KR100877840B1 - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 암모늄산화균 그룹의선택적 정량 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 암모늄산화균 그룹의 선택적 정량 방법에 관한 것으로, 암모늄산화균의 각 그룹의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 및 형광물질로 표지된 프로브를 제작하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 질산화 공정에서 암모늄산화균(ammonia oxidizing bacteria)의 각 그룹을 선택적으로 정량하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 제공하는 특이적 프라이머 및 형광물질로 표지된 프로브를 이용하면 신속하고 정확하게 계통발생학적으로 분류된 암모늄산화균의 5개 그룹를 정량할 수 있다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 프라이머 및 프로브 셋트(primer and probe set), 절대 정량(absolute quantification), 그룹 특이적(group-specific), 암모늄산화균(ammonia oxidizing bacteria), 질산화 공정(nitrification process)
Description
도 1은 24종의 플라스미드를 대상으로 Nsm1-셋트(set)를 사용하는 실시간(real-time) PCR을 수행하여 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage)에 속하는 3종의 플라스미드만이 선택적으로 검출되었음을 나타낸다.
도 2는 24종의 플라스미드를 대상으로 Nsm2-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드만이 선택적으로 검출되었음을 나타낸다.
도 3은 24종의 플라스미드를 대상으로 Nsm3-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드만이 선택적으로 검출되었음을 나타낸다.
도 4는 24종의 플라스미드를 대상으로 Nsm4-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage)에 속하는 2종의 플라스미드만이 선택적으로 검출되었음을 나타낸다.
도 5는 24종의 플라스미드를 대상으로 Nss-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드만이 선택적으로 검출되었음을 나타낸다.
도 6은 10배의 연속희석 DNA 시료를 대상으로 Nsm1-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage)에 속하는 3종의 플라스미드(pNeur, eNeur, eNhal)에 대해 순서대로 기울기 -3.667, -3.418, -3.421 그리고 절편 38.12, 36.90, 38.55로 산출되었음을 나타낸다.
도 7은 10배의 연속희석 DNA 시료를 대상으로 Nsm2-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드(eNmob)에 대해 기울기 -3.262 그리고 절편 37.28로 산출되었음을 나타낸다.
도 8은 10배의 연속희석 DNA 시료를 대상으로 Nsm3-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드(eNnit)에 대해 기울기 -3.478 그리고 절편 37.68로 산출되었음을 나타낸다.
도 9는 10배의 연속희석 DNA 시료를 대상으로 Nsm4-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage)에 속하는 2종의 플라스미드(pNcry, eN343)에 대해 순서대로 기울기 -3.390, -3.729 그리고 절편 36.73, 38.10로 산출되었음을 나타낸다.
도 10은 10배의 연속희석 DNA 시료를 대상으로 Nss-셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드(pNmul)에 대해 기울기 -3.394 그리고 절편 38.14로 산출되었음을 나타낸다.
본 발명은 암모늄산화균(ammonia oxidizing bacteria)에 속하는 5개의 그룹에 각각 특이적인 5개의 프라이머와 프로브 셋트(primer and probe set)를 제작하고, 이들과 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 이용하여 질산화공정에서 암모늄산화균을 각 그룹에 따라 선택적으로 신속, 정확하게 정량하는 방법에 관한 것이다.
수중의 암모니아성 질소는 다양한 미생물군집의 정교한 상호작용에 의해 질산화/탈질 반응을 통하여 무해한 질소가스로 전환된다. 그중에서도 암모늄산화반응은 이에 관여하는 암모늄산화균의 느린 생장속도로 인하여 전체 질소제거 공정의 율속단계로 알려져 있다. 따라서 질산화공정의 성공적인 운전 및 효율향상을 위해 제반공정뿐만 아니라 암모늄산화균에 대한 충분한 미생물생태학적 이해가 전제되어야 한다. 즉 전체 공정에서 가장 중요한 단계에 관여하는 암모늄산화균의 종류 및 농도를 정성정량적으로 정확히 분석하는 것이 필수적이다. 그러나 지금까지는 공정에 참여하는 이들 다양한 미생물 그룹들을 개별적으로 분석하는 것이 불가능했기 때문에 건조중량과 같은 하나의 변수로 나타낼 수밖에 없었다. 생물공정의 실패율을 낮추고 효율은 높이기 위한 연구가 쉽지 않았던 것은 이러한 블랙-박스 모델(black-box model)에 기초한 공정의 설계, 진단, 운전에 기인한 것이라 여겨진다. 생물공정의 물리화학적 변수와 더불어 개별 미생물군집에 대한 정성정량적 정보는 질산화공정을 보다 정확히 진단 및 예측하고 고효율 운전의 조건을 도출하기 위해서 반드시 필요하다. 따라서 각 단계를 담당하는 주요 미생물 그룹의 개체수를 모니터링 및 선택적으로 정량 분석하는 기술의 개발이 요구되지만 현재까지는 이와 같은 분석을 신속하고 간편하게 수행할 수 있는 방법이 거의 없는 실정이다(Rittmann and McCarty. 2001. Environmental biotechnology. McGraw-Hill, 581-585).
