티드의 수 간의 상관관계가 전술된 실시예들에서 입증될 수 있었다. 선택된 유전자들은 해파리, 인간 병원성 바이러스, 및 포유동물과 같은 상이한 개체로부터 유래했다. 따라서, 이 메카니즘은 일반적으로 유효한 것이 명확하다. 실시예는 또한 생체 외에서의 이 상관관계가 안정된 재조합 세포뿐 아니라 일시적인 형질감염에서도 유효한 것이라는 것을 보여준다. 본 명세서에 기술된 방법, 즉, 코딩 영역 및 벡터 배경에서 CpG 디뉴클레오티드의 표적화된 조절에 의해 진핵 생물에서 유전자 발현을 표적화된 방식으로 변화시키는 방법은 결과적으로 생물공학적 응용, 진단 또는 의학적 응용을 위한 생체분자의 제조를 위 해 이용될 수 있다.
서열의 설명
1. 올리고뉴클레오티드
Figure 112007017440849-PCT00001
Figure 112007017440849-PCT00002
Figure 112007017440849-PCT00003
Figure 112007017440849-PCT00004
Figure 112007017440849-PCT00005
Figure 112007017440849-PCT00006
Figure 112007017440849-PCT00007
Figure 112007017440849-PCT00008
Figure 112007017440849-PCT00009
Figure 112007017440849-PCT00010
Figure 112007017440849-PCT00011
참고문헌
Akiyama, Y., Maesawa, C, Ogasawara, S., Terashima, M. and Masuda, T. (2003) Cell-type-specific repression of the maspin gene is disrupted frequently by demethylation at the promoter region in gastric intestinal metaplasia and Cancer cells, Am.J.Pathol. 163, 1911-1919.
Antequera, F. and Bird, A. (1993) Number of CpG islands and genes in human and mouse, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 90, 11995-11999.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, d. d., Seidman, J. G., Smith, J. A. and Struhl, K. (1994) Percentage of Kodon Synonomous Usage and Frequency of Kodon Occurrence in Various Organisms, Current Protocols in Molecular Biology 2, A1.8-A1.9.
Bird, A. P. (1980) DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA, Nucleic Acids Res. 8, 1499-1504.
Chevalier-Mariette, C, Henry, I., Montfort, L., Capgras, S., Forlani, S., Muschler, J. and Nicolas, J. F. (2003) CpG content affects gene silencing in mice: evidence from novel transgenes, Genome Biol. 4, R53.
Choi, Y. S., Kim, S., Kyu, L. H., Lee, K. U. and Pak, Y. K. (2004) In vitro methylation of nuclear respiratory factor-1 binding site suppresses the promoter activity of mitochondrial transcription factor A, Biochem.Biophys.Res.Commun. 314, 118-122.
Demi L., Bojak A., Steck S., Graf M., Wild J., Schirmbeck R., Wolf H., Wagner R. (2003) Multiple Effects of Codon Usage Optimization on Expression and Immunognicity of DNA Candidate Vaccines Encoding the Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Gene, J. Viral. 75 No. 22, 10999-11001.
Deng, G., Chen, A., Pong, E. and Kim, Y. S. (2001) Methylation in hMLH1 Promoter interferes with its binding to transcription factor CBF and inhibits gene expression, Oncogene 20, 7120-7127.
Duan J. and Antezana A. (2003) Mammalian Mutation Pressure, Synonymous Codon Choice, and mRNA Degradation, J. Mol. Evol. 57, 694- 701
Hendrich, B. and Bird, A. (1998) Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins, Mol.Cell Biol. 18, 6538- 6547.
Hisano, M., Ohta, H., Nishimune, Y. and Nozaki, M. (2003) Methylation of CpG dinucleotides in the open reading frame of a testicular germ cellspecific intronless gene, Tact1/Actl7b, represses its expression in somatic cells, Nucleic Acids Res. 31 , 4797-4804.
Hsieh, C. L. (1994) Dependence of transcriptio[pi]al repression on CpG methylation density, Mol.Cell Biol. 14, 5487-5494.
Ivanova, T., Vinokurova, S., Petrenko, A., Eshilev, E., Solovyova, N., Kisseljov, F. and Kisseljova, N. (2004) Frequent hypermethylation of 5' flanking region of TIMP-2 gene in cervical cancer, Int.J.Cancer 108, 882- 886.
Jones, P. L., Veenstra, G. J., Wade, P. A., Vermaak, D., Kass, S. U., Landsberger, N., Strouboulis, J. and Wolffe, A. P. (1998) Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription, Nat.Genet. 19, 187-191.
Kang, G. H., Lee, S., Lee, H. J. and Hwang, K. S. (2004) Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia, J.Pathol. 202, 233-240.
Kudo, S. (1998) Methyl-CpG-binding protein MeCP2 represses Sp1- activated transcription of the human leukosialin gene when the promoter is methylated, Mol.Cell Biol. 18, 5492-5499.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, .Nature 227, 680-685.
Larsen, F., Gundersen, G., Lopez, R. and Prydz, H. (1992) CpG islands as gene markers in the human genome, Genomics 13, 1095-1107.
Li, Q. L., Kim, H. R., Kim, W. J., Choi, J. K., Lee, Y. H., Kim, H. M., Li, L. S., Kim, H., Chang, J., Ito, Y., Youl, L. K. and Bae, S. C. (2004) Transcriptional silencing of the RUNX3 gene by CpG hypermethylation is associated with lung Cancer, Biochem.Biophys.Res.Commun. 314, 223-228.
Nan, X., Ng, H. H., Johnson, C. A., Laherty, C. D., Turner, B. M., Eisenman, R. N. and Bird, A. (1998) Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex, Nature 393, 386-389.
Shen, J. C, Rideout, W. M., III and Jones, P. A. (1994) The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA, Nucleic Acids Res. 22, 972-976.
Sved, J. and Bird, A. (1990) The expected equilibrium of the CpG dinucleotide in vertebrate genomes under a mutation model, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87, 4692-4696.
Takai, D. and Jones, P. A. (2002) Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99, 3740-3745.
Voo, K.S., Carlone, D.L., Jacobsen, B.U., Flodin, A., und Skalnik, D. (2000) Cloning of a Mammalian Transcriptional Activator That Binds Unmethylated CpG motifs and Shares a CXXC Domain with DNA Mathyltransferase, Human Trithorax, and Methyl-CpG Binding Domain Protein I, Mol. And Cell. Biol. Mar. 2000, 2108-2121.
Wade, P. A., Gegonne, A., Jones, P. L., Ballestar, E., Aubry, F. and Wolffe, A. P. (1999) Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation, Nat.Genet. 23, 62-66.
Wise, T. L. and Pravtcheva, D. D. (1999) The undermethylated state of a CpG island region in igf2 transgenes is dependent on the H19 enhancers, Genomics 60, 258-271.
Wolf, H., Modrow, S., Soutschek, E., Motz, M., Grunow, R. and Dobl, H. (1990) Production, mapping and biological characterisation of monoclonal antibodies to the core protein (p24) of the human immunodeficiency virus type 1., AIFO 1 , 24-29.
Wu1 Q., Shi, H., Suo, Z. and Nesland, J. M. (2003) 5'-CpG island methylation of the FHIT gene is associated with reduced protein expression and higher clinical stage in cervical carcinomas, Ultrastruct.Pathol. 27, 417-422.
Yao, X., Hu, J. F., Daniels, M., Shiran, H., Zhou, X., Yan, H., Lu, H., Zeng, Z., Wang, Q., Li, T. and Hoffman, A. R. (2003) A methylated oligonucleotide inhibits IGF2 expression and enhances survival in a model of hepatocellular Carcinoma, J.Clin.Invest 111 , 265-273.
Yoshida, M., Nosaka, K., Yasunaga, J. I., Nishikata, I., Morishita, K. and Matsuoka, M. (2003) Aberrant expression of the MEL 1S gene identified in association with hypomethylation in adult T-cell leukemia cells, Blood.
