KR20060120835A - 다관능성 양친매성 고분자 공중합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

다관능성 양친매성 고분자 공중합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20060120835A
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Abstract

본 발명은 다관능성 양친매성 고분자 공중합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린을 결합한 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체는 소수성 약물을 탑재한 미셀형태로 제조시 지속적인 약물 방출 효과를 얻을 수 있다.
테트로닉, 카프로락톤, 헤파린, 공중합체, 접합체, 미셀, 약물, 성장 인자

Description

다관능성 양친매성 고분자 공중합체 및 이의 제조방법{AMPHIPHILIC COPOLYMER HAVING MULTI FUNCTIONAL GROUP AND PREPARATION METHOD THEREOF}
도 1는 본 발명의 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체의 개념도이다.
도 2은 용매 증발법을 나타낸 개념도이다.
도 3는 본 발명의 약물이 탑재된 테트로닉-카프로락톤 공중합체 미셀의 개념도이다.
도 4는 본 발명의 성장인자가 결합된 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체 미셀의 개념도이다.
도 5은 본 발명의 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체 미셀의 개념도이다.
도 6은 실시예 1의 테트로닉-카프로락톤 공중합체의 NMR 분석결과이다.
도 7은 실시예 1 및 실시예 2의 테트로닉-카프로락톤 공중합체과 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체의 IR분석 결과이다.
도 8는 실시예 2의 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체의 NMR 분석결과이다.
도 9은 테트로닉-카프로락톤 공중합체의 임계미셀 농도 분석 결과이다.
도 10은 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체의 임계미셀 농도 분석 결과이다.
도 11는 테트로닉, 테트로닉-카프로락톤 접합체, 테트로닉-카프로락톤-헤파린 미셀의 약물 방출 실험 결과이다.
도 12는 테트로닉-카프로락톤-헤파린 미셀의 성장인자 방출 실험 결과이다.
본 발명은 지속적인 약물 방출과 약효를 얻을 수 있는 미셀의 기초를 이루는 공중합체, 이의 미셀 및 이들의 제조방법에 관한 것으로, 특히 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 공중합체 및 이의 제조방법, 헤파린이 결합된 형태의 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 공중합체 및 이의 제조방법과 이들의 미셀 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
종래의 약물 전달체로서 응용이 가능하고 미셀(micelle)을 제조할 수 있는 양친매성 고분자로, 하기 화학식 1의 테트로닉(Tetronic®)이 잘 알려져 있다.
(화학식 1)
Figure 112005026893546-PAT00001
이 고분자는 중앙에 네 개의 팔을 가진 에틸렌 디아민(ethylene diamine)과 소수성 사슬인 폴리프로필렌 옥사이드(PPO; Polypropylene Oxide)로 이루어져 있 고, 곁가지에는 친수성 사슬인 폴리에틸렌 옥사이드(PEO; Polyethylene Oxide)로 이루어진 멀티 기능기를 가진 플로닉(Pluronic 계열)의 polymer이다. 이러한 소수성/친수성 균형은 계면 활성제로써 일정한 농도 이상(CMC, Critical Micelle Concentration)의 수용액상에서 자발적으로 미셀(micelle)의 형태를 가지게 할 뿐 아니라 농도가 20 중량% 이상이 되면 일정한 온도(LCST, Lower Critical Solution Temperature)에서 상전이 거동을 보이는 특성을 갖는다. 이러한 소수성/친수성 비율은 다양하게 조절할 수 있으며 비율에 따라 다른 물성과 상전이 거동, CMC를 갖는다. 특히 연구에서 사용되는 Tetronic 1307은 소수성/친수성 비율이 FDA에서 생체 내의 안정성을 승인을 받은 F127이라는 플로닉(pluronic)과 유사하다.
그러나 이러한 폴리프로필렌 옥사이드를 소수성 사슬로 가지고 있는 테트로닉/플로닉(tetronic/pluronic) 계열의 고분자 미셀은 안정성이 약하다는 문제점을 지적받아 왔다.
한편, 종래의 약물에 있어서 소수성 약물은 그 자체를 운반체에 높은 효율로 담기게 하기 어려우며, 방출도 즉시 이루어져 약물 투입에 대한 치료 등에 상당한 문제를 제공한다.
또 다른 한편으로, 헤파린(heparin)은 생체 활성화 분자(bioactive molecule)로 알려져 있으며, 생체 조직이나 세포의 분화에 직접적인 신호를 주는 성장인자와 결합하는 특성을 가지고 있어 주위 조직의 상처치유나 회복을 도와주고, 헤파린 자체가 ECM(Extra Cellular Matrix)의 성분이기 때문에 고분자의 생체 친화력을 높여준다고 알려져 있다. 또한 성장인자는 헤파린과 결합하면서 생리적 으로 안정한 형태로 변하는 것으로 알려져 있고 이후 세포의 수용체와 결합하여 분화와 증식을 유도하는 신호를 전달하게 된다.
이러한 특성을 이용, 지지체나 미립구 형태의 약물 전달체에 헤파린을 도입하여 성장인자를 전달하는 연구는 보고 되고 있으나 미셀을 이용하여 헤파린과 성장인자를 전달하는 연구는 보고된 바 없다. 종래의 기술을 이용한 방법들은 헤파린의 활성을 나타내는데 중요한 역할을 하는 카르복실기(carboxyl group)와 설폰산기(sulfonic acid group)를 화학결합에 이용하거나, 화학결합을 이용하지 않는 경우에도 일정한 담체에 물리적으로 함유시키기 때문에 활성부분이 가려져 생리활성이 크게 저하되는 문제점이 있다. 또한 종래의 기술을 이용하는 경우 전달체를 제조하는 과정에서 생리활성물질의 손실이 일어나는 경우가 많다.
종래의 성장인자 방출 시스템의 경우 조직공학에 응용되어 다공성 생분해성 지지체나 젤 지지체의 효과를 극대화하기 위하여 성장인자와 세포를 함께 응용하게 되는데, 이때 염증반응에 의한 부작용이 발현되어 이를 해결하기 위한 소수성 약물의 도입이 필요하다.
따라서 헤파린의 생리활성을 저하시키지 않고 헤파린을 약물 전달 고분자에 결합시켜, 성장인자를 안정하게 전달하며 소수성 약물을 함유하는 새로운 형태의 약물 전달체의 개발이 필요하다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 고려하여, 체내 흡수가 잘 안되는 소수성 약물을 체내에 잘 전달할 수 있는 약물 전달체로서, 극히 안정한 고분자 미셀 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 고분자 미셀의 기본 물질인 고분자 또는 접합체 및 이들의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 헤파린 결합 단백질들과 헤파린의 전기적 결합을 유도하여 본래의 소수성 약물을 전달함과 동시에 친수성인 성장인자를 체내에 안정적으로 전달할 수 있게 하기 위하여 생리활성을 저하시키지 않고 헤파린을 결합시킨 접합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은
생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체를 제공한다.
또한 본 발명은
(a) 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 제1소수성 블록 단량체, 폴리(프로필렌옥사이드)로 구성되는 제2소수성 블록 단량체 및 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록 단량체를 혼합하는 단계; 또는
폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 소수성 블록 단량체와 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록 단량체를 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 혼합물을 110 내지 180℃의 온도 및 6 내지 20시간 동안 중합하는 단계
를 포함하는 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은
소수성 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체 미셀(micelle)을 제공한다.
또한 본 발명은
(a) 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여서 미셀(micelle)을 형성시키는 단계; 및
(b) 상기 미셀에 소수성 약물 용액을 투입하는 단계
를 포함하는 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체 미셀(micelle) 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은
생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate)를 제공한다.
또한 본 발명은
(a) 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 다관능기를 활성화시키는 단계; 및
(b) 상기 활성화된 다관능성 양친매성 고분자 중합체의 다관능기에 헤파린을 결합시키는 단계
를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은
생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate)에 소수성 약물이 탑재된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체 미셀(micelle)을 제공한다.
또한 본 발명은
(a) 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여서 미셀(micelle)을 형성시키는 단계; 및
(b) 상기 미셀에 소수성 약물 용액을 투입하는 단계를 포함하는 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체 미셀(micelle) 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은
생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate)에 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle)을 제공한다.
또한 본 발명은
생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 양친매성 헤파린 접합체(conjugate)에 소수성 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle)을 제공 한다.