환경기술에서 가장 널리 사용되는 전통적 방법은 건조중량(dry weight) 또는 VSS(volatile suspended solid)를 측정하여 생물량의 지표로 삼는 것이다. 그러나 다양한 종류의 부유 고형물과 유기물을 포함하는 하수 및 산업폐수를 처리하는 질산화공정에서는 생물량(biomass)과 VSS를 구별할 수 없다는 근본적인 문제가 발생한다. 또한 콜로니 수 세기(colony count), MPN(most probable number)방법 등과 같은 전통적인 배양의존법은 까다로운 암모늄산화균의 배양조건 및 매우 낮은 생장속도로 인해 실제 질산화공정에서 미생물 정량에 이용되는데 한계가 많은 실정이다.
전통적인 생물량 측정법의 한계와 문제점을 극복하기 위해 다양한 생명공학기술이 도입되기 시작하였다. 16S rRNA 유전자 라이브러리(gene library)법은 해당 공정에서 DNA를 추출한 후 계통발생의 지표로 이용되는 16S rRNA 유전자(gene)를 증폭한다. 그리고 16S rRNA 유전자 라이브러리(gene library)를 만든 후 염기서열을 분석하면 질산화공정에 존재하는 개별 미생물을 동정하고 주요 군집들의 구성비율을 추정할 수 있다. 그러나 이 방법은 PCR(polymerase chain reaction)에 내재하는 종료점 검출법(end-point detection)에 의한 증폭오차(Beller et al. 2002. Environ. Sci. Technol. 36:3977-3984; Becker et al. 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66:4945-4953)와 염기서열을 분석해야 하는 샘플 수의 제한 등의 한계 때문에 미생물군집을 정량적으로 분석하기는 힘들다. 또한 PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) 방법이 질산화 공정에 일부 적용된 사례가 있으나 기술의 정성적 특성과 종말점 검출법에 의한 제한 등으로 정량적 분석에는 많은 어려움이 따르고 있다(Nicolaisen and Ramsing. 2002. J. Microbiol. Meth. 50:189-203).
현재 질산화 공정에서 미생물의 선택적 정량을 위해 가장 많이 사용되는 방법은 블롯 결합법(blot hybridization)와 FISH(fluorescence in situ hybridization)법이다. 이들 방법은 15-25개의 염기로 구성된 형광표지를 부착한 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 사용한다. 이들 프로브는 대상 미생물에만 존재하는 16S rRNA 염기서열과 상보적(complementary)인 염기서열을 가지도록 설계되며, 형광 또는 방사성 표지가 부착되어 있다. 따라서 특정 미 생물 또는 미생물 그룹만의 16S rRNA와 결합된 후, 발광되는 형광 또는 방사능의 세기로써 생물량을 간접적으로 정량할 수 있다(Rittmann and McCarty. 2001. Environmental Biotechnology. McGraw-Hill, 581-585). 많은 종류의 생물공정에서 이들 결합법에 의해 다양한 종류의 미생물군집들이 정량되었고, 반응의 진행에 따른 군집구조의 변화를 규명함으로써 해당 공정에 대한 이해를 크게 발전시켰다(Bouvier and del Giorgio. 2003. FEMS Microbiol. Ecol. 44:3-15; Nogueira et al. 2002. Water Res. 36:469-481; Wagner et al. 1998. Wat. Sci. Tech. 37:441-449).