<110> Geneart GmbH <120> Method for modulating the gene expression by altering the CpG content <130> 33252-DH <140> <141> <160> 59 <170> Patent In Ver. 2.1 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: depleted delta green fluorescent protein(GFP) gene <220> <221> CDS <222> (1)..(720) <400> 1 atg gtg tcc aag ggg gag gag ctg ttc aca ggg gtg gtg ccc atc ctg 48 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 gtg gag ctg gat ggg gat gtg aat ggc cac aag ttc tct gtg tct ggg 96 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 gag ggg gag ggg gat gcc acc tat ggc aag ctc acc ctg aag ttc atc 144 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 tgc acc aca ggc aag ctg cca gtg ccc tgg ccc acc ctg gtg acc acc 192 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 ttc acc tat ggg gtg cag tgc ttc agc aga tac cca gac cac atg aag 240 Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 cag cat gac ttc ttc aag tct gcc atg cct gag ggc tat gtg cag gag 288 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 agg acc atc ttc ttc aag gat gat ggc aac tac aag acc agg gct gag 336 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 gtg aag ttt gag ggg gat acc ctg gtg aac agg att gag ctg aag ggc 384 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 att gac ttt aag gag gat ggc aat atc ctg ggc cac aag ctg gag tac 432 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 aac tac aac agc cac aat gtg tac atc atg gca gac aag cag aag aat 480 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 ggc atc aag gtg aac ttc aag atc agg cac aac att gag gat ggc tct 528 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 gtg cag ctg gca gac cac tac cag cag aac acc ccc att gga gat ggc 576 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 cct gtc ctg ctg cca gac aac cac tac ctg agc acc cag tct gcc ctg 624 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 agc aag gac ccc aat gag aag agg gac cac atg gtg ctg ctg gag ttt 672 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 gtg aca gct gct ggc atc acc ctg ggc atg gat gag ctg tac aag tga 720 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 240 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: depleted delta green fluorescent protein(GFP) gene <400> 2 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: depleted delta green fluorescent protein(huGFP) Gene <220> <221> CDS <222> (1)..(720) <400> 3 atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc 96 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 ttc acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag 240 Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag 336 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac 480 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc 528 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg 624 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa 720 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 240 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: depleted delta green fluorescent protein(huGFP) Gene <400> 4 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-0CpG(murine MIP1alpha gene with 0 CpG dinucleotide) <220> <221> CDS <222> (1)..(279) <400> 5 atg aag gtg agc aca aca gct ctg gct gtg ctg ctg tgt acc atg acc 48 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 ctg tgc aac cag gtg ttc tct gcc cct tat gga gca gat acc cct aca 96 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcc tgc tgt ttc agc tac agc agg aag atc ccc agg cag ttc att gtg 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 gac tac ttt gag acc agc agc ctg tgt tct cag cct ggg gtg atc ttt 192 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 ctg acc aag agg aac agg cag atc tgt gca gac agc aag gag aca tgg 240 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 gtg cag gag tac atc aca gac ctg gag ctg aat gcc tag 279 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 6 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-0CpG(murine MIP1alpha gene with 0 CpG dinucleotide) <400> 6 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 7 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-2CpG(murine MIP1alpha gene with 2 CpG dinucleotides) <220> <221> CDS <222> (1)..(279) <400> 7 atg aag gtg agc aca aca gct ctg gcc gtg ctg ctg tgt acc atg acc 48 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 ctg tgc aac cag gtg ttc tct gcc cct tat gga gca gat acc cct aca 96 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcc tgc tgt ttc agc tac agc agg aag atc ccc agg cag ttc atc gtg 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 gac tac ttt gag acc agc agc ctg tgt tct cag cct ggg gtg atc ttt 192 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 ctg acc aag agg aac agg cag atc tgt gca gac agc aag gag aca tgg 240 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 gtg cag gag tac atc aca gac ctg gag ctg aat gcc tag 279 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 8 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-2CpG(murine MIP1alpha gene with 2 CpG dinucleotides) <400> 8 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 9 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-4CpG(murine MIP1alpha gene with 4 CpG dinucleotides) <220> <221> CDS <222> (1)..(279) <400> 9 atg aag gtg agc aca aca gct ctg gcc gtg ctg ctg tgt acc atg acc 48 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 ctg tgc aac cag gtg ttc tct gcc cct tac gga gca gat acc cct aca 96 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcc tgc tgt ttc agc tac agc agg aag atc ccc agg cag ttc atc gtg 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 gac tac ttt gag acc agc agc ctg tgt tct cag cct ggg gtg atc ttt 192 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 ctg acc aag agg aac cgc cag atc tgt gca gac agc aag gag aca tgg 240 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 gtg cag gag tac atc aca gac ctg gag ctg aat gcc tag 279 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 10 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-4CpG(murine MIP1alpha gene with 4 CpG dinucleotides) <400> 10 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 11 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-13CpG(murine MIP1alpha gene with 13 CpG dinucleotides) <220> <221> CDS <222> (1)..(279) <400> 11 atg aag gtg agc acc aca gct ctg gct gtg ctg ctg tgc acc atg acc 48 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 ctg tgc aac cag gtg ttc agc gct cct tac ggc gcc gat acc cct aca 96 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcc tgc tgc ttc agc tac agc agg aag atc ccc agg cag ttc atc gtg 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 gac tac ttc gag acc agc agc ctg tgt tct cag ccc ggc gtg atc ttc 192 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 ctg acc aag cgg aac aga cag atc tgc gcc gac agc aag gag aca tgg 240 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 gtg cag gag tac atc acc gac ctg gag ctg aac gcc tag 279 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 12 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-13CpG(murine MIP1alpha gene with 13 CpG dinucleotides) <400> 12 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 13 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-42CpG(murine MIP1alpha gene with 42 CpG dinucleotides) <220> <221> CDS <222> (1)..(279) <400> 13 atg aag gtg tcg acg acc gcg ctc gcc gtg ctg ctg tgc acg atg acg 48 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 ctg tgc aac cag gtg ttc agc gcc ccg tac ggc gcc gac acg ccg acc 96 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcg tgc tgc ttc tcg tac tcg cgg aag atc ccg cgg cag ttc atc gtc 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 gac tac ttc gaa acg tcg tcg ctg tgc tcg cag ccc ggc gtg atc ttc 192 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 ctc acg aag cgg aac cgg cag atc tgc gcc gac tcg aag gaa acg tgg 240 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 gtg cag gag tac atc acc gac ctc gaa ctg aac gcg tag 279 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 14 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: murine MIP1alpha-42CpG(murine MIP1alpha gene with 42 CpG dinucleotides) <400> 14 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 15 <211> 279 <212> DNA <213> Murine <220> <223> Murine MIP1alpha wild-type with 7 CpG dinucleotides <220> <221> CDS <222> (1)..