또한 본 발명은
(a) 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여서 미셀(micelle)을 형성시키는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 미셀에 소수성 약물 용액을 투입하고 성장 인자를 투입하여 배양하는 단계
를 포함하는 소수성 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle) 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기에서 언급한 여러 가지 타입의 미셀을 포함하는 주입형 생체재료, 세포, 또는 약물 전달체를 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 카프로락톤 등과 같은 생분해성 고분자를 테트로닉 등과 같은 다관능기를 갖는 다관능성 고분자와 공중합시키거나 또는 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 폴리락타이드 등과 같이 다관능기를 갖는 생분해성 고분자와 공중합시킨 결과, 고분자 체인의 소수성을 높여서 수용액 상에서 생성되는 미셀의 안정성을 증진시키고, 흡수가 어려운 소수성 약물의 전달체로서 고분자와 약물의 소수성 상호작용을 돕는다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 종래의 양친매성을 갖는 고분자가 미셀 상에서 비교적 약물의 탑재 효율이 낮고 약물 방출시간이 짧다는 것을 개선하기 위하여 생분해성 고분자를 다관능기를 갖는 고분자 말단에 도입시키거나 혹은 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 다관능기를 갖는 생분해성 고분자 말단에 도입시켜 새로운 공중합체를 제조한 것이다. 이 공중합체는 종래의 양친매성을 갖는 고분자에 비하여 저농도에서 미셀을 형성하며 소수성 부분이 많아 더 안정한 미셀을 만든다. 또한 약물 전달체로서의 기능이 우수하며, 말단의 다관능기(하이드록실기)를 이용하여 생리활성물질들을 다양하게 그리고 종래의 양친매성을 갖는 고분자에 비하여 많이 공유결합 할 수 있어 또 다른 고분자인 헤파린을 손쉽게 공유결합시켜 추가적인 접합체(conjugate)를 제조할 수 있다.
본 발명의 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 결합체는 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 다관능성 양친매성 고분자에 헤파린이 결합된 형태이다. 그 개념도를 도 1에 나타내었다.
본 발명에 따른 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 결합체는 생분해성 고분자를 포함하는 다수 개의 관능기를 갖는 다관능성 양친매성 고분자를 제조한 후 각 관능기에 헤파린을 화학적으로 결합시킨 것이다. 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 다관능성 양친매성 고분자는 기존의 다관능성 양친매성 고분자에 생분해성 고분자를 결합시키거나, 생분해성 고분자를 소수성 블록으로 하여 이에 다른 소수성 블록, 친수성 블록을 결합시켜 제조하는 방법이 사용될 수 있으며, 여기서 다관능성 양친매성 고분자는 모두 다수 개의 관능기를 가지고 있다.
상기 생분해성 고분자로는 폴리락타이드, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(락타이드-co-글리코리드), 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리(ε-카프로락톤-co-글 리코리드), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드) 등이 바람직하다.
또한 다관능성 양친매성 고분자는 3개 이상의 관능기를 갖는 것이 바람직하고, 3개 내지 8개의 관능기를 갖는 스타형 고분자형이 더욱 바람직하고, 또한 친수성 블록과 소수성 블록을 갖는 블록공중합체 형태인 것도 바람직하다. 이때, 다관능성 양친매성 고분자는 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 제1소수성 블록, 폴리(프로필렌옥사이드)로 구성되는 제2소수성 블록 및 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 블록공중합체 형태가 바람직하고, 구체적으로는 하기 화학식 2의 구조를 가지는 것이 가장 바람직하다. 또한, 다관능성 양친매성 고분자는 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 소수성 블록과 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 블록공중합체인 것도 바람직하고, 그 예로 하기 화학식 3 내지 6의 구조를 가지는 것을 들 수 있다. 이때 다관능성 양친매성 고분자의 분자량 및 친수성/소수성 비는 다양하게 조절될 수 있다.
Figure 112005026893546-PAT00002
Figure 112005026893546-PAT00003
Figure 112005026893546-PAT00004
Figure 112005026893546-PAT00005
Figure 112005026893546-PAT00006
(상기 화학식 2 내지 6에서,
a는 중합도로서 61 내지 62의 값을 갖고,
b는 중합도로서 19 내지 20의 값을 갖고,
c는 중합도로서 3 내지 21의 값을 갖고,
d는 중합도로서 10 내지 235의 값을 갖고,
e는 중합도로서 25 내지 562의 값을 갖고,
f는 중합도로서 10 내지 518의 값을 갖고,
g는 중합도로서 12 내지 869의 값을 갖고,
h는 중합도로서 16 내지 465의 값을 갖고,
i는 중합도로서 20 내지 375의 값을 갖고,
j는 중합도로서 16 내지 438의 값을 갖고,
k는 중합도로서 20 내지 736의 값을 갖는다.)
상기 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체 제조방법은 (a) 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 제1소수성 블록 단량체, 폴리(프로필렌옥사이드)로 구성되는 제2소수성 블록 단량체 및 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록 단량체를 혼합하는 단계; 또는 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 소수성 블록 단량체와 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록 단량체를 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물을 110 내지 180℃의 온도 및 6 내지 20시간 동안 중합하는 방법이다.
상기 제조방법 중 (a) 단계에 주석계 옥토에이트(Stannous octoate)가 첨가될 수 있으며, 주석계 옥토에이트는 고리열림 중합(ring opening polymerization) 방법으로 고분자 말단 하이드록실기로부터 생분해성 고분자 모노머를 중합시키거나 혹은 에틸렌 글라이콜 모노머를 중합시켜, 다관능성 양친매성 고분자 공중합체(copolymer)를 얻는다. 주석계 옥토에이트의 투입량은 생분해성 고분자 단량체 1몰에 대하여 1x10-5 내지 5x10-2 몰로 투입되는 것이 바람직하다. 이와 같이 제조된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체(copolymer)는 임계미셀 농도 이상으로 물에 가하여 수중에 분산시킬 경우 손쉽게 자발적으로 미셀을 형성한다.
또한 소수성 약물이 탑재된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체 미셀은 다관능기를 갖는 생분해성 다관능성 양친매성 고분자 공중합체(copolymer)를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여서 미셀(micelle)을 형성시킨 후, 이 미셀에 소수성 약물 용액을 투입하는 방법으로 제조할 수 있다.
상기 미셀에 소수성 약물을 용액 상으로 가하면 약물이 미셀의 소수성 중앙부분에 끼어 들어가게 되어 약물이 탑재된다. 약물을 미셀로 투입시키는 방법으로는 도 2에 나타낸 용매 증발법(solvent evaporation method)을 이용하는 것이 바람직하고, 또한 소수성 약물 용액 용매에 있어서 그 용매는 메탄올, 에탄올 등이 바람직하다. 이 미셀은 소수성 약물에 대하여 상당히 높은 탑재효율을 나타내며, 방출거동도 서서히 지속적으로 나타낸다. 이 미셀의 크기는 187 내지 188 ㎚가 바람직하다.
미셀에 탑재될 수 있는 소수성 약물로는 물에 대한 용해도가 10 ㎎/㎖ 이하 인 난용성 약물 중 파클리탁셀, 케토코나졸, 이트라코나졸, 사이클로 스포린, 시사프라이드, 아세트아미노펜, 아스피린, 아세틸살리실산, 인도메타신, 나프로센, 와파린, 파파베린, 티오아벤 다졸, 미코나졸, 시나리진, 독소루비신, 오메프라졸, 콜레칼시페롤, 멜팔란, 니페디핀, 디곡신, 벤조산 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 아즈트레오남, 이부프로펜, 펜옥시메틸페니실린, 탈리도마이드, 메틸테스토스테론, 프로클로르페라진, 히드로코티손, 디데옥시퓨린 뉴클레오사이드, 비타민 D2, 술폰아미드, 술포닐우레아, 파라아미노벤조산, 멜라토닌, 벤질페니실린, 클로람뷰실, 디아제핀, 디기톡신, 히드로코티손 뷰레이트, 메트로니다졸 벤조산염, 톨부타마이드, 프로스타 글란딘, 플루드로코티손, 그리세오풀빈, 미코나졸 질산염, 류코트라이엔 비포 억제제, 프로프라놀롤, 테오필린, 플러비 프로펜, 벤조산 나트륨, 벤조산, 리보플라빈, 벤조디아제핀, 페노바비탈, 글리뷰라이드, 설파이아진, 설파에틸티아디아졸, 디클로페낙 나트륨, 피니로인, 히오리다진히드로클로라이드, 브로피리민, 히드로클로로티아지드, 플로코나졸, 항생제, 소염 진통제, 마취제, 호르몬류, 고혈압 치료제, 당뇨병 치료제, 고지질증 치료제, 항바이러스제, 파킨슨병 치료제, 치매 치료제, 항 구토제, 면역 억제제, 궤양 치료제, 변비 치료제, 항 말라리아제 등이 바람직하다.
본 발명의 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체의 예로는 테트로닉-카프로락톤-헤파린(tetronic-polycaprolactone-heparin) 접합체(conjugate)가 가장 바람직하며, 이러한 접합체는 테트로닉-카프로락톤 공중합체의 하이드록실기 말단을 카르복실기로 개질한 후, 생리활성물질인 헤파린을 테트로닉-카프로락톤의 말단에 공유 결합시켜 제조할 수 있다. 헤파린이 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체의 개념도를 도 1에 나타내었다.
이 접합체는 소수성의 생분해성 고분자를 이용하여 고분자를 제조한 후 헤파린을 각 관능기에 화학적으로 결합시킨 것으로, 이 때 고분자의 분자량 및 친수성/소수성 비는 다양하게 조절될 수 있으며 헤파린의 관능기 중 아민기(amine group)와 하이드록실기(hydroxyl group)를 이용하여 고분자와의 결합체를 형성한다. 즉, 본 발명의 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체는 셋 이상의 가지를 가지는 고분자의 말단에 헤파린이 공유결합되어 제조되는 것으로, 미셀로 제조될 때 소수성인 생분해성 고분자를 포함시켜 소수성 약물 탑재 시에 그 효율성을 높여주고 약물의 흡수 및 지속적 방출을 도와줄 수 있도록 조절한다. 또한 헤파린을 고분자 말단에 화학결합 함으로써 헤파린과 결합 특성을 갖는 생리활성 물질을 효과적으로 전달할 수 있는 전달체가 된다. 또한 이러한 다관능성 고분자 가지의 수만큼 증가된 기능기의 수에 따라 결합되는 헤파린의 양은 증가하며 이에 따라 향상된 생리활성을 갖는 고분자 미셀이 제조된다.