그러나 이들 결합법은 개별 미생물(또는 미생물 그룹)을 전체 미생물에 대한 비율로 표현하는 상대정량만을 할 수 밖에 없는 구조적인 한계점을 내포하고 있다. 이는 세포 내 16S rRNA의 양은 세포의 종류, 기질의 농도, 성장단계, 주위 환경 등에 따라 큰 편차를 보이기 때문에 세포 당 평균 16S rRNA양을 추정할 수 없기 때문이다(Amann et al. 1995. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 59:143-169). 또한 전통적인 방법에 비해 월등하지만 정량한계(detection limit)가 1% 이상으로서 비교적 높으며 분석기간이 오래 걸리는 문제점이 있다(Amann et al. 1995. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 59:143-169; Suzuki et al. 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66:4605-4614).
따라서 질산화공정에서 암모늄산화균 각 군집의 농도를 지속적으로 모니터링 및 정량하기 위해서는 신속하고 정확하게 더욱 낮은 정량한계까지 절대정량 할 수 있는 기술이 반드시 필요하다.
본 발명의 목적은 암모늄산화균의 계통발생학적 분류에 따른 5개의 그룹에 각각 특이적인 5개의 프라이머 및 프로브 셋트를 제공하며, 상기 프이머 및 프로브 셋트와 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 질산화공정에서 암모늄산화균 각 그룹의 농도를 신속, 정확하고 매우 낮은 농도까지 절대정량 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
1) 암모늄산화균을 특이적으로 정량할 수 있는 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열을 제작하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브가 포함된 PCR 반응혼합물을 제조하여 암모늄산화균의 DNA를 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서의 형광 신호를 측정하여 반응물 내의 최초 시료를 정량하는 단계를 포함하는 암모늄산화균의 선택적 정량방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암모늄산화균을 특이적으로 정량할 수 있는 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브를 포함하는 암모늄산화균의 정량키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
계통발생학적으로 암모늄산화균은 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria) 강(class) 하위의 니트로소모나다시애(Nitrosomonadaceae) 과(family)에 속하는 암모늄산화균과 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) 강(class) 하위의 니트로소코쿠스(Nitrosococcus) 속(genus)에 속하는 암모늄산화균으로 분류되며, 다시 니트로소모나다시애(Nitrosomonadaceae) 과는 16S rRNA 유전자(gene) 서열의 상동성에 의해 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage), 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage), 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage), 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage), 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage) 등의 5개의 하위 그룹으로 분류될 수 있다. 본 발명자들은 상기 그룹의 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 형광물질이 표지된 프로브를 디자인하여 제작하였다(표 2 참조). 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) 강에 속하는 암모늄산화균은 해수의 염분농도 조건에서만 생장하기 때문에 담수조건의 일반 질산화공정에 존재할 가능성은 거의 없으므로 본 발명에서 정량 대상에 포함시키지 않았다. 이후, 본 발명자들은 디자인한 프라이머 및 형광물질이 표지된 프로브를 이용하여 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 실시간 PCR은 순방향과 역방향의 프라이머 사이에 있는 염기서열을 갖는 형광 탐침자(dual labeled fluorescent probe)를 사용한다. 5' 말단에는 빛을 발산하는 형광물질(reporter)이, 3' 말단에는 빛을 억제하는 물질(quencher)이 표지(labeling)되어 있는데 PCR 반응 중 주형 DNA(template DNA)에 붙어있던 프로브의 5' 말단이 중합반응 과정에서 떨어져 나감으로써 형광이 나타나고 이것이 기계에 탐지되게 된다. 기존의 정량 PCR 방법이 반응의 포화상태 이전의 지수적으로 증폭된 DNA 양을 측정하는데 비해 실시간 PCR 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기의 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(threshold cycle, 이하 'Ct'라고 칭한다)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석 방법이며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다(Heid et al. 1996. Genome Res. 6:986-994.). 상기 방법은 겔(gel)을 전기 영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 이 과정이 자동화, 수치화 되므로 간편성과 신속성, 정확성에서 크게 향상된 방법이라고 할 수 있다. 실시간 PCR 수행 결과, 각각의 프라이머 및 프로브 셋트를 이용하여 정량하고자 하는 목적 그룹에 속하는 미생물만이 선택적으로 증폭되어 검출됨을 확인하였다(도 1 내지 5 참조). 이후 5개의 프라이머 및 프로브 셋트에 대하여 각각의 검량곡선을 작성하였다. 질산화공정으로부터의 시료에서 DNA를 추출하고 각 프라이머 및 프로브 셋트를 이용한 실시간 PCR을 수행하여 얻어진 Ct 값을 검량곡선에 대입함으로써 해당 암모늄산화균 그룹에 속하는 개체수의 절대값을 신속하고 민감하게 정량하는 것이 가능함을 확인하였다(도 6 내지 10 참조). 