KR20070036016A - 아질산염-산화 박테리아 및 이를 검출하고 이용하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아질산염-산화 박테리아를 제시한다. 본 발명의 특정 박테리아는 담수 환경, 염수 환경, 또는 둘 모두에서 생존한다. 더 나아가, 다양한 구체예에서, 본 발명의 다양한 박테리아는 냉동 또는 냉동-건조 공정을 견뎌낼 수 있고, 이후에도 여전히 생존한다. 본 발명의 아질산염-산화 박테리아를 이용하여 수성 환경에서 아질산염의 축적을 예방하거나 완화하는 방법을 또한 제시한다. 본 발명의 박테리아를 검출하는 방법을 또한 제시한다. 본 발명의 아질산염-산화 박테리아 및 특히 암모니아-산화 박테리아를 함유하는 조성물을 또한 제시한다.
아질산염-산화 박테리아
Description
관련된 출원
본 출원은 2003년 9월 10일자로 제출된 U.S. 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-284779], 2003년 9월 10일자로 제출된 U.S. 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-284781], 2003년 9월 10일자로 제출된 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-294309], 2003년 9월 10일자로 제출된 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-305694]에 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 전반적으로, 아질산염 산화제, 구체적으로 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 박테리아에 관한다.
암모니아는 담수와 염수에서 경골어류 및 많은 무척추동물의 주요 질소성 폐산물이다. 암모니아는 생물체가 식이를 통하여 흡수하는 단백질의 탈아민화(deamination) 또는 트랜스아민화(transamination)로 발생한다. 하지만, 높은 암모니아 농도는 이들 수생 생물체에 유독할 수 있다. 자연계, 예를 들면, 호수, 강, 대양에서, 암모니아의 농도는 좀처럼 유해 수준에 도달하지 않는데, 그 이유는 수 량(mass of water)당 어류(또는 다른 생물체)의 밀도가 낮기 때문이다.
하지만, 공공과 개인의 인공 수생 체계, 예를 들면, 양식장, 탱크, 수로, 늪, 수족관에서, 암모니아는 때때로, 매우 급속하게 독성 농도에 도달할 수 있다. 이의 한 원인은 상기한 체계에서 어류 밀도가 적은 물의 양에 비하여 매우 높기 때문이다. 다른 원인은 이들 시스템에서 물이 지속적으로 교체되지 않기 때문이다; 오히려, 물은 단지 주기적이고 부분적인 교체에 의해 전체 시스템에 재순환된다.
이런 이유로, 대부분의 양식 체계와 수족관은 수생 생물체의 유지와 성장에 적합한 수질을 유지하기 위하여 한 형태 또는 다른 형태의 여과를 이용한다. 이와 같은 여과 단위의 주요 구성 요소는 생물 필터이다. 생물 필터는 산화에 의해 암모니아를 다른 화합물-아질산염으로 전환시킬 수 있는 박테리아의 성장을 위한 기질 또는 장소로서 기능할 수 있다는 사실로부터 유래된다. 높은 농도의 아질산염 역시 유독할 수 있긴 하지만 생물 필터에서 성장하고 아질산염을 질산염을 전환시키는 다른 박테리아 종, 예를 들면, U.S. 특허 6,268,154, 6,265,206, 6,207,440에 기술된 박테리아 종이 존재한다. 질산염은 극히 높은 농도의 예외적인 경우를 제외하고 수생 생물체에 비-독성인 것으로 간주된다.
생물 필터를 사용하는 다른 상황이나 경우가 존재한다. 여기에는 오수 처리 시설, 폐수 처리 시설, 음용수 여과 시설 등이 포함된다. 이들 각각은 생물 필터를 이용해야 하는 나름의 이유가 있긴 하지만, 목적은 동일하다: 독성 무기 질소 화합물의 덜 유해한 무기 질소성 물질로의 전환. 생물 필터는 여러 시설이 미국의 환경보호국(Environmental Protection Agency, EPA)에 의해 규정된 National Recommended Water Quality Criteria를 준수하는데 필요하다.
암모니아의 아질산염으로의 산화는 암모니아-산화 박테리아(AOB)에 의해 매개되는 과정이다. 구체적으로, 이는 아래의 화학 방정식에 따른 암모니아의 아질산염으로의 전환을 수반하는 2 단계 산화 과정이다:
NH3 + O2 + H2O + 2e- -----> NH2OH + H2O (1)
NH2OH + H2O -----> NO2 - + 5H+ + 4e- (2)
아질산염의 질산염으로의 산화 역시 박테리아-매개된 과정이다. 구체적으로, 이는 아래의 화학 방정식에 따라 아질산염의 질산염으로의 전환을 수반하는 1 단계 산화 과정이다:
NO2 - + H2O -----> NO3 - + 2H+ + 4e- (1)
가장 많이 연구된 아질산염 산화 박테리아(NOB)는 니트로박테르 위노그라디스키(Nitrobacter winogradsky)이다. 이는 토양으로부터 처음 분리되었고, 양식 시설(Wheaton, F. W. 1977. Aquacultural Engineering. John Wiley & Sons, Inc. New York.), 폐수 처리 시설(Painter, H.A. 1986. Vitrification in the treatment of sewage and waste-waters. In Nitrification J. I. Prosser ed. IRL Press. Oxford.), 수족관(Spotte, S. 1979. Seawater Aquariums - The Captive Environment. Wiley Interscience. New York)에서 활성 NOB인 것으로 생각된다. 이들 참고문헌 및 본 명세서에 언급된 다른 모든 참고문헌은 순전히 참조로 한다.
하지만, 생물체의 DNA 서열의 특이성을 이용하는 현대적 분자 방법으로 수행된 최근의 연구에서, 니트로박테르 위노그라디스키(N. winogradsky) 및 이의 가까운 일족은 담수 수족관 환경에서 검출 한계 미만으로 존재하였다(Hovanec, T.A. and E. F. DeLong. 1996. Comparative analysis of nitrifying bacteria associated with freshwater and marine aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 62:2888-2896.). 더 나아가, 연구를 통하여 니트로스피라(Nitrospira) 문(phylum)의 박테리아가 수족관(Hovanec, T.A., L.T. Taylor, A. Blakis and E.F. DeLong. 1998. Nitrospira-like bacteria associated with nitrite oxidation in freshwater aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 64:258-264.) 및 폐수 처리 시설(Burrell, P.C., J. Keller and L.L. Blackall. 1998. Microbiology of a nitrite-oxidizing bioreactor. Appl. Environ. Microbiol. 64:1878-1883.)에서 아질산염의 질산염으로의 산화와 연관하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 담수 수족관에서 질산염 산화와 연관하는 것으로 확인된 상기 니트로스피라((Nitrospira) 분리물은 해수 수족관에서 발견되지 않았다(Hovanec et. al. 1998).
니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)는 1986년 Watson에 의해 처음 발견되었다(Watson, S. W., E. Bock, F. W. Valois, J. B. Waterbury, and U. Schlosser; 1986. Nitrospira marina gen. nov., sp. nov.: A chemolithotrophic nitrite oxidizing bacterium. Archives Microbiology, 144:1-7). 하지만, 이는 자연(토양, 해수, 담수 또는 저수지) 또는 인공 환경(폐수 처리 시설)에서 중요하거나 주도적인 아질산염-산화 생물체로서 간주되지 않았다(Abeliovich, A. 2003. The Nitrite Oxidizing Bacteria. In M. Dworkin et al. Eds. The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community, third edition, release 3.13, March 2003. Springer-Verlag, New York). 2번째 니트로스피라 종(Nitrospira moscoviensis)은 러시아 모스크바에 위치한 한 건물의 난방 장치에서 부분적으로 부식된 철 파이프로부터 분리되었다. 상기 박테리아는 비-해수 배양기에서 39℃에서 최적으로 성장하였다(Abeliovich, A. 2003). 또한, 해수 이동층 반응기(MBB)는 다수의 종속영양 박테리아와 함께, AOB(Nitrosomonas cryotolerans)와 NOB(Nitrospira marina)를 보유하는 것으로 보고되었다(Y. Tal, J.E.M. Watts, S. Schreier, K.R. Sowers and H.J. Schreier, 2003. Characterization of the microbial community and nitrogen transformation process associated with moving bed bioreactors in a closed recirculated mariculture system. Aquaculture 215(2003) 187-202).
수족관 환경과 폐수 처리에서 특히 중요한 환경 인자는 염도(salinity), 더욱 구체적으로, 담수와 염수 환경에서 다양한 물리화학적 차이이다. 국소 환경에서 이런 급격한 변화를 견뎌내는 능력에서 다양한 NOB 간의 구별은 이들 시스템의 설계 및 NOB의 실행에 중요하다. 이와 같이, 염수 환경에 대한 특정 NOB에 의한 입증된 내성으로 인하여, 상기 NOB는 특정 수족관과 염수 환경에 사용하기 적합하다. 게다가, 담수와 염수 환경 사이의 변화를 견뎌내는 능력은 더욱 넓은 적용, 예를 들면, 넓은 담수와 염수 환경에서 특정 NOB의 사용적합성을 가능하게 한다.
더 나아가, 적어도 부분적으로, 여러 NOB 균주가 냉동-건조 공정을 견뎌내지 못함으로 인하여, NOB의 보관과 수송은 액체 배양기 및 유사한 잠재적으로 불편한 배양기에 빈번하게 한정된다. 냉동-건조는 예로써 온도에서 상당한 변동을 견뎌내고, 결과적으로 상업적 산물을 수송하고 취급하며 연장된 반감기를 유지하는데 더욱 실용적인 고체 냉동-건조 분말 또는 유사한 조성물로 NOB 볼륨의 조제를 가능하게 한다.
따라서, 염수 환경 및/또는 염수와 담수 환경 모두를 견뎌낼 수 있는 NOB의 확인이 당분야에서 요구되고 있다. 또한, 냉동-건조 공정이후에도 생존할 수 있는 NOB의 확인이 당분야에서 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명의 한 구체예에서, 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 분리된 박테리아 또는 박테리아 균주를 제시한다. 한 구체예에서, 상기 박테리아 또는 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유한다. SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2에 기술된 뉴클레오티드 서열은 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB의 전형이고, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8에 기술된 뉴클레오티드 서열은 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB의 전형이다. SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2로 대표되는 (Nitrococcus)-유사 NOB는 수탁 번호 PTA-5424로 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁되었다. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB는 수탁 번호 PTA-5422로 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁되었다.
다양한 구체예에서, 상기 박테리아 또는 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ1D NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ1D NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유하는 서열을 포함하는 핵산 서열과 박테리아를 제시한다.
본 명세서에서, “96% 상동한”은 단일 염기 치환이 이들 염기의 최대 4%까지 발생할 수 있음을 의미하고, “97% 상동한”은 단일 염기 치환이 이들 염기의 최대 3%까지 발생할 수 있음을 의미하고, “98% 상동한”은 단일 염기 치환이 이들 염기의 최대 2%까지 발생할 수 있음을 의미하고, “99% 상동한”은 단일 염기 치환이 이들 염기의 최대 1%까지 발생할 수 있음을 의미한다.
또한, 본 발명은 배양기에서 아질산염의 축적을 완화할 수 있는 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 본 발명의 한가지이상의 박테리아 균주를 함유하고, 여기 서 상기 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ1D NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유한다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 개시된 박테리아 또는 박테리아 균주를 냉동-건조하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 상기 박테리아 또는 박테리아 균주를 동결보존제(cryoprotectant)로 처리하고; 이들을 냉동기에 위치시키고; 이들 박테리아 또는 박테리아 균주를 진공 압력하에 건조시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 냉동-건조 방법은 생존능 및 아질산염을 질산염으로 산화시키는 능력을 유지하면서 냉동-건조된 형태로 보관될 수 있는 냉동-건조된 NOB를 생산한다.
또한, 본 발명은 배양기에서 아질산염의 축적을 완화시키는 방법을 제시한다. 상기 방법은 박테리아 균주, 또는 박테리아 균주를 함유하는 조성물의 충분한 양을 배양기에 위치시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ1D NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유한다.
또한, 본 발명은 배양기에서 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 박테 리아의 양을 검출하고 결정하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 본 발명의 검출가능하게 표지된 프로브를 제공하고; 배양기로부터 전체 DNA를 분리하고; 검출가능하게 표지된 프로브가 상기 박테리아의 핵산에만 혼성화되는 조건하에, 분리된 전체 DNA를 상기 프로브에 노출시키고, 여기서 상기 박테리아의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유하고; 혼성화된 프로브의 양을 검출하고 측정하여 박테리아의 양을 검출하고 측정하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 박테리아와 핵산 서열을 검출하는데 이용되는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머를 제시한다.
도 1에서는 본 발명의 구체예에 따라, 16S rDNA 서열의 비교 분석으로부터 추론된 8개의 박테리아 균주(즉, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 박테리아 균주)의 계통발생 상관관계를 도시한다. 상기 나무는 최소 1445개의 뉴클레오티드를 보유하는 서열의 이웃 결합(neighboring-joining) 거리 분석에 기초한다.
도 2에서는 본 발명의 구체예에 따라, 선택된 농축물 및 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 아질산염-산화 박테리아의 생물량(biomass)의 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)을 도시한다.
도 3에서는 본 발명의 구체예에 따라, 선택된 농축물 및 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7로 대표되는 아질산염-산화 박테리아의 생물량(biomass)의 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)을 도시한다.
도 4에서는 본 발명의 구체예에 따라, 선택된 농축물 및 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 아질산염-산화 박테리아의 생물량(biomass)의 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)을 도시한다.
도 5에서는 염수 박테리아 균주 및 2개의 상업적 첨가물에 대한 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 아질산염 농도 경향을 도시한다.
도 6에서는 염수 박테리아 균주와 비-접종된 대조를 비교하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 아질산염 농도 경향을 도시한다.
도 7에서는 5.5 개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 암모니아 농도 경향을 도시한다.
도 8에서는 5.5 개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 아질산염 농도 경향을 도시한다.
도9에서는 5.5 개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 질산염 농도 경향을 도시한다.
도 10에서는 11 개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 박테리아 균주의 생존능 을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 암모니아 농도 경향을 도시한다.
도 11에서는 11 개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 아질산염 농도 경향을 도시한다.
도 12에서는 11 개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 질산염 농도 경향을 도시한다.
도 13에서는 5 개월동안 보관된 냉동된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하고 14 개월동안 액체에서 보관된 냉동된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 암모니아 농도 경향을 도시한다.
도 14에서는 5 개월동안 보관된 냉동된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하고 14 개월동안 액체에서 보관된 냉동된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 아질산염 농도 경향을 도시한다.
도 15에서는 5 개월동안 보관된 냉동된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하고 14 개월동안 액체에서 보관된 냉동된 염수 박테리아 균주의 생존능을 평가하는 박테리아 첨가물 검사(Bacterial Additives Test)에서 평균 질산염 농도 경향을 도시한다.
본 발명은 염수 및/또는 담수 환경에서 아질산염 산화를 수행할 수 있고, 또한 냉동 또는 냉동-건조 공정이후 생존할 수 있는 신규한 박테리아 균주의 발견에 기초한다. 본 발명의 구체예에서는 이와 같은 박테리아 균주를 이용하고 검출하는 방법을 기술한다.
본 발명은 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 분리된 박테리아 균주, 또는 박테리아 균주의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공하는데, 여기서 상기 박테리아 균주의 16S rDNA는 표 1 내지 8에 도시된 바와 같이, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유한다.
[표 1]
SB7c32. SEQ ID NO:1로 대표되는 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
[표 2]
SB7c11. SEQ ID NO:2로 대표되는 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
[표 3]
SB7c136. SEQ ID NO:3으로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
[표 4]
SB7c47. SEQ ID NO:4로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
[표 5]
SB7c76. SEQ ID NO:5로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
[표 6]
R21c28. SEQ ID NO:6으로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
[표 7]
B7c10. SEQ ID NO:7로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
[표 8]
B7c7. SEQ ID NO:8로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염-산화 박테리아에 대한 서열
본 명세서에서, 분리된 박테리아 균주는 자연 환경으로부터 일정한 수준으로 정제되는 박테리아 균주다. 박테리아 배양액은 박테리아 중에서 적어도 20%가 한 박테리아 균주로부터 유래되는 경우에 생물학적으로 순수한 것으로 간주된다. 하지만, 배양액은 적어도 33%, 바람직하게는 적어도 45%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수하다.
본 발명의 박테리아 균주는 다른 박테리아 종, 영양분 및/또는 다른 성분과 서로 혼합하여 수성 배양기를 유지하거나 정제하기 위한 조성물을 제공한다. 적절하게는, 본 발명의 박테리아는 수성 배양기로부터 다른 오염물질 또는 원치않는 화합물을 제거할 수 있는 박테리아와 혼합된다. 이런 박테리아의 실례는 산화 박테리아(암모니아를 아질산염으로 산화시키는 화학독립영양 박테리아), 종속영양 박테리아(유기 물질을 암모니아와 다른 물질로 광화하는 박테리아), 당업자에게 널리 알려져 있는 다른 박테리아 등이다. 암모니아-산화 박테리아는 프로테오박테리아(proteobacteria)의 베타와 감마 부분으로부터 알려져 있다. 실례는 니트로소모나스(Nitrosomonas), 니트로스피라(Nitrosospira), 니트로솔로버스(Nitrosolobus), 니트로코커스(Nitrosococcus) 속의 종이다. 질산염-환원 박테리아는 아조아르쿠스(Azoarcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes) 속의 종이다. 종속영양 박테리아는 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes) 속으로부터 알려져 있다. 본 발명의 박테리아 균주와 혼합될 수 있는 다른 박테리아 군은 플랑크토마이세스(Planctomyces)의 구성원이다. 이들은 공지된 공급원(가령, American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas VA 20100, USA)으로부터 입수하거나, 또는 수족관 바이오필터로부터 직접 분리할 수 있다.
