KR20070031171A - 남극 토양에서 분리한 저온저항성 균주, 동 균주로부터분리한 저온 유도 단백질 유전자 및 동 유전자를 함유하는형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 남극토양에서 분리한 미생물 중에서 저온에서 생육이 왕성한 아스로박타 속(Arthrobacter sp.) A2-5 균주를 선발하여 신규의 균주의 확인과, 이 균주로부터 저온 유도 단백질(cold shock protein)을 생산하는 유전자를 분리하여 진핵 생물에서 그 기능을 규명한 것이다.

아스로박타 속, 저온유도 단백질, 저온유도 단백질 유전자, 저온저항성, 효모

Description

남극 토양에서 분리한 저온저항성 균주, 동 균주로부터 분리한 저온 유도 단백질 유전자 및 동 유전자를 함유하는 형질전환체 {Cold tolerance microorganism Arthrobacter sp. from South Pole soil and cold shock protein gene isolated from the bacterium, and Transformant comprising the same}

도 1a는 남극토양에서 분리한 미생물의 온도별 생육상태를 나타낸 사진이다.

도 1b는 A2-5 균주의 동정을 위하여 아스로박타 속 균주의 16S rDNA 염기서열의 근연도를 비교한 것이다.

도 2a은 아스로박타 속 A2-5 균주로부터 저온 유도 단백질 유전자를 PCR 증폭하여 그 산물을 전기영동한 사진이다.

도 2b는 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자(A2-5cspA)의 염기서열과 이로부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자(A2-5cspA)의 저온에서의 발현 분석을 위하여 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 10℃의 저온 처리하여 생성되는 메신저 RNA의 양을 비교한 사진이다.

도 4a는 A2-5cspA 유전자를 효모에 형질전환하기 위하여 제작한 유전자 카세트를 도식화한 것이다.

도 4b는 A2-5cspA 유전자를 효모에 형질전환한 후 효모에서의 발현을 RT-PCR로 확인한 전기영동 사진이다.

도 5는 A2-5cspA 유전자를 형질전환하여 발현시킨 효모를 15℃에서 7일간 배양한 사진이다.

본 발명은 저온저항성 균주, 동 균주로부터 분리한 저온 유도 단백질 유전자 및 동 유전자를 함유하는 형질전환체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저온저항성 균주를 남극토양으로부터 분리하고, 동 균주로부터 분리한 미생물의 저온 유도 단백질을 생산하는 유전자를 분리, 확인함과 동시에, 동 유전자를 이용하여 진핵생물에 형질전환시켜 저온저항성을 가지는 형질전환체에 관한 것이다.

원핵 미생물인 세균류에는 수종의 저온 유도 단백질이 존재하는 것으로 알려져 있으며 그 유전자도 밝혀져 이들 유전자에는 특징적으로 RNA 바인딩 모티프(binding motif)로 알려진 RNP-1과 RNP-2가 잘 보존된 아미노산 서열을 나타내고 있다. 저온 유도 단백질의 기능은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으나 외부의 저온 환경에 대하여 생물체 자신을 보호하는 것으로 추정되고 있다.

저온 유도 단백질 유전자는 기능해석을 위하여 대장균 및 바실러스 등 원핵 미생물을 대상으로 분자생물학적인 방법으로 연구하여 왔으나 아직 진핵생물에 적 용한 사례가 없어 진핵생물에서의 기능은 명확하지 않다.

작물의 안정적인 생산을 위해서는 생물적, 무생물적인 재해에 대하여 저항성을 가지는 작물의 개발이 무엇보다 중요하다. 따라서 내재해에 관련된 유전자를 분리하여 분자육종학적 방법을 이용하여 내재해성 기작을 밝혀, 이를 내재해성 작물개발의 소재로 이용할 수 있다.

