KR20070002029A

KR20070002029A - 항 인간 테나신 단클론 항체

Info

Publication number: KR20070002029A
Application number: KR1020067020062A
Authority: KR
Inventors: 리타 데 산티스; 안젤라 펠리치아; 지오반나 팔롬보; 파올로 까르미나띠
Original assignee: 테크노겐 에스.시.피.에이.
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-16
Publication date: 2007-01-04
Also published as: PL1718678T3; WO2005082938A2; US7989171B2; EP1718678A2; CA2558718A1; KR101266389B1; MXPA06009674A; CA2558718C; AR047819A1; ES2654065T3; CN1946740B; WO2005082938A3; AU2005217237A1; JP5191036B2; JP2008506355A; BRPI0508082A8; EP1718678B1; HK1100848A1; PT1718678T; US20100297003A1

Abstract

경쇄 및 중쇄 가변 부위 서열이 각각 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2인 항 인간 테나신 단클론 항체, 인간 테나신의 A_(1-4)-D 부위 내에서 항원 에피토프에 결합할 수 있는 그의 단백질 분해 단편, 인간 테나신의 A_(1-4)-D 부위 내에서 항원 에피토프에 결합할 수 있는 그의 재조합 유도체, 그의 접합체 및 유사한 작용성 동족체를 개시한다.

항 인간 테나신 단클론 항체

Description

항 인간 테나신 단클론 항체{ANTI-HUMAN TENASCIN MONOCLONAL ANTIBODY}

본 발명은 항 인간 테나신 단클론 항체, 이를 수득하기 위한 방법 및 물질, 테나신을 발현하는 종양에 대한 진단 및 치료 과정에서 상기 항체의 용도 및 의학 분야에 사용하기에 적합한 상기 항체를 함유하는 물질에 관한 것이다.

종양 요법의 특이성은 종종 상기 치료의 성공을 결정하는데 제한 인자를 구성한다. 실제로, 다수의 항암제들의 독성 효과의 개시 및 감소된 허용성은 상기 항암제의 용도와 환자의 삶의 질을 제한한다.

독성의 감소는 암 세포만의 치료 선택성과 직접적으로 관련된다. 단클론 항체는 종양을 특이적으로 국소화하는 이상적인 기구이며, 아비딘/비오틴 증폭 시스템과 결합 시 활성 분자를 종양 부위로 향하게 하는 매우 효능 있는 방법을 구성한다.

테나신은 배아발생 도중 및 성인 조직에서는 흉터 형성 과정 및 종양 발생 중에, 뿐만 아니라 새로 형성된 혈관에서 발현되는 세포 외 기질의 분자이다. 테나신은 사실상 정상적인 성인 조직에서는 존재하지 않는 반면, 신경아교종(Burdon, et al., Cancer Res., 43:2796-2805, 1983), 유방(Chiquet-Ehrismann, et al., 1986), 폐(Natali, et al., Intl. J. Cancer, 54:56-68, 1989)의 암종, 섬유육종 및 편평세포 암종(Ramos, D.M. et al., Intl. J. Cancer, 75:680-687, 1998)과 같은 다수의 충실성 종양의 기질에서 발현된다. 테나신은 신경아교종에서 발현되지만 상응하는 정상 뇌 조직에서는 발현되지 않는다. 테나신에 대한 심층 논의에 대해서 WO 92/04464(Wistar) 및 관련 참고문헌을 참조하시오.

EP 0 496 074를 토대로, 파가넬리(G. Paganelli et al.)는 종양의 전신 및 부위 이동(locoregional) 치료를 위한 "3 단계 예비 표적화"라 칭하는 방법을 개발하였으며, 그 결과가 하기 문헌들에 보고되어 있다[Cremonesi, M., et al., Eur. J. Nucl. Med., 26(2):110-120, 1999; Paganelli, G. et al., Eur. J. Nucl. Med., 26(4):348-357, 1999; Paganelli, G. et al., Cancer Biother. & Radiopharm., 16(3):227-235, 2001; Grana, C., et al., Br. J. Cancer, 86:207-212, 2001].

이러한 유형의 암 치료에 대한 다른 참고문헌으로는 WO 94/04702, 및 미국 특허 제 5,578,287 호가 있다.

3 단계 예비 표적화 치료(또한 상표명 PAGRIT(등록상표)에 의해 공지됨)는 아비딘과 비오틴화된(biotinylated) 알부민을 각각 스트렙트아비딘과 ⁹⁰Y-비오틴에 앞서 투여하면서("추적" 단계) 비오틴화된 항 테나신 단클론 항체, 스트렙트아비딘 및 ⁹⁰Y-비오틴을 연속적으로 정맥 내 투여하여 상기 항체 및 스트렙트아비딘의 순환 수준을 감소시키는 것을 기본으로 한다. 상기 3 단계 예비 표적화 방법의 선택성은 항 테나신 단클론 항체의 사용에 기인한다. 세포 외 기질 분자의 표적화는, 세포 표면 항원을 겨누는 표적화에 비해, 종양 세포 자체에 의한 항원 발현의 조절 에 의해 영향을 받지 않는다는 이점을 제공한다. 상기 예비 표적화 치료의 용량, 투여 회수 및 "추적"은 최적의 종양 대 비 종양 생체 분포 비를 획득할 목적으로 확립되었다.

파가넬리(Paganelli, G., et al., Eur. J. Nucl. Med., 26(4):348-357, 1999)에 의해 연구에 들어간, 아교모세포종(GBM) 또는 역 형성 별 세포종(AA)을 앓고 있는 48 명의 환자에서 획득된 결과는, 다수의 스트렙트아비딘에 대한 알러지 반응의 경우를 제외하고, 상당한 독성의 결여 및 상기 치료의 예비 효능을 입증하였다. 실제로, 상기 치료가 끝난 지 2 개월 후에, 상기 환자의 25%가 종양 질량의 감소(완전 반응 = 6%, 부분 반응 = 11%, 중요치 않은 반응 = 8%)를 나타내었고, 상기 환자의 52%는 안정하게 남아 있었으며, 전체적인 반응 비율은 77%이었다.

기대 수명이 6 개월 미만인 다수의 이들 환자에서, 상기 치료 반응은 1 년이 넘게 지속되었다.

상기 비오틴화된 항 테나신 항체의 역할은 아비딘 및 후속적으로 ⁹⁰Y-비오틴의 축적을 상기 비오틴화된 분자를 통해 종양에 국소화하고 매개하여, 상기 방사성 동위원소를 직접 상기 종양의 내부로 향하게 하는 것이다. 항 테나신 항체는 이미 특허 및 특허 출원들의 목적이다: 미국 특허 제 5,624,659 호(Duke University); JP 2219590(Rikagaku); WO 92/04464(Wistar); 및 WO 03/072608(Sigma-Tau).

하나의 특정한 항 테나신 항체가 문헌[Siri, A. et al., Nucl. Acid Res., 19(3):525-531, 1991; Balza, E., et al., FEBS 332:39-43, 1993]에 개시되어 있으며; 그의 치료를 목적으로 하는 용도는 문헌[Riva, P. et al., Acta Oncol. 38(3): 351-9, 1999; Riva, P., et al., Cancer, 80(12):2733-42; 1997; Riva, P. et al., Int. J. Cancer, 5:7-13, 1992]에 개시되어 있다.

상기 인용된 연구들에서 상기 항체의 발생에 사용된 클론을 BC-2라 칭한다. 출원인은 상기 클론 BC-2가, 대규모 생산 공정의 개발 도중 발현 수준이 증가하는 추가적인 비 작용성 경쇄(추정 상 모 골수종 계통으로부터 유래됨)를 생산하여 상기 항체의 산업적인 규모의 정제를 막는다는 점에서 산업적인 개발에 적합하지 않음을 입증하였다.

