KR20070018226A - 월동선인장의 발효액을 이용한 항균 감염증 및 항암 작용에 대한 예방ㆍ치료용 조성물의 제조방법 - Google Patents

월동선인장의 발효액을 이용한 항균 감염증 및 항암 작용에 대한 예방ㆍ치료용 조성물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자궁경부 암세포주에 대하여 항암활성을 갖는 월동선인장 (Opuntia humifusa) 발효액 제조방법, 이를 이용한 항균 감염증 및 항암 작용에 대한 예방ㆍ치료용 조성물에 관한 것으로, 손바닥 선인장의 과즙에 발효균주인 유산균 및 효모균을 첨가하여 항암작용이 뛰어나고 항산화 기능이 첨가된 조성물이 제공된다.
본 발명에서 제공되는 발효액은 항암활성이 뛰어나며 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)의 첨가로 항산화능이 뛰어난 건강 기능성 조성물을 제공할 수 있다.
월동선인장, 건강음료, 항암작용

Description

항암작용이 뛰어난 월동선인장의 발효액 제조 방법, 및 이로부터 얻어진 발효액을 이용한 항균 감염증 및 항암 작용에 대한 예방ㆍ치료용 조성물{A Preparing of Opuntia humifusa Fermented Liquid and Composition for Preventing and Treating Antimicrobial Infenction and Antitumor Action}
도 1은 본 발명의 월동선인장 발효액의 제조 과정을 나타내는 블록도이며,
도 2는 본 발명의 월동선인장 발효액 동결건조물내 부위별 원소함량비를 나타낸 그래프이며,
도 3은 본 발명에 의해 얻어진 월동선인장 선인장 분쇄액에 의한 항암활성 효과를 나타내는 그래프로서, a는 줄기메탄올추출액, b는 줄기에탄올추출액, c는 줄기물추출액, d는 열매메탄올추출액, e는 열매에탄올추출액, f는 잎물추출액을 각각 나타내며,
도 4는 본 발명에 의해 얻어진 월동 선인장 발효액의 항암활성을 나타내는 그래프로서, a는 월동선인장 열매발효액이고, b는 월동선인장 줄기발효액을 나타낸다.
본 발명에서는 항암 및 항산화 작용이 뛰어나 질병의 예방ㆍ치료에 유용한 월동선인장(Opuntia humifusa) 발효액 제조방법과 이를 이용한 항균 감염증과 항암 작용에 대한 예방ㆍ치료용 조성물에 관한 것이다.
지구상에는 4,000여종의 선인장이 있는데 그 중 열매가 달린 선인장은 손바닥 선인장으로 불리며 예로부터 식용이나 식품 대용으로 사용되어 왔다. 본초강목에 의하면 손바닥 선인장은 기관지, 천식, 기침, 폐질환, 위염, 변비, 장염, 신장염, 고혈압, 당뇨, 심장병, 신경통, 관절염 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 이들 손바닥 선인장 즙을 마시면 이뇨효과, 장운동의 활성화 및 식욕증진 효능이 있고, 최근엔 피부질환, 류마치스 및 화상치료에 사용되어 왔다. 손바닥선인장은 소화기능의 향상, 창상치유 효과 및 류마치스 관절염에 효능이 알려지면서 기능성 식물로 재조명되고 있다. 선인장에 대한 생리활성에 관한 연구로 최근에 Paik은 선인장열매 분말을 생쥐에 투여한 결과 항산화기능을 확인하였을 뿐만 아니라 선인장에 의한 항궤양작용을 증명한 바 있다.
손바닥선인장 (Opuntia ficus-indica var. saboten)은 선인장과(Cactaceae)에 속하는 열대성 식물로 우리나라의 제주도 등지에서 자생하고 있는 귀화식물로 백년초라는 이름으로 널리 알려져 있다. 한편, 손바닥선인장은 다양한 형태의 기호 식품으로 개발되어 시판되고 있으며 성분분석 결과 식이섬유, 비타민 및 플라보노이드 성분등이 다량 함유되어 있다고 한다. 이와같이 제주산 손바닥 선인장의 효능과 성분에 대한 다양한 연구결과들이 보고되고 있으며 특히, 랫드를 대상으로 한 면역계 세포의 활성화에 대한 연구, 대장균(E.coli) 등 식중독 미생물 6종에 대한 항균 효과와 항산화 효과 등이 발표된 바 있다.