생물체의 저온 저항성에는 여러 가지 인자가 복합적으로 작용하므로 그 기작을 설명하기는 어렵다. 또한, 원핵생물인 미생물과 대부분의 고등생물이 속하는 진핵생물 간에는 구조적, 생리학적으로 많은 차이가 있으므로 미생물의 유전자를 식물 등 진핵생물에 적용하기 위해서는 진핵생물에서의 그 기능을 구명하여야 한다. 따라서 이들 기작을 이해하기 위해서는 분자생물학적 방법을 이용하여 저온 저항성에 관련된 유전자를 분리하고 형질전환체를 얻어 각 유전자의 기능을 분석하는 것이다. 그러나 아직 원핵 미생물의 저온 유도 단백질 유전자를 진핵생물에 적용한 예가 없다.

본 발명은 상기와 같이 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 남극토양으로부터 분리되어지는 저온 내성 균주를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 남극으로부터 분리한 저온 내성 균주로부터 분리되어지는 저온 유도 단백질(cold shock protein)을 생산하는 유전자를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 저온 유도 단백질을 생산하는 유전자를 진핵세포에 형질전환하여 얻어지는 형질전환체를 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 남극토양에서 분리한 아스로박타 속(Arthrobacter sp.) A2-5 균주를 포함한다.

또한, 본 발명은 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자 A2-5cspA를 포함한다.

또한, 본 발명은 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자 A2-5cspA가 코딩하는 단백질을 포함한다.

또한, 본 발명은 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자 A2-5cspA가 도입된 형질전환체를 포함한다.

또한, 본 발명은 효모 형질전환용 운반체인 pYES-DEST52 벡터를 이용하여 A2-5cspA 유전자가 도입된 효모를 포함한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 의한 저온 저항성 균주는 남극토양에서 분리하였으며, 이들 분리되어진 균들을 15℃, 20℃, 25℃, 30℃의 항온기에서 3 일간 배양하여, 15℃의 저온에서 생육상태가 가장 우수한 균주를 선발하였다(도 1a).

상기 본 발명에 따라 분리된 저온 저항성 균주는 형태적으로는 간상의 특징 을 가지며, 또 동 균주의 16S rDNA 일부를 PCR법으로 증폭하여 염기서열 분석결과 아스로박타 속 균의 16S rDNA의 염기서열과 98% 이상의 상동성을 나타내었다. 이를 아스로박타 속의 표준 균주들의 16S rDNA 염기서열과 근연도를 비교분석하였는데 본 발명에 따른 상기 균주는 기존의 어느 종에도 속하지 않는 신규한 것으로 확인되었으며, 이 균주를 아스로박타 에스피 A2-5(Arthrobacter sp. A2-5)로 명명하였다.

상기 본 발명에 따라 분리된 아스로박타 에스피 A2-5는 트립틱 소이 고체배지(Tryptic Soy Agar) 또는 액체배지, 엘비(Luria-Bertani, tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%) 액체 또는 고체배지 등 미생물 증식용 배지에서 생육이 가능하다.

본 발명에 의하면, 상기 분리된 아스로박타 에스피 A2-5 균주가 15℃ 정도의 저온상태에서 우수한 생육특성을 가질 수 있는 것은 특정 단백질에 기인한 것으로 확인되었으며, 이를 발현하는 소정의 유전자가 확인되었다. 본 발명에 의하면 상기 저온 유도 단백질 유전자(이하, 동일)의 진핵세포로의 도입가능성이 확인되었으며, 이는 특히 저온에 민감한 식물체 또는 효모를 포함한 진핵생물군에 대하여 저온 저항성을 가지는 농작물 내지는 효모 등의 개발을 가능하게 하여 산업 전반에 걸쳐 폭넓게 응용될 수 있음을 시사한다.

본 발명에 의한 아스로박타 에스피 A2-5로부터 저온 유도 단백질 유전자를 분리 및 동정하는 과정은 다음과 같다. 먼저, 아스로박타 에스피 A2-5 균주로부터 저온 유도 단백질 유전자를 분리하기 위하여 세균류에서 보고된 저온 유도 단백질 유전자의 보존영역을 참고로 프라이머를 합성하여 PCR법으로 증폭하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기와 같다.