가령, 본 발명의 박테리아 균주는 암모니아-산화 박테리아와 혼합되고, 수중 시스템에 존재하는 암모니아가 아질산염으로 산화되고 아질산염이 질산염으로 산화된다. 첨가되는 암모니아-산화 박테리아는 당분야에 공지된 임의의 암모니아-산화 박테리아, 또는 아래의 특허 출원에 개시된 암모니아-산화 박테리아에 의해 구현된다: 2003년 9월 10일자로 제출된 U.S. 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-284779], 2003년 9월 10일자로 제출된 U.S. 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-284781], 2003년 9월 10일자로 제출된 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-294309], 2003년 9월 10일자로 제출된 특허 출원 [Atty. Docket No. 81289-305694].
다른 실례는 본 발명의 박테리아 균주와 호기성이나 혐기성 탈질소화 박테리아(denitrifying bacteria)를 혼합하는 것이다. 이 경우에, 본 발명의 박테리아 균주와 탈질소화 박테리아의 상호작용에 의해 생산된 질산염은 질소가스(dinitrogen) 또는 다른 질소 기초된 산물로 환원된다. 세 번째 실례는 본 발명의 박테리아 균주와 종속영양 박테리아를 혼합하는 것인데, 상기 종속영양 박테리아는 유기 물질을 더욱 단순한 무기 물질로 광화시키고, 이후 상기 무기 물질은 본 발명의 박테리아 균주에 의해 기질로서 이용될 수 있다.
여러 구체예에서, 아질산염-산화 박테리아 및 암모니아-산화 박테리아를 함유하는 수성 배양기를 유지하거나 정제하기 위한 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 가내 수족관의 유지를 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 염수 AOB와 함께, 본 발명의 염수 NOB를 함유한다. 한 구체예에서, 본 발명의 0.5-1.5 ㎖, 바람직하게는 대략 1 ㎖의 농축된 본 발명의 염수 NOB는 2.25-3.25 ㎖, 바람직하게는 대략 2.75 ㎖의 농축된 염수 AOB와 혼합된다. 상기 농축된 혼합물은 이후, 50-60 갤런(gallon), 바람직하게는 대략 55 갤런의 수족관용 물을 처리하도록 설계된 부피인 2.5-3.5 액량 온스(fluid ounce), 바람직하게는 대략 3 액량 온스(88.7 ㎖)로 인공 염수에 의해 희석된다. 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB의 여러 균주를 함유할 수 있는데, 여기서 이들 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB 균주 모두를 함유하는데, 상기 조성물의 대부분은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 박테리아 균주로 구성된다(본 명세서에서, “대부분”은 적어도 50%를 의미한다).
다른 구체예에서, 공공 수족관과 양식 시설의 유지를 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 염수 AOB와 함께 본 발명의 염수 NOB를 함유한다. 한 구체예에서, 40-50 ㎖, 바람직하게는 대략 45 ㎖의 농축된 본 발명의 본 발명의 염수 NOB는 118-128 ㎖, 바람직하게는 대략 123 ㎖의 농축된 염수 AOB와 혼합된다. 상기 농축된 혼합물은 이후, 2410-2510 갤런(gallon), 바람직하게는 대략 2460 갤런의 수족관 또는 양식 시설용 물을 처리하도록 설계된 부피인 0.9-1.1 갤런, 바람직하게는 대략 1 갤런(3.79 ℓ)로 탈염화되고 여과된 물에 의해 희석된다. 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB의 여러 균주를 함유할 수 있는데, 여기서 이들 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB 균주 모두를 함유하는데, 상기 조성물의 대부분은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 박테리아 균주로 구성된다(본 명세서에서, “대부분”은 적어도 50%를 의미한다).
또한, 본 발명은 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 농축된 박테리아 균주를 함유하는 혼합물을 제공하는데, 여기서 상기 박테리아의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ1D NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유한다. 본 발명의 본 구체예에 따라, 박테리아는 균주는 상기 박테리아 균주가 자연에서 발생하는 농도보다 높은 농도로 발생하는 경우에 농축된 것으로 간주된다. 일반적으로, 박테리아 균주의 농도는 적절한 대조와 계산 방법을 이용하는 당업자에게 널리 공지된 표준 기술, 예를 들면, 형광 in situ 혼성화(FISH) 기술에 의한 결정에서, 샘플에서 전체 세포의 적어도 20%이다. 적절하게는, 박테리아 균주의 농도는 전체 세포의 33% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이다. 하지만, 혼합물에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유하는 한가지이상의 박테리아를 보유하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 상기한 비율은 혼합물에서 전체 NOB의 비율에 관하고, 나머지 세포 개체군은 암모니아-산화 박테리아 또는 다른 유형의 박테리아로 구성될 수 있다.
특히, 임의의 이론에 한정됨 없이, 본 발명과 관련하여 기술된 다양한 박테리아 균주 중에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 균주들은 담수 환경에서도 이용될 수 있지만 염수 환경에서 특히 잘 견디고, 효과적으로 기능하는 것으로 생각된다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 균주 이외의 균주를 혼합하는 박테리아 균주와 혼합물 역시 상당한 정도로 염수 환경을 견뎌낼 수 있긴 하지만, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 아질산염을 질산염으로 산화시키는 염수 환경에는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8로 대표되는 균주들이 포함된다.
더 나아가, 본 발명과 관련하여 기술된 임의의 박테리아 균주가 냉동-건조될 수 있지만, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 균주들이 냉동-건조 공정을 특히 잘 견디는 것으로 생각되는데, 이는 이와 같은 공정이후에 생존하고 아질산염을 질산염으로 산화시키는 능력으로 확인된다. 따라서, 본 발명의 구체예에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8로 대표되는 이들 박테리아 균주는 냉동-건조되고, 이후 염수 환경에서 아질산염을 질산염으로 산화시키는데 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 박테리아 또는 박테리아 균주를 냉동-건조시키는 방법을 제공한다. 이들 방법은 박테리아 또는 박테리아 균주를 동결보존제로 처리하고; 이들 박테리아 균주를 냉동기에 위치시키고; 이들 박테리아 또는 박테리아 균주를 진공 압력하에 건조시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 냉동-건조 방법은 해동이후 생존능 및 아질산염을 질산염으로 산화시키는 능력을 유지하면서 냉동-건조된 형태로 보관될 수 있는 냉동-건조된 NOB를 생산한다.
여러 구체예에서, 본 발명의 박테리아 또는 박테리아 균주를 냉동-건조시키는 방법은 특정 냉동-건조 조건을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 NOB 균주는 30 ppt의 염도로 배양기에서 배양한다. 이후 NOB는 동결보존제로서 트레할로스로 처리하는데, 대략 5% 용액을 위하여 40-60g, 바람직하게는 대략 50g의 트레할로스가 900-1100 ㎖, 바람직하게는 대략 1000 ㎖의 NOB와 혼합된다. NOB 용액은 가공 때까지 대략 4℃에서 보관하고, 이후 미리-냉각된 접시에 부어넣고 대략 3시간동안 대략 -40℃에서 동결시킨다. 동결된 용액은 이후, 대략 12시간동안 강하지 않은 일차 승화율(primary sublimation rate)로 건조기에 위치시키는데, 최종 온도는 대략 27℃이고, 총 건조 시간은 대략 35시간이다. 다른 구체예에서, 동결된 용액이 대략 2시간동안 강한 일차 승화율로 건조기에 위치되고, 최종 온도가 대략 27℃이며, 총 건조 시간이 대략 28시간 점을 제외하고, 냉동-건조 조건이 동일하다.
다른 구체예에서, 본 발명의 NOB 균주는 30 ppt의 염도로 배양기에서 배양한다. 이후 NOB는 동결보존제로서 트레할로스로 처리하는데, 대략 10% 용액을 위하여 90-110g, 바람직하게는 대략 100g의 트레할로스가 900-1100 ㎖, 바람직하게는 대략 1000 ㎖의 NOB와 혼합된다. NOB 용액은 가공 때까지 대략 4℃에서 보관하고, 이후 미리-냉각된 접시에 부어넣고 대략 3시간동안 대략 -40℃에서 동결시킨다. 동결된 용액은 이후, 대략 12시간동안 강하지 않은 일차 승화율(primary sublimation rate)로 건조기에 위치시키는데, 최종 온도는 대략 27℃이다. 다른 구체예에서, 동결된 용액이 대략 2시간동안 강한 일차 승화율로 건조기에 위치되고, 최종 온도가 대략 27℃인을 제외하고, 냉동-건조 조건이 동일하다.
본 발명의 박테리아 균주, 혼합물, 조성물은 분말 형태, 액체 형태, 동결 형태, 냉동-건조 형태, 또는 당업자에 의해 인정되는 임의의 적절한 다른 형태일 수 있다. 이들은 통상적으로 “상업적 첨가물”이라고 하는데, 여기에는 아래와 같은 형태가 포함된다:
(1) 액체 형태, 여기서 한가지이상의 균주, 혼합물, 조성물은 무기 염 또는 유기 화합물을 함유하는 액체 용액 내에 존재하고, 따라서 세포의 생존능이 보관 과정동안 파괴되지 않는다;
(2) 동결 형태, 여기서 한가지이상의 균주, 혼합물, 조성물은 선택적으로 세포 용해를 예방하는 동결보존제 화합물을 함유하고 32℉ 이하의 온도에서 동결되고 보관되는 상기한 액체 혼합물 내에 존재한다.
(3) 냉동-건조 또는 다른 수단에 의해 생산되는 분말 형태, 여기서 한가지이상의 균주, 혼합물, 조성물의 탈수된 형태는 생존능의 상실없이 정상 실온에서 보관될 수 있다.
본 발명의 박테리아 균주와 혼합물의 적절한 형태를 획득하는 것은 본 발명의 개시에 비추어 당업자의 통상적인 지식에 속한다. 또한, 본 발명의 박테리아 균주와 혼합물은 단독으로, 또는 다른 성분과 공동으로 사용될 수 있다. 이런 성분의 실례에는 암모니아-산화 박테리아, 종속영양 아질산염-산화 박테리아, 종속영양 암모니아-산화 박테리아 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 생물학적으로 순수한 박테리아 균주의 모든 형태는 영양분, 아미노산, 비타민, 박테리아 균주의 성장을 보존하고 증진하는 다른 성분을 함유할 수도 있다. 본 발명의 박테리아 균주, 혼합물, 조성물은 담수 수족관, 염수 수족관, 폐수에 사용되어 아질산염의 축적을 완화시킬 수 있다. 이들은 아질산염에 의해 유발된 오염 수준을 감소시키는 생물적 환경 정화 공정에 사용될 수도 있다. 생물활성화(bioaugmentation)라고 하는 생물적 환경 정화 공정에는 최초 시스템에 존재하는 한가지이상 형태의 화학적 화합물의 변화를 유도하는 생물학적 및/또는 화학적 공정을 증진하거나 확립하는 목적으로 시스템(가령, 생물학적 또는 화학적 오염이 발생한 지역)에 미생물의 보충적 첨가가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 배양기에서 아질산염의 축적을 완화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 아질산염을 질산염으로 산화시켜 배양기에서 아질산염의 축적을 완화시킬 수 있는 본 발명의 한가지이상 박테리아 균주의 충분한 양을 배양기에 위치시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유한다. 박테리아 균주의 양은 첨가된 박테리아가 배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방할 수 있으면 충분하다. 일반적으로, 담수 또는 염수 수족관에 본 발명의 한가지이상 박테리아 균주의 첨가는 이런 박테리아 균주의 부재시에 달성되는 수준에 비하여 최대 아질산염 농도를 적어도 50% 정도 감소시킬 것으로 기대된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 배양기에서 아질산염의 축적을 완화시키는 방법은 배양기에서 아질산염의 축적을 완화시킬 만큼 충분한 양으로 본 발명의 조성물을 배양기에 위치시키는 단계를 포함한다. 상기 조성물은 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 본 발명의 한가지이상 박테리아 균주를 함유하는데, 여기서 상기 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유한다.
다양한 구체예에서, 수성 배양기를 유지하거나 정제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 수성 배양기를 유지하거나 정제할 만큼 충분한 양으로 조성물을 배양기에 위치시키는 단계를 포함한다. 상기 조성물에서, 본 발명의 박테리아 균주는 암모니아-산화 박테리아와 혼합되어, 수중 시스템에 존재하는 암모니아가 아질산염으로 산화되고, 상기 아질산염은 질산염으로 산화된다. 다른 실례는 본 발명의 박테리아 균주와 호기성이나 혐기성 탈질소화 박테리아(denitrifying bacteria)를 혼합하는 것이다. 이 경우에, 본 발명의 박테리아 균주와 탈질소화 박테리아의 상호작용에 의해 생산된 질산염은 질소가스(dinitrogen) 또는 다른 질소 기초된 산물로 환원된다. 세 번째 실례는 본 발명의 박테리아 균주와 종속영양 박테리아를 혼합하는 것인데, 상기 종속영양 박테리아는 유기 물질을 더욱 단순한 무기 물질로 광화시키고, 이후 상기 무기 물질은 본 발명의 박테리아 균주에 의해 기질로서 이용될 수 있다.
여러 구체예에서, 수성 배양기를 유지하거나 정제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 아질산염-산화 박테리아 및 암모니아-산화 박테리아를 함유하는 조성물의 충분한 양을 배양기에 위치시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 가내 수족관을 유지하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 염수 AOB와 함께, 본 발명의 염수 NOB를 함유하는 조성물을 상기 수족관에 위치시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 0.5-1.5 ㎖, 바람직하게는 대략 1 ㎖의 농축된 본 발명의 염수 NOB를 2.25-3.25 ㎖, 바람직하게는 대략 2.75 ㎖의 농축된 염수 AOB와 혼합함으로써 형성된다. 상기 농축된 혼합물은 이후, 50-60 갤런(gallon), 바람직하게는 대략 55 갤런의 수족관용 물을 처리하도록 설계된 부피인 2.5-3.5 액량 온스(fluid ounce), 바람직하게는 대략 3 액량 온스(88.7 ㎖)로 인공 염수에 의해 희석된다. 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB의 여러 균주를 함유할 수 있는데, 여기서 이들 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB 균주 모두를 함유하는데, 상기 조성물의 대부분은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 박테리아 균주로 구성된다(본 명세서에서, “대부분”은 적어도 50%를 의미한다).
다른 구체예에서, 공공 수족관과 양식 시설을 유지하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 염수 AOB와 함께 본 발명의 염수 NOB를 함유하는 조성물의 충분한 양을 상기 수족관 또는 양식 시설에 위치시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 40-50 ㎖, 바람직하게는 대략 45 ㎖의 농축된 본 발명의 염수 NOB를 118-128 ㎖, 바람직하게는 대략 123 ㎖의 농축된 염수 AOB와 혼합함으로써 형성된다. 상기 농축된 혼합물은 이후, 2410-2510 갤런(gallon), 바람직하게는 대략 2460 갤런의 수족관 또는 양식 시설용 물을 처리하도록 설계된 부피인 0.9-1.1 갤런, 바람직하게는 대략 1 갤런(3.79 ℓ)로 탈염화되고 여과된 물에 의해 희석된다. 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB의 여러 균주를 함유할 수 있는데, 여기서 이들 박테리아 균주의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명의 염수 NOB 균주 모두를 함유하는데, 상기 조성물의 대부분은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 박테리아 균주로 구성된다(본 명세서에서, “대부분”은 적어도 50%를 의미한다).
임의의 설정에서 달성되는 실제 수준은 시스템의 크기와 내용물(즉, 어류, 식물 등의 숫자)의 함수이다. 10마리의 물고기가 있는 새로 조립된 37 ℓ 수족관에서, 아질산염 농도는 본 발명의 박테리아 균주의 첨가가 없으면 14 ㎎/ℓ에 육박하는 반면, 한가지이상의 박테리아 균주가 첨가되면 최대 수준이 대략 5 ㎎/ℓ로 감소될 수 있다. 일반적으로, 최대 아질산염 농도는 본 발명의 한가지이상 박테리아 균주가 이와 같은 시스템에 첨가되는 경우에 3 ㎎/ℓ를 초과하지 않을 것으로 예상된다. 시스템이 항정 상태에 도달하면 아질산염 수준은 0.5 ㎎/ℓ 미만으로 떨어지는데, 이런 과정은 본 발명의 한가지이상 박테리아 균주가 존재하는 경우에 더욱 급속하게 진행된다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 박테리아 균주와 조성물은 배양기, 예를 들면, 담수 수족관, 염수 수족관, 폐수에 직접적으로 위치한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 이들 박테리아 균주와 조성물은 회전원판 접촉장치에서 배양되고, 이후 배양기에 위치된다. 상이한 구체예에서, 본 발명의 박테리아 균주와 조성물은 배양기에 포함된 바이오필터 단위에 위치될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 박테리아 균주와 조성물은 고정화 중합체, 예를 들면, 아크릴아마이드, 알기네이트 또는 카라기난에 고정된다. 이후, 박테리아-부착된 중합체 물질은 필터에 위치되거나, 또는 적절한 시설의 필터 스트림에 위치된다.
본 명세서에서, “수족관”은 물을 보유하고 살아있는 수생 생물체(가령, 어류, 식물, 박테리아, 무척추동물)가 위치하며 유리, 플라스틱 또는 나무, 또는 이들의 조합으로 만들어진 용기 및 이의 내용물을 의미한다. 수족관은 수생 생물체의 전시, 이들의 단기 또는 장기 보유, 과학 연구, 수송 및 다른 목적으로 이용된다. 담수 수족관은 일반적으로, 액체 배양기가 15 천분율(parts per thousand) 미만의 염도를 보유하는 수족관이다. 염수 수족관은 일반적으로, 액체 배양기가 15 천분율(parts per thousand) 이상의 염도를 보유하는 수족관이다. “수족관용 물”은 수족관내에 유지되고 수생 생물체가 존재하는 배양기 및 이의 연관된 필터 시스템을 의미한다. 수족관용 물은 넓은 범위의 무기 또는 유기 화학 물질을 함유하고, 따라서 넓은 범위의 파라미터, 예를 들면, 염의 농도, pH, 총 용존 고형물(total dissolved solid), 온도를 보유한다.