(279) <400> 15 atg aag gtc tcc acc act gcc ctt gct gtt ctt ctc tgt acc atg aca 48 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 ctc tgc aac caa gtc ttc tca gcg cca tat gga gct gac acc ccg act 96 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcc tgc tgc ttc tcc tac agc cgg aag att cca cgc caa ttc atc gtt 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 gac tat ttt gaa acc agc agc ctt tgc tcc cag cca ggt gtc att ttc 192 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 ctg act aag aga aac cgg cag atc tgc gct gac tcc aaa gag acc tgg 240 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 gtc caa gaa tac atc act gac ctg gaa ctg aat gcc tag 279 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 16 <211> 92 <212> PRT <213> Murine <223> Murine MIP1alpha wild-type with 7 CpG dinucleotides <400> 16 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 17 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: human MIP1alpha-43CpG(human MIP1alpha gene with 43 CpG) <220> <221> CDS <222> (1)..(282) <400> 17 atg caa gtg tcg acc gcc gct ctc gcc gtg ctg ctg tgc acg atg gcg 48 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 ctg tgc aac caa gtg ctg agc gcg cct ctc gcc gcc gac acg ccg acc 96 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcg tgc tgc ttc tcg tac acg tcg cgg cag atc ccg cag aac ttc atc 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 gcc gac tac ttc gag acg tcg tcg cag tgc tcg aag ccg agc gtg atc 192 Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile 50 55 60 ttc ctg acg aag cgc gga cgg caa gtg tgc gcc gac ccg agc gag gag 240 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80 tgg gtg cag aag tac gtg agc gac ctc gaa ctg agc gcg tag 282 Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90 <210> 18 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: human MIP1alpha-43CpG(human MIP1alpha gene with 43 CpG) <400> 18 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80 Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90 <210> 19 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic gene <220> <223> human GM-CSF-63CpG <220> <221> CDS <222> (1)..(435) <400> 19 atg tgg ctg cag tcg ctg ctg ctg ctc gga acc gtc gcg tgt tcg atc 48 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 agc gcg cct gcg cgg tcg ccg tcg ccg tcg acg cag ccg tgg gag cac 96 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 gtg aac gcg atc cag gag gcg cga cgg ctg ctg aac ctg tcg cgc gat 144 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 aca gcc gcc gag atg aac gag acc gtc gag gtg atc agc gag atg ttc 192 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 gac ctg cag gag ccg acg tgc ctg cag acg cgg ctc gaa ctg tat aag 240 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 cag ggc ctc cgc ggc tcg ctc acg aag ctg aag ggc ccg ctc acg atg 288 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 atg gcg tcg cac tac aag cag cac tgc ccg ccg acg ccc gaa acg tcg 336 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 tgc gcg acg cag atc atc acg ttc gag tcg ttc aag gag aac ctg aag 384 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 gac ttc ctg ctc gtg atc ccg ttc gat tgc tgg gag ccc gtg cag gag 432 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 tag 435 145 <210> 20 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> human GM-CSF-63CpG <400> 20 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 21 <211> 282 <212> DNA <213> human <220> <223> human MIP1alpha gene wild-type (8CpG) <220> <221> CDS <222> (1)..(282) <400> 21 atg cag gtc tcc act gct gcc ctt gcc gtc ctc ctc tgc acc atg gct 48 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 ctc tgc aac cag gtc ctc tct gca cca ctt gct gct gac acg ccg acc 96 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 gcc tgc tgc ttc agc tac acc tcc cga cag att cca cag aat ttc ata 144 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 gct gac tac ttt gag acg agc agc cag tgc tcc aag ccc agt gtc atc 192 Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile 50 55 60 ttc cta acc aag aga ggc cgg cag gtc tgt gct gac ccc agt gag gag 240 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80 tgg gtc cag aaa tac gtc agt gac ctg gag ctg agt gcc tag 282 Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90 <210> 22 <211> 93 <212> PRT <213> human <223> human MIP1alpha gene wild-type (8CpG) <400> 22 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80 Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90 <210> 23 <211> 435 <212> DNA <213> human <220> <223> human GM-CSF gene wild-type (10 CpG) <220> <221> CDS <222> (1)..(435) <400> 23 atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc act gtg gcc tgc agc atc 48 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc acg cag ccc tgg gag cat 96 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctg agt aga gac 144 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gaa atg ttt 192 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gag ctg tac aag 240 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg acc atg 288 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa act tcc 336 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac ctg aag 384 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc cag gag 432 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 tag 435 145 <210> 24 <211> 144 <212> PRT <213> human <223> human GM-CSF gene wild-type (10 CpG) <400> 24 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 25 <211> 3034 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence:p smallsyn vector <400> 25 atcgatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 60 ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120 gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 180 caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 240 cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 300 ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 360 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 420 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 480 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 540 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 600 taactagaga acccactgct tactggctta tctaaattaa tacgactcac tatagggaga 660 cccaagctgt taagcttggt agatatcagg gatccactca gctgatcagc ctccagttta 720 aacctgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 780 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 840 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 900 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc cgggtagtga 960 attcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 1020 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 1080 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 1140 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 1200 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 1260 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 1320 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 1380 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 1440 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 1500 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 1560 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 1620 tttgatcttt