상기 결과를 통해 목적하는 암모늄산화균 그룹을 정확하고 신속하게 정량하는데 본 발명의 프라이머 및 프로브 셋트를 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암모늄산화균의 선택적 정량방법을 제공한다: 1) 암모늄산화균을 특이적으로 정량할 수 있는 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열을 제작하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브가 포함된 PCR 반응혼합물을 제조하여 암모늄산화균의 DNA를 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서의 형광 신호를 측정하여 반응물 내의 최초 시료를 정량하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 암모늄산화균은 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage), 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage), 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage), 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage) 또는 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)의 미생물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 단계 1)의 프라이머 또는 프로브의 염기서열은 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 검출 및 정량할 수 있도록 제작되는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage)에 속하는 암모늄산화균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기 서열은 니트로소모나스 유로패아 계통에 속하는 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자 서열 상에서 818 ~ 856 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 1018 ~ 1054 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 974 ~ 1017 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 니트로소모나스 유로패아 계통 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량할 수 있도록 설계된 본 발명의 프라이머 및 프로브 셋트의 일실시태양으로서, 증폭산물의 크기는 217 bp이다:
Nsm1-828F : 5'-GTTGTCGGATCTAATTAAG-3'(서열번호 1);
Nsm1-984T : 5'-CCTACCCTTGACATGCTTGGAATC-3'(서열번호 2); 및
Nsm1-1028R : 5'-TGTCTTGGCTCCCTTTC-3'(서열번호 3).
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage)에 속하는 암모늄산화균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기 서열은 니트로소코쿠스 모빌리스 계통에 속하는 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자 서열 상에서 978 ~ 1027 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 1272 ~ 1310 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 1233 ~ 1275 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 니트로소코쿠스 모빌리스 계통 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량할 수 있도록 설계된 본 발명의 프라이머 및 프로브 셋트의 일실시태양으로서, 증폭산물의 크기는 313 bp이다:
Nsm2-988F : 5'-GCTTGGAATTTTACGGAGAC-3'(서열번호 4);
Nsm2-1243T : 5'-AGTGTACAGAGGGTAGCCAACCC-3'(서열번호 5); 및
Nsm2-1282R : 5'-CTACGAAGTGCTTTGTGAG-3'(서열번호 6).
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage)에 속하는 암모늄산화균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기 서열은 니트로소모나스 니트로사 계통에 속하는 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자 서열 상에서 428 ~ 466 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 623 ~ 664 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 473 ~ 516 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 니트로소모나스 니트로사 계통 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량할 수 있도록 설계된 본 발명의 프라이머 및 프로브 셋트의 일실시태양으로서, 증폭산물의 크기는 217 bp이다:
Nsm3-438F: 5'-TTCGGTCGGGAAGAWATAG-3'(서열번호 7);
Nsm3-483T : 5'-CGGTACCGACATAAGAAGCACCGG-3'(서열번호 8); 및
Nsm3-633R : 5'-CTAGTYATATAGTTTCAAACGC-3'(서열번호 9).
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cyyotolerans- lineage)에 속하는 암모늄산화균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기 서열은 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통에 속하는 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자 서열 상에서 201 ~ 239 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 424 ~ 464 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 260 ~ 303 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량할 수 있도록 설계된 본 발명의 프라이머 및 프로브 셋트의 일실시태양으로서, 증폭산물의 크기는 244 bp이다:
Nsm4-211F : 5'-AGACCTTRTGCTTTTGGAG-3'(서열번호 10);
Nsm4-270T : 5'-CCAACTACTGATCGTYGCCTTGGT-3'(서열번호 11); 및
Nsm4-434R : 5'-TTTTCTTCTCRACTGAAAGAG-3'(서열번호 12).