포워드 프라이머: CSP-1 5'-GGN ANN GTN AA(A,G) TGG TT(C,T) AA-3'

리버스 프라이머: CSP-2 [5'-AC(A,G) TTN GCN GC(C,T) TGN GGN CC-3'

상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 결과 약 180bp의 단편이 증폭되었으며, 염기서열 분석을 통하여 저온 유도 단백질 유전자의 단편임을 확인하였다(도 2a). 이 단편을 프로브(probe)로 아스로박타 에스피 A2-5 균주의 유전자은행으로부터 전장 유전자가 포함된 클론을 선발하였다. 동 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 도 2a에 나타난 바와 같이 오픈리딩프레임(ORF)가 207bp로 구성되며(서열번호 1), 이에 의해 68개 아미노산(서열번호 2)이 코딩되어져 있음을 확인할 수 있다. 선발된 게놈 클론의 아미노산의 상동성을 비교한 결과 기존의 세균에서 밝혀진 저온 유도 단백질 유전자와 60∼71.9%의 상동성을 나타내었고, 세균류의 저온 유도 단백질 유전자에서 발견되는 RNA 바인딩 모티프(binding motif)인 RPN-1 (KGYGFI) 및 RPN-2 (DVFVH)도 잘 보존되어 있어 선발된 유전자가 저온 유도 단백질 유전자의 일종인 것으로 판단되어 이 유전자를 A2-5cspA로 명명하였다.

상기 본 발명에 따라 분리·동정한 A2-5cspA 유전자의 저온에 따른 발현 양상을 분석한 결과 A2-5cspA 유전자는 25℃에서는 거의 발현되지 않았으나, 10℃의 저온 처리 30분 후부터 발현되기 시작하여 1시간∼2시간 사이에 가장 발현이 증가되다가 그 후에는 서서히 발현양이 감소하였다. 따라서 이 유전자는 저온의 자극에 의하여 발현이 유도됨을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 경우에 따라 상기 서열번호 1기재의 염기서열 중 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 변형서열이 사용되어질 수 있다. 하지만, 상기 변형서열은 궁극적으로 얻어지는 최종 저온 유도 단백질의 3차원적 구조에 실질적으로 영향을 주지 않는 범위 또는 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 범위내일 것이 요구된다. 이와 같은 변형서열의 획득은 인위적인 유전자조작과정에서 얻어지거나, 자연적인 돌연변이 과정을 통해 얻어질 수도 있다. 인위적인 유전자 조작과정을 통해 통상적으로 이미 잘 알려진 많은 돌연변이 유도실험 등의 과정을 통해 최종적으로 발현되어지는 단백질의 구조 및 활성을 측정하고 실질적으로 상기 서열번호 1에 의해 발현되는 단백질과 실질적으로 동일한 3차원적 구조 내지는 저항성 유도활성을 갖는 유전자를 획득하는 과정은 당업자에게는 극히 용이한 작업에 불과하므로 이에 대한 보다 상세한 설명은 생략하기로 한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 기재의 유전자와 이들의 변형서열 이외에도 이와 상보적인 유전자를 포함한다. 상보적인 유전자는 DNA 복제과정을 통해 서열번호 1 기재의 유전자와 이들의 변형서열을 가지는 유전자로 쉽게 합성할 수 있는 주형으로 사용될 수 있다. 상보적인 유전자를 얻는 과정은 당업자에게 극히 용이한 기술에 불과하며, 이러한 서열은 서열번호 1 기재의 유전자 또는 이들의 변형서열을 주형으로 직접 작성되어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 2 기재의 단백질을 포함한다. 상기 서열번호 2 기재의 단백질은 68개의 아미노산 서열을 가지며, 저온 유도 단백질 활성을 가진 다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 기재의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 형질전환에 사용되어질 숙주의 종류에 따라 제공되는 코돈용법(codon usage)에 따라 상기 단백질을 발현할 수 있도록 암호화하는 다양한 조합의 유전자일 수 있다.

