KR20070027662A - 세포 분리 칩 - Google Patents

세포 분리 칩 Download PDF

Info

Publication number
KR20070027662A
KR20070027662A KR1020070006546A KR20070006546A KR20070027662A KR 20070027662 A KR20070027662 A KR 20070027662A KR 1020070006546 A KR1020070006546 A KR 1020070006546A KR 20070006546 A KR20070006546 A KR 20070006546A KR 20070027662 A KR20070027662 A KR 20070027662A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
flow path
cell
flow
buffer
Prior art date
Application number
KR1020070006546A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100742783B1 (ko
Inventor
겐지 야스다
아끼히로 하또리
가즈노리 오까노
Original Assignee
도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
가부시끼가이샤 온칩 바이오테크놀리지스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬, 가부시끼가이샤 온칩 바이오테크놀리지스 filed Critical 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
Publication of KR20070027662A publication Critical patent/KR20070027662A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100742783B1 publication Critical patent/KR100742783B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G01N15/147—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle the analysis being performed on a sample stream
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/08—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a stream of discrete samples flowing along a tube system, e.g. flow injection analysis
    • G01N35/085—Flow Injection Analysis
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Quality & Reliability (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)

Abstract

기판 상에 형성하는 유로를 이용하는 세포 분리용의 염가로 시료마다 교체가 가능한 칩을 이용한 세포 분석 분리 장치를 제공하기 위해서, 이하의 구조를 구비한다. 세포를 포함하는 완충액을 유하시키기 위한 제1 유로, 이 제1 유로를 사이에 두고 이 제1 유로의 양측으로부터 세포를 포함하지 않는 완충액을 유하시키는 제2 및 제3 유로, 상기 제1 유로의 완충액과 제2 및 제3 유로의 완충액이 합류하여 1개의 유로로 되어 완충액을 유하시키는 제4 유로, 상기 제4 유로에 상기 완충액과 함께 유하하는 세포를 검출하는 세포 검출 영역 및 검출한 세포에 따라서 세포를 분리하는 세포 분리 영역을 캐스케이드로 형성하고, 상기 분리 영역의 하류로 분리된 세포를 유하시키는 2개의 유로를 형성함과 함께, 상기 제1 유로 ∼ 제4 유로를 유하하는 완충액이 공통의 액면 위치를 갖는 리저버로부터 공급되고, 상기 제1 유로와 제4 유로의 폭 혹은 단면적이 실질적으로 동일한 구조를 갖는다.
캐스케이드, 세포 표면 항원, 전해질 완충액, 마이크로 유로