tctacgggag atctgtctga ctctcagtgg aaccaaaact catgttaagg 1680 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 1740 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacaggt taacttacca 1800 atgcttaatc aatgaggcac caatctctgc aatctgccta tttctctcat ccatggttgc 1860 ctgactgcct gtggtgtaga taactacaat cctggagggc ttaccatctg gccccagtgc 1920 tgcaatgata cctctagacc ctctctcacc tgctccagat ttatctgcaa tgaaccagcc 1980 agctggaagg gcagacctca gaagtggtcc tgcaacttta tctgcctcca tccagtctat 2040 taattgttgt ctggaagcta gagtaagcag ttcaccagtt aatagtttcc tcaaggttgt 2100 tgccattgct acaggcatgg tggtgtccct ctcatcattt ggtatggctt cattcagctc 2160 tggttcccat ctatcaagcc tagttacatg atcacccatg ttgtgcaaaa aagcagtcaa 2220 ctcctttggt cctccaatgg ttgtcaaaag taagttggca gcagtgttat cactcatggt 2280 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatct gtaagatgct tttctgtgac 2340 tggactgtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatt cttctaccca gttgctcttg 2400 cccagcatca attctggata atactgcacc acatagcaga actttaaagg tgctcatcat 2460 tggaaatctt tcttctggtc taaaactctc aaggatctta ccagagttga gatccagttc 2520 aatgtaaccc actcttgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagggtttc 2580 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaaggc agcaaaaaag ggaataaggg caactctgaa 2640 atgttgaata ctcatagtac tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 2700 ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 2760 atgcattcag ctcacatttc cctgaaaagt gccacctgaa attgactgat agggagttct 2820 cccaatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgcctcata gttaagccag 2880 tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc actgagtagt gggctagcaa aatttaagct 2940 acaacaaggc aaggcttgac ctacaattgc atgaagaatc tgcttagggt taggcctttt 3000 gcactgcttg gagatgtact ggccagatat acta 3034 <210> 26 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: p24 delta CpG gene(HIV-1 plasmid p24 (capsid protein) gene with depleted CpG dinucleotides) <220> <221> CDS <222> (1)..(696) <400> 26 atg gtg cac cag gcc atc agc ccc agg acc ctg aat gcc tgg gtg aag 48 Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys 1 5 10 15 gtg gtg gag gag aag gcc ttc agc cct gag gtg atc ccc atg ttc tct 96 Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser 20 25 30 gcc ctg tct gag ggg gcc acc ccc cag gac ctg aac acc atg ctg aac 144 Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn 35 40 45 aca gtg ggg ggc cac cag gct gcc atg cag atg ctg aag gaa acc atc 192 Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile 50 55 60 aat gag gag gct gct gag tgg gac aga gtg cac cct gtg cat gct ggc 240 Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly 65 70 75 80 ccc att gcc cct ggc cag atg agg gag ccc agg ggc tct gac att gct 288 Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala 85 90 95 ggc acc acc tcc acc ctg cag gag cag att ggc tgg atg acc aac aac 336 Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn 100 105 110 ccc ccc atc cct gtg ggg gag atc tac aag aga tgg atc atc ctg ggc 384 Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly 115 120 125 ctg aac aag att gtg agg atg tac agc ccc acc tcc atc ctg gac atc 432 Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile 130 135 140 agg cag ggc ccc aag gag ccc ttc agg gac tat gtg gac agg ttc tac 480 Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr 145 150 155 160 aag acc ctg agg gct gag cag gcc agc cag gag gtg aag aac tgg atg 528 Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met 165 170 175 aca gag acc ctg ctg gtg cag aat gcc aac cct gac tgc aag acc atc 576 Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile 180 185 190 ctg aag gcc ctg ggc cca gct gcc acc ctg gag gag atg atg aca gcc 624 Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala 195 200 205 tgc cag ggg gtg gga ggc cct ggc cac aag gcc agg gtg ctg taa 669 Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu 210 215 220 <210> 27 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Description of the artificial sequence: p24 delta CpG gene(HIV-1 plasmid p24 (capsid protein) gene with depleted CpG dinucleotides) <400> 27 Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys 1 5 10 15 Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser 20 25 30 Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn 35 40 45 Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile 50 55 60 Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly 65 70 75 80 Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala 85 90 95 Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn 100 105 110 Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly 115 120 125 Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile 130 135 140 Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met 165 170 175 Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile 180 185 190 Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala 195 200 205 Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu 210 215 220 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer huGFP-1 <400> 28 caataagctt gccaccatgg tgagcaaggg cgag 34 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer huGFP-2 <400> 29 agtaggatcc tattacttgt acagctcgt 29 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer RT-oligo1 <400> 30 ccctgaagtt catctgcacc 20 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer oligo2 <400> 31 gatcttgaag ttcaccttga tg 22 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer mamip-1 <400> 32 caggtaccaa gcttatgaag gtctccacca ctgc 34 <210> 33 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer mamip-2 <400> 33 cagagctcga gtcatgaaga ctaggcattc agttccaggt cag 43 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer hugm-1 <400> 34 caggtaccaa gcttatgtgg ctgcagagcc tgc 33 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer hugm-2 <400> 35 cagagctcga gtcatgaaga ctactcctgg actggctccc agc 43 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer humip-1 <400> 36 cagtaccaag cttatgcagg tctccactgc tgc 33 <210> 37 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer humip-2 <400> 37 cagagctcga gtcatgaaga ctaggcactc agctccaggt cactg 45 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer p24-1 <400> 38 actaggtacc atctaagctt atgcccatcg tgcagaacat cca 43 <210> 39 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer p24-2 <400> 39 tcaagagctc gactggatcc tattacagca ccctggcctt gtggc 45 <210> 40 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer CMV-1 <400> 40 caaaggtacc gttaatcgat gttgacattg attattgact a 41 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer CMV-2 <400> 41 gaatgagctc tgcttatata gacc 24 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer ori-1 <400> 42 gtcacccggg tagtgaattc atgtgagcaa aaggc 35 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer ori-2 <400> 43 gatcttttct acgggagatc tgtcaatcga tagct 35 <210> 44 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer pa-1 <400> 44 gttagagctc cagtgtttaa acctgtgcct tctagttgcc ag 42 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer pa-2 <400> 45 caaacctacc gatacccggg ccatagagcc caccgcatc 39 <210> 46 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer ref-del-1 <400> 46 tcagatgcat ccgtacgtta acatgtgagc aaaaggccag ca 42 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer ref-del-2 <400> 47 agtcatgcat ccatagagcc caccgcatcc cca 33 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:primer 5`-3 <220> <223> huil-1 <400> 48 caggtaccaa gcttatgaga atttcgaaac cac 33 <210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence :primer 5`-3 <220> <223> huil-2 <400> 49 cagagctcga gtcatgaaga ctaagaagtg ttgatgaaca tttgg 45 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:primer 5`-3 <220> <223> magm-1 <400> 50 caggtaccaa gcttatggcc cacgagagaa aggc 34 <210> 51 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:primer 5`-3 <220> <223> magm-2 <400> 51 cagagctcga gtcatgaaga ctatttttgg cctggttttt tgc 43 <210> 52 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthetic gene <220> <223> human IL-15-21CpG <220> <221> CDS <222> (1)..