본 발명의 상기 서열번호 1 기재의 A2-5cspA 유전자 또는 이들의 변형서열은 적당한 벡터에 도입되어 특정 세포로 도입될 수 있다. 이러한 형질전환에 사용될 수 있는 벡터 제조기술은 공지된 또는 시판되는 벡터시스템을 이용할 수 있다. 후술하는 본 발명의 실시예에서는 pYES-DEST52(7.6kb) 벡터를 인비트로젠사(Invitrogen Life Technology, 미국)로부터 구입하여, 벡터내에 존재하는 GAL1 프로모터에 의하여 삽입 유전자가 발현되도록 A2-5cspA 유전자를 삽입하여 효모에서 발현가능한 벡터로 사용하였다(도 4a).

형질전환과정은 그 대상이 되는 효모 또는 식물체 등의 다양한 진핵생물에 대하여 이미 공지된 많은 방법이 이용될 수 있다.

효모의 형질전환 과정은 통상적인 방법(Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168. 등 다수) 및 동 과정들 중 일부를 수정하여 실시될 수 있다.

본 발명에 의하면 상기 A2-5cspA 유전자의 진핵생물에서의 기능을 검정하기 위하여 진핵미생물인 효모에 형질전환하여 그 발현양상을 관찰한 결과 도 4b의 실 험결과에서와 같이 A2-5cspA 유전자가 효모에서 발현됨을 확인할 수 있었다.

또한, 효모에서 A2-5cspA 유전자의 기능을 검정한 결과, 형질전환된 효모는 15℃의 온도에서 생육이 가능하였으나, 비형질전환 효모는 동일조건에서 전혀 생육을 하지 못하므로, 도입된 A2-5cspA 유전자가 세포내에 발현되어 저온에 대한 저항성을 증진시킨 것으로 나타났다(도 5).

본 발명은 상기한 바와 같이 남극의 토양에서 분리한 미생물 중 저온에서 생육이 왕성한 균주를 선발하여 신규의 아스로박타 속(Arthrobacter sp.) 균으로 동정하였고 이 균주로부터 저온의 자극에 의하여 생성되는 단백질을 코드하는 유전자를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 또한, 이 유전자는 저온에서 발현이 증가됨을 확인하였고, 이 유전자를 진핵생물인 효모에 도입하여 발현시킨 경우 15℃의 저온에서도 효모의 생육이 가능하여 진핵생물에서도 저온의 스트레스에 대한 저항성이 증진됨을 확인하였다.

이러한 결과는 본 발명에 따른 아스로박타 속 A2-5 균주로부터 분리한 저온 유도 단백질 유전자 A2-5cspA가 저온 저항성에 관련된 유전자로 저온 저항성 생물체의 개발에 기여할 수 있음을 시사한다. 또한, 작물의 안정적인 생산을 위하여 이러한 저온저항성에 관련된 유전자를 분자육종학적인 방법을 이용함으로써, 저온저항성 작물개발의 소재로 이용할 수 있는 가능성을 시사한다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 미생물의 선발 및 동정

1) 저온에서 생육 가능한 균주의 선발

미생물은 남극토양에서 분리하였는데, 분리과정은 토양 30g을 멸균수 270㎖에 현탁시키고 10분간 진탕하여 완전히 섞이게 하였다. 완전히 현탁된 현탁액을 10배씩 희석하여 10⁶까지 희석액을 만들고 각 희석액을 고체배지에 200㎕ 씩 도말하여 28℃의 항온기에 배양하여 자라난 미생물을 새로운 배지에 옮겨 증식시켰다. 분리한 미생물을 트립틱 소이 고체 배지(Tryptic Soy Agar)에 이식하고 15℃, 20℃, 25℃, 30℃의 항온기에서 3 일간 배양하여 생육상태를 조사한 결과 A2-5 균주가 15℃의 저온에서도 생육이 가장 우수하였다(도 1a).

