KR20060094544A - 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

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Abstract

수상세포에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 및 그의 항원 결합 부위를 개시한다. 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 분자, 면역독소 및 항원 결합체도 개시한다. 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 거쳐 인간 모노클로날 항체의 많은 이소타입을 생산할 수 있는 비-인간 형질전환 동물, 예컨대, 형질전환 마우스에서 생산할 수 있다. 상기 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 상기 인간 항체를 생산하는 비-인간 형질전환 동물 및 하이브리도마, 및 상기 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법도 개시한다.
수상세포, 모노클로날 항체, 항원 결합 부위

Description

수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체 {Human Monoclonal Antibodies to Dendritic Cells}
도 1은 플로우 사이토메트리로 측정시, 인간 모노클로날 항체 B11, C20 및 E21과 수상세포 및 조혈세포주 U937, CEM, THP-1 및 L540의 반응성을 나타낸다. 결합은 평균 형광 강도로 측정하였다.
도 2는 플로우 사이토메트리로 측정시, 인간 모노클로날 항체 B11, C20 및 E21과 수상세포의 투여량-의존적 결합을 보여준다. 결합은 평균 형광 강도로 측정하였다.
도 3은 플로우 사이토메트리로 측정시, 인간 모노클로날 항체 B11과 CD34+ 줄기세포-유래 수상세포의 투여량-의존적 결합을 보여준다. 결합은 평균 형광 강도로 측정하였다.
도 4는 플로우 사이토메트리로 측정시, 인간 모노클로날 항체 B11과 수상세포 및 대식세포의 결합을 보여준다.
도 5는 플로우 사이토메트리로 측정시, 인간 모노클로날 항체 B11과, 수상세포 표현형으로 분화되도록 유도된 THP-1의 결합을 나타낸다.
도 6은 플로우 사이토메트리로 측정시, 인간 모노클로날 항체 B11과 마카크 수상세포의 결합을 보여준다. 결합은 평균 형광 강도로 측정하였다.
도 7은 37℃에서 일정 시간에 걸친 수상세포에 의한 인간 모노클로날 항체 B11의 내재화율을 나타낸다.
도 8은 파상풍 독소-특이적 T 세포의 자극에 의해 측정할 때, 항원 단독과 비교하여 증가된, 항체 B11을 통한 항원 제시를 보여준다.
도 9는 인간 모노클로날 항체 B11의 VL (서열 1 및 2)과 VH (서열 3 및 4)의 연결에 의해 만들어진 B11 ScFv 제작물을 보여준다.
도 10은 FACS 분석에 의해 측정시, 전체 인간 모노클로날 항체 B11과 수상세포의 결합과, B11의 F(ab')2 단편과 수상세포의 결합 사이의 결합 비교를 보여준다.
도 11은 수상세포에 의한 FITC-덱스트란 내재화율을 보여준다.
도 12는 항체 B11-결합 파상풍 독소의 10 내지 100배의 양이 파상풍 독소만을 사용한 경우와 동일한 수준의 T 세포 자극을 달성하는 데 필요하기 때문에 B11과 항원의 결합이 항원 제시를 상승시킨다는 것을 보여준다.
도 13은 항체 B11의 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VL)의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.
수상세포는 1차 및 2차 T 및 B 림프구 반응을 개시하는 독특한 능력을 가진 면역시스템의 전문화된 세포이다. 전문적인 항원 제시 세포 (APC)로서 특징규명된 수상세포는 천연 T 림프구를 프라이밍시키는 데 필수적인 MHC 및 보조자극 분자를 발현한다. "천연 보조제"로도 불리는 수상세포의 이러한 독특한 성질 때문에, 자가면역질환에 있어서 그의 역할 및 다양한 질환의 면역요법에 있어서의 그의 이용 가능성에 많은 관심이 집중된다.
수상세포를 배양하는 기술에서의 최근 진보가 이러한 복합 타입의 세포에 대한 본 발명자들의 이해를 크게 개선시켰다. 계통, 조직 내의 위치, 표현형 및 기능에 의해 구별되는 여러 타입의 수상세포가 있다. 면역반응의 개시를 위해 T 림프구와 가장 잘 결합되는 수상세포는 골수 유래의 수상세포이다. 골수 유래의 수상세포는 1) 성숙 T 림프구의 소모에 특이적으로 관여하는 것으로 보이는, 림프 유래의 흉선 수상세포, 2) 피부에서 전문화된 APC 기능을 하는, 골수 계통의 랑게르한스 세포, 및 3) 특히 혈액, 비장 및 림프절에서 발견되는 골수 계통-유래의 수상세포로 세분화될 수 있다.
골수 계통-유래의 수상세포 (랑게르한스 세포를 포함함)의 특징은 1) 항원 섭취 및 제시를 위한 프로세싱을 할 수 있는 능력, 2) 조직 내에서 선택적으로 이동할 수 있는 능력, 및 3) T 림프구를 직접 자극할 수 있는 능력 (천연 및 프라이밍 둘 다)이다.
수상세포의 특징규명에 있어서 최근에 진전이 있다 하더라도, 수상세포 특이적 수용체 또는 분자에 대한 것은 거의 알려져 있지 않다. 다른 골수 및 비-골수 세포와 공유하는 다수의 수상세포-관련 분자가 있으나, 수상세포에 특이적인 이용 가능한 물질은 매우 한정되어 있다. 수상세포와 특이적으로 반응하거나 월등히 잘 반응하는 물질, 특히 항체는 종양 또는 감염성 질환 항원에 대한 강력한 면역반응을 유도하기 위한 표적 물질로서의 큰 잠재력을 갖는다. 이들 세포-특이적 표적화제는 골수 및 다른 기관 이식 또는 다른 자가면역 질환에서 강력한 APC (예컨대, 수상세포)를 없애는 독소를 전달하도록 개량할 수도 있다.
따라서, 수상세포-특이적 결합제는 치료 및 진단 가치가 높을 것이다.
본원발명은 수상세포와 특이적으로 반응하거나 월등히 잘 반응하는 물질, 특히 항체를 개발하여, 종양 또는 감염성 질환 항원에 대한 강력한 면역반응을 유도하고, 골수 및 다른 기관 이식 또는 다른 자가면역 질환에서 강력한 APC(예컨대, 수상세포)를 없애는 독소를 전달하도록 개량하는 등 치료 및 진단 용도로 사용하는 것을 목적으로 한다.
<발명의 요약>
본 발명은 항원 제시 세포 (APC), 특히 수상세포에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체, 및 다른 치료제 또는 진단제와 함께 (예컨대, 상기 치료제 또는 진단제와 혼합되거나 또는 결합된 상태로) 또는 단독으로 상기 항체를 함유하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체 및 조성물은 각종 수상세포-표적 요법에 사용될 수 있고, 예를 들어, 항원 제시에 영향을 주거나 APC-매개 질환을 치료하는 데 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 인간 항체는 수상세포와의 고친화성 결합, 및 규정된 기능을 갖는 분자 또는 세포 (예를 들어, 종양세포, 박테리아, 바이러스, 이펙터세포)를 수상세포에 표적화하여 수상세포 생장 및(또는) 기능에 영향을 주는 능력을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내 및 시험관내에서 진단제 또는 치료제로 사용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 인간 항체는 수상세포 상의 특정 신규 에피토프 (예를 들어, 수용체)와의 결합을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 인간 항체는 대식세포 만노스 수용체 또는 관련 수용체와의 결합을 특징으로 한다.
본 발명의 단리된 인간 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE와 같은 다양한 항체 이소타입을 포함한다. 전형적으로, 이들 인간 항체는 IgG1 (예를 들어, IgGlκ) 및 IgM 이소타입을 포함한다. 상기 항체는 전장일 수 있거나 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체) 항원-결합 부위 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편)만을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 재조합 인간 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 인간 항체는 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스로부터 얻은, 불멸 세포에 융합되어 있는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명의 구체적인 인간 항체에는 본 명세서에서 A3, A5, A23, A24, A33, B9, B11, B33, B47, C8, C10, C20, C28, C29, C30, C35, E1, E8, E10, E18, E20, E21 및 E24로 불리는 하이브리도마에 의해 생성되는 것이 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 수상세포와의 특이적 결합 및 1종 이상의 하기 성질을 특징으로 한다.
a) 약 107 M-1 이상, 바람직하게는 약 109 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 1010 M-1 내지 1011 M-1 이상의 결합 친화 상수;
c) 약 103 이상, 바람직하게는 약 104, 보다 바람직하게는 약 105 M-1S-1 이상의 결합 상수 (Kassoc);
d) 약 10-3 s-1, 바람직하게는 약 10-4 s-1, 보다 바람직하게는 10-5 s-1, 가장 바람직하게는 10-6 s-1의 해리 상수 (Kdis);
e) 수상세포를 옵소닌화하는 능력;
f) 수상세포와의 결합 후 내재화하는 능력;
g) 제자리에서 (예컨대, 인간 조직에서) 수상세포와 결합하는 능력;
h) 수상세포를 활성화시키는 (예컨대, 사이토킨 방출 또는 면역조절 표면 분자의 발현을 유도하는) 능력; 또는
i) (예컨대, 시험관내에서) 약 10 mg/ml 이하의 농도로 인간 이펙터세포의 존재 하에 수상세포의 생장을 억제하고(하거나) 식세포작용을 매개하고 수상세포를 사멸시키는 능력.
한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 인간 항체는 약 107 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 가장 바람직하게는 약 1010 내지 1011 M-l 이상의 친화 상수로 수상세포에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체 코딩 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이 벡터로 형질감염된 숙주 세포 뿐만 아니라, 이들 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 제조하는 방법도 본 발명에 포함된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 수상세포에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 다양한 이소타입 (예컨대, IgG, IgA 및(또는) IgM)을 발현할 수 있는 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스로부터 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 단리된 B 세포는 정제된 수상세포 제제 또는 상기 세포가 풍부한 제제로 면역화된 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻는다. 바람직하게는, 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는다. 이어서, 단리된 B-세포를 불멸화하여 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체의 공급원 (예를 들어, 하이브리도마)를 제공한다.
따라서, 본 발명은 수상세포에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 하이브리도마는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인 간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻은, 불멸 세포에 융합되어 있는 B 세포를 포함한다. 형질전환 비인간 동물은 정제된 수상세포 제제 또는 상기 수상세포가 풍부한 제제로 면역화시켜 항체-생산 하이브리도마를 만들 수 있다. 본 발명의 구체적 하이브리도마에는 A3, A5, A23, A24, A33, B9, B11, B33, B47, C8, C10, C20, C28, C29, C30, C35, E1, E8, E10, E18, E20, E21 및 E24가 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 수상세포에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 형질전환 마우스 (본 명세서에서 "HuMAb"로 불림)와 같은 형질전환 비인간 동물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 형질전환 비인간 동물은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스이다. 상기 형질전환 비인간 동물은 정제된 수상세포 제제 또는 상기 수상세포가 풍부한 제제로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 수상세포 수용체에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소타입 (예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgM)을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들어, 고전적 이소타입 전환 또는 비-고전적 이소타입 전환에 의해 일어날 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 수상세포와 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스를 정제된 수상세포 제제 또는 상기 수상세포가 풍부한 제제로 면역화시키는 것을 포함한다. 이어서, 상기 동물의 B 세포 (예를 들어, 비 장 B 세포)를 얻어 골수종 세포와 융합시켜 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성한다.
본 발명의 단리된 항-수상세포 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 유도화될 수 있거나 또 다른 기능성 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대, Fab' 단편)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 하나 이상의 다른 분자, 예컨대, 또 다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체)에 기능적으로 연결될 수 있다 (예컨대, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로 연결될 수 있음). 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 치료 잔기, 예컨대, 세포독성 약물, 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편, 방사성 동위원소 또는 소분자, 예컨대, 면역조절 (예를 들어, 항-염증성) 화합물 또는 항암제에 결합된 인간 항-수상세포 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 항-수상세포 항체는 항원을 내재화하고 프로세싱하고 제시하는 수상세포에 상기 항원이 표적화되도록 상기 항원에 결합시킬 수도 있다. 항원은 예를 들어, 종양세포 항원, 미생물 항원, 바이러스 항원 또는 자가항원일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 항원에 결합된 수상세포의 표면 상의 성분에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는 분자 결합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원 (예를 들어, 종양세포 항원, 미생물 항원 또는 바이러스 항원)에 대한 면역반응을 유도하거나 상승시키는 방법을 제공 하는데, 여기서 상기 수상세포 표면 상의 성분은 결합 특이적 부위에 의해 결합될 때 상기 분자 결합체의 내재화를 매개한다. 한 실시양태에서, 면역반응은 항원에 결합하는 항체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 면역반응은 MHC-I 또는 MHC-II 결합체의 한 성분으로서 항원에 결합하는 T 세포를 포함한다.
