CN101914480A - 具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有亚硝酸盐去除功能的非致病性工程菌及其构建方法。所述工程菌由重组质粒和宿主菌组成，重组质粒指的是连有nirS基因的重组pET载体，宿主菌指的是pET系统非致病性宿主菌。本发明是将含有cd1-NiRs的条件性致病菌中的nirS基因插入pET表达载体的多克隆位点处，将构建的重组质粒导入pET系统非致病性宿主菌中获得重组菌株，培养重组菌株使nirS基因得到表达。本发明构建的非致病性工程菌对于水产养殖废水中的亚硝酸盐具有非常好的处理效果。该工程菌在对水产养殖废水的处理中，无需加入IPTG进行诱导即可有很好的亚硝酸盐去除效果，大大简化了操作的步骤和处理的成本，具有重要的实际意义和广阔的开发前景。
Description
技术领域
本发明公开了一种具有亚硝酸盐去除功能的非致病性工程菌及其构建方法，该工程菌可用于水产养殖水体中亚硝酸盐的去除。
背景技术
水产养殖业是指水生环境系统中生物体的生产、加工和销售，已有数千年的历史。水产养殖是农业生产的重要组成部分，在过去50年中取得了迅猛发展。近年来，传统的水产养殖业越来越趋向于集约化，在发展中存在的问题很多。在高投入、高产出的水产养殖系统中，残留在水体中的排泄物及饵料残渣远远超出了水体自身的净化能力，导致大量氮元素滞留在养殖水体中。
氮元素在养殖水体中主要以分子态氮(N2)、氨氮(NH3、NH4 +-N)、亚硝酸盐(NO2 --N)、硝酸盐(NO3 --N)及有机物氮(如尿素、氨基酸、蛋白质)等形式存在。养殖水体中的有机氮首先在氨化作用下转化为氨氮。产生的氨氮在亚硝酸细菌的作用下转化为亚硝酸盐，随后硝酸细菌将亚酸盐转化为硝酸盐。最后再由反硝化细菌将硝酸盐按亚硝酸盐→一氧化氮→一氧化二氮-→氮气的顺序依次还原，完成水体氮循环过程。硝化过程中，亚硝酸细菌生长速率较快，较能适应不利的环境条件。而硝化细菌的生长较慢，易受环境条件的影响，因此当硝化细菌受到抑制时，有可能出现亚硝酸盐(NO2 -)的积累。在反硝化过程中，由于反硝化作用是一个生物耗能作用，而硝酸盐还原酶所催化的NO3 -→NO2 -是整个过程的限速步骤，因此当环境中作为反硝化作用电子供体的能源物质不足时，就易使反硝化作用停滞于NO2 -，从而导致亚硝酸盐浓度的升高。由此可以看出，亚硝酸盐作为硝化反应和反硝化反应过程中的产物，在水体氮循环过程中是不可避免的。
养殖水体中积累的亚硝酸盐对于水产养殖动物具有强烈的毒性。当鱼类发生亚硝酸盐中毒时，其血液会变成棕色。研究表明，这是由于亚硝酸盐氧化了生物体内血红蛋白上的亚铁离子所致。氧化生成的高铁血红蛋白失去了携带氧分子的能力，从而影响生物体内氧的运输造成生物死亡。魏泰莉等发现鲫血液中的高铁血红蛋白随亚硝酸盐浓度的增加呈指数递增关系；48h和96h毒性影响的临界值分别为1.8mg/L和0.8mg/L[魏态莉，余瑞兰，聂湘平，等.水中亚硝酸盐对彭泽鲫血红蛋白及高铁血红蛋白的影响.大连水产学报.2001.16(1)：67-71.]。此外，亚硝酸盐还能使生物体内的一些重要酶的活性降低，导致生物体代谢紊乱，生理功能失调等[吴中华，刘昌彬，刘存仁，等.中国对虾慢性亚硝酸盐和氨中毒的组织病理学研究.华中师范大学学报.1999.33(1)：119-122.]。因此在水产养殖过程中，对亚硝酸盐的防治应该是严格控制其在安全浓度以下。
目前用于水体中亚硝酸盐去除的方法主要包括物理法、化学法及生物法。活性碳吸附法、离子交换法、渗透法等物理方法对于亚硝酸盐具有较好的处理效果，但是处理成本较高，因而不适宜于大规模的水体处理。化学法主要通过添加一些还原剂、氧化剂及螯合剂等将水体中的亚硝酸盐去除。化学法也存在着成本高的缺点，且还容易造成水体的二次污染。目前，生物方法是研究的重点和热点，其主要利用可降解亚硝酸盐的微生物或其产生的亚硝酸盐还原酶，降低亚硝酸盐含量。
目前报道的具有亚硝酸还原酶活性的微生物主要为反硝化细菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌、节杆菌(Arthrobacter sp.)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)等。但许多反硝化细菌为条件性致病菌，对于水产养殖生物具有一定的危害性，不能直接用于水体的处理。因而亚硝酸还原酶编码基因转入非致病菌中构建具有亚硝酸盐还原活性的非致病性工程菌株具有非常重要的意义。目前发现的亚硝酸还原酶有两种，分别为血红素cd1型亚硝酸还原酶(cd1-NiRs)和铜型亚硝酸还原酶(Cu-NiRs)。其中，cd1-NiRs由nirS基因编码合成，而Cu-NiRs则由nirK基因编码。2种亚硝酸还原酶的功能相同，每种反硝化细菌只具有1种类型的亚硝酸还原酶。含有cd1-NiRs的反硝化细菌包括施氏假单胞菌(Pseudomonas stutxeri)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、泛养琉球菌(Thiosphaera pantotropha)、浑球红细菌(Rhodobactersphaeroides)等。而粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclasters)、Pseudomonas aureofacien中含有的亚硝酸还原酶则为Cu-NiRs。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌及其构建方法，该工程菌能够用于水产养殖水体中亚硝酸盐的去除。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：该具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌的保藏编号为CGMCC No.3626；该工程菌由重组质粒和宿主菌组成，重组质粒指的是连有nirS基因的重组pET载体，宿主菌指的是pET系统非致病性宿主菌。
本发明的具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌的构建方法包括如下步骤：
1)按如下方法进行nirS基因的TA克隆：
设计nirS基因PCR反应扩增所需的引物，在上游引物和下游引物的5’端分别加入限制性酶切位点；
以含有cd1-NiRs的条件性致病菌的基因组为模板，进行PCR反应扩增得到目的片段，该目的片段经纯化后首先与T克隆载体进行连接，后再将连接产物转入克隆宿主菌中挑取阳性克隆子进行测序以验证目的片段是否得到正确扩增，对目的片段扩增正确的阳性克隆子进行双酶切，回收目的片段。
2)按以下方法构建连有nirS基因的重组PET表达载体：
将步骤1)回收得到的目的片段首先与含有限制性酶切位点的pET表达载体进行连接，后将连接产物转入克隆宿主菌中挑取阳性重组子，从所述阳性重组子中提取重组质粒，该重组质粒为连有nirS基因的重组PET表达载体。
3)按以下方法构建所述非致病性工程菌：
将步骤2)得到的重组质粒转入pET系统非致病性宿主菌中，挑取阳性转化子得到重组菌株，该重组菌株为所述非致病性工程菌。
本发明非致病性工程菌的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，具有亚硝酸盐去除能力，已于2010年2月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.3626。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种新型的具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌，以该菌的亚硝酸盐去除能力，可有效去除水产养殖废水中的亚硝酸盐。本发明的优点在于通过基因工程技术的方法将含有cd1-NiRs的条件性治病菌的nirS基因转入pET系统非致病性宿主菌中，构建的非致病性工程菌能够用于水产养殖废水的处理。该工程菌在对水产养殖废水的处理中，无需加入异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，简称IPTG)进行诱导即可有很好的亚硝酸盐去除效果，大大简化了操作的步骤和处理的成本，具有重要的实际意义和广阔的开发前景。
生物材料样品的保藏信息：