Description

세포 분리 칩{CELL SEPARATION CHIP}
도 1은 본 발명의 세포 분리 장치(셀 소터)의 시스템 구성의 일례를 모식적으로 도시하는 평면도.
도 2는 마이크로 유로(204)의 세포를 포함하는 완충액에, 마이크로 유로(205, 205')의 완충액이 합류하여, 마이크로 유로(240)를 유하하고, 세포 검출 영역(221)의 직전에서, 마이크로 유로(204')를 유하하는 완충액과 합류하여 마이크로 유로(240)를 유하하는 상황을 설명하는 도면.
도 3은 세포 검출 영역(221)의 상류부에서, 유로(204)를 유하하는 완충액이 유로(205, 205')를 유하하는 완충액에 의해서 중앙부로 밀어 붙여진 결과의 합류 후의 유로(240)의 세포 분포를 도시하는 도면.
도 4의 (A),(B)는 유로의 폭을 넓게 하는 것에 수반하는 문제와, 그 해결안의 예를 나타내는 단면도.
도 5는 도 4에서 설명한 리저버(203)와 개구(201, 201') 및 유로(204, 204')의 부분을 보다 상세하게 설명하기 위해, 도 1의 A-A 위치 있어서 화살표 방향으로 본 단면도.
도 6은 겔 전극 부분이 다른 구조로 된 셀 소터 칩을 평면도의 형태로 도시하는 도면.
도 7은 CCD 카메라로 취득한 화상으로부터 세포를 인식하고, 각각의 세포를 넘버링하여 식별하는 알고리즘을 설명하는 도면.
도 8은 실시예4의 칩의 평면도.
도 9는 도 8의 B-B 위치에서 화살표 방향으로 본 단면도.
도 10은 셀 소터 칩의 시료 세포를 얻기 위한 전처리 칩으로서 사용하는 것에 주목한 칩의 실시예를 도시하는 평면도.
도 11은 실시예5의 셀 소터를 모식적으로 도시하는 평면도.
도 12의 (A), (B) 및 (C)는, 도 11의 C-C, D-D 및 E-E 위치에서 화살표 방향으로 본 단면도.
도 13은 실시예6의 세포 분리 장치(셀 소터)의 시스템 구성의 일례를 모식적으로 도시하는 평면도.
도 14의 (A), (B) 및 (C)는, 실시예6의 시료 세포의 도입부에 있어서의 고안를 설명하기 위한 부분적인 단면도.
[비특허 문헌 1] Kamarck, M.E., Methods Enzymo1.Vo1.151, p150-165(1987)
[비특허 문헌 2] Micro Total Analysis, 98, pp.77-80(Kluwer Academic Publishers,1998); Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915(1998)
[특허 문헌 1] 일본 공개특허 2003-107099호 공보
[특허 문헌 2] 일본 공개특허 2004-85323호 공보
[특허 문헌 3] 국제 공개 제2004/101731호 팜플렛
본 발명은, 세포 분리 장치(셀 소터)에 관한 것이다.
다세포 생물에 있어서의 생체 조직은 여러 가지 세포가 역할을 분담하여 전체적으로 조화가 이루어진 기능을 유지하고 있다. 혹은, 세포의 일부가 암화(여기서는 종양도 포함시켜, 일괄해서 암이라고 부르기로 한다)하면, 주변 영역과 다른 신생물로 되지만, 암 영역과 그곳으로부터 멀리 떨어진 정상 조직 부분과는 임의의 경계를 가지고 반드시 구획되는 것은 아니고, 암 주변 영역도 어떠한 영향을 받고 있다. 따라서, 장기 조직에 있어서의 기능을 해석하기 위해서는 좁은 영역에 존재하는 소수의 세포를 분리할 필요가 있다.
혹은 의료 분야에 있어서, 정상 조직 중의 암이 의심되는 영역을 조사하기 위해서는, 바이옵시로 분리한 조직편으로부터 암이 의심되는 부분을 분리할 필요가 있다. 이러한 특정 세포의 분리에는, 세포를 고정하고, 여러 가지 세포 염색을 실시하여, 원하는 부분을 잘라내는 것이 일반적이고, 최근에는 레이저 마이크로 다이섹션이라고 불리는 레이저를 쪼인 영역만의 세포를 분리하는 방법이 고안되어 있다.
혹은, 재생 의료 분야에서는, 조직 중에서 줄기 세포를 분리하고, 이것을 배양하여 분화 유도하여 원하는 조직, 나아가서는 장기를 재생하려고 하는 시도가 이루어지고 있다.
세포를 식별하거나 분리하거나 하려고 하면, 어떠한 지표에 따라 구별할 필요가 있다. 일반적으로 세포의 구별에는,
1) 눈으로 확인하는 것에 의한 형태학적인 세포 분류: 이것은 예를 들면 소변 중에 출현하는 이형 세포 검사에 의한 방광암이나 요도의 암 등의 검사나 혈중의 이형 세포 분류, 조직 중에 있어서의 세포진에 의한 암 검사 등을 들 수 있다,
2) 형광항체법에 의한 세포 표면 항원(마커) 염색에 의한 세포 분류: 일반적으로 CD 마커라고 불리는 세포 표면 항원을, 그것에 특이적인 형광 표지 항체로 염색하는 것으로, 셀 소터에 의한 세포 분리나 플로우 사이트 미터나 조직 염색에 의한 암 검사 등에 이용되고 있다. 물론 이들은, 의료면 뿐만 아니라, 세포 생리 연구용이나, 공업적인 세포 이용에 있어서도 다용되고 있다.
3) 혹은, 줄기 세포의 분리에 관해서는, 세포 내로 취입되는 형태의 형광 색소를 리포터로 해서 줄기 세포를 포함하는 세포를 대략적으로 분리하고, 또 그 후에 실제로 배양을 행함으로써 원하는 줄기 세포를 분리하는 예가 있다. 이것은, 줄기 세포의 유효한 마커가 아직 확립되어 있지 않기 때문에, 실제로 배양하고, 분화 유도한 것만을 이용함으로써, 실질적일 목적 세포를 분리하고 있는 것이다.
이와 같이 배양액 중의 특정한 세포를 분리하고 회수하는 것은 생물학·의학적인 분석에 있어서는 중요한 기술이다. 세포의 비중의 차이로 세포를 분리하는 경우에는 속도 침강법에 의해서 분리할 수 있다. 그러나, 미감작의 세포와 감작한 세포를 분별하는 것과 같은, 세포의 비중의 차이가 거의 없는 경우에는, 형광항체 로 염색한 정보 혹은 눈으로 확인한 정보에 기초하여 세포를 1개 1개 분리할 필요가 있다. 이 기술에 대해서는, 예를 들면, 셀 소터가 있다. 셀 소터는, 형광 염색 처리 후의 세포를 전하를 갖게 한 액적 중에 1 세포 단위로 단리하여 적하하고, 이 액적 중의 세포의 형광의 유무, 광 산란량의 대소에 기초하여, 액적이 낙하하는 과정에서, 낙하 방향에 대하여 법평면 방향으로 고전계를 임의의 방향으로 인가함으로써, 액적의 낙하 방향을 제어하여, 하부에 놓인 복수의 용기에 분류하여 회수하는 기술이다(비특허 문헌 1).
그러나, 이 기술은 고가라는 점, 장치가 대형이라는 점, 수천 볼트와 같은 고전계가 필요하다는 점, 시료가 다량으로 필요하다는 점, 액적을 작성하는 단계에서 세포에 데미지를 줄 가능성이 있다는 점, 직접 시료를 관찰할 수 없다는 점 등의 문제가 있다. 이들의 문제를 해결하기 위해서, 최근, 마이크로 가공 기술을 이용하여 미세한 유로를 작성하고, 유로 내의 층류 중을 흐르는 세포를 직접 현미경 관찰하면서 분리하는 셀 소터가 개발되어 있다(비특허 문헌 2). 그러나, 이 마이크로 가공 기술을 이용하여 작성하는 셀 소터에서는 관찰 수단에 대한 시료 분리의 응답 속도가 느려, 실용화하기 위해서는, 시료에 데미지를 주지 않고, 또한, 보다 응답이 빠른 처리 방법이 필요하였다.
본 발명자들은, 이러한 문제점을 해소하기 위해서, 마이크로 가공 기술을 활용하여, 시료의 미세 구조와 시료 중의 형광 분포에 기초하여 시료를 분류하고, 회수하는 시료에 데미지를 주지 않고, 간편하게 세포 시료를 분석 분리할 수 있는 세포 분석 분리 장치를 출원하고 있다(특허 문헌 1, 특허 문헌 2, 특허 문헌 3). 이 것은 실험실 레벨에서는 충분히 실용적인 셀 소터이지만, 범용적으로 사용하기 위해서는, 액 반송법이나 회수법, 시료 조제에 대하여 새로운 기술 개발이 필요하다.
본 발명은, 기판 상에 형성하는 유로를 이용하는 세포 분리 혹은 검출용으로, 확실하게 소정의 세포의 검출 및 분리를 행할 수 있는 세포 분리 칩 및 세포 분리 기술을 확립하여, 염가로 시료마다 교체가 가능한 칩을 이용한 세포 분석 분리 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
기판 상에 마이크로 유로를 작성하여 액을 흘리면, 일반적으로는 그 안을 흐르는 액은 층류로 된다. 언뜻보면, 유로의 단면적 방향에는 액유속 분포가 없는 것처럼 착각하지만, 실제로 이러한 마이크로 유로 중에 세포 현탁액을 흘리면, 세포가 유로 내의 벽에 접근하는 현상이 빈발한다. 벽에 접근한 세포는 흐름을 거스르는 저항을 받게 되기 때문에 유속이 저하하고, 뒤쪽을 흘러 오는 세포와 접촉하거나 한다. 셀 소터나 플로우 사이트 미터에 있어서 이러한 현상이 발생하면, 세포의 분리 검출이 곤란하게 된다. 일반적으로 이러한 현상을 방지하기 위해서는 시스 플로우 기술이 이용된다. 이것은 고속으로 흐르는 액류를 덮개로 해서 그 코어 부분에 세포 현탁액을 유입시킴으로써 세포를 일렬로 정렬시키는 기술로, 덮개로 되는 시스류와 코어류를 합체시킨 후, 공기 중에 제트류로서 유출시킴으로써 달성된다. 이 종래법에서는 애당초 벽이 없기 때문에 세포가 벽에 접근하는 현상이 없는 이상적인 상태로 세포를 분리할 수 있다.
그러나, 시스를 이용한 제트류를 안정적으로 형성하는 것은 매우 어렵고, 실용적인 장치는 매우 고가이며, 시스 형성용의 셀은 시료마다 교체할 수 없다. 대형의 장치에 한하지 않고 칩 상에 형성한 셀 소터에 관해서도, 본원의 발명자들이 개시하고 있는 방법 이외의 종래의 기술에서는, 빠짐없이 시료액 반송과 시스액 반송을 위해 독립된 펌프를 이용하고 있다. 이들의 펌프는 칩과는 별도로 배치되며, 칩을 교환할 때마다 재연결할 필요가 있다. 또한, 칩을 교환에 수반하는 시료 송액(送液) 속도와 시스 송액의 밸런스 변동을 재조정할 필요가 있다. 이러한 엄밀한 제어를 행하기 위해서, 대규모의 고안정의 펌프가 필요하다.
셀 소터를 칩 상에 구축하는 것이기 때문에, 송액 부분도 칩 상에 형성하고, 광학계 이외의 기능은 칩만으로 클로즈드로 행함으로써 사용성을 개선하여, 저가격을 실현하는 것이 중요한 과제이다. 클로즈드로 함으로써 셀 소터 칩을 샘플마다 사용하고 버리는 새로운 사용 방법이 발생한다. 예를 들면, 줄기 세포의 분리나 임상 검사에는, 다른 검체 조직 유래 세포의 콘터미네이션 방지가 필수이지만, 셀 소터 칩을 일회만 사용하고 버림으로써 콘터미네이션을 고려할 필요가 없어진다. 이와 같이, 셀 소터의 주요 부분을 칩화함으로써, 장치의 소형화, 저비용화, 시료마다의 칩 교환에 따른 크로스 콘터미네이션의 완전한 방지 등이 가능하게 되어, 의료 분야에서의 특히 재생 의료 분야에서 필수인 크로스 콘터미네이션이 없는 세포 분리 시스템을 구축하는 것이 본 발명의 제1 목적이다.
칩 상의 셀 소터를 실현하는 데에 있어서 중요한 기술적인 사항에 미세 유로 내를 흘러 오는 세포의 분리 기구가 있다. 분리 기구에는 여러 가지의 것이 제안 되어 있다. 예를 들면, 초음파, 자계, 밸브에 의한 유로 절환, 레이저 핀셋, 고주파 전계, 직류 전계에서 세포를 임의의 방향으로 이동시키는 기구를 예를 들 수 있다. 이 중, 세포에 데미지를 주지 않고, 재현성 좋게, 특별한 장치를 이용하지 않고 할 수 있는 것은 저전압의 직류 전계를 이용하는 방법이다. 그런데 직류 전계를 이용하여 고속인 세포 분리를 행함에 있어서, 통상의 금속 전극을 이용하면 완충액의 전기 분해가 일어나, 안정적으로 장시간 사용을 할 수 없다는 문제가 있다. 가장 실용화에 가까운 방법이 특허 문헌 3에 기재되어 있다.
특허 문헌 3에 개시되어 있는 마이크로 가공 기술을 이용하여 작성한 양산 가능한 셀 소터 칩에서는, 전기 분해의 영향을 어느 정도 방지하기 위해서, 세포를 분리하는 기구로서 겔 전극을 이용하여 세포가 흐르는 유로 내에 직류 전계를 걸어, 전기 영동적으로 세포를 분류하고 있다. 겔 전극으로서는 전해질을 포함하는 아가로스겔 등을 이용하고 있다. 세포가 흐르는 유로 근방은 세공(細孔)을 통한 겔이 있을 뿐이므로, 기포 발생의 영향을 소정 시간 방지할 수 있지만, 불충분한다. 또한, 겔은, 전해질 완충액을 포함하는 상태에서 공급 보존할 필요가 있기 때문에, 건조에 약하여 장기 보존에 적합하지 않다는 문제가 있다. 또한 장기 보존을 행하기 위해 동결 보존하려고 하면, 겔이 동해(凍害)를 받아 파괴되기 때문에, 동결 보존은 할 수 없다.
따라서, 본 발명은, 전계를 걸고 있는 도중의 기포의 발생을 방지하여, 보존 시에 건조나 동결에 내성이 있는 겔 전극을 제공하고, 참된 의미에서의 검체마다의 소모형(One Time Use) 셀 소터 칩을 제공하는 것을 제2 목적으로 하고 있다.
기판 상에 형성하는 유로를 이용하여 세포 분리를 행하고자 하면, 유로 중의 특정 영역에 세포 인식을 행하는 부위를 형성하고, 어떠한 수단으로 세포를 인식하는 알고리즘이 필요하게 된다. 또한, 세포 분리를 행하는 셀 소터로서 사용하려고 하면, 세포 검출부의 하류에 분리부를 형성할 필요가 있다. 일반적으로, 세포 검출에는 이하의 3가지의 방법이 존재한다.
1) 레이저 등을 유로 상의 검출부에 조사하고, 세포가 가로지를 때의 산란광이나 세포를 형광 염색할 수 있는 경우에는 그 형광을 검출한다,
2) 검출부에 전극을 형성하고, 세포가 전극을 가로지를 때의 임피던스나 컨덕턴스의 변화를 검출한다,
3) CCD 카메라 등을 이용하여, 세포를 상으로서 검출한다.
여기서, 1)의 방법에서는 세포 인식은 실질적으로 일점에서 행해져, 세포가 연속해서 고속으로 흘러 왔을 때에도 고속인 처리가 가능하기 때문에, 세포를 액적에 가두어 넣음으로써 일정 속도로 검출부와 분리부 사이를 이동시키는 기술을 이용한 대형의 셀 소터에 사용되고 있다. 2)의 방법은 역시 고속인 처리가 가능하지만, 검출 후의 세포의 이동 속도를 측정할 수 없고, 또한 분취 기구와 조합하는 것이 어렵기 때문에, 일반적으로는 세포 분류에 이용하는 프로우 사이트 미터에 채용되고 있다. 3)의 방법은, 언뜻 보아, 간편한 것 같지만, 유로 중을 항상 이동하는 복수의 세포를 취급할 필요가 있기 때문에, 셀 소터에서는 화상 처리의 부하가 커지기 때문에 일반적으로는 이용되고 있지 않는다.
그러나, 기판 상의 좁은 범위에 형성한 유로에 있어서, 마찬가지의 세포인식 과 그것에 계속되는 세포 분리를 행하고자 하면, 여러 가지 문제가 새롭게 발생한다. 우선, 유로 중을 흐르는 세포의 이동 속도는 모든 세포에서 동일하지 않고, 세포의 형상이나 크기, 유로의 중심을 흐르는지 벽 근방을 흐르는지 등의 요인으로 가지 각색으로 된다. 이 때문에, 특히 세포를 인식한 후에 그 하류에서 세포를 분리할 때까지의 시간에 변동이 발생한다. 다음으로, 마찬가지로 세포의 이동 속도가 가지 각색이기 때문에, 어떤 세포가 다른 세포를 유로 내에서 추월하는 등의 현상도 나타난다. 이 때문에, 세포를 1점에서 관찰하는 상기 1)이나 2)의 방법에서는 각 세포를 확실하게 분리할 필요가 있는 경우의 해결해야 할 문제로 된다. 그래서 본 발명의 제3 목적은, CCD 카메라 등을 이용하여, 세포를 상으로서 검출함으로써 유로 중을 연속해서 고속으로 흘러 오는 세포를 식별하여, 필요한 세포를 선별하기 위한 알고리즘을 제공하는 것에 있다.