본 명세서에서, “폐수”는 일반적으로, 산업 공정이나 인공 공정의 산물로서 생성된 액체 배양기를 의미한다. 폐수는 이를 환경에 덜 유해하도록 하여 정부 기관에 의해 결정된 방출 표준에 적합시키는 한가지이상의 여과 방법에 의한 처리를 요한다. 폐수는 주변 환경으로 방출되지 않도록 재활용될 수도 있다.
본 명세서에서, “생물학적 필터” 또는 “바이오필터”는 일반적으로, 미생물의 성장을 증진하거나, 또는 미생물의 부착과 성장을 위한 기질을 제공하는 목적의 필터를 의미한다. 바이오필터는 수족관 여과 시스템 또는 폐수 여과 시스템의 일부일 수 있다. 본 명세서에서, “회전원판 접촉장치”는 일반적으로, 물이나 배양기에서 회전하는 유형의 바이오필터를 의미한다. 이는 물이나 배양기에 완전히 또는 부분적으로 잠길 수 있다. 회전원판 접촉장치는 미국 특허 2,085,217; 2,172,067; 5,423,978; 5,419,831; 5,679,253; 5,779,885 등에서 구현하고 있다.
본 명세서에서, “필터 솜”은 바이오필터, 기계적 필터, 또는 이들의 조합으로 기능하는 부정형의 자연이나 합성 복수-가닥 물질을 의미한다.
본 명세서에서, “수족관 자갈”은 수족관의 바닥 위에 통상적으로 위치하는 기질을 의미한다. 이는 바위, 산호, 플라스틱 또는 다른 물질의 부정형이나 정형 조각으로 구성된다. 이는 장식 목적으로 바이오필터, 기계적 필터, 또는 이들의 조합으로 기능한다.
본 명세서에서, “필터 스펀지”는 수족관에 또는 수족관 여과 시스템의 일부로서 사용되는 경우에 기계적 필터, 바이오필터, 또는 둘 모두로 기능하는 자연이나 합성 물질을 의미한다.
본 명세서에서, “플라스틱 필터 매체”는 바이오필터, 기계적 필터, 또는 둘 모두로 기능하는 인공 물질을 의미한다. 이는 플라스틱 성형 또는 주입 성형된다.
다른 구체예에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ1D NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 이의 변이체를 보유하는 서열을 포함하는 핵산 서열과 박테리아를 제공한다.
다른 구체예에서, 배양기에 존재하는 본 발명의 박테리아의 양을 검출하는 측정하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공한다. 상기 프로브는 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브는 당분야에 공지된 방법으로 합성될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브는 검출가능한 임의의 표식으로 표지될 수 있다. 적절한 표식의 실례에는 방사성 표식, 형광 표식 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절한 표지 물질은 상업적으로 입수가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 표지하는 방법 역시 당업자에게 공지되어 있다(참조: Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. Molecular Cloning-A Laboratory Manual, second edition, 1989, Cold Spring Harbor Press).
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브는 본 발명의 박테리아 균주의 16S rDNA와 혼성화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브는 본 발명의 박테리아의 양을 검출하고 결정하는 방법에 특히 적합하다.
본 발명의 한 측면에서, 배양기에서 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 박테리아의 양을 검출하고 결정하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 박테리아의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:18에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 검출가능하게 표지된 본 발명의 프로브를 제공하고;
(b) 배양기로부터 전체 DNA를 분리하고;
(c) 검출가능하게 표지된 프로브가 상기 박테리아의 핵산에만 혼성화되는 조건하에, 분리된 전체 DNA를 상기 프로브에 노출시키고, 여기서 상기 박테리아의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ NO:8의 뉴클레오티드 서열을 보유하고;
(d) 혼성화된 프로브의 양을 검출하고 측정하여 박테리아의 양을 검출하고 측정한다.
본 발명의 프로브는 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18로 대표된다. 전장에서 임의의 상기한 프로브와 적어도 96% 상동한 서열 역시 본 발명의 박테리아를 검출하는데 이용될 수 있다. 이들 프로브는 하기의 실시예에서 더욱 상세하게 기술한다.
배양기는 수족관용 물일 수 있는데, 이로부터 DNA가 분리된다. 배양기는 수족관 자갈, 스펀지 필터 물질, 필터 솜, 또는 플라스틱 필터 매체를 포함하지만 이들에 국한되지 않은 물질 역시 함유할 수 있다. 따라서, DNA는 이런 박테리아가 발견될 것으로 예상되는 공급원으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 방법은 DNA 칩, 또는 당업자에게 공지된 유사한 도구와 동시에 수행될 수 있다. DNA 칩은 고체 담체 및 공유 결합을 통하여 고체 담체에 고정되는 일군의 뉴클레오티드 유도체 또는 이들의 유사체를 보유한다. DNA 칩으로 핵산 단편의 검출은 일반적으로, 검출되는 핵산 단편과 상보적인 프로브 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화로 수행된다. 프로브 올리고뉴클레오티드는 일반적으로, 고체 담체(가령, 고체 기질)에 고정된다. 검출 공정에서, 샘플 액체에서 핵산 단편은 형광 표식 또는 방사성 표식이 제공되고, 이후 샘플 액체는 DNA 칩의 프로브 올리고뉴클레오티드와 접촉하게 된다. 샘플 액체에서 표지된 핵산 단편이 프로브 올리고뉴클레오티드에 상보적이면, 표지된 핵산 단편은 혼성화에 의해 프로브 올리고뉴클레오티드와 결합한다. 프로브 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 의해 DNA 칩에 고정된 표지된 핵산 단편은 다른 검출 방법이 이용될 수도 있지만, 예로써 형광 분석(fluorometry) 또는 자가방사법(autoradiography)과 같은 적절한 검출 방법으로 검출한다.
대안으로, 상기 방법은 당업자에게 널리 인정되고 통상의 실험으로 수행되는 다양한 자동화 공정과 동시에 수행될 수 있다. 예로써, 본 발명의 방법은 통상적인 방법, 예를 들면, DNA 또는 단백질 마이크로어레이, 바이오센서, 생물프로브, 모세관 전기영동, 실시간 PCR로 수행된다; 하지만, 상기 목록은 무-제한적이다.
본 발명의 검출 방법은 배양기에서 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있는 박테리아의 발생을 모니터하고 검출하기 위한 효과적인 도구를 제공한다. 상기 방법은 또한, 본 발명의 박테리아의 양을 측정함으로써, 상업적 첨가물을 검사하여 이런 첨가물의 효능을 결정하는 도구를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 박테리아와 핵산 서열을 검출하는데 이용되는 PCR 프라이머를 제공한다. 이들 PCR 프라이머 쌍은 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22로 대표된다. 전장에서 상기한 PCR 프라이머와 적어도 96% 상동한 서열 역시 본 발명의 박테리아를 검출하는데 이용될 수 있다. 이들 PCR 프라이머는 하기의 실시예에서 더욱 상세하게 기술한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 박테리아와 핵산 서열을 검출하는데 이용되는 상기한 올리고뉴클레오티드 프로브와 PCR 프라이머의 변이체는 본 발명의 범위에 속한다. 가령, 하나이상의 뉴클레오티드 부가, 결실 또는 치환으로 인하여 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 또는 SEQ ID NO:22와 상이하지만 본 발명의 박테리아와 핵산 서열을 검출하는데 여전히 이용될 수 있는 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머의 변이체는 본 발명에 의해 포섭된다.
본 발명은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8, 또는 이들 서열의 변이체로서 확인된 서열을 포함하는 분리된 박테리아, 분리된 박테리아 균주, 박테리아 배양액, 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히 바람직한 변이체는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 높은 수준의 유사성이 존재하는 변이체이다. 본 발명은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동한, 적어도 97% 상동한, 적어도 98% 상동한 또는 적어도 99% 상동한 변이체를 제공한다. 당분야에서, 참고 서열(가령, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8)을 제조하고 이용하는 방법에 관한 교시는 상기한 변이체를 제조하고 이용하는 방법을 당업자에게 교시하는데 충분하다.
아질산염-산화 박테리아, 이런 박테리아를 이용하는 방법, 이런 방법을 검출하는 방법을 기술하는 3개의 특허가 미국에서 허여되었다(U.S. Patent 6,207,440, 6,265,206, 6,268,154). 이들 3개의 특허는 뉴클레오티드 서열 및 상기 서열과 96.1% 초과의 상동성을 보유하는 임의의 변이체를 기술한다. 이들 특허의 허여는 특정 서열을 열거하고 특정 변이체를 기술하는 명세서를 통하여 당업자가 상기 서열 및 이의 기술된 변이체를 제조하고 이용할 수 있음을 입증한다. 이에 더하여, 뉴클레오티드 서열을 개시하는 특허가 이들 서열의 변이체를 개시하고 청구하는 것은 당분야에서 일상적이다(참조: U.S. 특허 6,465,621, 6,509,170, 6,573,066).
특정 뉴클레오티드 서열의 변이체는 자연-발생 다형성 또는 합성 서열 변형일 수 있다(참조: U.S. 특허 6,485,938). 자연과 합성 뉴클레오티드 서열에 대한 다양한 변형은 합성 변이체를 제조하는 방법과 함께, 당분야에 널리 공지되어 있다(참조: U.S. 특허 6,448,044, 6,509,170). 2개 이상의 뉴클레오티드 서열의 유사성을 비교하는 방법은 당분야에 널리 알려져 있다. 유사한 서열은 빈번하게, BESTFIT 및 BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램에 의해 확인된다(참조: U.S. 특허 6,461,836). 게다가, 변이체 서열과 참고 서열 사이의 유사성을 검출하는데 혼성화가 이용될 수 있다(참조: U.S. 특허 6,573,066). 따라서, 당업자는 공지된 기술을 이용하여 참고 서열의 변이체가 되는 뉴클레오티드 서열을 용이하게 합성하고 확인할 수 있다. 이런 이유로, 뉴클레오티드 서열 및 이의 변이체를 기술하는 명세서를 통하여 당업자는 상기 서열과 이의 변이체를 제조하고 이용할 수 있다.
일련의 검사와 실험을 실시하여 본 명세서에 보고된 박테리아 균주를 분리하고 확인하며 이들 균주의 효능을 입증하였다. 이들 검사와 실험은 다양한 박테리아 배양 기술, 배양액의 샘플로부터 추출된 DNA의 분자 생물학적 분석, 박테리아 균주의 분자 생물학적 분석, 아질산염 농도를 조절하는 능력을 측정하기 위한 액체 형 태와 동결-건조 형태 박테리아 균주의 농축된 배양액의 수족관으로의 적용을 수반하였다.
실시예 1
박테리아 배양
박테리아 배양 용기(반응기)는 조립하고 작동 수족관으로부터 수집된 박테리아 바이오매스(biomass)로 접종하였다. 각 반응기는 50g KH2PO4, 50g K2HPO4, 18.75g MgSO4ㆍ7H2O, 1.25g CaCl2ㆍ2H2O, lg FeSO4ㆍ7H2O를 함유하는 4.95ℓ의 무기염 용액(증류수에서 제조)을 보유하였다. 용존 산소가 7.5 ㎎/ℓ 이상이 되도록 공기를 제공되고 교반하며, 반응기는 대략 28℃에서 암실에 유지시켰다.
염수 환경에서 본 발명의 NOB 균주의 분리와 배양을 위하여, 합성 바다 소금(INSTANT OCEAN, Aquarium Systems Inc., Mentor, OH)을 첨가하여 28 내지 33 ppt의 염 농도를 달성하였다.
암모니아와 아질산염 농도는 유동 주입 분석(FIA, Tecator FIASTAR 5010 시스템)을 이용하여 매일 측정하고, pH는 전극(Denver Instruments Model 225 pH/ISE 측정기 및 연관된 pH/ATC 전극)을 이용하여 결정하였다. 염도는 YSI Model 30 염도, 온도, 전도도 프로브로 측정하였다. 질산염은 주기적으로 측정하고, 획득된 데이터를 이용하여 물 교체가 필요한 지를 결정하였다. 박테리아 바이오매스는 물 교체동안 반응기에 유지시켰는데, 그 이유는 바이오메스가 잘 응집되기 때문이다. 따라서, 적절한 샘플링 포트(sampling port)를 통하여 반응기 용량의 50%를 버리기에 앞서, 상기 바이오매스는 1시간동안 환기와 교반 장치의 작동을 중단시킴으로써 가라앉혔다. 부가적으로, 반응기는 주기적으로 세척하여 표면으로부터 바이오매스를 떼어내고 현탁액으로 다시 집어넣었다. 미생물 샘플은 추가 분석을 위한 DNA 추출(PCR을 위해)과 세포 고정(FISH를 위해)을 위하여 정기적으로 채취하였다.
실시예 2
핵산 샘플링과 추출
DNA 추출을 위하여, 적절한 생물학적 여과 매체의 샘플을 채취하고 세포 용해 완충액(40 mM: EDTA. 50 mM Tris-HCl, pH 8.3)에 재부유시켰다. 샘플은 추출 때까지 -20℃ 또는 -74℃에서 보관하였다. 가공을 위하여, 라이소자임을 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 샘플에 첨가하였다. 37℃에서 90분간 배양한 이후, 20% 황산 도데실 나트륨(SDS)을 1%의 최종 농도로 첨가하였다. 이후, 이들 샘플은 4회 냉동/해동 주기를 수행하고, 2 ㎎/㎖의 최종 농도로 단백분해효소 K(원액 농도, 10 ㎎/㎖)를 첨가하며 70℃에서 35분간 배양하였다. 일부 경우에, 추가의 단백분해효소 K와 SDS를 첨가하고, 샘플은 55℃에서 추가로 30분간 배양하였다.
세포 용해이후, DNA는 EASY DNA 추출 키트(Qiagen Inc., Santa Clarita, CA; 이후 "Qiagen")를 이용하여 추출하였다. DNA는 50 ㎕ 부피로 용리하고 Hoechst 타입 33258 염료 결합과 형광 분석(DYNAQUANT 200, Hoefer Pharmacia Biotech Inc., San Francisco, CA)로 정량하였다.
실시예 3
PCR 증폭된 rRNA 유전자의 클론 라이브러리
클론 라이브러리는 반응기와 수족관으로부터 채취된 바이오매스 샘플의 DNA 추출물로부터 유래되었다. 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 박테리아로부터 유래된 박테리아 리보솜 RNA 유전자 단편은 프라이머 S-D-Bact- 0011-a-S-17(8f; GTT TGA TCC TGG CTC AG)(SEQ ID NO:9)과 1492r(진정세균; GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)(SEQ ID NO:10)로 증폭하였다. PCR 조건, 주기 파라미터, 반응 성분은 기존 문헌에서 보고된 바와 동일하였다(DeLong, E. F. 1992. Archaea in coastal marine environments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5685 - 5689). PCR 산물은 아가로즈 겔 전기영동으로 평가하였다. PCR 단편은 TE 완충액으로 세척하고 CENTRICON 농축기(Amicon, Inc. Beverly, MA)로 30 ㎕로 농축한 이후, 제조업자의 사용설명서에 기술된 바와 같이 TA Cloning 키트(vitrogen, Carlsbad, CA)로 클론하였다.
실시예 4
염기서열분석과 계통발생 분석
클론 라이브러리를 구성하는 각 클론으로부터 16S rDNA 삽입체는 제한 효소 Hae III을 이용한 제한 효소 분석(REA)으로 선별하여 16S rDNA 삽입체가 증폭되도록 담보하고, 16S rDNA가 Hae III 효소로 절단되는 경우에 독특한 REA 패턴을 보유하는 지를 결정하였다. 클론이 증폭되고 독특한 REA 패턴을 보유하면, 목적하는 16S rDNA 삽입체를 보유하는 상기 클론의 플라스미드를 부분적으로 염기서열분석하였다. 염기서열분석을 위하여 선별된 각 클론의 증폭된 PCR 16S rDNA 주형은 PCR Purification Kit Catalog No. 28142(Qiagen)를 이용하여 손질하였다. 염기서열분석은 형광 표지된 프라이머와 SEQUITHERM EXCEL II DNA Sequencing 키트(Epicentre Technologies, Madison, W1)로 주기-정렬된 주형에서 LICOR 4000L 자동화된 DNA 서열분석기를 이용하여 수행하였다.
동일한 REA 패턴의 2개 또는 3개 클론을 부분적으로 염기서열분석하여 이들이 동일함을 담보하였다. 다수의 클론은 완전히 염기서열분석하고 PAUP(Phylogenetic Analysis Using Parsimony ver 4.0b2a, D.L. Swofford)(부트스트랩 수치와 거리 분석), ARM(A Software Environment for Sequence Date, W. Ludwig and O. Strunk)(계통수), Phylip(Phylogeny Inference Package J. Felsentein)(유사성 매트릭스)에 의해 계통발생학적으로 분석하였다. 클론 라이브러리로부터 목적하는 클론에 대한 프라이머와 프로브는 ARB 프로브 설계와 프로브 정합 프로그램 및 후속의 수동 정렬을 이용하여 개발하였다. 프라이머와 프로브는 BLAST(S.F. Altschul et al. 1990. Basic local alignment tool. J. Mol. Biol. 215:403-410)로 이중 검사하였다. 이들 프라이머의 특이성은 공지된 박테리아의 클론과 순수 배양액으로부터 추출된 DNA에 이들을 이용함으로써 결정하였다. 이들 프로브의 특이성은 공지된 박테리아의 순수 배양액 및 반응기로부터 샘플을 이용하여 검사하였다.