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)에 속하는 암모늄산화균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기 서열은 니트로소스피라 멀티포미스 계통에 속하는 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자 서열 상에서 199 ~ 235 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 468 ~ 505 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 422 ~ 463 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 니트로소 스피라 멀티포미스 계통 암모늄산화균의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량할 수 있도록 설계된 본 발명의 프라이머 및 프로브 셋트의 일실시태양으로서, 증폭산물의 크기는 287 bp이다:
Nss209F : 5'-CAAGACCTTGCGCTYTT-3'(서열번호 13);
Nss432T : 5'-TTTCGTTCCGGCTGAAAGAGCT-3'(서열번호 14); 및
Nss478R : 5'-TCTTCCGGTACCGTCAKT-3'(서열번호 15).
상기 염기서열의 올리고뉴클레오티드 이름 뒤의 F는 순방향 프라이머(forward primer), R은 역방향 프라이머(reverse primer), T는 형광 프로브(fluorescence probe)를 나타낸다. 본 발명의 상기 프라이머 및 프로브 셋트의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 길이는 15 ~ 35 bp인 것이 바람직하며, 17 ~ 30 bp인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 프라이머 및 프로브 셋트의 프로브의 길이는 20 ~ 30 bp인 것이 바람직하며, 21 ~ 27 bp인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 형광 프로브는 5' 말단에는 빛을 발산하는 형광물질인 6-FAM(carboxyfluorescein)을 부착하였으며, 3' 말단에는 형광 억제 물질로서 6-TAMRA(carboxytetramethylrhodamine)을 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 형광 물질은 5' 말단에 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5 또는 VIC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 또한 3' 말단에는 형광 억제 물질로서 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 또는 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 암모늄산화균을 특이적으로 정량할 수 있는 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브를 포함하는 암모늄산화균의 정량키트를 제공한다.
상기 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브는 서열번호 1 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 상기 형광 물질은 5' 말단에 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5 또는 VIC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 또한 3' 말단에는 형광 억제 물질로서 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 또는 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
본 발명의 정량키트를 이용하여 정량할 수 있는 암모늄산화균은 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage), 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage), 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage), 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage) 또는 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)의 미생물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
단 하기 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 5개의
프라이머
및
프로브
셋트의
설계 및 제작
암모늄산화균의 16S rDNA의 염기서열에 대한 자료는 공인된 데이터베이스에서 확보하였다(Cole et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31:442-443.). 이들 염기서열에서 각 그룹에 특이적인 부분들을 선정하여 각각 순방향 및 역방향 프라이머, 그리고 프로브로 역할하도록 설계하였다. 형광 프로브는 5' 말단에는 빛을 발산하는 형광물질인 FAM(6-carboxyfluorescein)을 부착하였으며, 3' 말단에는 형광 억제 물질로서 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)를 사용하였다.
각 프라이머 및 프로브 셋트의 해당 암모늄산화균 그룹에 대한 특이성은 상기 16S rRNA 유전자 데이터베이스에 있는 프로그램(PROBE MATCH)을 이용하여 이론적으로 검증하였다. 또한 실험적으로 특이성을 검증하기 위하여 표 1과 같이 3종의 정량대상 암모늄산화균과 13종의 정량대상이 아닌 세균(bacteria)을 여러 균주수탁기관(ATCC, DSMZ, KCTC)으로부터 분양받아 각 균주의 16S rRNA 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 또한 실험실규모 질산화 반응기 및 실험실 규모 활성슬러지 부유고형물에서 추출한 메타게놈 DNA로부터 질산화 미생물의 16S rRNA 유전자를 분리하여 이를 포함하는 8종의 플라스미드를 제작하였다. 이들 24종의 플라스미드를 주형(template)으로 하여 각 프라이머 및 프로브 셋트(표 2)를 사용하는 실시간 PCR을 수행하여 해당 그룹에 속하는 암모늄산화균만이 검출되는 것을 확인함으로써 특이성을 실험적으로 검증하였다.