따라서, 약학적 용도에 필요한 정제 수준에서 산업적인 규모로 생산할 수 있는 항 테나신 단클론 항체가 필요함이 인식된다.

선행 특허 출원 WO 03/072608(Sigma Tau Industrie Famaceutiche Riunite S.p.A.의 이름으로 출원됨)에는 상기 추가적인 비 작용성 경쇄 없이, 항체 BC-4(또한 비 작용성 경쇄에 의해 오염된 것)와 공유된 항원 에피토프를 인식할 수 있는 항 테나신 항체 ST2146의 생성이 개시되어 있다.

본 발명의 목적인 항체 ST2485는 BC-2의 에피토프와 부분적으로 공유되고 따라서 동일한 단백질 부위에 위치한 에피토프를 인식한다. 상기 부위는 다양한 종양 조직들에서 크게 발현된다. 따라서, 암 진단 또는 표적화에 사용되도록, 상기 부위에 특이적인 동질의 단클론 항체를 갖는 것이 중요하다.

더욱이, 본 발명은 항체 ST2485가 항체 ST2146 이외에 테나신에 결합하는 이 점을 제공하며, 따라서 이는 상기 두 항체의 병용을 포함하는 예비 표적화 방법에 유용함을 입증한다.

발명의 요약

본 발명에 이르러 항 인간 테나신 단클론 항체가 비 작용성 경쇄를 갖지 않고 또 다른 항 테나신 항체와 함께 사용 시 추가의 이점을 제공하기 때문에 상기 언급한 문제들을 해결하는 것으로 밝혀졌다. 상기 항체는, 상기를 수득하기 위한 방법 및 특히 테나신의 발현을 특징으로 하는 질병, 예를 들어 종양의 치료에 유용한 생성물의 제조를 위한 상기의 치료 용도와 함께 본 발명의 목적이다.

본 발명은 추가의 마커 및 진단제를 임의로 함유하는 항체 및 항체 단편, 상기 항체 및 항체 단편을 수득하기 위한 방법, 상기 항체 및 그의 단편을 함유하는 약학 조성물, 및 상기를 사용하는 진단 및 치료 방법뿐만 아니라 상기 방법을 실행하는데 유용한 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 DNA, 상기와 같은 DNA를 함유하는 벡터, 상기와 같은 벡터를 함유하는 숙주 세포, 뉴클레오타이드 서열 서열식별변호: 1 및 서열식별번호: 3에 의해 암호화되는 단백질, 상기 단백질 및 단편을 암호화하는 DNA, 특이적인 상보성 결정 부위(CDR) 및 상기와 같은 CDR을 함유하는 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 또한 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마이다.

본 발명의 목적인 상기 항체는 각각 도 17 및 18에 나타낸 경쇄 및 중쇄 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 3의 가변 부위의 서열들을 특징으로 한다. 간결 하게 하기 위해서, 본 발명의 목적인 상기 항체를 ST2485라는 이름으로 나타낼 것이다. 또한 ST2485의 단편 또는 그의 키메릭 또는 재조합 유도체들을 본 발명의 범위 내에서 생산하고 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 목적은 인간 테나신의 A1-4-D 부위 내에서 항원 에피토프에 결합할 수 있는 상기 항체의 단백질 분해 단편이다. 본 발명을 설명하는 과정에서 항체 단편이 의미하는 것은 인간 테나신 C의 A1-4-D 부위 내에서 항원 에피토프와 결합할 수 있는 단편들이다.

본 발명에 따라, 상기 항체 또는 단백질 분해 단편은 바람직하게는 비오틴화된다.

본 발명의 또 다른 목적은 항체 ST2485를 생산하는 cST2485라 지칭되는 하이브리도마 세포주이다.

상기 하이브리도마 세포주는 부다페스트 조약의 규정에 따라 2003년 11월 12일에 기탁 번호 PD03003으로 센트로 디 바이오테크놀로지 아반자테(the Centro di Biotecnologie Avanzate, Largo Rossana Benzi 10, Genoa, Italy)에 기탁되었다.

또한 본 발명의 목적은 임의로 비오틴화될 수 있는 항체 ST2485의 재조합 유도체이다. 특히, 바람직한 재조합 유도체는 쥐의 일정 부위가 그의 인간 대응물에 의해 대체된 것(Ferrer, C. et al., J. Biotechnol., 52:51-60, 1996), 또는 쥐의 일정 부위가 생물학적으로 활성인 성분, 예를 들어 종양 지향된 면역학적 효과기를 자극하는데 유용한 성장 인자(예를 들어 G-CSF, GM-CSF)인 아비딘 계열의 일원으로 대체된 것(Penichet ML., Manuel, L., et al., J. Immunol., 163:4421-4426, 1999), 또는 쥐의 일정 부위가 약리학적으로 활성인 성분, 예를 들어 초항 원, 독소, 사이토킨, 또는 항암 치료 효능을 증강시키는데 유용한 임의의 다른 단백질로 대체된 것(Di Massimo, AM, et al., British J. Cancer, 75(6):822-828, 1997; Parente D., et al., Anticancer Research, 17(6A):4073-4074, 1997)이다. 상기와 같은 유도체들을 수득하는 방법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 임의로 비오틴화된 항체 ST2485의 접합 유도체이다.

특히, 바람직한 접합 유도체는 생물학적으로 활성인 성분이 통상적인 시스템에 의해 항체에 결합된 것이다. 생물학적으로 활성인 화합물의 예는 종양 지향된 면역학적 효과기를 자극하는데 유용한 성장 인자(예를 들어 G-CSF, GM-CSF)인 아비딘 계열의 일원, 또는 쥐의 일정 부위가 약리학적으로 활성인 성분, 예를 들어 초항원, 독소, 사이토킨, 또는 항암 치료 효능, 항암 약물 및 방사성 동위원소를 증강시키는데 유용한 임의의 다른 단백질로 대체된 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 바람직하게는 테나신 항체를 발현하는 암에 걸린 환자에게, 바람직하게는 비오틴화된 ST2485 또는 그의 단백질 분해 단편을 투여함을 포함하는 3 단계 예비 표적화 방법(또한 상표명 PAGRIT(등록상표)에 의해 공지됨)에 따라 수행되는 암 방사선면역요법의 방법에 유용한 약학적 생성물의 제조를 위한 상기 항체 또는 그의 유도체의 용도이다.

본 발명의 목적인 항체의 재조합 유도체 및 그의 접합체들을 사용하여 암 치료를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 테나신을 발현하는 종양의 치료를 위한 약물의 제조에서 상기 항체 및 그의 단편 또는 유도체의 용도는 본 발명의 추가의 목적을 구성한다.

방사선면역요법을 실행하기 위해서, 2 개의 치료 키트, 즉 전신적인 것과 다른 부위 이동적인 것을 또한 개시한다. 이들 키트는 또한 상표명 PAGRIT(등록상표)에 의해 공지되어 있다. 상기 전신용 키트는 5 개의 바이알, 즉 본 발명에 따른 비오틴화된 항체 또는 그의 단편 또는 유도체를 함유하는 바이알 1; 아비딘을 함유하는 바이알 2; 스트렙트아비딘을 함유하는 바이알 3; 비오틴화된 인간 알부민을 함유하는 바이알 4; 및 비오틴 DOTA(또는 WO 02/066075에 개시된 비오틴의 유도체)를 함유하는 바이알 5로 이루어진다. 상기 부위 이동용 키트는 상기 전신용 키트의 바이알 1, 2 및 5에 해당하는 3 개의 바이알로 이루어진다. 상기 바이알들을 치료할 환자, 바람직하게는 인간 환자에서 주입에 적합하도록 제조한다. 방사선면역요법을 실행하기 위해서, 본 발명의 목적인 시약을 단독으로 또는 상기 PAGRIT(등록상표) 키트의 다른 성분들과 함께 종양 덩어리를 제거하는 수술을 받고 있는 환자의 수술 중 치료를 기본으로 하는 IART(방사성핵종 치료를 위한 수술중 아비딘화)라 칭하는 방법을 개시한다.