한 측면에서, 항-수상세포 항체 또는 그의 단편은 전체 세포 (예컨대, 종양세포, 이펙터세포) 또는 병원체를 수상세포에 표적화하여 면역반응을 유도하는 데 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 항-수상세포 항체가 세포의 표면 상에서 발현되도록 본 발명의 인간 항-수상세포 항체를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항-수상세포 항체는 세포(예컨대, 종양세포, 박테리아 또는 바이러스)가 수상 세포에 표적화될 수 있도록 상기 세포의 세포 표면에 직접 화학적으로 아니면 다른 방식으로 가교결합시키거나, 앵커링시키거나 또는 태깅할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 항원에 결합된 수상세포의 표면 상의 성분에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는 분자 결합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 면역화시키는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 수상세포 표면 상의 성분은 상기 결합 특이적 부위에 의해 결합될 때 상기 분자 결합체의 내재화를 매개한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 수상세포에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이적 부위 및 Fc 수용체, 예컨대, 인간 FcγRI 또는 인간 Fcα수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 또다 른 측면에서, 본 발명은 수상세포에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이적 부위 및 표적세포 상의 항원에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다. 표적세포는 제거하면 숙주에게 유익한 세포, 예컨대, 종양세포, 미생물 병원체, 바이러스 또는 바이러스-감염 세포이다.
본 발명의 다중특이적 분자에는 삼중특이적, 사중특이적 및 다른 다중특이적 분자도 포함된다. 한 실시양태에서, 다중특이적 분자에는 항-상승 인자 (EF) 부위, 예컨대, 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하는 분자가 포함된다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 하나 이상의 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv)을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 항체 및 그의 단편은 완전한 인간 항체 또는 그의 일부이거나, "키메라" 또는 "인간화" 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, 비인간 항체 (예컨대, 뮤린)으로부터 유래된 가변 영역 또는 적어도 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖고, 나머지 부위는 인간으로부터 유래된 항체)이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자로 된 하나 이상의 항체 또는 그의 단편은 인간 IgG 수용체 즉, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 같은 Fc-감마 수용체 (FcγR)와 같은 Fc 수용체에 결합한다. 바람직한 Fc 수용체는 고친화성 Fcγ수용체인 FcγRI 수용체이다. 그러나, 다른 Fc 수용체, 예컨대 인간 IgA 수용체 (예컨대, FcαRI)도 표적화될 수 있다. Fc 수용체는 이펙터세포, 예컨대, 단핵구, 대식세포 또는 활성화된 다형핵 세포의 표면 상에 위치하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 Fc 수용체의 이뮤노글로불린 Fc (예를 들어, IgG 또는 IgA)와 구별되는 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 이중특이적 분자와 다중특이적 분자의 결합은 이뮤노글로불린의 생리학적 농도에 의해 방해받지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 수용체를 발현하는 이펙터세포, 예를 들어, 대식세포 또는 활성화된 PMN 세포를 포함하는, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 결합된 표적-특이적 이펙터세포를 제공하는데, 상기 이중특이적 또는 다중특이적 분자는 이펙터세포의 Fc 수용체를 통해 이펙터세포에 결합하고 수상세포에도 결합하여 이펙터세포가 수상세포에 표적화되도록 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체, 및 수상세포에 특이적으로 결합하는 본 발명의 하나 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 및 진단 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 배합물을 포함하며, 상기 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위 각각은 상이한 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이펙터세포의 존재 하에 수상세포의 고효율적 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 수상세포의 생장을 억제하는 또 다른 인간 모노클로날 항체와 병용할 수 있다. 따라서, 이러한 병용은 최대 치료 효과를 제공하도록 맞춰진 다양한 치료법을 제공한다. 본 발명의 하나 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위와 본 발명의 하나 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 분자 또는 다른 치료제 (예컨대, 세포독성제)의 배합물을 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물도 본 발명의 범위내에 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체)를 사용하여 인간 이펙터세포, 예컨대, 인간 다형핵 세포 (PMN)에 의한 수상세포의 생장을 억제하고(하거나) 상기 수상세포의 식세포작용 및(또는) 사멸을 유도시킴으로써 수상세포의 증식 및(또는) 분화를 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 수상세포를 시험관내 또는 생체내에서 인간 이펙터세포의 존재 하에 본 발명의 인간 모노클로날 항체 및 그의 항원-결합 부위 하나 중 하나 또는 이들의 배합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 배양물, 예를 들어, 시험관내 또는 생체외 (예컨대, 수상세포 및 이펙터세포를 포함하는 배양물) 중에서 이용할 수 있다. 예를 들어, 수상세포 수용체를 발현하는 세포 및 이펙터세포를 함유하는 샘플을 시험관내에서 배양하여 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자)와 배합할 수 있다. 별법으로, 상기 방법은 예를 들어, 생체내 (예컨대, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서 대상체내에서 수행할 수 있다.
생체내 방법의 경우, 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자)는 수상세포-관련 질환을 앓는 인간 환자에게 투여하여할 수 있다. 이러한 질환에는 예를 들어, 자가면역질환, 염증질환, 이식편 대 숙주 질환이 포함된다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료하거나 (예를 들어, 완화시키거나) 예방할 수 있는 예시적 자가면역질환에는 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 중증근무력증, 악성빈혈, 애디슨병, 홍반성루프스, 레이터 증후군 및 그레이브스병이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 상기 대상체는 Fc 수용체, 예컨대, Fcα 수용체 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절하는, 예를 들어, 상승시키거나 억제하는 물질, 예를 들어, 사이토카인으로 더 치료할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자로 치료하는 동안 투여하기에 바람직한 사이토카인으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 있다.
본 발명의 단리된 인간 모노클로날 항체 조성물은 다른 공지된 치료법, 예를 들어, 항-염증요법, 면역억제요법 또는 세포독소 투여와 함께 병행할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 중의 수상세포의 존재를 시험관내에서 또는 생체내에서 검출하기 위한 방법, 예를 들어, 수상세포-관련 질환을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 대조구 샘플과 함께 시험할 샘플을, 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 수상세포 사이의 결합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 이중특이적 또는 다중특이적 분자)와 접촉시킴으로써 달성된다. 이어서, (예를 들어, ELISA를 이용하여) 두 샘플에서 결합체 형성을 검출하고, 두 샘플 사이의 결합체의 형성에 있어서 임의의 통계학적으로 유의한 차이점은 수상세포 항원이 시험 샘플에 존재함을 나타낸다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 항원에 대한 면역반응을 조절하고 수상세포에 의해 매개되는 질환을 치료 및 진단하는 데 이용하기 위한 신규 항체-기재 요법을 제공한다.
본 발명의 요법은 항원 제시 세포 (APC), 특히 수상세포 및 이와 관련된 세포 상의 에피토프에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 사용한다. 한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소타입 (예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예컨대, 형질전환 마우스에서 생산한다. 따라서, 본 발명의 다양한 측면은 항체, 항체 단편, 항체 유사체 및 그의 제약학적 조성물 뿐만 아니라, 비인간 형질전환 동물 및 상기 모노클로날 항체를 생산하기 위한 B-세포 및 하이브리도마를 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 수상세포 또는 수상세포 항원을 발현하는 관련 세포를 검출하거나 시험관내 또는 생체내에서 수상세포의 생장, 분화 및(또는) 활성을 억제하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 일부 용어를 먼저 정의한다. 추가 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "수상세포"는 미성숙 및 성숙 수상세포; 및 수상세포, 또는 수상세포와 공통된 항원을 발현하는 관련 항원 제시 세포 (예컨대, 단핵구 및 대식세포)로 분화할 수 있는 관련 골수 조상세포를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "관련"에는 공통 조상세포 또는 세포 계통으로부터 유래된 세포가 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 수상세포의 결합은 수상세포의 생장을 억제한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 수상세포의 결합은 규정된 기능을 하는 분자 또는 세포(예컨대, 종양세포, 이펙터세포, 미생물 병원체)를 수상세포에 표적화시킴으로써 수상세포의 생장 및(또는) 기능에 대한 영향을 매개한다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체와 수상세포의 결합은 수상세포에 의한 항체의 내재화를 일으킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호결합된 두 개 이상의 중쇄 (H) 및 두 개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질을 말한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 한 개의 도메인, 즉 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 더 나누어질 수 있는데, 상기 초가변 영역 사이에는 골격 영역 (FR)으로 불리는, 보존성이 보다 높은 영역이 존재한다. 각 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자와 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 항체의 "항원 결합 부위" (또는 단순히 "항 체 일부"란 용어는 항원 (예컨대, 수상세포 상의 항원)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 보여진 바 있다. 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 있다. 더욱이, Fv 단편의 VL 및 VH 도메인이 별개의 유전자에 의해 코딩된다 하더라도, 재조합 방법을 사용하여, 이들 두 도메인이 페어링(pairing)되어 1가 분자를 형성한 단일 단백질로서 만드는 합성 링커에 의해 이들 두 도메인을 연결시킬 수 있다 (상기 1가 분자는 단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어, 문헌 (Bird et al., (1998) Science 242: 423-426; 및 Huston et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)을 참조함). 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에 포함되는 것이다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 얻고, 유용한 단편은 온전한 항체의 경우와 동일한 방식으로 스크리닝한다.
용어 "이중특이적 분자"는 예컨대, (a) 수상세포 및 (b) 이펙터세포의 표면 상의 Fc 수용체와 결합하거나 상호작용하는 두 개 다른 결합 특이적 부위를 갖는 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 단백질 결합체 또는 펩티드 결합체를 포함한다. 본 발명의 이중특이적 분자는 (a) 수상세포 및 (b) 표적세포 (예컨대, 종양세포) 상의 항원과 결합하거나 상호작용하는 두 개의 다른 결합 특이적 부위를 갖는다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"에는 예컨대, (a) 수상세포, (b) 이펙터세포 표면 상의 Fc 수용체 및 (c) 하나 이상의 다른 성분과 결합하거나 상호작용하는 두 개 이상의 결합 특이적 부위를 갖는 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 단백질 결합체 또는 펩티드 결합체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 수상세포 항원와 같은 세포 표면 항원, 및 이펙터세포 상의 Fc 수용체 또는 표적세포 (예컨대, 종양세포) 상의 항원에 대한 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 다른 다중특이적 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "이중특이적 항체"는 디아보디(diabody)를 추가로 포함한다. 디아보디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에 발현되는 2가 이중특이적 항체이지만, 동일한 사슬 상의 상기 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하기 때문에 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 상기 도메인들이 페어링되어 두 개의 항원-결합 부위가 형성된다 [예를 들어, 문헌 (Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123)을 참조].
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 항체"는 두 가지 이상의 항체, 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab), 그의 유도체, 또는 항원-결합 영역들이 연결된 것 (이들은 2종 이상의 상이한 특이적 부위를 가짐)을 말한다. 이들 상이한 특이적 부위에는 수상세포에 대한 결합 특이적 부위, 이펙터세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이적 부위, 및 표적세포, 예컨대, 종양세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이적 부위가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발이나 생체내 체세포 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"에는 마우스와 같은 다른 포유동물종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 이식되어 있는 항체는 포함되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자로 된 제제를 말한다. 모노크로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 보인다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻은, 불멸화 세포에 융합된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 유전자 (하기 단락 I에 더 자세히 기재됨)로 형질전환된 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체; 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체; 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 또는 다른 DNA 서열에 대한 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내에서 돌연변이시켜 (또는 인간 Ig 서열로 형질전환된 동물이 사용된 경우에는, 생체내에 체세포 돌연변이를 유발하여) 얻은 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포의 VH 및 VL 서열로부터 유래하며 이 서열과 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식세포 레파토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본 명세서에 사용된 용어 "이종 항체"는 이러한 항체를 생산하는 형질전환 비인간 유기체와 관련되어 정의된다. 이 용어는 형질전환 비인간 동물로 구성되지 않고 대체적으로 형질전환 비인간 동물종 이외의 종으로부터 유래된 유기체에서 발견된 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 말한다.