| 출처 | 플라스미드 이름 | 균주명 또는 유사 균주명 |
| 균주수탁기관 | pAcal | 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus KCTC 2357T) |
| pAhyd | 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila KCTC 2358T) | |
| pEfae | 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis KCTC 3206T) | |
| pEcol | 에셰리치아 콜리(Escherichia coli KCTC 2443) | |
| pNham | 니트로박터 함버젠시스(Nitrobacter hamburgensis DSM 10229) | |
| pNvul | 니트로박터 불가리스(Nitrobacter vulgaris DSM 10236) | |
| pNwin | 니트로박터 위노그라드스키(Nitrobacter winogradskyi DSM 10237T) | |
| pNmob | 니트로코쿠스 모빌리스(Nitrococcus mobilis ATCC 25380T) | |
| pNoce | 니트로소코쿠스 오세아니(Nitrosococcus oceani ATCC 19707) | |
| pNcry | 니트로소모나스 크리오톨러란스(Nitrosomonas cryotolerans ATCC 49181) | |
| pNeur | 니트로소모나스 유로패아(Nitrosomonas europaea ATCC 19718) | |
| pNmul | 니트로소스피라 멀티포미스(Nitrosospira multiformis ATCC 25196T) | |
| pPcar | 슈도모나스 카복시도하이드로제나(Pseudomonas carboxydohydrogena DSM 1083) | |
| pPstu | 슈도모나스 스투쩌리(Pseudomonas stutzeri KCTC 1066) | |
| pRpal | 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris DSM 123T) | |
| pTplu | 티오바실러스 프룸보필러스(Thiobacillus plumbophilus DSM 6690) | |
| 환경시료 | eNeur | 니트로소모나스 유로패아(Nitrosomonas europaea) (99%) |
| eNhal | 니트로소모나스 할로필라(Nitrosomonas halophila) (96%) | |
| eNmob | 니트로소코쿠스 모빌리스(Nitrosococcus mobilis) (100%) | |
| eNnit | 니트로소모나스 니트로사(Nitrosomonas nitrosa) (99%) | |
| eN343 | 니트로소모나스(Nitrosomonas sp. Is343) (98%) | |
| eNr14 | 니트로스피라(Nitrospira sp. RC14) (99%) | |
| eNr19 | 니트로스피라(Nitrospira sp. RC19) (99%) | |
| eTden | 티오바실러스 데니트리피칸스(Thiobacillus denitrificans) (98%) |
| 셋트명 | 계통 | 프라이머 이름 | 서열 | 서열번호 |
| Nsm1 | 니트로소모나스 유로패아(Nitrosomonas europaea) | Nsm1-828F Nsm1-984T Nsm1-1028R | 5'-GTTGTCGGATCTAATTAAG-3' 5'-CCTACCCTTGACATGCTTGGAATC-3' 5'-TGTCTTGGCTCCCTTTC-3' | 1 2 3 |
| Nsm2 | 니트로소코쿠스 모빌리스 (Nitrosococcus mobilis) | Nsm2-988F Nsm2-1243T Nsm2-1282R | 5'-GCTTGGAATTTTACGGAGAC-3' 5'-AGTGTACAGAGGGTAGCCAACCC-3' 5'-CTACGAAGTGCTTTGTGAG-3' | 4 5 6 |
| Nsm3 | 니트로소모나스 니트로사 (Nitrosomonas nitrosa) | Nsm3-438F Nsm3-483T Nsm3-633R | 5'-TTCGGTCGGGAAGAWATAG-3' 5'-CGGTACCGACATAAGAAGCACCGG-3' 5'-CTAGTYATATAGTTTCAAACGC-3' | 7 8 9 |
| Nsm4 | 니트로소모나스 크리오톨러란스(Nitrosomonas cryotolerans) | Nsm4-211F Nsm4-270T Nsm4-434R | 5'-AGACCTTRTGCTTTTGGAG-3' 5'-CCAACTACTGATCGTYGCCTTGGT-3' 5'-TTTTCTTCTCRACTGAAAGAG-3' | 10 11 12 |
| Nss | 니트로소스피라 멀티포미스 (Nitrosospira multiformis) | Nss209F Nss432T Nss478R | 5'-CAAGACCTTGCGCTYTT-3' 5'-TTTCGTTCCGGCTGAAAGAGCT-3' 5'-TCTTCCGGTACCGTCAKT-3' | 13 14 15 |
24개의 PCR 모세관(capillary)에 상기 24종의 플라스미드 DNA를 주형(template)으로 각각 첨가하고 실시간 PCR을 수행하여 5개의 프라이머 및 프로브 셋트의 특이성을 검증한 결과를 도 1 내지 5에서 그래프로 나타냈다. 실시간 PCR은 증폭시 매 회(cycle)의 형광의 세기(fluorescence intensity)를 실시간으로 모니터링 할 수 있으므로, 증폭이 지수적으로 일어나는 PCR 반응의 초기에 정량이 가능하다.