종래의 셀 소터로도, 특정 세포 영역을 분리하고, 포함되는 게놈이나 트랜스크립톰의 해석, 혹은 이뮤노 케미스트리를 이용한 검사를 행하는 데 있어서는 충분하다. 그러나, 대부분의 방법에서는, 염색이나 고정 등의 조작에 의해, 회수한 세포는 이미 그 생명 기능을 정지하고 있다. 이 때문에, 회수한 세포의 동적 기능의 해석이나, 또한, 이것을 배양하여 이용한다고 하는 것이 불가능하다는 문제가 있다. 특히, 금후 실용화가 기대되는 재생 의료나, 배양 조직 세포편을 이용하는 약품 동태 검사 등의 재료로서의 세포를 얻기 위해서는, 장기 조직을 세포 레벨로 해부하여 회수하는 기술의 확립이 중요하다.
본 발명의 제4 목적으로서, 장기 조직을 그 표면으로부터 순차적으로 세포를 유리시켜, 세포층마다 대략적으로 세포를 분리하는 전처리부와, 세포 분리 영역을 일체화한 칩형상 디바이스와 그것을 이용하는 세포 분리법을 제공한다.
이와 같이, 본 발명에서는, 칩 상에 셀 소터 ∼ 플로우 사이트 미터를 구축하는 데에 있어서의 구체적 아키텍쳐로서, 특히, 세포용 유로의 형상과 세포 현탁액 반송 부분의 구조, 장기 보존에 견디어 유통 경로에 오를 수 있는 전극 부분의 구조, 분리 알고리즘, 시료로서의 조직 단편이나 세포 덩어리로부터의 세포 계측 및 분리 칩을 제안한다.
본 발명에서 상정하고 있는 세포는, 작은 것으로는 박테리아, 큰 것으로는 동물 세포에서 암 세포와 같은 것이다. 따라서, 세포 사이즈로서는 0.5μm ∼ 30μm 정도의 범위로 된다. 세포 분리를 기판 상에 형성한 유로를 이용하여 행하고자 하면, 우선 문제로 되는 것이 유로 폭(단면 형상)이다. 또한, 유로는 기판의 두께 방향으로 1O∼1OOμm 내외의 스페이스에 실질적으로 2차원 평면 형상으로 작성하게 된다. 세포의 크기로 보아 박테리아용으로는 5∼10μm, 동물 세포용으로는 10 ∼ 50μm가 적당한 사이즈로 된다. 상기한 바와 같이, 우선 세포가 벽에 접근하는 것을 방지할 필요가 있다. 세포 현탁액이 흐르는 유로의 양측면으로부터 다른 액을 측류로서 유입시켜, 세포가 벽에 접근하지 않도록 한다. 이러한 액의 합류 방법을 검토한 결과, 액의 합류 전의 세포 현탁액을 흘리는 유로의 폭(실질적으로 단면적)과 합류 후의 유로의 폭이 거의 동일하여, 상기 양측으로부터 합류하는 유로의 유로 길이가 동일할 때에 가장 효과가 얻어지는 것을 알 수 있었다. 합류 후의 유로 폭이 넓으면 세포를 벽으로부터 멀리 떨어지게 하는 효과가 작아지고, 합류 후의 유로 폭이 좁으면 합류 후에 세포가 흐르는 속도가 너무 빨라져, 검출하기 어렵게 되고, 흘러 오는 세포 그 자체의 빈도가 극단적으로 적어진다. 또한, 2개의 측류의 길이가 다르면 유로 저항이 변하기 때문에, 세포를 흐르는 중앙의 유로가 한쪽으로 치우쳐 버리는 문제가 발생한다.
칩 상에, 셀 소터든 플로우 사이트 미터를 구축하려고 하면, 세포 현탁액이나 상기 측류의 유속 제어가 매우 어려운 문제로서 부상한다. 대규모의 무맥류 펌프로, 게다가, 수십 피코리터/분의 유속을 안정적으로 만들 수 있는 것을 사용하면 해결하지만, 소모형의 칩을 전제로 하면, 칩과 펌프의 커넥션을 매회 행하지 않으면 안되어, 재현성과 사용성의 면에서 문제이다. 그래서, 칩 상의 펌프를 형성하는 연구가 이루어져 있지만, 본 발명에서는, 일체 펌프를 사용하지 않고, 액의 자유 낙하로 해결한다. 즉, 유로의 입구에 리저버를 설치하여, 리저버 내의 액면보다 유로 출구의 액면을 낮게 함으로써 무맥류에서의 미량 액송을 실현하고 있다.
이러한 액면 높이의 차이를 이용하는 시스템에서는, 복수의 액을 송액할 때의 액유속 제어가 곤란하다. 액면의 미묘한 차이로 세포 현탁액과 측류의 유속비가 변동하는 문제가 발생한다. 본 발명에서는, 세포 현탁액을 넣은 리저버와 측류를 형성하는 완충액을 넣는 리저버를 일체화함으로써 양자의 액면을 엄밀히 일치시켜 해결하고 있다. 즉, 공통의 액면로부터의 고저 차를 드라이빙 포스로 하여 액송을 행함으로써 세포 현탁액과 측류의 유속비의 변동을 없애고 있다. 이와 같은 구조의 리저버로서, 1개의 리저버에 칸막이가 있고, 한쪽의 바닥에 시료용 유로가 결합하고, 다른 쪽에 측류용의 유로가 접합하고 있는 구조를 고안한다. 실질적으 로 사이폰의 원리로 양 리저버의 액면을 일치시키고 있다고 생각할 수 있다. 칸막이보다 높은 곳에서는 액이 연결되어 있는 것으로 되지만, 세포는 완충액보다 비중이 높기 때문에, 칸막이를 타고 넘어 측류 쪽으로 유입되는 일은 없다.
본 발명의 검출부는, 측류가 합류한 유로 부분에 있다. 합류 후의 유로 부분을 CCD 카메라로 관측하는 부위를 형성하고, 필요에 따라서 그 하류에 세포 분리 영역을 형성하는 구조로 하고 있다. 필요에 따라서, 라고 하는 것은 셀 소터로서의 칩을 말하는 것으로, 프로우 사이트 미터로서는 검출부의 하류에 직접 드레인을 형성한다. 이에 의해, 세포가 벽에 접근하지 않고, 유로의 중심부로 치우친 경로를 거의 일정한 속도로 흐르게 된다.
셀 소터로서 이용하기 위해서는 검출부의 하류에 세포 분리 영역을 형성한다. 분리부의 입구에서 세포를 이동시키기 위한 유로로서 세포 분리 영역에 있어서 완충액(혹은 배지)만을 흘리는 유로가 합류하고, 하류측에서 분리부로부터 분기하고 있다. 분리부에서 세포를 분리한다는 것이지만, 세포 분리 영역에 외부로부터 세포에 외력을 가하여 세포를 이동시키는 수단으로서 전극을 형성하고, 세포를 분리하여 배출할 수 있는 유로를 형성한다. 전극에 전압을 걸어 이온을 흘리는 것에 의해 세포의 유로 내에서의 자세 제어(유로 변경)를 행할 때에는, 이온이 흐르는 방향과, 유로 내에서 액이 흐르는 방향의 합성 벡터의 방향으로 세포가 이동한다. 세포는 마이너스로 차지하고 있으므로 플러스의 전극을 향하여 움직인다. 따라서, 합체 후의 유로가 흐르는 방향에 대하여 마이너스극을 하류측, 플러스극을 상류측으로 어긋나게 한 형태로 전극을 형성함으로써 이동을 위한 합성 벡터를 제어하고, 적은 전류로 세포의 유로 변경을 가능하게 하고 있다. 유로 변경하는 세포와 유로 변경하지 않는 세포는 각각 다른 유로에 유입되어 분리된다. 여기서 시료가 흐르는 쪽의 유로는, 원래의 시료용의 유로에 측류가 합류한 유로로 되어 있다. 이에 대하여, 합류하는 완충액(혹은 배지)만을 흘리는 유로에서는 상류측에서 측류의 합류는 없다. 시료 유로와 완충액만의 유로 및 합류 후의 유로는 폭이 동일하다. 합류 후의 시료 유로는 측류가 실려 있는 분만큼, 유속이 빠르고, 이 때문에 분리부에 있어서는 약간 완충액 유로측으로부터의 흐름의 부분으로 비어져 나오는 구조로 되어 있다. 이 것도, 세포를 자세 제어하고, 시료 유로측으로부터 완충액 유로측으로 바꿔 타기 쉽게 하는 중요한 효과이다. 전류를 흘릴 때는, 세포는 시료 유로측의 중심을 흐르고 있기 때문에, 그대로 바꿔 타는 일 없이 시료액이 흘러 나오는 유로측으로 흘러 간다.
분리부에 형성하는 전극은, 유로(공간과 공간을 채우는 액을 포함하는 세관으로, 여기서는 겔로 채워지고 있다)를 통하여 겔을 충전한 공간에 금속 전극이 접하는 구조로 되어있다. 이것을 겔 전극이라고 부르기로 한다. 마이너스 전극측은 생성하는 히드록시 이온을 흡수하기 위해 저 pH의 완충액, 플러스 전극측은 생성하는 수소 이온을 흡수하기 위해 높은 pH의 완충액을 포함하는 겔 매트릭스로 되어 있다. 겔 매트릭스로서는 아가로스나 폴리아크릴아미드와 같은 생화학에서 일반적으로 사용되고 있는 메시 구조를 드는 겔을 이용할 수 있다. 이에 의해, 겔 전극부의 전기 분해에 의한 가스 발생을 억제하여 안정적으로 세포 분석 분리를 가능하 게 하고 있다. 물론, 금속 전극이 세포에 직접 닿는 일이 없으므로, 전극 표면에서 세포를 괴롭히지 않게 된다. 세포 시료의 데미지를 방지하여, 전극의 전기 분해에 의한 소실을 방지하는 것을 가능하게 하고 있다.
겔 전극은 상기한 바와 같이 특허 문헌1에 기재된 금속 전극에 비하여 장점이 크지만, 유저에게 칩을 공급하는 데에 있어서 문제가 남는다. 즉, 겔 전극은 습식의 전극이기 때문에, 저장 안정성이 나쁘고, 실질적으로 유저가 사용 직전에 겔을 칩에 충전하여 겔 전극을 작성할 필요가 있다. 본 발명에서는, 트레할로스 등의 비 환원성 이당이나 글리세롤, 에틸렌글리콜 등을 첨가함으로써 일정 기간의 실온 보존을 가능하게 하고 있다. 또한, 통상적으로, 겔은 동결하면 겔 구조가 깨지기 때문에, 동결에 의한 장기 보존이 곤란하지만, 상기 트레할로스 등을 첨가하여 급속 냉동함으로써, 겔 구조를 파괴하는 빙정의 출현을 억제할 수 있어, 결과적으로 겔 전극의 냉동 보존에 의한 장기 보존을 가능하게 하고 있다.
또한, 본 발명의 세포 분리 장치는, 세포 분리 영역에 도입되는 시료를 포함하는 유체가 도입되는 유로의 상류부에서 불순물을 포획하여 유로의 막힘을 방지하는 수단을 가질 수 있다.
즉, 본 발명은, 세포 분리용 공간, 그것에 세포를 포함하는 유체를 주입하기 위한 적어도 하나의 유로, 그리고 나서 유체를 배출하기 위한 적어도 2개의 유로 및 상기 세포 분리 영역에 외부로부터 세포에 외력을 가하는 수단으로 이루어지는 세포 분리 장치로서, 이들의 유로가, 세포 분리 영역에 외부로부터 외력을 가한 경우와 가하지 않는 경우에, 세포가 상기 세포 분리용 공간으로부터 각각 상이한 유 로로 배출되도록 배치된 것을 특징으로 하는 세포 분리 장치이다.
이 세포 분리 장치에 있어서는, 세포 분리 영역에 외부로부터 세포에 외력을 가하기 때문에, 전극 등이 직접 세포를 포함하는 완충액에 접하지 않고, 또한, 낮은 전압으로 전류를 흘려(즉 이온을 흘려) 세포를 분류하기 때문에, 세포에 대한 데미지를 적게 하고 있다.
세포 인식과 분리의 알고리즘에 관해서는 다음과 같은 특징이 있다.
일점에서의 세포 인식이 상기 이유에 의해 불가능하기 때문에, 측정 범위를 면으로 넓혀 화상 인식으로 세포의 식별을 행하고, 추적함으로써 보다 확실한 세포 분리를 행한다. 이 때 중요한 것은, 화상의 취득 속도이다. 일반의 30프레임/초의 비디오 레이트의 카메라에서는, 화상에서의 세포 놓침이 발생한다. 최저 200프레임/초의 취득 레이트가 있으면, 유로 중을 상당한 속도로 흐르는 세포를 인식할 수 있다.
다음으로, 화상 처리법인데, 취득 레이트가 빠르다는 것은 너무 복잡한 화상 처리를 행하는 것은 불가능하다. 우선, 세포 인식인데, 상기한 바와 같이, 세포의 이동 속도나 세포에 따라 가지각색이고, 경우에 따라서는 세포의 추월이 있다. 이 때문에, 각 세포가 최초로 화상 프레임에 나타났을 때에 세포에 넘버링을 실시하고, 이하, 화상 프레임으로부터 사라질 때까지 동일 넘버로 관리를 행하는 것으로 한다. 즉, 연속하는 복수매의 프레임에서 세포상이 이동하는 상황을 넘버로 관리한다. 각 프레임 내에서의 세포는 상류측에 있던 것부터 순서대로 하류측으로 이행하고, 화상 중에 인식되는 넘버링된 특정 세포의 이동 속도는 임의의 범위에 들 어간다는 조건에서 프레임간의 세포를 링크시킨다. 이와 같이 함으로써, 가령, 세포의 추월이 있었다고 해도 각 세포를 확실하게 추적할 수 있도록 한다.
이로써, 세포의 인식이 가능하게 되지만, 세포의 넘버링에는, 우선 세포상을 2치화하고, 그 무게 중심을 구한다. 2치화한 세포의 휘도 중심, 면적, 주위 길이, 긴 직경, 짧은 직경을 구하고, 이들의 파라미터를 이용하여 각세포를 넘버링한다. 각 세포상을 이 시점에서 화상으로서 자동 보존하는 것도 사용자에게 있어서 이익이 있으므로 행할 수 있도록 한다.
다음으로, 세포 분리에 사용하는 경우인데, 넘버링한 세포 중, 특정한 세포만을 분리하지 않으면 안 된다. 분리의 지표는 상기한 휘도 중심, 면적, 주위 길이, 긴 직경, 짧은 직경 등의 정보라도 되고, 검출부와 화상 처리부에서 형광 검출을 행하여 정보를 얻어도 된다. 어쨌든, 검출부에서 얻은 세포를 넘버링에 따라 분리한다. 구체적으로는, 소정 시간마다 취득되는 상기 화상으로부터 넘버링된 세포의 이동 속도(V)를 계산하고, 세포 이동 속도(V)에 대하여 검출부로부터 분리부까지의 거리를 (L), 인가 시간(T)에 의해서, 인가 타이밍을 (L/V)부터(L/V+T)까지로 함으로써 바로 원하는 넘버의 세포가 전극 사이에 왔을 때에 세포를 전기적으로 분류하여 분리한다.
일반적으로, 동물 조직의 세포에서는, 세포 사이에 세포 외 매트릭스가 존재하여, 세포끼리가 뿔뿔이 흩어지지 않도록 되어 있다. 세포 외 매트릭스는 주위의 세포가 분비한 단백질과 다당류가 집합하고, 이들을 분비하는 세포 표면과 결합하여 메시형 구조를 형성한 것이다. 세포 외 매트릭스의 실태는, 프로테오글리칸이 나 콜라겐 엘라스틴, 파이브로넥틴이나 라미닌으로 이루어진다. 따라서, 조직을 형성하는 개개의 세포를 얻기 위해서는 일반적으로 트립신 등의 프로테아제 처리를 행한다. 일반적으로는 조직을 되도록 작은 단편으로 절단한 후에 트립신 처리를 단시간에 행하여, 세포에 그다지 데미지를 주지 않도록 하여 세포 단체를 얻는다.
본 발명에서는, 이 프로테아제 처리를 역수로 취하고, 프로테아제로 조직 표면으로부터 순차적으로 세포를 유리시킴으로써 조직의 깊이 방향으로 분포를 갖는 일련의 세포군을 얻는 기능과 구조를 포함한 칩도 제공한다.
(실시예1)