그러나 제주산 백년초는 영하 20oC의 혹한에서도 생존이 불가능하여 우리나라의 중부등지에서는 서식이 불가능한 것으로 알려져 있다. 현재 손바닥선인장의 한 종류인 Opuntia humifusa(이하, '월동선인장'이라 한다.)는 영하 20oC에서도 월동하는 것으로 알려져 있으며 그 특성 및 성분 또한 제주도에서 자라는 백년초와는 다른 것으로 알려져 있다. 월동선인장은 수년에서 수십년 생의 경작이 가능한 다년생 식물로 영남, 호남, 강원도에서도 재배가 가능하다. 여러 해 동안 생리활성물질들이 농축되므로 뛰어난 기능성이 뛰어나고 항산화작용, 항균작용, 항궤양작용 등 다양한 생리활성 기능이 알려져 있으나 항암작용에 대한 효과는 알려져 있지 않다.
현재 손바닥선인장을 이용한 제품으로 시중에는 줄기, 혹은 잎, 혹은 뿌리등을 한약재와 함께 추출하여 판매하는 기능성음료가 판매가 되고 있다. 또한 항산화작용 및 항균작용이 알려지면서 기능성비누, 화장품 원료 및 팩 등으로 시중에 판매되고 있다. 그러나 기능성음료의 제조법이 고압 및 고온으로 추출되면서 열에 약한 비타민류가 많이 파괴되어 효과의 효능을 인정하기가 어렵다. 따라서 새로운 손바닥선인장 발효액을 이용하는 발명이 시작되었다.
더 나아가 월동선인장과 유사한 제주산 백년초에 대한 발효액 제조법으로는 한국특허출원 특1994-0039828(선인장 열매 조성물)내에서 선인장 열매에 당류, 식초 등 식품 또는 식품첨가물 등을 혼합하여 조리, 발효가공, 또는 추출정제제하여 만든 선인장 열매의 쨈류, 절임류, 음료 및 술등의 관한 선인장 열매를 이용한 조성물 제조방법이 공개되어 있다.
또한 한국특허출원 공개-0013602(손바닥 선인장을 이용한 기능성 식품의 제조방법)에서는 손바닥선인장의 열매, 또는 줄기, 또는 잎을 이용하여 엿, 젤리, 엑기스 등을 제조하는 방법이 공개되어 있다. 그러나 이러한 제조법으로는 생리활성이 가능한 음료의 제조가 불가능하다.
따라서 본 발명에서는 월동선인장 자체에 압력을 가하여 과즙을 만든 다음 효모균, 혹은 유산균을 첨가하면 지금까지 알려져 있지 않았던 자궁경부암 항암활성을 보강시키고, 이와 동시에 제조된 발효액에 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)를 첨가하면 맛과 항산화 작용을 극대화한 신규 기능성원료를 제조할 수 있다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 목적은 비타민의 파괴가 없으면서 항산화작용을 보강하고 발효미생물에 의하여 항암활성이 증가되는 월동선인장 발효액을 제조하는 방법을 제공하려는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항산화작용이 뛰어난 월동선인장 손바닥선인장 발효액을 이용하여 항균 감염증과 항암 작용에 대하여 예방ㆍ치료용 조성물을 제공하려는데 있다.
본 발명의 일견지에 의하면 상기 목적을 달성하기 위하여,
세척한 월동선인장 손바닥 선인장(Opuntia humifusa)의 열매, 줄기 혹은 뿌리 분쇄액에 흑설탕 4-6 % (w/v)을 첨가하는 단계;
상기 흑설탕 첨가액에 유산균과 효모를 총량 5-15 %(v/v) 범위 내에서 동시에 혹은 순차적으로 접종하는 단계; 및
상기 접종액을 35 ~ 45 ℃에서 2 ~ 10 일간 발효시키는 단계로 이루어지는 손바닥 선인장 발효액을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면,
상기와 같은 방법으로 제조한 손바닥 선인장 발효액에 분쇄액과 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)를 1∼10:0.1∼5:0.01∼5의 중량비로 함유시켜 이루어지는 항균 감염증 및 항암 작용에 대한 예방ㆍ치료용 조성물이 제공된다.