본 실시예의 결과를 통해 해당 프라이머 및 프로브 셋트가 정량하고자 하는 목적 그룹에 속하는 미생물만이 선택적으로 증폭되어 검출되었음을 확인할 수 있다.
도 1에서 Nsm1 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage)에 속하는 3종의 플라스미드만이 검출되었다.
도 2에서 Nsm2 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드만이 검출되었다.
도 3에서 Nsm3 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드만이 검출되었다.
도 4에서 Nsm4 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage)에 속하는 2종의 플라스미만이 검출되었다.
도 5에서 Nss 셋트에 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드만이 검출되었다.
<실시예 2> 5개의 프라이머 및 프로브 셋트에 대한 각각의 검량곡선 제작 및 실험조건
5개의 프라이머 및 프로브 셋트에 대하여 각각의 검량곡선을 작성한 결과를 도면 6 내지 10에서 그래프로 나타내었다. 각 검량곡선은 해당 암모늄산화균 그룹에 속하는 미생물의 16S rRNA 유전자를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하여 작성하였다. 플라스미드의 농도를 측정한 다음 10배씩 연속 희석하여 검량시료를 제작하였다. 각 검량시료에 대해 해당 프라이머 및 프로브 셋트를 이용하는 실시간 PCR을 수행하여 Ct 값을 산출하였다. 10배씩 연속 희석한 검량시료의 Ct 값을 해당 검량시료 농도의 대수(log)값에 대해 그래프를 작성하고, 최소자승법을 이용하여 기울기와 절편을 계산하였다.
실시간 PCR의 반응조건은 하기와 같다. 반응키트(LightCycler TaqMan Master Mix, Roche Diagnostics사 제품)의 각 모세관(capillary tube)에 2 ㎕ 시료 DNA, 각각 500 nM 순방향 및 역방향 프라이머, 100 nM 형광 프로브, 4 ㎕ 반응액(reaction mixture), 그리고 전체 부피가 20 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 모든 실시간 PCR 반응조건은 2단계(2-step)로서 중합효소 활성화(Taq polymerase activation)를 94℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 10초), 결합과 연장(annealing and extension, 60℃에서 30초)을 총 50회(cycle) 수행하였다. 모든 실시간 PCR을 수행할 때 시료 DNA 대신 멸균 증류수를 넣은 대조군 모세관을 포함시켰다.
그 결과, 도 6에서 Nsm1 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage)에 속하는 3종의 플라스미드(pNeur, eNeur, eNhal)에 대해 순서대로 기울기 -3.667, -3.418, -3.421 그리고 절편 38.12, 36.90, 38.55로 산출되었다.
도 7에서 Nsm2 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드(eNmob)에 대해 기울기 -3.262 그리고 절편 37.28로 산출되었다.
도 8에서 Nsm3 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드(eNnit)에 대해 기울기 -3.478 그리고 절편 37.68로 산출되었다.
도 9에서 Nsm4 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage)에 속하는 2종의 플라스미드(pNcry, eN343)에 대해 순서대로 기울기 -3.390, -3.729 그리고 절편 36.73, 38.10로 산출되었다.
도 10에서 Nss 셋트를 사용하는 실시간 PCR을 수행한 결과 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)에 속하는 1종의 플라스미드(pNmul)에 대해 기울기 -3.394 그리고 절편 38.14로 산출되었다.
본 발명의 암모늄산화균 그룹 특이적 프라이머 및 프로브 셋트를 이용한 실시간 PCR에 의한 선택적 정량방법을 통하여 질산화공정의 효율적 운전에 가장 중요한 암모늄산화균을 각 그룹별로 개체수를 정량함으로써 암모늄산화균의 군집구조를 분석하여 차후 질산화공정의 설계 및 운전, 진단을 보다 효율적으로 수행할 수 있다.