바람직하게는, 비오틴화된 형태의 항체 또는 그의 단편을 함유하는 주입용으로 적합한 바이알 형태의 특정 용기가 본 발명의 추가의 목적을 구성한다.

본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 치료 키트에서 비오틴화된 항체를 바람직하게는 상기 단백질의 EGF 유사 부위에 지향된 다른 항 테나신 항체와 병용시킨다. 한편으로 상기 비오틴화된 항체를 상기 종양에 특이적인 다른 항체에 커 플링시킬 수 있다. 이러한 유형의 방법은 EP 0 496 074, 문헌[European Journal of Nuclear Medicine Vol.26, No. 4; April, 1999;348-357], 미국 특허 제 5,968,405 호에 일반적으로 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 종양에서 생체 내 면역국소화에 의해 후속적인 진단용("영상화") 영상을 획득하기 위한 단클론 항체 ST2485의 용도이다.

본 발명의 또 다른 목적은 테나신의 순환 수준 측정용 진단 키트의 제조를 위한 시험에서 제 2의 항 테나신 항체와 병용되는 단클론 항체 ST2485의 용도이다.

본 발명의 상기 및 다른 목적들을 또한 실시예 및 도면의 도움으로 하기에 상세히 개시할 것이다.

도 1은 인간 테나신 C 및 BC-2-유사 항체를 생성시키기 위해 채택된 전략을 개략적으로 나타낸다.

도 2는 환원 및 비 환원 조건 하에서 항체 ST2485의 SDS-PAGE(a,b) 및 웨스턴 블럿(c,d) 분석을 나타낸다. 환원 조건 하에서, 이중 밴드가 항체의 경쇄 수준에서 관찰된다(b,d).

도 3은 효소 PNGaseF(플라보박테리움으로부터의 펩타이드-N-글리코시다제)에 의한 절단에 의해 탈글리코실화시킨 항체 ST2485에 대한 SDS-PAGE 분석: 고 분자량 경쇄 밴드의 소실이 관찰된다.

도 4는 항체 ST2485 및 BC-2의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.

도 5는 웨스턴 블럿 분석에 의한 인간 테나신 및 Tn(A_(1-4)-D) 단편에 대한 ST2485의 결합 특이성을 나타낸다.

도 6은 테나신 C(a) 또는 Tn(A_(1-4)-D) 단편(b)에의 결합에 대한 ST2485 및 BC-2간의 경쟁적인 ELISA를 나타낸다.

도 7은 테나신 C(a) 및 Tn(A_(1-4)-D) 단편(b)에 대한 ST2485의 BC-2와 비교된 면역반응성을 나타낸다.

도 8은 테나신 C(a) 및 Tn(A_(1-4)-D) 단편(b)에 대한 비오틴화된 ST2485 및 BC-2의 면역반응성을 나타낸다.

도 9는 LMM3 종양(쥐 유방암) 및 정상적인 쥐의 장에서 발현된 쥐 테나신과 항체 ST2485의 교차 반응성을 나타낸다.

도 10은 누드 마우스에서 ST2485 생체 분포 연구에 채택된 프로토콜을 나타낸다.

도 11 및 11a는 BC-2와 비교된, 다양한 투여 용량에서의 ST2485의 생체 분포를 나타낸다. 투여된 모든 용량에서 종양 중의 ST2485의 축적은 BC-2의 경우보다 2 배 이상 많다.

도 12 및 12a는 BC-2와 비교된 ST2485의 종양 대 비 종양 비를 나타낸다. 상기 비는 투여된 모든 용량에서 항체 ST2485의 경우가 더 높다.

도 13은 ELISA 시험에 의한 항 테나신 항체 ST2485 및 ST2146의 생체 외 간섭(a) 및 부가성 시험(b)을 나타낸다.

도 14 및 14a는 BiaCore 분석에 의한 항체 ST2485 및 ST2146의 생체 외 부가성 시험을 나타낸다.

도 15는 항체 ST2485 및 ST2146의 생체 내 부가성 연구에 채택된 도표를 나타낸다.

도 16은 종양 g당 국소화된 항체의 ng으로 표현된, 항체 ST2485 및 ST2146의 생체 내 부가성을 나타낸다.

도 17은 ST2485의 경쇄의 가변 부위(VL)의 서열식별번호:1 서열을 나타낸다. 암호화된 아미노산 서열을 서열식별번호: 2로 나타낸다.

도 18은 ST2485의 중쇄의 가변 부위(VH)의 서열식별번호:3 서열을 나타낸다. 암호화된 아미노산 서열을 서열식별번호: 4로 나타낸다.

본 발명자들은 경쇄 및 중쇄 가변 부위 서열이 각각 하이브리도마 세포주 cST2485로부터 생성된 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 3인, ST2485라 칭하는 신규의 항 인간 테나신 항체를 제조하였다. 상기 항체는 인간 테나신의 A_(1-4)-D 부위 내에서 항원 에피토프에 결합할 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 단백질 분해 단편은 인간 테나신의 A_(1-4)-D 부위 내에서 항원 에피토프에 결합할 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 재조합 유도체를 당해 분야의 전문가들에게 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 수득한다. 바람직한 재조합 유도체는 쥐의 일정 부위가 그의 인간 대응물, 또는 생물학적으로 또는 약리학적으로 활성인 성분, 또는 아비딘 계열의 일원에 의해 대체된 것이다.

본 발명에 따라, 접합 유도체를 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 수득한다.

바람직한 접합 유도체는 생물학적으로 활성인 부분이 상기 항체에 결합된 것이다. 생물학적으로 활성인 부분의 예로는 종양 지향된 면역학적 효과기를 자극하는데 유용한 성장 인자(예를 들어 G-CSF, GM-CSF)인 아비딘 계열의 일원, 약리학적으로 활성인 부분, 예를 들어 독소, 초항원, 사이토킨, 또는 치료학적 항암 효과, 항암 약물 및 방사성 동위원소를 증강시키는데 유용한 임의의 다른 단백질이 있다.

상기 재조합 및 접합 유도체의 제조에 대한 추가의 정보에 대해서 WO 03/072608을 참조하시오.

본 발명에 따라, 상기 단클론 항체의 재조합 또는 접합 유도체를 또한 "유도체"라 칭한다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 항체, 그의 단편 및 유도체를 비오틴화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 항체, 그의 단편 및 유도체는 또한 유리하게는 추가의 마커 및 진단제를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같은 단클론 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 DNA를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 DNA를 함유하는 벡터, 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.

벡터 및 숙주 세포는 당해 분야에 속하는 상식의 범위 내에 있다.

본 발명은 또한 뉴클레오타이드 서열 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 3 또는 그의 단편 및 상기를 암호화하는 DNA에 의해 암호화되는 단백질을 포함한다.

본 발명은 또한 상기 언급한 항체의 특이적인 CDR(상보성 결정 부위) 및 상기 CDR을 함유하는 단백질을 포함한다.