본 명세서에 사용된 용어 "헤테로하이브리드 항체"는 다양한 유기체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 말한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 연결된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다. 헤테로하이브리드 항체의 예로는 전술된 키메라 항체 및 인간화 항체가 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 (예를 들어, 수상세포 및 관련 골수 유래의 항원 제시 세포 (예컨대, 단핵구 및 대식세포)에 특이적으로 결합하며, 수상세포 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않는 단리된 항체)를 말한다. 그러나, 수상세포에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 세포, 예컨대, 수상세포 상의 동족 항원과 관련된 항원을 발현하는 세포와 교차 반응할 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및(또는) 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 다양한 특이성을 갖는, "단리된" 모노클로날 항체의 배합물은 잘 정의된 조성물 중에서 배합한다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적 결합" 및 "에 특이적으로 결합한다"는 예정된 항원 또는 세포에 대한 항체 결합의 특이성을 말한다. 특정한 항원 또는 세포"에 특이적으로 결합하는" 또는 특정한 항원 또는 세포"에 대해 특이적인" 항체는 다른 항원 및 세포에 대해서보다 더 높은 선별성으로 상기 항원 또는 세포에 결합한다. 본 발명의 각 항체는 특정한 표적 에피토프 (예컨대, 수상세포 표면 상에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하지만, 특정 실시양태에서 본 발명의 특정 항체는 다른 APC와 어느 정도의 교차 반응을 나타낼 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 약 1 x 107 M-1의 친화도로 예정된 항원과 결합하고, 예정된 항원 또는 관련성이 높은 항원 이외의 비특이적 항원 (예컨대, BSA, 카세인)에 대한 그의 결 합 친화도보다 2배 이상 더 높은 친화도로 예정된 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본 명세서에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어와 상호교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고친화도"란 용어는 약 107 M-1 이상, 바람직하게는 약 109 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 또는 그 이상, 예를 들어, 1013 M-1 이상의 결합 친화도를 말한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항체 이소타입마다 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 "고친화성" 결합은 약 1 x 107 M-1 이상의 결합 친화도를 말한다.
본 명세서에 사용된 용어 "Kassoc"는 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 말한다.
본 명세서에 사용된 용어 "Kdis"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 말한다.
본 명세서에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예컨대, IgM 또는 IgG)를 말한다.
본 명세서에 사용된 "이소타입 전환"은 항체의 클래스 또는 이소타입이 한 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스로 바뀌는 현상을 말한다.
본 명세서에 사용된 "전환되지 않은 이소타입"은 이소타입 전환이 일어나지 않은 경우 생산되는 중쇄의 이소타입 클래스를 말하는데, 전환되지 않은 이소타입 을 코딩하는 CH 유전자는 전형적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 아래에 위치한 제1 CH 유전자이다. 이소타입 전환은 고전적인 이소타입 전환 또는 비고전적인 이소타입 전환으로 분류된다. 고전적인 이소타입 전환은 트랜스진내의 전환 서열 영역을 하나 이상 수반하는 재조합 과정에 의해 일어난다. 비전환적 이소타입 전환은 예를 들어, 인간 σμ과 인간 Σμ(δ-관련 결실) 사이의 상동 재조합에 의해 일어날 수 있다. 트랜스진 간의 재조합 및(또는) 염색체 간의 재조합과 같은 별도의 비고전적 전환 메커니즘이 일어나 이소타입 전환을 수행할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "전환 서열"은 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 말한다. 전형적인 μ전환 영역인 "전환 공여자 (donor)" 서열은 전환 재조합 동안 결실되는 작제물 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실된 작제물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대, γ, ε등) 사이에 있을 것이다. 재조합이 항상 일어나는 특정 부위가 없기 때문에, 일반적으로 작제물로부터 최종 유전자 서열을 예측할 수 없을 것이다.
본 명세서에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 보다 구체적으로 이뮤노글로불린 단백질에 공유 결합된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다. 이종 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비인간 형질전환 동물의 종의 글리코실화 패턴과 더 유사하다는 것을 당업자가 인식할 경우, 상기 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 형질전환 동물 종에 의해 생산되는 항체 상에서 자연적으로 발생되는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 한 대상체에게 적용되는 "자연-발생"이란 용어는 상기 대상체를 자연 상태로 발견할 수 있다는 사실을 말한다. 예를 들어, 자연 상태의 공급원으로부터 단리할 수 있고 실험실에서 인간에 의해 고의적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적인 서열이다.
본 명세서에 사용된 용어 "재배열된"은 V 단편이 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 코딩하는 구조로 D-J 또는 J 단편과 바로 인접한 위치에 있는 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 좌위의 구성을 말한다. 재배열된 이뮤노글로불린 유전자 좌위는 생식세포의 DNA와 비교하여 확인할 수 있고, 재배열된 좌위에는 1종 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 원소가 있을 것이다.
V 단편에 대해 본 명세서에 사용된 용어 "재배열되지 않은 구성" 또는 "생식세포 구성"이란 용어는 V 단편이 재조합되지 않아 D 또는 J 단편에 바로 인접하는 구성을 말한다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 수상세포와 결합하는 항체 또는 항체 일부 (예를 들어, VH, VL, CDR3)를 코딩하는 핵산에 대한 용어 "단리된 핵산 분자"는 수상세포 이외의 세포에 결합하는 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 다른 뉴클레오티 드 서열이 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 없는 핵산 분자를 말하는데, 상기 다른 서열은 인간 게놈 DNA 내의 상기 핵산을 자연적으로 플랭킹할 수 있다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"이란 적당한 뉴클레오티드가 삽입 또는 결실되어 있는 두 핵산 또는 그의 특정 서열이 최적으로 정렬되어 비교될 때 뉴클레오티드의 약 80% 이상, 통상적으로 약 90 내지 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 98 내지 99.5% 이상 동일함을 의미한다. 또는, 실질적인 상동성은 단편이 선택적인 혼성화 조건 하에서 상기 단편 가닥의 상보체와 혼성화할 때 존재한다.
두 서열 사이의 동일성%은 갭 (gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 서열에 의해 나누어진 동일한 위치의 뉴클레오티드 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/ 위치의 총 # X 100). 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성%의 측정은 하기 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성%은 NWSgapdna CMP 메트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램을 이용하여 측정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성%은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용한 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)내로 도입되는 알고리즘 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989))]을 이용하여 측정할 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동 일성%은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램내로 도입되는 니들만 및 웬치 [Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))] 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "의문 서열"로 사용하여 공개 데이터베이스를 검색함으로써 예컨대, 관련된 서열을 확인할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. NBLAST 프로그램 (점수 = 100, 단어길이 = 12)으로 BLAST 뉴클레오티드를 검색하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램 (점수 =50, 단어길이 =3)으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교하기 위한 갭 정렬을 얻기 위해서는 갭 BLAST를 문헌 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조).
핵산은 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 전체 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 기술을 비롯 한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 분리되어 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한 형태가 된"다 (F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한효소 부위 등은 제외함), 유전자 서열을 제공하는 표준 기술에 따라 돌연변이될 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이들 돌연변이는 원하는 아미노산 서열에 영향을 줄 수 있다. 특히, 천연 V, D, J 불변 서열 및 전환 서열 및 본 명세서에 기재된 다른 이러한 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유도된 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유도된"은 한 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또는 다른 서열로부터 변형된 것임을 의미함).
용어 "활동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 한 분자의 활성 또는 상태의 변화가 다른 분자의 활성 또는 상태에 의해 영향을 받도록 분자들이 서로 기능적으로 커플링되어 있는 것을 말한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖도록 놓여 있을 때 "작동 가능하게 연결되어" 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 이들이 서열의 전사에 영향을 주다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열의 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고, 필요한 경우, 두 개의 단백질 코딩 영역이 인접하여 리딩 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 서열이 전환 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 작동가능하게 연결된 두 개의 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 공유결합되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터 중 한 유형은 추가 DNA 단편이 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 말하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터인데, 이 벡터에서 추가 DNA 단편은 바이러스 게놈내로 결찰될 수 있다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀형 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀형 포유동물 벡터)도 숙주 세포내로의 도입시 숙주 세포의 게놈내로 삽입되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 일부 벡터는 이들과 작동 가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순하게 "발현 벡터")로 불린다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이므로 상호교환 가능하게 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 불능 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 동일한 기능을 갖는 다른 형태의 발현 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 단순하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손세포도 말하는 것으로 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 후대 세포에서 일부 변형이 일어날 수 있기 때문에, 사실상 이러한 자손세포는 모세포와 동일하지 않을 수 있지만 본 명세서에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에 여전히 포함된다.
본 발명의 다양한 측면이 하기 단락에 더 자세히 기재된다.
I. 수상세포에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 인간 모노클로날 항체 (mAb)를 생성시키는 특히 바람직한 방법이 본 명세서에 자세히 기재되어 있지만, 통상적인 모노클로날 항체 생산기술, 예를 들어, 표준 체세포 혼성화 기술 (Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975))을 비롯한 다양한 기술도 이용할 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 바람직하다고 하더라도, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스 또는 온코진 형질전환을 이용할 수도 있다.
하이브리도마를 제조하는 데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 뮤린에서의 하이브리도마 제조는 매우 잘-확립된 방법이다. 융합용 면역화 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예컨대, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 수반하는 형질전환 마우스를 이용하여 발생시킬 수 있다. 본 명세서에서 "HuMAb" 마우스로 불리는 이들 형질전환 마우스는, 내재 μ쇄 및 κ쇄 좌위를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로 불린 유전자 미니좌위를 함유한다 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). 따라서, 상기 마우스는 마우스의 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 보이고, 면역화에 반응하여 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 일어나 고친화성 인간 IgGκ모노클로날 항체가 생산된다 (Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546). HuMAb 마우스의 제조는 하기 단락 II 및 문헌 (Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851)에 자세히 기재되어 있고, 이들의 전체 개시 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 또한, 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,789,650호, 제5,877,397호, 제 5,661,016호, 제5,814,318호, 제5,874,299호 및 제5,770,429호 (Lonberg and Kay, and GenPharm International); 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.); 1998년 6월 11일 공개된 WO 98/24884; 1994년 11월 10일 공개된 WO 94/25585; 1993년 6월 24일 공개된 WO 93/1227; 1992년 12월 23일 공개된 WO 92/22645; 1992년 3월 19일 공개된 WO 92/03918도 참조할 수 있는데, 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
HuMAb 면역화
수상세포에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 문헌 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 and WO 98/24884)에 기재된 바와 같이 HuMAb 마우스를 정제된 수상세포 제제 또는 이 수상세포가 풍부한 제제로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 생후 6-16주에 처음 면역화시킬 것이다. 예를 들어, 단리된 수상세포 제제 또는 수상세포가 풍부한 제제 (1-106 세포)를 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다. 정제된 수상세포 제제 또는 수상세포가 풍부한 제제를 사용한 면역화가 항체를 발생시키지 않을 경우, 마우스를 수상세포 용해물로 면역화시켜 면역 반응을 촉진할 수도 있다.
다양한 항원을 사용한 중복 실험은 HuMAb 형질전환 마우스를 프로인트 완전 면역보강제 (complete Freund's adjuvant) 중의 항원을 사용하여 복강내로 (IP) 초기 면역화시킨 후 프로인트 불완전 면역보강제 (incomplete Freund's adjuvant) 중 의 항원으로 (총 6회까지) 매주 IP 면역화하는 경우, 상기 HuMAb 형질전환 마우스가 가장 잘 반응한다는 것을 보인 바 있다. 면역 반응은 안와후 출혈에 의해 얻어지는 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜의 경로에 걸쳐 관찰할 수 있다. 혈장을 ELISA 또는 플로우 사이토메트리 (하기에 기재함)에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-수상세포 인간 이뮤노글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적출하기 3일 전에 마우스를 항원으로 정맥내 부스팅시킬 수 있다. 각 항원에 대해 2-3회의 융합을 수행할 필요가 있을 수 있음이 예측된다. 각 항원에 대해 여러 마리의 마우스를 면역화시킬 것이다. 예를 들어, HC07 및 HC012 계통의 총 12마리 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다.