(489) <400> 52 atg cgg atc agc aag ccc cac ctg agg agc atc agc atc cag tgc tac 48 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 ctg tgc ctg ctg ctg aac agc cac ttc ctg aca gag gcc ggc atc cac 96 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 gtg ttt atc ctg ggc tgc ttc tct gcc ggc ctg cct aag aca gag gcc 144 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 aac tgg gtg aac gtg atc agc gac ctg aag aag atc gag gac ctg atc 192 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 cag agc atg cac atc gac gcc acc ctg tac aca gag agc gac gtg cac 240 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 cct agc tgt aag gtg acc gcc atg aag tgc ttc ctg ctg gag ctg cag 288 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 gtg atc agc ctg gag agc ggc gat gcc agc atc cac gac acc gtg gag 336 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 aac ctg atc atc ctg gcc aac aac agc ctg agc agc aac ggc aat gtg 384 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 acc gag agc ggc tgc aag gag tgt gag gag ctg gag gag aag aac atc 432 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 aag gag ttc ctg cag agc ttc gtg cac atc gtg cag atg ttc atc aac 480 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 acc agc tag 489 Thr Ser <210> 53 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> human IL-15-21CpG <400> 53 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 54 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthetic gene <220> <223> murine GM-CSF-62CpG <220> <221> CDS <222> (1)..(426) <400> 54 atg tgg ctg cag aac ctg ctg ttc ctc ggc atc gtc gtg tac tcg ctg 48 Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu 1 5 10 15 agc gcg ccg acg cgc tcg ccg atc acc gtg acg cgg ccg tgg aag cac 96 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 20 25 30 gtc gag gcg atc aag gag gcg ctg aac ctg ctc gac gac atg ccc gtg 144 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 35 40 45 acg ctg aac gag gag gtc gag gtc gtg tcg aac gag ttc tcg ttc aag 192 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys 50 55 60 aag ctg acg tgc gtg cag acg cgg ctg aag atc ttc gag cag ggc ctg 240 Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 65 70 75 80 cgc ggc aac ttc acg aag ctg aag ggc gcg ctg aac atg acc gcg tcg 288 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 85 90 95 tac tac cag acg tac tgc ccg ccg acg ccc gag acc gat tgc gag acg 336 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 100 105 110 cag gtg acg acg tac gcc gac ttc atc gac tcg ctg aag acg ttc ctg 384 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 115 120 125 acc gac atc ccg ttc gag tgc aag aag ccc ggc cag aag tag 426 Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys 130 135 140 <210> 55 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> murine GM-CSF-62CpG <400> 55 Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 20 25 30 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 35 40 45 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys 50 55 60 Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 65 70 75 80 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 85 90 95 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 100 105 110 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 115 120 125 Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys 130 135 140 <210> 56 <211> 489 <212> DNA <213> human <220> <223> human IL-15 wild-type (3CpG) <220> <221> CDS <222> (1)..(489) <400> 56 atg aga att tcg aaa cca cat ttg aga agt att tcc atc cag tgc tac 48 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 ttg tgt tta ctt cta aac agt cat ttt cta act gaa gct ggc att cat 96 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 gtc ttc att ttg ggc tgt ttc agt gca ggg ctt cct aaa aca gaa gcc 144 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 aac tgg gtg aat gta ata agt gat ttg aaa aaa att gaa gat ctt att 192 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 caa tct atg cat att gat gct act tta tat acg gaa agt gat gtt cac 240 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 ccc agt tgc aaa gta aca gca atg aag tgc ttt ctc ttg gag tta caa 288 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 gtt att tca ctt gag tcc gga gat gca agt att cat gat aca gta gaa 336 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 aat ctg atc atc cta gca aac aac agt ttg tct tct aat ggg aat gta 384 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 aca gaa tct gga tgc aaa gaa tgt gag gaa ctg gag gaa aaa aat att 432 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 aaa gaa ttt ttg cag agt ttt gta cat att gtc caa atg ttc atc aac 480 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 act tct tag 489 Thr Ser <210> 57 <211> 162 <212> PRT <213> human <223> human IL-15 wild type (3CpG) <400> 57 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 58 <211> 426 <212> DNA <213> murine <220> <223> murine GM-CSF wild type (11 CpG) <220> <221> CDS <222> (1)..(426) <400> 58 atg tgg ctg cag aat tta ctt ttc ctg ggc att gtg gtc tac agc ctc 48 Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu 1 5 10 15 tca gca ccc acc cgc tca ccc atc act gtc acc cgg cct tgg aag cat 96 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 20 25 30 gta gag gcc atc aaa gaa gcc ctg aac ctc ctg gat gac atg cct gtc 144 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 35 40 45 aca ttg aat gaa gag gta gaa gtc gtc tct aac gag ttc tcc ttc aag 192 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys 50 55 60 aag cta aca tgt gtg cag acc cgc ctg aag ata ttc gag cag ggt cta 240 Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 65 70 75 80 cgg ggc aat ttc acc aaa ctc aag ggc gcc ttg aac atg aca gcc agc 288 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 85 90 95 tac tac cag aca tac tgc ccc cca act ccg gaa acg gac tgt gaa aca 336 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 100 105 110 caa gtt acc acc tat gcg gat ttc ata gac agc ctt aaa acc ttt ctg 384 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 115 120 125 act gat atc ccc ttt gaa tgc aaa aaa cca ggc caa aaa tag 426 Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys 130 135 140 <210> 59 <211> 141 <212> PRT <213> murine <223> murine GM-CSF wild-type (11 CpG) <400> 59 Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 20 25 30 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 35 40 45 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys 50 55 60 Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 65 70 75 80 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 85 90 95 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 100 105 110 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 115 120 125 Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys 130 135 140