이하, 본 발명의 월동선인장 발효액의 제조방법을 도 1을 참조하여 설명한다.
우선, 세척된 월동선인장 열매 혹은 줄기 혹은 뿌리 혹은 그 혼합물을 분쇄하여 분쇄액을 제조한다. 기존 손바닥 선인장은 열매 혹은 줄기만 사용할 수 있었으나, 본 발명에 사용되는 월동선인장은 열매, 줄기 뿐만 아니라 뿌리까지 사용할 수 있어 효율성이 높은 점이 특징이다.
얻어진 월동선인장 분쇄액에 흑설탕을 첨가한다. 이때 흑설탕은 발효를 효과적으로 수행하기 위한 목적으로 당분을 보충하기 위해 첨가되는 것으로 그 함량은 통상 4-6%(w/v)정도이면 충분하다.
그런 다음 발효시키기 위한 미생물로는 유산균 혹은 효모를 투입한다. 이때 유산균 혹은 효모는 109 cells/ml로 자란 균주액을 총량 5-15 %(v/v) 범위내에서 동시에 혹은 순차적으로 접종할 수 있다. 접종 균의 총량이 5% 이하이면 접종 균주가 사멸하여 발효가 이루어지지 않고 접종균주가 15% 이상이면 발효기간의 단축으로 발효액의 항암활성이 저하되는 성질이 있어 가장 바람직한 균 접종량은 약10%정도이다.
이때 사용되는 유용미생물의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 효모균으로는 사카로세스 세레비지애 (Saccharoces cerevisae)를, 그리고 유산균으로는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, ATCC8014) 혹은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei ATCC7469)를 사용하는 것이 통상적으로 입수가능하다는 점에서 바람직하다.
또한 발효를 위하여 투입하는 효모 및 유산균 수는 이에 한정하는 것은 아니나 통상 입수가능한 109 cells/ml정도인 것이 좋다.
이같이 하여 얻어진 유용미생물 투입액을 발효시키기 위하여 35 ~ 45 ℃ 하에 2 ~ 10일 정도 발효하면 고온ㆍ고압하에 비타민의 파괴를 방지하면서 효과적으로 본 발명의 월동선인장 발효액을 제조할 수 있다. 이때 발효 유무에 따라 상기 발효 단계를 반복할 수도 있다.
이때 발효 유무 혹은 완료는 pH를 확인하여 결정한다. 즉, pH 4.0부근이면 완료시키고, 이에 못 미치면 추가 발효시켜 pH 4.0인지를 확인한 다음 발효단계를 완료하게 된다. 이같이 발효시키면 발효과정 완료후 유산균의 총 수는 107 ~ 108 cells/ml 이고, 효모의 총 수는 1O8 ~ 1O9 cells/ml 정도가 된다. 단, 저장 기간의 경과에 따라 다소 증가할 수 있다.
이와같이 하여 제조한 월동선인장 발효액에 분쇄액과 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)을 1∼10:0.1∼5:0.01∼5의 중량비로 함유시켜 얻어진 조성물은 항균 감염증 및 항암 작용에 대한 예방ㆍ치료 효과를 발휘할 수 있다. 이때 상기 범위를 벗어나면 항암활성, 항산화능등의 조화가 깨지게 되므로 바람직하지 않다.
이때 분쇄액은 부형제로서 첨가되는 것으로, 일반 화학약품을 첨가하는 것보다 독성 측면이나 항암 작용 측면에서 보다 바람직하다.
또한, OPC란 통상적으로 항산화작용을 갖는 물질로서, 본 발명에서는 항산화작용을 발현하는 발효액에 있어 항산화작용을 보강하는 역할을 수행하게 된다.