수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
표준 프로토콜을 기초로 하여 마우스 비장세포를 단리하고 PEG로 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝한다. 예를 들어, 면역화 마우스로부터 얻은 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG를 사용하여 상기 단일 세포수의 1/6에 상응하는 수의 P3X63-Ag8.653 비-분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)와 융합시킨다. 대략 2 x 105 만큼의 세포를 평편 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅한 후, 20% 태아소 클론 혈청, 18% "653" 상태조절 배지, 5% 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM L-글라타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캡토에타놀, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 젠타마이신 및 1 X HAT (Sigma; HAT는 융합으로부터 24시간 후 첨가함)이 함유된 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, ELISA에 의해 개별 세포를 인간 항-수상세포 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 일단 광범위한 하이브리도마 생장이 일어나면, 통상 10-14일 후 배지를 관찰한다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG, 항-수상세포 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 제한 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 다음으로, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 조직 배양 배지 중의 소량의 항체를 생산하여 특징규명에 사용하였다.
수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체의 결합 특징 규명
본 발명의 인간 모노클로날 수상세포 항체의 결합 특징을 규명하기 위해, 예를 들어, 플로우 사이토메트리로 수상세포와의 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다.
요약하면, 수상세포를 모아 세척한 후, 96웰 플레이트에 첨가하고 하이브리도마 상등액 (또는 0.1% Tween 80 및 20% 마우스 혈청이 함유된 PBS 중의 모노클로날 항체)의 희석물과 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 상기 플레이트를 세척하고, 4℃에서 2차 항체 (예컨대, FITC 또는 PE-표지 항-인간 IgG)와 1시간 동안 더 인큐베이션한다. 세포를 세척한 후, 세포를 1% 파라포름알데히드로 고정시키고 분석한다. 샘플을 광, 및 단일 세포 상의 게이트에 대한 측산란성을 이용하는 FACScan 장치로 분석할 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 다른 분석법을 플 로우 사이토메트리 분석법과 함께 또는 플로우 사이토메트리 분석법 대신에 이용할 수 있다. 세포는 정확히 상기한 바와 같이 염색하고 형광 현미경으로 조사할 수 있다. 이 방법은 개별 세포의 가시화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 민감성을 나타낼 수 있다.
수상세포에 대한 고결합도로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 그 특징을 추가로 규명할 것이다. 모세포의 반응성 (플로우 사이토메트리에 의해 측정함)을 보유하는 각 하이브리도마로부터 얻은 하나의 클론을 선택하여 -140℃에 저장되는 5-10개의 바이알 세포 뱅크를 제조하고 항체를 정제할 수 있다.
인간 항-수상세포 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 2 리터 스피너-플라스크에서 생장시켜 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상등액을 여과하고 단백질 A-세파로스를 사용한 친화 크로마토그래피 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 전에 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교체할 수 있고, 1.43 흡광 계수를 사용한 OD280에 의해 농도를 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에 저장할 수 있다.
선별된 인간 항-수상세포 모노클로날 항체가 특정한 에피토프에 결합하는지를 알아보기 위해, 시판되는 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 각 항체를 바이오티닐화할 수 있다. 상기한 바와 같이 플로우 사이토메트리를 이용하여 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 바이오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구 를 수행할 수 있다. 바이오티닐화 모노클로날 항체 결합은 스트렙-아비딘 알칼리성 포스패타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 10 ㎍/ml의 항-인간 Ig로 밤새 코팅할 수 있다. 5% BSA로 블로킹한 후, 주위 온도에서 상기 플레이트를 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조구와 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스패타제-결합 프로브와 반응시킬 수 있다. 세척 후, pNPP 기질 (1 mg/ml)로 현상하고 405-650의 OD에서 분석한다.
웨스턴 블롯팅으로 항-수상세포 인간 IgG와 수상세포 항원의 반응성에 대해 더 시험할 수 있다. 요약하면, 수상세포의 세포 추출물을 준비하여 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고 20% 마우스 혈청으로 블로킹하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스패타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 현상할 수 있다.
수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체의 식세포작용 활성 및 세포 살해 활성
수상세포에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항-수상세포 항체의 능력 이외에, 수상세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항-수상세포 항체의 능력에 대해 시험할 수 있다. 모노클로날 항체 활성의 시험관내 시험은 생 체내 모델에서 시험하기 전에 초기 스크리닝을 제공할 것이다. 요약하면, 건강한 공여자의 다형핵 세포 (PMN) 또는 다른 이펙터세포는 피콜 하이파크 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리 후 오염 적혈구를 용해시켜 정제할 수 있다. 세척된 PMN은 10% 열-불활성화 태아소 혈청이 보충된 RPMI에 현탁시키고, 수상세포에 대한 이펙터세포의 다양한 비율로 (이펙터세포 : 수상세포) 51Cr 표지 수상세포와 혼합할 수 있다. 그 다음, 정제된 인간 항-수상세포 IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 관련없는 인간 IgG를 음성 대조구로 사용할 수 있다. 분석은 37℃에서 0-120분 동안 수행할 수 있다. 배양 상등액으로 방출되는 51Cr을 측정함으로써 샘플을 세포용해에 대해 분석할 수 있다. 항-수상세포 모노클로날 항체는 세포용해가 다수의 모노클로날 항체에 의해 상승되는지 상승되지 않는 지를 알아보기 위해 서로 배합된 상태로 시험할 수도 있다.
수상세포에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생체내 모델 (예컨대, 마우스)에서 시험하여 수상세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 데 있어서의 상기 항체의 효능을 알아볼 수도 있다. 이들 항체는 예컨대, 하기 기준을 기초로 하여 선별할 수 있고, 하기 기준은 제한되지 않는다:
1) 살아있는 수상세포에의 결합;
2) 수상세포와의 높은 결합 친화도;
3) 수상세포 상의 단일 에피토프와의 결합 (함께 사용될 경우 상보적 활성을 갖는 모노클로날 항체가 동일한 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁한다는 가정은 제 외함);
4) 수상세포의 옵소닌화;
5) 인간 이펙터세포의 존재 하에 수상세포의 생장 억제, 식세포작용 및(또는) 사멸의 매개;
6) 수상세포와 결합한 후 내재화;
7) 제자리에서 (예컨대, 인간 조직에서) 수상세포에의 결합;
8) 수상세포의 활성화 (예컨대, 사이토카인 방출 및 면역조절 표면 분자 (예컨대, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD40 및 CD54 (ICAM)) 발현의 유도);
9) 수상세포 상이 인간 만노스 수용체에의 결합; 및
10) 영장류 사이에 보존되어 있는 수상세포 항원에의 결합.
본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 이들 기준 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 총족시킨다. 구체적인 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 예를 들어, 1종 이상의 항-수상세포 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물로서 함께 사용된다. 예를 들면, 다르지만 상보적인 활성을 갖는 인간 항-수상세포 모노클로날 항체를 단일 치료법으로 함께 사용하여 원하는 치료 및 진단 효과를 얻을 수 있다. 이것의 일례로는 수상세포의 항원 제시 세포 활성, 예를 들어, 면역조절 사이토카인의 방출을 유도하는 또 다른 인간 항-수상세포 모노클로날 항체와 함께, 수상세포에 의해 급속히 내재화되는 항-수상세포 인간 모노클로날 항체를 함유하는 조성물이 있다.
II. 인간 모노클로날 항-수상세포 항체를 생성하는 비인간 형질전환 동물의 발생
또 다른 측면으로, 본 발명은 수상세포에 특이적으로, 바람직하게는 높은 친화도로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현시킬 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스(HuMAb 마우스)는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는다. 한 실시양태에서, 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스는 정제된 수상세포 제제 또는 수상세포가 풍부한 제제로 면역화된다. 바람직하게는, 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 수행함으로써 수상세포에 대한 다수의 인간 모노클로날 항체 이소타입(예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은, 예를 들어 고전적이거나 비고전적인 이소타입 전환에 의해 일어날 수 있다.
이종 항체 레파토리를 사용한 외래 항원 자극에 대해 반응하는 비인간 형질전환 동물을 디자인하기 위해서는, 이종 이뮤노글로불린 트랜스진이 형질전환 동물내에 포함되어 있고 B-세포 발생 경로를 통해 정확하게 작동하는 것을 필요로 한다. 바람직한 실시양태에서, 이종 중쇄 트랜스진의 정확한 작동에는 이소타입 전환이 포함된다. 따라서, 본 발명의 트랜스진은 이소타입 전환, 및 (1) 높은 수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능성 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 대립유전자 배제에 대한 반응, (4) 충분한 1차 레파토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다변이, 및 (7) 면역 반응 동안의 트랜스진 항체 좌위의 우성화 중 하나 이상을 나타내도록 제작한다.
상기 기준 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들어, 형질전환 동물의 내재 이뮤노글로불린 좌위의 기능이 손상된 실시양태의 경우, 트랜스진은 대립유전자 배제를 활성화할 필요가 없다. 또한, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 실시양태의 경우, 기능적 유전자 재배열의 두번째 기준은 적어도 트랜스진이 이미 재배열된 경우에는 필요치 않다. 분자 면역학의 배경 기술에 대하여는, 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N. Y.]을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 데 사용되는 비인간 형질전환 동물은 형질전환 동물의 생식세포에서 재배열된 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 또는 이들의 조합을 포함한다. 중쇄 트랜스진은 각각 하나 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 형질전환 동물의 B-세포에서 다수의 CH 유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소타입 전환을 뒷받침할 수 있는 기능성 이소타입 전환 서열을 포함할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스진 CH 유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 생식세포 이뮤노글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것이거나, 또는 이 트랜스진 제작물을 수용하게 될 종 (형질전환 동물)에서 발생하는 것들로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 마우스를 생성하는 데 사용되는 인간 트랜스진 제작물은 이 제작물이 마우스 중쇄 좌위에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 전환 서열을 포함하는 경우, 아마도 마우스 전환 서열은 마우스 전환 리컴비나제 효소 시스템과 함께 작동되도록 최적화되어 있지만 인간 전환 서열의 경우에는 그렇지 못할 것이기 때문에, 이소타입 전환 이벤트를 더 높은 빈도로 수행할 수 있다. 전환 서열은 통상의 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝되거나, 또는 이뮤노글로불린 전환 영역 서열에 대한 공개된 서열 정보를 기초로 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드를 중첩시켜 드 노보(de novo)로 합성할 수 있다 [그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 문헌(Mills et al., Nucl. Acids Res. 15: 7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1: 631-642 (1989)) 참조]. 상기 형질전환 동물 각각의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진은 형질전환 동물의 B-세포내에 상당한 비율 (10 % 이상)로 존재한다.
본 발명의 형질전환 동물을 발생시키는 데 사용되는 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 단편, 하나의 변화(diversity) 유전자 단편, 하나의 연결(joining) 유전자 단편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 포함한다. 이뮤노글로불린 경쇄 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 단편, 하나의 연결 유전자 단편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 코딩하는 유전자 단편은 비인간 형질전환 동물로 구성되지 않은 종으로부터 얻은, 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 코딩하는 DNA로부터 유도되거나 또는 이 DNA와 상응한다는 점에서 비인 간 형질전환 동물에 대하여 이종성이다. 본 발명의 한 측면에서, 트랜스진은 개별 유전자 단편이 재배열되지 않도록, 즉 기능성 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게끔 제작한다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 단편의 재조합 (기능적 재배열)을 지지하며, 바람직하게는 수상세포에 노출되는 경우 비인간 형질전환 동물에서 생성된 재배열된 이뮤노글로불린 중쇄내의 D 영역 유전자 단편의 전부 또는 일부의 혼입을 지지한다.