도 1은, 본 발명의 세포 분리 장치(셀 소터)의 시스템 구성의 일례를 모식적으로 도시하는 평면도이다. 셀 소터(100)는 기판(101)에 의해 구성되어 있다. 기판(101)의 하면에 유로를, 상면에 이 유로와 연통하는 개구를 형성하여, 시료나 필요한 완충액의 공급구로 한다. 또한, 충분한 완충액의 공급과 각 유로에서의 유량의 조정을 위해서 리저버를 형성한다. 유로의 작성은 PMMA 등의 플라스틱을 금형에 유입시키는 소위 사출 성형으로 작성할 수 있다. 칩 기판(101) 전체의 사이즈는 20×30×1mm(t)이다. 칩 기판(101)의 하면에 새겨진 홈이나 관통 구멍을 유로나 웰의 형상으로 하기 위해서, 홈이 새겨진 하면측에 O.1mm 두께의 라미네이트 필름을 열압착하고 있다. 개구수 1.4, 배율 100배의 대물 렌즈를 이용하여, O.1mm의 라미네이트 필름을 통해서 유로 내를 흐르는 세포를 관찰할 수 있다. 물론 이것보다 저 배율의 렌즈에서는 문제없이 관찰할 수 있다. 칩 기판(101)의 상면에는, 마 이크로 유로에 세포를 포함하는 시료 완충액을 도입하는 구멍(201), 세포를 포함하지 않는 완충액을 도입하는 구멍(201', 202 및 202')이 형성될 뿐아니라, 이들을 포괄하는 리저버(203)가 형성된다. 따라서, 리저버(203)에 충분한 완충액을 공급하면 구멍(201, 201', 202 및 202')은 완충액으로 연결된다. 이에 의해, 구멍(201 및 201')에 연결되는 유로(204)와 유로(204')에는 동일한 액면 높이의 완충액이 공급된다. 따라서, 양 유로의 유로 폭(유로 높이를 동일한 것으로 하면), 혹은, 단면적, 그리고 양 유로의 유로 길이를 실질적으로 동일하게 하면, 양 유로의 유량을 실질적으로 동량으로 할 수 있다. 마찬가지로, 구멍(202, 202')에 연결되는 유로(205, 205')에는 동일한 액면 높이의 완충액이 공급되고, 유로(205, 205')를 흐르는 완충액의 유량을 유로(204)에 흐르는 유량과 소정의 비로 일치시킬 수 있다. 시료를 포함하는 완충액을 도입하는 구멍(201)의 주변에는 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(250)이 형성되어 있다. 벽(250)의 높이는, 리저버(203)의 벽보다 낮고, 완충액은 벽(250)보다 높은 위치까지 채워져 있다.
구멍(201)에 도입된 세포를 포함하는 완충액은, 마이크로 유로(204)(폭 20μm, 깊이 15μm)를 통과하여, 세포 검출 영역(221) 및 세포 분리 영역(222)까지 도입된다. 여기서, 마이크로 유로(204) 상에는, 마이크로 유로의 막힘을 방지하기 위해서, 칩 중에 직접 미세 구조로서 조립된 필터(230)가 배치되어 있다. 한편, 구멍(202, 202')에 도입된 세포를 포함하지 않는 완충액은 유로(205, 205')(폭 12μm, 깊이 15μm)를 통과하여, 마이크로 유로(204)의 세포를 포함하는 완충액과 합류한다. (240)는 합류 후의 마이크로 유로로서, 세포 검출 영역(221)으로 된다. 또한, 마이크로 유로(240)는 세포 분리 영역(222)까지 도입된다.
한편, 구멍(201')에 도입된 세포를 포함하지 않는 완충액은, 마이크로 유로(204')(폭 20μm, 깊이 15μm)를 통과하여, 세포 분리 영역(222)에 도입되어, 마이크로 유로(240)와 합류한다. 합류 후의 유로 폭에 대해서는, 후술한다. 또한, 이 합류한 유로는, 세포 분리 영역(222)의 출구에서, 마이크로 유로(218)(폭 20μm, 깊이 15μm) 및 (219)(폭 20μm, 깊이 15μm)으로 분류한다.
(206, 206' 및 207, 207')은 전해질을 포함하는 겔을 도입하는 구멍으로서, 각각, 구멍(206 및 207)에 도입된 겔은 기판(101)의 하면의 마이크로 구조(208, 209)(폭 200μm×높이 15μm의 절곡된 홈)을 통해서 구멍(206' 및 207')으로 보내진다. 따라서, 마이크로 구조(208, 209)는 전해질을 포함하는 겔로 채워져 있다. 마이크로 구조(208, 209)의 굴곡부는 마이크로 유로(204, 204') 사이에서 20μm 정도의 길이의 액로 구조의 연결부(241, 242)로 되어 있고, 세포 분리 영역(222)에 있어서, 마이크로 유로(240)와 마이크로 유로(204')가 합류한 유로(247)를 흐르는 완충액에, 겔이 직접 접촉할 수 있는 구조로 된다. 겔과 완충액이 접촉하는 면적은, 15μm(유로를 따른 길이)×15μm(높이)이다. 겔을 도입하는 구멍(206 및 207)에는, 검은색 동그라미로 나타내는 전극이 삽입되고, 이들 전극은, 배선(106, 107) 및 스위치(216)를 통해서 전원(215)에 접속된다. 스위치(216)는 마이크로 유로(240)와 마이크로 유로(204')가 합류한 유로(247)를 흐르는 완충액에 전압을 걸 때만 ON으로 된다.
세포 분리 영역(222)에서 마이크로 유로(240)와 마이크로 유로(204)가 합류 한 유로(247)를 흐르는 완충액에, 겔이 접촉하는 연결부(241와 242)는, 도면에 도시하는 바와 같이, 마이크로 유로(240)와 마이크로 유로(204')가 합류한 유로(247)에서의 겔과의 접촉 위치가, 연결부(241) 쪽이 유로의 상류에 위치하는 구조로 되어 있다. 구멍(206)의 전극에 플러스, 구멍(207)의 전극에 마이너스의 전압을 걸었을 때에, 마이크로 유로(240)를 흘러 오는 세포를 유로(211')에 효율적으로 이동시킬 수 있다. 왜냐하면 전류를 흘렸을 때에 마이너스로 차지하고 있는 세포는 전기 영동적인 힘이 작용하여, 이 힘과 유로 내를 흐르는 완충액으로부터 받는 벡터와 전기 영동적 힘의 벡터의 합성 벡터로 되기 때문이다. 이에 의해, 연결부(241와 242)를 유로의 흐름에 대하여 동일 위치(흐름의 선의 대상 위치)에 작성한 경우에 비하여, 효율이 좋은 전계 이용이 가능하게 되어, 보다 저전압으로 안정된 세포의 마이크로 유로(218) 혹은 마이크로 유로(219)로의 이동이 가능하게 된다.
마이크로 유로(218, 219)의 하류부에는, 세포 분리 영역(222)에서 분류된 세포의 회수 구멍(211, 212)이 뚫려 있다. 각각의 구멍(211, 212)에는, 회수된 세포를 포함하는 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(211', 212')이 형성됨과 함께, 또한, 이들을 포괄하는 리저버(213)가 형성된다. 리저버(213)는, 세포를 포함하는 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(211', 212')의 높이보다 높고, 분리 조작전에 완충액은 벽(211', 212')보다 높은 위치까지 채워져 있지만, 이 높이는, 리저버(203)에 채워져 있는 완충액의 위치보다는 낮은 것으로 된다.
리저버(203)의 완충액의 액위는 리저버(213)의 그것보다도 높기 때문에, 이 낙차가 유로를 흐르는 완충액의 이동의 구동력으로 됨과 함께, 맥동이 없는 안정된 흐름을 만들어낸다. 리저버(213)의 완충액의 저장량을 충분히 큰 것으로 해 두면, 구멍(201)에 도입된 세포를 포함하는 완충액을, 모두 유로(204)에 유입시킬 수 있다.
도 2는, 마이크로 유로(204)의 세포를 포함하는 완충액에, 마이크로 유로(205, 205')의 완충액이 합류하여, 세포 검출 영역(221)으로 됨과 함께, 또한, 마이크로 유로(240)를 유하하여, 마이크로 유로(204')를 유하하는 완충액과 합류하고 마이크로 유로(247)를 유하하여 세포 분리 영역(222)으로 되는 상황을 설명하는 도면이다.
여기서, 세포 검출 영역(221)의 상류부에서, 유로(205, 205')를 유하하는 세포를 포함하지 않는 완충액을, 마이크로 유로(204)를 유하하는 세포를 포함하는 완충액과 합류시키는 이유를 설명한다. 세포를 포함하는 완충액이 흐르는 유로(204)에는, 세포를 포함하지 않는 완충액이 흐르는 유로(205, 205')가 세포 검출 영역(221)의 상류부에서 합류하지만, 각각의 유로의 최상류에 형성된 구멍(201 및 202, 202')은, 공통의 액위의 완충액의 리저버(203)에 개구되어 있다. 따라서, 각각의 유로를 유하하는 완충액의 유량은, 유로의 높이가 동일하기 때문에, 유로 폭에 비례한 것으로 된다. 이들의 완충액이 합류하지만, 합류 후의 유로(240)의 폭을, 세포를 포함하는 완충액이 흐르는 유로(204)의 폭과 실질적으로 동일한 폭을 갖는 것으로 한다. 실질적으로 동일하다는 것은, 가공 정밀도를 고려하여 동일하다는 것으로, 엄밀하게 동일하다는 것은 아니다. 이에 의해, 유로(204)를 유하하는 완충액은 유로(205, 205')를 유하하는 완충액에 의해서, 일정한 비율로 중앙부 로 밀어 붙여지기 때문에, 유로(204)에서는 측벽에 접근하면서 흘러 오는 세포가, 합류 후의 유로(240) 중에서는 측벽에 접근하지 않게 된다.
세포 분리 영역(222)에 있어서의 마이크로 유로(247)는, 유로(240)와 유로(204')를 각각 유하하는 완충액이, 각각의 흐름의 층을 유지하면서, 동일한 폭의 유로를 가지고 있는 것처럼 유하하고 있다. 세포 검출 영역(221)의 유로(204)에서 유하하는 세포를 검출하여, 세포 분리 영역(222)에서, 겔이 유하하는 완충액과 접촉하는 연결부(241와 242)에 의해 전계를 작용시켜 분리하는 것이다.
도 3은, 세포 검출 영역(221)의 상류부에서, 유로(204)를 유하하는 완충액이 유로(205, 205')를 유하하는 완충액에 의해서 중앙부로 밀어 붙여진 결과의 합류 후의 유로(240)의 세포 분포를 설명하는 도면이다. 도면에 있어서, (255)는 유로의 측벽이다. 즉, 폭 20μm의 유로(204)를 유하하는 세포를 포함하는 완충액의 흐름이, 폭 12μm의 유로(205, 205')를 유하하는 완충액의 흐름에 의해서, 폭 20μm의 유로(240)의 중앙부에 밀어 붙여지는 상황을, 횡축에 유로(204)의 위치, 종축에 세포의 출현 빈도로 도시하는 도면이다. 곡선(301)은, 유로(205, 205')의 각각을 유하하는 완충액이, 유로(204)를 유하하는 세포를 포함하는 완충액 세포의 거의 절반, 즉, 유로(205, 205')의 유로 폭이 유로(204)의 거의 절반인 경우에, 세포가 중앙부의 대략 10μm의 폭에 분포하는 것을 나타내고 있다. 곡선(302)은 유로(205, 205')의 유로 폭이 보다 작은 경우의 세포 분포, 곡선(303)은 유로(205, 205')를 형성하지 않는 경우의 세포 분포를 각각 나타낸다. 곡선(301)으로부터 명확한 바와 같이, 유로(205, 205')의 유로 폭을 적절하게 설정함으로써, 실질적으로 세포 를, 유로 벽으로부터 분리하여 흘릴 수 있어, 세포가 벽에 접근하는 것을 방지할 수 있다.
도 3에서는 설명하지 않았지만, 세포 분리 영역(222)에서는 유로(240)와 유로(204')가 합류한다. 따라서, 도 3에 도시하는 특성이, 약간 유로(204')가 유입되는 측으로 넓어지는 경향을 나타내지만, 유로(240)와 유로(204')를 유하하는 완충액은 각각의 흐름의 층을 실질적으로 유지하기 때문에, 그다지 큰 변화는 없다.
여기서, 도 1에서는, 유로(204, 204', 205 및 205')는, 각각의 전체 길이에서 폭은 동일한 것으로 했지만, 유로의 저항을 낮추고 싶을 때에는, 리저버(203)에 가까운 부분은 폭을 넓혀도 된다. 또한, 세포 분포를 적절하게 하기 위해 유로 폭을 소정의 폭으로 하는 길이는, 예를 들면, 1OOμm 정도 있으면 되기 때문에, 유로의 저항을 고려하여 폭이 넓은 범위를 길게 해도 된다. 예를 들면, 세포를 포함하지 않는 완충액이 흐르는 측류를 형성하는 유로(205)의 유로 폭을, 세포를 포함하는 완충액이 흐르는 유로(204)의 유로 폭에 비하여 넓게 하고, 또한, 소정의 유로 폭으로 하는 길이도 짧게 하면, 측류의 유로(205)의 유로 저항은 유로(204)에 비하여 작아진다. 그 결과, 합류 후의 유로(240)의, 유로(204)로부터의 액류 폭을 좁히는 작용이 얻어진다. 즉, 도 3의 세포 분포 곡선이, 보다 첨예한 것으로 된다.
도 4의 (A), (B)는 유로의 폭을 넓게 하는 것에 수반하는 문제와, 그 해결안의 예를 나타내는 단면도이다. 도면에 있어서, (101)은 기판을 나타내고, (260)은 기판에 형성된 홈, (410)은 홈(260)을 피복하는 라미네이트 필름이다. (205)는 유로로서, 홈(260)과 이것을 피복하는 라미네이트 필름(410)에 의해 형성된다. 도 4의 (A)에 도시하는 바와 같이, 유로의 폭을 넓게 하면, 유로(205)의 폭이 넓은 부분에서, 기판(101)에 라미네이트 필름을 압착할 때에 라미네이트 필름(410)이 홈(260)에 떨어져, 유로(205)를 막아 버리는 일이 발생한다. 이에 대하여, 도 4의 (B)에서는, 홈(260)의 폭이 넓은 부분에 들보(400)를 형성한 것이다. 들보(400)를 형성함으로써, 라미네이트 필름이 홈(260)에 떨어져 유로(205)를 막는 것을 방지할 수 있다.
도 5는, 도 4에서 설명한 리저버(203)와 개구(201, 201') 및 유로(204, 204')의 부분을 보다 상세하게 설명하기 위해, 도 1의 A-A 위치에 있어서, 화살표 방향으로 본 단면도이다. 칩 기판(101)의 하면에는 마이크로 유로(204, 204')에 대응하는 홈이 형성되어 있고, 라미네이트 필름(410)에 의해 피복되어, 마이크로 유로(204, 204')가 형성되어 있다. 마이크로 유로에 세포를 포함하는 시료 완충액을 도입하는 구멍(201)이 마이크로 유로(204)의 최상류단에 뚫리고, 세포를 포함하지 않는 완충액을 도입하는 구멍(201')이 마이크로 유로(204')의 최상류단에 뚫려 있다. 구멍(201)을 둘러싸도록, 구멍(201)에 주입된 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위해서 벽 또는 리저버(250)가 형성되어 있다. 구멍(201') 및 구멍(201)에 주입된 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위해서 벽 또는 리저버(250), 그리고, 도 5에는 도시되지 않는 구멍(202, 202')도 리저버(203) 내에 형성된다. 리저버(203) 내에 완충액(200)이 채워져 있고, 모든 구멍에 완충 액(200)이 공급되기 때문에, 마이크로 유로(204, 204')를 흐르는 완충액의 유량을, 실질적으로 동량으로 할 수 있다. 또한, 마이크로 유로(205, 205')를 흐르는 완충액의 유량을, 실질적으로 동량으로 할 수 있다. 또한, 마이크로 유로(204)와 마이크로 유로(205)를 흐르는 완충액의 유량을 소정비로 안정적으로 유지할 수 있다. 또한, 구멍(201)을 유발 형상으로 한 것은, 시료 세포가 유로(204)에 확실하게 유입되도록 하기 위해서이다. 또한, 벽(250)은 도 1에 도시하는 바와 같이 리저버(203) 중에 배치하는 높이가 낮은 소형의 리저버 모양의 것이라도 되고, 단지 칸막이 판과 같은 구조라도 된다. 또한, (231)은 멤브레인 필터로서, 구멍(201)의 상면에 형성되고, 시료에 포함되는 먼지를 제거한다. 벽(250)을 형성함으로써, 세포의 분산을 방지할 수 있기 때문에, 구멍(201)에 직접 세포를 포함하는 시료 완충액을 주입하지 않아도 된다.