실시예 5
DODGE 분석과 프로필링
전체 진정세균 DGGE 분석을 위하여, rDNA 단편은 Murray 등(A. Murray et al. 1996. Phylogenetic compositions of bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments. Appl. Environ. Microbiol. 62:2676 2680)에 의해 기술된 바와 같이 5' 말단에 40-bp GC-클램프를 보유하는 전방 35Sf(진정세균; CCT ACG GGA GGC AGC AG)(SEQ ID No:11) 및 후방 프라이머 S-*-Univ-0519-a-A-18(519r: GWA TTA CCG CGG CKG CTG)(SEQ ID NO:12)을 이용하여 증폭하였다. 특이적인 NOB DGGE를 위하여, 5' 말단에 40-bp GC-클램프를 보유하는 358f의 전방 프라이머(SEQ ID No:11)는 후방 프라이머 NSP685(NSP685: CAC CGG GAA TTC CGC GCT CCT C)(SEQ ID NO:13)와 함께 이용되었다. PCR 조건은 동일하고 TAQ PCR 코어 키트(Qiagen)를 이용하여 ROBOCYCLER GRADIENT 96(Stratagene, La Jolla, CA)에서 수행되었다. PCR 조건은 핫 스타트(hot start)(80℃) 및 터치다운(touchdown) 절차를 수반하였다. 94℃에서 3분간 최초 변성이후, 94℃에서 1분간 변형, 65℃에서 55℃까지 1분 29초간 터치다운 어닐링(터치다운동안 어닐링 시간은 사이클당 1.4초씩 증가하였다), 72℃에서 56초간 프라이머 신장(신장 시간은 사이클당 1.4초씩 증가하였다)을 순차적으로 수행하였다. 상기 가열 사이클의 최종 온도 연속은 총 20회 사이클동안 반복하고, 이후 72℃에서 5분간 최종 신장시켰다. 앰플리콘은 아가로즈 겔 전기영동으로 검사하였다.
DGGE는 Bio-Rad D-GENE System(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA; 이후 "Bio-Rad")로 수행하였다. 겔은 Bio-Rad 시약(D GENE Electrophoresis Reagent Kit, Bio-Rad)을 이용한 8.5% 아크릴아마이드/Bis이었다. 겔 구배는 달리 명시하지 않는 경우에, 25% 내지 55%(100% 변성제는 40% 탈이온화된 포름아마이드와 7 M 요소의 혼합물이다)의 변성 구배를 보유하는 Bio-Rad 시약(D GENE Electrophoresis Reagent Kit, Bio-Rad) 및 Bio-Rad 구배 전달 시스템(Model 475, Bio-Rad)을 이용하여 집어넣었다. 모든 겔은 200 볼트에서 6시간동안 동작시켰다. 증거 조사를 위하여, 일부 겔은 Vistra Green(1:10,000 희석됨)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA; 이후 "Molecular Dynamics")에서 20분간 염색하고, 이후 1X TAE 완충액에서 20분간 세척하고 FLUORIMAGER SI(Molecular Dynamics)를 이용하여 자세히 조사하였다.
개별 밴드는 알코올-멸균된 칼을 이용하여 DGGE 겔로부터 절제하였다. 겔로부터 DNA의 추출은 Ferris 등(M. J. Ferris et al. 1996. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined population inhabiting a hot spring microbial mat community. Appl. Environ. Microbiol. 62: 340-346.)의 방법을 따랐다. 절제된 밴드는 500 ㎕ 무균 탈이온수를 보유하는 무균 2 ㎖ 스크루 캡 튜브에 위치시켰다. 이들 튜브는 유리 비드(cat. no.11079-101, Biospec Products Inc., Bartlesville, OK; 이후 "Biospec")로 반쯤 채우고, 기계적 비드 비터(mechanical bead beater)(MINI-BEADBEATER-8, Biospec)에서 3분간 최대 설정으로 위치시켰다. 가공된 DNA는 4℃에서 하룻밤동안 튜브 내에 방치하였다. 하룻밤 보관이후, 이들 튜브는 4℃에서 8분간 3,200 X g로 원심분리하여 겔 단편을 농축하였다. 상층액은 깨끗한 에펜도르프 튜브로 이전하였다.
추출 효능을 검사하기 위하여, 상층액은 가끔씩 DGGE 프라이머로 재-증폭하 고 DGGE로 재-분석하였다. 추출은 DGGE 분석에서, 혼성 집단 샘플에서 고유 DGGE 밴드와 동시-이동하는 단일 밴드가 산출되면 수용가능으로 간주되었다. 절제된 밴드의 뉴클레오티드 서열은 형광 표지된 프라이머를 이용한 전술한 방법으로 염기서열분석하였다.
실시예 6
올리고뉴클레오티드 프로브 개발
형광 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 본 연구에서 반응기로부터 밀접하게 관련된 박테리아로부터 분리된 16S rRNA 유전자와 특이적으로 혼성화되도록 설계되었다. 한 프로브, SNOBTP(GTT GCC CCG GAT TCT CGT TO)(SEQ ID NO:14)는 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2의 서열로 대표되는 아질산염-산화제(니트로코커스(Nitrococcus)-유사 박테리아) 및 니트로박테르 위노그라디스키(Nitrobacter winogradsky)로 대표되는 알파 하위 프로테오박테리아 아질산염-산화제를 제외하고, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8의 서열로 대표되는 본 연구에서 발견된 모든 니트로스피라(Nitrospira)-유사 박테리아를 표적한다. 상기 프로브는 20%의 포름아마이드 비율을 보유하는 Cy-3 또는 플루레신-ON(Qiagen Inc., USA)과 함께 성공적으로 이용되었다.
두 번째 프로브, NSP685(CAC CGG GAA TTC CGC GCT CCT C)(SEQ ID NO:15)는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5의 서열로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 박테리아의 특정 클레이드(클레이드 1)을 표적하는데 이용될 수 있다. 프로브 NSP685(SEQ ID NO:15)는 형과 염료 Cy-3으로 표지되고, 혼성화 절 차동안 2개의 추가 프로브가 반응물에 추가된다. 이들 2개의 추가 프로브는 플루레신-ON(Qiagen Inc., USA)으로 표지된 SNTSP2(CAC CGG GAA TTC CGC ACT CCT C)(SEQ 11) NO:16) 및 플루레신-ON으로 표지된 EUBAC338(GCT GCC TCC CGT AGG AGT)(SEQ ID NO:17)이다. 포름아마이드 비율은 55%이다. 이런 방식으로, 클레이드 1 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염 산화 박테리아는 현미경의 시야에서 유일하게 관찰되는 생물체이다.
세 번째 프로브 조합은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 박테리아의 다른 특정 클레이드(클레이드 2)를 표적하는데 이용될 수 있다. 이는 2개의 다른 프로브: Cy-3으로 표지된 NSP685(SEQ ID NO:15) 및 Cy-3으로 표지된 EUBAC338(SEQ ID NO:17)과 함께, 플루레신-ON으로 표지된 프로브 SNTSP2(SEQ ID NO:16)의 이용을 수반한다. 포름아마이드 비율은 55%이다. 이런 방식으로, 클레이드 2 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염 산화 박테리아는 현미경의 시야에서 유일하게 관찰되는 생물체이다.
네 번째 프로브, MOBP(CTC GCC AGC CAC CTT TCC GAA)(SEQ ID NO:18)은 모든 니트로스피라(Nitrospira)-유사 아질산염-생물체 및 니트로박테르 위노그라디스키(Nitrobacter winogradsky)로 대표되는 알파 하위 프로테오박테리아 아질산염-산화제를 제외하고, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2로 대표되는 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 아질산염-산화 생물체를 표적한다.
프로브 정합은 BLAST(S.F. Altschul et al. 1990. Basic local alignment tool. J. Mol. Biol. 21 5:403-410) 및 CHECK_PROBE(B.L. Maidak et al. 1994. The ribosomal database project. Nucleic Acids Res. 22:3485-3487)로 먼저 선별하였다. 프로브는 Operon Tech, Inc.(Alameda, CA)에서 합성하였다. 이들 프로브의 뉴클레오티드 서열은 표 9에 도시한다.
[표 9]
아질산염-산화 박테리아에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브와 PCR 프라이머 세트의 뉴클레오티드 서열과 위치.
이들 프로브(SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18)에 대한 엄밀도(stringency)는 반응기 바이오매스를 본 발명의 박테리아 서열(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8)에 대한 양성 대조로 이용하여, 상이한 포름아마이드 농도에서 일련의 FISH 실험을 통하여 결정하였다. 부착되고 고정된 세포의 In situ 혼성화는 0.9 M NaCl, 20 mM Tris/HCl(pH 7.4), 0.01% 황산 도데실 나트륨(SDS), 25 ng의 올리고뉴클레오티드 프로브, 변량의 포름아마이드로 구성되는 혼성화 용액에서 수행하였다. 슬라이드는 46℃에서 90 내지 120분간 평형화된 가습 챔버에서 배양하였다. 상기 혼성화 용액은 미리 데워진(48℃) 세척 용액으로 세척하였다. 이후, 이들 슬라이드는 48℃에서 15분간 상기 세척 용액에서 배양하였다. 혼성화 단계에서처럼 세척 단계동안 동일한 엄밀도를 달성하기 위하여, 세척 용액은 20 mM Tris/HCl(pH 7.4), 0.01% SDS, 5 mM EDTA, NaCl을 함유하였다. NaCl의 농도는 상기 용액에 사용된 포름아마이드의 비율에 따라 변하였다. NaCl 농도는 20% 포름아마이드에서 215 mM, 30%에서 120 mM, 40%에서 46 mM이었다. 세포는 FITC/FLUO3과 HQ CY3에 대한 필터 세트가 구비된 AXIOSKOP 2 표면형광 현미경(epifluorescence microscope)(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 검출하였다. 최적 엄밀도는 SNOBTP 프로브(SEQ ID NO: 14)의 경우 20% 포름아마이드인 것으로 결정되었다. NSP685와 SNTSP2 삼중-표지된 프로브(각각 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16)의 경우, 최적 엄밀도는 각각 55% 포름아마이드인 것으로 결정되었다. SEQ ID NO:18로 대표되는 MOBP 프로브의 경우, 최적 엄밀도는 20% 포름아마이드인 것으로 결정되었다.
실시예 7
PCR 프라이머 개발
본 발명의 서열의 니트로스피라(Nitrospira)-유사 박테리아를 특이적으로 검출하는 첫 번째 PCR 프라이머 세트(SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20)를 개발하였다(표 9). 본 발명의 서열의 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 박테리아를 특이적으로 검출하는 두 번째 PCR 프라이머 세트(SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22)를 개발하였다. 첫 번째 세트(SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20)는 다른 아질산염-산화 박테리아를 제외하고, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8에 열거된 16S rDNA 서열을 포함하는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 박테리아를 특이적으로 검출한다(표 10). 두 번째 세트(SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22)는 다른 아질산염-산화 박테리아를 제외하고, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2에 열거된 16S rDNA 서열을 포함하는 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 박테리아를 특이적으로 검출한다(표 10). PCR 조건은 어닐링 온도가 표 10에 기술된 바와 같이 변경된 점을 제외하고, 실시예 5에 앞서 기술된 바와 동일하였다.
[표 10]
PCR 프라이머 개발 특이성 검사와 어닐링 온도 실험의 결과
"+" 강한 신호, “-” 신호 없음, “+/-” 약한 신호
각 프라이머의 특이성은 Stratagene ROBOCYCLER의 온도 구배 양식을 이용하여 각 프라이머로 PCR 실험을 수행함으로써 최적화시켰다. 상기 양식에서, 모든 반응물의 단일 실험은 최대 12가지 상이한 어닐링 온도에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 이들 실험은 2℃ 증가 간격(increasing interval)으로 4 내지 6가지 상이한 온도에서 수행하였다. 각 PCR 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ 1:D NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론 산물에 대하여 검사하였다. 표 9는 PCR 프라이 머 세트를 제시하고, 최적 어닐링 온도 결과는 표 10에서 도시한다.
실시예 8
유사성 분석
아질산염의 질산염으로의 산화를 주도하는 아질산염 산화제의 실체를 확인하기 위하여, 염수 질산화 바이오매스로부터 3개의 클론 라이브러리를 작제하였다. 이들 바이오매스에 대한 상세는 표 11에서 제시한다.
[표 11]
바이오매스가 추출되고 클론 라이브러리가 작제된 반응기와 수족관에 관한 상세.
| 클론 라이브러리 | 질화 바이오매스의 상세 |
| P4 | 본 반응기는 염도가 30 내지 35 ppt로 유지된 염수 바이오매스인 바이오팜(biofarm) 15의 오수로부터 얻은 20 ℓ의 물질로 접종되었다. 상기 반응기는 5 ㎎/ℓ 암모니아-질소로 공급되었다. |
| SB7 | 본 반응기는 염도가 30 내지 35 ppt로 유지된 염수 바이오매스인 바이오팜(biofarm) 5와 15의 오수로부터 얻은 물질로 접종되었다. 상기 반응기는 5 ㎎/ℓ 암모니아-질소로 공급되었다. |
| B7 | 본 반응기는 염도가 30 내지 35 ppt로 유지된 염수 바이오매스인 바이오팜(biofarm) 5와 15의 오수로부터 얻은 물질로 접종되었다. 상기 반응기는 5 ㎎/ℓ 암모니아-질소로 공급되었다. |
상기 클론 라이브러리 데이터는 검사 암모니아 공급 반응기에 두 군의 아질산염-산화 박테리아가 존재한다는 것을 보여준다. 이들 2가지 유형의 아질산염-산화 박테리아는 니트로스피라(Nitrospira)-유사 생물체와 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 미생물이다(표 12). 하지만, 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB만 3가지 클론 라이브러리 모두에서 발견되었다. 니트로스피라(Nitrospira)-유 사 NOB로 확인된 클론의 비율은 선별된 전체 클론의 3.11 내지 33.33이었다. 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB는 3가지 클론 라이브러리 중에서 2개에서, 선별된 전체 클론의 2.56과 8.70의 비율로 발견되었다(표 12).
[표 12]
아질산염-산화 박테리아에 대하여 개발된 3가지 클론 라이브러리 내에서 상이한 계통발생 군에 속하는 클론의 숫자
"+" 존재; "--" 존재하지 않음. 선별된 전체 클론의 비율은 괄호안에 제시됨.
유사성 랭킹(similarity ranking)은 RDP(Maidak, B.L., J. R. Cole, C. T. Parker, Jr, G. M. Garrity, N. Larsen, B. Li, T. G. Lilburn, M. J. McCaughey, G. J. Olsen, R. Overbeek, S. Pramanik, T. M. Schmidt, J. M. Tiedje and C. R. Woese. A new version of the RDP(Ribosomal Database Project). Nucelic Acids Res. 27:171-173(1999))를 이용하여 본 명세서에 기술된 8개의 클론 서열(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8)에서 수행하였다(표 13).
[표 13]
반응기와 수족관으로부터 분리된 아질산염-산화 클론에 대한 유사성 랭킹
이와 같은 유사성 분석에서, 니트로코커스 모빌리스(Nitrococcus mobilis)와 98.9% 유사한 일군의 클론(SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2로 대표됨)이 확인되었다.
상기 유사성 분석에서, 본 발명의 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB(SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표됨)의 2가지 클레이드가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 클레이드 1은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5로 대표되는 NOB이다. 클레이드 1 내에서, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4로 대표되는 NOB는 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)와 99.2% 상동하고, SEQ ID NO:5로 대표되는 NOB는 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)와 98.7% 상동하다. 클레이드 2는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 NOB이다. 클레이드 2 내에서, SEQ ID NO:6으로 대표되는 NOB는 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)와 92.2% 상동하고, SEQ ID NO:7로 대표되는 NOB는 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)와 91.6% 상동하고, SEQ ID NO:8로 대표되는 NOB는 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)와 94.0% 상동하다.
이웃 결합 거리 분석과 부트스트랩 분석을 이용한 나무의 구성에 의한 이들 서열의 계통발생 분석은 유사성 분석의 결과를 뒷받침한다(도 1). 이들 계통발생 결과는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2가 가장 근접한 일족, 니트로코커스 모빌리스(Nitrococcus mobilis)와 유사할 가능성이 매우 높음을 보여준다. 하지만, 이들 결과는 또한, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2가 니트로코커스 모빌리스(Nitrococcus mobilis)가 아님을 입증한다.
이들 계통발생 결과는 또한, 공지된 니트로스피라(Nitrospira) 박테리아와 상이한 2가지 별개의 염수 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB 클레이드가 존재한다는 결론을 뒷받침한다(도 1). SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5로 대표되는 클레이드 1은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 클레이드 2와 상이하다. 클레이드 1 염수 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB의 가장 근접한 일족은 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)이다.
예로써, 클레이드 2 염수 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB(SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8)가 적어도 새로운 박테리아 종이라는 점은 확실하다. 상기한 유사성 분석 결과는 이들 가장 근접한 일족(니트로스피라 마리나(Nitrospira marina))이 최대 94.0%(SEQ ID NO:8의 경우) 상동하다는 것을 보여준다. 상기한 계통발생 분석 결과는 이들 3가지 서열이 모든 공지된 니트로스피라(Nitrospira) 박테리아와 분명하게 구별된다는 것을 보여준다(도 1). BLAST 분석 결과는 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)가 이들 서열에 대한 데이터베이스에서 가장 근접한 박테리아이긴 하지만, 상기한 유사성과 계통발생 분석 결과에 의해 입증되는 바와 같이 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)의 서열이 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 서열과 명백하게 구별된다는 것을 보여준다.
표 13에 제시된 유사성 랭킹은 박테리아 균주의 유일성을 결정하는 가이드이다. 새로운 박테리아 종을 규정하는 손쉬운 규칙은 존재하지 않는다. 하지만, 예로써, 0.989의 유사성 랭킹을 보유하는 암모니아-산화 박테리아 니트로솔로버스 멀티포르미스(Nitrosolobus multiformis)와 니트로소비브리오 테니스(Nitrosovibrio tennis)는 모든 생물학적 권위자에 의해 별개의 종으로 인식되며, 니트로솔로버스 멀티포르미스(Nitrosolobus multiformis)와 니트로소스피라 브리엔시스(Nitrosospira briensis)(0.980의 유사성 랭킹) 역시 별개의 종으로 인식된다. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4로 대표되는 박테리아 균주는 니트로스피라 마리 나(Nitrospira marina)와 비교하여 0.992의 유사성 랭킹을 보유한다. 이런 유사성 랭킹은 상기한 0.989보다 약간 더 높긴 하지만, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4는 니트로스피라 마리나(Nitrospira marina)로부터 충분히 구별되고 신규한 독특한 종을 구성한다.
이런 이유로, 상기한 클론 데이터, PCR 결과, 계통발생 분석 결과, DGGE 데이터, 유사성 랭킹을 종합하면, 본 명세서에 보고된 박테리아 균주는 공지된 아질산염-산화 박테리아로부터 명백하게 구별된다.