나아가, 본 발명에서는 월동선인장 발효액을 액상 타입과 분말 타입으로 제공함으로써 이용하여 각각 건강기능성 음료와 항암예방 효과 및 항산화작용이 뛰어난 화장품 원료로 제공할 수도 있다.
이하에서는, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 일예를 들어 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 이에 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
제조예 1: 월동선인장 선인장의 발효액 제조
세척된 손바닥 선인장 열매, 줄기, 뿌리(총 100 kg)를 분쇄기를 사용하여 2.O× 2.O mm 이하의 크기로 분쇄하여 손바닥 선인장 분쇄액을 제조하였다. 얻어진 분쇄액에 흑설탕 5 %(w/v)을 첨가하였다.
그런 다음 월동선인장 분쇄액에 효모균으로서 사카로세스 세레비지애(Saccharoces cerevisae)(109 cells/ml) 배양액 10%(v/v)를 투입한 다음 유산균으로서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, ATCC8014)(109 cells/ml) 배양액 1O %(V/V)를 접종하였다.
상기 접종액을 40 ℃ 항온기에서 10일정도 발효시켜 본 발명의 손바닥 선인장 발효액을 제조하였다. 제조된 발효액의 pH가 4.O 부근인 것을 확인하고 단계를 완료하였다. 발효 완료후 측정한 총 유산균 수는 107 cells/ml 이었으며, 총 효모 수는 1O8 cells/ml 정도이었다.
제조한 손바닥선인장 발효액을 이용하여, 본 발명의 손바닥 선인장 발효액에 오피시를 1-10% 중량비로 보강하여 항산화 활성을 증가시키며 발효전 분쇄액에는 없었으나 발효후에는 항균 및 항암활성이 증가되는 것이 관찰되었다.
실시예 1. 월동선인장 발효액의 일반성분 분석
상기 제조예 1에서 제조된 월동선인장의 발효액에 대한 일반성분을 A.O.A.C.법으로 분석하였다.
시료의 조섬유는 산 및 알칼리 분해법을 이용하여 조섬유 분석 장치 (Fibertec system, Sweden)로 측정하였다. 수분은 적외선 수분측정기 (Kett, FD-240, Japan)로 3회 측정하였고, 조단백질의 함량은 Kijeltec-1035 (Auto sampler system, Sweden)를 사용하여 켈달법으로 총질소 함량을 구한 후 단백질 계수 6.25를 곱하여 산출하였다. 조지방 그리고 조회분은 A.O.A.C법에 따라 측정하였다. 식이섬유는 건조분말에 α-아밀라제를 가하여 끓는 물에서 15분 가열처리 후 0.2 N 염산 (pH 1.5)을 가하고 펩신을 처리하여 40℃에서 6시간 가수분해하였다.
효소처리 후 수산화나트륨을 가하여 중화한 후 판크레아틴을 가하여 40℃에서 1시간 진탕하였다. 분해가 끝난 반응액에 95% 에탄올을 가하여 1시간 동안 정치시켰다.
정치동안 생성된 불용성 침전물을 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 총 식이섬유를 분리하였다. 침전물을 증류수에 용해한 후 3,000 rpm에서 원심 분리하여 침전물을 100℃에서 건조하여 불용성식이섬유 (Insoluble dietary fiber)로 하고, 상층액에는 95% 에탄올을 가하여 1시간동안 재 정치시켜 형성된 침전물을 원심 분리하여 분리한 후 건조하여 가용성 식이섬유(Soluble dietary fiber)로 하였고 불용성 및 가용성 식이섬유소의 합계를 총 식이섬유(Total dietary fiber)량으로 하였다.
조지방을 분석하기 위해서 시료를 미리 90℃로 1-2시간 건조 후 에테르를 추출용매로 해서 Soxhlet 지방추출기를 사용하여 16-32시간 동안 식품에서 지질을 연속 추출한 뒤 추출액에서 에테르를 제거하고 다시 95-100℃로 건조해서 얻어진 잔류물을 조지방으로 사용하는 Soxhlet 추출법을 이용하였다.
얻어진 월동 선인장의 발효액의 일반 성분 분석 결과를 하기표 1에 정리하였다.