각 유로의 최상류단에 공통의 리저버를 형성하는 구조는 본 발명의 중핵의 하나를 이루는 것으로, 공통의 액면을 갖는 구조로 함으로써 복수의 유로에 동일한 압력으로 완충액을 보낼 수 있는 구조로, 기판 상에 형성할 수 있는 가장 간단한 구조의 송액계이다. 또한, 각 유로의 송액물을 구별하기 위해, 액면보다 높이가 낮은 칸막이 판으로 구획함으로써 여러 가지 완충액을 서로 다른 유로에 동일한 압력으로 흘릴 수 있다. 각 칸막이 판으로 구획된 완충액에는 공통의 액면을 형성하는 완충액에 비하여 비중이 높은 것을 이용하면, 기본적으로 서로가 섞이는 일은 없다. 또한, 세포의 경우는 그 자체가 비중이 높아, 용기 저면에 가라앉기 때문에 기본적으로는 문제없다. 주화성의 세포에서는 칸막이 판을 타고 넘을 수 없는 높 이로 하면 된다. 예를 들면, 신경 세포 등에서는, 수십 μm나 되면 벽(칸막이 판)을 타고 넘을 수 없고, 대장균과 같은 세포에서는, 벽(250) 위에, 완충액은 자유롭게 빠져나갈 수 있지만 세포는 통과할 수 없는 스폰지 형상의 막을 형성함으로써 세포가 다른 유로로 들어가는 것을 방지하는 것이 좋다.
(실시예2)
겔 전극에 대하여 구체적으로 설명한다. 겔 전극부는, 도 1에 도시하는, 구멍(206, 206' 및 207, 207'), 구멍(206과 206')을 연결하는 마이크로 구조(208), 구멍(207, 207')을 연결하는 마이크로 구조(209)와 세포 분리 영역(222)에 있어서의 액락(液絡) 구조의 연결부(241, 242)의 것을 말한다. 사출 성형으로 칩을 작성한 단계에서는, 겔 전극부에는 겔은 포함되어 있지 않다. 여기서는 전해질을 포함하는 아가로스겔을 전해액으로서 사용하는 케이스에 대하여 설명한다. 겔의 조성은 마이너스극측의 (209, 242)에 작성하는 것이 0.25M NaCl, 0.296M 인산나트륨(PH 6.0) 완충액, 플러스 전극측의 (208, 241)에 작성하는 것이 0.25M NaCl, 0.282M 인산나트륨(PH 8.0)의 조성을 포함하는 1% 아가로스이다. pH가 다른 것은 전류를 흘렸을 때에 전기 분해에 의해 기포가 발생하는 현상을 방지하기 위해서이다. 플러스극측에서 발생하는 수소 이온은 수소 분자로 되기 전에 높은 pH의 완충액으로 중화되고, 마이너스극측에서 발생하는 히드록시 이온은 낮은 pH의 완충액으로 중화되어 산소 분자의 생성을 저해한다.
또한, 상기 겔 전극은 당류를 포함하는 겔 상태 물질로 이루어지는 것으로 하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 당류는 3% ∼ 50%의 비 환원성 이당, 1% ∼ 50%의 트레할로스, 5% ∼ 30%의 농도의 글리세롤, 5% ∼ 40%의 농도의 에틸렌글리콜, 혹은, 5% ∼ 30%의 농도의 디메틸설폭시드를 포함하는 것으로 하는 것이 바람직하다.
다음으로, 사출 성형으로 칩을 작성하고, 구멍(206 및 207)으로부터 겔을 주입하여, 겔 전극을 갖는 셀 소터 칩을 완성한 후 칩을 사용하지 않고 방치한 상태를 고려한다. 겔은 구멍(206과 206', 207와 207')의 개방부 및 세포 분리 영역(222)에 있어서의 유로와 액락 구조의 연결부(241, 242)의 부분에서 대기와 접하고 있기 때문에, 여기에서부터 건조가 시작된다. 이 때문에, 작성한 겔 전극을 갖는 셀 소터 칩을 보존하기 위해서는 하기와 같은 연구가 필요하다. 우선, 구멍(206과 206', 207와 207')의 개방부로부터의 건조 방지는 사용 직전까지 개구부에 시일(seal)을 붙임으로써 방지할 수 있다. 세포 분리 영역(222)에 있어서의 유로와 액락 구조의 연결부(241, 242)의 부분에서는, 겔이 마르지 않도록 물을 함유하는 시트와 함께 밀폐 용기 중에서 보존함으로써, 4℃에서 3개월 정도의 보존을 용이하게 할 수 있다. 밀폐 용기로서는 공기 부분을 되도록 적게 하기 위해서 라미네이트 백이 적합하다.
또한, 건조를 방지하여 장기 보존을 가능하게 하기 위해서, 겔에는 보온제를 첨가한다. 보온제로서는 예를 들면 1%∼10% 정도의 트레할로스나 수크로오스 등의 2당류 혹은 올리고당, 5%∼10% 정도의 글리세린을 첨가함으로써 건조 방지에 효과가 있다.
또한, 장기 보존에는 겔 전극을 갖는 셀 소터 칩을 라미네이트 백에 넣은 채 로 동결 보존하는 것이 바람직하다. 이 때에 문제로 되는 것이, 동결 시간과 융해 시에 빙정이 생겨 겔 구조를 파괴하는 현상이다. 셀 소터 칩과 같이 미소한 영역에 작성하는 겔 전극에서 빙정이 생기면, 융해 후에 그 부분이 공동으로 된다. 공동이 생기면, 전극에 전계를 인가했을 때에, 공동에 세포가 들어가거나, 혹은, 들어간 세포가 불필요할 때에 셀 소터의 유로로 유출되거나 하는 문제가 발생한다.
이것을 방지하기 위해서는, 겔 전극부의 겔에 얼음의 결정 성장을 억제하는 물질을 첨가하고, 셀 소터 칩을 동결 상태에서 장기 보존을 가능하게 하는 것이 본 발명의 가장 중요한 점이다. 결정 성장을 억제하는 물질로서는 상기 보온 재료와 마찬가지의 것을 이용할 수 있다. 겔 작성 시에 트레할로스나 수크로오스 등의 2당류나 올리고당 등을 섞어 넣는 것이 가장 유효하다. 이 중 트레할로스는 일반적인 동물 세포에 대한 펑션은 작아 매우 유효하다. 농도는 1%로 좋다. 상한 농도는 50% 정도이다. 수크로오스라도 효과가 높지만, 동물 세포에 대해서는 바이오 펑션인 것이 고려되고, 목적에 따라서는 부적절한 케이스가 있다. 당쇄의 수산기의 일부를 황산기로 치환함으로써, 동결 방지능을 유지하여 생화학적인 영향을 저감할 수 있기 때문에, 이들 2당류의 수산기에 황산기를 도입하여 이용하면 된다. 이 이외에 글리세린이나 에틸렌글리콜과 같은 당도 효력이 있다. 혹은 디메틸설폭시드도 효과가 있지만, 에틸렌글리콜이나 디메틸설폭시드는 세포 독성이 문제로 되는 케이스가 있는 것을 고려하지 않으면 안 되지만, 일반적으로는 셀 소팅 유로로 용출하는 디메틸설폭시드 등은 미량이므로 무시할 수 있다.
구체적인 실시예를 나타낸다. 하기 조성의 캐소드 전해액과 애노드 전해액 을 전자 레인지로 과열 융해하여 완충 액화시킨다. 별도 기판(101)을 60℃로 가열하고 있는 핫 플레이트에 실어 가온한다. 완충액 상태로 되어 있는 캐소드 전해액과 애노드 전해액을 실린지로 구멍(206, 207)에 주입하고, 구멍(206'와 207')으로부터 흡인하여, 마이크로 구조(208, 209)와 연결부(241과 242)를 채운다. 연결부(241와 242)에는 모관 현상으로 융해한 겔이 들어간다. 실온에서 10분간 방치함으로써, 마이크로 구조(208, 209)와 연결부(222와 242) 내의 완충액이 겔화한다. 유로(247)는 연결부(241와 242)에 비하여 단면적이 넓기 때문에, 겔 완충액이 들어가는 일은 없다.
개선된 겔 조성을 나타낸다.
마이너스 전극액: 1% 트레할로스, 0.25M NaCl, 0.296M 인산나트륨(PH 6.0), 1% 아가로스,
플러스 전극액: 1% 트레할로스, 0.25M NaCl, 0.282M 인산나트륨(PH 8.0), 1% 아가로스,
상기한 바와 같이 조제한 겔 전극을 갖는 셀 소터 칩의 표면을 점착성 테이프로 실링한다. 다공질 플라스틱 타올인 플라세무에 물을 담그고, 물기를 뺀 2cm각의 단편을 겔 전극을 갖는 셀 소터 칩과 함께 30mm×40mm의 플라스틱 백에 넣고 실러를 이용하여 백의 입구를 막는다.
이 상태에서 4℃ 혹은 -20℃에서 보존한다.
작성 직후의 동결 전의 칩, 1개월 후, 3개월 후, 6개월 후의 4℃ 및 -20℃ 보존의 칩의 전극부의 상태를, 현미경을 이용하여 관찰한다. 또한, 리저버(203)에 배양액을 첨가하고, 유로(204와 205, 205')에 배양액을 채우고, 구멍(201)에 적혈구를 첨가하여, 겔 전극에 전해를 걸거나, 차단하거나 하여 세포가 유로(218, 219)로 분류되는 것을 확인한다. 우선, 작성 직후의 칩에서는 마이크로 구조(208, 209)와 연결부(241과 242)에 겔이 채워져 있어, 크랙이 생기거나, 마르거나 하는 외적 데미지는 없다. 겔 전극에 전계를 걸면 세포 분리 영역(222)의 유로를 흐르고 있는 적혈구가 유로(219)로 이동하여, 구멍(212)을 통하여 리저버(212')에 축적된다. 전계를 걸지 않으면 리저버(211')에 축적된다. 동결한 것은 6개월 후에 있어서도 작성 직후와 마찬가지로 겔 전극에 전계를 거는 것에 의해 리저버(212)에, 전계를 차단하는 것에 의해 리저버(211)에 세포를 모을 수 있다. 4℃ 보존에 관해서는 현미경 관찰하면 3개월째에 연결부(108과 109)에 겔의 후퇴가 보이지만, 실제로 세포를 흘려 보면, 작성 직후와 마찬가지로 분리할 수 있다.
도 6은, 겔 전극 부분이 다른 구조로 된 셀 소터 칩을 평면도의 형태로 도시하는 도면이다. 여기서는, 도 1의 배선(106 및 107)과 전해질을 포함하는 겔을 도입하는 구멍에 삽입한 전극을, 기판(101)의 하면에 접착하는 라미네이트 필름(410)에 증착한 도전막에 의해 실현하는 것이다. 라미네이트 필름(410)은, 기판(101)의 하면에 접착되는 것이기 때문에, 도전막에 형성한 전극 등은, 칩의 평면도에서는 보이지 않지만, 여기서는, 다른 구성 요소와의 관계를 알기 쉽도록, 중첩해서 표시했다.
도 6의 구조에서는, 도 1에 도시한 마이크로 구조(208, 209) 대신에, 오각형 형상의 마이크로 구조(208, 209)로 했다. 오각형 형상의 마이크로 구조(208, 209) 에는, 기판(101)에 형성된 개구(206, 207)가 연통하고 있어, 이 개구를 통해서 겔이 주입된다. (206', 207')는 마이크로 구조(208, 209)에 연통하고 있는 공기 배출 개구이다. 겔 주입 시에, 공기 배출 개구(206', 207')로부터 겔이 넘치는 상태로 되면, 겔 주입은 종료로 하면 된다. 오각형 형상의 마이크로 구조(208, 209)의 돌출부에는, 연결부(241, 242)가 형성되어, 유로(247)를 흐르는 완충액과 겔이 접촉할 수 있게 된다. 오각형 형상의 마이크로 구조(208, 209)에 주입된 겔과 배선(106 및 107)을 대신하는 증착된 도전막(106 및 107)과의 충분한 전기적 접속을 얻기 위해서, 오각형 형상의 마이크로 구조(208, 209)에 주입된 겔이, 적당한 넓이로, 도전막(106 및 107)의 단부와 접촉하는 위치에, 도전막(106 및 107)은 증착된다. 도전막(106 및 107)의 다른 단부는, 전원(215)에 접속되기 위한 단자를 형성한다.
여기서, 라미네이트 필름(410)은, 기판(101)과 접합되기 때문에, 도전막(106 및 107)의 다른 단부의 단자는 기판에 숨겨져 버린다. 도시하지 않았지만, 이 단자와 접속되어, 기판(101)의 표면에서 전원(215)과 접속 가능하게 하기 위한 구조가 마련된다.
(실시예3)
도 1의 셀 소터 칩(100)을 이용하여 화상 인식에 의한 세포 인식과 분리의 알고리즘을 설명한다. 도 1을 참조하면서 설명한 바와 같이, 세포 현탁액은 구멍(201)에 주입된다. 구멍(201)의 주변에는 세포 현탁액의 확산을 방지하기 위한 벽(250)이 형성되어 있다. 벽(250)은, 리저버(203) 중에 만들어지고, 구멍(201)의 액면은, 리저버(203)의 액면과 동일한 상태로 되어 있다. 세포는 구멍(201)으로부터 유로(204)로 흘러, 측류를 형성하는 유로(205)와 세포 검출 영역(221) 앞에서 합류한다. 이에 의해, 세포가 유로의 중심부로 치우친 상태를 만들 수 있다(도 3).
유로(204)의 세포 검출 영역(221)을 통과하는 세포를, CCD 카메라로 촬상한다. CCD 카메라는, 예를 들면, 매초 200 프레임으로 화상을 취득하는 능력이 있는 것을 사용한다. 이 촬영 능력이 있으면, 세포 검출 영역(221)의 유로를 유하하는 완충액의 유속이 1mm/sec 정도이더라도, 세포 단위로 인식할 수 있다.
도 7은, CCD 카메라로 취득된 화상으로부터 세포를 인식하고, 각각의 세포를 넘버링하여 식별하는 알고리즘을 설명하는 도면이다. 도 7에서는, 차례차례 취득되는 화상을 프레임1, 2, …, N으로서, 각각의 프레임에 나타나고 있는 세포를 표시하고 있다. 프레임1에는 검은색 동그라미로 나타내는 세포만이 나타나 있다. 이 검은색 동그라미로 나타내는 세포를 화상 인식함과 함께 No.421로 넘버링한다. 다음의 프레임2에서는, (421) 세포 외에 흰색 동그라미로 나타내는 세포와 별표로 나타내는 세포가 나타나 있다. 여기서, 흰색 동그라미로 나타내는 세포와 별표로 나타내는 세포는, 동시에, 프레임2에 최초로 나타나 있다. 이들의 세포를 화상 인식함과 함께, 하류측에서 최초로 검출되는 세포에 빠른 번호(숫자가 적은 번호)를 붙인다. 여기서는 흰색 동그라미로 나타내는 세포 쪽이 별표로 나타내는 세포에 비하여 하류에 출현하고 있기 때문에, 흰색 동그라미로 나타내는 세포에 No.422, 별표로 나타내는 세포에 No.423으로 넘버링한다. 다음의 프레임3에서는, 새로운 세포가 인식되어 있지 않다. 프레임2와 프레임3을 비교하면, (422) 세포는, 세포(421) 및 (423) 세포보다 이동 속도가 빠른 것을 알 수 있다. 다음의 프레임4에서도, 새로운 세포가 인식되어 있지 않다. (422) 세포는 이동 속도가 빠르기 때문에 프레임4에서는, 간신히 나타나 있는 상태이다. 한편, 세포(421) 및 (423) 세포는, 거의 동일한 속도로 이동하고 있는 것을 알 수 있다. 프레임8까지 인식할 수 있다. 여기서, 세포의 화상의 인식은, 지표로서, 각 세포의 휘도 중심, 면적, 주위 길이, 긴 직경, 짧은 직경에 주목한다.
이와 같이 하여, 화상 인식되고, 넘버링된 세포의 이동 속도로부터, 각각의 세포가 세포 분리 영역(222)(엄밀하게는, 연결부(241, 242))에 도달하는 시간을 산출하고, 연결부(241)의 겔 전극에 마이너스, 연결부(242)의 전극에 플러스의 전계를 걸거나, 혹은, 전계를 걸지 않고, 세포를 회수용 구멍(211)과 구멍(212)으로 분류한다. 즉, 소정 시간마다 취득되는 상기 화상으로부터 넘버링된 세포의 이동 속도(V)를 계산하고, 세포 이동 속도(V)에 대하여 미리 입력한 거리(L), 인가 시간(T)에 의해서, 인가 타이밍을 (L/V)부터 (L/V+T)까지로 해서 세포를 분류한다.
(실시예4)
실시예4에서는, 장기 조직을 그 표면으로부터 순차적으로 세포를 유리시켜, 세포층마다 대략적으로 세포를 분리하는 전처리부와, 세포 분리 영역을 일체화한 칩형 디바이스와 그것을 이용하는 세포 분리의 구체예를 설명한다. 여기서는, 내시경으로 채취한 대장 폴립(직경 3mm 정도)을 샘플로 해서 셀 소팅에 의해 평균적인 세포보다 큰 세포를 분리한다.