다른 실시양태에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 통상적으로 C, D 및 J 단편뿐 아니라 V 유전자 단편 하위군의 실질적인 부분을 포함한다. 이와 같은 트랜스진 제작물에서, 다양한 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 클래스 전환 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여체 및 스플라이스-수용체 서열 및 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유도된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용된 비인간 동물과 동일한 종 또는 그와 관련된 종 유래의 트랜스진내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 유전자 단편은 형질전환 마우스에서 사용되는 설치류 이뮤노글로불린 인핸서 서열을 갖는 트랜스진내에서 조합될 수 있다. 또는, 합성 조절 서열은 이 합성 조절 서열과 포유류의 게놈에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 기능성 DNA 서열 사이에 상동성이 없는 경우 트랜스진에 도입될 수 있다. 합성 조절 서열은 예를 들어 스플라이스-수용체 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 것과 같은 컨센서스 규칙에 따라 디자인한다. 예를 들어, 미니좌위는 자연 발생적인 생식세포 Ig 좌위에 비해 비필수적인 DNA 부위 (예 를 들어, 개입 서열; 인트론 또는 그의 일부)의 내부(즉, 그 부위의 말단부는 아님) 결실을 하나 이상 갖는 게놈 이뮤노글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 수상세포에 대한 인간 항체를 생성하는 데 사용되는 형질전환 동물은 WO98/24884의 실시예 12에 기재된 트랜스진(예를 들어, pHC1 또는 pHC2)을 한 카피 이상, 통상적으로 2 내지 10 카피, 때로는 25 내지 50 카피 이상을 포함하며, 그 내용이 본 명세서에 포함되는 WO 98/24884의 실시예 5, 6, 8 또는 14에 기재된 경쇄 트랜스진의 단일 카피를 포함하는 동물과 교배하며, 그 자손은 WO 98/24884의 실시예 10에 기재된 JH 결실 동물과 교배한다. 동물을 교배하여 이 세가지 특질 각각에 대한 동형접합체를 만들어 낸다. 이들 동물은 다음의 유전자형을 갖는다: 재배열되지 않은 인간 중쇄 미니좌위의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 12에 기재됨), 재배열된 인간 K 경쇄 제작물의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 14에 기재됨), 및 기능성 JH 단편의 전부가 제거된, 마우스의 내재 중쇄 좌위 각각에서의 결실 (WO 98/24884의 실시예 10에 기재됨). 이러한 동물을 JH 단편의 결실에 대하여 동형접합인 마우스 (WO 98/24884의 실시예 10)와 교배하여 JH 결실에 대하여 동형접합이고 인간 중쇄 및 경쇄 제작물에 대하여는 반접합인 자손을 생산하였다. 생산된 동물에 항원을 주입하고, 이 동물을 사용하여 이들 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산한다.
이러한 동물로부터 단리된 B 세포는 이들이 각 유전자의 단일 카피만을 포함 하고 있기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대하여 단일특이적이다. 또한, 이들은 내재 마우스 중쇄 유전자 카피가 WO 98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같이 도입된 JH 영역에 걸친 결실에 의해 비기능적으로 되기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 대하여 단일특이적일 것이다. 또한, 재배열된 인간 κ경쇄 유전자의 단일 카피의 발현이 실질적인 B 세포 분획에서 내재 마우스 κ및 람다 쇄 유전자의 재배열을 대립유전자적 및 이소타입적으로 배제할 것이기 때문에, 실질적인 B 세포 분획은 인간 또는 마우스 경쇄에 대하여 단일특이적일 것이다.
바람직한 실시양태의 형질전환 마우스는 천연 마우스의 이뮤노글로불린과 이상적 및 실질적으로 유사한, 중요한 레파토리를 포함하는 이뮤노글로불린 생산을 보일 것이다. 따라서, 예를 들어, 내재 Ig 유전자가 불활성화되는 실시양태에서, 총 이뮤노글로불린 수준은 혈청의 약 0.1 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/ml, 이상적으로는 약 1.0 mg/ml 이상의 범위일 것이다. IgM으로부터 IgG로의 전환을 수행할 수 있는 트랜스진이 형질전환 마우스에 도입되는 경우, 성체 마우스의 혈청내 IgG 대 IgM의 비율은 바람직하게는 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비율은 비성숙 마우스에서는 훨씬 더 낮을 것이다. 일반적으로, 비장 및 림프절 B 세포의 약 10 % 초과, 바람직하게는 40 내지 80 %가 인간 IgG 단백질을 독점적으로 발현시킨다.
레파토리는 이상적으로는 비-형질전환 마우스에서 나타난 것과 비슷하고, 일반적으로는 그의 약 10 % 이상일 것이며, 바람직하게는 25 내지 50 % 이상일 것이 다. 일반적으로, 약 1,000 가지 이상의 다른 이뮤노글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 그의 104 내지 106 가지 이상의 다른 이뮤노글로불린이 주로 마우스 게놈내에 도입된 다른 V, J 및 D 영역의 수에 따라 생산될 것이다. 이러한 이뮤노글로불린은 통상적으로 고도로 항원성인 단백질, 예를 들어 수상세포 단백질의 대략 절반 이상을 인식할 것이다. 통상적으로, 이러한 이뮤노글로불린은 소정의 항원에 대하여 약 107M-1 이상, 바람직하게는 약 109M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1 이상, 예를 들어, 1013M-1 이상의 친화도를 나타낼 것이다.
몇몇 실시양태에서, 예정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 나타나는 V 유전자의 선택을 제한하기 위해서는 예정된 레파토리를 갖는 마우스를 발생시키는 것이 바람직할 수 있다. 예정된 레파토리를 갖는 중쇄 트랜스진은 예를 들어 인간에서 예정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 주로 사용되는 인간 VH 유전자를 포함할 수 있다. 또는, 몇몇 VH 유전자는 여러가지 이유로 (예를 들어, 예정된 항원에 대한 고친화성 V 영역을 코딩할 가능성이 낮기 때문에; 체세포 돌연변이 및 친화성 증대를 수행할 성향이 낮기 때문에; 또는 일부 인간에 대하여 면역원성이기 때문에) 정의된 레파토리로부터 배제시킬 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 단편을 포함하는 트랜스진의 재배열에 앞서, 예를 들어 혼성화 또는 DNA 시퀀싱함으로써 형질전환 동물 이외의 다른 생물 종으로부터 유래된 상기 유전자 단편을 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명의 형질전환 마우스를 상기 기재된 바와 같이 정제된 수상세포 제제 또는 수상세포가 풍부한 제제 및(또는) 수상세포 용해물로 면역화할 수 있다. 이 마우스는 트랜스진내 전환 재조합(시스-전환)을 통해 클래스-전환을 수행하여 수상세포에 반응성인 이뮤노글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 이뮤노글로불린은 인간 서열 항체일 수 있으며, 여기서 그의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이에 의해 유도되는 서열 및 V 영역 재조합 연결부뿐만 아니라 생식세포-코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되며, 이러한 인간 이뮤노글로불린 서열은, 체세포 돌연변이 및 특이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 다른 비-생식세포 서열이 존재할지라도, 인간 VL 또는 VH 유전자 단편 및 인간 JL 또는 JL 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 언급될 수 있다. 이러한 인간 서열 항체에 대하여, 각 쇄의 가변 영역은 인간 생식세포 V, J, 및 중쇄의 경우에는 D 유전자 단편에 의해 통상적으로 80 % 이상 코딩되고, 종종 가변 영역의 85 % 이상은 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식세포 서열에 의해 코딩되며, 흔히 가변 영역 서열의 90 또는 95 % 이상은 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식세포 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 비-생식세포 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히, 마우스의 생식세포내의 인간 트랜스진내에 존재하는 인간 V, D 또는 J 유전자 단편에 의해 코딩되지 않는 일부 가변 영역 서열 (보다 덜 흔하게는 불변 영역 서열)을 가질 것이다. 통상적으로, 이러한 비-생식세포 서열 (또는 각각의 뉴클레오티드 위치)은 CDR내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 밀집되어 있는 것으로 알려 진 영역내에 밀집되어 있을 것이다.
예정된 항원에 결합하는 인간 항체 서열은, 인간 서열 γ쇄 (예를 들어, γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예를 들어, K)를 포함하는 인간 항체가 생산되도록, 이소타입 전환으로부터 생성될 수 있다. 이러한 이소타입-전환된 인간 서열 항체는 종종, 특히 2차 (또는 후속) 항원 챌린지 후 항원에 의한 B 세포의 친화 성숙 및 선별의 결과로서, 통상적으로는 가변 영역내에, 흔히 CDR의 잔기 약 10개 또는 그 이내에서 하나 이상의 체세포 돌연변이를 포함한다. 이와 같은 고친화도 인간 서열 항체는 1 x 109M-1 이상, 통상적으로 5 x 109M-1 이상, 흔히 1 x 1010M-1 이상, 때로는 5 x 1010M-1 내지 1 x 1011M-1 이상의 결합 친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 수상세포와 고친화도 (예를 들어, 2 x 109 M-1 초과)로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 발생시키는 데 사용될 수 있는 마우스 유래의 B 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서, 이러한 하이브리도마는 2 x 109M-1 이상의 친화 상수 (Ka)를 가지고 수상세포와 결합하는 이뮤노글로불린을 포함하는 조성물을 생산하는 데 사용되며, 여기서 상기 이뮤노글로불린은,
(1) 인간 VL 유전자 단편 및 인간 JL 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CL 유 전자 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 불변 영역으로 이루어진 인간 경쇄 서열, 및
(1) 인간 VH 유전자 단편, 임의로 D 영역, 및 인간 JH 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CH 유전자 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 불변 영역으로 이루어진 인간 중쇄 서열을 포함한다.
수상세포에 대한 고친화성 인간 모노클로날 항체의 발생은 상기 삽입된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스에서 인간 가변 영역 유전자 단편의 레파토리를 확장하는 방법에 의해 용이해지며, 이 방법은 삽입된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진에는 존재하지 않는 V 영역 유전자 단편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈내에 도입하는 것을 포함한다. 종종, V 영역 트랜스진은, 인간 게놈에서 자연적으로 발생하거나 또는 재조합 방법에 의해 따로 스플라이싱될 수 있기 때문에, 손상된 V 유전자 단편을 포함할 수 있거나 V 유전자 단편이 생략되어 있을 수 있는, 인간 VH 또는 VL(VK) 유전자 단편 분석의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체이다. 종종 5개 이상의 기능성 V 유전자 단편이 YAC 상에 포함된다. 이 방법의 변형법에서, V 레파토리 확장 방법에 의해 생산되는 형질전환 마우스를 만들 수 있으며, 이 마우스는 V 영역 트랜스진상에 존재하는 V 영역 유전자 단편에 의해 코딩되는 가변 영역 서열 및 인간 Ig 트랜스진 상에 코딩되어 있는 C 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 쇄를 발현시킨다. V 레파토리 확장 방법에 의 해, 다섯 이상의 다른 V 유전자를 갖는 형질전환 마우스를 만들 수 있으며, 약 24개 이상의 V 유전자를 포함하는 마우스도 만들 수 있다. 몇몇 V 유전자 단편은 비-기능적일 수 있으며 (예를 들어, 슈도진 (pseudogene) 등), 이러한 단편은 보유되거나 또는 원한다면 당업자에게 공지된 재조합 방법에 의해 선별적으로 결실될 수 있다.