保藏的生物材料样品：大肠埃希氏菌ZY-4(Escherichia coli ZY-4)；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所
(邮编：100101)；
保藏日期：2010年2月3日；
保藏登记号：CGMCC No.3626。
附图说明
图1为表达载体pET-28a-c(+)的物理图谱。
图2为nirS基因的电泳检测图。
图3为重组克隆载体pMD19-T-nirS的菌落PCR电泳检测图。
图4为重组克隆载体pMD19-T-nirS的酶切鉴定结果。
图5为重组表达载体pET-28a-nirS的菌落PCR电泳检测图。
图6为重组表达载体pET-28a-nirS的酶切鉴定结果。
图7为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的菌落PCR电泳检测图。
图8为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的酶切鉴定结果。
图9为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626表达产物的SDS-PAGE电泳图谱。
图10为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的亚硝酸盐去除能力测定结果。
图11为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626对模拟水产养殖废水的处理效果。
图12为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626对实际水产养殖废水的处理效果。
图13为nirS基因的电泳检测图。
图14为重组克隆载体pGEM-T-nirS的菌落PCR电泳检测图。
图15为重组克隆载体pGEM-T-nirS的酶切鉴定结果。
图16为重组表达载体pET-28a-nirS的菌落PCR电泳检测图。
图17为重组表达载体pET-28a-nirS的酶切鉴定结果。
图18为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21的菌落PCR电泳检测图。
图19为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21的酶切鉴定结果。
图20为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21表达产物的SDS-PAGE电泳图。
图21为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21的亚硝酸盐去除能力测定结果。
图22为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21对模拟水产养殖废水的处理过程中氨氮(□)、亚硝酸盐(*)、硝酸盐(+)、及上清中总氮(■)的变化曲线。
图23为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21对实际水产养殖废水的处理过程中氨氮(□)、亚硝酸盐(*)、硝酸盐(+)、及上清中总氮(■)的变化曲线。
具体实施方式
本发明具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌的构建方法，是利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)从含有cd1-NiRs的条件性致病菌中扩增得到nirS基因，将其进行TA克隆(Original TA Cloning Kit)。挑取阳性克隆子测序，验证目的片段是否得到正确扩增。对目的片段扩增正确的阳性克隆子进行双酶切，回收目的片段。将目的片段连到pET表达载体中，所用的pET表达载体可从表1中选择，例如，可选用pET-28a-c(+)【pET-28a-c(+)的物理图谱如图1所示】、pET-23a-d(+)或pET-24a-d(+)。将目的片段连到pET表达载体后得到重组质粒，即连有nirS基因的重组pET表达载体。将重组质粒转入pET系统非致病性宿主菌中，所用pET系统非致病性宿主菌可从表2中选择，例如，可选用大肠埃希式菌BL 21(简称E.coli BL 21)、大肠埃希式菌BL21(DE3)(简称E.coli BL21(DE3))或大肠埃希式菌BL21(DE3)pLysS(简称E.coli BL21(DE3)pLysS)。接着，挑取阳性转化子得到重组菌株，所得重组菌株即为本发明的具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌。本发明构建的具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌由重组质粒和宿主菌组成，其中，重组质粒指的是连有nirS基因的重组pET载体，宿主菌指的是pET系统非致病性宿主菌。本发明构建的具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌命名为大肠埃希式菌ZY-4(Escherichia coli ZY-4)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.3626。
具体地说，本发明具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌的构建过程为：
(1)nirS基因的TA克隆：
根据基因库(GenBank)中已报道的nirS基因开放阅读框设计合成PCR所需的引物。为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物和下游引物的5’端分别加入限制性内切酶位点。这两个限制性酶切位点应该存在于pET表达载体上，而nirS基因中不应该具有这两个酶切位点。
以含有cd1-NiRs的条件性致病菌的基因组(例如铜绿假单胞菌、斯氏假单胞菌等)为模板进行PCR反应扩增得到目的片段。目的片段经纯化后首先与T克隆载体进行连接，连接产物转入克隆宿主菌如大肠埃希氏菌DH5α(简称E.coli DH5α)、JM109(简称E.coli JM109)或NovaBlue中。采用菌落PCR及双酶切方法对克隆子进行验证。挑取阳性克隆子测序，验证目的片段是否得到正确扩增。对目的片段扩增正确的阳性克隆子进行双酶切，回收目的片段。
(2)连有nirS基因的重组PET表达载体的构建：
将回收得到的目的片段首先与pET表达载体如pET-28a-c(+)、pET-23a-d(+)、pET-24a-d(+)(可选择的pET表达载体如表1所示)中进行连接，后将连接产物转入克隆宿主菌如E.coli DH5α、JM109或NovaBlue中。采用菌落PCR及双酶切方法对重组子进行验证，挑取阳性重组子。从阳性重组子中提取重组质粒，该重组质粒即为连有nirS基因的重组pET载体。
(3)亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌的构建
将重组质粒转入pET系统非致病性宿主菌如E.coli BL 21、E.coli BL21(DE3)或E.coliBL21(DE3)pLysS(可选择的pET非致病性宿主菌如表2所示)中，涂布含抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基(Luria-Bertani，简称LB培养基)平板。采用菌落PCR及双酶切方法筛选阳性转化子，即可得到具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌。
上述含有cd1-NiRs的条件性致病菌如铜绿假单胞菌、斯氏假单胞菌等可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买得到。构建本发明具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌中所涉及到的T克隆载体、pET表达载体、E.coli DH5α、JM109、NovaBlue、pET系统非致病性宿主菌、限制性内切酶和PCR所用的DNA聚合酶等均可从市场购得。
表1：构建本发明非致病性工程菌可选用的pET表达载体