Claims (42)

  1. 유전자 발현의 표적화된 조절 방법으로서:
    (i) 발현될 표적 핵산 서열을 제공하는 단계,
    (ii) 유전자 발현을 증가시키기 위해 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)을 이용하여 상기 표적 핵산 서열에 존재하는 CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가시키거나, 또는 유전자 발현을 감소시키기 위해 CpG 디뉴클레오티드의 수를 감소시키는 것인, 상기 표적 핵산 서열을 변형하는 단계,
    (iii) 적합한 전사 조절 서열과 작동적으로 결합된 적합한 발현 벡터에서 변형된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 상기 변형된 표적 핵산 서열을 클로닝하는 단계,
    (iv) 적합한 발현 시스템에서 상기 변형된 표적 핵산서열을 발현시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (ii)에서, 상기 표적 핵산 서열의 변형은 CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가 또는 감소시키는 것 외에, 하나 이상의 추가적인 변형이 핵산 수준에서 일어나도록 수행되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 수준에서의 추가적인 변형은 코돈 선택의 변형, RNA 이차 구조-안정화 서열, 증가된 자가-상동성(self-homology)을 갖는 영역, 천 연 유전자에 대해 증가된 상동성을 갖는 영역, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열(adenine-rich sequence), 엔도뉴클레아제 인식 부위의 삽입 또는 제거로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 디뉴클레오티드의 수를 증가 또는 감소시키는 것에 의한 상기 표적 핵산 서열의 변형은 상기 발현 시스템에 대해 최적화된 코돈 선택을 고려하여 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 디뉴클레오티드의 수의 변형은 포유동물에 대해 최적화된 코돈 선택을 고려하여 수행되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 발현이 증가되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 발현이 감소되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현될 표적 핵산 서열은 상기 발현 시스템에 대해 이종기원인(heterologous) 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 또는 원핵생물 발현 시스템이 상기 발현 시스템으로서 이용되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시스템으로서, 세균, 효모, 단일 세포, 기생 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 인간 세포 및 체세포로 구성된 군으로부터 선택되는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포 또는 세포-불포함 환경이 이용되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현될 표적 핵산 서열은 진핵생물, 원핵생물, 바이러스 기원 또는 합성 기원인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 낮은 메틸화 시스템이 발현 시스템으로서 이용되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 표적 핵산 서열 및 상기 전사 조절 서열은 CpG 섬과 관련되지 않는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 디뉴클레오티드의 수는 2개 이상 증가 또는 감소되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 디뉴클레오티드의 수는 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상 증가 또는 감소되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여 모든 CpG 디뉴클레오티드가 제거되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 RNA, 그의 유도체 또는 모방체(mimetic), 펩티드, 또는 폴리펩티드, 변형된 펩티드 또는 폴리펩티드, 단백질 또는 변형된 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 치료용 및/또는 진단용 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 인간 단백질, 기생성(parasitic) 단백질, 바이러스 단백질, 또는 세균 단백질, 효소, 호르몬, 백신, 메신저 물질 및 조절자 단백질로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것이 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 아스파라기나아제, 아 데노신 디아미나아제, 인슐린, tPA, 응고 인자, 비타민 L 에폭시드 리덕타아제, 에리트로포이에틴, 여포-자극 호르몬, 에스트로겐, 골형성 단백질, 항트롬빈, HIV-, HBV-, HCV-, 인플루엔자-, 보렐리아-, 헤모필루스-, 메닌고콕코스-, 안트락스-유래 단백질, 보툴리누스 독소, 디프테리아 독소, 테타누스 독소, 플라스모디움 단백질, 혈액형 항원, HLA 단백질, 사이토카인, 케모카인, G-CSF, GM-CSF, 인터루킨, 인터페론, PDGF, TNF, RANTES, MiP1α 및 전사 인자로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 기능성 RNA를 코딩하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 siRNA, 리보자임, 안티센스-RNA 또는 디코이(decoy)인 것인 방법.
  23. 야생형 서열로부터 유래되고, 발현 시스템에서 발현될 수 있는 전사가 가능한 영역을 갖는 변형된 핵산으로서, 상기 전사가 가능한 영역은 상기 이용된 발현 시스템에 대해 코돈-최적화되고, 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여, 상기 야생형 서열로부터 유래된 상기 코돈-최적화된 서열에 비해 CpG 디뉴클레오티드의 수가 증가되도록 변형된 것인 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 상기 CpG 디뉴클레오티드의 수는 상기 야생형 서열에 비해 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 특히 바람직하게는 100% 이상, 보다 특별하게 바람직하게는 200% 이상, 특히 5배(a factor of 5) 및 가장 바람직하게는 10 배 이상 증가된 것인 핵산.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 핵산은 CpG 섬과 관련되지 않는 것인 핵산.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 26, 52 및 54로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 핵산.
  27. 적합한 전사 조절 서열과 작동적으로 결합된 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 상기 전사 조절 서열은 프로모터를 포함하는 것인 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 활성 프로모터(constitutively active promoter)인 것인 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 구성적 활성 프로모터는 CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터 및 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터로부터 선택되는 것인 벡터.
  31. 제28항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인 것인 벡터.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 테트라사이클린-의존성 프로모터인 것인 벡터.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CpG 섬과 관련되지 않는 것인 벡터.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터에 존재하고 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 핵산과 상이한 서열 또는 그의 일부는 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 것인 벡터.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 핵산과 상이한 서열 또는 그의 일부는 약 25%, 바람직하게는 50%, 보다 바람직하게는 75% 및 가장 특별히 바람직하게는 100% 만큼 감소된 CpG 디뉴클레오티드의 수를 갖는 것인 벡터.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 25에 표시된 핵산 서열을 갖는 것인 벡터.
  37. 제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포.
  38. a) 야생형 서열로부터 유래된, 전사가 가능한 영역을 갖는 변형된 핵산 서열로서, 상기 변형된 핵산 서열은 상기 야생형 서열에 비해 증가 또는 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 가지며, 전사 제어 서열과 작동적으로 결합된 것인 변형된 핵산 서열, 및
    b) 상기 a)가 발현될 수 있는, 세포 및 세포-불포함 발현 환경으로부터 선택된 발현 환경으로서, 증가된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 변형된 핵산 서열의 발현의 경우, 상기 발현 시스템은 증가된 발현을 보이고, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 변형된 핵산 서열의 발현의 경우, 감소된 발현을 보이는 것인 발현 환경을 포함하는 것인 발현 시스템.
  39. 활성 구성성분으로서 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및/또는 벡터 및/또는 세포 및/또는 발현 시스템을 포함하는 약제.
  40. 진단용 약제 및/또는 치료용 치료제의 제조를 위한 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및/또는 벡터 및/또는 세포 및/또는 발현 시스템의 용도.
  41. 제40항에 있어서, 유전자 요법 치료제를 위한 것인 용도.
  42. 백신의 제조를 위한 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및/또는 벡터 및/또는 세포 및/또는 발현 시스템의 용도.
KR1020077004967A 2004-08-03 2005-08-03 ＣｐＧ 함량을 변화시키는 것에 의해 유전자 발현을조절하는 방법 KR101222628B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200410037652 DE102004037652B4 (de) 2004-08-03 2004-08-03 Verfahren zur Modulation der Genexpression durch Änderung des CpG Gehalts
DE102004037611A DE102004037611B4 (de) 2004-08-03 2004-08-03 Induzierbare Genexpression
DE102004037611.5 2004-08-03
DE102004037652.2 2004-08-03
PCT/EP2005/008423 WO2006015789A2 (de) 2004-08-03 2005-08-03 Verfahren zur modulation der genexpression durch änderung des cpg gehalts