본 발명에 따른 항체의 제조 방법은 하기의 단계들로 이루어진다:

a) 동물, 바람직하게는 마우스를 인간 테나신의 A_(1-4)-D 단편으로 면역시키고;

b) 상기 동물의 체 비장 세포를 면역글로불린을 생산하지 않는 골수종 세포와 융합시키고;

c) 단클론 항체를 선택한다.

단클론 항체 ST2485는 상기 정의한 하이브리도마 세포주 cST2485로부터 생산된다.

본 발명에 따라, 임의로 비오틴화된 항체 또는 그의 단편 또는 그의 유도체를 테나신의 발현을 특징으로 하는 질병의 치료 및 진단에 유용한 약학적 생성물의 제조에 사용한다. 특히, 상기 질병은 종양이며, 보다 특히 신경아교종, 유방암, 폐암, 섬유육종 및 편평 세포 암종을 포함한다.

하나의 바람직한 태양에서, 상기 언급한 약학적 생성물을 국제 출원 WO 03/07268에 개시된 충실성 종양의 2 단계 수술중 요법에 사용한다. 이러한 유형의 요법에서, 상기 비오틴화된 항체를 투여한 다음 아비딘을 투여하여, 실제적인 후속 항암제에 대한 "인공 수용체"를 구성한다. 이 경우, 상기 항암제는 비오틴(상기 항암제와 착체를 형성하기에 적합한 화학적 화합물 중에 함유되고 이후부터 비오틴 화합물로서 지칭될 것이다)에 의해 전달될 것이며 수술 후 단계에서 전신 투여될 것이다. 상기 비오틴은 실제로 아비딘이 존재하는 곳에만 국한될 것이며 이 경우 우리는 치료에 관심을 갖는 영역 중에 아비딘[즉 수술 중에 수 시간 전(예를 들어 4 내지 72 시간)에 외과의에 의해 도입된다]이 존재할 것을 확신할 수 있다.

이는 1 차 종양의 제거와 보조 요법 사이에 경과하는 시간을 극적으로 감소시킨다는 점에서 이롭다.

본 발명의 산업적인 태양에 관해서, 본 발명에 개시된 항체를 약학 분야에서의 통상적인 실시에 따라 약학 조성물 또는 치료 또는 진단 키트에서 적합하게 제형화할 것이다.

약학 조성물 및 키트는 전적으로 당해 분야에 통상적인 유형의 것이며 심지어 단지 상식을 토대로 당해 분야의 숙련가에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물의 예는 본 발명에 인용된 참고문헌들에 제공되어 있다. 이는 키트도 마찬가지이다. 특히 바람직한 것은 상기 언급한 파가넬리 등에 의한 연구 및 EP 0 496 074, WO 02/066075, WO 03/072608, 및 WO 03/075960에 개시된 바와 같은 종양 방사선면역요법용 키트이다. 상기 방사선면역요법 키트의 특정한 사용을 WO 03/069632에 개시된 장치를 사용하여 실행할 수 있다.

임의로 비오틴화된 상기 항체 또는 그의 유도체 또는 단편을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 비히클의 혼합물로 함유하는 약학 조성물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 5 개의 바이알, 즉 임의로 비오틴화된 항체 또는 그의 단편 또는 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체를 함유하는 바이알 1; 아비딘을 함유하는 바이알 2; 스트렙트아비딘을 함유하는 바이알 3; 비오틴화된 인간 알부민을 함유하는 바이알 4; 및 비오틴 DOTA를 함유하는 바이알 5를 함유하는 전신 방사선면역요법, 특히 3 단계 예비 표적화 방사선면역요법용 키트를 공급한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 키트는 부위 이동 방사선면역요법을 위한 것이며 상기 전신용 키트의 바이알 1, 2 및 5와 동일한 3 개의 바이알을 함유한다.

특히 바람직한 실시태양에서, 비오틴 DOTA를 함유하는 바이알에서, 상기 비오틴 DOTA는 하기 화학식 I의 화합물이다:

상기 식에서,

Q는 -(CH₂)_n- 그룹이고, 여기에서 n은 4 내지 12의 정수이며, 이 경우 R'는 존재하지 않거나, 또는

Q는 -(CH₂)_a-CH(R')_b-(CH₂)_b-로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 a 및 b는 독립적으로 0 내지 n의 정수이고, R'는 하기 정의하는 바와 같거나, 또는

Q는 사이클로헥실, 페닐이고, 이 경우 R'는 사이클로헥실 또는 페닐 고리 상의 치환체이고;

R은 수소 또는 -Λ이고, 여기에서 -Λ는 하기 화학식 II의 마크로사이클이고:

[상기 식에서,

다양한 Y들은 동일하거나 상이할 수 있으며, 수소, 직쇄 및 분지된 C₁-C₄ 알킬, -(CH₂)_m-COOH로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 m은 1 내지 3의 정수이고,

X는 수소 또는 그룹 -CH₂-U이고, 여기에서 U는 메틸, 에틸 및 p-아미노페닐로 이루 어진 그룹 중에서 선택되거나, 또는

X는 그룹-(CHW)_o-Z이고, 여기에서 o는 1 내지 5의 정수이고, W는 수소, 메틸 또는 에틸이며, Z는 O, N-R₁(이때 R₁은 수소 또는 직쇄 또는 분지된 C₁-C₄ 알킬이다) 및 S 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 5- 또는 6-원 헤테로사이클릭 그룹이거나, 또는 Z는 -NH₂, -NH-C(=NH)-NH₂ 및 -S-R₂(이때 R₂는 직쇄 또는 분지된 C₁-C₄ 알킬이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

p는 2 또는 3의 수이다];

R'는 수소, 직쇄 또는 분지된 C₁-C₄ 알킬, -(CH₂)_q-T(여기에서 T는 -S-CH₃, -OH, -COOH로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, q는 1 또는 2의 수이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

R"는 하기의 조건에 따라, R'와 동일한 의미를 갖는다, 즉 R이 -Λ일 때, R"는 수소이고; R이 수소일 때, R"는 -Λ이거나, 또는 R 및 R"가 각각 -(CH₂)_r-Λ(R의 경우)(이때 r은 4 내지 12의 정수이다) 및 -Λ(R'의 경우)이고, Q는 -(CH₂)_n- 그룹이며, 이때 n은 4 내지 12의 정수이다.

상기 화합물들은 WO 02/066075에 개시되어 있다.

특히 바람직한 실시태양에서, 아비딘을 함유하는 바이알에서, 상기 아비딘은 2 분자의 아비딘이 수베레이트에 의해 -NH₂ 그룹을 통해 결합된 아비딘 이량체이거나, 또는 2 분자의 아비딘이 분자량 3,400의 폴리에틸렌 글리콜에 의해 -COOH 그룹 을 통해 결합된 아비딘 이량체이다(WO 03/075960에 개시되어 있음).

본 발명에 따른 키트에서, 임의로 비오틴화된 항체, 그의 단백질 분해 단편, 그의 유도체는 바람직하게는 상기 단백질의 EGF 유사 부위를 표적화하는 다른 항 테나신 항체들과 함께 존재하거나, 또는 다른 종양 특이 항체와 함께 존재할 수 있다.

본 발명의 모든 태양들은 테나신을 발현하는 종양의 치료에 적용되는 것 이외에, 종양의 진단 및 특히 종양 면역국소화 과정, 예를 들어 영상화에도 또한 적용된다. 본 발명의 또 다른 목적은 임의로 비오틴화된 및/또는 방사성 표지된 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 유도체를 함유하는, 바람직하게는 주입에 적합한 바이알 형태의 용기이다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 항체 또는 그의 단편, 재조합 유도체, 또는 동족체를 순환하는 테나신의 수준 및 특히 A_(1-4)-D 부위를 함유하는 동형(isoform)을 측정하기 위해서 제 2의 테나신 특이 항체와 함께, 샌드위치 유형 생체 외 ELISA 분석에, 상기 제 2의 항체가 테나신의 제 2의 항원 에피토프에 결합하는 조건으로 사용한다.