마우스 생식세포를, 실질적으로 J 및 C 유전자 단편을 포함하는 인간 Ig 트랜스진에는 존재하지 않는 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 포함하도록 개조한다면, 유전적 특질 (trait)은 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC가 다른 인간 Ig 트랜스진을 갖는 마우스 생식세포내에서 증식하는 경우의 백그라운드 (background)를 비롯한 다른 유전적 백그라운드로 증대되고 개량될 수 있다. 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 다수의 기능적 YAC은 생식세포내에 도입되어 인간 Ig 트랜스진 (또는 다수의 인간 Ig 트랜스진)과 함께 작용할 수 있다. 본 명세서에서 YAC 트랜스진으로 불리지만, 게놈내로 삽입되는 경우, 이러한 트랜스진에는 효모에서의 자가 복제에 필요한 서열 등의 효모 서열이 실질적으로는 결실되어 있을 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 다음(즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전접합체로의 도입에 앞서) 유전자 조작 (예를 들어, 제한 절단 및 펄스-필드(pulsed-field) 겔 전기영동 또는 다른 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 서열 발현의 특질을 증대시키는 방법은 인간 Ig 트랜스진, 및 임의로는 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 보유하는 형질전환 마우스를 기르는 것을 포함한다. VH 및 VL 유전자 단편은 둘 다 YAC상에 존재할 수 있다. 이 형질전환 마우스를, 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 인간의 다른 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 인간의 다른 트랜스진을 보유하는 백그라운드를 비롯하여 당업자에 의해 요구되는 특정 백그라운드로에 개량시킬 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레파토리 YAC 트랜스진을 갖는 형질전환 마우스에 의해 생산되는 고친화성 인간 서열 이뮤노글로불린을 제공한다. 상기에는 본 발명의 형질전환 동물의 바람직한 실시양태에 대하여 기술되어 있지만, 하기의 네가지 카테고리로 분류된 다른 실시양태도 본 발명에서 고려된다.
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물,
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물, 및
IV. 재배열된 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물.
이러한 형질전환 동물 카테고리 중에서, 바람직한 우선 순서는 II > I > III > IV (여기서, 내재 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)는 상동성 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 넉아웃됨) 및 I > II > III > IV (여기서, 내재 경쇄 유전자는 넉아웃되지 않았으며, 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.
III. 수상세포에 결합하는 이중특이적/다중특이적 분자
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 유도체화시키거나, 또는 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대, Fab' 단편)에 연결하여 다수의 결합 부위 또는 표적 에피토프와 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대, 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 유사체에 (예컨대, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합 또는 다른 방식으로) 기능적으로 연결시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 수상세포에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이적 부위 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 표적세포 상의 항원, 예컨대, 종양세포 항원, 미생물 항원, 바이러스 항원 또는 자가항원이다. 이들 이중특이적 및 다중특이적 분자는 수상세포가 표적세포 또는 표적세포 항원에 대한 면역반응을 조절할 수 있도록 수상세포를 상기 표적세포에 표적화한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세 포 (PMN)) 및 수상세포 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 수상세포를 이펙터세포에 표적화하며, 본 발명의 인간 모노클로날 항체처럼 수상세포의 식세포작용, 항체 의존 세포-매개성 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출 또는 수퍼옥사이드 음이온 생성 등의 Fc 수용체-매개 이펙터세포의 활성을 유발할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이적 부위 또는 항-표적세포 항원 및 항-수상세포 결합 특이적 부위 이외에도 제3의 결합 특이적 부위를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 제3의 결합 특이적 부위는 항-상승인자 (EF) 부위, 예컨대, 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질과 결합함으로써 표적세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 분자이다. "항-상승인자 (EF) 부위"는 소정의 분자, 예를 들어, 항원 또는 수용체와 결합함으로써 Fc 수용체, 표적세포 항원 또는 수상세포에 대한 결합 결정자의 효과를 상승시키는 항체, 기능적 항체 단편, 또는 리간드일 수 있다. "항-상승 인자 부위"는 Fc 수용체, 표적세포 항원 또는 수상세포와 결합할 수 있다. 또는, 항-상승 인자 부위는 제1 및 제2 결합 특이적 부위가 결합하는 실체와는 다른 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-상승 인자 부위는 (예를 들어, 표적세포에 대한 면역 반응의 증가를 일으키는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해) 세포독성 T-세포, 또는 표적세포에 대해 강화된 면역반응을 일으키는 다른 면역세포와 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이적 부위로서, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv를 비롯하여, 1종 이상의 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 본 명세서에 그 내용이 참고로 포함되는, 1990년 8월 7일 허여된 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 것과 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 Fv 또는 단일쇄 제작물과 같은 그의 임의의 최소 단편일 수도 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 표적세포 상의 항원, 예컨대, 종양세포 항원, 미생물 항원, 바이러스 항원 또는 자가항원에 대한 결합 특이적 부위 및 수상세포에 대한 제2의 결합 특이적 부위를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 이펙터세포 표면 상에 존재하는 FcγR 또는 FcαR에 대한 결합 특이적 부위, 및 수상세포에 대한 제2의 결합 특이적 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이적 부위는 인간 모노클로날 항체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "IgG 수용체"는 1번 염색체상에 위치하는 8개의 γ-쇄 유전자들 중 임의의 것을 의미한다. 이 유전자들은 3가지 Fcγ수용체 클래스, 즉 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 분류되는 총 12가지의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소폼을 코딩한다. 바람직한 한 실시양태에서, Fcγ수용체는 인간의 고친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체성 IgG에 대한 고친화도 (108 - 109M-1)를 나타내는 72 kDa 크기의 분자이다.
이와 같은 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 특징규명은 그 내용이 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 팡거 (Fanger) 등의 PCT 출원 WO88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ결합 부위와는 다른 부위에서 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 에피토프에 결합하며, 따라서 이들의 결합은 생리학적 수준의 IgG에 의해서 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특정 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 HB9469)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에서 분양받을 수 있다. 항-FcγRI mAb 22, mAb 22의 F(ab')2 단편은 메다렉스, 인크 (Medarex, Inc.; Annandale, N.J.)로부터 입수할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ수용체 항체는 모노클로날 항체 22 (H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산 및 특징규명은 문헌 [Graziano et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 및 PCT/US93/10384]에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 1992년 11월 4일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 HA022CL1 명칭으로 기탁되어 기탁번호 CRL 11177을 배정받았다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이적 부위는 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는 것이 바람직하다. 용어 "IgA 수용체"는 19번 염색체 상에 위치하는 하나의 α-유 전자 (FcαRI)의 유전자 산물을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa 크기의 얼터네이티브 (alternative) 스플라이싱되는 여러 막횡단 이소폼을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립구에서는 기본적으로 발현되지만, 비-이펙터세포 집단에서는 발현되지 않는다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대하여 중간 친화도 (약 5 x 107M-1)를 갖는데, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF 등의 사이토카인에 노출되는 경우에 증가한다 (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). IgA 리간드 결합 도메인의 외부의 FcαRI과 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 네가지 FcαRI-특이적 모노클로날 항체는 문헌 (Monteiro, R. C. et al., 1992, J. Immunol. 148: 1764)에 기재되어 있다.
FcαRI 및 FcγRI은 (1) 주로 면역 이펙터세포, 예컨대, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수상세포 상에서 발현되고; (2) 고도로 발현되고 (예컨대, 세포 당 5,000 내지 100,000); (3) 세포독성 활성 (예컨대, ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 그들에 표적화되는 자가-항원을 비롯한 항원의 상승된 항원 제시를 매개하기 때문에 본 발명에 사용하기에 바람직한 유발 수용체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 수상세포, 예를 들어, 수상세포 상의 항원을 인식하여 그에 결합하는 결합 특이적 부위를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 결합 특이적 부위는 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 제공된다.
본 명세서에 사용된 "이펙터세포 특이적 항체"는 이펙터세포의 Fc 수용체와 결합하는 항체 또는 기능성 항체 단편을 의미한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 항체는 내재 이뮤노글로불린에 의해 결합되지 않는 부위에서 이펙터세포의 Fc 수용체와 결합한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터세포"는, 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와 대립되는, 면역 반응의 작용 단계에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 예시적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어, 림프구 (예를 들어, 세포용해성 T 세포 (CTL)를 비롯한 B 세포 및 T 세포), 살해 (killer)세포, 천연 살해 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포 및 호염구가 포함된다. 몇몇 이펙터세포는 특정 Fc 수용체를 발현하며, 특정 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 이펙터세포는 항체-의존 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있는데, 예를 들어 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현시키는 단핵구, 대식세포는 표적세포를 특이적으로 사멸시키는 것, 항원을 면역시스템의 다른 성분에 제시하는 것 또는 항원을 제시하는 세포에 결합하는 것에 관여한다. 다른 실시양태에서, 이펙터세포는 표적 항원, 표적세포 또는 미생물을 식세포작용할 수 있다. 이펙터세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인 등의 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상승된 발현은 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터세포는 표적 항원 또는 표적세포를 식세포작용하거나 용해시킬 수 있다.
"표적세포"는 대상체 (예, 인간 또는 동물)에서 본 발명의 조성물 (예, 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는 바람직하지 않은 임의의 세포를 의미한다. 한 실시양태에서, 표적세포는 수상세포이다. 다른 실시양태에서, 표적세포로는 종양세포, 미생물 병원체, 바이러스 또는 바이러스에 감염된 세포가 포함된다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하며, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체로는 뮤린 항체, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체가 있다.
키메라 마우스-인간 모노클로날 항체 (즉, 키메라 항체)는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 뮤린 (또는 다른 종) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자를 제한 효소로 절단하여 뮤린 Fc를 코딩하는 영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 상응하는 부위로 치환한다 (문헌 (Robinson et al., 국제 특허 출원 제PCT/US86/02269호; Akira, et al., 유럽 특허 출원 제184,187호; Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 제171,496호; Morrison et al., 유럽 특허 출원 제173,494호; Neuberger et al., 국제 특허 공개 제WO 86/01533호; Cabilly et al. 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제125,023호; Better et al. (1988 Science 240 : 1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; 및 Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559) 참조).
키메라 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역의 상응하는 서열로 대체하여 추가로 인간화할 수 있다. 인간화 키메라 항체에 대한 일반적인 검토를 위해서는 문헌 (Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202-1207 and by Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214)을 참고한다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나의 이뮤노글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 개조 및 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 핵산의 공급원은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 7E3, 항-GPIIbIIIa 항체 생산 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 이어서, 키메라 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 재조합 DNA를 적합한 발현 벡터내에 클로닝할 수 있다. 별법으로, 적합한 인간화 항체는 CDR 치환에 의해 생성할 수 있다 (미국 특허 제5,225,539호; Jones et al. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239: 1534; and Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060).
특정 인간 항체의 모든 CDR을 비인간 CDR의 적어도 일부로 대체하거나, CDR의 일부만을 비인간 CDR로 대체할 수 있다. 인간화 항체와 Fc 수용체의 결합에 요구되는 CDR의 수를 바꾸는 것이 필요할 뿐이다.
항체는 인간 항체의 CDR의 적어도 일부를 비인간 항체로부터 유도된 CDR로 대체할 수 있는 임의의 방법에 의해 인간화할 수 있다. 윈터 (Winter)는 본 발명의 인간화 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 방법을 문헌 (1987년 3월 26일 출원 된 영국 특허 출원 제GB 2188638A호)에 개시하고 있는데, 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 국제 특허 출원 공개 제WO 94/10332호 (제목: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 부위 특이적 돌연변이유발을 이용하여 인간 CDR을 비인간 CDR로 대체할 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화 항체가 본 발명의 범위내에 든다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 항원에 대한 결합을 향상시킬 수 있도록 골격 영역내에 아미노산 치환부를 갖는다. 예를 들어, 마우스 CDR을 갖는 인간화 항체에서 인간 골격 영역내에 위치하는 아미노산을 마우스 항체의 상응하는 부위에 위치하는 아미노산으로 대체할 수 있다. 이러한 치환은 어떤 경우 인간화 항체와 항원의 결합을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 항체를 본 명세서에서는 변형된 항체 또는 변경된 항체라 부른다.
또한 변형된 항체라는 용어는 예를 들어 항체의 일부를 결실, 부가 또는 치환하여 변형시킨 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체 등의 항체를 포함하는 의미이다. 예를 들어, 불변 영역을 결실시키고, 그를 항체의 반감기, 예컨대 혈청 반감기, 안정성 또는 친화성을 증가시키는 불변 영역으로 대체하여 항체를 변형시킬 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자가 FcγR에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 영역을 가지며 하나 이상의 이펙터 기능을 유발하는 한, 어떠한 변형도 본 발명의 범위내에 든다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학 기술 (예를 들어, 문헌 (D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5807) 참조), "폴리도마 (polydoma)" 기술 (미국 특허 제4,474,893호 참조), 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되어 있으며 본 명세서에 기재된 실시예에 기재되어 있는 방법을 이용하여 성분 결합 특이적 부위, 예를 들어 항-FcR 및 항-수상세포 결합 특이적 부위를 연결하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각 결합 특이적 부위를 별도로 생성시킨 다음, 서로 연결시킬 수 있다. 결합 특이적 부위가 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 가교결합제를 사용하여 공유결합적으로 연결시킬 수 있다. 가교결합제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648) 참조). 다른 방법으로는 문헌 (Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), 및 Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375))에 기재된 것들이 포함된다. 바람직한 연결제는 피어스 케미칼 (Pierce Chemical Co. (Rockford, IL))사로부터 입수할 수 있는 SATA 및 술포-SMCC 이다.