에너지열량 (kcal/100g) 조단백질 (Crude protein) (%) 조지질 (Crude lipid) (%) 조회분 (Crude carbohydrate) (%)
줄기 86 0.92 0.12 20
뿌리 121 2.4 0.12 28
열매 65 1.04 0.08 15
상기표에서 보듯이, 줄기의 수분함량은 88.4%, 조단백질은 8.1%, 조지방은 1.1%, 조회분은 12.4%로 나타났으며, 열매의 수분함량은 89.1%, 조단백질은 4.6%, 조지방은 1.5%, 조회분은 7.8%로 나타나 줄기와 열매의 수분과 조지방 함량에는 큰 차이가 없었으나, 줄기에는 열매에 비해 조단백질과 조회분이 약 2배 정도 더 많이 함유됨을 알 수 있었다.
에너지열량을 비교시 열매보다 줄기 및 뿌리가 1.3배 및 1.9배로 높은 열량을 보여주었다. 탄수화물은 줄기와 뿌리는 유사하였으나 열매는 15% 정도로 낮은 함량을 보여주었다.
실시예 2. 월동선인장 발효액의 원소 및 무기질분석
월동선인장 발효액에 대한 원소분석비를 비교하고자 동결건조된 발효액을 분쇄기로 분말화하여 경북대학교 공동실습관으로부터 Elemental Analyzer (FISONS, EA 1110)를 지원받아 탄소(C), 산소(O), 수소(H), 그리고 질소(N)를 정량분석 하여 비교하였다.
<무기성분의 분석>
무기성분의 비교·분석을 위하여 한국기초과학지원연구원 부산분소로부터 분석·지원을 받았다.
분석방법은 건식법으로 전 처리 과정은 발효액을 건조분말로 만든 다음 각각의 시료 0.2-0.3 g를 Teflon vessel 용기에 취하여 HNO3(고순도, Merck사 GR Grade) 5 ㎖을 가한 후 마개를 열은 상태로 100-150℃에서 가열하였다. 이 과정을 통해 산을 완전히 날려 보낸 다음 여기에 다시 HNO3 3 ㎖과 HCl 0.5 ㎖을 취하여 마개를 닫고 가압상태로 100℃ 부근에서 하루 정도 가열하였다.
용기를 완전히 식힌 다음 마개를 열고 시료가 완전히 산에 녹은 것을 확인한 다음 마개를 연 상태에서 산이 1 ㎖ 정도 남을 때까지 다시 가열하였다. 증류수로 희석(× 100)하여 ICP 분석기 (Jobin-Yvon, JY 38 Plus, France)를 이용해 ICP-AES으로 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 아연(Zn), 철(Fe) 그리고 인(P)을 각각 비교 분석하였다.
또한, 월동선인장은 부위별 발효시킨 뒤 동결건조하여 원소 함량의 구성비를 비교하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보듯이, 부위별 원소함량을 보면 탄소가 38.4-39.6%, 산소가 43.3-44.4%, 수소가 5.6-6.2% 그리고 질소가 0.9-1.8% 등 큰 차이점은 발견되지 않았다. 모든 부위별 발효액에서 황은 측정되지 않았다.
부위별 발효액에 대하여 원소분석과 일반조성을 비교하였을 경우 특별한 차이점은 인정되지 않았다. 부위별 조성이 같을 수는 있으나 실제로 다양한 식품을 개발할 경우 상기 무기성분은 중요한 변수가 될 수가 있다.
이에 부위별 무기성분을 ICP로 분석하고 그 결과를 하기표 2에 나타내었다.
Concentration (ppm)
샘플 AS Ca Cd Fe Mg Pb Zn
줄기 ND 1,800 ND 21 497 ND 710
뿌리 ND 2,520 ND 12 1,319 ND 610
열매 ND 388 ND 10 781 ND 1,627
상기표에서 보듯이, Ca의 경우 뿌리에서 2,520 ppm이 검출되어 열매와 비교시 6.5배의 높은 칼슘 함량을 보였다. 그러나 Zn의 경우는 오히려 열매에서 2.6배 높은 함유량을 보였다.