상기 헤파린은 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 헤파린이 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체의 제조방법을 보다 상세히 설명하면, (a) 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 다관능기를 활성화시키는 단계; 및 (b) 상기 활성화된 다관능성 양친매성 고분자 중합체의 다관능기에 헤파린을 결합시키는 단계로 나눌 수 있다.
헤파린 결합방법으로는 공유 결합 (covalent bonding), 이온성 결합(ionic bonding), 비이온성 결합(nonionic bonding), 물리적인 흡착 (physical absorption), 또는 물리적인 혼합(physical blending)방법이 가능하고, 특히 공유결합은 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 아민기(amine group), 티올기(thiol group), 아지드기(azide group) 반응기를 이용한 공유결합이 바람직하다. 또한 공유결합은 그 형태에 따라 아미드 결합(amide bond); 우레탄 결합(urethane bone)과 같은 비분해성 결합(non-degradable bond); 및 에스테르 결합(ester bond), 안하이드라이드(anhydride bond)과 같은 분해성 결합(degradable bond)의 형태로 분류할 수 있다.
이와 같이 제조된 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체(다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체)는 수중에 분산시킬 경우 임계미셀 농도 이상으로 가하면 손쉽게 자발적으로 미셀을 형성한다.
이러한 테트로닉-카프로락톤-헤파린 접합체 미셀에 성장인자가 결합될 수도 있다. 그 방법을 상세히 설명하면, 테트로닉-카프로락톤-헤파린(tetronic-polycaprolactone-heparin) 접합체(conjugate)를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고, 녹여서 미셀(micelle)을 형성시킨 후 상기 미셀에 성장인자를 투입하고 배양하여 헤파린과 성장인자를 결합시키는 단계로 제조가능하다.
또한, 이 미셀에 소수성 약물을 용액상으로 가하면 약물이 미셀의 소수성 중 앙부분에 끼어 들어가게 되어 약물이 탑재된다. 약물을 미셀 내부로 투입시키는 방법은 도 2에 나타낸 용매 증발법(solvent evaporation method)을 이용하는 것이 바람직하다. 이 미셀은 소수성 약물에 대하여 상당히 높은 탑재효율을 나타내며, 방출거동도 서서히 지속적으로 나타낸다.
상기 소수성 약물로는 물에 대한 용해도가 10 ㎎/㎖ 이하인 난용성 약물 중 파클리탁셀, 케토코나졸, 이트라코나졸, 사이클로 스포린, 시사프라이드, 아세트아미노펜, 아스피린, 아세틸살리실산, 인도메타신, 나프로센, 와파린, 파파베린, 티오아벤 다졸, 미코나졸, 시나리진, 독소루비신, 오메프라졸, 콜레칼시페롤, 멜팔란, 니페디핀, 디곡신, 벤조산 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 아즈트레오남, 이부프로펜, 펜옥시메틸페니실린, 탈리도마이드, 메틸테스토스테론, 프로클로르페라진, 히드로코티손, 디데옥시퓨린 뉴클레오사이드, 비타민 D2, 술폰아미드, 술포닐우레아, 파라아미노벤조산, 멜라토닌, 벤질페니실린, 클로람뷰실, 디아제핀, 디기톡신, 히드로코티손 뷰레이트, 메트로니다졸 벤조산염, 톨부타마이드, 프로스타 글란딘, 플루드로코티손, 그리세오풀빈, 미코나졸 질산염, 류코트라이엔 비포 억제제, 프로프라놀롤, 테오필린, 플러비 프로펜, 벤조산 나트륨, 벤조산, 리보플라빈, 벤조디아제핀, 페노바비탈, 글리뷰라이드, 설파이아진, 설파에틸티아디아졸, 디클로페낙 나트륨, 피니로인, 히오리다진히드로클로라이드, 브로피리민, 히드로클로로티아지드, 플로코나졸, 항생제, 소염 진통제, 마취제, 호르몬류, 고혈압 치료제, 당뇨병 치료제, 고지질증 치료제, 항바이러스제, 파킨슨병 치료제, 치매 치료제, 항 구토제, 면역 억제제, 궤양 치료제, 변비 치료제, 항 말라리아제 등이 바람직하 다.
또한 이처럼 소수성 약물이 탑재된 미셀에 성장인자를 추가로 첨가하면 성장인자가 생분해성 고분자인 헤파린과 결합하여 높은 성장인자의 탑재효율을 나타내며 방출거동도 서서히 지속적으로 나타낼 수 있다. 상기 성장인자로는 섬유아세포성장인자(bFGF), VEGF, TGF-1을 포함하는 헤파린 결합 성장인자(HBGF, heparin binding growth factor); Fibronectin, selectin, vitronetin을 포함하는 헤파린 결합 단백질; PF-4, IL-8을 포함하는 헤파린 결합 케모카인(Chemokines); 보바인 세륨 알부민(BSA), 라이소자임(Lysozyme), 알파-락탈부민(a-lactalbumin), 인슐린(Insulin), 엘-클루타민(l-glutamine)을 포함하는 각종 펩타이드, 혈장 단백질, 효소, 호르몬 등이 바람직하다.
본 발명의 다관능기를 갖는 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체 미셀은 종래의 미셀을 형성하는 계면활성제형 고분자와는 달리 말단의 작용기에 헤파린을 도입하였으며, 다관능기를 가지고 있음으로 인하여 헤파린과 결합될 수 있는 많은 기회를 가지게 된다. 그에 따른 헤파린의 결합량 증가에 의해 주입형 생체재료에 필수적인 생체적합성이 향상되고, 또한 헤파린과 특이적으로 결합가능한 단백질들을 미셀의 외부에 안정하게 함유가 가능하여 종래의 단일약물 탑재 미셀보다 세포 재생 및 약물 전달에 효과적으로 응용될 수 있다는 장점을 가지고 있다.
이러한 헤파린이 결합된 접합체가 약물 전달체 등으로 응용되기 위해서는 생리활성을 가지는 헤파린 함량이 적어도 0.44 ㎍/㎍ 이상이 되어야 한다.
이상 설명한 본 발명의 다관능성 양친매성 고분자 공중합체(copolymer), 다 관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체 및 이들의 미셀을 이용하여 아래 상술할 세가지 대표적인 타입의 형태로 응용이 가능하다.
첫째는 도 3의 개념도와 같이 다관능성 양친매성 고분자 공중합체를 수용액 상에서 소수성 약물과 함께 분산시켜 미셀(micelle)의 소수성 부분에는 약이 함유되고, 친수성 부분은 미셀(micelle)이 나노 크기로 물에 잘 분산되게 도와주어 흡수력을 증진시켜 주는 시스템이다. 또한 미셀(micelle)의 코어(core)와 약물(drug)의 소수성/소수성 인력(interaction)으로 인하여 약물이 효과적으로 운반체에 담기면서 서서히 방출되는 시스템을 구현할 수 있다. 이것은 흡수에 문제가 있는 소수성 약물의 흡수를 돕고 약물의 손실을 최소화하여 지속적인 약물의 효과를 얻을 수 있다.
둘째는 도 4의 개념도와 같이 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체를 상기 다관능성 양친매성 고분자 공중합체와 같은 방법으로 물에 분산시키는데, 이때는 소수성 약물을 넣어주는 것이 아니라 성장인자 (Growth Factor)를 같이 넣어 주어 미셀(micelle)의 헤파린(heparin) 부위(part)에 성장인자가 결합(binding) 되어 있는 형태이다. 이것은 상처의 치유나 조직의 회복이 필요한 부위에 주사기를 이용, 주입(injection)하여 쉽게 응용될 수 있으며, 현재 사용되고 있는 스케폴드(scaffold)나 하이드로겔(hydrogel)과 같이 병행하여 사용되면 세포의 성장이나 분화를 증진시켜 줄 수 있을 것이다. 스케폴드(scaffold)와 하이드로겔(hydrogel)은 현재 회손된 조직에 채워져서 조직이 회복될 때까지 세포가 자랄 공간과 환경을 제공해 주는 장치(device)로 사용되고 있다.
셋째는 도 5의 개념도와 같이 상기 두 번째 응용과 같이 미셀(micelle)을 제조할 때, 첫 번째 응용기술을 도입하는 것이다. 즉, 쉘(shell)부분에는 성장인자가 헤파린(heparin)과 결합한 상태이고, 코어(core)부분에는 조직의 염증이나 통증을 완화시켜주는 소수성 약물을 탑재한 더욱 향상된 시스템으로, 안정하게 세포재생 및 약물 전달에 효과적으로 응용될 수 있는 형태이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명의 내용이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(테트로닉-카프로락톤(tetronic-polycaprolactone) 공중합체(copolymer)의 제조)
앰플에 카프로락톤(ε-caproclactone), 테트로닉(tetronic) 고분자, 주석계 옥토에이트(stannous octoate)를 함께 넣은 후, 60℃의 반응조에서 질소충전과 감압을 반복하여 내부의 수분과 공기를 완전히 제거한 후, 유리 앰플의 입구를 토치로 봉하였다.