도 8은, 실시예4의 칩의 평면도, 도 9는, 도 8의 B-B 위치에서 화살표 방향으로 본 단면도이다. (101)은 기판으로서, 기판 하면에는 유로(503)가 형성되고, 유로(503)의 양단에 개구를 통해서 기판 상면에 형성한 리저버(512) 및 리저버(506)와 연통되어 있다. 유로(503)는 기판 하면에 홈을 판 형태로 형성되고, 기판 하면에는, 도 4, 도 5에서 설명한 바와 같이, 라미네이트 필름(410)이 접착되어 있다. 유로(503)의 양단의 리저버(512, 506)는 개구를 뚫은 후에 기판 상면에 접착하는 형태로 작성된다. 또한, 유로(503)의 도중에는, 필터(504)가 형성되어 있다. 필터(504)는 다수의 필러(505)가 배열된 구조를 하고 있다.
기판(101)의 하면에는, 기판(101)은, 리저버(512)의 하면에 대응하는 위치에 온도 조절 장치(520)가, 유로(503)의 하면에 대응하는 위치에 온도 조절 장치(521)가 각각 형성된 기판(102) 상에 탑재된다. 각각의 온도 조절 장치(520, 521)는, 리저버(512), 유로(503)를 소정의 다른 온도로 유지하고 있다. 각각의 온도 조절 장치(520, 521) 사이에는 단열을 위해 슬릿(501)이 형성되어 있다. 슬릿은 단순한 컷팅으로 공기의 층으로 되어 있어도 되고, 단열성 물질로 되어 있어도 된다.
사용에 앞서서, 리저버(512)에 소정량의 완충액을 넣고 유로(503)를 완충액으로 채운다. 또한, 리저버(507)에는 트립신 활성을 저해하기 위한 트립신 인히비터를 포함하는 완충액을 넣는다. 다음으로, 리저버(512)에 시료인 조직 단편(510)을 넣고, 리저버(512) 내의 완충액에 피펫(522)을 이용하여, 소정의 양의 트립신을 포함하는 액을 첨가한다. 조직편 표면의 세포 매트릭스가 트립신에 의해서 분해되고, 세포(511)가 조직 단편(510)의 표면으로부터 순차적으로 유리된다. 온도 조절 장치(520)는, 이 처리가 효율적으로 행해지도록, 리저버(512)를 소정의 온도로 유지한다. 조직 단편(510)의 표면으로부터 유리된 세포(511)는, 리저버(512와 506)의 액면 차에 의한 완충액의 이동에 따라서 유로(503)로 유도된다. 유로(503)에 형성된 필터(504)로, 충분히 분산하고 있지 않은 세포 덩어리나 구조물을 제거하고, 분산한 세포를 리저버(506)로 유도한다. 온도 조절 장치(521)는, 유로(503)를 세포(511)가 이동할 때, 트립신에 의한 지나친 분해를 방지하기 위해서, 유로(503)를 소정의 온도로 유지한다.
필터(504)와 리저버(506)를 연결하는 유로에는 리저버(507)에 연결되는 유로가 접속되고, 리저버(507)에는 트립신 인히비터를 포함하는 완충액이 넣어져 있기 때문에, 필터(504)를 통과한 세포(511)에는, 트립신 인히비터가 작용한다. 그 때문에, 세포(511)는 트립신의 영향으로부터 개방되어 안정된 상태로 리저버(506)에 도달한다. 리저버(506)에 도달한 세포(511)는 피펫(521)에서 순차적으로 회수할 수 있다. 회수한 분산 세포를 실시예1에서 설명한 도 1에 기재된 셀 소터 칩(100)을 이용하여 거대 세포를 분리한다. 어떤 샘플에서는, 분리할 수 있는 거대 세포의 80%는 암화되어 있는 것이 판명된다. 또한, 리저버(507)는 하나라도 된다.
도 8, 도 9를 참조하여 설명한 칩(500)은, 시료인 조직편으로부터 경시적으로 박리되어 오는 분산 세포를 순차적으로 분리하는 소터의 역할을 담당하고 있다고 할 수 있지만, 실시예1에서 설명한 도 1에 기재된 셀 소터 칩(100)의 시료 세포를 얻기 위한 전처리 칩으로 볼 수 있다.
도 10은 셀 소터 칩의 시료 세포를 얻기 위한 전처리 칩으로서 사용하는 것 에 주목한 칩의 실시예를 도시하는 평면도이다. 도 8과 대비하여 명확한 바와 같이, 리저버(512) 내에서 시료인 조직편으로부터, 세포가 트립신 소화되고, 조직 표면으로부터 분산 세포가 유로(503)에 유입되고, 필터(504)를 통해서 유하하고, 리저버(507)로부터 트립신 인히비터를 포함하는 완충액을 공급받는 것은, 도 8에서 설명한 칩과 동일하다
도 10에 도시하는 칩에서는, 유로(503)의 최하류부(503')에서 유로의 선단이 분기하고 있다. 또한, 분기하고 있는 각 유로의 말단은 폐쇄된 리저버(506-1∼506-4)에 연결되어 있다. 도 9를 참조하여 명확한 바와 같이, 리저버(506)는 상면이 개방되어 있다. 이에 대하여, 폐쇄된 리저버는, 리저버 상면이 시일로 피복된 구조를 하고 있어, 이대로는 유로로부터 액이 유입될 수 없는 구조로 되어 있다. 그 때문에, 리저버 상면의 시일에 핀으로 구멍을 뚫으면, 구멍이 뚫린 리저버에만 유로로부터 액이 유입되게 된다. 따라서, 1개의 리저버에 소정 시간 세포를 포함하는 완충액을 회수한 후, 구멍을 점착 테이프로 막고, 다음의 리저버의 시일에 구멍을 뚫어 세포를 포함하는 완충액을 회수한다고 하는 조작을 계속하면, 시계열적으로 분류한 세포를 수집할 수 있다. 다만, 처음부터 모든 리저버를 시일로 폐쇄하면, 최초로 완충액을 넣어 유로를 완충액으로 채우는 조작을 할 수 없다. 따라서, 1개의 리저버만은 개방해 두는 것이 필요하다.
도 10에서는, 리저버(506-1)의 상면 시일에 구멍(530-1)을 뚫어 세포를 포함하는 완충액을 회수하여 점착 테이프(531)로 구멍을 막는 조작을 한 후, 리저버(506-2)의 상면 시일에 구멍(530-2)을 뚫어 세포를 포함하는 완충액을 회수하고 있는 상태를 도시한다. 상면 시일의 구멍이 폐쇄되었을 때에 분기 유로에 남아 있는 세포는, 그대로 분기 유로에 남는다.
(실시예5)
실시예5에서는, 실시예4의 전처리 칩과 실시예1에 기재된 셀 소터 칩을 일체화한 칩을 이용함으로써, 조직편을 트립신 처리하고, 조직편으로부터 순차적으로 세포를 분리함과 함께, 순차적으로 분산해 오는 세포 중 특정한 세포군만을 회수하는 것을 가능하게 한 셀 소터에 관한 것이다.
도 11은, 실시예5의 셀 소터를 모식적으로 도시하는 평면도이다. 도 12의 (A), (B) 및 (C)는, 도 11의 C-C, D-D 및 E-E 위치에서 화살표 방향으로 본 단면도이다. 도 11, 도 12에 있어서, 전술한 실시예에서 설명한 바와 같은 것, 또는, 동등한 기능을 하는 것에는 동일한 참조 부호를 붙였다.
(600)은 실시예5의 셀 소터이다. 기판(101) 상에는, 트립신 처리부(610)와 셀 소트부(650)가 구축되고, 캐스케이드로 접속되어 있다. 리저버(601)는 (602, 603, 604)의 3가지 방으로 구획되어 있다. 각 방 사이의 칸막이(605)의 구조를 도 12의 (A)에 도시한다. 여기서는 방(602)과 (603)의 관계로 설명한다. 방(602)과 (603)의 칸막이(605)는, 칸막이 판(6051, 6052 및 6053)으로 구성되어 있다. 각 칸막이 판(6051, 6052, 6053)은 본 실시예에서는 100μm의 간격으로 배치되고, 칸막이 판(6051과 6053)은 방(603)의 저면 사이에 100μm의 갭을 갖게 하고 있다. 따라서, 방(602)과 방(603)은 100μm 폭의 공간에서 연통한 것으로 되어 있다. 방(603과 604)의 칸막이(605)도 마찬가지이다. 3가지 방의 전체에 완충액을 넣는다. 이 때, 액면이 칸막이 판(6052)의 상면보다 높은 위치이고, (6051, 6053)의 상면보다 낮은 위치인 것이 중요하다. 액면의 높이는 12 ∼ 15mm이다.
방(602)에는, 리저버(512)가 구성되어 있다. 이것은, 도 8에서 설명한 리저버(512)와 동일하지만, 여기서는, 방(602)에 채워진 완충액의 액면보다 낮은 높이, 예를 들면, 10mm로 한다. 리저버(512) 내에 조직편과 트립신 용액을 리저버(512)의 체적의 절반까지 첨가한다. 트립신 용액은 글리세린으로 1.04의 비중을 두고 있다. 이것으로 침강하지 않는 조직편의 경우는, 비중을 완충액과 동일하게 하여 벽(611)의 상면에 두께 10μm 정도의 필터를 올려 놓는다. 이에 의해, 리저버(512) 내에 존재하는 세포나 트립신이 방(602) 내로 리크되는 것을 방지한다. 그래도 방(602) 내로 리크되는 트립신은 방(603)으로 이행하는 것을 방지할 필요가 있다. 칸막이 판(605)는 이 때문에 형성되어 있다.
셀 소터(600)는, 도 9에서 설명한 것과 마찬가지의 온도 조절 장치(520, 521)가 형성되어 있는 기판에 탑재되어 사용되지만, 도면에서는, 온도 조절 장치(520, 521)가 형성되어 있는 기판의 표시는 생략한다. 리저버(512)의 하면에는, 유로(503)와 연통하는 개구가 있고, 도 8에서 설명한 바와 같이, 필터(504)에 연결되어 있다. 필터(504)의 하류에서, 리저버(507)와 연통하는 유로(623, 624)가 합류하여, 도 8에서 설명한 바와 같이, 리저버(507)에 넣어져 있는 트립신 인히비터를 포함하는 완충액이 공급된다. 따라서, 필터(504)를 통과한 세포에는, 트립신 인히비터가 작용하여, 세포는 트립신의 영향으로부터 개방된다. 여기서는, 리저버(507)는, 방(602)과 마찬가지로, 방(603)과 칸막이 판(605)으로 구획된 방(604) 내에 형성된다. 도 12의 (B)에 방(604)과 리저버(507)의 부분을 단면도로 도시한다. 방(604)은, 칸막이 판(605)으로 구획되어 있기 때문에, 방(602)과 마찬가지로, 완충액의 액면 높이는, 방(602)과 동일하다. 또한, 리저버(507)는, 리저버(512)와 동일한 높이로 되고, 리저버(512)의 완충액의 비중과 동일한 비중의 완충액이 넣어진다. 따라서, 트립신 인히비터를 포함하는 완충액은, 필터(504)의 하류에서, 유로(503)를 유하해 온 세포를 포함하는 완충액에 합류하여, 세포를 트립신의 영향으로부터 개방한다. 합류한 완충액은, 유로(204)를 유하한다. 또한, 리저버(507)의 하면에는, 도 9에서 설명한 바와 같이, 온도 조절 장치(521)가 형성되어 있다. 또한, 리저버(507)의 상면에는, 리저버(512)와 마찬가지로, 필요에 따라서, 필터(606)가 형성된다.
방(602) 및 방(604)은 조직편을 트립신 처리하고, 조직편으로부터 순차적으로 세포를 분리하는 트립신 처리부(610)를 구성함과 함께, 셀 소트부(650)에 세포를 공급하는 기능을 한다.
한편, 방(603)에는, 도 12의 (A)에 도시하는 바와 같이, 구멍(201')이 형성되고, 이것에 연통하는 유로(204')가 개구되어 있다. 또한, 방(603)의 방(604)보다 하류측에, 구멍(202, 202')이 뚫리고, 이것에, 유로(205, 205')가 연통하고 있다. 이들의 구멍을 통하여, 완충액이 유로에 공급된다. 유로(204)로부터 공급되는 세포를 포함하는 완충액, 유로(204', 205, 205')로부터 공급되는 완충액에 대하 여 구성되는 시스템은, 도 6에서 설명한 셀 소터와 동일하며, 셀 소트부(650)를 구성한다.
유로(218, 219)에 얻어지는 세포를 포함하는 완충액은, 리저버(211, 212)에서 회수되지만, 도 12의 (C)에 리저버(211, 212)를 포괄하는 리저버(663)에 대하여, E-E 위치에서 화살표 방향으로 본 단면도로 나타낸다. 리저버(663)의 완충액의 액면은, 방(602-604)의 액면보다 낮게 되고, 이것이, 유로를 완충액이 유하할 때의 에너지로 된다.
도 12의 (A)~(C)에 도시한 바와 같이, 기판(101)의 하면은, 라미네이트 필름(410)으로 피복되고, 기판(101)에 파진 홈을 유로로 해서 폐쇄된 것으로 한다. 또한, 도 6에서 설명한 것과 마찬가지로, 배선(106 및 107)과 전해질을 포함하는 겔을 도입하는 구멍에 삽입한 전극을 라미네이트 필름으로 증착한 도전막에 의해 실현할 수도 있다. 이 경우에는, 도 6에서 설명한 것과 마찬가지로, 라미네이트 필름(410)은, 기판(101)의 하면에 접착되는 것이기 때문에, 도전막에 형성한 전극 등은, 칩의 평면도에서는 보이지 않지만, 여기서는, 다른 구성 요소와의 관계를 알기 쉽도록, 중첩해서 표시했다. 또한, 도전막(106 및 107)의 전원(215)에 접속되기 위한 단자를 형성하는 단부가, 기판(101)의 표면에서 전원(215)과 접속 가능하게 하기 위한 구조가 마련된다.
(실시예6)
실시예6는, 실시예1의 시료 세포의 도입에 고안를 실시한 것이다. 도 13은 실시예6의 세포 분리 장치(셀 소터)의 시스템 구성의 일례를 모식적으로 도시하는 평면도이고, 도 14의 (A), (B) 및 (C)는, 실시예6의 시료 세포의 도입부에 있어서의 고안을 설명하기 위한 부분적인 단면도이다. 실시예1과 동일한 참조 부호를 붙인 것은 동일한 것 또는 동일한 기능을 하는 것이다.
도 13과 도 1을 대비하여 명확한 바와 같이, 실시예6의 셀 소터는, 실시예1의 유로(204)를 보다 상류부까지 연장하고, 개구(290)를 형성하여, 완충액을 도입하도록 한 점에 있어서 실시예1의 셀 소터와 다를 뿐이고, 이후는 동일하다. 도 14의 (A)로부터 알 수 있는 바와 같이, 유로(204)는 개구(201)를 통해서 리저버(250)에 연통할 뿐만 아니라, 보다 상류까지 연신되어 개구(290)와도 연통하고 있다.
도 14의 (B)에, 개구(201) 및 개구(290)로부터 유로(204)에 유입되는 완충액 및 세포를 모식적으로 도시한 바와 같이, 실시예6에 따르면, 개구(290)로부터 유로(204)에 유입되는 완충액의 층에 의해서, 개구(201)로부터 유로(204)에 유입되는 완충액 및 세포가 라미네이트 필름(410)과 접촉하는 것이 저지된다. 즉, 개구(201)로부터 유로(204)에 유입되는 완충액 및 세포는, 개구(290)로부터 유로(204)에 유입되는 완충액의 층 상을 흐르게 된다. 따라서, 세포가 라미네이트 필름(410)과 접촉하여, 그것이 원인으로 되는 체류를 방지할 수 있다.
도 14의 (C)는, 개구(201)로부터 유로(204)에 유입되는 세포가, 라미네이트 필름(410)과 접촉하여, 그것이 원인으로 되는 체류를 발생하고 있는 모습을 모식적으로 도시하는 것이다. 세포 중 하나가 라미네이트 필름(410)과 접촉하여, 거기에 고착하는 경우가 발생하면, 그것에 다른 세포가 걸리고, 차례차례 세포가 쌓여 버 려, 결국은, 세포의 유하가 정지해 버리게 된다.
실시예6의 설명을, 실시예1의 유로(204)를 보다 상류부까지 연장시킨 예로 설명했지만, 이것은, 실시예4, 5의 유로(503)에 대해서도 마찬가지로 할 수 있는 것은 분명하다. 즉, 세포를 도입하는 위치보다도 상류측에서 완충액을 도입하여, 완충액의 흐름의 층을 형성해 두고, 세포를 도입함으로써, 세포가 유로의 저면과 접촉하는 것을 방지하는 것이다.
본 발명에 의해, 안정된 세포 분리가 가능한 소모형의 세포 분리 칩을 실현할 수 있다.