2) 저온 저항성 미생물의 동정

선발한 A2-5 균주의 16S rDNA 일부를 PCR법(95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분의 조건으로 30 cycles)으로 증폭하여 염기서열 분석결과 아스로박타 속 균의 16S rDNA의 염기서열과 98% 이상의 상동성을 나타내었다. 이를 아스로박타 속의 표준 균주들의 rDNA 염기서열과 근연도를 비교분석하였는데 A2-5 균주는 기존의 어느 종에도 속하지 않는 신규의 균주였다(도 1b). 따라서 이 균주를 Arthrobacter sp. A2-5로 명명하고, 경기도 수원시 소재 농용 미생물 보존센터에 2005. 7. 29.일자 KACC91168P 로 기탁하였다.

[실시예 2] 저온유도 단백질 유전자 분리 및 염기서열 분석

1) 저온유도 단백질 유전자의 분리

아스로박타 에스피 A2-5 균주로부터 저온 유도 단백질 유전자를 분리하기 위하여 세균류에서 보고된 저온 유도 단백질 유전자의 보존영역을 참고로 프라이머 CSP-1 [5'-GGN ANN GTN AA(A,G) TGG TT(C,T) AA-3']과 CSP-2 [5'-AC (A,G) TTN GCN GC(C,T) TGN GGN CC-3']를 합성하여 PCR법으로 증폭하였다. 이때 사용된 PCR 조건은 하기와 같다.

저온유도 단백질 유전자의 증폭을 위한 PCR은 아스로박타 에스피 A2-5 균주의 DNA 약 200ng을 주형으로 사용하였고, dNTP 20mM, primer 100pM, Taq polymerase 2.5U 되도록 반응액을 만든 다음 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분의 조건으로 30 cycles PCR 증폭을 실시하였다. PCR 산물은 1.5%의 agarose gel에서 확인하고 pGEM-T easy vector (Promega Co.)에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다.

PCR 결과 약 180bp의 단편이 증폭되었는데 염기서열 분석을 통하여 저온 유도 단백질 유전자의 단편임을 확인하였다(도 2a). 이 단편을 프로브로 아스로박타 에스피 A2-5 균주의 유전자은행으로부터 전장 유전자가 포함된 클론을 선발하였다. 선발된 게놈 클론의 염기서열을 분석하여 207 bp의 저온 유도 단백질 유전자의 오픈리딩프레임(ORF)이 확인되었고 68 개의 아미노산으로 구성되어 있었다(도 2b). 아미노산의 상동성을 비교한 결과 기존의 세균에서 밝혀진 저온 유도 단백질 유전자와 60∼71.9%의 상동성을 나타내었고, 세균류의 저온 유도 단백질 유전자에서 발 견되는 RNA 바인딩 모티프인 RPN-1 (KGYGFI) 및 RPN-2 (DVFVH)도 잘 보존되어 있어 선발된 유전자가 저온 유도 단백질 유전자의 일종인 것으로 판단되어 이 유전자를 A2-5cspA로 명명하였다.

[실시예 3] 저온 유도 단백질 유전자의 발현 분석

A2-5cspA 유전자의 저온에 따른 발현 양상을 분석하기 위하여 25℃에서 배양한 아스로박타 에스피 A2-5 균주의 균체를 10℃의 저온에 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 처리한 다음 총 RNA를 분리하고 노던블롯 혼성화를 수행하였다. 그 결과 A2-5cspA 유전자는 25℃에서는 거의 발현되지 않았으나, 10℃의 저온 처리 30분 후부터 발현되기 시작하여 1시간∼2시간 사이에 가장 발현이 증가되다가 그 후에는 서서히 발현양이 감소하였다. 따라서 이 유전자는 저온의 자극에 의하여 발현이 유도됨을 확인하였다(도 3).