결합 특이적 부위가 항체 (예, 2개의 인간화 항체)인 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 연결시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역이 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 포함하도록 변형시킨 다음, 연결시킨다.
또는, 두 결합 특이적 부위가 동일한 벡터내에 코딩시키고, 동일한 숙주 세포내에서 발현시켜 어셈블리할 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단일쇄 분자, 예를 들어 단일쇄 이중특이적 항체, 하나의 단일쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단일쇄 분자이거나, 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호)에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자와 그의 특이적 표적의 결합은 효소-결합된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성면역분석 (RIA), FACS 분석, 생검 (예, 생장 억제), 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인할 수 있다. 이러한 분석 각각은 일반적으로 해당 결합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예, 항체)을 사용하여 특정 대상의 단백질-항체 결합체의 존재를 검출한다. 예컨대, FcR-항체 결합체는 예를 들어 항체-FcR 결합체를 인식하여 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 또는, 결합체는 임의의 다양한 다른 면역분석을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 물질로 표지하고 방사성면역분석 (RIA)에서 사용할 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 (Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986) 참조). 방사성 동위원소는 γ카운터 또는 섬광계수기 또는 오토라디오그래피의 사용과 같은 방법에 의해 검출할 수 있다.
IV. 항체 컨쥬게이트/면역독소
다른 측면으로, 본 발명은 치료 잔기, 예를 들어 세포독소, 약물 또는 방사성 동위원소에 연결된 인간 항-수상세포 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 세포 독소에 연결되는 경우, 이러한 항체 컨쥬게이트는 "면역독소"라고 한다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 해로운 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 물질이 포함된다. 이들의 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드로 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티 코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이들의 유사체 또는 동족체를 들 수 있다. 치료제로는 항-대사물질 (예, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예, 다우노루비신 (종전에는 다우노마이신이라 함) 및 독소루비신), 항생제류 (예, 닥티노마이신 (종전에는 악티노마이신이라 함), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 항체를 방사성 동위원소, 예를 들어 방사성 요오드에 연결시켜 수상세포-관련 질환, 예를 들어 자가면역 또는 염증성 질환, 또는 이식편 대 숙주 질환의 치료를 위한 세포독성 방사성 약제를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체 결합체를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변화시킬 수 있으며, 약물 잔기는 통상의 화학 치료제로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 예를 들어, 약물 잔기는 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변경제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자가 포함될 수 있다.
이러한 치료 잔기를 항체에 연결시키는 기술은 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 (Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)) 참조).
다른 측면으로, 수상세포에 대하여 특이적인 인간 항체를 사용하여 전체 세포, 예를 들어 종양세포, 이펙터세포 또는 미생물 병원체를 수상세포로 직접 표적화할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 인간 수상세포-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 세포를 형질감염 또는 형질도입시켜 항-수상세포 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포의 표면상에 직접 발현 시킬 수 있다. 이는 예를 들어 막횡단 도메인 및 인간 항-수상세포 항체를 포함하는 융합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산으로 표적세포를 형질감염시켜 수행할 수 있다. 이러한 핵산, 융합 단백질, 및 이 융합 단백질을 발현시키는 세포를 생성하는 방법은 예를 들어 본 명세서에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 출원 제09/203,958호에 기재되어 있다. 또는, 화학적 링커, 지질 태그, 또는 다른 관련된 방법 (deKruif, J. et al. (2000 Nat. Med. 6: 223-227; Nizard, P. et al. (1998) FEBS Lett. 433: 83-88)을 이용하여 항-수상세포 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포 또는 병원체에 결합시킬 수 있다. 표면에 앵커링된 항-수상세포 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포를 사용하여 세포, 예를 들어 종양세포 또는 미생물 병원체에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.
V. 제약 조성물
다른 측면으로, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위 중 하나 또는 이들의 배합물을 포함하는 치료 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 이 조성물은 다른 치료제, 예를 들어 다른 항체, 세포독소 또는 약물 (예, 면역억제제)을 추가로 포함할 수 있으며, 단독으로 투여하거나 또는 다른 치료법, 예를 들어 방사선요법과 병행할 수 있다.
한 실시양태에서, 상보적 활성을 갖는 인간 항-수상세포 모노클로날 항체를, 예를 들어 2가지 이상의 인간 항-수상세포 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물로서 배합하여 사용한다. 예를 들어, 이펙터세포의 존재하에 수상세포를 매우 효과적으로 사멸시키는 것을 매개하는 인간 모노클로날 항체를, 수상세포의 생장을 억제하는 다른 인간 모노클로날 항체와 배합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 수상세포에 의해 빠르게 내재화되는 인간 모노클로날 항체를, 수상세포의 항원 제시 세포 활성, 예를 들어 면역자극 사이토카인의 방출을 유도하는 다른 인간 모노클로날 항체와 배합할 수 있다.
다른 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자의 하나 또는 배합물을 포함한다 (예를 들어, 이 분자는 Fc 수용체에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위 및 수상세포에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위를 포함함).
또 다른 실시양태에서, 조성물은 다른 분자, 예를 들어 세포독소 또는 항원, 예를 들어 표적세포 상의 항원에 기능적으로 연결된 수상세포에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"로는 생리학적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항-박테리아제 및 항-진균제, 및 등장성 및 흡수지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예, 주사 또는 주입)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자를 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유 하며 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다 (예를 들어, 문헌 (Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19) 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 들 수 있다. 산 부가 염으로는 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 포스포러스 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기 부가 염으로는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유도된 것들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 당업자라면 투여 경로 및(또는) 방식이 원하는 결과에 따라 달라질 것임을 잘 알 것이다. 활성 화합물은 급속한 방출에 대하여 화합물을 보호하는 담체와 함께, 예를 들어 임플란트, 경피 패취 및 마이크로캡슐화 전달계를 비롯한 조절 방출형 제제로 제조될 수 있다. 생분해성 및 생적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 많은 방법은 특허되었거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978) 참조).
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 화합물의 활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나, 이러한 물질과 화합물을 동시 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적절한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제 중에 넣어 대상체에게 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제로는 염수 및 수성 완충액을 들 수 있다. 리포좀은 수중유중수 CGF 에멀젼뿐 아니라 통상의 리포좀을 포함한다 (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).
약제학적으로 허용되는 담체에는 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 분말이 포함된다. 제약상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 물질이 활성 화합물과 상용불가능하다는 것을 제외하면, 상기 매질 또는 물질을 본 발명의 제약 조성물에 사용하는 것도 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료 조성물은 통상적으로 무균성이어야 하며 제조 및 저장 조건하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 대해 적합한 다른 정도된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 이용하고, 분산액의 경우 소정의 입도를 유지하고, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 중에 등장성 물질, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사가능한 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
소정량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 언급한 성분들 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 다음, 무균 미세여과하여 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기 언급한 것들로부터 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클 중에 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 미리 무균 여과한 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공건조법 및 동결건조법 (동결건조)이다.
투여 요법을 조절하여 최적의 바람직한 반응 (예, 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 치료 상황의 요건에 따라 지시된 바와 같이, 단일 볼루스를 투여하거나, 여러 번으로 나누어 시간에 따라 투여하거나, 또는 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 일정하게 하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대하여 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 소정의 제약 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 나타내도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감응성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 있어서 고유한 제한에 의해 설명되며, 이들에 직접적으로 의존한다.
약제학적으로 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술피트 및 소듐 술피트 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등이 포함된다.
치료 조성물의 경우, 본 발명의 제제로는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100％로 했을 때 이 양은 활성 성분 약 0.01％ 내지 약 99％, 바람직하게는 약 0.1％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게는 약 1％ 내지 약 30％의 범위이다.
또한 질내 투여에 적합한 본 발명의 제제로는 당업계에 적절한 것으로 알려진 담체를 포함하는 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분무 제제를 들 수 있다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여용 투여 형태로는 분말, 스프레 이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패취 및 흡입제가 포함된다. 무균 조건하에 활성 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체 및 필요에 따라 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이라는 구절은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로 주사를 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉강내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물 중에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 들 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하고, 분산액의 경우 소정의 입도를 유지하고, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 보조제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 상기 무균화 방법, 및 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법 둘 다에 의해 미생물 존재의 방지를 보장할 수 있다. 등장성 물질, 예를 들어 슈가 및 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사가능한 약 제 제형의 흡수를 지연시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 인간 및 동물에게 약제로 투여하는 경우, 화합물을 단독으로 투여하거나, 예를 들어 활성 성분 0.01 내지 99.5％ (보다 바람직하게는, 0.1 내지 90％) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 제약 조성물을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 제제화한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준을 변화시켜 대상체에게 비독성이면서 특정 환자의 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양, 조성물 및 투여 방식을 결정할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 기타 약물, 사용된 특정 조성물과 함께 사용된 화합물 및(또는) 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전체적인 건강 및 기존의 병력, 및 의료분야에 잘 알려진 인자 등을 비롯하여 다양한 약물동태학적 인자에 따라 달라질 것이다.
당업계의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을, 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 양보다 더 낮은 수준에서 출발하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킨다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 나타내는 데 효과적인 가장 낮은 투여량에 해당하는 화합물의 양일 것이다. 이러한 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 설명한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위 근처에 투여하는 것이 바람직하다. 원하다면, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량을 임의로 단위 투여 형태로 하루 동안 2회, 3회, 4회, 5회, 6회에 걸쳐 투여하거나, 적절한 간격으로 보다 여러 회에 걸쳐 분할 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 제약 제제 (조성물) 형태로 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물을 당업계에 공지된 의료 디바이스 (device)와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물을 바늘없는 피하 주사 디바이스, 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,399,163호; 동 제5,383,851호; 동 제5,312,335호; 동 제5,064,413호; 동 제4,941,880호; 동 제4,790,824호; 또는 동 제4,596,556호)에 개시된 디바이스와 함께 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로는 미국 특허 제4,487,603호 (조절된 속도로 약물을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시함); 동 제4,486,194호 (피부를 통해 약물을 투여하는 치료 디바이스를 개시함); 동 제4,447,233호 (정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시함); 동 제4,447,224호 (흐름을 변화시킬 수 있고 약물을 지속적으로 전달할 수 있는 이식가능한 주입 디바이스를 개시함); 동 제4,439,196호 (멀티-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달계를 개시함); 및 동 제4,475,196호 (삼투성 약물 전달계를 개시함)를 들 수 있다. 이들 특허문헌들의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 많은 다른 임플란트, 전달계 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체가 생체내에서 적절한 분포되도록 제제화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 통과하는 것을 보장하기 위해 (원한다면), 이들 화합물을 예를 들어 리포좀내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대하여는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호; 동 제5,374,548호; 및 동 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관내로 선택적으로 운반되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있으며, 따라서 표적화된 약물 전달을 증가시킨다 (예를 들어, 문헌 (V. V. Ranade (1989) J Clin. Pharmacol. 29: 685) 참조). 표적화 잔기의 예에는 폴레이트 또는 바이오틴 (예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호 참조, Low et al.); 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체 (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357 : 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39 : 180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233: 134) (그의 여러 종은 본 발명의 제제뿐만 아니라 본 발명의 분자 성분을 포함할 수 있음); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090)이 포함된다 (또한, 문헌 (K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273) 참조). 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물을 리포좀내에 제제화하고; 보다 바람직한 실시양태에서, 리포좀은 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 리포좀내 치료 화합물을 볼루스 주사에 의해 종양 또는 감염 근처의 부위로 전달한다. 조성물은 주사 투여가 쉬울 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다.