하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.

실시예 1

BC-2 특이성을 갖지만 비 작용성 경쇄를 생성시키지 않는 신규의 하이브리도 마를 제조하기 위해서, Balb/c 마우스를 BC-2에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 인간 테나신의 A_(1-4)-D 단편으로 면역시켰다(Siri, A., et al., Nucl. Acid Res., 19(3):525-531, 1991; Balza, E., et al., FEBS, 332:39-43, 1993). 인간 테나신 C의 도식적인 표현 및 BC-2 유사 항체를 생성시키기 위해 채택된 전략을 도 1에 예시한다. Tn(A_(1-4)-D) 단편으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 표준 방법(Cianfriglia, M., et al., Methods Enzymol., 121:193-210, 1986)에 따라 면역글로불린 Sp2/0-Ag14를 생성시키지 않는 골수종 세포와 융합시키고, 수득된 하이브리도마 집단을 SK-Mel 28 인간 흑색종 세포(ICLC HTL99010)로부터 정제된 테나신에 대해 ELISA 시험을 사용하여 선별하였다. 항 테나신 항체를 분비하는 하이브리도마를 FCS를 함유하는 생육 배지에서 제한 희석에 의해 2 회 클로닝하고 동물 기원의 단백질 비 함유 배지에서 2 회 클로닝하였다(Animal Derived Component Free Medium HyClone, HyQR Perbio).

ST2485 기준 물질의 생산을, cST2485 하이브리도마 세포를 2 리터 생물반응기에서 배양하고; cST2485 포스트 프로덕션 셀 뱅크(PPCB)의 서브클로닝물을 2 회 연속 제한 희석하여 서브클론 cST2485/A3e/A12f(마스터 셀 뱅크(MCB) 및 워킹 셀 뱅크(WCB)의 생산에 사용된다)를 선택함으로써 성취하였다.

ST2485는 IgG1/k 아이소타입의 마우스 면역글로불린이다.

도 2는 환원 및 비 환원 조건 하의 항체 ST2485의 SDS-PAGE(a,b) 및 웨스턴 블럿(c,d) 분석을 나타낸다. 환원 조건(b,d) 하에서, 상기 항체의 경쇄 수준에서 이중 밴드가 관찰되며; 웨스턴 블럿 분석은 상기 두 밴드가 면역글로불린의 경쇄로서 면역반응성임을 입증한다. 도 3에 나타낸 항체 ST2485의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 분석은 약간 비대칭인 피크를 통해 상기 항체의 가벼운 이종성을 확인한다. 동일한 분석에서, 다른 한편으로, 항체 BC-2는 분명한 이종 프로파일을 나타내며, 여기에서 3 개의 피크가 구분될 수 있는데, 이 중에서 단지 피크 1만이 완전히 작용성인 동종 항체에 해당한다.

항체 ST2485의 이종성의 성질을 규정하기 위해서, 상기 항체의 샘플에 대해 효소 PNGaseF(플라보박테리움으로부터의 펩티드-N-글리코시다제)에 의한 N-글리코사이드 잔기의 절단을 수행하였다. 상기 효소 절단을 제조자에 의해 지시된 조건 하에서 프로자임 탈글리코실화 키트(cat. N°GE51001)를 사용하여 수행하였다, 즉 대략 8 ㎍의 ST2485 및 5 mU의 효소를 37 ℃에서 밤새 10 ㎕의 반응 혼합물 중에서 반응시켰다. 절단 및 절단되지 않은 항체 ST2485를 환원 조건 하에서 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에 적용시켰다. 상기 겔을 쿠마씨 브릴리언트 블루로 염색하였다.

상기 절단은 도 4에 예시된 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석에 의해 입증된 바와 같이, 고 분자량 경쇄 밴드를 소실시켰다. 이러한 발견은 항체 ST2485의 2 개의 경쇄 밴드가 상기의 글리코실화(고 분자량) 및 비 글리코실화(저 분자량)된 변체에 해당함을 보인다. 잠재적인 N-글리코실화 부위의 존재가 또한 면역글로불린 cDNA 서열 데이터에 의해 확인되었다(도 17).

카파 경쇄의 가변 부위를 문헌[M. Sassano et al. Nucl. Ac. Res.(1994)22, 1768-1769]에 개시된 바와 같이 항체의 일정 부위를 인식하는 한 쌍의 프라이머(5' GGGAAGATGGATACAGTTGGTG(서열식별번호: 5), 5' CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG)(서열식별번호: 6)를 사용하여 원형으로 된 cDNA에 의해 증폭시켰다.

테나신의 A_(1-4)-D 부위에 결합하는 ST2485는 도 5에 제공된 웨스턴 블럿 분석에 의해 입증된 바와 같이, 특이적이다. 상기 항체는 인간 테나신 및 A_(1-4)-D 단편에 결합하지만, BC-4 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 상기 단백질의 EGF 유사 단편에는 결합하지 않는다.

항체 ST2485는 별개의 에피토프에서, 또는 도 6에 예시된 두 항체들 간의 경쟁적인 ELISA 분석에 의해 입증되는 바와 같이, BC-2와 부분 공유하는 에피토프에서 인간 테나신과 결합한다. 상기 비오틴화된 항체 BC-2는 예비 실험에서 확립된 농도에서 항원 테나신 C(a) 또는 Tn A_(1-4)-D 단편(b)으로 민감하게 한 플레이트 상에서 증가하는 농도의 비오틴화되지 않은 BC-2(곡선 1) 또는 ST2485(곡선 2)와 함께 분배된다. 상기 비오틴화된 항체의 결합을 HRP-스트렙트아비딘 및 관련된 색원체 기질 TMB의 첨가 후에 측정한다. 항체 ST2485는 테나신 C 또는 Tn A_(1-4)-D 단편에 대한 BC-2 결합을 40% 억제시킨다.

ST2485의 면역반응성을 도 7에 도시된 바와 같이 테나신 C 및 Tn A_(1-4)-D 단편에 대한 ELISA 분석에 의해 BC-2와 비교 평가하였다. 항체 ST2485 및 BC-2 및 정상적인 마우스 면역글로불린(nMIgG)을 테나신 C(a) 또는 Tn A_(1-4)-D 단편(b)으로 민감하게 한 플레이트 상에서 증가하는 농도로 분배하였으며; 알칼리성 포스파타제 및 관련된 색원체 기질(pNPP)로 표지한 2 차 항마우스 항체의 첨가는 상기 항체들의 용량 반응 곡선을 측정할 수 있게 하였다. 1.0의 OD를 획득하는데 필요한 ST2485의 양은 전체 테나신(a) 상의 BC-2의 양보다 대략 13 배 더 적고 Tn A_(1-4)-D 단편(b) 상의 BC-2의 양보다 대략 10 배 더 적다.