[실시예 4] A2-5cspA 유전자의 효모에서의 기능 검정

1) 효모 형질전환 유전자 카세트제작 및 형질전환

A2-5cspA 유전자의 진핵생물에서의 기능을 검정하기 위하여 진핵미생물인 효모에 형질전환하여 발현시켰다. 이를 위하여 효모 형질전환용 운반체인 pYES-DEST52 벡터(Invitrogen Life Technology)에 A2-5cspA 유전자를 연결하여 효모에서 발현할 수 있도록 조작하였다(도 4a).

벡터의 제작은 벡터제조사인 인비트론 라이프 테크놀로지사 (Invitrogen Life Technology)에서 추천하는 방법으로 실시하였다. A2-5cspA 유전자를 프라이머 attB1-cspA-F(5'-AAA AAG CAG GCT ATG GCA TTG GGA ACC GTC AA-3') 와 attB2-cspA-R(5'-AGA AAG CTG GGT GTC TCA CTC TGC AGG CCG GA-3')를 사용하여 95℃-30초, 55℃-30초, 68℃-1분의 조건으로 30회 1차 PCR 증폭하고 프라이머 attB1(5'-AAA AAG CAG GCT-3')과 attB2(5'-AGA AAG CTG GGT-3')로 94℃-30초, 45℃-30초, 68℃-2분으로 25회 2차 증폭하였다. PCR 산물은 4,470bp 크기의 pDONR201벡터(Invitrogen)에 클로닝 하였고, 이를 다시 7.6kb의 효모 형질전환용 pYES-DEST52 벡터에 클로닝하여 효모 형질전환에 사용하였다(도 4a). 제작된 효모 형질전환용 벡터는 A2-5CSPA로 명명하여, 경기도 수원시 소재 농용 미생물 보존센터에 2005. 7. 29.일자 KACC95037P 로 기탁하였다.

형질전환용 효모는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하였으며 세포벽을 리튬아세테이트(Lithium acetate) 용액으로 외래 유전자의 유입이 용이하게 처리한 다음 42℃의 열 충격을 주어 A2-5cspA 유전자가 세포내로 유입되게 하였다. 형질전환이 끝난 효모는 우라실(uracil)이 결핍된 SC 최소배지(0.67% yeast nitrogen base, 2% carbon source, 0.01% adenine/arginine/ cysteine/leucine/lysine/threonine/tryptophan, 0.005% aspartic acid/ histidine/isoleucine/methionine/phenylalanine/proline/serine/tyrosine/valine)에서 선발하였다.

2) 형질전환 효모에서의 A2-5cspA 유전자 발현분석

실시예 4의 1)에서 선발된 형질전환 효모에서 A2-5cspA 유전자가 발현되는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. A2-5cspA 유전자를 형질전환한 균주에서 A2-5cspA 유전자가 발현되도록 갈락토즈(galactose)가 포함된 YPD(Yeast extract Peptone Dextrose) 배지에 배양하여 증식시키고 이 균체로부터 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 주형으로 A2-5cspA 유전자를 RT-PCR 법으로 증폭시켜 도입된 A2-5cspA 유전자가 효모에서 발현됨을 확인하였다(도 4b).

형질전환된 효모는 Saccharomyces serevisiae transformed with A2-5CSPA로 명명하여, 경기도 수원시 소재 농용 미생물 보존센터에 2005. 7. 29.일자 KACC 93024P로 기탁하였다.

[실시예 5] 형질전환 효모의 저온 저항성 검정

효모에서 A2-5cspA 유전자의 기능을 검정하기 위하여 형질전환 효모를 YPD 고체 배지에 도말한 다음 15℃의 항온기에 7일간 배양하였다. 형질전환된 효모는 15℃의 온도에서 생육이 가능하였으나, 비형질전환 효모는 동일조건에서 전혀 생육을 하지 못하므로, 도입된 A2-5cspA 유전자가 세포내에 발현되어 저온에 대한 저항성을 증진시킨 것으로 나타났다(도 5).