결론적으로 특정 부위만을 이용하기 보다는 적절한 비율로 혼합한 부위를 사용하는 것이 유리하다는 결론을 얻을 수 있었다.
실시예 3. 월동선인장 발효액의 급성독성시험
본 실시예에서는 월동선인장 발효액에 대한 피부자극에 대한 안전성시험을 의약품 등의 독성시험기준에 의거하여 실시하였다.
본 시험은 온도 23± 3℃, 상대습도 50± 10%, 환기횟수 13~18회/hr, 조명시간 12시간 (오전 7시~ 오후 7시), 조도 150~300 Lux로 설정된 실험실에서 실시하였다. 시험 종사자들은 모두 동물실에 입실하기 위하여 교육을 받은 후 작업복, 두건, 마스크, 장갑 등을 착용하였다.
시험기간의 사육기간중 동물실의 온습도는 자동온습도측정기에 의하여 매시간 마다 측정하였으며, 환경측정의 결과 시험의 신뢰성에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 없었다.
순화기간 및 시험기간중에 스테인레스제 철망사육상자(220W× 410L× 200H mm)에 랫드 5마리 이하/사육상자로 사육하였다. 사육상자에는 시험번호, 동물번호 및 투여량을 기입한 개체식별 카드를 부착하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(제일사료 주식회사)를 방사선 조사 멸균하여 자유섭취시켰으며, 상수도수는 자유섭취시켰다.
손바닥 선인장의 분쇄액은 식품으로 사용되는 안전성이 확보되어 있으나 손바닥 선인장은 발효액에 대한 안전성을 확보하기 위하여 급성독성시험을 최대투여용량인 2,000 mg/kg로 투여하였다.
동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다. 우선, 순화기간중 건강하다고 판정된 동물의 전례에 대하여 체중을 측정하고 암수 랫드 각 5마리에 투여직전에 각 용량별로 월동선인장 손바닥 선인장 발효액을 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 조제하였다.
동물에 대한 발효액 투여전 하룻밤 절식시킨 후, 경구 투여용 주사침을 부착한 주사관을 이용하여 1회 강제 경구투여하였다. 투여 직전의 체중을 기준으로 하여 투여액량 (ml/kg b.w)을 산출하였다.
그런다음 투여당일은 투여 후 1시간에서 6시간까지는 매시간 일반 상태를 관찰하였고 투여 익일부터 14일까지는 매일 1회씩 일반상태의 변화, 중독증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다.
관찰기간 종료 후 에테르 마취하에 방혈치사시켜 내부장기의 육안적 이상 유무를 상세히 관찰하였다. 육안적 이상장기는 10% 중성 포르말린액에 고정하여 보관하였다.
손바닥 선인장 발효액을 투여 후 암수 랫드에서 사망동물은 한 마리도 없었으며 임상적으로 특별한 소견은 관찰할 수가 없었다. 부검 소견도 수컷 및 암컷 모두 신장, 간장 및 폐장에서 변화가 관찰되지가 않았다.
결론적으로, 손바닥 선인장 발효액은 랫드에 대한 독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 월동선인장 분쇄액과 발효액의 항암효과
자궁경부암 세포주 카스키(CaSki), 시하(SiHa)와 케라티노사이트(keratinocyte)세포 HaCaT를 배양하기 위한 둘베코스 개질된 이글 매개체(Dulbecos modified Eagle medium, DMEM)과 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 안티마이코틱-안티바이오틱스(Antimycotic-antibiotics)는 GIBCO Laboratories(Grand Island, NY)에서 구입하였으며, 송아지 혈청(FBS)은 Hyclone Laboratories (Logan, UT)에서, 96 웰 조직 배양 플레이트 및 조직 배양 접시는 Nunc, Inc(North Aurora Road, IL), 술포로디아민 B(sulphorodiamine B, SRB)는 시그마(sigma)사에서 각각 구입하였다.
흡광도 측정을 위하여 ELASA 판독기를 사용하였고(Molecular Device사제), 세포배양은 CO2 인큐베이터(Vision사제)를, 현미경은 역 현미경(Nikon사제)를 각각 사용하였다.