항체 ST2485의 친화성을 BIAcore 분석에 의해 테나신 C 및 Tn A_(1-4)-D 단편 모두에 대해 평가하였다. 테나신 C에 대해서 ST2485의 KD₁은 9.77 x 10^-10 M(ka₁ = 6.02 x 10⁵; kd₁ = 5.88 x 10^-4)인 반면, BC-2의 KD₁은 2.54 x 10^-7 M(ka₁ = 9.85 x 10³; kd₁ = 2.5 x 10^-3)이다. Tn (A_1-4-D) 단편에 대해서 ST2485의 KD₁은 9.72 x 10^-10 M(ka¹ = 3.28 x 10⁵; kd1 = 3.19 x 10^-4)인 반면, BC-2의 KD₁은 7.39 x 10^-8 M(ka₁ = 2.68 x 10⁴; kd₁ = 1.93 x 10^-3)이다.

비오틴화 후 면역반응성을 유지시키는 것은 예비 표적화에 사용되는 항체에 필수적인 요소를 구성하며, 따라서 비오틴화된 ST2485(8.3 비오틴/분자)의 양상을 ELISA 및 BIAcore 분석에 의해 비오틴화된 BC-2(7.6 비오틴/분자)와 비교 평가하였다. 도 8을 참고로, 비오틴화 및 비오틴화되지 않은 항체 ST2485 및 BC-2, 및 정상적인 마우스 면역글로불린(nMIgG)을 테나신 C(a) 또는 Tn A_(1-4)-D 단편(b)으로 민 감하게 한 플레이트 상에서 증가하는 농도로 분배하였으며; 알칼리성 포스파타제 및 관련된 색원체 기질(pNPP)로 표지한 2 차 항마우스 항체의 첨가는 각각의 비오틴화된 항체의 용량 반응 곡선을 비오틴화되지 않은 것(잔류 면역반응성)과 비교 측정할 수 있게 하였다. 상기 테나신 C에 대한 비오틴화된 ST2485 및 BC-2의 잔류 면역반응성은 각각 76% 및 88%와 같다. Tn A_(1-4)-D 단편 상에서 상기 ST2485 및 BC-2에 대한 잔류 면역반응성은 각각 73% 및 83%이다.

전체 테나신 상의 비오틴화된 항체에 대한 BIAcore 분석은 비오틴화된 ST2485의 경우 KD₁ 친화성 = 2.88 x 10^-9 M(ka₁ = 2.8 x 10⁵; kd₁ = 8.07 x 10^-4)이고 비오틴화된 BC-2의 경우 KD₁ 친화성 = 3.71 x 10^-7 M(ka₁ = 6.0 x 10³; kd₁ = 2.23 x 10^-3)이다. 따라서 비오틴화된 ST2485는 양호한 면역반응성 및 친화성 특성을 유지하여, 비오틴화된 BC-2보다 대략 100 배 더 큰 테나신에 대한 친화성을 보존한다.

다양한 인간 종양(유방, 폐, 위, 결장)에 대한 면역조직화학적 연구는 BC-2에 대해 보고된 바와 유사한, 세포 외 기질의 수준에서의 ST2485의 국소화를 입증하였다(Natali, PG, et al., Int. J. Cancer, 47:811-16, 1991). 이러한 연구는 또한 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 정상적인 마우스 조직에서 발현되는 것을 포함하여, 쥐 테나신과 교차 반응을 생성시키는 ST2485의 능력을 입증하였다. 포르말린으로 고정시킨 LMM3 종양(쥐 유방 암종) 및 정상적인 쥐의 장 단편을 10 ㎍/㎖ 의 ST2485 또는 정상적인 쥐 IgG1 항체(대조군)와 함께 배양하였다. 비오틴화된 2 차 항 마우스 항체 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체(Vectastain Elite ABC 키트)와의 배양 후에, 비색 기질 DAB(Vector)을 첨가하여 테나신에 대한 결합을 검출하였다. 메이어의 헤마톡실린을 사용하여 대조를 수행하였다. 상기 LMM3과 쥐의 장 단편은 ST2485에 양성이나 대조용 항체에는 양성이 아니다. 상기 연구를 BC-2와 비교하여 수행할 수 없었는데, 그 이유는 상기 항체가 파라핀 중에 매몰된 고정된 조직 단편들을 인식하지 못하기 때문이다. 정상 조직에 의해 발현되는 것을 포함하여, 쥐 테나신을 인식하는 ST2485의 능력은 하기에 개시하는 쥐 모델에서 항체 생체 분포 연구에서 획득된 결과들의 유의수준을 향상시킨다.

종양 덩어리 중에 국소화하는 항체의 능력을 평가하기 위해서, 비오틴화된 ¹²⁵I-표지된 ST2485 및 BC-2의 생체 분포 연구를 수행하였다. 상기 연구를 도 10에 도식적으로 나타낸 프로토콜에 따라, 테나신을 발현하는 인간 종양을 이식한 누드 마우스에서 수행하였다.

상기 동물에게 멸균 염수 용액 0.1 ㎖ 중의 4 x 10⁶ 인간 결장 암종 HT-29 세포를 피하 접종하였다. 15일 후에, 상기 종양이 약 200 ㎎의 질량에 도달했을 때, 5 마리 동물의 그룹들에게 ¹²⁵I-BC2, ¹²⁵I-ST2485, 또는 정상 마우스 ¹²⁵I-면역글로불린(nMIg)을 정맥 내 투여하였으며, 이들은 모두 비오틴화되었고(7 내지 9 비오틴/몰) 5 회의 상이한 용량, 즉 멸균 PBS 100 ㎕ 중의 0.2-0.5-1-2-5 ㎍/마우스로 투여하였다. 상기 항체 투여 후 5 일째에, 상기 동물들을 죽이고 혈액, 비장, 신 장, 간 및 종양 샘플을 존재하는 방사능을 측정하기 위해 취하였다. 상기 동물들을 죽이기 24 시간 전에 상기 동물들에게 멸균 PBS 100 ㎕ 중의 아비딘을 항체의 용량보다 100 배 더 큰 용량으로 정맥 내 투여하였다(추적).

도 11 및 11a에 제공된 결과들은 BC-2와 ST2485가 모두 용량(항체의 양을 조직 g 당 주입된 용량의 퍼센트로서 나타낸다: %ID/gr)에 관계없이 종양 중에 특이적으로 국소화함을 나타낸다. 더욱이, ST2485는 분석된 모든 용량에서 BC-2와 비교 시 종양 중에 보다 큰 국소화를 보이며, 항상 보다 큰 종양 대 비 종양 비를 유지한다(도 12 및 12a). 특히 1 ㎍/마우스의 용량에서 종양 중의 ST2485의 축적은 주입된 용량의 16%에 달하는 반면, BC-2의 축적은 분석된 어떠한 용량에서도 5%를 초과하지 않는다. 1 ㎍/마우스의 용량에서, ST2485에 대한 종양:혈액 비는 20(최적 용량)보다 큰 반면, 항체 BC-2의 경우 상기 비는 분석된 어떠한 용량에서도 결코 6을 넘지 않는다. 다른 기관에서, ST2485의 경우 종양 대 비 종양 비는 1 ㎍/마우스의 용량에서 비장, 신장 및 간에 대해 각각 9, 26 및 43이다. 다른 한편으로, BC-2의 경우, 상기 비는 분석된 모든 용량에서 항상 7 미만이다. 상기 종양 대 비 종양 비를 도 12 및 12a에 나타낸다.