이렇게 봉해진 앰플을 110℃의 반응조에서 20시간 동안 반응시켜 Tetronic-PCL 공중합체를 제조하였다. 반응이 종료된 후 앰플 안에 있는 결과물을 클로로포름에 녹인 다음 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 제조된 공중합체 용액을 디에틸 에테르(Diethyl ether)에 투입하여 침전시킨 후, 여과를 통해 공중합체 (tetronic-PCL)를 얻어내고, 감압 건조기 내에서 상온에서 60시간 동안 건조시켜 잔여 용매를 제거하였다.
실시예 2
(테트로닉-카프로락톤-헤파린(tetronic-polycaprolactone-heparin) 접합체(conjugate)의 제조)
1단계 : 카복실기 개질 처리(Carboxylated Tetronic-PCL의 제조)
디옥산(Dioxane) 용매에 Tetronic-PCL를 녹인 후, 석시닉 안하이드라이드(Succinic anhydride), DMAP (Dimethylaminopyridine), TEA (Triethylamine)를 각각 Dioxane 용매에 녹인 다음 순서대로 첨가하여, 30℃, 질소분위기하에서 24시간동안 반응을 진행시켰다. 반응진행 후에는 회전식 증발기를 이용하여 용매를 적당량 날린 후, 클로로포름에 녹이고 여과하여 불순물을 제거하였다. 제조된 공중합체 용액은 디에틸 에테르(Diethyl ether)에 투입하여 침전시킨 후 여과하고, 감압 건조기 내에서 60시간 동안 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 분말상의 Carboxylated Tetronic-PCL 공중합체를 얻을 수 있었다.
2단계 : Tetronic-PCL과 헤파린(heparin)의 결합
0.05M MES(2-(3-morpholino)ethanesulfonic acid) 버퍼(buffer)를 제조하여 pH 5.6에서 반응을 진행하였다. 상기에서 제조된 Carboxylated Tetronic-PCL를 먼저 MES 버퍼(buffer)에 녹인 후, EDC(1-ethyl-3-(-3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide)와 NHS (N-hydroxylsuccinimide)를 15분 간격으로 첨가하였다. 헤파린을 MES 버퍼(buffer)에 녹여서 첨가한 후 30℃에서 24시간 동안 반 응을 진행하였다. 반응이 종료되면 공중합체 용액을 투석막(투석제한분자량 15000)에 담고 72시간 동안 증류수를 흘려주면서 미반응 물질과 잔여 화학물질을 제거하였다. 마지막으로 동결건조를 통하여 테트로닉-카프로락톤-헤파린(tetronic-polycaprolactone-heparin;Tetronic-PCL-heparin) 접합체를 얻었다.
실시예 3
(폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체(Polyethylene oxide-Polylactide, PEO-PLA copolymer)의 제조)
건조된 삼구 둥근바닥플라스크에 8가 폴리에틸렌옥사이드(미국 shearwater社) 2g과 락타이드 5g, 및 옥토산 제일주석(stannous octoate) 0.3g을 80ml의 톨루엔(toluene)에 첨가하여 용해시켰다. 상기 반응용액에 컨덴서를 연결한 후 질소를 충전하여 질소분위기로 만든 다음 섭씨 110℃의 반응조에서 60시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 상기 반응 용액을 클로로포름(CHCl3)에 녹인 다음 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후, 공극 0.2㎛의 막으로 여과를 통해 반응물을 얻었다. 위의 과정을 두 번 반복한 후, 상온에서 60시간 동안 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 8 개의 관능기를 갖는 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체를 얻었다.
실시예 4
(폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드-헤파린 접합체 (PEO-PLA-Heparin conjugate)의 제조)
1단계 : 카복실기 개질 처리(Carboxylated PEO-PLA의 제조)
250ml 둥근바닥플라스크를 질소분위기로 준비한 다음 다이옥산(dioxane) 용매 150ml를 넣고, 상기 실시예 3로부터 얻은 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체 10g을 용해시켰다. 30분 동안 교반하여 완전히 용해시킨 후 숙신산무수물(Succinicanhydride) 0.500g, 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP) 0.488g, 트리에틸아민(Triethylamine, TEA) 0.406g이 각각 용해된 다이옥산 용액을 다시 첨가하였다. 질소분위기를 유지하며 섭씨 30℃의 반응조에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 회전식 증발기를 이용하여 용매를 적당량 날린 후클로로포름에 녹이고 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과한 다음 상기 과정을 두 번 반복하였다. 감압 건조기 내에서 60시간 동안 상온 진공건조시켜 잔여 용매를 제거하여 말단이 카르복실기로 개질된 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체를 얻었다.
증류수 1000ml에 2-(3-모르포리노)에탄술폰산 (2-(3-morpholino)ethanesulfonic acid, MES) 4.88g을 용해시켜 0.05 MES 완충용액을 제조하였다. 상기 카르복실화된 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체 5g을 50ml의 MES 완충용액에 가하여 완전히 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(-3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide, EDC) 0.312g와 N-하이드록시숙신이미드 (N- hydroxylsuccinimide, NHS) 0.094g을 15분 간격으로 첨가하여 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체의 말단(카르복실기)를 활성화하였다.
2단계 : PEO-PLA와 헤파린(heparin)의 결합
상기 실시예 3의 1단계로부터 얻은 활성화 용액을 헤파린 9.6g이 녹아있는 MES 완충용액 150ml에 5분간에 걸쳐 적하하면서 혼합한 후 질소 분위기 하 섭씨 30℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 반응이 진행된 후 상기 결합체 용액을 투석막(투석제한분자량 15000)에 담고 72시간동안 증류수를 흘려주어 분자량이 낮은 미반응 물질과 잔여 화학물질을 제거하였다. 이로부터 얻어진 용액을 동결건조기 내에서 잔여 수분을 제거하여 흰색의 스펀지상의 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드-헤파린 결합체를 얻었다.
실시예 5
(폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체(Polylatide-Polyethylene oxide, PLA-PEO copolymer)의 제조)
1단계 : 4가 폴리락타이드의 합성
건조된 앰플에 락타이드(L-Lactide) 10g과 펜타에리쓰리톨(pentaerythritol) 0.236g를 넣었다. 이후 톨루엔 5ml에 옥토산 제일주석(stannous octoate) 1.406g을 녹인 다음, 이 중 1ml를 취하여 앰플에 첨가하였다. 상기 앰플을 섭씨 60℃의 반응조에서 30분 동안 질소충전과 감압을 반복하여 내부의 수분과 공기를 완전히 제거한 후, 앰플의 입구를 봉하였다. 이렇게 봉해진 앰플을 섭씨 130℃의 반응조에서 10 시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 앰플을 파괴하고, 클로로포름에 녹인 다음 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과를 통해 반응물을 얻었다. 위의 과정을 두 번 반복한 후 상온에서 60시간 동안 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하고 백색의 분말상을 갖는 4가 폴리락타이드를 얻었다.
2단계 : 폴리에틸렌옥사이드 말단의 카르복실화
250ml 둥근바닥플라스크를 질소분위기로 준비한 다음 다이옥산(dioxane) 용매 150ml를 넣고, 선형의 폴리에틸렌옥사이드 40g을 30분 동안 교반하여 완전히 용해됨을 확인한 후, 숙신산무수물(Succinicanhydride) 1.922g, 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP) 1.954g, 트리에틸아민(Triethylamine, TEA) 1.62g이 각각 용해된 다이옥산 용액을 다시 첨가하였다. 질소분위기를 유지하며 섭씨 30℃의 반응조에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 회전식 증발기를 이용하여 용매를 적당량 날린 후, 클로로포름에 녹이고 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과한 다음 상기 과정을 두 번 반복하였다. 감압 건조기 내에서 60시간 동안 상온 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 말단이 카르복실기로 개질된 선형의 폴리에틸렌옥사이드 중합체를 얻었다.
3단계 : 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체의 제조
상기 실시예 5의 2단계로부터 얻은 카르복실로 개질된 선형의 폴리에틸렌옥사이드 30.8g을 메틸렌클로라이드(methylene chloride, MC) 100ml에 넣고 교반을 통해 완전히 용해시킨 후 N,N-디싸이클로헥실카보디이미드(N,N- dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 1.246g, 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP) 0.148g을 각각 메틸렌클로라이드에 녹여 첨가하였다. 상기 실시예 5의 1단계로부터 얻은 4가의 폴리락타이드 20g을 메틸렌클로라이드 100ml에 완전히 용해시킨 후 상기 혼합 용액에 1시간에 걸쳐 천천히 적하하여 혼합하였다. 반응이 진행됨에 따라 서서히 디싸이클로헥실카보디유리아(dicyclohexylcarbodiurea, DCU)가 생성되어 침전되었다. 24시간 동안 질소 분위기 하에서 반응을 진행한 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과하여 부산물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 여과한 다음 상기 과정을 두 번 반복하였다. 감압 건조기 내에서 60시간 동안 상온 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 4가 폴리락타이드 말단에 선형의 폴리에틸렌옥사이드가 결합된 형태의 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체를 얻었다.