Claims (9)

  1. 완충액 중에 장기 조직편을 유지하고, 상기 조직에 소정의 처리제를 작용시켜 상기 조직편을 구성하는 세포를 박리시키는 반응 용기, 상기 용기 저면으로부터 연장되어 상기 처리제를 포함하는 완충액과 함께 세포를 유하시키는 제1 유로, 상기 제1 유로를 유하하는 세포에 작용하여 상기 세포의 박리를 위한 처리제의 작용을 정지시키는 처리제를 포함하는 완충액을 상기 제1 유로에 합류시키는 제2 유로, 상기 제2 유로의 합류 위치보다 하류에 위치하고, 상기 제1 유로와 제2 유로가 합류한 제3 유로 내를 유하해오는 세포를 임의의 시간마다 채취하는 복수의 유로로 이루어지는 세포 분리 칩.
  2. 기판, 상기 기판 상에 구성되고, 완충액 중에 장기 조직편을 유지하고, 상기 조직에 소정의 처리제를 작용시켜 상기 조직편을 구성하는 세포를 박리시키는 반응 용기, 상기 용기 저면으로부터 연장되어 상기 처리제를 포함하는 완충액과 함께 세포를 유하시키는 제1 유로, 상기 제1 유로를 유하하는 세포에 작용하여 상기 세포의 박리를 위한 처리제의 작용을 정지시키는 처리제를 포함하는 완충액을 상기 제1 유로에 합류시키는 제2 유로, 상기 제2 유로의 합류 위치보다 하류에 위치하고, 상기 제1 유로와 제2 유로가 합류한 제3 유로 내를 유하해오는 세포를 인식하기 위한 세포 검출 영역, 상기 세포 검출 영역의 하류에 형성되고, 상기 세포 검출 영역에서 검출한 세포를 상기 세포 검출 영역에서의 세포의 인식 결과에 따라서 분류하는 세포 분리 영역, 상기 세포 분리 영역의 하류에 형성되고, 상기 세포 분리 영역에서 분류된 세포를 선택적으로 유하시키는 제4, 제5 유로를 구비하고, 상기 세포 분리 영역은, 세포 분리 영역을 구성하는 유로가 대향하는 측벽의 각각에 대향하는 2개의 겔 전극을 구비하고, 상기 세포 검출 영역에서 검출한 세포에 대응하여, 상기 세포 분리 영역에 있어서 2개의 겔 전극 사이에 소정의 전류를 흘린 경우와 흘리지 않는 경우에 따라서, 상기 제4, 제5 유로에 세포를 배분하는 세포 분리 칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 유로에 소정의 사이즈 이하의 세포만을 통과시키는 필러군에 의해 구성된 필터를 구비하는 세포 분리 칩.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 필러군이 유로 내의 단면 방향에 대하여 경사진 각도의 선상에 배열된 구조를 하고 있는 세포 분리 칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 반응 용기와 제1 유로 부위를 각각 상이한 온도로 유지하는 온도 조절기를 갖는 세포 분리 칩.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 제1 유로에 소정의 사이즈 이하의 세포만을 통과시키는 필러군에 의해 구성된 필터를 구비하는 세포 분리 칩.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 반응 용기와 제1 유로 부위를 각각 상이한 온도로 유지하는 온도 조절기를 갖는 세포 분리 칩.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 유로를, 상기 제1 유로보다 상류로 연장시켜 상기 공통의 액면 위치를 갖는 리저버와 연통시킨 세포 분리 칩.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 제1 유로를, 상기 제1 유로보다 상류로 연장시켜 상기 공통의 액면 위치를 갖는 리저버와 연통시킨 세포 분리 칩.
KR1020070006546A 2004-12-28 2007-01-22 세포 분리 칩 KR100742783B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2004-00379327 2004-12-28
JP2004379327A JP4601423B2 (ja) 2004-12-28 2004-12-28 細胞計測および分離チップ