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070041605A true KR20070041605A (ko) 2007-04-18
KR101222628B1 KR101222628B1 (ko) 2013-01-16

Family

ID=35839637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077004967A KR101222628B1 (ko) 2004-08-03 2005-08-03 ＣｐＧ 함량을 변화시키는 것에 의해 유전자 발현을조절하는 방법

Country Status (14)

Country Link
US (4) US8859275B2 (ko)
EP (1) EP1776460B8 (ko)
JP (1) JP4550115B2 (ko)
KR (1) KR101222628B1 (ko)
AT (1) ATE453716T1 (ko)
AU (1) AU2005270430B2 (ko)
BR (1) BRPI0513081A (ko)
CA (1) CA2575490A1 (ko)
DE (1) DE502005008794D1 (ko)
DK (1) DK1776460T3 (ko)
HK (1) HK1100089A1 (ko)
IL (1) IL180786A (ko)
MX (1) MX2007001292A (ko)
WO (1) WO2006015789A2 (ko)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1776460T3 (da) 2004-08-03 2010-04-12 Geneart Ag Fremgangsmåde til modulering af genekspression ved ændring af CpG-indholdet
US9303080B2 (en) 2006-01-13 2016-04-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Codon optimized IL-15 and IL-15R-alpha genes for expression in mammalian cells
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
WO2008069663A1 (en) 2006-12-07 2008-06-12 Publiekrechtelijke Rechtspersoon Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Leids Universitair Medisch Centrum Use of a varicellovirus tap-inhibitor for the induction of tumor- or virus-specific immunity against teipp
CN101861168B (zh) 2007-05-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 抗-icos抗体及其在治疗肿瘤、移植和自身免疫病中的应用
EP2019134A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-28 Vision 7 GmbH Gene therapy of chronic granulomatous disease
BRPI0814459B1 (pt) 2007-07-26 2023-01-24 Uniqure Ip B.V Método para produzir um vírion parvoviral recombinante em uma célula de inseto, e, construção de ácido nucleico
JP5728389B2 (ja) 2009-01-30 2015-06-03 ユニキュアー アイピー ビー．ブイ． アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ治療薬
WO2011100369A2 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for altering polypeptide expression and solubility
CA2819181C (en) 2010-11-29 2020-03-10 Dako Denmark A/S Methods and systems for analyzing images of specimens processed by a programmable quantitative assay
DE102010056289A1 (de) 2010-12-24 2012-06-28 Geneart Ag Verfahren zur Herstellung von Leseraster-korrekten Fragment-Bibliotheken
EP2751729B1 (en) 2011-09-01 2020-10-21 Genome Compiler Corporation System for polynucleotide construct design, visualization and transactions to manufacture the same
WO2014153188A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
WO2013049227A2 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Geneart Ag High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
WO2013152220A2 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Life Technologies Corporation Tal-effector assembly platform, customized services, kits and assays
KR102160389B1 (ko) 2013-08-05 2020-09-28 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
RU2016109938A (ru) * 2013-08-21 2017-09-26 Куревак Аг Композиция и вакцина для лечения рака предстательной железы
EP3035955B1 (en) * 2013-08-21 2019-09-11 CureVac AG Composition and vaccine for treating lung cancer
EP4043032A1 (en) * 2013-08-21 2022-08-17 CureVac AG Rabies vaccine
KR20160044566A (ko) 2013-08-21 2016-04-25 큐어백 아게 호흡기 세포융합 바이러스
EA037217B1 (ru) * 2013-08-21 2021-02-20 Куревак Аг Композиция и вакцина для лечения рака легких
BR112016001192A2 (pt) 2013-08-21 2017-08-29 Curevac Ag Vacina contra a raiva
EP3035960B1 (en) * 2013-08-21 2019-07-03 CureVac AG Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
EP3218508A4 (en) * 2014-11-10 2018-04-18 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
EP3229959B1 (en) 2014-12-09 2019-05-15 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
DK3294885T3 (da) 2015-05-08 2020-08-10 Curevac Real Estate Gmbh Fremgangsmåde til at fremstille rna
PT3303583T (pt) 2015-05-29 2020-07-07 Curevac Ag Um método para produção e purificação de rna, compreendendendo pelo menos um passo de filtração por fluxo tangencial
EP3350314A4 (en) 2015-09-18 2019-02-06 Twist Bioscience Corporation BANKS OF OLIGONUCLEIC ACID VARIANTS AND SYNTHESIS THEREOF
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
CN115920796A (zh) 2015-12-01 2023-04-07 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
CA3034769A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized nucleic acid libraries
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
WO2018087276A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Or10h1 modulators and uses thereof
GB2573069A (en) 2016-12-16 2019-10-23 Twist Bioscience Corp Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
US10894959B2 (en) 2017-03-15 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018195339A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immune cells expressing engineered antigen receptors
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
AU2018284227B2 (en) 2017-06-12 2024-05-02 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
CN111566125A (zh) 2017-09-11 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 Gpcr结合蛋白及其合成
GB2583590A (en) 2017-10-20 2020-11-04 Twist Bioscience Corp Heated nanowells for polynucleotide synthesis
AU2019205269A1 (en) 2018-01-04 2020-07-30 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage
EP3508499A1 (en) 2018-01-08 2019-07-10 iOmx Therapeutics AG Antibodies targeting, and other modulators of, an immunoglobulin gene associated with resistance against anti-tumour immune responses, and uses thereof
US20210163922A1 (en) 2018-03-19 2021-06-03 Modernatx, Inc. Assembly and error reduction of synthetic genes from oligonucleotides
CN112639130B (zh) 2018-05-18 2024-08-09 特韦斯特生物科学公司 用于核酸杂交的多核苷酸、试剂和方法
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
JP2022522668A (ja) 2019-02-26 2022-04-20 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 抗体を最適化するための変異体核酸ライブラリ
WO2020176678A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor
CA3144644A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
AU2020300519A1 (en) * 2019-06-30 2022-02-24 John Fraser Wright Recombinant AAV vectors with altered immunogencity and methods of making the same
EP3994171A1 (en) 2019-07-05 2022-05-11 iOmx Therapeutics AG Antibodies binding igc2 of igsf11 (vsig3) and uses thereof
AU2020356471A1 (en) 2019-09-23 2022-04-21 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for CRTH2
EP3822288A1 (en) 2019-11-18 2021-05-19 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
EP4175668A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 iOmx Therapeutics AG Antibodies binding igv of igsf11 (vsig3) and uses thereof
CA3186830A1 (en) * 2020-07-21 2022-01-27 Zhongdong SHI Composition and method for treating eye diseases
EP3992205A1 (en) 2020-11-03 2022-05-04 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Sars coronavirus-2 spike protein binding compounds
JP2023547507A (ja) 2020-11-03 2023-11-10 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ 標的細胞限定的で共刺激性の二重特異性かつ２価の抗ｃｄ２８抗体
WO2022106205A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Corona virus spike protein binding compounds
US20240174768A1 (en) 2021-03-03 2024-05-30 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Bispecific antibodies enhancing cell mediated immune responses
EP4384628A2 (en) * 2021-08-11 2024-06-19 Solid Biosciences Inc. Treatment of muscular dystrophy
CN118077011A (zh) * 2022-09-30 2024-05-24 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种降低外源核酸免疫原性的密码子优化
WO2024133940A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Iomx Therapeutics Ag Cross-specific antigen binding proteins (abp) targeting leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily b1 (lilrb1) and lilrb2, combinations and uses thereof