PAGRIT(등록상표) 및 IART 방법에서 항 테나신 항체 ST2485 및 ST2146(단백질의 EGF 유사 부위에 국소화된 에피토프를 지향한다(De Santis, R., et al., Br. J. Cancer, 88:996-1003, 2003, WO 03/072608))의 병용 가능성을 평가하기 위해서, 상기 두 항체에 대한 생체 외 및 생체 내 부가성 실험을 수행하였다. 도 13은 테나신 C로 민감하게 한 플레이트 상에서 수행된 2 개의 ELISA 시험에서, 항체 ST2485와 ST2146 간의 에피토프 간섭의 부재(13a) 및 항원에 대한 이들 결합의 부가적인 성질(13b)을 나타낸다. 간섭(a)의 평가를 위해서, 비오틴화된 항체 ST2485를 증가하는 농도로, 포화 농도의 ST2146의 부재(1) 및 존재(2) 하에서 테나신 C로 민감화한 플레이트 상에 분배시켰다: 겹쳐 놓인 곡선 1 및 2는, 테나신에 대한 비오틴화된 ST2485의 결합이 ST2146의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 점에서(이와 역도 마찬가지임; 데이터는 도시 안됨) 상기 두 항체들 간에 에피토프 간섭이 부재함을 가리킨다. 곡선 3은 비오틴화되지 않은 포화 ST2485(대조군)의 존재 하에서 비오틴화된 ST2485를 접종했을 때 획득되는 신호를 나타낸다.

도 13b는 부가성 시험을 나타내며, 여기에서 비오틴화된 항체 ST2485 및 ST2146을 테나신 C로 민감화 한 미세플레이트 상에 별도로 또는 함께 포화 용량으로 분배하였다: 상기 두 항체의 혼합물은 신호들의 합과 같은 신호를 생성하며, 따라서 이는 상기 두 항체의 결합이 부가성임을 입증한다.

상기 두 항체의 생체 외 부가성을 또한 도 14 및 14a에 나타낸 바와 같이 BIACore 분석을 사용하여 분석하였다. 테나신을 문헌[De Santis R.; et al.; Br. J. Cancer, 88:996-1003, 2003]에 개시된 방법에 따라 칩(CM5 센서 칩, Biosense) 상에 고정화시켰다. 제 1 항체의 2 회의 연속적인 주입(a에서 ST2485, c에서 ST2146)을 포화 농도(10 μM)로 투여한 다음, 제 2의 항 테나신 항체(a에서 ST2146; c에서 ST2485)를 주입하였다. 센서사진 a) 및 c)는 상기 두 항체가 각각의 단일 항체에 의해 생성된 공명 신호의 증가에 의해 나타난 바와 같이, 부가적인 방식으로 각각의 에피토프에 결합할 수 있음을 나타낸다. 센서사진 b) 및 d)는 ST2485 및 ST2146 각각의 주입을 나타내며, 이어서 각각의 아이소타입형 대조용 항체 mIgG2b 및 mIgG1을 주입하였다.

상기 두 항체 ST2485 및 ST2146의 부가성 연구를 또한 앞서 개시한 동물 모델에서 생체 내로 수행하였다. 연구 도표를 도 15에 예시하는 반면, 획득된 결과는 도 16에 제공한다(종양 g당 항체 ng으로 나타냄). 상기 데이터는 또한 상기 동물 모델에서 상기 두 항체의 부가성을 입증한다. 상기 두 표지된 항체의 혼합물은 실제로 이론치(상기 두 개별적인 표지 항체의 수학적인 합)의 93%에 달하는 종양 내 축적을 제공한다. 대조용 동물의 그룹을 방사성 표지된 항체와 제 2의 "냉" 항체의 혼합물로 처리하여 임의의 간섭을 피하였다.

카파 경쇄의 가변 부위를 문헌[M. Sassano et al. Nucl. Ac. Res.(1994)22, 1768-1769]에 개시된 바와 같이 항체의 경쇄의 일정 부위를 인식하는 한 쌍의 프라이머(5' GGGAAGATGGATACAGTTGGTG 3'(서열식별번호: 5), 5' CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG 3')(서열식별번호: 6)를 사용하여 원형으로 된 cDNA로부터 출발하여 증폭시켰다.

감마 중쇄의 가변 부위를 문헌[M. Sassano et al. Nucl. Ac. Res.(1994)22, 1768-1769]에 개시된 바와 같이 항체의 중쇄의 일정 부위를 인식하는 한 쌍의 프라이머(5' ATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAG 3'(서열식별번호: 7), 5' GCACAACCACCATACTGAGAAG 3')(서열식별번호: 8)를 사용하여 원형으로 된 cDNA로부터 출발하여 증폭시켰다.

도 17은 ST2485의 경쇄(VL)의 가변 부위의 서열식별번호: 1 서열을 나타낸다.

도 18은 ST2485의 중쇄(VH)의 가변 부위의 서열식별번호: 3 서열을 나타낸 다.

BC-2와 비교된 ST2485의 비교 특성화는 항체 ST2485가 하기의 특징들을 가짐을 입증한다:

-BC-2의 에피토프에 가깝거나 또는 상기와 부분적으로 겹치는, 인간 테나신의 A_(1-4)-D 부위 내에서 에피토프를 인식하고;

-관찰된 이종성이 경쇄 글리코실화 변체에 기인한다는 점에서, 경쇄 및 중쇄의 조성에 대해 동종 항체이고;

-BC-2보다 더 면역반응성이고;

-BC-2보다 더 큰 항원 친화성을 갖고;

-비오틴화 후 면역반응성의 유지에 관하여 BC-2에 필적할만하고;

-동물 모델에서 종양 국소화에 관하여 BC-2보다 우수하고;

-생체 외 및 생체 내 동물 모델 모두에서 테나신 C에 대해 항 테나신 단클론 항체 ST2146과 부가적인 방식으로 결합한다.

참고문헌

<110> TECNOGEN S.c.p.A. <120> ANTI-HUMAN TENASCIN MONOCLONAL ANTIBODY <130> PCT-9110 <150> RM2004A000105 <151> 2004-02-27 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 1 atg gat ttt caa gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt gct tca 48 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc aac 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Asn 35 40 45 tca agt gta cgt ttc atg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc 192 Ser Ser Val Arg Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tat tct gtc aca atc 288 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Val Thr Ile 85 90 95 agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg 336 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 agt agt aat tca ccc agg acg ttc ggt gga ggc acc aag gtg gaa atc 384 Ser Ser Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 aga cgg gct 393 Arg Arg Ala 130 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Asn 35 40 45 Ser Ser Val Arg Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Val Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Arg Arg Ala 130 <210> 3 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <400> 3 atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cac tct gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct gga gct tca atg aag att tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 act ggc tac acc atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt 192 Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu 50 55 60 gaa tgg att gga ctt att aat cct cac aat ggt ggt act acc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc aac 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt aca aga ccc ggg ggt tac tac tgg ttc ttc gat gtc tgg 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Gly Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 115 120 125 ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 414 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 4 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Gly Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 115 120 125 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gggaagatgg atacagttgg tg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 caagagcttc aacaggaatg ag 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 atggagttag tttgggcagc ag 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcacaaccac catactgaga ag 22

Claims

경쇄 및 중쇄 가변 부위 서열이 각각 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2인, 바람직하게는 쥐의 항 인간 테나신 단클론 항체, 인간 테나신의 A_(1-4)-D 부위 내에서 항원 에피토프에 결합할 수 있는 그의 단백질 분해 단편, 인간 테나신의 A_(1-4)-D 부위 내에서 항원 에피토프에 결합할 수 있는 그의 재조합 유도체, 그의 접합체 및 유사한 작용성 동족체.
제 1 항에 있어서,