注：I＝内部标签，N＝N-端标签，C＝可选的C-端标签；蛋白酶酶切位点：T＝凝血酶，E＝肠激酶，X＝Xa因子
续表1
注：I＝内部标签，N＝N-端标签，C＝可选的C-端标签；蛋白酶酶切位点：T＝凝血酶，E＝肠激酶，X＝Xa因子
表2：构建本发明非致病性工程菌可选用的pET系统非致病性宿主菌及其特性
续表2
续表2
续表2
实施例1
(一)nirS基因的TA克隆
1.以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为材料，采用十六烷基三乙基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)法进行基因组DNA的提取。
2.引物设计
在GenBank已报道的铜绿假单胞菌中，铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonasaeruginosa PAO1)、铜绿假单胞菌UCBPP-PA14(Pseudomonas aeruginosaUCBPP-PA14)、铜绿假单胞菌LESB58(Pseudomonas aeruginosa LESB58)的nirS基因核苷酸序列的序列登录号分别对应为AE004091.2、CP000438.1、FM209186.1)，其中，Pseudomonas aeruginosa PAO1的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，Pseudomonas aeruginosa LESB58的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本实施例中，可依据铜绿假单胞菌PAO1、铜绿假单胞菌UCBPP-PA14或铜绿假单胞菌LESB58的nirS基因核苷酸序列，应用Primer premier 5.0软件设计一对特异性引物nirS-1和nirS-2。为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物nirS-1和下游引物nirS-2的5’端分别加入限制性内切酶位点。设计的上游引物nirS-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中，画线部分为加入的Nde I酶切位点；设计的下游引物nirS-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中，画线部分为加入的EcoR I酶切位点。该引物预计扩增得到的片段长度为1707bp。
设计的上游引物：ggaattccatatgatgccatttggcaagccactg
设计的下游引物：ccggaattctcagtacacgtcgtgctgggtg
3.nirS基因的PCR扩增
以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组为模板，通过PCR扩增目的片段。PCR反应体系(50uL)为：10×PCR缓冲液5.0uL，MgCl2(25mmol/L)4.0uL，dNTP 1.5uL，引物nirS-1和nirS-2各1.0uL，模板DNA 1.0uL，Taq酶(10000U/mL，由TaKaRa公司生产)0.5uL，重蒸水36.0uL。PCR反应程序为：94℃热变性5min，然后94℃1min，58℃退火1min，72℃延伸1min50s，共35个循环，最后进行72℃延伸10min。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳分离检测PCR产物。PCR反应结束后，采用1％的普通琼脂糖电泳，检查PCR产物，结果如图2所示：图2为nirS基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道M为DNA分子量标准)，其中，泳道1在1707bp处有一条清晰条带，所得结果与预期结果相符。
4.重组克隆载体pMD19-T-nirS的构建
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，采用AxyGEN公司的AxyPrep PCRCleanup Kit回收目的片段。将回收的目的片段克隆到pMD19-T Vector上，进行蓝白斑筛选。目的片段(割胶回收产物)与pMD19-vecter载体连接采用Takara公司的连接试剂盒。反应体系为(10uL)：PCR回收产物4.5uL，pMD19-vecter 0.5uL，Solution I 5uL。离心混匀，4℃放置16h(以上均在冰上操作)。取连接产物8uL加于100uL E.coli DH5α感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，冰浴30min。42℃下热激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液体1mL，混匀，37℃下200rpm培养1h，使细胞复苏。取200uL转化的细菌液涂布于含有50mg/ml氨苄(Ampicillin，简称Amp)的LB抗性平板上37℃下培养过夜进行筛选。
5.重组克隆载体pMD19-T-nirS的鉴定
挑取上述抗生素平板上的白色单菌落接入5mL含50mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜。次日，直接以菌液为模板，M13-47为引物进行PCR扩增。PCR反应体系(50uL)为：10×PCR缓冲液5.0uL，MgCl2(25mmol/L)4.0μL，dNTP 1.5μL，M13-47通用引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq酶(10000U/mL，TaKaRa公司)0.5μL，重蒸水36.0μL。PCR反应程序同上。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图3所示：图3为重组克隆载体pMD19-T-nirS的菌落PCR电泳检测图(泳道M为DNA分子量标准)，泳道1、2在1707bp处未显示出条带，证明这两个克隆子中未插入目的片段。而泳道3、4、5、6在1707bp处各有一条清晰条带，初步证明这4个克隆子中插入了目的片段。
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit对PCR检测中初步证明插入目的片段的克隆子进行质粒提取。对质粒DNA作限制性内切酶双酶切(Nde I和EcoRI)，酶切体系20uL，混合液置于37℃反应3h。反应结束后，对酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，观察酶切片段的位置和大小。结果如图4所示：图4为重组克隆载体pMD19-T-nirS的酶切鉴定结果(泳道1为酶切产物，泳道M为DNA分子量标准)，其中，泳道1在1707bp和2700bp处各有一条清晰条带，分别对应于目的片段nirS和克隆载体pMD19-vecter，进一步证明这一克隆子中插入了目的片段。
PCR和酶切鉴定都正确的克隆子鉴定为阳性克隆子，命名为大肠埃希氏菌pMD19-T-nirS DH5α。保存的甘油菌液采用Sanger双脱氧链终止法或Maxam-Gilbert化学降解法进行测序，测序引物为M13-47。测序结果显示阳性重组克隆载体中插入的目的片段序列如SEQ ID NO.3所示。将该序列通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)Blast程序与GenBank数据库中的核苷酸序列进行比对。结果显示，该序列与铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonasaeruginosa PAO1)、铜绿假单胞菌UCBPP-PA14(Pseudomonas aeruginosaUCBPP-PA14)、铜绿假单胞菌LESB58(Pseudomonas aeruginosa LESB58)的nirS基因核苷酸序列(序列登录号分别为AE004091.2、CP000438.1、FM209186.1)(Pseudomonas aeruginosa PAO1的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Pseudomonas aeruginosa LESB58的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的相似性均达到100％。表明本发明重组克隆载体中所插入的目的片段含有正确的nirS基因序列，达到预期目的。