이상에서 살펴본 바와 같이 아스로박타 속 A2-5 미생물에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자를 진핵 미생물인 효모에 형질전환하여 발현시킨 결과 저온에 대한 저항성이 증진되어 15℃에서도 효모의 생육이 가능하였다. 따라서 진핵생물에서도 저온 저항성을 증진시키는 기능이 규명됨으로서 작물 등의 진핵 생물에 적용이 가능할 것으로 사료되어 저온 저항성 육종소재로 활용이 가능할 것으로 기대된다.

<110> Rural Development Administraion <120> Cold tolerance microorganism Arthrobacter sp. from South Pole soil and cold shock protein gene isolated from the bacterium, and Transformant comprising the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 873 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. A2-5 <220> <221> CDS <222> (298)..(501) <400> 1 gatcccaagc atctactgcc ggaacaaccg gctggcctga gaaccttttg gtagttgact 60 gctgccaggt ggcatcaagt cagagaactt ggaacttaga tgccgagcat cttccggatg 120 acctttgcgt cacccttgaa aacgatcccc ctggggctcc aataacgttt gggcttcgtc 180 ccggccgtgt gcctcggcct tccggagggc ttgtggctag agtgatttca ggccttggtc 240 cgtaactcgc ggcacacagc ggcgtggacc gtcggcacta cggaaagagt ggacatc 297 atg gca ttg gga acc gtc aag tgg ttc aac gcc gaa aaa ggc tat ggc 345 Met Ala Leu Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Tyr Gly 1 5 10 15 ttc atc acc gtg gac gga tcc ggg gac gac gtc ttt gtg cac tgg tcc 393 Phe Ile Thr Val Asp Gly Ser Gly Asp Asp Val Phe Val His Trp Ser 20 25 30 gcc atc gag ggc gag ggt tac cgc gcg ctc gat gag gga cag cgt gtc 441 Ala Ile Glu Gly Glu Gly Tyr Arg Ala Leu Asp Glu Gly Gln Arg Val 35 40 45 gag ctc gaa atc ggc gag ggc gag aag ggc ccc cag gca gaa aac gtc 489 Glu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Glu Lys Gly Pro Gln Ala Glu Asn Val 50 55 60 cgg cct gca gag tgaagccgg caattttcac ctcaaactcc cgcgttgccg 540 Arg Pro Ala Glu 65 cgttccgctg cagtggccgg cggcccgtcc tgctggcgct ggcgggctgc tcgggcacag 600 cgggcaatgc ccggctggat gccgccgaag cgtcaggtga tggactactg cgcatcgggc 660 tgatcctgga cagcacaggg gaccagggtt tcctcaatga ttcccagctt gcctaccgct 720 gacactggcc gtgaaggaaa tcaacgctgc cggcggtcac aagggcaggc cggttgagct 780 ccttcccgct caggcgggca gtaactcctc cgcccaggcc gcggagctgg tgactgcaaa 840 ggctgacgtg gtgatcggac cggcggactc gag 873 <210> 2 <211> 68 <212> PRT <213> Arthrobacter sp. A2-5 <400> 2 Met Ala Leu Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Phe Ile Thr Val Asp Gly Ser Gly Asp Asp Val Phe Val His Trp Ser 20 25 30 Ala Ile Glu Gly Glu Gly Tyr Arg Ala Leu Asp Glu Gly Gln Arg Val 35 40 45 Glu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Glu Lys Gly Pro Gln Ala Glu Asn Val 50 55 60 Arg Pro Ala Glu 65

Claims (4)

1. 남극토양에서 분리한 아스로박타 속(Arthrobacter sp.) A2-5 균주.
2. 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자 A2-5cspA.
3. 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자 A2-5cspA가 코딩하는 단백질.
4. 아스로박타 속 A2-5 균주에서 분리한 저온 유도 단백질 유전자 A2-5cspA가 도입된 효모.

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