<110> Postech academy-industry foundation
<120> The selective quantification method of ammonia oxidizing bacteria
group using real-time polymerase chain reaction
<130> 7p-05-27
<160> 15
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm1-828F
<400> 1
gttgtcggat ctaattaag 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm1-984T
<400> 2
cctacccttg acatgcttgg aatc 24
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm1-1028R
<400> 3
tgtcttggct ccctttc 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm2-988F
<400> 4
gcttggaatt ttacggagac 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm2-1243T
<400> 5
agtgtacaga gggtagccaa ccc 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm2-1282R
<400> 6
ctacgaagtg ctttgtgag 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm3-438F
<400> 7
ttcggtcggg aagawatag 19
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm3-483T
<400> 8
cggtaccgac ataagaagca ccgg 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm3-633R
<400> 9
ctagtyatat agtttcaaac gc 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm4-211F
<400> 10
agaccttrtg cttttggag 19
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm4-270T
<400> 11
ccaactactg atcgtygcct tggt 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nsm4-434R
<400> 12
ttttcttctc ractgaaaga g 21
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nss209F
<400> 13
caagaccttg cgctytt 17
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nss432T
<400> 14
tttcgttccg gctgaaagag ct 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nss478R
<400> 15
tcttccggta ccgtcakt 18
Claims (23)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- i) 서열번호 1 및 서열번호 3로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계;ii) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 단계 i)의 프라이머 쌍 및 형광물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및,iii) 단계 ii)에서의 형광신호를 측정하여 반응물 내의 최초 시료를 정량하는 단계를 포함하는, 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 선택적 정량방법.
- 삭제
- i) 서열번호 4 및 서열번호 6로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계;ii) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 단계 i)의 프라이머 쌍 및 형광물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및,iii) 단계 ii)에서의 형광신호를 측정하여 반응물 내의 최초 시료를 정량하는 단계를 포함하는, 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 선택적 정량방법.
- 삭제
- i)서열번호 7 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계;ii) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 단계 i)의 프라이머 쌍 및 형광물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및,iii) 단계 ii)에서의 형광신호를 측정하여 반응물 내의 최초 시료를 정량하는 단계를 포함하는, 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 선택적 정량방법.
- 삭제
- i) 서열번호 10 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계;ii) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 단계 i)의 프라이머 쌍 및 형광물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및,iii) 단계 ii)에서의 형광신호를 측정하여 반응물 내의 최초 시료를 정량하는 단계를 포함하는, 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 선택적 정량방법.
- 삭제
- i) 서열번호 13 및 서열번호 15로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 14로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계;ii) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 단계 i)의 프라이머 쌍 및 형광물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및,iii) 단계 ii)에서의 형광신호를 측정하여 반응물 내의 최초 시료를 정량하는 단계를 포함하는, 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 선택적 정량방법.
- 제 4항, 제 6항, 제 8항, 제 10항 또는 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5 및 VIC로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제 4항, 제 6항, 제 8항, 제 10항 또는 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 3’말단에 형광억제물질이 표지된 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제 14항에 있어서, 프로브의 3′말단에 표지되는 형광억제물질은 6-카르복시테트라메틸로다민, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 및 ROX로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 서열번호 1 및 서열번호 3로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 포함하는, 니트로소모나스 유로패아 계통(Nitrosomonas europaea-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 정량키트.
- 서열번호 4 및 서열번호 6로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 포함하는, 니트로소코쿠스 모빌리스 계통(Nitrosococcus mobilis-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 정량키트.
- 서열번호 7 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 포함하는, 니트로소모나스 니트로사 계통(Nitrosomonas nitrosa-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 정량키트.
- 서열번호 10 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 포함하는, 니트로소모나스 크리오톨러란스 계통(Nitrosomonas cryotolerans-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 정량키트.
- 서열번호 13 및 서열번호 15로 기재되는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 14로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브를 포함하는, 니트로소스피라 멀티포미스 계통(Nitrosospira multiformis-lineage)에 속하는 암모늄산화균의 정량키트.
- 제 16항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5 및 VIC로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정량키트.
- 제 16항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 3’말단에 형광억제물질로 표지된 것을 특징으로 하는 정량키트.
- 제 22 항에 있어서, 프로브의 3‘말단에 표지되는 형광억제물질은 6-카르복시테트라메틸로다민, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 및 ROX로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정량키트.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 논문1:Water Sci Technol. |
| 논문2:Appl Environ Microbiol. |
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