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050131267A1 (en) * 1995-06-07 2005-06-16 Talmadge Karen D. System and method for delivering a therapeutic agent for bone disease
DE69838294T2 (de) * 1997-05-20 2009-08-13 Ottawa Health Research Institute, Ottawa Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten
AP1775A (en) * 1999-09-25 2007-08-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
ATE319814T1 (de) 2000-03-15 2006-03-15 Prolume Ltd Luciferase, fluoreszenzproteine, für luciferase und fluoreszenzproteine kodierend nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose, hoch- durchsatz screeningsverfahren
EP1156112B1 (en) * 2000-05-18 2006-03-01 Geneart GmbH Synthetic gagpol genes and their uses
US6919204B2 (en) * 2000-09-29 2005-07-19 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of gene expression using localization domains
DE10053781B4 (de) 2000-10-30 2008-07-03 Geneart Ag Kernexportreportersystem
JP2005500019A (ja) 2001-04-05 2005-01-06 エムエル ラボラトリーズ ピーエルシー 改良された遺伝子発現
WO2002099105A2 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Cellectis Methods for modifying the cpg content of polynucleotides
US7605138B2 (en) * 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7316925B2 (en) * 2002-07-16 2008-01-08 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Codon optimized synthetic plasmids
DE10260805A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
WO2005114106A1 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Northrop Grumman Corporation System and method for aligning multiple navignation components
DK1776460T3 (da) * 2004-08-03 2010-04-12 Geneart Ag Fremgangsmåde til modulering af genekspression ved ændring af CpG-indholdet
DE102004037611B4 (de) * 2004-08-03 2013-10-02 Geneart Ag Induzierbare Genexpression
DE102007052344B3 (de) * 2007-11-02 2009-03-12 Geneart Ag Selektion kodierender Nukleinsäure-Konstrukte auf Abwesenheit von Frameshift-Mutationen
EP2970965A2 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Pronai Therapeutics, Inc. Dnai for the modulation of genes

Also Published As

Publication number Publication date
EP1776460A2 (de) 2007-04-25
JP4550115B2 (ja) 2010-09-22
US8859275B2 (en) 2014-10-14
ATE453716T1 (de) 2010-01-15
EP1776460B2 (de) 2013-12-25
US20090324546A1 (en) 2009-12-31
IL180786A (en) 2013-08-29
US20190270999A1 (en) 2019-09-05
US10273486B2 (en) 2019-04-30
US20150104832A1 (en) 2015-04-16
DE502005008794D1 (de) 2010-02-11
IL180786A0 (en) 2007-06-03
MX2007001292A (es) 2007-07-04
KR101222628B1 (ko) 2013-01-16
WO2006015789A3 (de) 2006-06-01
US20210155940A1 (en) 2021-05-27
DK1776460T3 (da) 2010-04-12
EP1776460B8 (de) 2014-02-26
HK1100089A1 (en) 2007-09-07
BRPI0513081A (pt) 2008-04-22
AU2005270430B2 (en) 2008-06-12
EP1776460B1 (de) 2009-12-30
CA2575490A1 (en) 2006-02-16
WO2006015789A2 (de) 2006-02-16
AU2005270430A1 (en) 2006-02-16
JP2008507986A (ja) 2008-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101222628B1 (ko) ＣｐＧ 함량을 변화시키는 것에 의해 유전자 발현을조절하는 방법
CN101035899B (zh) 通过改变CpG含量来调节基因表达的方法
AU711882B2 (en) Chimeric kanamycin resistance gene
DK2864489T3 (en) LOCATION-SPECIFIC INTEGRATION
EP1859046B1 (en) Expression vector for animal cell comprising at least one copy of mar dna sequences at the 3&#39;terminal of transcription termination region of a gene and method for the expression of foreign gene using the vector
JP6688297B2 (ja) サイトメガロウイルス抗原を発現する哺乳動物細胞
EP0378382B1 (en) Recombinant DNA method and host cells
KR101841350B1 (ko) 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달 복합체
US8642045B2 (en) Recombinant virus vector originating in HHV-6 or HHV-7, method of producing the same, method of transforming host cell using the same, host cell transformed thereby and gene therapy method using the same
EP2138580B1 (en) Vector for gene therapy
KR20230031929A (ko) 고릴라 아데노바이러스 핵산 서열 및 아미노산 서열, 이들을 함유하는 벡터, 및 이의 용도
CN113699186A (zh) 基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用
KR20060135830A (ko) 경미한 저온에서 유전자의 발현을 촉진시키는 서열
WO2003106658A2 (en) Hybrid vector having a cytomegalovirus enhancer and myeloproliferative sarcoma virus promoter
CN116171326A (zh) 用于基因病症的核酸疗法
CN110964741B (zh) 一种核定位信号fnb及其在提高碱基编辑效率中的应用
CN114045305B (zh) 多转座子系统
AU3871200A (en) Expression of human alpha-fetoprotein in mammalian cells
KR20030079214A (ko) 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 제한된 초기유전자1을 포함하는 발현벡터 및 이를 포함하는 동물 세포주

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151217

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161220

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171219

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181226

Year of fee payment: 7