추가의 마커 및 진단제를 임의로 함유하는 항체의 단편.
제 1 항에 있어서,

쥐의 일정 부위(constant region)가 그의 인간 대응물에 의해 대체된 항체의 재조합 유도체.
제 1 항에 있어서,

쥐의 일정 부위가 생물학적으로 활성인 성분에 의해 대체된 항체의 재조합 유도체.
제 1 항에 있어서,

쥐의 일정 부위가 약리학적으로 활성인 성분에 의해 대체된 항체의 재조합 유도체.
제 1 항에 있어서,

쥐의 일정 부위가 아비딘 계열의 일원에 의해 대체된 항체의 재조합 유도체.
제 1 항에 있어서,

생물학적으로 활성인 물질과 접합된 항체의 유도체.
제 1 항에 따른 비오틴화된(biotinylated) 항체 또는 제 2 항에 따른 비오틴화된 단편 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 비오틴화된 유도체.
제 1 항에 따른 항체 또는 제 2 항에 따른 단편을 암호화하는 DNA.
제 9 항에 따른 DNA를 함유하는 벡터.
제 10 항에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포.
뉴클레오타이드 서열 서열식별번호: 1 및 서열식별변호: 2 또는 그의 단편에 의해 암호화된 단백질.
제 12 항에 따른 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 DNA.
제 1 항에 따른 항체의 특이적인 CDR(상보성 결정 부위) 또는 상기 CDR을 함유하는 단백질.
부다페스트 조약의 규정에 따라 2003년 11월 12일에 기탁 번호 PD03003으로 센트로 디 바이오테크놀로지 아반자테(the Centro di Biotecnologie Avanzate, Largo Rossana Benzi 10, Genoa, Italy)에 기탁된, 제 1 항에 따른 항체를 생산하는 하이브리도마.
a) 동물을 인간 테나신의 A_(1-4)-D 단편으로 면역시키고;

b) 상기 동물의 체 비장 세포를 면역글로불린을 생산하지 않는 골수종 세포와 융합시키고;

c) 단클론 항체를 선택함

을 포함하는, 제 1 항에 따른 항체의 제조 방법.
테나신의 발현을 특징으로 하는 질병의 치료 또는 진단에 유용한 약학적 생 성물의 제조를 위한, 임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오틴화된 유도체의 용도.
제 17 항에 있어서,

질병이 종양인 용도.
제 18 항에 있어서,

종양이 신경아교종, 유방암, 폐암종, 섬유육종 및 편평 세포 암종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
충실성 종양의 2 단계 수술중 요법에 유용한 약학적 생성물의 제조를 위한, 임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오틴화된 유도체의 용도.
임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오틴화된 유도체를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 및/또는 부형제와의 혼합물로 포함하는 약학 또는 진단 조성물.
임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 비오틴화된 유도체를 함유하는 바이알 1; 아비딘을 함유하는 바이알 2; 스트렙트아비딘을 함유하는 바이알 3; 비오틴화된 인간 알부민을 함유하는 바이알 4; 및 비오틴 DOTA를 함유하는 바이알 5의 5 개의 바이알로 이루어진, 전신 방사선면역요법, 특히 3 단계 예비 표적화 방사선면역요법용 키트.
임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 비오틴화된 유도체를 함유하는 바이알 1; 아비딘을 함유하는 바이알 2; 및 비오틴 DOTA를 함유하는 바이알 3의 3 개의 바이알로 이루어진 부위 이동(locoregional) 방사선면역요법용 키트.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,

각각 바이알 5 또는 바이알 3 중의 비오틴 DOTA가 하기 화학식 I의 화합물인 키트:

화학식 I

상기 식에서,

Q는 -(CH₂)_n- 그룹이고, 여기에서 n은 4 내지 12의 정수이며, 이 경우 R'는 존재하지 않거나, 또는

Q는 -(CH₂)_a-CH(R')_b-(CH₂)_b-로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 a 및 b는 독립적으로 0 내지 n의 정수이고, R'는 하기 정의하는 바와 같거나, 또는

Q는 사이클로헥실, 페닐이고, 이 경우 R'는 사이클로헥실 또는 페닐 고리 상의 치환체이고;

R은 수소 또는 -Λ이고, 여기에서 -Λ는 하기 화학식 II의 마크로사이클이고:

화학식 II

[상기 식에서,

다양한 Y들은 동일하거나 상이할 수 있으며, 수소, 직쇄 및 분지된 C₁-C₄ 알킬, -(CH₂)_m-COOH로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 m은 1 내지 3의 정수이고,

X는 수소 또는 그룹 -CH₂-U이고, 여기에서 U는 메틸, 에틸 및 p-아미노페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나, 또는

X는 그룹-(CHW)_o-Z이고, 여기에서 o는 1 내지 5의 정수이고, W는 수소, 메틸 또는 에틸이며, Z는 O, N-R₁(이때 R₁은 수소 또는 직쇄 또는 분지된 C₁-C₄ 알킬이다) 및 S 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 5- 또는 6-원 헤테로사이클릭 그룹이거나, 또는 Z는 -NH₂, -NH-C(=NH)-NH₂ 및 -S-R₂(이때 R₂는 직쇄 또는 분지된 C₁-C₄ 알킬이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

p는 2 또는 3의 수이다];

R'는 수소, 직쇄 또는 분지된 C₁-C₄ 알킬, -(CH₂)_q-T(여기에서 T는 -S-CH₃, -OH, -COOH로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, q는 1 또는 2의 수이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

R"는 하기의 조건에 따라, R'와 동일한 의미를 갖는다, 즉 R이 -Λ일 때, R"는 수소이고; R이 수소일 때, R"는 -Λ이거나, 또는 R 및 R"가 각각 -(CH₂)_r-Λ(R의 경우)(이때 r은 4 내지 12의 정수이다) 및 -Λ(R'의 경우)이고, Q는 -(CH₂)_n- 그룹이며, 이때 n은 4 내지 12의 정수이다.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,

바이알 3이, 2 개의 아비딘 분자가 수베레이트에 의해 -NH₂ 그룹을 통해 결합된 아비딘 이량체를 함유하는 키트.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,

바이알 3이, 2 개의 아비딘 분자가 분자량 3,400의 폴리에틸렌 글리콜에 의해 -COOH 그룹을 통해 결합된 아비딘 이량체를 함유하는 키트.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,

임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오 틴화된 유도체를 바람직하게는 단백질의 EGF 유사 부위를 표적화하는 다른 항 테나신 항체와 병용하는 키트.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,

임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오틴화된 유도체를 다른 종양 특이 항체와 병용하는 키트.
종양 면역국소화 과정에 유용한 조성물의 제조에서, 임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오틴화된 유도체의 용도.
임의로 비오틴화된 및/또는 방사성 표지된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오틴화된 유도체를 함유하는, 주입에 적합한, 바람직하게는 바이알 형태의 용기.
종양에 걸린 사람 또는 종양에 걸린 것으로 의심이 가는 사람에게 임의로 비오틴화된 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 그의 재조합 유도체 또는 그의 접합체 또는 동족체, 또는 임의로 비오틴화된 제 2 항에 따른 그의 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 그의 비오틴화된 유도체를 투여하고, 상기 종양을 검출함을 포함하는 종양 영상화 방법.
제 31 항에 있어서,

항체 또는 그의 단백질분해 단편 또는 재조합 유도체 또는 접합체 또는 동족체를 방사성 표지하는 방법.
제 1 항에 따른 항체 또는 그의 단백질 분해 단편 또는 재조합 유도체 또는 접합체 또는 동족체, 또는 제 2 항에 따른 단편, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 유도체, 및 제 2의 테나신 특이 항체를 함유하는 조합.
순환하는 테나신 수준, 특히 A_(1-4)-D 부위를 함유하는 동형(isoform)의 수준을 측정하기 위한 샌드위치 유형 생체 외 ELISA 분석에서, 제 2의 항체가 제 2의 항원 에피토프에 결합하는 조건 하의 제 33 항에 따른 조합의 용도.