실시예 6
(폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드-헤파린 접합체(PLA-PEO-Heparin conjugate)의 제조)
1단계 : 카복실기 개질 처리(Carboxylated PLA-PEO의 제조)
증류수 1000ml에 2-(3-모포리노)에탄술폰산 (2-(3-morpholino)ethanesulfonic acid, MES) 4.88g을 녹여 0.05 MES 완충용액을 제조하였다. 상기 실시예 5로부터 얻은 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체 5g을 50ml의 MES 완충용액에 가하여 완전히 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(-3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide, EDC) 0.156g와 N-하이드록시숙신이미드 (N-hydroxylsuccinimide, NHS) 0.047g을 15분 간격으로 첨가하여 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체의 말단을 활성화하였다.
2단계 : PLA-PEO와 헤파린(heparin)의 결합
상기 실시예 6의 1단계에서 제조된 활성화 용액을 헤파린 4.8g이 녹아있는 MES 완충용액 150ml에 5분간에 걸쳐 적하하면서 혼합한 후 질소 분위기 하 섭씨 30℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 상기 결합체 용액을 투석막(투석제한분자량 15000)에 담고 72시간 동안 증류수를 흘려주어 분자량이 낮은 미반응 물질과 잔여 화학물질을 제거하였다. 이로부터 얻어진 용액을 동결건조기 내에서 잔여 수분을 제거하여 흰색의 스펀지상의 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드-헤파린 결합체를 얻었다.
실시예 7
(소수성 약물(indomethacin)이 탑재된 테트로닉-카프로락톤(tetronic-polycaprolactone) 공중합체(copolymer)의 미셀(micelle)의 제조)
고분자 미셀의 제조는 도 2에 나타낸 용매 증발법을 따랐다.
실시예 1에서 제조된 Tetronic-PCL 공중합체를 임계 미셀 농도(Critical Micelle Concentration; CMC) 이상의 농도로 증류수에 녹여서 고분자 사슬의 소수성 힘에 의해서 자발적으로 수용액 상에서 미셀을 형성하게 하였다.
상기 CMC는 파이렌 (Pyrene)이라는 형광물질을 아세톤에 녹여서 일정량을 여 러 개의 유리병에 똑같이 넣고 아세톤을 증발시켜 준 다음 여기에 3차 증류수에 농도별로 다양하게 녹인 Tetronic-PCL 공중합체를 넣고 형광 분석(Fluorescence spectroscopy)을 하여 파악하였다. 즉, 일정 농도에서 미셀이 형성되면 형광 산란이 급격히 증가하여 분석되는 것이다. 테트로닉 고분자의 임계 미셀 농도는 0.02g/l 내지 0.03g/l 이였으며, 테트로닉-폴리카프로락톤 공중합체는 0.02g/l 내지 0.03g/l이 확인되었다. 이 결과는 도 9에 테트로닉 고분자와 비교하여 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 두 가지 경우 모두 낮은 농도에서 안정된 미셀을 형성함을 확인할 수 있었다.
상기 미셀 용액에 소수성 약물인 IMC를 메탄올에 녹여서 투입하여 미셀의 소수성 중앙부분에 메탄올과 함께 약물이 끼어 들어가도록 하였다.
회전식 증발장치로 메탄올을 증발시켜서 고분자 미셀의 중앙부분에 IMC(indomethacin)를 탑재시켰다.
미셀내부에 탑제되지 않은 약물을 제거하기 위해 원심분리 장치를 이용 1000rpm으로 10분 처리해주고 아래에 가라앉은 IMC를 제외한 용액을 취하였다. 미셀을 안정화시키기 위해서 초음파(sonication)를 30분 동안 쐬어주고 마지막으로 이것을 48시간 동안 동결건조 하여 소수성 약물을 탑제한 미셀을 제조하였다.
Indomethacin(IMC)는 하기 화학식 7로 나타내며, 관절염 소염진통제로 많이 사용되며, 연구용 약물로도 널리 사용되고 있다.
Figure 112005026893546-PAT00007
상기 미셀은 Tetronic-PCL 공중합체를 0.1 g을 100 ㎖의 3차 증류수에 녹여 2 중량%의 수용액을 제조한 후 동적광산란(Dynamic light scattering, DLS) 분석 방법을 이용하여 수용액 상에서의 크기를 확인하였다. 테트로닉-폴리카프로락톤 공중합체의 미셀 구조의 지름은 24 ㎚ 내지 25 ㎚이었으며, 소수성의 약물을 함유할 경우 미셀 구조의 크기가 증가하는 것을 확인하였으며 그 크기는 테트로닉-폴리카프로락톤 공중합체의 경우 187 nm 내지 188 nm이었다.
실시예 8
(섬유모세포 성장인자와 결합된 테트로닉-카프로락톤-헤파린(tetronic-polycaprolactone-heparin) 접합체(conjugate) 미셀의 제조)
상기 실시예 2에서 제조된 다관능성 고분자-헤파린 결합체(테트로닉-카프로락톤-헤파린(tetronic-polycaprolactone-heparin) 접합체(conjugate))를 2중량%의 농도(임계 미셀 농도 이상)로 50㎖ 수용액에 녹여서 미셀 용액을 제조하였다.
상기 CMC는 파이렌 (Pyrene)이라는 형광물질을 아세톤에 녹여서 일정량을 여러 개의 유리병에 똑같이 넣고 아세톤을 증발시켜 준 다음 여기에 3차 증류수에 농도별로 다양하게 녹인 Tetronic-PCL-헤파린 결합체를 넣고 형광 분석(Fluorescence spectroscopy)을 하여 파악하였다. 즉, 일정 농도에서 미셀이 형성되면 형광 산란 이 급격히 증가하여 분석되는 것이다. 테트로닉 고분자의 임계 미셀 농도는 0.02g/l 내지 0.03g/l 이였으며, 테트로닉-폴리카프로락톤-헤파린 결합체는 0.10g/l 내지 0.11g/l이 확인되었다. 이 결과는 도 10에 테트로닉 고분자와 비교하여 나타내었다.
상기 미셀 용액에 헤파린과 결합하는 성질을 갖고 있는 섬유모세포 성장인자(basic-Fibroblast Growth Factor, bFGF)를 400ng/㎖를 넣어주고 24시간 동안 21℃에서 배양하여 헤파린과 성장인자가 결합하도록 하였다.
결합하지 않은 잔여 성장인자를 제거하기 위해서 10중량%의 진한 폴리에틸렌옥사이드(Poly ethylene oxide, PEO) 1㎖를 넣어주어 상대적으로 용해도가 낮아진 성장인자가 미세한 고체로 떨어지게 되도록 하였다(salting-out salt effect).
이 용액을 원심분리(1000rpm, 10분) 해주고, 상층액을 취하여 초음파를 30분 동안 쐬어 준 다음 48시간 동안 동결건조하여 다관능성 고분자-헤파린 미셀을 제조하였다.
상기 bFGF (basic fibroblast growth factor, FGF-2)는 분자량이 15000 정도 되는 성장인자(Growth factor; GF)로, 특정 세포가 잘 성장하고 분화가 가능하도록 신호를 주는 단백질이며, 섬유모세포(Fibroblast) 뿐만 아니라 다른 여러 종류의 세포에도 그 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 특히 헤파린이 여러 가지 많은 단백질들과 특이적인 결합을 할 수 있다는 것은 이미 많이 알려진 사실이며, 헤파린과 bFGF와의 특이적인 결합이 가능하며, 헤파린과 결합되어 존재하는 bFGF는 그 반감기 또한 길어질 수 있다고 알려져 있다.
상기 미셀은 다관능성 고분자 - 헤파린 결합체 0.1g을 100㎖의 3차 증류수에 녹여 2중량%의 수용액을 제조한 후 동적광산란 분석(Dynamic light scattering, DLS) 방법을 이용하여 수용액 상에서의 크기를 확인하였다.
다관능성 고분자 - 헤파린 결합체는 113㎚ 내지 114㎚의 지름을 가지고 있음이 확인되었다. 소수성의 약물을 함유할 경우 미셀 구조의 크기가 증가하는 것을 확인하였으며 그 크기는 테트로닉-폴리카프로락톤-헤파린 결합체의 경우 210nm 내지 211nm로 확인되었다. 또한 헤파린과 결합특성을 가지고 있는 섬유모세포 성장인자를 미셀에 결합시켰을 경우 테트로닉-폴리카프로락톤-헤파린 결합체의 크기가 192nm 내지 193nm로 증가하였다.
실시예 9
(소수성 약물이 탑제되고 성장인자와 결합된 Tetronic-PCL-Heparin 미셀의 제조 -이중약물전달)
상기 실시예 2에서 제조된 다관능성 고분자-헤파린 결합체(테트로닉-카프로락톤-헤파린(tetronic-polycaprolactone-heparin) 접합체(conjugate))를 2중량%의 농도로 50㎖ 수용액에 녹인 후, 고분자 사슬의 소수성 힘에 의해서 자발적으로 수용액 상에서 미셀을 형성하게 하였다.
이 용액에 소수성 약물인 IMC를 메탄올에 녹여서 투입하여 미셀의 소수성 중앙부분에 메탄올과 함께 약물이 끼어 들어가도록 하였다.
회전식 증발장치로 메탄올을 증발시켜서 고분자 미셀의 중앙부분에 IMC(indomethacin)를 탑재시켰다.
미셀내부에 탑제되지 않은 약물을 제거하기 위해 원심분리 장치를 이용 1000 rpm으로 10 분 처리해주고 아래에 가라앉은 IMC를 제외한 용액을 취하였다.
헤파린과 결합하는 성질을 갖고 있는 섬유모세포 성장인자(basic-Fibroblast Growth Factor, bFGF)를 400ng/㎖를 넣어주고 24시간 동안 21℃에서 배양하여 헤파린과 성장인자가 결합하도록 하였다.
결합하지 않은 잔여 성장인자를 제거하기 위해서 10중량%의 진한 폴리에틸렌옥사이드(Poly ethylene oxide, PEO) 1㎖를 넣어주어 상대적으로 용해도가 낮아진 성장인자가 미세한 고체로 떨어지게 되도록 하였다(salting-out salt effect).
이 용액을 원심분리(1000rpm, 10분) 해주고, 상층액을 취하여 초음파를 30분 동안 쐬어 준 다음 48시간 동안 동결건조하여 소수성 약물과 성장인자를 함유한 다관능성 고분자-헤파린 미셀을 제조하였다.
상기 실시예 8에서와 마찬가지로, 고분자-헤파린 미셀의 임계 미셀 농도를 확인한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 다관능성 고분자-헤파린의 경우에도 낮은 농도에서 안정된 미셀을 형성함을 확인할 수 있었다.
실시예 10
(테트로닉-PCL 공중합체의 구조 및 분자량 분석)
실시예 1에서 얻은 공중합체는 테트로닉(tetronic)과 PCL 모두 CHCl3에 녹기 때문에 세 가지 고분자를 CDCl3에 녹여 NMR(Bruker AMX-5)를 통하여 피크를 분석하여 도 6에 나타내었다. 3.6ppm과 1.1ppm에서 Tetronic의 -CH2-, -CH3의 특성피크 가, 1.2ppm, 1.6ppm, 2.2ppm, 및 4.1ppm에서 PCL의 -CH2- 피크가 나옴을 확인하였다.
또한 실시예 1과 2에서 얻은 공중합체의 IR(Niolet Magma-IR 5)분석 결과는 도 7에 나타내었다.
또한 상기에서 얻은 공중합체를 겔투과 크로마토그래피(GPC)를 통하여 얻은 분자량 분석 결과는 하기 표 1과 같다.
(표 1)
Tetronic Mn Tetronic-PCL Mn (NMR) Tetronic-PCL Mn (GPC) Tetronic-PCL Mw (GPC) Tetronic-PCL PD Unit ratio PEO:PPO:PCL
18000 19136 20300 20280 0.99 248 : 80 : 20
테트로닉-폴리카프로락톤 공중합체는 중량평균 분자량이 21,000 내지 22,000이며, 여러 개의 가지 중 하나의 가지는 상기 화학식 2의 반복 단위를 가진다.
실시예 11
(테트로닉-PCL-헤파린 접합체의 구조와 도입된 헤파린의 정량 및 활성 분석)
상기에서 얻은 공중합체는 헤파린이 녹는 용매가 물과 포름아미드 뿐이므로 비교를 위해 모두 D2O에 녹여 NMR 피크를 확인하여 도 9에 나타내었다. 헤파린은 복잡한 다당류의 구조적 특성상 결합된 특이 피크는 다른 피크에 묻혀서 사라지지만, 전체적으로 확인해 보았을 때 Tetronic, PCL와 헤파린의 특성 피크 2.0ppm, 2.8ppm, 3.1ppm, 4.1ppm 및 4.2ppm가 나오고 있음을 알 수 있었다.
또한 실시예 2에서 얻은 공중합체의 NMR분석 결과는 도 8에 나타내었다.
테트로닉-카프로락톤-헤파린 결합체는 카프로락톤과 헤파린의 카르보닐 그룹 이 각각 적외선분광분석 스펙트럼의 1750cm-1과 1690cm-1에서 특이적으로 나타났으며, 헤파린의 하이드록시기는 3500cm-1에서 테트로닉과 폴리카프로락톤의 C-H 결합은 2850cm-1에서 흡수파장이 확인되었다.
상기에서 얻은 테트로닉-카프로락톤-헤파린 결합체에 결합되어 있는 헤파린의 정량은 하기와 같이 실시하였다.
0.02중량%의 염화나트륨 수용액에 염산을 첨가하여 0.01N HCl 용액을 제조한 다음, 상기 제조용액 500㎖에 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) 25mg을 첨가하고 교반을 통해 0.005중량% 톨루이딘 블루 용액을 제조하였다. 헤파린을 0.02중량%의 염화나트륨 수용액에 녹여 각각 0.01㎍/㎖, 0.05㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 1㎍/㎖, 1.5㎍/㎖, 2㎍/㎖, 2.5㎍/㎖, 3㎍/㎖, 4㎍/㎖, 5㎍/㎖ 및 6㎍/㎖ 용액 2㎖씩을 제조하여 헤파린 표준용액을 준비하였다. 상기 다관능성 고분자 - 헤파린 결합체 20㎍을 2㎖의 염화나트륨 수용액에 용해시켜 시료 용액을 제조하였다. 각각의 헤파린 표준 용액과 시료 용액에 상기 제조한 톨루이딘 블루 용액 500㎕을 첨가한 후 살짝 교반을 하여 헤파린-톨루이딘 블루 복합체가 이루어지도록 한 다음 n-헥산을 각각 3㎖씩 첨가하여 강하게 흔들어 주었다. 기포가 생긴 층이 안정화 되도록 1분 동안 방치한 다음 아래의 수용액 층에서 각각 200㎕씩 뽑아 자외선 분광기를 통해 630㎚ 파장에서 흡광도를 분석하였다. 앞서 준비한 헤파린 표준 용액의 흡광도와 제조된 테트로닉-폴리카프로락톤-헤파린 결합체의 흡광도를 비교 분석하여 헤파린의 함량이 0.44㎍/㎍로 높은 양의 헤파린이 도입되었음을 확인하였다.
또한 상기에서 얻은 테트로닉-카프로락톤-헤파린 결합체에 결합되어 있는 헤파린의 활성 측정을 하기와 같이 실시하였다.
3차 증류수에 헤파린을 녹여 각각 2㎍/㎖, 1㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 0.05㎍/㎖, 0.01㎍/㎖, 0.005㎍/㎖의 헤파린 표준 용액을 준비하였다. 테트로닉-폴리카프로락톤-헤파린 결합체는 1㎍/㎖의 농도로 준비하였다. 각각의 헤파린 용액을 먼저 시험관에 넣은 후 미리 37℃로 예열해 놓은 Citracted standard plasma 100㎕와 PathromtinㄾSL 100㎕을 첨가하였다. 37℃ 하에서 0.025 M의 염화칼슘 용액을 100㎕ 첨가함과 동시에 시간을 재기 시작하여 응고 분석기 (coagulation analyzer, SYSMEX CA50)를 통하여 혈액이 응고되는 시간을 측정하였다. 앞서 준비한 헤파린 표준 용액의 응고 시간과 테트로닉-폴리카프로락톤-헤파린 결합체의 흡광도를 비교하여 헤파린의 고유한 항혈전 특성이 결합되지 않은 헤파린에 비해 얼마나 나타나는 지를 확인함으로써 결합된 헤파린의 활성을 분석한 결과 43.56% 이상의 높은 헤파린 활성을 보임을 확인하였다. 이는 종래의 헤파린 함유 고분자에 비해 많은 양의 헤파린이 도입됨과 동시에 더 높은 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
실시예 12
(미셀 내의 소수성 약물 탑제 효율 분석)
에탄올/테트라 하이드로 퓨란 (Tetra hydrofuran, THF) 1:1 용액에 인도메타신을 각각 0.15mg/ml, 0.1mg/ml, 0.03mg/ml, 0.025mg/ml, 0.02mg/ml, 0.015mg/ml, 0.01mg/ml의 농도로 녹인 표준 용액을 준비하여 UV 스펙트럼(Ultra Visable spectrophotometer, UV-1601PC, SHIMADZU)의 319nm에서 분석하였다.
상기 실시예 7과 실시예 9에서 제조된 각각의 미셀을 에탄올/테트라 하이드로 퓨란 1:1 용액에 녹여 미셀 내부의 약물을 녹인 다음 주사 여과기로 여과하여 불순물을 제거한 후 마찬가지로 UV 스펙트럼으로 분석한 후 상기에서 분석한 표준용액과 비교하여 미셀 내부에 탑제된 인도메타신을 정량하였다.
그 결과는 하기 표 2와 같으며, 소수성의 생분해성 고분자를 결합시키지 않았을 경우 보다 탑제 효율이 7 내지 8% 증가하였다.
(표 2)
구분 Tetronic 고분자 Tetronic-PCL 공중합체 Tetronic-PCL -heparin 결합체
DLE(drug loading efficiency, %) 22.2 30.7 30.9
실시예 13
(미셀 내의 소수성 약물의 방출 실험)
약물이 탑제된 각각의 고분자 미셀(테트로닉 고분자(비교예), 테트로닉-PCL 공중합체(실시예 7), 및 테트로닉-PCL-헤파린(실시예 9)) 2중량%를 PBS 2㎖에 녹인 후, 분자량 50kDa의 투석막에 넣고 깨끗한 PBS 48㎖이 담겨 있는 용기에 넣는다. 37℃, 50 rpm에서 보관하면서 약물과 섞여 있는 PBS 1㎖을 각각 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 6시간 후, 10시간 후, 25시간 후, 51시간 후, 110시간 후, 125시간 후, 140시간 후에 채취해 동결 건조하였다. 상기 채취한 시료를 에탄올/THF에 녹여 상기 명시된 UV 스펙트럼을 통해 정량하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.
초기에 약물전달에서 주로 나타나는 터짐효과(burst effect, 약물이 초기에 많이 방출되는 현상)가 크지 않았다.
폴리카프로락톤이 존재하는 미셀은 약물의 탑제가 많고 고분자 사슬이 길어질수록 미셀이 커지기 때문에 표면에 묻어 있는 약의 양도 많이 지게 된다. 그래서 초기에는 테트로닉 보다 그 유도체들이 방출양이 많아지다가 하루정도가 지나게 되면 외부의 약들이 다 빠져나오고 미셀 안에 탑제된 약이 나오게 되는데 테트로닉이 폴리카프로락톤이 존재하는 유도체보다 약을 더 빨리 방출하는 것으로 확인되었다. 이는 폴리카프로락톤과 소수성 약과 소수성/소수성 결합 때문으로 약은 4일정도 서서히 방출되었다.
실시예 14
(성장인자 결합효율)
상기 실시예 8과 실시예 9에서 제조된 다관능성 고분자-헤파린 미셀을 PBS에 녹여 2중량% 용액을 제조한 후, bFGF 정량 키트(Quantikine Human FGF Basic Immunoassay, R&D System)를 이용하여 흡광도를 측정하여 헤파린이 결합되지 않는 샘플과 비교하여 헤파린에 의한 bFGF의 도입 정도를 확인하였다. 이 bFGF의 결합효율을 하기 표 3에 나타내었다.
(표 3)
구분 Tetronic 고분자 Tetronic-PCL 공중합체 Tetronic-PCL -heparin 결합체
DLE(drug loading efficiency, %) 39.75 37.51 70.47
대조군에 비하여 헤파린이 결합된 테트로닉-폴리카프로락톤-헤파린 결합체가 두 배 정도의 bFGF에 대한 탑재 효율을 가짐을 확인하였다. 이는 종래의 성장인자 운반체에 비해 월등히 높은 결과이다.
실시예 15
(미셀에 결합된 성장 인자의 방출 실험)
성장인자가 결합된 고분자 미셀 테트로닉-PCL-헤파린(실시예 8과 실시예 9)) 2중량%를 PBS 1㎖에 녹인 후, 분자량 50kDa의 투석막에 넣고 깨끗한 PBS 49㎖이 담겨 있는 용기에 넣는다. 37℃, 100rpm에서 보관하면서 약물과 섞여 있는 PBS 5㎖을 각각 하루 후, 이틀 후, 4일 후, 일주일 후, 2주일 후, 3주일 후, 한 달 후, 5주일 후, 6주일 후에 채취해 동결 건조하였다. 상기 채취한 시료를 깨끗한 PBS 1 ㎖에 녹여 상기 명시된 bFGF 정량 키트(Quantikine Human FGF Basic Immunoassay, R&D System)을 통해 정량하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.
초기에 약물전달에서 주로 나타나는 터짐효과(burst effect, 약물이 초기에 많이 방출되는 현상)가 없었다.
헤파린이 존재하는 미셀은 성장인자와 이온성 결합을 많이 하고 있는데 확산과 재분배 효과로 인해 6주 동안의 긴 시간 동안 일정한 방출 속도를 가지면서 서서히 방출되었다. 이 결과는 종래의 성장인자 혹은 단백질 운반체에 비해 상당히 장기간이다.
본 발명의 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중중합체와 그의 헤파린 접합체는 안정적인 약물 전달체로의 미셀로 전환될 수 있으며, 그 약물은 높은 탑재효율로 지속적으로 방출할 수 있으며, 성장인자가 높은 탑재효율로 탑재될 수 있어서 생체조직 재생과 약물 치료의 동시 효과를 얻을 수 있다.

Claims (33)

  1. 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 양친매성 고분자 공중합체는 블록 공중합체로서,
    폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 제1소수성 블록, 폴리(프로필렌옥사이드)로 구성되는 제2소수성 블록 및 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 구조이거나,
    또는
    폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 소수성 블록과 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 구조인 것을 특징으로 하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다관능성 양친매성 고분자 공중합체는,
    3 개 이상의 관능기를 갖는 것을 특징으로 하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 다관능성 양친매성 고분자 공중합체는,
    3 개 내지 8 개의 관능기를 갖는 스타형 고분자인 것을 특징으로 하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체는,
    하기 화학식 2 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체:
    [화학식 2]
    Figure 112005026893546-PAT00008
    [화학식 3]
    Figure 112005026893546-PAT00009
    [화학식 4]
    Figure 112005026893546-PAT00010
    [화학식 5]
    Figure 112005026893546-PAT00011
    [화학식 6]
    Figure 112005026893546-PAT00012
    (상기 화학식 2 내지 6에서,
    a는 중합도로서 61 내지 62의 값을 갖고,
    b는 중합도로서 19 내지 20의 값을 갖고,
    c는 중합도로서 3 내지 21의 값을 갖고,
    d는 중합도로서 10 내지 235의 값을 갖고,
    e는 중합도로서 25 내지 562의 값을 갖고,
    f는 중합도로서 10 내지 518의 값을 갖고,
    g는 중합도로서 12 내지 869의 값을 갖고,
    h는 중합도로서 16 내지 465의 값을 갖고,
    i는 중합도로서 20 내지 375의 값을 갖고,
    j는 중합도로서 16 내지 438의 값을 갖고,
    k는 중합도로서 20 내지 736의 값을 갖는다.)
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는,
    폴리락타이드, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(락타이드-co-글리코리드), 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드) 및 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드)로 이루어진 폴리에스터군과 더불어 폴리카보네이트군, 폴리오쏘에스터군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 공중합체는 폴리락타이드와 폴리에틸렌옥사이드의 공중합체인 것을 특징으로 하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체.
  8. (a) 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 제1소수성 블록 단량체, 폴리(프로필렌옥사이드)로 구성되는 제2소수성 블록 단량체 및 폴리(에틸렌옥사이 드)로 구성되는 친수성 블록 단량체를 혼합하는 단계; 또는
    폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 소수성 블록 단량체와 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록 단량체를 혼합하는 단계; 및
    (b) 상기 혼합물을 110 내지 180℃의 온도 및 6 내지 20시간 동안 중합하는 단계
    를 포함하는 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (a)단계는 주석계 옥토에이트(stannous octoate)가 투입되며, 그 투입량은 생분해성 고분자 단량체 1몰에 대하여 1x10-5 내지 5x10-2 몰로 투입되는 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 제조방법.
  10. 소수성 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 미셀(micelle).
  11. 제10항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 물에 대한 용해도가 10 ㎎/㎖ 이하인 난용성 약물 중 파 클리탁셀, 케토코나졸, 이트라코나졸, 사이클로 스포린, 시사프라이드, 아세트아미노펜, 아스피린, 아세틸살리실산, 인도메타신, 나프로센, 와파린, 파파베린, 티오아벤 다졸, 미코나졸, 시나리진, 독소루비신, 오메프라졸, 콜레칼시페롤, 멜팔란, 니페디핀, 디곡신, 벤조산 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 아즈트레오남, 이부프로펜, 펜옥시메틸페니실린, 탈리도마이드, 메틸테스토스테론, 프로클로르페라진, 히드로코티손, 디데옥시퓨린 뉴클레오사이드, 비타민 D2, 술폰아미드, 술포닐우레아, 파라아미노벤조산, 멜라토닌, 벤질페니실린, 클로람뷰실, 디아제핀, 디기톡신, 히드로코티손 뷰레이트, 메트로니다졸 벤조산염, 톨부타마이드, 프로스타 글란딘, 플루드로코티손, 그리세오풀빈, 미코나졸 질산염, 류코트라이엔 비포 억제제, 프로프라놀롤, 테오필린, 플러비 프로펜, 벤조산 나트륨, 벤조산, 리보플라빈, 벤조디아제핀, 페노바비탈, 글리뷰라이드, 설파이아진, 설파에틸티아디아졸, 디클로페낙 나트륨, 피니로인, 히오리다진히드로클로라이드, 브로피리민, 히드로클로로티아지드, 플로코나졸, 항생제, 소염 진통제, 마취제, 호르몬류, 고혈압 치료제, 당뇨병 치료제, 고지질증 치료제, 항바이러스제, 파킨슨병 치료제, 치매 치료제, 항 구토제, 면역 억제제, 궤양 치료제, 변비 치료제 및 항 말라리아제로 사용되는 난용성 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소수성 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 미셀(micelle).
  12. (a) 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여 서 미셀(micelle)을 형성시키는 단계; 및
    (b) 상기 미셀에 소수성 약물 용액을 투입하는 단계
    를 포함하는 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 미셀(micelle) 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (b)단계의 소수성 약물 용액의 투입은 용매 증발법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 미셀(micelle) 제조방법.
  14. 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 양친매성 헤파린 접합체(conjugate).
  15. 제14항에서,
    상기 헤파린은,
    헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 양친매성 헤파린 접합체.
  16. (a) 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체의 다관 능기를 활성화시키는 단계; 및
    (b) 상기 활성화된 다관능성 양친매성 고분자 중합체의 다관능기에 헤파린을 결합시키는 단계
    를 포함하는 양친매성 헤파린 접합체 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 헤파린 결합 방법은
    공유 결합 (covalent bonding), 이온성 결합(ionic bonding), 비이온성 결합(nonionic bonding), 물리적인 흡착 (physical absorption), 또는 물리적인 혼합(physical blending)방법인 것을 특징으로 하는 양친매성 헤파린 접합체 제조방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 공유결합은
    하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 아민기(amine group), 티올기(thiol group) 및 아지드기(azide group)로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응기를 이용한 공유결합인 것을 특징으로 하는 양친매성 헤파린 접합체 제조방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 공유결합은
    아미드 결합(amide bond); 우레탄 결합(urethane bone)과 같은 비분해성 결합(non-degradable bond); 및 에스테르 결합(ester bond), 안하이드라이드(anhydride bond)과 같은 분해성 결합(degradable bond)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공유결합인 것을 특징으로 하는 양친매성 헤파린 접합체 제조방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 접합체 내의 헤파린 함유량이 적어도 0.44 ㎍/㎍인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 제조방법.
  21. 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 양친매성 헤파린 접합체(conjugate)에 소수성 약물이 탑재된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체의 미셀(micelle).
  22. 제21항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 물에 대한 용해도가 10 ㎎/㎖ 이하인 난용성 약물 중 파클리탁셀, 케토코나졸, 이트라코나졸, 사이클로 스포린, 시사프라이드, 아세트아미노펜, 아스피린, 아세틸살리실산, 인도메타신, 나프로센, 와파린, 파파베린, 티오아벤 다졸, 미코나졸, 시나리진, 독소루비신, 오메프라졸, 콜레칼시페롤, 멜팔란, 니페디핀, 디곡신, 벤조산 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 아즈트레오남, 이부프 로펜, 펜옥시메틸페니실린, 탈리도마이드, 메틸테스토스테론, 프로클로르페라진, 히드로코티손, 디데옥시퓨린 뉴클레오사이드, 비타민 D2, 술폰아미드, 술포닐우레아, 파라아미노벤조산, 멜라토닌, 벤질페니실린, 클로람뷰실, 디아제핀, 디기톡신, 히드로코티손 뷰레이트, 메트로니다졸 벤조산염, 톨부타마이드, 프로스타 글란딘, 플루드로코티손, 그리세오풀빈, 미코나졸 질산염, 류코트라이엔 비포 억제제, 프로프라놀롤, 테오필린, 플러비 프로펜, 벤조산 나트륨, 벤조산, 리보플라빈, 벤조디아제핀, 페노바비탈, 글리뷰라이드, 설파이아진, 설파에틸티아디아졸, 디클로페낙 나트륨, 피니로인, 히오리다진히드로클로라이드, 브로피리민, 히드로클로로티아지드, 플로코나졸, 항생제, 소염 진통제, 마취제, 호르몬류, 고혈압 치료제, 당뇨병 치료제, 고지질증 치료제, 항바이러스제, 파킨슨병 치료제, 치매 치료제, 항 구토제, 면역 억제제, 궤양 치료제, 변비 치료제 또는 항 말라리아제로 사용되는 난용성 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소수성 약물이 탑재된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체의 미셀(micelle).
  23. (a) 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여서 미셀(micelle)을 형성시키는 단계; 및
    (b) 상기 미셀에 소수성 약물 용액을 투입하는 단계를 포함하는 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체의 미셀(micelle) 제조방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 (b)단계의 소수성 약물 용액의 투입은 용매 증발법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 약물이 탑재된 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체의 미셀(micelle) 제조방법.
  25. 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 양친매성 헤파린 접합체(conjugate)에 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle).
  26. 제25항에 있어서,
    상기 성장인자는 섬유아세포성장인자(bFGF), VEGF, TGF-1을 포함하는 헤파린 결합 성장인자(HBGF, heparin binding growth factor);
    Fibronectin, selectin, vitronetin을 포함하는 헤파린 결합 단백질;
    PF-4, IL-8을 포함하는 헤파린 결합 케모카인(Chemokines);
    보바인 세륨 알부민(BSA), 라이소자임(Lysozyme), 알파-락탈부민(a-lactalbumin), 인슐린(Insulin), 엘-클루타민(l-glutamine)을 포함하는 각종 펩타이드, 혈장 단백질, 효소 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle).
  27. (a) 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate)를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여서 미셀(micelle)을 형성시키는 단계; 및
    (b) 상기 미셀에 성장 인자를 투입하고 배양하여 헤파린과 성장인자를 결합시키는 단계
    를 포함하는 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle) 제조방법.
  28. 생분해성 고분자를 포함하는 다관능성 양친매성 고분자 공중합체에 헤파린이 결합된 양친매성 헤파린 접합체(conjugate)에 소수성 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle).
  29. 제28항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 물에 대한 용해도가 10 ㎎/㎖ 이하인 난용성 약물 중 파클리탁셀, 케토코나졸, 이트라코나졸, 사이클로 스포린, 시사프라이드, 아세트아미노펜, 아스피린, 아세틸살리실산, 인도메타신, 나프로센, 와파린, 파파베린, 티오아벤 다졸, 미코나졸, 시나리진, 독소루비신, 오메프라졸, 콜레칼시페롤, 멜팔란, 니페디핀, 디곡신, 벤조산 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 아즈트레오남, 이부프로펜, 펜옥시메틸페니실린, 탈리도마이드, 메틸테스토스테론, 프로클로르페라진, 히드로코티손, 디데옥시퓨린 뉴클레오사이드, 비타민 D2, 술폰아미드, 술포닐우레 아, 파라아미노벤조산, 멜라토닌, 벤질페니실린, 클로람뷰실, 디아제핀, 디기톡신, 히드로코티손 뷰레이트, 메트로니다졸 벤조산염, 톨부타마이드, 프로스타 글란딘, 플루드로코티손, 그리세오풀빈, 미코나졸 질산염, 류코트라이엔 비포 억제제, 프로프라놀롤, 테오필린, 플러비 프로펜, 벤조산 나트륨, 벤조산, 리보플라빈, 벤조디아제핀, 페노바비탈, 글리뷰라이드, 설파이아진, 설파에틸티아디아졸, 디클로페낙 나트륨, 피니로인, 히오리다진히드로클로라이드, 브로피리민, 히드로클로로티아지드, 플로코나졸, 항생제, 소염 진통제, 마취제, 호르몬류, 고혈압 치료제, 당뇨병 치료제, 고지질증 치료제, 항바이러스제, 파킨슨병 치료제, 치매 치료제, 항 구토제, 면역 억제제, 궤양 치료제, 변비 치료제 또는 항 말라리아제로 사용되는 난용성 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소수성 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle).
  30. 제28항에 있어서,
    상기 성장인자가 섬유아세포성장인자(bFGF), VEGF, TGF-1을 포함하는 헤파린 결합 성장인자(HBGF, heparin binding growth factor);
    Fibronectin, selectin, vitronetin을 포함하는 헤파린 결합 단백질;
    PF-4, IL-8을 포함하는 헤파린 결합 케모카인(Chemokines);
    보바인 세륨 알부민(BSA), 라이소자임(Lysozyme), 알파-락탈부민(a-lactalbumin), 인슐린(Insulin), 엘-클루타민(l-glutamine)을 포함하는 각종 펩타이드, 혈장 단백 질, 효소 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 소수성 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle).
  31. (a) 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체를 증류수에 임계미셀 농도(critical micelle concentration) 이상의 농도로 투입하고 녹여서 미셀(micelle)을 형성시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계의 미셀에 소수성 약물 용액을 투입하고 성장 인자를 투입하여 배양하는 단계
    를 포함하는 소수성 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle) 제조방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 (b)단계의 소수성 약물 용액의 투입은 용매 증발법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 소수성 약물이 탑재되고 성장인자가 결합된 다관능성 양친매성 고분자 헤파린 접합체(conjugate) 미셀(micelle) 제조방법.
  33. 제10항, 제21항, 제25항 또는 제28항 기재의 미셀을 포함하는 주입형 생체재료, 세포, 또는 약물 전달체.
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