DMEM/10% FBS에 유지시킨 자궁경부암 세포주 카스피(CaSki), 시하(SiHa)와 케라티노사이트 세포 HaCaT을 96 웰 플레이트에 1× 104/well씩 넣은 후 1일 동안 CO2 인큐베이터에 배양후 새로운 배지로 갈아주고 여러 가지 농도로 희석시킨 추출물을 각각 처리한 다음 24시간 후 70% 아세톤 용액으로 -20℃에서 세포를 고정시킨 후 건조하여 0.4% SRB 용액을 사용하여 웰에 남아있는 세포를 염식시킨 후 세척, 건조하여 10mM 트리즈마 베이스(Trizma base) 용액으로 SRB를 용출시킨 다음 562nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다.
자궁경부암 세포주의 각 추출물의 세포독성 결과 자궁경부암 세포주 카스키(CaSki), 시하(SiHa)와 케라티노사이트세포 HaCaT에 월동선인장의 용매별 추출물을 농도별 50 ㎍/ml 까지 처리한 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이, 카스키(CaSki)와 시하(SiHa)에서는 농도 의존적으로 세포독성을 보이지 않았다.
한편, 자궁경부암 세포주에 대한 본 발명에 의한 월동선인장 발효액의 항암효과를 보기위하여 상기 제조예 1에서 얻어진 발효액을 그대로 동결건조하였다. 이 발효액을 처리한 군(a)에서는 카스키 (CaSki) 새포주와 SiHa (시하)세포주에서 농도 의존적으로 민감한 세포독성을 보여 성장이 현저하게 감소하는 것을 볼 수 있었다. 자궁경부암 세포주 중에서도 HPV가 아닌 다른 원인에 의해 암세포화된 케라티노사이트 HaCaT 세포주에서는 도 4에서 보듯이, 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.
또한 발효물을 규조토 여과하여 동결건조한 것을 처리한 군(b)에서도 여과하지 않은 군과 같은 경향을 나타내었다. 이는 손바닥 선인장 발효액이 HPV 바이러스 게놈을 가지고 있는 카스키(CaSki)와 시하(SiHa) 세포주의 성장을 억제하는 것임을 보이는 결과로 판단된다.
실시예 5 - 월동선인장 분쇄액과 발효액의 항균활성
본 실시예에서는 월동선인장 분쇄액과 발효액을 이용한 항균 활성을 확인하기 위하여 확산법을 이용하여 그 효과를 검증하였다.
그람양성균주로 항균제 내성을 가진 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 해당하는 KCCM40510, KCCM11593, KCCM41294, KCCM40881 및 KCCM41291의 5가지 종류를 한국미생물보존센터(KCTC)에서 분양받아 항균제 감수성 시험배지인 뮐러힌톤(Muller-Hinton) 배지에 접종하여 37 ℃에서 전 배양을 하였다.
전 배양된 균주를 뮐러힌톤배지에 접종하여 시험배지를 만들고 하기표 3에 나타낸 성분에 대한 1차 항균작용을 종이디스크를 이용하여 확산법에 의해 그 효과를 검증하였다.
즉, 종이디스크에는 하기표 3에 나타낸 성분 60 ㎕를 흡착시키고 시험배지 위에 올린 다음 37 ℃에서 하룻밤 배양하여 18시간 배양한 다음 저지환을 mm로 측정하였으며, 또한 비교예로서 알로에 분쇄액을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험을 반복하고 그 결과를 표 3에 함께 나타내었다.
구분 KCCM40510 KCCM11593 KCCM41294 KCCM40881 KCCM41291 피부자극
실험예 분쇄액 18 17 16 17 14 -
발효액 18 15 18 16 11 -
비교분쇄액 8 8 8 8 8 -
비교발효액 12 12 8 8 13 -
*비교분쇄액은 알로에 분쇄액이며 발효액은 같은 공정으로 제조된 알로에 발효액
상기표 1에서 보듯이, 알로에 분쇄액에 비하여 발효액이 항균활성이 조금 강한 것으로 나타났으나 크게 두드러지지는 않았으며, 월동선인장 손바닥 선인장 분쇄액은 항균효과가 전혀 나타나지 않았으나 월동선인장 손바닥 선인장 발효액은 분쇄액에 비해 그 항균활성이 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
제조예 2: 건강기능성 음료의 제조법
상기제조법으로 발효된 손바닥 선인장 발효액을 이용한 건강음료의 제조 구성비는 다음과 같다.