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050129668A Division KR100804883B1 (ko) 2004-12-28 2005-12-26 세포 분리 칩

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070027662A true KR20070027662A (ko) 2007-03-09
KR100742783B1 KR100742783B1 (ko) 2007-07-25

Family

ID=36090848

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050129668A KR100804883B1 (ko) 2004-12-28 2005-12-26 세포 분리 칩
KR1020070006546A KR100742783B1 (ko) 2004-12-28 2007-01-22 세포 분리 칩

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050129668A KR100804883B1 (ko) 2004-12-28 2005-12-26 세포 분리 칩

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8361412B2 (ko)
EP (1) EP1677094B1 (ko)
JP (1) JP4601423B2 (ko)
KR (2) KR100804883B1 (ko)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120077206A1 (en) 2003-07-12 2012-03-29 Accelr8 Technology Corporation Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing
AU2004273783A1 (en) 2003-07-12 2005-03-31 Accelr8 Technology Corporation Sensitive and rapid biodetection
JP4921858B2 (ja) * 2006-06-07 2012-04-25 オリンパス株式会社 画像処理装置および画像処理プログラム
JP5170647B2 (ja) * 2008-02-05 2013-03-27 国立大学法人 東京医科歯科大学 微粒子画像計測装置
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
WO2011120024A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Quantalife, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
JP5382852B2 (ja) 2009-02-06 2014-01-08 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 使い捨てチップ型フローセルとそれを用いたフローサイトメーター
US8248604B2 (en) 2009-09-24 2012-08-21 On-Chip Biotechnologies Co., Ltd Flow cytometer and flow cell for the same
ITTO20100068U1 (it) * 2010-04-20 2011-10-21 Eltek Spa Dispositivi microfluidici e/o attrezzature per dispositivi microfluidici
JP5580117B2 (ja) * 2010-06-08 2014-08-27 公益財団法人神奈川科学技術アカデミー 細胞分析装置
JP5872776B2 (ja) * 2011-03-04 2016-03-01 株式会社生体分子計測研究所 細胞アッセイ用流路チップ及び検査装置
ES2551922T3 (es) 2011-03-07 2015-11-24 Accelerate Diagnostics, Inc. Sistemas rápidos de purificación celular
US10254204B2 (en) 2011-03-07 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Membrane-assisted purification
WO2012126478A1 (en) * 2011-03-21 2012-09-27 Motilitycount Aps Device for analysis of cellular motility
US10450545B2 (en) * 2011-09-14 2019-10-22 National Tsing Hua University Microfluidic chips for acquiring sperms with high motility, productions and applications thereof
JP5912034B2 (ja) * 2011-11-28 2016-04-27 公益財団法人神奈川科学技術アカデミー 液体還流型高速遺伝子増幅装置
JP6027321B2 (ja) * 2012-03-06 2016-11-16 公益財団法人神奈川科学技術アカデミー 高速遺伝子増幅検出装置
WO2013174862A1 (de) * 2012-05-24 2013-11-28 Leica Microsystems Cms Gmbh Probenfänger zum auffangen eines laser-mikrodissektats
JP2013250229A (ja) * 2012-06-04 2013-12-12 Sony Corp 微小粒子分取用マイクロチップ、該微小粒子分取用マイクロチップが搭載された微小粒子分取装置、並びに微小粒子の分取方法
US9423234B2 (en) 2012-11-05 2016-08-23 The Regents Of The University Of California Mechanical phenotyping of single cells: high throughput quantitative detection and sorting
US9677109B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Accelerate Diagnostics, Inc. Rapid determination of microbial growth and antimicrobial susceptibility
SG11201508880TA (en) * 2013-04-30 2015-11-27 Hewlett Packard Development Co Microfluidic sensing device and system
EP2848698A1 (en) * 2013-08-26 2015-03-18 F. Hoffmann-La Roche AG System and method for automated nucleic acid amplification
US10253355B2 (en) 2015-03-30 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
EP3278115A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
US10830685B2 (en) 2015-04-07 2020-11-10 National University Corporation Nagoya University Device for electrical measurement and electrical measurement apparatus
KR101573501B1 (ko) * 2015-04-09 2015-12-01 주식회사 페라메드 세포 분리칩 및 이를 이용한 세포 분리 방법
EP3289362B1 (en) 2015-04-30 2022-04-13 European Molecular Biology Laboratory Microfluidic droplet detection and sorting
KR101766450B1 (ko) 2015-04-30 2017-08-08 주식회사 싸이토젠 표적 세포 회수 방법
JP6714924B2 (ja) * 2015-11-30 2020-07-01 国立大学法人大阪大学 サンプル検出用デバイス、サンプル検出装置及びイオン電流の検出方法
US10913065B2 (en) 2016-01-22 2021-02-09 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Fluid sensing with control of particle aggregation in sensing zone
DE112016006830B4 (de) 2016-05-02 2024-02-22 Integriculture Inc. System zur intelligenten induktion, steuervorrichtung zur alterungsinduktion, verfahren zur steuerung der alterungsinduktion und programm zur steuerung von alterungsinduktion
JP6111510B1 (ja) 2016-05-02 2017-04-12 インテグリカルチャー株式会社 成長誘導システム、成長誘導制御装置、成長誘導制御方法、および、成長誘導制御プログラム
EP3469338A4 (en) * 2016-06-10 2020-01-15 The Regents of the University of California IMAGE-BASED CELL SORTING SYSTEMS AND METHODS
US11440004B2 (en) 2017-11-14 2022-09-13 Sony Corporation Microparticle sorting microchip and microparticle sorting apparatus
KR102019664B1 (ko) * 2018-04-18 2019-09-09 포항공과대학교 산학협력단 이동 속도 차이를 이용한 세포 구분 방법, 이를 수행하기 위한 장치
CN109251841B (zh) * 2018-08-21 2021-09-10 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种单细胞分选芯片及其制造方法以及单细胞分选方法
US11919000B2 (en) 2019-10-10 2024-03-05 1859, Inc. Methods and systems for microfluidic screening
CN114100706B (zh) * 2021-10-18 2022-08-19 吉林大学 一种基于粒子漂移的粒子分选方法及系统

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2749906B2 (ja) * 1989-10-04 1998-05-13 キヤノン株式会社 粒子測定装置
CA2123487A1 (en) * 1991-11-12 1993-05-27 Adrian S. Fox Adhesive hydrogels having extended use lives and process for the preparation of same
US5302348A (en) * 1992-12-10 1994-04-12 Itc Corporation Blood coagulation time test apparatus and method
JP2716361B2 (ja) * 1994-02-16 1998-02-18 株式会社アドバンス 生体用プリント電極
AU4113297A (en) * 1996-09-04 1998-03-26 Technical University Of Denmark A micro flow system for particle separation and analysis
US5869004A (en) * 1997-06-09 1999-02-09 Caliper Technologies Corp. Methods and apparatus for in situ concentration and/or dilution of materials in microfluidic systems
US7214298B2 (en) * 1997-09-23 2007-05-08 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter
WO1999061888A2 (en) 1998-05-22 1999-12-02 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter
JP4002720B2 (ja) * 2000-11-22 2007-11-07 独立行政法人科学技術振興機構 一細胞長期培養顕微観察装置
DE60221984T2 (de) * 2001-06-13 2008-05-15 Kenneth F. Los Gatos Uffenheimer Automatisches flüssigkeitsbehandlungssystem und -verfahren
JP4093740B2 (ja) * 2001-09-27 2008-06-04 独立行政法人科学技術振興機構 微粒子分別マイクロチップと微粒子分別装置
KR100473362B1 (ko) * 2001-10-17 2005-03-08 주식회사 디지탈바이오테크놀러지 미세 입자 분석 장치 및 방법
AU2003219836A1 (en) * 2002-02-27 2003-09-09 The Regents Of The University Of Michigan Process for sorting motile particles from lesser-motile particles and apparatus suitable therefor
JP3898103B2 (ja) * 2002-08-26 2007-03-28 独立行政法人科学技術振興機構 細胞分析分離装置
KR100700437B1 (ko) * 2003-05-19 2007-03-28 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 세포분리장치

Also Published As

Publication number Publication date
EP1677094A2 (en) 2006-07-05
KR20060076226A (ko) 2006-07-04
JP4601423B2 (ja) 2010-12-22
JP2006180810A (ja) 2006-07-13
US20060194307A1 (en) 2006-08-31
US8361412B2 (en) 2013-01-29
EP1677094B1 (en) 2019-03-27
EP1677094A3 (en) 2013-05-29
KR100804883B1 (ko) 2008-02-20
KR100742783B1 (ko) 2007-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100742783B1 (ko) 세포 분리 칩
JP4420900B2 (ja) 細胞分離装置
KR100746431B1 (ko) 셀 소터 칩
US20220187191A1 (en) Cell capture system and method of use
JP4145938B2 (ja) 細胞分離チップおよびこれを使用した細胞培養方法
Yun et al. Cell manipulation in microfluidics
ES2641524T3 (es) Microanálisis de la función celular
WO2010113994A1 (ja) 細胞濃縮分離装置
US20150132766A1 (en) Imaging cell sorter
CN107497503B (zh) 用于研究肿瘤单细胞侵袭和上皮间质转化的微流控芯片
KR20160040647A (ko) 플래너 패치 클램프 장치 및 플래너 패치 클램프 시스템
US9879308B2 (en) Apparatus for ex vivo microfluidic analysis of biologic samples
EP1621211A1 (en) Soft capsule film and soft capsule
JP4679847B2 (ja) 細胞の解析方法
Sugino et al. Integration in a multilayer microfluidic chip of 8 parallel cell sorters with flow control by sol–gel transition of thermoreversible gelation polymer
Cheng et al. An open-chamber flow-focusing device for focal stimulation of micropatterned cells
KR102240392B1 (ko) 자가 종양을 이용한 최적 항암제 선별 시스템 및 그 방법
Rehman Laser ablation assisted size-based sorting of pure water droplets inside a microfluidic chip and designing a microfluidic chip for studying sprouting angiogenesis
ES2904780T3 (es) Método y sistema para seleccionar, manipular y aislar células tumorales circulantes en líquidos corporales por transferencia asistida por láser
Anggraini et al. Single-Cell Cultivation Utilizing Microfluidic Systems
Hassanzadehbarforoushi Capillary-based microfluidic sample confinement for studying dynamic cell behaviour
Tallerico Fabrication and Characterization of a Microfluidic Device to Ultrapurify Blood Samples

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20100707

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee