KR20060098480A - 천연 미백 생리활성 물질을 포함한 유용성 감초추출물의 제조. - Google Patents

Abstract

본 발명은 파쇄한 감초 내의 플라보노이드류를 온도 40 내지 80℃, 압력 11 내지 50Mpa, 겉보기 유속 0.54cm/min의 초임계 이산화탄소, 에탄올과 아세톤의 보조용매로 추출하는 것과 합성 흡착제를 이용한 정제를 포함하여 글라브리딘 함량 35% 이상 함유된 유용성 감초 추출물의 제조방법을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 파쇄된 감초로부터 인체에 무해한 용매인 이산화탄소를 사용하여 단시간 내에 고수율/고순도의 글라브리딘이 포함된 플라보노이드류를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 에탄올만을 사용한 환경친화적인 흡착 정제방법으로 글라브리딘 35%이상 포함된 유용성 감초 추출물을 제조할 수 있는 효과가 있다.

초임계 유체 추출방법, 감초, 유용성 감초 추출물, 글라브리딘, 보조용매

Description

천연 미백 생리활성 물질을 포함한 유용성 감초추출물의 제조. {Formation of oil-soluble licorice extract including whitening bioactive materials}

도 1은 본 발명에 따른 이산화탄소를 이용한 초임계 유체 추출장치의 구성도

도 2는 초임계 이산화탄소에 95% 에탄올(함수 에탄올)을 보조용매로 첨가하여 추출한 추출물의 HPLC 크로마토그램 분석도.

도 3은 초임계 이산화탄소에 99% 아세톤을 보조용매로 첨가하여 추출한 추출물의 HPLC 크로마토그램 분석도.

도 4는 본 발명의 정제 과정을 통하여 제조된 천연 미백 활성물질인 글라브리딘이 35%이상 포함된 유용성 감초 추출물의 HPLC 크로마토그램 분석도이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

2 : 이산화탄소 저장탱크 4 : 보조용매 저장탱크

6 : 제 1 고압액체펌프 8 : 제 2 고압액체펌프

10 : 혼합수단 12 : 온도조절수단

14 : 추출반응기 16 : 미터링밸브

18 : 1차 분리기 20 : 2차 분리기

22 : 냉각장치 24,24’ : 후방압력조절기

26 : 이산화탄소 배출구 28 : 밸브

30 : 카트리지 32 : 필터

본 발명은 감초로부터 글라브리딘(Glabridin) 함량 35% 이상 포함된 유용성 감초 추출물(Oil soluble licorice extract) 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초임계 이산화탄소/공용매 추출시스템을 이용하여 감초로부터 빠른 시간에 글라브리딘이 포함된 플라보노이드(Flavonoid)류를 추출하고, 간단한 정제 과정을 통하여 글라브리딘 함량 35% 이상 함유하고 있는 유용성 감초 추출물을 제조하는 방법에 관한 기술이다.

그리스어로 “Sweet root"라는 뜻을 가지고 있는 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch, Glycyrrhiza glabra L.)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 다년생초(여러해살이풀)본으로 줄기는 1-1.5m로 곧게 자라며 전체에 털이 없고, 뿌리는 지하경으로 옆으로 뻗어가며 상업적으로 매우 중요한 부분이다.

감초는 중국 동북부에서 중앙아시아, 남유럽에 걸쳐 널리 분포하며, 약전에서는 Glycyrrhiza glabra Linne var.(스페인감초) glandulifera Regel et Herder, Glycyrrhiza uralensis Fisher(우랄감초), Glycyrrhiza inflata Batalin 등 3종만 은 인정하고 있고, 변종으로 var. typica(러시아감초), var. glanduliferra(페르시아 감초), var. violacea 및 var. pallidark 있다.

한편, 상기 뿌리는 품종, 경작조건과 생육환경에 따라 성분함량이 다양하지만, 대략 20%의 수분, 3-5%의 glycyrrhizin, 3-16%의 당류, 30%의 전분과 6%의 회분으로 구성되어 있으며, 감초의 지표성분인 glycyrrhizin을 2.5%이상 함유하고 있지 않으면 감초로 분류될 수 없다. 또한 굵기에 따라 4등급으로 구분되고, 맛이 달고, 독이 없으며 따듯한 기운을 가지고 있어, 심, 폐, 위경맥에 작용하는 것으로 알려져 있고 유용, 습양, 생창 등의 치료에 활용된다.

감초에는 주요 생리활성 성분으로써 설탕의 50배 이상의 단맛을 내는 글리시리진(Glycyrrhizin 또는 Glycyrrhizic acid)과 아글리콘(Aglycone), 글리시리에티닉(Glycyrrhetinic)이 존재하고 더불어 다양한 플라보노이드가 유효성분으로 포함되어 있어, 감미제 뿐만 아니라, 의약품, 의약부외품, 화장품 등에 매우 폭 넓게 이용되고 있다. 또한 예부터 플라보노이드가 함유된 생약, 화분 등은 각종 질병을 치료하는데 사용되어 왔으며, 감초의 플라보노이드 성분은 피부화장료 및 두발화장료에 함유되어 유해한 활성산소로부터 생체를 보호할 수 있는 작용을 가지고 있다. 그 중 글라브리딘은 감초 내의 플라보노이드 중 가장 많은 양을 차지하는 성분이며 글라브리딘이 포함된 유용성 감초 추출물은 체내에서 인체에 해로운 저밀도 지질단백질(Low Density Liprotein)의 산화 억제, 염증 억제, 노화 방지일본 등에 우수한 효능을 보일 뿐만 아니라, 미백작용(일본 특허공개평 1-149706호 공보 및 일본 특 허공개평1-311011호 공보 참조), 자외선 흡수작용(일본 특허공개평1-157509호 공보 참조) 에도 탁월한 효과를 나타내어, 의약품 및 기능성화장품의 중요한 원료로서 이용되고 있다.

글라브리딘을 포함하고 있는 유용성 감초추출물의 경우 식품의약청에서 고시(식품의약품안전청고시 제 2001-15호)에 의해 피부미백 효과를 위한 첨가물로 분류되어 있으며, 이를 위한 기준으로 추출물 내의 주성분은 글라브리딘으로 중량비 35%이상 포함되어 있어야 한다.

한편, 감초 내의 플라보노이드를 추출 및 정제하기 위한 방법으로 한국특허공개 특1993-0005629호, 특2000-0049485호, 일본특허공개 10-0073681호와 같이 감초근을 벤젠, 톨루엔, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 함수메탄올, 함수에탄올 등의 유기용매로 교반하면서 상온에서 추출하는 방법, 가열 환류를 통해 추출하는 방법이 개시되어 있다.

또한 얻어진 추출액은 원심분리 및 여과에 의해 불용물을 제거한 후, 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올 등의 유해한 유기용매를 이용한 용매분획 및 활성탄, 합성흡착제, 이온교환수지 등을 사용한 정제방법이 개시되어 있다.

그러나 전술한 방법은 공정상 인체에 유해한 유기용매를 과량 사용하게 되며, 추출물 내의 잔존 유기용매를 제거하는 것이 곤란하기 때문에 추출물의 순도가 낮다는 문제점과 복잡한 분리 정제 공정으로 인한 낮은 회수율과 많은 시간, 비용 이 소비된다는 문제점 등이 있다.

전술한 문제점을 극복하기 위하여 인체에 유해하지 않은 용매를 사용하여 경제적으로 유용성 감초 추출물을 수득하는 초임계 유체 추출방법과 정제방법이 개발되었다.

이러한 일례로서, 대한민국 특허공보 특1998-015534호는 분쇄한 감초근을 초임계 용매인 온도 30 내지 80℃, 압력 80 내지 400bar, 유속 3 내지 6L/min의 이산화탄소를 통과시켜 감초 추출물을 수득하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기 대한민국 특허공보 특1998-015534호의 초임계 유체 추출방법을 이용하여 감초로부터 유용성 감초 추출물을 수득할 경우, 추출된 감초 추출물의 플라보노이드 함량이 낮은 것으로 나타났다.

이에, 본 발명의 발명자들은 초임계 유체 추출방법을 이용하여 감초로부터 고순도 및 고수율의 유용성 감초 추출물을 제조하기 위한 연구를 거듭한 결과, 일부 보조용매를 이용한 초임계 유체 추출방법을 사용할 경우 감초로부터 고수율 및 고순도의 유용성 감초 추출물을 수득할 수 있다는 것을 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 상술한 기존 추출방법의 문제점을 해결하기 위하여 도출한 것으로서, 짧은 추출시간과 기존의 분리?정제 공정을 단순화 또는 단일화시킴으로써 인체에 유해한 유기용매의 사용량을 최소화하여 경제적으로 감초로부터 고수율/고순도 의 유용성 감초 추출물을 제조할 수 있는 환경친화적인 추출 및 정제방법을 제공하는 것에 기술적 과제가 있다.

[초임계 이산화탄소 추출]

본 발명에 따른 감초로부터 유용성 감초 추출물 제조는 파쇄된 건조 감초를 초임계 유체 상태에서 추출하는 방식으로 이루어지는데, 상기 초임계 유체란 임계점 이상의 온도 및 압력을 가지는 물질의 상태를 나타낸 용어로서, 초임계 유체의 밀도는 액체의 밀도와 비슷하지만 점도는 기체의 점도처럼 낮기 때문에 그 확산계수가 액체의 확산계수에 비하여 수백 또는 수천 배 크다. 그러므로, 초임계 유체는 낮은 점도로 시료 침투력이 좋아 추출 효율이 향상되고, 확산계수가 크므로 물질의 평형상태에 빠르게 접근할 수 있는 특징을 지니고 있다. 따라서, 초임계 유체를 추출에 이용할 경우에는 기존의 용매추출과 비교하여 볼 때 압력 및 온도조작이 매우 용이하여 고밀도에서 저밀도 상태까지 어떠한 조건에서도 추출을 할 수 있다는 장점이 있으며, 비교적 저온에서 추출공정이 진행됨으로써 열에 민감한 물질을 안전하게 추출할 수 있다는 장점이 있다.

전술한 초임계 유체 추출에 사용되는 용매는 추출력이 매우 강한 비극성 용매인 이산화탄소가 단독으로 사용될 수 있으며, 상기 이산화탄소와 에탄올 및 아세톤 등 다양한 용매를 보조용매로 혼합하여 사용할 수도 있다. 이때, 상기 이산화탄소와 보조용매의 혼합비는 부피비로 19:1 내지 3:1인 것이 바람직하다.

여기서, 상기 이산화탄소와 보조용매를 혼합하여 초임계 유체 추출에 사용할 경우 상기와 같이 혼합비를 한정하는 이유는 이산화탄소와 메탄올, 에탄올, 아세톤 등으로 지칭되는 보조용매의 적절한 용매비가 효율적인 초임계 유체 추출에 있어서 중요한 역할을 하기 때문이다. 통상 상기 부피비로 19:1 내지 3:1인 용매비 범위로 사용되는 보조용매는 주용매인 이산화탄소의 용매력 한계를 도와주는 용매로서 초임계 상태에서 주용매인 이산화탄소와 섞어서 추출효과를 높일 수 있다.

본 발명에 따른 초임계 유체 추출방법에 있어서 온도는 40 내지 80℃, 압력은 11 내지 50Mpa이며, 겉보기 유속(superficial velocity) 0.54cm/min을 유지한다. 상기 초임계 유체 추출방법의 운전조건은 통상의 초임계 상태 운전조건이며, 상기 한계를 벗어난 경우 초임계 유체 추출이 곤란한 상태가 된다.

한편, 본 발명에 따른 감초로부터 유용성 감초 추출물을 제조하는 초임계 유체 추출방법은 기본적으로 보조용매를 첨가하여 사용하여야 하는 바, 에탄올과 아세톤을 보조용매로서 이용하는 두 가지 방법으로 접근할 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나, 하기의 설명은 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 하기 설명에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것을 아니다.

도 1은 본 발명에 따른 이산화탄소를 이용한 초임계 유체 추출장치의 구성도로서 함께 설명한다.

도 1은 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 초임계 유체 추출장치는 이산화탄소가 저장되어 있는 이산화탄소 저장탱크(2), 에탄올, 아세톤의 보조용매 저장탱크(4), 상기 이산화탄소 저장탱크(2)에 연결설치되어 이산화탄소를 냉각, 바람직하게는 5 내지 10℃로 냉각시키는 냉각장치(22), 상기 냉각장치(22)에 연결설치되어 이산화탄소를 압축하는 제 1고압액체펌프(6), 상기 제 1고압액체펌프에 연결되어 추출압력을 11 내지 50Mpa로 조절하는 후방압력조절기(24), 상기 보조용매 저장탱크(4)에 연결설치되어 보조용매를 11 내지 50MPa로 압축하는 제 2고압액체펌프(8), 상기 제 1고압액체펌프(6) 및 제 2고압액체펌프(8)에 연결설치되어 상기 제 1고압액체펌프(6) 및 제 2고압액체펌프(8)로부터 유입되는 이산화탄소와 보조용매를 혼합시키는 혼합수단(10), 상기 혼합수단(10)에 연결설치되어 혼합수단(10)으로부터 유입되는 고압의 이산화탄소와 보조용매를 40 내지 80℃ 유지시켜 주는 온도조절수단(12), 상기 온도조절수단(12)에 연결설치되고 그 내부에 파쇄된 건조 감초가 충진된 추출반응기(14), 상기 추출반응기(14)에 연결설치되어 추출반응기(14)로부터 배출되는 글라브리딘 등을 포함하는 추출물의 유속을 조절하는 미터링밸브(16), 상기 미터링밸브(16)에 연결설치되어 미터링밸브(16)를 통과한 유체에 존재하는 글라브리딘 등의 추출물을 회수하는 제 1차 분리기(18), 상기 제 1차 분리기(18)의 압력을 조절하는 후방압력조절기(24’), 상기 후방압력조절기(24’)를 통과한 잔여 추출물을 회수하는 제 2차 분리기(20), 상기 제 2차 분리기(20)를 통과한 이산화탄소를 외부로 배출시키는 이산화탄소 배출구(26) 및 상기 1차 분리기(18)와 2차 분리기(20)에 각각 설치되어 분리된 추출물을 회수하는 밸브(28)를 포함한다.

한편, 필요에 따라 상기 추출반응기(14)의 내부에 카트리지(30)를 설치한 후 상기 카트리지(30)에 감초를 충진 할 수 있도록 하여 본 발명에 따른 초임계 유체 추출장치를 구성할 수 있는데, 상기 추출반응기(14) 내부에 설치되는 카트리지(30)의 상부는 반응기 뚜껑에 연결설치되어 있으며 하부는 불순물을 제거할 수 있는 통상적인 필터(32), 바람직하게는 0.5㎛의 기공을 갖는 필터(32)가 장착되어 초임계 유체가 필터(32)를 통과하여 감초로부터 추출한 불순물을 제거한다.

여기서, 상기 이산화탄소 저장탱크(2)에 채워져 있는 이산화탄소는 제 1고압 액체펌프(6) 및 온도조절수단(12)을 통과하여 초임계 이산화탄소로 전환되며, 상기 파쇄된 감초가 충진 되어 추출반응기(14)의 카트리지(30)가 파쇄된 감초로 완전히 충진 되지 않을 경우에는 그 잔여 공간을 씨샌드(sea sand) 또는 글래스 울(glass wool)로 충진 할 수 있다. 이때 상기 씨샌드 또는 글래스 울을 사용하여 파쇄된 감초가 충진 되지 않은 카트리지(30)의 잔여 공간을 충진하는 것은 상기 추출반응기(14)에 충진된 감초의 비산을 방지하기 위한 것이다.

전술한 구성을 갖는 본 발명에 따른 초임계 유체 추출장치의 작동기작을 설명하면 다음과 같다.

먼저 파쇄된 건조 감초를 카트리지(30)에 충진하여 추출반응기(14)에 장착한 후 이산화탄소 저장탱크(2)에 저장되어 있는 이산화탄소를 5℃ 내지 10℃로 냉각시키는 냉각장치(22)를 통과시켜 냉각시킨 뒤 제 1 고압액체펌프(6)로 이송시켜 압축시키고, 후방압력조절기(24)로 11 내지 50Mpa의 압력으로 조절한다.

여기서, 상기 카트리지(30)를 사용하지 않을 경우 추출반응기(14)에 직접 파쇄된 건조 감초를 충진하여 사용하게 된다

그 다음, 보조용매 저장탱크(4)에 저장되어 있는 에탄올, 아세톤인 보조용매를 제 2 고압액체펌프(8)로 이송시켜 11 내지 50MPa의 압력으로 압축한다.

이때, 상기 보조용매 저장탱크(4)에 저장된 보조용매의 부피비가 1:3 내지 1:19가 되도록 한다.

그 다음, 상기 제 1 고압액체펌프(6) 및 제 2 고압액체펌프(8)로부터 배출되는 고압의 이산화탄소 및 보조용매를 혼합수단(10)으로 이송시켜 이산화탄소와 물을 포함하는 보조용매를 부피비 19:1 내지 3:1이 되도록 혼합한 후 상기 혼합물을 온도조절수단(12)으로 이송시켜 40℃ 내지 80℃의 온도로 조절하여 초임계 유체로 전환시킨다.

여기서, 상기 초임계 유체는 초임계 상태의 이산화탄소 및 보조용매 혼합물을 의미한다.

그 다음, 상기 초임계 유체를 파쇄된 감초가 채워져 있는 추출반응기(14)로 유입시켜 상기 추출반응기(14) 내의 카트리지(30)에 채워져 있는 감초로부터 글라브리딘 및 여러 플라보노이드 등을 포함하는 감초 추출물을 추출한다.

그 다음, 상기 감초 추출물을 포함하는 초임계 유체는 미터링밸브(16)를 통과시켜 30 내지 60기압으로 유지되는 제 1차 분리기(18)로 유입시킴으로써 상기 초임계 유체를 이산화탄소와 감초 추출물로 1차 분리한다.

그 다음, 상기 제 1차 분리기(18)를 통과한 이산화탄소를 대기압 상태인 제 2차 분리기(20)로 유입시켜 기상의 이산화탄소와 감초 추출물로 2차 분리시킨 뒤 상기 기상의 이산화탄소는 상기 제 2차 분리기(20)의 일측에 구비된 이산화탄소 배출구(26)를 통과시켜 외부로 배출한다.

여기서, 본 발명에 따른 초임계 유체의 겉보기 유속(Superficial velocity)은 상기 미터링밸브(16)에 의하여 0.54cm/min으로 조절된다.

[글라브리딘 정제 공정]

본 발명은 초임계 유체 추출방법을 이용하여 추출된 유용성 감초 추출물을 침전과 합성 흡착제를 이용한 정제과정을 통해 글라브리딘 함량 35% 이상 포함된 유용성 감초 추출물을 제조방법을 제공한다.

초임계 유체 추출방법을 이용함으로서 기존 추출방법에 비하여 2-4배 높은 유용성 감초 추출물은 얻을 수 있었으나, 식품의약품안전청에 고시된 기능성 미백 화장품의 원료로서 추출물 내의 글라브리딘이 중량비 35%이상 포함되어야 한다는 기준에는 미흡하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 상기의 초임계 유체 추출방법에 의하여 글라브리딘이 포함된 유용성 감초 추출물을 얻은 후, 80%(v/v) 에탄올(에탄올:물=80:20)로 지방을 제거하는 공정, 합성 흡착제를 사용한 정제 및 탈색공정, 물로 재결정하는 결정공정을 포함하는 정제방법이다. 초임계 유체 추출 후 얻어진 유용성 감초 추출물(글라브리딘 10~20%)에는 글라브리딘 이외에 단백질, 지방, 색소성분 등이 다량 함유되어 있다. 따라서 글라브리딘 함량 35% 이상의 유용성 감초 추 출물을 제조하기 위해서는 반드시 지방, 단백질, 당류 및 색소 성분의 제거가 필수적이다.

종래 지방 제거를 위해서는 헥산을 사용하여 제거하였으나, 본 발명에서는 80% 에탄올을 이용하여 추출물 내의 지방을 침전시켜 제거하였으며, 이 추출액을 농축하여 합성 흡착제를 통과시켜 단백질, 당류 및 색소성분 등을 제거하는 것을 특징으로 한다. 이때 사용하는 수지는 SAMYANG 사의 다이아이온(Diaion) HP 20으로 다른 이온교환수지들에 비하여 글라브리딘 흡착율이 적어 본 발명에 유리하였다. 또한 본 발명에서 글라브리딘 분체를 만들기 위한 방법으로서 물을 사용하였으며 글라브리딘의 손실 없이 고순도 유용성 감초 추출물을 얻을 수가 있었다.

유용성 감초 추출물(글라브리딘 함량 7.5%)을 상기 방법으로 정제한 결과, 함량은 약 37%~40% 정도로 상승하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것을 아니다.

<실시예 1>

도 1에 도시된 바와 같이, 150mesh 이하의 크기로 파쇄된 건조 감초 300g을 추출반응기인 SUS 316로 제작된 내경 69mm, 외경 75mm, 높이 319mm 크기의 카트리 지에 충진시킨 후 상기 파쇄된 감초가 채워져 있지 않은 잔여공간을 씨샌드 등으로 충진한 뒤 SUS 316로 제작된 내경 77mm, 외경 180mm, 높이 470mm 크기의 추출반응기의 내부에 장착하였다.

그 다음, 고순도의 이산화탄소가 채워져 있는 탱크[초고순도가스탱크, 동민특수가스. 대한민국]를 고압액체펌프[EL-1, LEWA, 미국]에 연결시키고, 상기 고압액체펌프를 온도조절기[VTRC-640, JEIOTECH, 대한민국] 및 상기 추출반응기에 순차적으로 연결시켰다.

그 다음, 상기 추출반응기의 일측을 초임계 유체의 유속을 조절할 수 있는 미터링밸브[30VRMM4812, Autoclave, 미국]를 연결설치한 후 상기 미터링밸브에 SUS 316 재질의 내경 46mm, 외경 80mm, 높이 200mm, 부피 330㎖인 제 1차 분리기(제한 압력 7000psi)를 연결설치한 후 상기 제 1차 분리기와 동일한 재질 및 크기의 제 2차 분리기를 연결하였다.

그 다음, 이산화탄소탱크로부터 이산화탄소를 배출한 후 상기 배출되는 이산화탄소를 고압액체펌프로 30Mpa로 압축하고, 온도조절기로 40℃로 유지시켜 초임계 이산화탄소를 제조하며, 상기 제조된 초임계 이산화탄소를 겉보기 유속 0.54cm/min으로 상기 카트리지가 장착되어 있는 상기 추출반응기에 공급하여 파쇄된 건조 감초로부터 글라브리딘을 추출하였다.

그 결과 회수율은 17.7%였다.

여기서, 상기 글라브리딘의 회수율은 감초 추출물을 일절 부피로 조절한 후 HPLC(고속액체크로마토그래피)를 사용하여 표준곡선으로부터 정량하여 건조감초에 대한 글라브리딘의 무게비로 추출율(수학식 2)을 계산한 후 유기용매추출시의 수율을 기준으로 하여 하기 수학식 1로 회수율을 계산하였다.

한편, 본 발명에 따른 회수율은 유기용매추출법에 의한 추출물을 기준으로 수득되는 것으로, 상기 유기용매추출법으로 추출되는 감초 추출물과 용이하게 비교할 수 있도록 표현되었다.

여기서, 상기 HPLC를 수행하기 위한 조건은 하기 표 1로 나타냈다.

사용기기	HPLC M616LC system[워터스, 미국]
컬럼	CAPCell PAK C18 UG S-5㎛(4.6㎜× 250㎜ ) [시세이도, 일본]
이동상 유량	1.8 ㎖/min
시료 주입량	20㎕
이동상	물과 아세톤니트릴의 부피비 50:50로 혼합하고 초산을 이용하여 pH를 2.5으로 조절함

한편, 상기 유기용매추출시의 수율은 다음과 같은 방법에 따른 유기용매 추출법을 사용하여 감초로부터 글라브리딘을 추출한 결과를 사용하였다.

상기 유기용매 추출법을 설명하면 다음과 같다.

ⅰ) 시료의 30배가량의 추출용매를 넣어 45℃에서 100rpm으로 교반하면서 1시간동안 추출한다.

ⅱ) 상기 단계 ⅰ)의 용매추출이 종료된 후 추출액과 감초시료 혼합물을 3000 rpm으로 15분간 원심분리 후 상등액을 취하고 추출박에 다시 용매를 첨가하여 추출한다. 이 조작을 2회 반복한다.

ⅲ) 2회의 추출이 끝난 후 추출액을 Whatman 시린지 필터(0.45㎛)로 여과하여 추출액을 제조하였다.

여기서, 상기 추출용매는 100% 메탄올, 80%(v/v) 메탄올(메탄올:물=80:20)과 100% 에탄올, 95%(v/v) 에탄올(에탄올:물=95:5), 90%(v/v) 에탄올(에탄올:물=90:10), 80%(v/v) 에탄올(에탄올:물=80:20), 마지막으로 100% 아세톤을 사용하였다.

이하, 본 발명에 따른 회수율은 전술한 방법에 의하여 수득된다.

<실시예 2>

실시예 1과 동일한 방법으로 실시하되, 보조용매로 에탄올과 아세톤을 사용하였으며, 40 내지 80℃의 추출온도, 11 내지 50Mpa의 추출압력의 조건에서 총 추출시간은 120분이었다.

그 결과 40℃에서 30Mpa의 조건에서 에탄올을 보조용매로 사용한 경우 회수율은 96.5%로 가장 높은 회수율을 나타냈다.

실험 1

보조용매에 따른 회수율 측정.

보조용매로서 95% 에탄올과 99% 아세톤을 이산화탄소에 첨가하여 상기 실시예 1에 따른 장치를 구성한 후 보조용매에 따른 회수율을 측정하였다.

상기 추출압력은 30Mpa, 추출온도는 40℃였고, 이산화탄소와 보조용매의 부피비는 9:1로 하였으며, 유체의 겉보기 유속은 0.54cm/min, 추출시간은 120분이었다.

그 결과를 표 2로 나타냈다.

보조용매	추출율 (wt%)	회수율(%)	추출시간(분)
사용안함	0.035	17.7	120
95% 에탄올	0.17	87.5	120
99% 아세톤	0.133	67	120

표 2에 나타낸 바와 같이 에탄올과 아세톤을 보조용매로 사용한 경우 유기용매 추출법을 이용하여 유용성 감초 추출물을 수득하는 것 보다 단시간에 보다 높은 추출수율을 수득할 수 있고 사용되는 유기용매의 양을 감소시킬 수 있다.

실험 2

추출압력의 측정

감초로부터 글라브리딘을 추출하는 초임계 유체 추출의 추출압력을 측정하기 위하며 실시예 1에 따른 장치를 구성한 후 95% 에탄올과 99% 아세톤을 보조용매로 사용하여 회수율을 측정하였다.

유체의 겉보기 유속은 0.54cm/min이었고, 이산화탄소에 대한 보조용매의 사용량, 추출압력, 추출온도 및 추출시간 등은 표 3 및 표 4로 나타냈다.

압력 (Mpa)	온도 (℃)	보조용매	사용량 (%,v/v)	추출율 (wt%)	회수율 (%)	추출시간
11	40	95% 에탄올	10	0.154	77.9	120
20	40	95% 에탄올	10	0.154	78.0	120
30	40	95% 에탄올	10	0.173	87.5	120
40	40	95% 에탄올	10	0.179	90.4	120
50	40	95% 에탄올	10	0.168	84.7	120

※ 상기 추출시간은 120분은 연속추출시간이었다.

압력 (Mpa)	온도 (℃)	보조용매	사용량 (%,v/v)	추출율 (wt%)	회수율 (%)	추출시간
11	60	99% 아세톤	10	0.088	44.7	120
20	60	99% 아세톤	10	0.142	71.7	120
30	60	99% 아세톤	10	0.149	75.01	120
40	60	99% 아세톤	10	0.149	75.3	120
50	60	99% 아세톤	10	0.119	60.2	120

※ 상기 추출시간은 120분은 연속추출시간이었다.

표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 40Mpa의 추출압력에서 가장 높은 수율은 나타냈었다.

실험 3

추출온도의 측정

감초로부터 글라브리딘을 추출하는 초임계 유체 추출의 추출온도를 측정하기 위하여 실시예 1에 따른 장치를 구성한 후 95% 에탄올과 99% 아세톤을 보조용매로 사용하여 회수율은 측정하였다.

유체의 겉보기 유속은 0.54cm/min이었고, 이산화탄소에 대한 보조용매의 사용량, 추출압력, 추출온도 및 추출시간 등은 표 5 및 표 6으로 나타냈다.

압력 (Mpa)	온도 (℃)	보조용매	사용량 (%,v/v)	추출율 (wt%)	회수율 (%)	추출시간
30	40	95% 에탄올	10	0.173	87.5	120
30	60	95% 에탄올	10	0.166	83.64	120
30	80	95% 에탄올	10	0.135	67.98	120

※ 상기 추출시간은 120분은 연속추출시간이었다.

압력 (Mpa)	온도 (℃)	보조용매	사용량 (%,v/v)	추출율 (wt%)	회수율 (%)	추출시간
30	40	99% 아세톤	10	0.133	67.3	120
30	60	99% 아세톤	10	0.149	75.01	120
30	80	99% 아세톤	10	0.118	59.7	120

※ 상기 추출시간은 120분은 연속추출시간이었다.

표 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 추출온도 95% 에탄올을 보조용매로 사용하였을 때 동일한 압력에서 추출온도(40℃)가 낮을수록 글라브리딘 회수율은 높았으며, 99% 아세톤을 보조용매로 사용한 경우에는 60℃일 경우 가장 추출수율이 높아지는 결과를 나타내었다.

실험 4

보조용매의 사용량 측정

95% 에탄올과 99% 아세톤을 이용하여 보조용매의 사용량을 측정하기 위해 실시예 1에 따른 장치를 구성한 후 보조용매의 사용량에 따른 회수율을 측정하였다.

유체의 겉보기 유속은 0.54cm/min이었고, 이산화탄소에 대한 보조용매의 사용량, 추출압력, 추출온도 및 추출시간 등은 표 7 및 표 8으로 나타냈다.

압력 (Mpa)	온도 (℃)	보조용매	사용량 (%,v/v)	추출율 (wt%)	회수율 (%)	추출시간
30	40	95% 에탄올	10	0.173	87.5	120
30	40	95% 에탄올	25	0.191	96.4	120

※ 상기 추출시간은 120분은 연속추출시간이었다.

압력 (Mpa)	온도 (℃)	보조용매	사용량 (%,v/v)	추출율 (wt%)	회수율 (%)	추출시간
30	40	99% 아세톤	5	0.124	62.8	120
30	40	99% 아세톤	10	0.133	67.3	120
30	40	99% 아세톤	15	0.149	75.0	120
30	40	99% 아세톤	20	0.185	93.4	120
30	40	99% 아세톤	25	0.187	94.3	120

※ 상기 추출시간은 120분은 연속추출시간이었다.

표 7 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 초임계 이산화탄소에 대한 보조용매 사용량이 증가함에 따라 추출율도 증가하였다. 한편, 이산화탄소와 상기 95% 에탄올과 99% 아세톤을 3:1의 부피비로 하였을 경우 가장 높은 수율을 수득하였다. 또한 이산화탄소와 보조용매를 3:1으로 하였을 경우가 9:1로 하였을 경우보다 추출시간을 4배 단축하는 것으로 나타났다.

실험 5

유기용매 추출법과의 비교

감초로부터 글라브리딘의 수득하기 위한 유기용매 추출법과 초임계 유체 추출방법을 비교하기 위하여 실시예 1에 따른 장치를 구성한 후 하기 표 9에 나타난 조건으로 초임계 유체 추출방법을 수행하였다.

이때, 유체의 겉보기 유속은 0.54cm/min이었고, 이산화탄소에 대한 보조용매의 사용량, 추출압력, 추출온도 및 추출시간 등은 표 9에 나타내었다. 또한 상기 유용성 감초 추출물 내의 글라브리딘은 도 2 및 도 3의 HPLC로 분석한 크로마토그램으로 나타냈다.

그 다음으로, 추출물 내의 순도를 측정하기 위하여 추출 용매를 감압증류기를 사용하여 제거한 후 잔류물을 105℃에서 건조하여 가용성 고형분을 얻었다. 가용성 고형분의 농도(mg/g, mg soluble solids/g licorice)는 감초 시료의 무게에 대한 가용성 고형분의 무게에 대한 비율로서 나타내었고, 추출물 내의 글라브리딘 순도(%. w/w)는 수학식 3을 이용하여 계산하였으며, 결과는 표 9 및 표 10으로 나타냈다.

초임계 이산화탄소 추출방법

압력 (Mpa)	온도 (℃)	보조용매 (사용량(%))	유기용매 사용량 (㎖/g)	추출율 (wt%)	순도 (%)	추출시간 (분)
30	40	95% 에탄올 (25%)	3.00	0.173	7.49	30
30	40	95% 에탄올 (25%)	5.98	0.191	9.72	60

한편, 유기용매추출방법은 알콜류 등의 유기용매를 이용해 교반을 통해 추출하였으며, 그 방법을 자세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 10g의 건조감초 시료량에 대해 중량비로 10 내지 30배 가량의 추출용매를 감초 시료와 혼합한 뒤 45℃에서 교반하면서 1시간동안 용매추출하고, 용매추출이 종료된 후 추출액과 감초시료 혼합물을 3000rpm으로 15분간 원심분리하고 상등액을 취하여 추출박에 다시 용매를 첨가하여 추출하였으며, 이러한 조작을 2회 반복하였다.

그 다음, 상기 2회 추출이 종료된 후 추출액을 Whatmam 시린지 필터(0.45㎛)로 여과하여 추출액을 제조하였다. 여기서, 상기 추출용매는 100% 메탄올, 80%(v/v) 메탄올(메탄올:물=80:20)과 100% 에탄올, 95%(v/v) 에탄올(에탄올:물=95:5), 90%(v/v) 에탄올(에탄올:물=90:10), 80%(v/v) 에탄올(에탄올:물=80:20), 마지막으로 100% 아세톤을 사용하였다.

유기용매 추출방법에 의한 결과는 표 10으로 나타냈다.

용매교체수	추출용매	유기용매 사용량 (㎖/g)	추출율 (wt%)	순도 (%)	추출시간 (분)
2	95% 에탄올	60.00	0.182	1.93	120
2	99% 아세톤	89.81	0.185	4.27	120

표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같이 초임계 유체 추출방법을 통해 기존의 유기용매를 사용한 추출법보다 극히 적은 양의 유기용매 사용과 짧은 추출 시간으로 고수율의 글라브리딘과 2-4배 가량 높은 순도를 수득할 수 있었다.

<실시예 3>

상기 실시예 1에 따른 장치를 구성한 후, 300g의 감초를 추출온도 40℃, 추출압력 30 MPa에서 보조용매 95% 에탄올과 이산화탄소와의 부피비는 1:3으로 첨가하여 추출하였다.

초임계 유체 추출을 통해 얻어진 유용성 감초 추출물(글라브리딘 함량 7.5%)을 감압증류기(RE 111, BUCHI, 스위스)를 이용하여 50℃에서 감압 농축한 후, 80% 에탄올(에탄올:물=80:20)을 약 300㎖ 첨가하여 48시간 동안 일정온도(4℃)에서 보관하였다.

그 다음, 방치 후 생성된 침전물을 paper filter(Whatman No. 42, 영국)와 규조토(해동규조토, 대한민국)를 이용하여 제거하였다.

그 다음, 침전물이 제거된 추출물의 부피가 약 300㎖정도 남을 때 까지 또 다시 감압 농축을 한 후, 길이 40cm, 직경 2cm 크기의 유리컬럼에 합성 흡착제인 다이아이온 HP 20(SAMYANG사, 대한민국)를 충진하여 상부에서 하부로 일정한 유속으로 흘려보내주어 100㎖당 용출액을 수집하였다. 이 때, 사용된 합성 흡착제는 사용 전 다양한 불순물(oligomaer, monomer, solvent) 및 박테리아 번식을 억제하기 위하여 용리 용매로 충분히 세척을 해주어 사용하였다.

그 다음, 수집된 용출액은 50℃에서 감압 농축하고 3차 증류수를 가하여 재결정을 실시함으로써 글라브리딘 함량 37%의 유용성 감초 추출물 0.3g을 얻었다. 한편 글라브리딘 함량과 순도는 상기 실시예 1에 명시된 분석방법과, 실시예 2에 명시된 순도 측정방법을 이용하여 측정하였다.

본 발명은 감초로부터 단시간 내에 고순도의 글라브리딘을 고수율로 수득할 수 있을 뿐만 아니라, 간단한 정제과정을 통하여 글라브리딘 함량 35% 이상 포함된 유용성 감초추출물을 제조할 수 있다. 또한 인체에 무해한 용매인 이산화탄소와 에탄올을 사용하여 제조함으로써 환경친화적인 글라브리딘 함량 35% 이상 포함된 유용성 감초 추출물을 제조할 수 있는 효과가 있다.

Claims (7)

1. 파쇄한 감초를 31 내지 90℃의 온도범위, 7 내지 60 MPa의 압력범위에서 초임계 유체를 이용하여 감초추출물을 추출, 정제하는 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   특히, 초임계 유체로 이산화탄소를 이용하고 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 등 다양한 유기용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 보조용매와 혼합하여 초임계 추출하는 것을 특징으로 하는 유용성 감초 추출물의 추출방법.
3. 제 1항에 있어서,

   초임계 이산화탄소와 보조용매의 혼합비가 추출조건에서 부피비로 1:0.01 내지 1:0.3 바람직하게는 1:0.05 내지 1:0.2인 것을 특징으로 하는 유용성 감초 추출물 제조방법.
4. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서

   감초추출물 중 유효성분 특히, 글라브리딘 성분의 함량을 증가시키기 위해 추출기 이후 어느 한 부분에 흡착제 및 이온교환수지 등으로 충진된 컬럼을 장착하는 추출 및 정제방법.
5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,

   얻어진 감초추출물 중 플라보노이드류, 특히 글라브리딘 정제를 위하여 초임계 추출 과정 후 합성 흡착제 및 이온교환수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 글라브리딘 함량 35% 이상 포함된 유용성 감초 추출물 제조방법.
6. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,

   에탄올과 물만을 사용한 환경친화적인 정제방법인 것을 특징으로 하는 글라브리딘 함량 35% 이상 포함된 유용성 감초 추출물 제조방법.
7. 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법으로 추출 내지 정제된 유용성 감초 추출물을 0.01 내지 0.05 중량 %로 포함하는 화장품 조성물.

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