발효액 ················ 99ml
OPC ··········· 1∼2 ml
제조예 3 : 건강기능성 분말의 제조
상기 제조에 2에 기재한 구성을 갖는 월동선인장 손바닥 선인장 발효액을 동결건조하여 총 10g 용량의 분말화 제제로 제조하였다.
실시예 6-분쇄액, 발효액, 제조예 2, 3에 의해 제조한 조성물의 항암 및 항산화활성
본 시료시예에서는 분쇄액, 발효액, 제조예 2, 3에 의해 제조한 조성물의 항암 및 항산화활성 수치를 확인하여 각 활성을 검증하였다.
여기서 항암작용 및 항균작용은 상기에 기술한 방법으로 측정하였으며 항산화활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 사용한 항산화활성 검정법으로 여러 농도의 시료를 4 mL의 메탄올에 녹여 1.5X10-4M DPPH 메탄올 용액 1mL를 첨가한 후, 30분간 실온에 방치하여 517nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 표 4에 나타내었다.
구분 (1 mg/ml) 항암작용(세포성장억제율)(%) 항균작용(mm) (KCCM40881) 항산화작용(%) (DPPH) 피부자극
CaSki SiHa HaCaT
실험예 분쇄액 0 0 0 8 14 -
발효액 60 59 60 16 11 -
제조예 2 34 40 48 18 8 -
제조예 3 40 37 39 18 13 -
제조예 2의 구성: 발효액 99%: OPC 1-2% 제조예 3의 구성: 발효액 99g: OPC 1g
상기표에서 보듯이, 제조예 2 및 제조예 3에 의해 제조한 조성물의 항암활성황균작용, 항산화활성 수치가 발효액 자체보다 더 개선된 것을 확인할 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의해 제공된 월동선인장 발효액 및 이로부터 얻어진 조성물은 항암활성이 뛰어나며 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)의 첨가로 항산화능이 뛰어난 건강 기능성 조성물을 제공할 수 있다.

Claims (5)

  1. 세척한 월동선인장(Opuntia humifusa)의 열매, 줄기 혹은 뿌리 분쇄액에 흑설탕 4-6 % (w/v)을 첨가하는 단계;
    상기 흑설탕 첨가액에 유산균과 효모를 총량 5-15 %(v/v) 범위내에서 동시에 혹은 순차적으로 접종하는 단계; 및
    상기 접종액을 35 ~ 45 ℃에서 2 ~ 10 일간 발효시키는 단계; 로 이루어지는 항암활성 및 항균작용을 갖는 월동선인장 선인장 발효액의 제조방법
  2. 제1항에 있어서, 상기 발효시킨 발효액에 유산균과 효모를 총량 5-15%(v/v) 범위내에서 동시에 혹은 순차적으로 접종하여 2차 발효시키는 단계;를 더 포함하여 이루어지는 월동선인장 손바닥 선인장 발효액의 제조방법
  3. 제1항 또는 제2항중 어느 한항의 방법에 의해 얻어진 월동선인장 발효액에 분쇄액과 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)를 1∼10:0.1∼5:0.1∼5의 중량비로 함유시켜 이루어지는 항균 감염증에 대한 예방ㆍ치료용 조성물
  4. 제1항 또는 제2항중 어느 한항의 방법에 의해 얻어진 월동선인장 발효액에 분쇄액과 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)를 1∼10:0.1∼5:0.1∼5의 중량비로 함유시켜 이루어지는 항암활성을 갖는 예방ㆍ치료용 조성물
  5. 제1항 또는 제2항중 어느 한항의 방법에 의해 얻어진 월동선인장 발효액에 분쇄액과 올리고메릭 프로안토 싸이아미딘(OPC)를 1∼10:0.1∼5:0.1∼5의 중량비로 함유시켜 이루어지는 항산화작용 예방ㆍ치료용 조성물
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