실시예 9
박테리아와 실험 결과의 분석
니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB의 클론 구성원은 클론 라이브러리가 개발된 3가지 염수 농축물 모두에서 발견되었다(표 12). 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB는 전체 클론의 3% 초과(SB7)에서 33% 이상(P4)까지, 확인된 전체 클론의 상당한 부분을 차지한다.
니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB는 3가지 클론 라이브러리 중에서 2개에서, 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB보다 적은 숫자로 발견되었다(표 12). 샘플 B7에서, 3% 미만의 클론이 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB로 확인되었고, 샘플 SB7에서 비율은 14이었다. 샘플 P4에서는 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB가 전혀 발견되지 않았다(표 12).
실시예 10
클론과 반응기의 변성 구배 겔 전기영동 조사
본 명세서에서 보고된 다양한 박테리아 균주의 신규성은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE) 검사의 결과에 의해 더욱 뒷받침된다. 도 2에서는 암모니아-와 아질산염-산화 박테리아와 함께, 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2) 및 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB의 클레이드 1(SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5)과 클레이드 2(SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8)에 전형적인 클론에 대한 DGGE 결과를 도시한다. 이들 결과는 겔에서 이동 거리에서 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2(니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB) 사이에 약간의 차이가 존재함을 보여준다. 3가지 클레이드 2 니트로스피라(Nitrospira)-유사 클론(SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8)에 대한 밴드 위치 역시 상이한데, 이는 16S rRNA 유전자에서 약간의 서열 차이에 기인한다(표 6-8). 더 나아가, 도 2에서 4가지 농축물(레인 E, F, G, H)의 밴드 위치를 비교하면, 겔에서 이들 농축물에 대한 밴드가 SEQ ID NO:1(니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB) 또는 SEQ ID NO:7(니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB)과 함께 정렬되는 지를 판단하기 어렵다.
이런 이유로, 두 번째 유형의 DGGE 분석이 설정되었다. 본 DGGE 분석을 위하여, 구배는 200 볼트에서 360분의 동작 시간(run time)동안 25 내지 55%의 표준에서 30 내지 60%의 구배로 수정되었다. 도 3에서는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2(둘 모두 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB) 및 SEQ ID NO:7(니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB)로 구성되는 일단의 혼성 클론 표준, 개별적으로 동작된 동일 클론, NOB 농축물(레인 A)에 대한 밴드 이동 패턴을 도시한다. 이들 결과는 상기 DGGE로 이들 3가지 클론의 밴드를 명확하게 분리할 수 있음을 보여준다. 이에 더하여, 상기 농축물(레인 A)에서 양 밴드는 절제하고 전술한 바와 같이 처리하며 염기서열분석하였다. 상부 밴드는 클론 SB7c32(SEQ ID NO:1)에 상응하고, 하부 밴드는 클론 B7c10(SEQ ID NO:7)에 상응하는데, 이런 결과는 상기한 방법과 결과의 유효성을 더욱 뒷받침한다.
도 4에서는 도 2에서와 동일하지만 변화된 겔 조건으로 인한 증가된 분석력으로 동일 농축 샘플을 보여주는 다른 DGGE 분석을 도시한다. 이들 결과는 환경 샘플에서 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB와 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB(레인 G-K)를 구별할 수 있음을 분명하게 보여준다.
실시예 11
박테리아 첨가물 검사
(1) 혼합물을 보유하지 않는 대조 수족관, (2) 열대 어류 수족관용 박테리아 혼합물이 접종된 수족관, (3) 본 발명의 박테리아 균주의 보존되거나 저장된 박테리아 혼합물과 비교하여, 본 발명의 박테리아 균주를 함유하는 다양한 박테리아 혼합물의 효능을 결정하는 일련의 실험을 수행하였다.
혼합물의 효능은 본 발명의 아질산염-산화 박테리아 균주가 수족관에서 아질산염을 산화시키고, 또한 다른 박테리아 균주(가령, 암모니아-산화 박테리아)와 혼합되는 경우에, 상기 박테리아가 수족관에서 질산화작용(nirification)의 확립을 가속화시킨다는 것을 보임으로써 입증된다. 질산화작용의 확립은 적어도 3가지 상이한 방법으로 측정될 수 있다. 첫 번째 방법은 새로운 수족을 조립한 이후 수족관용 물에서 암모니아와 아질산염 농도가 0 ㎎/ℓ 농도에 근접하는데 소요되는 일자 를 산정하는 것이다. 새로 조립된 염수 수족관에서, 암모니아 농도가 0 ㎎/ℓ 농도에 근접하는데 대략 14일 소요되고, 아질산염 농도가 0 ㎎/ℓ 농도에 근접하는 데에는 대략 30 내지 35일이 소요된다.
수족관에 질산화 박테리아 균주를 첨가할 때의 이점을 측정하는 두 번째 방법은 암모니아와 아질산염 농도가 0 ㎎/ℓ 농도로 떨어지기에 앞서 도달된 암모니아 또는 아질산염의 최대 농도를 비교하는 것이다. 질산화 박테리아가 첨가된 수족관에서 도달된 암모니아 또는 아질산염의 최대 농도가 대조 수족관에서 도달된 최대 농도보다 현저하게 낮으면, 효능이 입증된다.
실시예 12
박테리아 첨가물 검사
본 검사는 아질산염을 질산염으로 산화시키는 본 발명의 NOB 균주의 다양한 혼합물의 능력을 평가하는 것을 목적으로 하는데, 그 이유는 이들 혼합물이 “실세계” 설정에서 활용되기 때문이다. 본 발명의 혼합물은 담수 또는 염수 수족관에 사용하기 적합한 것으로 보고된 상업적으로 구입가능한 박테리아 혼합물과 효능을 비교하였다.
본 검사를 위하여, 15개의 10-갤런 수족관과 15개의 Penguin 170B(Marineland Aquarium Products) 헹-온-더-백(hang-on-the-back) 유형 파워 필터는 멸균하고 완전하게 세척하며 자연 건조시켰다. 다음날, 각 탱크는 10 lbs.의 세척된 Tideline Crushed Coral #5로 채우고, 멸균된 파워 필터(PF 0170B)와 세척된 탄소 카트리지를 설치하였다. 각 탱크는 35 ℓ의 인공 염수로 채웠다. 상기 염 수는 30 ppt 염도로 Tropic Marine 염 혼합물과 포스트 GAC 물의 조합이었다.
그 다음날, 탱크는 초순수 물로 마무리하여 증발을 보충하고 물 샘플을 채취하였다. 각 탱크는 한가지 박테리아 처리물을 투입하지만, 대조군에는 박테리아 혼합물을 첨가하지 않았다.
본 검사를 위하여 4가지 처리물이 존재하였다: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8로 대표되는 본 발명의 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB의 모든 균주를 보유하는 반응기 21과 29; CYCLE(담수 또는 염수에 사용되는 상업적으로 구입가능한 박테리아 혼합물); STRESS ZYME(담수 또는 염수에 사용되는 상업적으로 구입가능한 다른 박테리아 혼합물). 반응기 21 또는 29 처리물을 수용하는 수족관은 검사 1일에 둘중 한 혼합물 100 ㎖를 1회 투입하였다. CYCLE 또는 STRESS LYME 처리물을 수용하는 수족관은 검사 1일에 둘중 한 처리물 10 ㎖, 검사 7일에 추가로 10 ㎖, 이후의 검사 기간동안 매 7일마다 추가로 5 ㎖를 투입하였다. 4가지 분류된 담셀(damsel)(Pomacentrus spp.)은 검사 당일에 각 탱크에 추가하고 일일 2회 사료를 공급하였다.
물 샘플은 수집하고 pH, 암모니아, 아질산염, 전도도를 매일 분석하였다. 월요일, 수요일, 금요일에, 물은 질산염과 탁도를 검사하였다. pH는 Denver Instruments 콤비네이션 전극이 구비된 Denver Instruments Model 225 pH/Ion 측정기로 측정하였다. Tecator FIASTAR 5010 분석기를 이용하여 Tecator Application Note에 기술된 방법으로 암모니아, 아질산염, 질산염(질소로서)을 측정하였다. 염도는 YSI Model 30 소형 염도, 전도도, 온도 시스템을 이용하여 각 탱크에서 매일 직접 측정하였다. 탁도 데이터는 DRT-100 탁도 측정기(HF Scientific)로 측정하였다.
4가지 처리물과 대조에 대한 평균 아질산염 농도는 도 5에 도시한다. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표되는 NOB 균주를 포함하는 반응기 21과 29 처리물은 다른 처리물보다 훨씬 신속하게 아질산염을 산화시켰다. 이들 반응기 처리물에서 아질산염 농도는 다른 처리물에서보다 훨씬 빨리 정점에 도달하고 0 ㎎/ℓ로 회복되었다(도 5). 반응기 21은 21일에 0 ㎎/ℓ에 도달하였고, 반응기 29는 29일에 0 ㎎/ℓ에 도달한 반면, 대조와 상업적 첨가물은 37일 이후에도 0 ㎎/ℓ로 회복되지 않았다(도 5).
이들 결과는 (1) 본 발명의 NOB 균주가 새로 조립된 염수 수족관에서 아질산염 산화를 가속화시키고; (2) 니트로박테르 위노그라디스키(Nitrobacter winogradsky)를 보유하는 것으로 보고된 상업적 첨가물이 새로운 염수 수족관의 조립동안 아질산염을 조절하는데 무효하다는 것을 입증한다.
실시예 13
박테리아 첨가물 검사
본 검사는 아질산염을 질산염으로 산화시키는 본 발명의 NOB 균주의 다양한 혼합물의 능력을 평가하는 것을 목적으로 하는데, 그 이유는 이들 혼합물이 “실세계” 설정에서 활용되기 때문이다. 반응기 SB7(본 발명의 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB와 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB 균주를 모두 보유한다)로부터 물질은 수족관에 위치시키고, 상기 시스템은 박테리아가 접종되지 않 은 수족관과 효능을 비교하였다.
본 검사를 위하여, 8개의 10-갤런 수족관과 8개의 Penguin 170B(Marineland Aquarium Products) 헹-온-더-백(hang-on-the-back) 유형 파워 필터는 멸균하고 완전하게 세척하며 자연 건조시켰다. 다음날, 각 탱크는 10 lbs.의 세척된 Tideline Crushed Coral #5로 채우고, 멸균된 파워 필터(PF 0170B)와 세척된 탄소 카트리지를 설치하였다. 각 탱크는 35 ℓ의 인공 염수로 채웠다. 인공 염수는 염도가 30 ppt가 될 때까지, INSTANT OCEAN SeaSalts(Aquarium Systems, Mentor, Ohio)를 탄소 여과된 상수도에 첨가하여 만들었다. 수족관은 상기 염수로 채우고, 필터는 박테리아 첨가물과 어류의 추가에 앞서 하룻밤동안 작동시켰다.
그 다음날, 탱크는 초순수 물로 마무리하여 증발을 보충하고 물 샘플을 채취하였다. 이후, 4개의 탱크는 150 ㎖의 SB7 반응기 박테리아 혼합물을 투입하였다. 다른 4개의 탱크는 박테리아 혼합물을 투입하지 않았다. SB7 반응기 혼합물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8로 대표되는 본 발명의 니트로코커스(Nitrococcus)-유사 NOB 균주 및 니트로스피라(Nitrospira)-유사 NOB 균주로 구성되었다. 6마리의 흰동가리(clownfish)(Amphiprion ocellaris)는 검사 당일에 각 탱크에 추가하고 일일 2회 사료를 공급하였다. 물고기 사료는 동결된 브라인 슈림프(brine shrimp)와 스피룰리나(Spirulina) 박편의 혼합물이었다. 검사 3일에, 4가리의 흰동가리(Amphiprion ocellaris)를 각 수족관에 추가하였다.
물 샘플은 수집하고 pH, 암모니아, 아질산염, 전도도를 매일 분석하였다. 월 요일, 수요일, 금요일에, 물은 질산염과 탁도를 검사하였다. pH는 Denver Instruments 콤비네이션 전극이 구비된 Denver Instruments Model 225 pH/Ion 측정기로 측정하였다. Tecator FIASTAR 5010 분석기를 이용하여 Tecator Application Note에 기술된 방법으로 암모니아, 아질산염, 질산염(질소로서)을 측정하였다. 염도는 YSI Model 30 소형 염도, 전도도, 온도 시스템을 이용하여 각 탱크에서 매일 직접 측정하였다. 탁도 데이터는 DRT-100 탁도 측정기(HF Scientific)로 측정하였다.
SB7 처리물과 대조에 대한 평균 아질산염 농도는 도 6에 도시한다. SB7 처리물은 대조보다 훨씬 신속하게 아질산염을 산화시켰다. SB7 처리물을 수용하는 탱크에서 평균 아질산염 농도는 24일에 0 ㎎/ℓ에 도달한 반면, 대조 수족관에서는 아질산염 수치가 0 ㎎/ℓ의 동일한 수준에 도달할 때까지 38일이 소요되었다. 더 나아가, SB& 처리물의 평균 최대 아질산염 농도(대략 2.4 ㎎/L-N)는 대조 처리물의 평균 최대 아질산염 농도(대략 7.2 ㎎/L-N)보다 현저하게 낮았다(도 6).
이들 결과는 본 발명의 NOB 균주가 새로 조립된 염수 수족관에서 아질산염 산화를 가속화시키고 이 기간동안 아질산염을 독성 농도 미만으로 유지하는데 유효하다는 것을 입증한다.
실시예 14
박테리아 첨가물 검사
본 검사는 5.5개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 아질산염-산화 박테리아의 생존능을 평가하는 것을 목적으로 한다. 본 검사는 또한, 수성 배양기를 유지하는 상기한 다양한 조성물의 효능을 검사하는 것을 목적으로 한다.
방법: 박테리아의 준비
반응기 SB1로부터 600 ℓ의 NOB 및 반응기 SB2로부터 600 ℓ의 NOB는 서로 혼합하고 Harvest Only Tank(HOT)에서 하룻밤동안 안정시켰다. 양 반응기 SB1과 SB2는 본 발명의 모든 NOB 균주(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표됨)를 보유하고, 30 ppt의 염도로 유지되었다. 다음날, 가능한 많은 상층액을 탱크로부터 제거하였다. 가능한 많은 상층액에 제거될 때까지, 작은 용기에서 2차 농축을 수행하였다. 남아있는 박테리아는 수거하고 5 ℓ 용기에 위치시키며 4-5시간 추가로 안정시켰다. 다시, 가능한 많은 상층액을 제거하고, 용액은 두 부분으로 분할하였다. 이 시점에서, 변량의 트레할로스를 동결보존제로서 박테리아 용액에 첨가하였다. 한 용액에서, 5% 트레할로스 용액을 위하여 50g의 트레할로스를 1,000 ㎖의 NOB와 혼합하고, 다른 용액에서 10% 트레할로스 용액을 위하여 100g의 트레할로스를 1,000 ㎖의 NOB와 혼합하였다(표 14). 2가지 염수 반응기로부터 AOB는 냉동-건조를 위하여 유사하게 준비하였다. 샘플은 추가 가공에 앞서 4℃에 보관하였다. 동결보존제가 없는 과량의 NOB와 AOB는 양성 대조로서 4℃에 보관하였다.
[표 14]
냉동-건조를 위한 박테리아의 실험 설정
| 박테리아 유형 | SB1과 SB2 NOB | AOB |
| 염도 | 30 ppt | 30 ppt |
| 동결보존제 | 5%, 10% 트레할로스 | 5%, 10% 트레할로스 |
| 공정 | 건조 | 건조 |
| 동결 정도 | 건조동안 -40℃ | 건조동안 -40℃ |
| 일차 승화율 | 약함, 강함 | 약함, 강함 |
냉동-건조를 위하여, 이들 샘플은 2가지 일차 상승율(PSR): 약함과 강함을 검사하기 위하여 분할하였다. 모든 샘플은 미리 냉각된 트레이에 집어넣고 냉동기에 위치시켰다. 냉동기는 -40℃로 냉각하였다. 샘플은 3시간동안 동결하고, 이후 건조기에 위치시켰다. 이들 샘플은 약한 또는 강한 PSR에서 건조시켰다. 동결-건조된 샘플은 냉동 건조 형태로 4℃에서 5.5개월동안 보관하였다.
검사 설정: 28개의 5-갤런 수족관과 필터는 Sanaqua로 살균하고 세척하며 자연 건조시켰다. 수족관은 29 ppt 염도로 INSTANT OCEAN Sea Salts를 포스트-GAC에 용해시켜 만든 19 ℓ의 새로 제조된 인공 염수로 채웠다. 새로 세척된 탄소 카트리지와 새로운 BIOWHEEL이 구비된 Penguin 125 파워 필터를 각 수족관에 위치시키고 전원을 공급하며 하룻밤동안 작동시켰다. Access Test Database를 이용하여, 수족관은 각각 4개의 복제물로 구성되는 특정 처리물을 무작위로 지정하였다(표 15).
[표 15]
박테리아 첨가물 검사 48 설정
| 샘플 번호 | 동결보존제 | 일차 승화율 | 탱크당 물질의 양 | 액체 동등물의 추정 | |
| 7, 15, 20, 24 | 5% 트레할로스 | 빠름 | 1x | 0.4g AOB + 0.2g NOB | 2 ㎖ AOB + 1 ㎖ NOB |
| 4, 6, 13, 21 | 5% 트레할로스 | 빠름 | 5x | 2g AOB + 1.0g NOB | 10 ㎖ AOB + 5 ㎖ NOB |
| 1, 9, 10, 22 | 10% 트레할로스 | 느림 | 1x | 0.5g AOB + 0.25g NOB | 2 ㎖ AOB + 1 ㎖ NOB |
| 3, 8, 19, 23 | 10% 트레할로스 | 빠름 | 1x | 0.5g AOB + 0.25g NOB | 2 ㎖ AOB + 1 ㎖ NOB |
| 5, 17, 18, 27 | 4℃ | 1x | 1 ㎖ AOB + 0.5 ㎖ NOB | ||
| 2, 16, 25, 26 | 양성 | 1x | 1 ㎖ AOB + 0.5 ㎖ NOB | ||
| 11, 12, 14, 28 | 음성 |
검사의 출발 시점에서, 수족관은 탈이온수로 마무리하여 증발로 상실된 물을 보충하고, 기준 샘플을 채취하였다. 박테리아는 11 a.m.에 첨가하고, 2차 기준 샘플을 채취하기에 앞서 30분간 순환시켰다. 12:30 p.m.에, 9마리의 도미노 담셀( domino damsel)을 각 수족관에 추가하였다. 매일 아침, 수족관은 탈이온수로 마무리하고 샘플을 채취하였다.
이들 샘플은 pH, 암모니아, 아질산염, 탁도를 매일 분석하였다. 질산염은 전체 검사 기간동안 간헐적으로 측정하였다. 암모니아와 질산염은 Foss Application Note에 기술된 방법으로 Foss FIASTAR 5000에서 측정하였다. Tecator FIASTAR 5010 분석기를 이용하여 Tecator Application Note에 기술된 방법으로 질산염(질소로서)을 측정하였다. 탁도 데이터는 HF Scientific Micro 100 탁도 측정기로 측정하였 다.
결과: 표 16에서는 냉동 건조된 각 처리물에 대한 냉동-건조된 박테리아와 트레할로스 혼합물의 최초 습식 중량 및 냉동 건조이후 건식 중량 수율을 보고한다.
[표 16]
다양한 냉동-건조된 박테리아 처리물의 최초 습식 중량과 건식 중량 수율
| 박테리아 | % Cryo | PSR | 최초 부피 (ℓ) | 습식 wt(g) | 건식 wt(g) |
| AOB | 5% | 약함 | 1000 | 1047.2 | 200.5 |
| AOB | 5% | 강함 | 1000 | 1046.6 | 201.2 |
| AOB | 10% | 약함 | 1000 | 1082.4 | 248.4 |
| AOB | 10% | 강함 | 1000 | 1082.2 | 249.1 |
| NOB | 5% | 약함 | 500 | 539.7 | 102.4 |
| NOB | 5% | 강함 | 500 | 537.8 | 103.7 |
| NOB | 10% | 약함 | 500 | 549.0 | 122.0 |
| NOB | 10% | 강함 | 500 | 548.2 | 121.7 |
냉동 건조 공정동안, 아래의 사항에 유의하였다: 약한 PSR은 대략 35시간이 소요되었고 27℃의 온도에서 완료되었다. 강한 PSR은 대략 28시간이 소요되었고 27℃의 온도에서 완료되었다. NOB는 AOB보다 발리 건조되었다. 10% 트레할로스 용액은 건조 산물에서 얇은 당 층에 잔류하였다. 내부 끓음(internal boiling)은 관찰되지 않았다.
도 7에서는 본 검사에서 다양한 처리물에 대한 평균 암모니아 수치(N=4)를 도시한다. 음성 대조(박테리아 첨가없음)는 0 ㎎/ℓ 농도의 암모니아에 도달하는데 20일이 소요되었다. 상기 처리물에서 암모니아는 7일에 거의 7 ㎎/ℓ의 수치로 정 점에 도달하였다. 이들 수치와 대조적으로, 액체(양성 대조) 또는 냉동-건조 형태의 질산화 박테리아를 수용하는 모든 처리물은 O ㎎/ℓ 농도의 암모니아에 훨씬 빨리 도달하였다(도 7).
냉동-건조된 처리물에 대한 평균 암모니아 농도 수치는 양성 대조와 음성 대조의 수치 사이에 위치하였다(도 7). 일반적으로, 냉동-건조된 처리물을 수용하는 수족관은 대략 4-6 ㎎/ℓ의 최대 암모니아 농도에 도달하고 10일과 13일 사이에 O ㎎/ℓ로 회복되었다.
본 검사의 다양한 처리물의 평균 아질산염 농도는 도 8에 제시한다. 이들 결과는 암모니아 데이터에 대한 결과를 반영한다. 양성 대조 또는 냉동-건조 형태의 여부에 상관없이, 박테리아 접종물을 수용하는 모든 수족관은 음성 대조를 수용하는 수족관보다 훨씬 빨리 질산화반응을 나타냈다(도 8).
도 9는 암모니아와 아질산염의 소멸이 이들 화합물의 질산염으로의 산화에 기인함을 확증한다. 상기 도면은 모든 처리물이 시간의 추이에서 질산염 농도의 증가를 유도한다는 것을 분명하게 보여준다. 양성 대조 처리물은 검사를 시작한 직후에 질산염을 생산하기 시작하였다. 냉동-건조된 처리물은 대략 10-15일 정도에 질산염을 생산하기 시작하였다. 이는 질산화반응이 접종되지 않은 수족관에서보다 본 발명의 박테리아 균주가 접종된 수족관에서 훨씬 빨리 확립된다는 것을 확증한다.
본 검사의 이들 결과는 본 발명의 박테리아 균주의 냉동-건조된 제조물이 냉동-건조 형태로 장기간 보관이후에도 생존능 및 아질산염을 질산염으로 산화시키는 능력을 유지한다는 것을 입증한다. 본 검사의 이들 결과는 또한, 본 발명의 박테리 아 균주의 액체 제조물과 냉동-건조 제조물이 비-접종된 수족관보다 훨씬 빨리 새로 조립된 수족관에서 질산화반응을 확립할 수 있음을 입증한다. 본 검사의 이들 결과는 또한, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수성 배양기의 유지를 위한 조성물이 상기 수성 배양기에서 암모니아를 아질산염으로, 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 15
박테리아 첨가물 검사
본 검사는 11개월동안 보관된 냉동-건조된 염수 아질산염-산화 박테리아의 생존능을 평가하고 수성 배양기에서 아질산염의 농도를 감소시키기 위한 염수 아질산염 산화 박테리아의 최적량을 결정하는 것을 목적으로 한다. 본 검사는 또한, 수성 배양기를 유지하는 상기한 다양한 조성물의 효능을 검사하는 것을 목적으로 한다.
방법: 박테리아의 준비
반응기 SB1로부터 600 ℓ의 NOB 및 반응기 SB2로부터 600 ℓ의 NOB는 서로 혼합하고 Harvest Only Tank(HOT)에서 하룻밤동안 안정시켰다. 양 반응기 SB1과 SB2는 본 발명의 모든 NOB 균주(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표됨)를 보유하고, 30 ppt의 염도로 유지되었다. 다음날, 가능한 많은 상층액을 탱크로부터 제거하였다. 가능한 많은 상층액에 제거될 때까지, 작은 용기에서 2차 농축을 수행하였다. 남아있는 박테리아는 수거하고 5 ℓ 용기에 위치시키며 4-5시간 추가로 안정시 켰다. 다시, 가능한 많은 상층액을 제거하고, 용액은 두 부분으로 분할하였다. 이 시점에서, 변량의 트레할로스를 동결보존제로서 박테리아 용액에 첨가하였다. 한 용액에서, 5% 트레할로스 용액을 위하여 50g의 트레할로스를 1,000 ㎖의 NOB와 혼합하고, 다른 용액에서 10% 트레할로스 용액을 위하여 100g의 트레할로스를 1,000 ㎖의 NOB와 혼합하였다(표 17). 2가지 염수 반응기로부터 AOB는 냉동-건조를 위하여 유사하게 준비하였다. 샘플은 추가 가공에 앞서 4℃에 보관하였다. 동결보존제가 없는 과량의 NOB와 AOB는 양성 대조로서 4℃에 보관하였다.
[표 17]
냉동-건조를 위한 박테리아의 실험 설정
| 박테리아 유형 | SB1과 SB2 NOB | AOB |
| 염도 | 30 ppt | 30 ppt |
| 동결보존제 | 5%, 10% 트레할로스 | 5%, 10% 트레할로스 |
| 공정 | 건조 | 건조 |
| 동결 정도 | 건조동안 -40℃ | 건조동안 -40℃ |
| 일차 승화율 | 약함, 강함 | 약함, 강함 |
냉동-건조를 위하여, 이들 샘플은 2가지 일차 상승율(PSR): 약함과 강함을 검사하기 위하여 분할하였다. 모든 샘플은 미리 냉각된 트레이에 집어넣고 냉동기에 위치시켰다. 냉동기는 -40℃로 냉각하였다. 샘플은 3시간동안 동결하고, 이후 건조기에 위치시켰다. 이들 샘플은 약한 또는 강한 PSR에서 건조시켰다. 동결-건조된 샘플은 냉동 건조 형태로 4℃에서 11개월동안 보관하였다.
비교 검사를 위한 2 ℓ의 새로운 세포를 양 염수 NOB 반응기(SB1과 SB2)로부터 채취하고, 5 ℓ의 새로운 세포를 2개의 염수 AOB 반응기로부터 채취하였다. NOB 는 개별적으로 합치고 하룻밤동안 안정시켰다. 다음날, 상층액은 따라버리고, 남아있는 샘플은 Imhoff 침강 콘(setting cone)에 위치시켜 밀도를 측정하였다. 밀도에 기초하여, 28 ppt의 염도로 INSTANT OCEAN Sea Salts와 탈이온수를 혼합하여 새로 만든 염수를 이용하여 고용량 농도로 희석하였다(표 18). 염수로 상기 원액을 연속 희석하여 본 검사에 이용되는 배양기와 저용량을 달성하였다(표 18)
검사 설정: 22개의 5-갤런 수족관과 필터는 Sanaqua로 살균하고 세척하며 자연 건조시켰다. 수족관은 29 ppt 염도로 INSTANT OCEAN Sea Salts를 포스트-GAC에 용해시켜 만든 37 ℓ의 새로 제조된 인공 염수로 채웠다. 새로 세척된 탄소 카트리지와 새로운 BIOWHEEL이 구비된 Penguin 125 파워 필터를 각 수족관에 위치시키고 전원을 공급하며 하룻밤동안 작동시켰다. Access Test Database를 이용하여, 수족관은 각각 4개의 복제물로 구성되는 특정 처리물을 무작위로 지정하였다(표 18).
[표 18]
박테리아 첨가물 검사 48 설정
| 샘플 번호 | 동결보존제 | 일차 승화율 | 탱크당 물질의 양 | 액체 동등물의 추정 | |
| 4, 27, 29, 30 | 5% 트레할로스 | 빠름 | 1x | 0.4g AOB + 0.2g NOB | 2 ㎖ AOB + 1 ㎖ NOB |
| 12, 19, 28, 31 | 5% 트레할로스 | 빠름 | 5x | 2g AOB + 1.0g NOB | 10 ㎖ AOB + 5 ㎖ NOB |
| 14, 15, 17, 22 | 10% 트레할로스 | 빠름 | 1x | 0.5g AOB + 0.25g NOB | 2 ㎖ AOB + 1 ㎖ NOB |
| 6, 7, 18, 23 | 4℃ | -- | 1x | 1 ㎖ AOB + 0.5 ㎖ NOB | -- |
| 새로운 세포 | 탱크당 세포의 양 | [AOB]와 용량 | [NOB]와 용량 | ||
| 1, 3, 20, 32 | 높은 용량 | 1 ㎖ AOB + 0.5 ㎖ NOB | 4x | 5 ㎖/ℓ 200 ㎖/탱크 | 2.5 ㎖/ℓ 200 ㎖/탱크 |
| 5, 8, 9, 21 | 중간 용량 | 0.5 ㎖ AOB + 0.25 ㎖ NOB | 2x | 2.5 ㎖/ℓ 200 ㎖/탱크 | 1.25 ㎖/ℓ 200 ㎖/탱크 |
| 2, 10, 25, 26 | 낮은 용량 | 0.25 ㎖ AOB + 0.125 ㎖ NOB | 1x | 1.25 ㎖/ℓ 200 ㎖/탱크 | 0.625 ㎖/ℓ 200 ㎖/탱크 |
| 11, 13, 16, 24 | 음성 | -- | 0 | 0 |
검사의 출발 시점에서, 수족관은 탈이온수로 마무리하여 증발로 상실된 물을 보충하고, 기준 샘플을 채취하였다. 박테리아는 10 a.m.에 첨가하고, 2차 기준 샘플을 채취하기에 앞서 30분간 순환시켰다. 매일 아침, 수족관은 탈이온수로 마무리하고 샘플을 채취하였다. 샘플링이후 매일 수동으로 암모니아(0.5 ㎎/ℓ)를 수족관에 첨가하여 물고기 배설을 모의하였다.
이들 샘플은 pH, 암모니아, 아질산염, 탁도를 매일 분석하였다. 질산염은 전체 검사 기간동안 간헐적으로 측정하였다. 암모니아와 질산염은 Foss Application Note에 기술된 방법으로 Foss FIASTAR 5000에서 측정하였다. Tecator FIASTAR 5010 분석기를 이용하여 Tecator Application Note에 기술된 방법으로 질산염(질소로서)을 측정하였다. 탁도 데이터는 HF Scientific Micro 100 탁도 측정기로 측정하였다.
결과: 표 19에서는 냉동 건조된 각 처리물에 대한 냉동-건조된 박테리아와 트레할로스 혼합물의 최초 습식 중량 및 냉동 건조이후 건식 중량 수율을 보고한다.
[표 19]
다양한 냉동-건조된 박테리아 처리물의 최초 습식 중량과 건식 중량 수율
| 박테리아 | % Cryo | PSR | 최초 부피 (ℓ) | 습식 wt(g) | 건식 wt(g) |
| AOB | 5% | 약함 | 1000 | 1047.2 | 200.5 |
| AOB | 5% | 강함 | 1000 | 1046.6 | 201.2 |
| AOB | 10% | 약함 | 1000 | 1082.4 | 248.4 |
| AOB | 10% | 강함 | 1000 | 1082.2 | 249.1 |
| NOB | 5% | 약함 | 500 | 539.7 | 102.4 |
| NOB | 5% | 강함 | 500 | 537.8 | 103.7 |
| NOB | 10% | 약함 | 500 | 549.0 | 122.0 |
| NOB | 10% | 강함 | 500 | 548.2 | 121.7 |
냉동 건조 공정동안, 아래의 사항에 유의하였다: 약한 PSR은 대략 35시간이 소요되었고 27℃의 온도에서 완료되었다. 강한 PSR은 대략 28시간이 소요되었고 27℃의 온도에서 완료되었다. NOB는 AOB보다 발리 건조되었다. 10% 트레할로스 용액은 건조 산물에서 얇은 당 층에 잔류하였다. 내부 끓음(internal boiling)은 관찰되지 않았다.
도 10에서는 본 검사에서 다양한 처리물에 대한 평균 암모니아 수치(N=4)를 도시한다. 음성 대조(박테리아 첨가없음)는 0 ㎎/ℓ 농도의 암모니아에 도달하는데 20일이 소요되었다. 상기 처리물에서 암모니아는 12일에 거의 7 ㎎/ℓ의 수치로 정점에 도달하였다. 이들 수치와 대조적으로, 액체 형태 또는 냉동-건조 형태의 질산화 박테리아를 수용하는 모든 처리물은 O ㎎/ℓ 농도의 암모니아에 훨씬 빨리 도달하였다(도 10).
액체 형태의 경우, 용량이 높을수록 질산화반응이 더욱 빨리 확립되는 분명한 경향이 나타났다. 고용량 처리에서 평균 암모니아 수치는 0.3 ㎎/ℓ를 초과하지 않았고, 수족관은 4일에 0 ㎎/ℓ NH3-N에 도달하였다. 중간 용량 처리에서, 평균 암모니아 농도는 대략 1 ㎎/ℓ의 최대 수치에 도달하였고 5일에 0 ㎎/ℓ로 회복되었다. 저용량 처리에서, 평균 암모니아 농도는 1.5 ㎎/ℓ의 최대 수치에 도달하였고 6일에 0 ㎎/ℓ로 회복되었다.
냉동-건조된 처리물에 대한 평균 암모니아 농도 수치는 서로 매우 밀접하고, 액체 처리물과 대조의 수치 사이에 위치하였다(도 10). 일반적으로, 냉동-건조된 처리물을 수용하는 수족관은 대략 4 ㎎/ℓ의 최대 암모니아 농도에 도달하고 10일과 12일 사이에 O ㎎/ℓ로 회복되었다.
본 검사의 다양한 처리물의 평균 아질산염 농도는 도 11에 제시한다. 이들 결과는 암모니아 데이터에 대한 결과를 반영한다. 접종되지 않은 수족관은 거의 26 ㎎/ℓ NO2-N의 최대 농도에 도달한 이후 0 ㎎/ℓ NO2-N에 도달하는데 평균적으로 50일 이상 소요되었다. 액체 형태 또는 냉동-건조 형태의 여부에 상관없이, 박테리아 접종물을 수용하는 모든 수족관은 접종되지 않은 수족관보다 훨씬 빨리 질산화 반응을 나타냈다(도 11).
도 12는 암모니아와 아질산염의 소멸이 이들 화합물의 질산염으로의 산화에 기인함을 확증한다. 상기 도면은 모든 처리물이 시간의 추이에서 질산염 농도의 증가를 유도한다는 것을 분명하게 보여준다. 액체 처리물은 검사를 시작한 직후에 질산염을 생산하기 시작하였다. 냉동-건조된 처리물은 대략 17일 정도에 질산염을 생산하기 시작하기 시작한 반면, 접종되지 않은 수족관은 대략 40일까지 질산염을 생산하지 못하였다. 이는 질산화반응이 접종되지 않은 수족관에서보다 본 발명의 박테리아 균주가 접종된 수족관에서 훨씬 빨리 확립된다는 것을 확증한다.
본 검사의 이들 결과는 본 발명의 박테리아 균주의 냉동-건조된 제조물이 냉동-건조 형태로 장기간 보관이후에도 생존능 및 아질산염을 질산염으로 산화시키는 능력을 유지한다는 것을 입증한다. 본 검사의 이들 결과는 또한, 본 발명의 박테리아 균주의 액체 제조물과 냉동-건조 제조물이 비-접종된 수족관보다 훨씬 빨리 새로 조립된 수족관에서 질산화반응을 확립할 수 있음을 입증한다. 본 검사의 이들 결과는 또한, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수성 배양기의 유지를 위한 조성물이 상기 수성 배양기에서 암모니아를 아질산염으로, 아질산염을 질산염으로 산화시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 16
박테리아 첨가물 검사
본 검사는 5개월동안 보관된 동결된 염수 아질산염-산화 박테리아의 생존능을 평가하고, 14개월동안 상이한 온도에서 액체에 보관된 박테리아의 생존을 평가 하는 것을 목적으로 한다. 본 검사는 또한, 수성 배양기를 유지하는 상기한 다양한 조성물의 효능을 검사하는 것을 목적으로 한다.
방법: 박테리아의 준비
본 검사를 위하여 반응기 SB1과 SB2로부터 염수 NOB를 수거하였다. 양 반응기 SB1과 SB2는 본 발명의 모든 NOB 균주(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8로 대표됨)를 보유하고, 30 ppt의 염도로 유지되었다. 본 검사를 위하여 2가지 염수 반응기로부터 AOB 역시 수거하였다. AOB와 NOB의 3가지 원액(stock skolution)을 제조하였는데, 이들 각각은 동결보존제로서 0%, 5%, 10% 트레할로스를 함유하였다. 이후, 샘플은 4℃에서 1시간동안, 그 다음 -80℃에서 72시간동안 배치하였다. 최종적으로, 이들 샘플은 3개로 분할하고, 3가지 상이한 보관 온도: -15℃, -20℃, -80℃에 배치하였다. 이들 샘플은 이들 온도에서 5개월동안 보관하였다.
대략 11개월 전에, 반응기 SB1과 SB2로부터 염수 NOB 및 AOB 반응기로부터 AOB는 3가지 상이한 온도: 4℃, 실온, 37℃에서 보관하였다. 이들 액체 샘플은 14개월동안 보관하였다. 보관 기간의 종결 시점에서, 각 보관 조건은 상이한 세포 밀도를 결과하였다. 따라서, 각 샘플은 동등량의 세포를 보유하도록 희석하였다(표 20). 최종적으로, 박테리아 첨가물 51 검사를 설정하기 직전에 반응기 SB1과 SB2 및 AOB 반응기부터 박테리아 샘플을 수거함으로써 양성 NOB와 AOB 대조를 선별하였다.
[표 20]
액체 샘플의 제조
| 세포 | 온도 | 밀도 | 희석 | 수율 |
| AOB | 4℃ | 11 ㎖/ℓ | 450㎖ + 50㎖ 물 | 5㎖/ℓ |
| AOB | 실온 | 5 ㎖/ℓ | 500㎖ + O㎖ 물 | 5㎖/ℓ |
| AOB | 37℃ | 7.5 ㎖/ℓ | NOB에 첨가된 666㎖ | 5㎖/ℓ |
| NOB | 4℃ | 2.5 ㎖/ℓ | 400㎖ + 100㎖ 물 | l㎖/ℓ |
| NOB | 실온 | 1 ㎖/ℓ | 모든 세포를 이용 | l㎖/ℓ |
| NOB | 37℃ | 3 ㎖/ℓ | AOB에 첨가된 333㎖ | l㎖/ℓ |
검사 설정: 36개의 5-갤런 수족관과 필터는 Sanaqua로 살균하고 세척하며 자연 건조시켰다. 수족관은 30 ppt 염도로 INSTANT OCEAN Sea Salts를 포스트-GAC에 용해시켜 만든 19 ℓ의 새로 제조된 인공 염수로 채웠다. 새로 세척된 탄소 카트리지와 새로운 BIOWHEEL이 구비된 Penguin 170 파워 필터를 각 수족관에 위치시키고 전원을 공급하며 하룻밤동안 작동시켰다. Access Test Database를 이용하여, 수족관은 각각 4개의 복제물로 구성되는 특정 처리물을 무작위로 지정하였다(표 21). 검사를 위한 처리 조건은 다양한 동결 보관된 박테리아와 액체 박테리아에서 수행된 초기 생존능 검사에 기초하여, 더욱 넓은 박테리아 보관 조건에서 선택되었다(다양한 농도의 트레할로스와 함께 -80℃, -20℃, -15℃에서 동결된 박테리아 및 4℃, 실온, 37℃에서 액체 박테리아).
[표 21]
박테리아 첨가물 검사를 위한 검사 설정
| 처리 | 보관 시간 | 탱크 번호 | 트레할로스 % | AOB/NOB(㎖) 첨가 부피 | AOB/NOB 첨가된 세포(㎖) |
| FT 17-10℃ | 5개월 | 12, 14, 16, 18 | 5% | 2㎖/0.4㎖ | 2㎖/0.4㎖ |
| FT 17-15℃ | 5개월 | 3, 7, 15, 22 | 10% | 2㎖/0.4㎖ | 2㎖/0.4㎖ |
| FT 17-20℃ | 5개월 | 1, 2, 5, 28 | 10% | 2㎖/0.4㎖ | 2㎖/0.4㎖ |
| FT 17-80℃ | 5개월 | 8, 11, 13, 23 | 10% | 2㎖/0.4㎖ | 2㎖/0.4㎖ |
| 음성 | 4, 9, 10, 32 | 박테리아 없음 | |||
| 양성 | 24, 31, 35, 36 | 0% | 25㎖ 전체 | 2.5㎖/1.8㎖ | |
| 액체 실온 | 14개월 | 17, 20, 21, 25 | 0% | 100㎖/l00㎖ | 1㎖/0.2㎖ |
| 액체 37℃ | 14개월 | 19, 26, 27, 33 | 0% | 100㎖/100㎖ | 1㎖/0.2㎖ |
| 액체 4℃ | 14개월 | 6, 29, 30, 34 | 0% | 100㎖/100㎖ | 1㎖/0.2㎖ |
검사의 출발 시점에서, 수족관은 탈이온수로 마무리하여 증발로 상실된 물을 보충하고, 기준 샘플을 채취하였다. 박테리아는 첨가하고, 2차 기준 샘플을 채취하기에 앞서 30분간 순환시켰다. 매일 아침, 수족관은 탈이온수로 마무리하고 샘플을 채취하였다. 샘플링이후 매일 수동으로 암모니아(0.5 ㎎/ℓ)를 수족관에 첨가하여 물고기 배설을 모의하였다.
이들 샘플은 pH, 암모니아, 아질산염, 탁도를 매일 분석하였다. 질산염은 전체 검사 기간동안 간헐적으로 측정하였다. 암모니아와 질산염은 Foss Application Note에 기술된 방법으로 Foss FIASTAR 5000에서 측정하였다. Tecator FIASTAR 5010 분석기를 이용하여 Tecator Application Note에 기술된 방법으로 질산염(질소로서)을 측정하였다. 탁도 데이터는 HF Scientific Micro 100 탁도 측정기로 측정하였다.
도 13에서는 본 검사에서 다양한 처리물에 대한 평균 암모니아 수치(N=4)를 도시한다. 음성 대조(박테리아 첨가없음)는 0 ㎎/ℓ 농도의 암모니아에 도달하는데 25일이 소요되었다. 상기 처리물에서 암모니아는 14일에 거의 7 ㎎/ℓ의 수치로 정점에 도달하였다. 이들 수치와 대조적으로, 동결된 또는 액체 처리물을 수용하는 모든 실험 수족관은 O ㎎/ℓ 농도의 암모니아에 훨씬 빨리 도달하였다(도 13).
도 14에서는 본 검사에서 다양한 처리물에 대한 평균 아질산염 수치(N=4)를 도시한다. 음성 대조 및 37℃에 보관된 액체 박테리아 처리물을 수용하는 수족관은 30일 이후에도 감소되지 않는 상승된 아질산염 수준을 보였다. 이들 수치와 대조적으로, 동결된 또는 액체 처리물을 수용하는 나머지 실험 수족관은 아질산염 농도에서 감소를 보였다(도 14).
도 15에서는 본 검사에서 다양한 처리물에 대한 평균 질산염 수치(N=4)를 도시한다. 모든 수족관은 검사 과정동안 질산염 농도에서 상당한 증가를 보였다. 37℃에 보관된 액체 세포를 제외하고, 동결된 또는 액체 처리물을 수용하는 수족관은 질산염 농도에서 지속적인 상승 추세를 보였다(도 15).
본 검사의 이들 결과는 본 발명의 NOB의 동결된 제조물이 5개월간의 동결 보관이후에도 아질산염을 질산염으로 산화시키는 능력을 유지한다는 것을 입증한다. 본 검사의 이들 결과는 또한, 본 발명의 NOB에 대한 최적 동결 보관 온도가 -80℃ 이지만 -20℃와 -15℃ 역시 우수한 보관 온도임을 입증한다.
상기한 설명은 본 발명의 특정 구체예를 인용하지만, 이의 기술적 사상을 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하다. 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 진실한 기술적 사상과 범위 내에 이들 개변을 포섭한다. 이런 이유로, 본 명세서에 개시된 구체예는 설명을 목적으로 하며, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 특허청구범위의 균등한 범위에 속하는 모든 변화는 여기에 포섭된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Hovanec, Timothy A
Phalen, Carol M
<120> Nitrite-Oxidizing Bacteria and methods of using and Detecting the Same
<130> 81289-294289
<140> US 10/682,179
<141> 2003-10-09
<160> 22
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1495
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> NOB SB7c32 16S rDNA
<400> 1
Tgatcatggc tcagattgaa cgctggcggc atgcctaaca catgcaagtc gagcggcagc 60
agcgcctttc ttcggaaagg tggctggcga gcggcggacg ggtgagtaac gcgtgggaat 120
ctaccttcgg tgggggatag cccggggaaa ctcggattaa taccgcatac gcctacgggg 180
gaaagcgggc ctctgcttgc aagctcgcac cgatggatga gcccgcgtcc gattagctag 240
ttggtggggt aatggcctac caaggcgacg atcggtagct ggtctgagag gacgatcagc 300
cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 360
caatgggcgc aagcctgatc cagcaatgcc gcgtgggtga agaaggcctg cgggttgtaa 420
agccctttca gtcgggagga aaagcatcgg gttaatacct cggtgtcttg acgttaccgg 480
cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt 540
taatcggaat tactgggcgt aaagcgcatg taggcggtcg gataagtcgg gtgtgaaagc 600
cccgggctca acctgggaat tgcatccgat actgtttggc tagagtctgg tagagggagg 660
cggaattccc ggtgtagcgg tgaaatgcgt agatatcggg aggaacacca gtggcgaagg 720
cggtctcctg gatcaagact gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780
ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg aggactagcc gttggattca ttaatgagtc 840
tagtggcgca gctaacgcgt taagtcctcc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac 900
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac 960
gcgaagaacc ttacctgctc ttgacatctc cggaacctta cagagatgtg agggtgcctt 1020
cgggaaccgg atgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080
taagtcccgc aacgagcgca acccttgccc ctagttacca gcggttcggc cggggactct 1140
agggggactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc 1200
ttatgggcag ggctacacac gtgctacaat ggccggtaca aagggttgca aaccgtggag 1260
gggagctaat cccaaaaagc cggtcccagt ccggattgca gtctgcaact cgactgcatg 1320
aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag caatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt cggctgcacc agaagtcggt agcctaacct 1440
tcttaggaag gagggcgctg cccacggtgt ggtcgatgac tggggtgaag tcgta 1495
<210> 2
<211> 1450
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> NOB SB7c11 16S rDNA
<400> 2
gatcatggct cagattgaac gctggcggca tgcctaacac atgcaagtcg agcggcagca 60
gcacctctct tcggaaaggt ggctggcgag cggcggacgg gtgagtaacg cgtgggaatc 120
taccttcggt gggggatagc ccggggaaac tcggattaat accgcatacg cctacggggg 180
aaagcgggcc tctgcttgca agctcgcacc gatggatgag cccgcgaccg attagctagt 240
tggtggggta acggcctacc aaggcgacga tcggtagctg gtctgagagg acgatcagcc 300
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac 360
aatgggcgca agcctgatcc agcaatgccg cgtgggtgaa gaaggcctgc gggttgtaaa 420
gccctttcag ccgggaggaa aagcatcggg ttaatacctc gatgtgttga cgttaccggc 480
agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt 540
aatcggaatt actgggcgta aagcgcatgt aggcggtcgg ataagtcggg tgtgaaagcc 600
ccgggctcaa cctgggaatt gcatccgata ctgtttgtct agagtctggt agagggaggc 660
ggaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta gatatcggga ggaacaccag tggcgaaggc 720
ggtctcctgg atcaagactg acgctgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780
taccctggta gtccacgccg taaacgatga ggactagccg ttggattcat taatgagtct 840
agtggcgcag ctaacgcgtt aagtcctccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg 960
cgaagaacct tacctgctct tgacatctcc ggaaccttgc agagatgtga gggtgccttc 1020
gggaaccgga tgacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aggtcccgca acgagcgcaa cccttgcccc tagttaccag cggttcggcc ggggactcta 1140
gggggactgc cggtgacaaa ccggaggatg gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct 1200
tatgagcagg gctacacacg tgctacaatg gccggtacaa agggttgcaa accgtgaggg 1260
ggagctaatc ccaaaaagcc ggtcccagtc cggattgcag tctgcaactc gactgcatga 1320
agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc aatgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380
gtacacaccg cccgtcacac catgggagtc ggctgcacca gaagtcggta gcctaacctt 1440
cttaggaagg 1450
<210> 3
<211> 1445
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> NOB SB7c136 16S rDNA
<400> 3
tgatcatggc tcagaacgaa cgctggcggc gcgcctaaca catgcaagtc gaacgagaat 60
ccggggcaac tcggtagtaa agtggcaaac gggtgaggaa tacatgggta acctgccctt 120
gagaagggaa taacccgccg aaaggtgagc taatacccta tacgctatca tttttacgaa 180
aaagatagga aagccaagtc gaggacttgg tactcaagga ggggctcatg tcctatcagc 240
ttgttggtgg ggtaacggcc taccaaggct acgacgggta gctggtctga gaggatgatc 300
agccacactg gcactgagat acgggccaga ctcctacggg aggcagcagt gaggaatatt 360
gcgcaatggg cgaaagcctg acgcagcgac gccgcgtggg ggatgaaggt tttcggattg 420
taaacccctt tcatgaggaa agataaagtg ggtaaccact tagacggtac ctcaagaaga 480
agccacggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga wggtggcgag cgttgttcgg 540
atttactggg cgtaaagagc acgtaggcgg ttgggaaagc cttttgggaa atctcccggc 600
ttaaccggga aaggtcgaga ggaactactc agctagagga cgggagagga gcgcggaatt 660
cccggtgtag cggtgaaatg cgtagatatc gggaagaagg ccggtggcga aggcggcgct 720
ctggaacgta cctgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 780
ggtagtccac gccctaaacg atgggtacta agtgtcggcg gtttaccgtc ggtgccgcag 840
ctaacgcagt aagtaccccg cctggggagt acggccgcaa ggttgaaact caaaggaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgacgcaacg cgaggaacct 960
tacccaggtt ggacatgctc gtggtacgaa cctgaaaggg tgaggacctc gaaaggggag 1020
cgagctcagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgttgg gttaagtccc 1080
gcaacgagcg taacccctgt cttcagttgc catcgggtca tgccgagcac tctgaagaga 1140
ctgcccagga taacggggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcagcatgg cctttatgcc 1200
tggggctaca cacgtgctac aatgaccggt acagagggtt gcaatcccgc aagggggagc 1260
caatctcaaa aaaccggcct cagttcagat tggggtctgc aactcgaccc catgaaggtg 1320
gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380
accgcccgtc acaccacgaa agtcagctgt accagaagtc actggcgcca acctgcaagg 1440
gaggc 1445
<210> 4
<211> 1450
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> NOB SB7c47 16S rDNA
<400> 4
tgatcatggc tcagaacgaa cgctggcggc gcgcctaaca catgcaagtc gaacgagaat 60
ccggggcaac tcggtagtaa agtggcaaac gggtgaggaa cacatgggta acctgccctt 120
gagaagggaa taacccgccg aaaggtgagc taatacccta tacgctatca tttttacgaa 180
aaagatagga aagccaagtc gaggacttgg tactcaagga ggggctcatg tcctatcagc 240
ttgttggtgg ggtaacggcc taccaaggct acgacgggta gctggtctga gaggatgatc 300
agccacactg gcactgagat acgggccaga ctcctacggg aggcagcagt gaggaatatt 360
gcggaatggg cgaaagcctg acgcagcgac gccgcgtggg ggatgaaggt cttcggattg 420
taaacccctt tcatgaggaa agataaagtg ggtaaccact tagacggtac ctcaagaaga 480
agccacggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga aggtggcgag cgttgttcgg 540
atttactggg cgtaaagagc acgtaggcgg ttgggaaagc cttttgggaa atctcccggc 600
ttaaccggga aaggtcgaga ggaactactc agctagagga cgggagagga gcgcggaatt 660
cccggtgtag cggtgaaatg cgtagatatc gggaagaagg ccggtggcga aggcggcgct 720
ctggaacgta cctgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 780
ggtagtccac gccctaaacg atgggtacta agtgtcggcg gtttaccgtc ggtgccgcag 840
ctaacgcagt aagtaccccg cctggggagt acggccgcaa ggttgaaact caaaggaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgacgcaacg cgaagaacct 960
tgcccaggtt ggacatgctc gtggtacgaa cctgaaaggt gaggacctcg aaaggggagc 1020
gagctcaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgt aacccctgtc ttcagttgcc atcgggtcat gccgagcact ctgaagagac 1140
tgcccaggat aacggggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcagcatggc ctttatgcct 1200
ggggctacac acgtgctaca atgaccggta cagagggttg caatcccgca agggggagcc 1260
aatctcaaaa aaccggcctc agttcagatt ggggtctgca actcgacccc atgaaggtgg 1320
aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccacgaaa gtcagctgta ccagaagtca ctggcgccaa cctgcaaggg 1440
agggcaggtg 1450
<210> 5
<211> 1473
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> NOB R21c76 16S rDNA
<400> 5
gaacgaacgc tggcggcgcg cctaacacat gcaagtcgaa cgagaatccg gggcaacccg 60
gtagtaaagt ggcaaacggg tgaggaatgc atgggcaacc tgcccttgag aagggaataa 120
cccgccgaaa ggtgggctaa taccctatac gctatcttct tttcggaaaa gataggaaag 180
cttggtcgag gactcggcac tcaaggaggg gctcatgtcc tatcagcttg ttggtggggt 240
aacggcctac caaggctacg acgggtagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggca 300
ctgagatacg ggccagactc ctacgggagg cagcagtgag gaatattgcg caatgggcga 360
aagcctgacg cagcgacgcc gcgtggggga tgaaggtttt cggattgtaa acccctttca 420
tgaggaaaga taaagtgggt aaccacttag acggtacctc aagaagaagc cacggctaac 480
ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg tggcaagcgt tgttcggatt tactgggcgt 540
aaagagcacg taggcggttg ggaaagcctc ttgggaaatc tcccggctta accgggaaag 600
ttcgagaggt actattcagc tagaggacgg gagaggagcg cggaattccc ggtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agatatcggg aagaaggccg gtggcgaagg cggcgctctg gaacgtacct 720
gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
ctaaacgatg ggtactaagt gtcggcggtt taccgtcggt gccgcagcta acgcagtaag 840
taccccgcct ggggagtacg gccgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga cgcaacgcga agaaccttac ccaggttgga 960.