(二)重组表达载体pET-28a-nirS的构建
1、重组表达载体pET-28a-nirS的构建
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit提取大肠埃希氏菌pMD19-T-nirS DH5α的质粒DNA。然后采用限制性内切酶Nde I和EcoR I分别对质粒DNA和表达载体pET-28a-c(+)(购自Novagen生物公司)进行双酶切。酶切体系20uL，混合液置于37℃反应3h。反应结束后，对酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。采用AxyGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit回收酶切产物。
采用T4 DNA连接酶将经双酶切后割胶回收得到的目的片段与同样经双酶切处理的表达载体pET-28a-c(+)进行连接。反应体系10uL，混匀，16℃反应16h。取连接产物8uL加于100uL E.coli DH5α感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，冰浴30min。42℃下热激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液体1mL，混匀，37℃下200rpm培养1h，使细胞复苏。取200uL转化的细菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin，简称Kna)的LB抗性平板上37℃下培养过夜进行筛选。
2、重组表达载体pET-28a-nirS的鉴定
挑取上述抗生素平板上的单菌落接入5mL含50mg/L Kna的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜。次日，直接以菌液为模板，T7为引物进行PCR扩增。PCR反应体系(50uL)为：10×PCR缓冲液5.0uL，MgCl2(25mmol/L)4.0μL，dNTP 1.5μL，T7通用引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq酶(10000U/mL，TaKaRa公司)0.5μL，重蒸水36.0μL。PCR反应程序同上。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图5所示：图5为重组表达载体pET-28a-nirS的菌落PCR电泳检测图(泳道M为DNA分子量标准)，泳道1、2、5、6、8在1707bp处无条带，证明这5个重组子中未插入目的片段。而泳道3、4、7在1707bp处各有一条清晰条带，初步证明这4个重组子中插入了nirS片段。
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit对PCR检测中初步证明插入目的片段的重组子进行质粒提取。对质粒DNA作限制性内切酶双酶切(Nde I和EcoRI)，酶切体系20uL，混合液置于37℃反应3h。反应结束后，对酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，观察酶切片段的位置和大小。结果如图6所示，图6为重组表达载体pET-28a-nirS的酶切鉴定结果，其中，泳道1、2、3、4为酶切产物，泳道M1、M2为DNA分子量标准，泳道1、2、3、4在1707bp和5000bp处各有一条清晰条带，分别对应于目的片段nirS和表达载体pET-28a-c(+)，进一步证明这四个重组子中插入目的片段，表达载体pET-28a-nirS构建成功。PCR和酶切鉴定都正确的重组子鉴定为阳性重组子，该阳性重组子被命名为：大肠埃希氏菌pET-28a-nirS DH5α。
(三)重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21的构建
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit提取大肠埃希氏菌pET-28a-nirS DH5α的质粒DNA。取质粒DNA 8uL加于100uL E.coli BL 21感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，冰浴30min。42℃下热激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液体1mL，混匀，37℃下200rpm培养1h，使细胞复苏。取200uL转化的细菌液涂布于50mg/L含有Kna的LB抗性平板上37℃下培养过夜进行筛选。挑取抗生素平板上的单菌落接入5mL含50mg/L Kna的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜。次日，采用上述相同的菌落PCR及酶切验证方法鉴定阳性转化子。图7为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的菌落PCR电泳检测图(泳道M为DNA分子量标准)。图7中，泳道1在1707bp处没有出现条带，说明该转化子中未转入重组表达载体pET-28a-nirS。而泳道2在1707bp出有一条清晰条带，初步证明这个转化子中转入了重组表达载体pET-28a-nirS。图8为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的酶切鉴定结果(泳道1为酶切产物，泳道M1、M2为DNA分子量标准)。图8中，泳道1在1707bp和5000bp处各有一条清晰条带，分别对应于目的片段nirS和表达载体pET-28a-c(+)，进一步证明该转化子中转入了重组表达载体pET-28a-nirS。PCR和酶切结果都正确的转化子鉴定为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21，即为本发明的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626。
(四)nirS基因在大肠埃希氏菌CGMCC No.3626中表达的检测
1、目的蛋白的诱导表达
从含有50mg/l Kna的LB固体平板上挑取大肠埃希氏菌CGMCC No.3626菌落接入5mL含有50mg/L Kna的LB液体培养基中，200rpm、37℃培养12-16h后，4℃静置过夜，接入新鲜的50mg/L Kna的LB培养基中，200rpm振荡培养。当菌体生长至对数期时加入异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.7mmol/L，然后继续培养2.5h，离心收集菌体。裂解细胞后，以十二烷基磺酸纳-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，简称SDS-PAGE)分析胞内总蛋白。
2、SDS-PAGE分析
将上述所提蛋白进行SDS-PAGE检测，方法如下：
1)配制10％的分离胶，5％的浓缩胶；2)待测样品于99℃加热处理5min；3)各取20ul样品上样；4)起始电压80V，待样品跑过浓缩胶后，加压至150V，溴酚兰到达底部边缘停止电泳；5)剥下胶块，于10％三氯乙酸中固定1h；6)将胶块置于0.05％卡马斯亮蓝染色液中染色过夜；7)用脱色液轻微震荡脱色至背景干净，条带清晰。
结果如图9所示：图9大肠埃希氏菌CGMCC No.3626表达产物的SDS-PAGE电泳图谱(泳道1为未诱导时的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626蛋白，泳道2为诱导2h的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626蛋白，泳道3为诱导4h的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626蛋白，泳道M为蛋白电泳标准分子量)，在泳道2和3中，在约65kDa附近处有一非常明显的特异性蛋白条带，其分子量大小与nirS基因分子量的理论预测值相符，说明nirS基因在大肠埃希氏菌CGMCC No.3626中得到了表达。
3、大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的亚硝酸盐去除能力测定
亚硝酸盐去除能力测试培养基(g/L)：NaNO2 0.097g，NH4Cl 0.246g，MgSO4·7H2O 0.039g，CaCl2 0.055g，FeSO4·7H2O 0.010g，CuSO4·5H2O 0.000024g，K2HPO413.908g，KH2PO45.304g，琼脂20g(固体培养基中)。以上各化合物溶于1L蒸馏水中，用NaOH或HCl调节溶液pH值至7.0-7.5，分装后灭菌。冷却后在无菌条件下加入适量的灭菌葡萄糖母液，使得葡萄糖终浓度为3.96g/L。
将大肠埃希氏菌CGMCC No.3626接入含有50mg/L Kna的LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。菌株生长至对数期时，取出适量菌液，12000rpm离心5min，收集菌体。从每个管中取出适量菌液，12000rpm离心5min，收集菌体。用无菌水清洗3次后再离心收集菌体。取适量菌体接入100mL亚硝酸盐去除能力测试培养基中，使OD600＝0.9左右。同时在培养基内加入异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)至浓度0.7mmol/L进行诱导，200rpm、37℃培养16h。每隔1h取样，测定样品中亚硝酸盐含量。亚硝酸盐含量测试方法为N-(1-萘基)-乙二胺光度法(参见：国家环境保护总局，《水和废水监测分析方法》编委会编(2002)，水和废水监测分析方法(第四版)，中国环境科学出版社)。
本测试中设置5个对照组，对照1为野生菌株Pseudomonas aeruginosa，对照2为未加入IPTG诱导的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626，对照3为含有空的载体质粒pET-28a E.coli BL 21菌株，对照4为不携带质粒的表达宿主菌株E.coli BL 21，对照5不投加任何菌体。分别测试了上述5个对照组的亚硝酸盐去除效果，测试方法与上述基本相同，不同之处培养基中不用加入IPTG进行诱导。此外，除未加入IPTG诱导的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626及含有空的载体质粒pET-28aE.coli BL 21菌株的培养基中要加入Kna至终浓度50mg/L外，其他菌株的培养基中均不用加入Kna。
测定结果如图10所示：图10为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的亚硝酸盐去除能力测定结果(图10中，■为诱导的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626样品中亚硝酸盐含量变化曲线，◇为未诱导的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626样品中亚硝酸盐含量变化曲线，*为野生菌株样品中亚硝酸盐含量变化曲线，▲为未插入目标片段的表达宿主菌BL 21样品中亚硝酸盐含量变化曲线，+为未投加菌株的样品中亚硝酸盐含量变化曲线)可以看出，诱导的大肠埃希氏菌CGMCCNo.3626、未诱导的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626样品中亚硝酸盐含量均大幅度的下降。表明诱导的大肠埃希氏菌CGMCC No.3626、未诱导的大肠埃希氏菌CGMCCNo.3626具有非常好的亚硝酸盐去除能力。
(五)大肠埃希氏菌CGMCC No.3626对实际水产养殖废水及模拟水产养殖废水的处理效果
1)将大肠埃希氏菌CGMCC No.3626菌株活化；2)将活化后的菌株接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜；3)从管中取出适量菌液，12000rpm离心5min，收集菌体。用无菌水清洗3次后重悬。将菌株悬液接入100mL实际及模拟的水产养殖废水中，使OD600＝0.9左右；4)每隔1h取样，测定样品中亚硝酸盐、氨氮、硝酸盐含量及上清中总氮含量。所有样品均设置3个重复，以不接菌的培养基为空白对照。
实际水产养殖废水中氨氮含量为4.517mg/L，亚硝酸盐含量为1.126mg/L，硝酸盐含量为9.016mg/L，总氮含量为19.145mg/L。外源添加葡萄糖调整高锰酸钾指数(potassium permanganate index，简称CODMn)至80mg/L左右，加入IPTG至浓度0.7mmol/L。
模拟水产养殖废水中含有的氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐，总氮含量为实际水产养殖废水的4倍左右，具体为氨氮16.817mg/L、亚硝酸盐5.018mg/L、硝酸盐46.167mg/L，总氮73.817mg/L。外源添加添加葡萄糖调整CODMn至320mg/L左右，加入IPTG至浓度0.7mmol/L。
结果见图11、12所示，图11为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626对模拟水产养殖废水的处理过程中氨氮(□)、亚硝酸盐(*)、硝酸盐(+)、及上清中总氮(■)含量的变化曲线，图12为大肠埃希氏菌CGMCC No.3626对实际水产养殖废水的处理过程中氨氮(□)、亚硝酸盐(*)、硝酸盐(+)、及上清中总氮(■)含量的变化曲线。可以看出，投放了大肠埃希氏菌CGMCC No.3626的养殖水体中亚硝酸盐浓度呈下降趋势，说明大肠埃希氏菌CGMCC No.3626对含有高浓度亚硝酸盐的模拟和实际水产养殖废水具有较好的处理效果。
实施例2
(一)nirS基因的TA克隆
1.以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为材料，采用CTAB法进行基因组DNA的提取。
2.引物设计
依据GenBank中已报道的施氏假单胞菌A151(Pseudomonas stutzeri A151)或施氏假单胞菌LYS-86(Pseudomonas stutzeri LYS-86)的nirS基因核苷酸序列(序列登录号分别为AY957388.1和GU474546.1)(Pseudomonas stutzeriA151的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；Pseudomonas stutzeri LYS-86的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，应用Primer premier 5.0软件设计一对特异性引物。为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物和下游引物的5’端分别加入限制性内切酶位点。设计的上游引物nirS-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中，画线部分为加入的Nde I酶切位点；设计的下游引物nirS-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中，画线部分为加入的BamHI酶切位点。该引物预计扩增得到的片段长度为257bp。
设计的上游引物：ggaattccatatgcgcctggagaacatcattgc
设计的下游引物：cgcggatcccttcagtgtcttgtcgtcat
3.nirS基因的PCR扩增
以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组为模板，通过PCR扩增目的片段。PCR反应体系(50uL)为：10×PCR缓冲液5.0uL，MgCl2(25mmol/L)4.0uL，dNTP 1.5uL，引物nirS-1和nirS-2各1.0uL，模板DNA 1.0uL，Taq酶(10000U/mL，TaKaRa公司)0.5uL，重蒸水36.0uL。PCR反应程序为：94℃热变性5min，然后94℃1min，58℃退火1min，72℃延伸1min50s，共35个循环，最后进行72℃延伸10min。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳分离检测PCR产物。PCR反应结束后，采用1％的普通琼脂糖电泳，检查PCR产物，结果如图13所示：图13为nirS基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道M为DNA分子量标准)泳道1在257bp处有一条清晰条带，所得结果与预期结果相符。
4.重组克隆载体pMD8-T-nirS的构建
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，采用AxyGEN公司的AxyPrep PCRCleanup Kit回收目的片段。将回收的目的片段克隆到pGEM-T Vector上，进行蓝白斑筛选。目的片段(割胶回收产物)与pGEM-vecter载体连接采用Takara公司的连接试剂盒。反应体系为(10uL)：PCR回收产物4.5uL，pGEM-vecter 0.5uL，Solution I 5uL。离心混匀，4℃放置16h(以上均在冰上操作)。取连接产物8uL加于100uL E.coli JM109感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，冰浴30min。42℃下热激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液体1mL，混匀，37℃下200rpm培养1h，使细胞复苏。取200uL转化的细菌液涂布于含有50mg/ml氨苄(Ampicillin，简称Amp)的LB抗性平板上37℃下培养过夜进行筛选。
5.重组克隆载体pGEM-T-nirS的鉴定
挑取上述抗生素平板上的白色单菌落接入5mL含50mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜。次日，直接以菌液为模板，M13/pUC(-29)back和M13/pUC(40)for为引物进行PCR扩增。PCR反应体系(50uL)为：10×PCR缓冲液5.0uL，MgCl2(25mmol/L)4.0μL，dNTP 1.5μL，M13/pUC(-29)back和M13/pUC(40)for引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq酶(10000U/mL，TaKaRa公司)0.5μL，重蒸水36.0μL。PCR反应程序同上。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图14所示：图14为重组克隆载体pGEM-T-nirS的菌落PCR电泳检测图(泳道M为DNA分子量标准)泳道1、2在257bp处未显示出条带，证明这两个克隆子中未插入目的片段。而泳道3、4、5、6在257bp处各有一条清晰条带，初步证明这4个克隆子中插入了目的片段。
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit对PCR检测中初步证明插入目的片段的克隆子进行质粒提取。对质粒DNA作限制性内切酶双酶切(Nde I和BamHI)，酶切体系20uL，混合液置于37℃反应3h。反应结束后，对酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，观察酶切片段的位置和大小。结果如图15所示：图15为重组克隆载体pGEM-T-nirS的酶切鉴定结果(泳道1为酶切产物，泳道M为DNA分子量标准)泳道1在257bp和2692bp处各有一条清晰条带，分别对应于目的片段nirS和克隆载体pGEM-T vecter，进一步证明这一克隆子中插入了目的片段。
PCR和酶切鉴定都正确的克隆子鉴定为阳性克隆子，命名为大肠埃希氏菌pGEM-T-nirS JM109。保存的甘油菌液采用Sanger双脱氧链终止法或Maxam-Gilbert化学降解法进行测序，测序引物为M13-47。测序结果显示重组克隆载体中插入的目的片段序列如SEQ ID NO.11所示。将该序列通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)Blast程序与GenBank数据库中的核苷酸序列进行比对。结果显示，该序列与施氏假单胞菌A151(Pseudomonas stutzeriA151)、施氏假单胞菌LYS-86(Pseudomonas stutzeri LYS-86)的nirS基因核苷酸序列(序列登录号分别为AY957388.1和GU474546.1)的相似性均为100％(AY957388.1的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；GU474546.1的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)。表明重组克隆载体中所插入的目的片段含有正确的nirS基因序列，达到预期目的。
(二)重组表达载体pET-28a-nirS的构建
1、重组表达载体pET-28a-nirS的构建
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit提取大肠埃希氏菌pGEM-T-nirS JM109的质粒DNA。然后采用限制性内切酶Nde I和BamHI分别对质粒DNA和表达载体pET-28a-c(+)(购自Novagen生物公司)进行双酶切。酶切体系20uL，混合液置于37℃反应3h。反应结束后，对酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。采用AxyGEN公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit回收酶切产物。
采用T4 DNA连接酶将经双酶切后割胶回收得到的目的片段与同样经双酶切处理的表达载体pET-28a-c(+)进行连接。反应体系10uL，混匀，16℃反应16h。取连接产物8uL加于100uL E.coli JM109感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，冰浴30min。42℃下热激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液体1mL，混匀，37℃下200rpm培养1h，使细胞复苏。取200uL转化的细菌液涂布于含有50mg/L Kna的LB抗性平板上37℃下培养过夜进行筛选。
2、重组表达载体pET-28a-nirS的鉴定
挑取上述抗生素平板上的单菌落接入5mL含50mg/L Kna的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜。次日，直接以菌液为模板，T7为引物进行PCR扩增。PCR反应体系(50uL)为：10×PCR缓冲液5.0uL，MgCl2(25mmol/L)4.0μL，dNTP 1.5μL，T7通用引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq酶(10000U/mL，TaKaRa公司)0.5μL，重蒸水36.0μL。PCR反应程序同上。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图16所示：图16为重组表达载体pET-28a-nirS的菌落PCR电泳检测图(泳道M为DNA分子量标准)泳道1、3、6、8在257bp处无条带，证明这4个重组子中未插入目的片段。而泳道2、4、5、7在257bp处各有一条清晰条带，初步证明这4个重组子中插入了nirS片段。
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit对PCR检测中初步证明插入目的片段的重组子进行质粒提取。对质粒DNA作限制性内切酶双酶切(Nde I和BamHI)，酶切体系20uL，混合液置于37℃反应3h。反应结束后，对酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，观察酶切片段的位置和大小。结果如图17所示：图17为重组表达载体pET-28a-nirS的酶切鉴定结果(泳道1、2为酶切产物，泳道M1、M2为DNA分子量标准)泳道2在257bp和5000bp处各有一条清晰条带，分别对应于目的片段nirS和表达载体pET-28a-c(+)，进一步证明这个重组子中插入目的片段，表达载体pET-28a-nirS构建成功。PCR和酶切鉴定都正确的重组子鉴定为阳性重组子，命名为：大肠埃希氏菌pET-28a-nirSJM109。
(三)重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21的构建
采用AxyGEN公司的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit提取大肠埃希氏菌pET-28a-nirS JM109的质粒DNA。取质粒DNA 8uL加于100uL E.coli BL 21感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，冰浴30min。42℃下热激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液体1mL，混匀，37℃下200rpm培养1h，使细胞复苏。取200uL转化的细菌液涂布于50mg/L含有Kna的LB抗性平板上37℃下培养过夜进行筛选。挑取抗生素平板上的单菌落接入5mL含50mg/L Kna的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜。次日，采用上述相同的菌落PCR及酶切验证方法鉴定阳性转化子。图18为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coliBL 21的菌落PCR电泳检测图(泳道M为DNA分子量标准)。泳道7在257bp出没有出现条带，说明该转化子中未转入重组表达载体pET-28a-nirS。而泳道1、2、3、4、5、6在257bp出有一条清晰条带，初步证明这6个转化子中转入了重组表达载体pET-28a-nirS。图19为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL21的酶切鉴定结果(泳道1、2为酶切产物，泳道M1、M2为DNA分子量标准)。泳道1在257bp和5000bp处各有一条清晰条带，分别对应于目的片段nirS和表达载体pET-28a-c(+)，进一步证明该转化子中转入了重组表达载体pET-28a-nirS。PCR和酶切结果都正确的转化子鉴定重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21，即具有亚硝酸盐去除功能的非致病性工程菌。
(四)nirS基因在E.coli BL 21中表达的检测
1、目的蛋白的诱导表达
从含有50mg/l Kna的LB固体平板上挑取重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21菌落接入5mL含有50mg/L Kna的LB液体培养基中，200rpm、37℃培养12-16h后，4℃静置过夜，接入新鲜的50mg/L Kna的LB培养基中，200rpm振荡培养。当菌体生长至对数期时加入IPTG至终浓度为0.7mmol/L，然后继续培养2.5h，离心收集菌体。裂解细胞后，以SDS-PAGE分析胞内总蛋白。
2、SDS-PAGE分析
将上述所提蛋白进行SDS-PAGE检测，方法如下：
1)配制10％的分离胶，5％的浓缩胶；2)待测样品于99℃加热处理5min；3)各取20ul样品上样；4)起始电压80V，待样品跑过浓缩胶后，加压至150V，溴酚兰到达底部边缘停止电泳；5)剥下胶块，于10％三氯乙酸中固定1h；6)将胶块置于0.05％卡马斯亮蓝染色液中染色过夜；7)用脱色液轻微震荡脱色至背景干净，条带清晰。
结果如图20所示：图20为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21表达产物的SDS-PAGE电泳图(泳道1为未诱导时的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21蛋白，泳道2为诱导2h的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21蛋白，泳道3为诱导4h的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21蛋白，泳道M为蛋白电泳标准分子量)泳道2和3中，在约58kDa附近处有一非常明显的特异性蛋白条带，其分子量大小与nirS基因分子量的理论预测值相符，说明nirS基因在重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21中的到了表达。
3、重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21的亚硝酸盐去除能力测定
亚硝酸盐去除能力测试培养基(g/L)：NaNO2 0.097g，NH4Cl 0.246g，MgSO4·7H2O 0.039g，CaCl2 0.055g，FeSO4·7H2O 0.010g，CuSO4·5H2O 0.000024g，K2HP04 13.908g，KH2PO4 5.304g，琼脂20g(固体培养基中)。以上各化合物溶于1L蒸馏水中，用NaOH或HCl调节溶液pH值至7.0-7.5，分装后灭菌。冷却后在无菌条件下加入适量的灭菌葡萄糖母液，使得葡萄糖终浓度为3.96g/L。
将重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21接入含有50mg/L Kna的LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。菌株生长至对数期时，取出适量菌液，12000rpm离心5min，收集菌体。从每个管中取出适量菌液，12000rpm离心5min，收集菌体。用无菌水清洗3次后再离心收集菌体。取适量菌体接入100mL亚硝酸盐去除能力测试培养基中，使OD600＝0.9左右。同时在培养基内加入IPTG至浓度0.7mmol/L进行诱导，200rpm、37℃培养16h。每隔1h取样，测定样品中亚硝酸盐含量。亚硝酸盐含量测试方法为N-(1-萘基)-乙二胺光度法(国家环境保护总局，《水和废水监测分析方法》编委会编(2002)，水和废水监测分析方法(第四版)，中国环境科学出版社)。
本测试中设置5个对照组，对照1为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，对照2为未加入IPTG诱导的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21，对照3为含有空的载体质粒pET-28a(+)E.coli BL 21菌株，对照4为不携带质粒的表达宿主菌株E.coli BL 21，对照5不投加任何菌体。分别测试了上述5个对照组的亚硝酸盐去除效果，测试方法与上述基本相同，不同之处培养基中不用加入IPTG进行诱导。此外，除未加入IPTG诱导的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21及含有空的载体质粒pET-28a(+)E.coli BL 21菌株的培养基中要加入Kna至终浓度50mg/L外，其他菌株的培养基中均不用加入Kna。
测定结果如图21所示：图21为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL21的亚硝酸盐去除能力测定结果(■为诱导的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21样品中亚硝酸盐含量变化曲线，◇为未诱导的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21样品中亚硝酸盐含量变化曲线，*为施氏假单胞菌样品中亚硝酸盐含量变化曲线，▲为未插入目标片段的表达宿主菌BL 21样品中亚硝酸盐含量变化曲线，-为未投加菌株样品中亚硝酸盐含量变化曲线)可以看出，诱导的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21、未诱导的重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21均表现出非常好的亚硝酸盐去除能力。
(五)重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E coli BL 21对实际水产养殖废水及模拟水产养殖废水的处理效果
1)将重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21菌株活化；2)将活化后的菌株接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜；3)从管中取出适量菌液，12000rpm离心5min，收集菌体。用无菌水清洗3次后重悬。将菌株悬液接入100mL实际及模拟的水产养殖废水中，使OD600＝0.9左右；4)每隔1h取样，测定样品中亚硝酸盐、氨氮、硝酸盐含量及上清中总氮含量。所有样品均设置3个重复，以不接菌的培养基为空白对照。
实际水产养殖废水中氨氮含量为4.517mg/L，亚硝酸盐含量为1.126mg/L，硝酸盐含量为9.016mg/L，总氮含量为19.145mg/L。外源添加葡萄糖调整高锰酸钾指数(potassium permanganate index，简称CODMn)至80mg/L左右，加入IPTG至浓度0.7mmol/L。
模拟水产养殖废水中含有的氨氮，亚硝酸盐，硝酸盐，总氮含量为实际水产养殖废水的4倍左右，具体为氨氮16.817mg/L，亚硝酸盐5.018mg/L，硝酸盐46.167mg/L，总氮73.817mg/L。外源添加添加葡萄糖调整CODMn至320mg/L左右，加入IPTG至浓度0.7mmol/L。
结果见图22、23所示，图22为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL21对模拟水产养殖废水的处理过程中氨氮(□)、亚硝酸盐(*)、硝酸盐(+)、及上清中总氮(■)含量的变化曲线，图23为重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21对实际水产养殖废水的处理过程中氨氮(□)、亚硝酸盐(*)、硝酸盐(+)、及上清中总氮(■)含量的变化曲线。可以看出，投放了重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21的养殖水体中亚硝酸盐浓度呈下降趋势，说明重组大肠埃希氏菌pET-28a-nirS-E.coli BL 21对含有高浓度亚硝酸盐的模拟和实际水产养殖废水具有较好的处理效果。
Claims (2)
1.一种具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌，其特征在于：所述工程菌的保藏编号为CGMCC No.3626；所述工程菌由重组质粒和宿主菌组成，重组质粒指的是连有nirS基因的重组pET载体，宿主菌指的是pET系统非致病性宿主菌。
2.一种权利要求1所述的具有亚硝酸盐去除能力的非致病性工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)按如下方法进行nirS基因的TA克隆：
设计nirS基因PCR反应扩增所需的引物，在上游引物和下游引物的5’端分别加入限制性酶切位点；
以含有cd1-NiRs的条件性致病菌的基因组为模板，进行PCR反应扩增得到目的片段，该目的片段经纯化后首先与T克隆载体进行连接，后再将连接产物转入克隆宿主菌中挑取阳性克隆子进行测序以验证目的片段是否得到正确扩增，对目的片段扩增正确的阳性克隆子进行双酶切，回收目的片段；
2)按以下方法构建连有nirS基因的重组PET表达载体：
将步骤1)回收得到的目的片段首先与含有限制性酶切位点的pET表达载体进行连接，后将连接产物转入克隆宿主菌中挑取阳性重组子，从所述阳性重组子中提取重组质粒，该重组质粒为连有nirS基因的重组PET表达载体；
3)按以下方法构建所述非致病性工程菌：
将步骤2)得到的重组质粒转入pET系统非致病性宿主菌中，挑取阳性转化子得到重组菌株，该重组菌株为所述非致病性工程菌。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498518A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-08 | 上海大学 | 厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体及其构建方法 |
| CN104560858A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-29 | 鹭滨环保科技（上海）有限公司 | 一种红城红球菌及其构建方法和在污水处理中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1890388A (zh) * | 2003-10-09 | 2007-01-03 | 爱克瑞公司 | 亚硝酸盐氧化细菌及使用和检测它们的方法 |
| CN101302485A (zh) * | 2008-07-07 | 2008-11-12 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种异养硝化微生物菌剂、其培养方法和用途 |
| CN100537746C (zh) * | 2006-10-13 | 2009-09-09 | 北京工商大学 | 具有好氧反硝化性能的戴尔福特菌及其处理废水的方法 |
-
2010
- 2010-07-09 CN CN 201010224954 patent/CN101914480A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1890388A (zh) * | 2003-10-09 | 2007-01-03 | 爱克瑞公司 | 亚硝酸盐氧化细菌及使用和检测它们的方法 |
| CN100537746C (zh) * | 2006-10-13 | 2009-09-09 | 北京工商大学 | 具有好氧反硝化性能的戴尔福特菌及其处理废水的方法 |
| CN101302485A (zh) * | 2008-07-07 | 2008-11-12 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种异养硝化微生物菌剂、其培养方法和用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 19990430 MIGUEL PRUDENCIO等 The blue copper-containing nitrite reductase from Alcaligenes xylosoxidans:Cloning of the nirA gene and characterization of the recombinant enzyme》 第2323－2329 1－2 第181卷, 第8期 2 * |
| 《JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY 》 19931231 MAKOTO NISHIYAMA等 Cloning and characterization of a nitrite reductase gene from Alcaligenes faecalis and its expression in Escherichia coli》 第725－733页 1－2 , 第139期 2 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498518A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-08 | 上海大学 | 厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶表达载体及其构建方法 |
| CN104560858A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-29 | 鹭滨环保科技（上海）有限公司 | 一种红城红球菌及其构建方法和在污水处理中的应用 |
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