catgctcgtg gtacgaacct gaaagggtga ggaccttgaa agaggagcga gctcaggtgc 1020
tgcatggctg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgttgggtt aagtcccgca acgagcgtaa 1080
cccctgtctt cagttgccat cgggtcatgc cgagcactct gaagagactg cccaggataa 1140
cggggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc agcatggcct ttatgcctgg ggctacacac 1200
gtgctacaat gaccggtaca gagggttgca atcccgcaag ggggagccaa tctcaaaaaa 1260
ccggcctcag ttcagattgg ggtctgcaac tcgaccccat gaaggtggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgaaagt cagctgtacc agaagtcact ggcgccaacc cgcaaggggg gcaggtgccc 1440
aaggtatggt tggtaattgg ggtgaagtcg taa 1473
<210> 6
<211> 1473
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> NOS R21c28 16S rDNA
<400> 6
atcctggctc agaacgaacg ctgcggcgcg cctaacacat gcaagtcgaa cgagaatccg 60
ggcaacctgg tagtaaagtg gcgaacgggt gaggaataca tgggtaacct gcccttgaga 120
atggaataac ctatcgaaag atgggctaat accatatacg cttcctgatt cgaggattgg 180
gaaggaaagt cgtatcgagg atacggcgtt caaggagggg ctcatggcct atcagcttgt 240
tggtggggta acggcctacc aaggcaacga cgggtagctg gtctgagagg atgatcagcc 300
acactggcac tgagatacgg gccagactcc tacgggaggc agcagtgagg aatattgcgc 360
aatgggcgaa agcctgacgc agcgacgccg cgtgggggat gaaggttttc ggattgtaaa 420
cccctttcag gaggaaagat aaggcaggtt actgcctgga cggtacctcc agaagaagcc 480
acggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggt ggcgagcgtt gttcggattt 540
actgggcgta aagagcgcgt aggcggttag gtaagcctct tgtggaatct ccggcttaac 600
cgggaatagt cgagggtaac tgcttagcta gagggcggga gaggagtgcg gaattcccgg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag atatcgggaa gaaggccggt ggcgaaggcg gcactctgga 720
acgcacctga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccct aaacgatggg cactaagtgt cggcggttta ccgccggtgc cgcagctaac 840
gcagtaagtg ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgacg caacgcgaag aaccttaccc 960
aggttggaca tgcaagtagt aagaacctga aagggggatg agcccgcaag ggcagcttgc 1020
tcaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gccgtgaggt gttggttaag tcccgcaacg 1080
agcgtaaccc ctgtcttcag ttgccatcgg gtcatgccgg gcactctgga gagactgccc 1140
aggataacgg ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcagc atggccttta tgcctggggc 1200
tacacacgtg ctacaatgac cggtacaaag ggttgcaatc ccgcaagggt gagctaatct 1260
caaaaaacca gtctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg 1320
ctagtaatcg gagatcagca cgctccgatg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgggagtcgg ctgctccaga agtagttatc ttaacccgca aggagggagg 1440
ctaccaagga tcggtcggtg actggggtga agt 1473
<211> 1480
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> NOB B7c10 16S rDNA
<400> 7
catggctcag aacgaacgct gcggcgcgcc taacacatgc aagtcgaacg agaatccggg 60
gcaactcggt agtaaagtgg cgaacgggtg aggaatacat gggtaacctg cccttgaaag 120
tggaataacc tatcgaaaga tgggctaata ccatatacgc ttcctagttt gcggattagg 180
aaggaaagtc gtatcgagga tacggtgttc aaggaggggc tcatggccta tcagcttgtt 240
ggtggggtaa tggcctacca aggcaacgac gggtagctgg tctgagagga tgatcagcca 300
cactggcact gagatacggg ccagactcct acgggaggca gcagtgagga atattgcgca 360
atgggcgaaa gcctgacgca gcgacgccgc gggggggatg aaggttttcg gattgtaaac 420
ccctttcagg agggaagaaa aagcgggtaa ccgcccggac ggtacctcca gaagaagcca 480
cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaaggtg gcgagcgttg ttcggattta 540
ctgggcgtaa agagcgcgta ggcggttagg taagcctctt gtgaaagctc ccggcttaac 600
cgggaatggt cgaggggaac tacttagcta gagggcggga gaggagtgcg gaattcccgg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag atatcgggaa gaaggccggt ggcgaaggcg gcactctgga 720
acgcacctga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccct aaacgatggg cactaagtgt cggcggttta ccgtcggtgc cgcagctaac 840
gcagtaagtg ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgacg caacgcgaag aaccttaccc 960
aggttggaca tgcaagtagt aagaacctga aaggggatga gcccgcaagg agcttgctca 1020
ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgtaacccct gtcttcagtt gccatcgggt catgccgggc actctggaga gactgcccag 1140
gataacgggg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcagcat ggcctttatg cctggggcta 1200
cacacgtgct acaatgaccg gtacaaaggg ttgcaatccc gtaaggggga gctaatctca 1260
aaaaaccggc ctcagttcag attggggtct gcaactcgac cccatgaagg tggaatcgct 1320
agtaatcggg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac atattgtccg 1380
tcacagcacg aaagtcagct gtaccagaag ttgctggcgc taacccgtaa ggaggcaggt 1440
gcccaaggta tggttggtaa ttggggtgaa gtcgtaacaa 1480
<210> 8
<211> 1490
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> NOB B7c7 16S rDNA
<400> 8
tttgatcatg gctcagaacg aacgctggcg gcgcvvctaa cacatgcaag tcgaacgaga 60
atccggggca actcggtagt aaagtggcga acgggtgagg aatacatggg taacctgccc 120
ttgaaagtgg aataacctat cgaaagatgg gctaatacca tatacgcttc ctagtttgcg 180
gattaggaag gaaagtcgta tcgaggatac ggtgttcaag gaggggctca tggcctatca 240
gcttgttggt ggggtaatgg cctaccaagg caacgacggg tagctggtct gagaggatga 300
tcagccacac tggcactgag atacgggcca gactcctacg ggaggcagca gtgaggaata 360
ttgcgcaatg ggcgaaagcc tgacgcagcg acgccgcgtg ggggatgaag gttttcggat 420
tgtaaacccc tttcaggagg gaagaaaaag cgggtaaccg cccggacgat acctccagaa 480
gaagccacag ctaacttcgt gccagcaacc gcggtaatac aagggtagcg aacgttgttc 540
aaatttacta ggcgtaaaga gcacatagac aattaggtaa gcctcttgtg aaagctcccg 600
gcttaaccgg gaatggtcga ggggaactac ttagctagaa aacaggagaa aagtacgaaa 660
ttcccaatat aacaataaaa tacataaata tcaaaaagaa ggccggtggc gaaggcggca 720
ctctggaacg cacctgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc acgccctaaa cgatgggcac taagtgtcgg cggtttaccg tcggtgccgc 840
agctaacgca gtaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac 960
cttacccagg ttggacatgc aagtagtaag aacctgaaag gggatgagcc cgcaaggagc 1020
ttgctcaggt gctgcatagc tgtcgtcaac tcgtgccata aagtgttggg ttaagtccca 1080
caacaagcgt aacccctgtc ttcagttgcc atcgggtcat gccgggcact ctggagagac 1140
tgcccaggat aacggggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcagcatggc ctttatgcct 1200
ggggctacac acgtgctaca atgaccggta caaagggttg caatcccgta agggggagct 1260
aatctcaaaa aaccggcctc agttcagatt ggggtctgca actcgacccc atgaaggtgg 1320
aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccacgaaa gtcagctgta ccagaagtcg ctggcgctaa cccgtaagga 1440
ggcaggtgcc caaggtatgg ttggtaattg gggtgaagtc gtaacaaggt 1490
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 9
Gtttgatcct ggctcag 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 10
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 11
cctacgggag gcagcag 17
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 12
gwattaccgc ggckgctg 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 13
Caccgggaat tccgcgctcc tc 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide Probe
<400> 14
gttgccccgg attctcgttc 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide Probe
<400> 15
Caccgggaat tccgcgctcc tc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide Probe
<400> 16
Caccgggaat tccgcactcc tc 22
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide Probe
<400> 17
gctgcctccc gtaggagt 18
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide Probe
<400> 18
Ctcgccagcc acctttccga a 21
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 19
Tccggggcaa ccyggta 17
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 20
Tcmccctttc aggttc 16
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 21
Ttcggaaagg tggctggcga g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Primer
<400> 22
Atctctgyaa ggttccggag 20
Claims (49)
- 아질산염을 질산염으로 산화시키는 분리된 박테리아 균주에 있어서, 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 균주.
- 제 1항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 동일한 것을 특징으로 하는 박테리아 균주.
- 아질산염을 질산염으로 산화시키는 분리된 박테리아 균주의 생물학적으로 순수한 배양액에 있어서, 상기 박테리아 균주의 16S rDNA는 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 순수한 배양액.
- 제 3항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 동일한 것을 특징으로 하는 생물학적으로 순수한 배양액.
- 아질산염을 질산염으로 산화시키는 분리된 박테리아 균주를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 박테리아 균주는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 열거된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 5항에 있어서, 액체 형태, 동결 형태, 냉동 건조 형태, 분말 형태에서 선택되는 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 5항에 있어서, 중합체에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 7항에 있어서, 중합체는 아크릴아마이드(acrylamide), 카라기난(carrageenan), 알기네이트(alginate), 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 5항에 있어서, 암모니아-산화 생물체, 아질산염-산화 미생물, 질산염-환원 미생물, 종속영양 미생물, 이들의 조합에서 선택되는 미생물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 아질산염을 질산염으로 산화시키는 농축된 박테리아 균주를 함유하는 조성물 에 있어서, 상기 박테리아 균주의 16S rDNA는 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 10항에 있어서, 박테리아 균주는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 동일한 16S rDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 10항에 있어서, 암모니아-산화 생물체, 아질산염-산화 미생물, 질산염-환원 미생물, 종속영양 미생물, 이들의 조합에서 선택되는 미생물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 아질산염을 질산염으로 산화시키는 적어도 2개의 분리된 박테리아 균주를 함유하는 조성물에 있어서, 적어도 2개의 분리된 박테리아 균주 각각은 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열에서 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 13항에 있어서, 암모니아-산화 생물체, 아질산염-산화 미생물, 질산염-환원 미생물, 종속영양 미생물, 이들의 조합에서 선택되는 미생물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 13항에 있어서, 적어도 2개의 박테리아 균주에는 SEQ ID NO:1에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:3에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:4에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:5에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:6에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:7에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:8에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주가 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 13항에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 냉동 건조 공정으로 생산되는 것을 특징으로 하는 조성물:적어도 2개의 분리된 박테리아 균주를 동결보존제(cryoprotectant)로 처리하고;처리된 박테리아 균주를 냉동기에 위치시키고;처리된 박테리아 균주를 냉동기로부터 이전하고;진공 압력하에 박테리아 균주를 건조시킨다.
- 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
- 제 17항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8에서 선택되는 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
- 전장에서 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 96% 상동성을 보이는 올리고뉴클레오티드 프로브에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아의 핵산에 혼성화되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
- SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머.
- 전장에서 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 96% 상동성을 보이는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머에 있어서, 상기 PCR 프라이머는 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아의 핵산에 혼성화되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머.
- 배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방하는 방법에 있어서,아질산염을 질산염으로 산화시키는 박테리아 균주를 제공하고, 여기서 상기 박테리아 균주는 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방할 만큼 충분한 양의 박테리 아 균주를 상기 배양기에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 배양기는 염수 수족관, 담수 수족관, 폐수, 양식 시설(aquaculture facility)에서 액체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 배양기 도입 단계에는 배양기에서 회전원판 접촉장치(rotating biological contactor), 바이오필터, 중합체에서 선택되는 담체(vector)에 박테리아 균주를 배치하는 과정이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방하는 방법에 있어서,아질산염을 질산염으로 산화시키는 박테리아 균주를 제공하고, 상기 박테리아 균주는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 열거된 뉴클레오티드 서열을 포함하고;배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방할 만큼 충분한 양의 박테리아 균주를 상기 배양기에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방하는 생물적 환경 정화(bioremediation) 방법에 있어서,아질산염을 질산염으로 산화시키는 박테리아 균주를 제공하고, 상기 박테리아 균주는 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;배양기를 교정할 만큼 충분한 양의 박테리아 균주를 상기 배양기에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방하는 방법에 있어서,아질산염을 질산염으로 산화시키는 적어도 2개의 분리된 박테리아 균주를 함유하는 조성물을 제공하고, 여기서 적어도 2개의 분리된 박테리아 균주 각각은 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열에서 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA 서열을 포함하고;배양기에서 아질산염의 축적을 완화하거나 예방할 만큼 충분한 양의 조성물을 상기 배양기에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 적어도 2개의 박테리아 균주에는 SEQ ID NO:1에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:3에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:4에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:5에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:6에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:7에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:8에 열거된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 조성물은 암모니아-산화 생물체, 아질산염-산화 미생물, 질산염-환원 미생물, 종속영양 미생물, 이들의 조합에서 선택되는 미생물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 배양기에서 아질산염을 질산염으로 산화시키는 박테리아의 양을 검출하고 결정하는 방법에 있어서, 상기 박테리아의 16S rDNA는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 보유하고,SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 검출가능하게 표지된 프로브를 제공하고;배양기로부터 전체 DNA를 분리하고;검출가능하게 표지된 프로브가 상기 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아의 핵산에만 혼성화되는 조건하에, 분리된 전체 DNA를 상기 프로브에 노출시키고;혼성화된 프로브의 양을 검출하고 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 배양기는 염수 수족관, 담수 수족관, 폐수, 양식 시설에서 액체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 배양기는 수족관 자갈, 필터 스펀지, 필터 솜, 플라스틱 필터 매체에서 선택되는 물질을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33항에 있어서, 배양기로부터 전체 DNA 분리 단계에는 상기 물질로부터 전체 DNA를 분리하는 과정이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 검출가능하게 표지된 프로브 제공 단계에는 DNA 칩에 검출가능하게 표지된 프로브를 도입하는 과정이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 자동화 공정을 통합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항에 있어서, 자동화 공정은 DNA 마이크로어레이, 단백질 마이크로어레이, 바이오센서, 생물프로브, 모세관 전기영동, 실시간 중합효소 연쇄 반응에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 혼성화된 프로브의 존재는 아질산염을 질산염으로 산화시키는 박테리아의 존재를 지시하고, 혼성화된 프로브의 양은 배양기에서 아질산염을 질산염으로 산화시키는 상기 박테리아의 양을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 배양기에서 아질산염을 질산염으로 산화시키는 박테리아의 양을 검출하고 결정하는 방법에 있어서, 상기 박테리아의 16S rDNA는 전장에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8과 적어도 96% 상동성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 보유하고,전장에서 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 96% 상동성을 보이는 검출가능하게 표지된 프로브를 제공하고;배양기로부터 전체 DNA를 분리하고;검출가능하게 표지된 프로브가 상기 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아의 핵산에만 혼성화되는 조건하에, 분리된 전체 DNA를 상기 프로브에 노출시키고;혼성화된 프로브의 양을 검출하고 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 배양기는 염수 수족관, 담수 수족관, 폐수, 양식 시설에서 액체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 배양기는 수족관 자갈, 필터 스펀지, 필터 솜, 플라스틱 필터 매체에서 선택되는 물질을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 41항에 있어서, 배양기로부터 전체 DNA 분리 단계에는 상기 물질로부터 전체 DNA를 분리하는 과정이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 검출가능하게 표지된 프로브 제공 단계에는 DNA 칩에 검출가능하게 표지된 프로브를 도입하는 과정이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 자동화 공정을 통합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 44항에 있어서, 자동화 공정은 DNA 마이크로어레이, 단백질 마이크로어레이, 바이오센서, 생물프로브, 모세관 전기영동, 실시간 중합효소 연쇄 반응에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 혼성화된 프로브의 존재는 아질산염을 질산염으로 산화시키는 박테리아의 존재를 지시하고, 혼성화된 프로브의 양은 배양기에서 아질산염을 질산염으로 산화시키는 상기 박테리아의 양을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 고체 기질;상기 고체 기질에 배열된 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA 칩.
- 제 47항에 있어서, 프로브는 공유 결합에 의해 고체 기질에 부착되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
- 대략 1:3 비율로 존재하는 아질산염-산화 박테리아와 암모니아-산화 박테리아를 함유하는 조성물에 있어서, 아질산염-산화 박테리아에는 SEQ ID NO:1과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:3과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:4와 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:5와 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:6과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:7과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주, SEQ ID NO:8과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 16S rDNA를 포함하는 박테리아 균주가 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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