"치료 유효량"은 바람직하게는 수상세포 성장 및(또는) 활성을 비처리된 대상체에 비해 약 20％ 이상, 보다 바람직하게는 약 40％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 60％ 이상, 가장 바람직하게는 약 80％ 이상까지 조절한다. 수상세포 성장 및(또는) 활성을 조절하는 화합물의 능력은 항원 제시 및(또는) 면역조절에서 효과를 나타내는 동물 모델계에서 평가할 수 있다. 또는, 조성물의 이러한 특성은 수상세포에 의한 면역 세포 자극을 조절하는 화합물의 능력을 조사하여, 예를 들어 본 명세서에 설명되어 있으며 당업자에게 공지되어 있는 시험관내 분석에 의해 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 치료 유효량의 치료 화합물은 대상체에서 수상세포 성장 및(또는) 활성을 억제, 달리 말하면 자가면역 증상과 같은 증상을 호전시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 치료 화합물은 수상세포에 의한 항원 프로세싱 및 제시를 증가시킬 수 있으며, 따라서 면역원 또는 표적 항원에 대한 면역 반응을 증가시킨다. 당업자라면 대상체의 사이즈, 대상체의 증상의 심도, 대상체의 면역 활성, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자를 기준으로 하여 치료 유효량 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 무균상태이어야 하며, 주사기로 조성물을 전달할 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 물 이외에도, 담체는 등장성 완충 염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하고, 분산액의 경우 소정의 입도를 유지하고, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 등장성 물질, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사가능한 조성물의 장기간에 걸친 흡수가 일어나도록 할 수 있다.
활성 화합물이 적합하게는 상기와 같이 보호되는 경우, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다.
VI. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 조성물 (예를 들어, 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체 및 그의 유도체/컨쥬게이트)은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다.
예를 들어, 이들 분자는 예를 들어 시험관내 또는 생체외에서 배양중의 세포, 또는 예를 들어 대상체의 생체내에 투여하여 다양한 질환을 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함하는 의미이다. 본 발명의 "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인간 항체 및 그의 유도체를 생체내에서 사용하여 여러 수상세포 매개 또는 수상세포 관련 질환을 치료, 예방 또는 진단한다.
한 실시양태에서, 바람직한 인간 동물에는 수상세포 매개 또는 수상세포 관련 질환을 앓는 인간 대상이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 자가면역, 면역계 또는 염증성 질환, 예를 들어 수상세포에 의한 면역조절과 관련된 비정상적이거나 원치 않는 면역 활성을 특징으로 하는 질환을 치료할 수 있다. 본 발명의 인간 항-수상세포를 사용한 치료로부터 효과를 얻을 수 있는 자가면역, 면역계 및 염증성 질환에는 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 애디슨병, 홍반성 루프스, 레이터 (Reiter's) 증후군 및 그레이브스 병이 포함된다. 예를 들어, 자가면역 질환으로 고통받는 대상체는 수상세포에 의해 매개되는 자가항원 제시의 억제로부터 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 인간 항-수상세포 항체를 사용하여 치료할 수 있는 질병의 다른 예로는 이식 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환을 들 수 있다.
이식 거부반응
최근 수년 동안, 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수와 같은 조직 및 기관을 이식하는 수술 기술의 효과에 있어서 상당한 진척이 이루어졌다. 현재 해결해야 할 주요 문제는 수용체에서 이식되는 동종이식편 또는 기관에 대한 면역-내성을 유도하는 만족스러운 물질이 부족하다는 점일 것이다. 동종이형 세포 또는 기관이 숙주에 이식되는 경우 (즉, 공여자 및 수용자는 동일한 종에서 유래하는 다른 개체임), 숙주 면역시스템은 이식된 외래 항원에 대해 면역 반응을 개시하여 이 식되는 조직을 파괴시킬 수 있다 (숙주 대 이식편 질환). CD8+ 세포, CD4+ 세포 및 단핵구는 모두 이식 조직의 거부에 관여한다. 본 발명의 치료제는 수용체에서 수상세포에 의해 매개되는 동종항원 유도성 면역 반응을 억제하여 이러한 세포가 이식되는 조직 또는 기관을 파괴하는 데 관여하는 것을 방지하는 데 유용하다.
이식편 대 숙주 질환
본 발명의 치료제에 대한 관련 용도는 "이식편 대 숙주" 질환 (GVHD)에 관여하는 면역 반응을 조절하는 것이다. GVHD는 면역학적으로 항체 반응 능력이 있는 세포가 동종이형 수용체로 전달되는 경우 발생하는 잠재적으로 치명적인 질병이다. 이러한 상황에서, 공여체의 항체 반응 능력이 있는 세포가 수용체에서 조직을 공격할 수 있다. 피부, 장의 상피 및 간의 조직이 종종 표적이 되며, GVHD의 진행 동안 파괴될 수 있다. 이 질환은 면역 조직이 예를 들어 골수 이식으로 이식되는 경우 특히 심각한 문제를 나타내었지만, 덜 심한 GVHD가 심장 및 간 이식을 비롯한 다른 경우에서도 보고된 바 있다. 본 발명의 치료제를 사용하여 숙주 항원 제시 세포, 예를 들어 수상세포의 활성을 억제한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다. 본 발명의 인간 항-수상세포 항체를 사용하여 항원을 수상세포로 표적화하여, 항원에 대한 면역 반응이 유도되도록 항원 제시 및 프로세싱을 조절할 수 있다. 항원은 종양 항원, 또는 병원체 유래의 항원, 예를 들어 미생물 병원체일 수 있다. 병원체는 바이러스 (예, HIV), 박테리아, 진균 또는 기생충일 수 있다. 항원은 또한 대상체, 예를 들어 알쯔하이머병으로 고통받 는 대상체에서 아밀로이드 침착물의 성분일 수 있으며, 항원은 Aβ 펩티드이다.
예를 들어, 항원에 연결된 수상세포의 표면 상의 성분에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는 분자 결합체 (여기서, 결합체와 수상세포의 결합은 분자 결합체의 내재화를 매개함)을 대상체에게 투여하여 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증가시킬 수 있다. 항원에 대하여 유도된 면역 반응은 항원에 결합하는 항체, 및 MHC-I 또는 MHC-II 결합체의 성분으로서 항원에 결합하는 T 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명의 인간 항-수상세포 항체를 사용하여 대상체의 수상세포-표적화 면역화를 매개할 수도 있다. 예를 들어, 항원에 연결된 수상세포의 표면 상의 성분에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는 분자 결합체로 대상체를 면역화할 수 있다 (결합체와 수상세포의 결합은 분자 결합체의 내재화를 매개하며, 예를 들어 항원의 프로세싱 및 제시를 증가시킴).
다른 측면으로, 수상세포에 대하여 특이적인 인간 항체를 사용하여 전체 세포, 예를 들어 종양세포, 이펙터세포 또는 미생물 병원체를 수상세포로 직접 표적화할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간 수상세포-특이적 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 세포를 형질감염 또는 형질도입시켜 항-수상세포 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포의 표면상에 직접 발현시킬 수 있다. 또는, 화학적 링커, 또는 지질 태그, 또는 다른 관련 방법을 이용하여 항-수상세포 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포 또는 병원체에 결합시킬 수 있다. 표면에 앵커링된 항-수상세포 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포를 사용하여 세포, 예를 들어 종양세포 또는 미생물 병원체에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체를 사용하여 병원체, 독소 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 이러한 치료제가 특히 유용할 수 있는 병원체의 예로는 현재 효과적인 백신이 없는 병원체, 또는 통상의 백신에 의해서는 완전하게 효과적이지 못한 병원체가 포함된다. 이들로는 HIV, 간염 (A, B 및 C), 인플루엔자 (Influenza), 헤르페스 (Herpes), 기아르디아 (Giardia), 말라리아 (Malaria), 레이쉬마니아 (Leishmania), 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus Aureus), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)를 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 시험관내의 치료 또는 진단 용도와 관련된 결합 활성에 대하여 먼저 시험할 수 있다. 예를 들어, 플로우 사이토메트리 및 하기 실시예에 기재된 내재화 분석을 이용하여 본 발명의 조성물을 시험할 수 있다. 또한, 수상세포의 세포용해를 비롯하여 하나 이상의 이펙터 매개 이펙터세포 활성을 개시하는 데 있어서의 상기 분자의 활성을 분석할 수 있다. 이펙터세포 매개 식균작용 및 세포용해에 대하여 분석하는 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 수상세포 매개 또는 수상세포 관련 질환의 치료 및 진단에 있어서 추가의 용도를 갖는다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어 생체내 또는 시험관내에서 다음과 같은 생물학적 활성 중 하나 이 상을 유도할 수 있다: 수상세포를 옵소닌화하는 것, 인간 이펙터세포의 존재하에 수상세포의 식균작용 또는 세포용해를 매개하는 것, 수상세포의 생장을 억제하는 것, 수상세포에 의해 내재화되는 것, 또는 항원을 수상세포로 표적화하는 것.
본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 투여하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 대상의 연령 및 체중 및 사용되는 특정 약물에 따라 달라질 것이다. 문헌 (Goldenberg, D. M. et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360, 및 EP 0365 997)에 기재된 바와 같이 분자를 방사성핵종, 예를 들어 1□1I, 90Y, 105Rh 등에 커플링시킬 수 있다. 또한 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 면역조절제에 커플링시킬 수도 있다.
표적-특이적 이펙터세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 이펙터세포 또한 치료제로 사용할 수 있다. 표적화를 위한 이펙터세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 천연 살해 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포를 들 수 있다. 원하다면, 이펙터세포를 치료될 대상체로부터 얻을 수 있다. 표적-특이적 이펙터세포는 생리학적으로 허용되는 용액중 세포 현탁액으로서 투여할 수 있다. 투여될 세포의 수는 약 108 내지 109개일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 한 실시양태에서, 이 양은 예를 들어 수상세포에 국소화되어, 예를 들어 식균작용에 의해 세포 사멸을 수행하기에 충분한 양일 것이 다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 연결된 표적-특이적 수상세포, 예를 들어 수상세포를, 표적세포, 예를 들어 종양세포, 미생물 병원체, 바이러스 또는 바이러스에 감염된 세포로의 국소화 또는 항원의 표적화를 위한 치료제로 사용할 수 있으며, 예를 들어 항원 프로세싱 및 제시에 의해 표적세포 또는 표적 항원에 대한 면역 반응을 수행할 수 있다. 투여 경로 또한 달라질 수 있다.
표적-특이적 이펙터세포 또는 표적-특이적 수상세포를 사용한 치료는 표적세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자), 및 이러한 조성물과 결합된 이펙터세포를 사용하는 항-수상세포 요법을 화학요법 또는 면역조절요법, 예를 들어 항-염증성 또는 면역억제 요법과 함께 이용할 수 있다. 또한, 복합 면역요법을 이용하여 예를 들어 수상세포에 대한 2가지 상이한 세포독성 이펙터 집단을 유도할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마RI 또는 항-CD3에 결합된 항-수상세포 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자로 표적화된 수상세포를 면역조절 요법, 예를 들어 면역자극법과 함께 이용하여 표적세포 또는 표적 항원에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 수상세포 표적화 요법을 다른 형태의 면역요법, 예를 들어 사이토카인 처리 (예, 인터페론, TNFα, GM-CSF, G-CSF, IL-2)와 병용할 수 있다.
또한 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 사용하여 수상세포 활성, 예를 들어 항원 프로세싱 및 제시를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 예를 들어 세포 표면상의 수용체의 캡핑 및 제거에 의해 수상세포상의 동족체 항원의 수준을 조절할 수 있다.
보체 결합 부위, 예를 들어 보체와 결합하는 IgG1, IgG2 또는 IgG3, 또는 IgM으로부터의 부위를 갖는 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 또한 보체의 존재하에 사용할 수도 있다. 한 실시양태에서, 표적세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터세포로 생체외 처리한 것은 보체 또는 보체 함유 혈청을 가하여 보충할 수 있다. 보체 단백질을 결합시켜 본 발명의 결합제로 코팅된 표적세포의 식균작용을 개선시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적세포를 보체로 용해시킬 수도 있다.
또한 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 보체와 함께 투여할 수도 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물은 본 발명의 범위내에 든다. 이러한 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 근처 가까이에 위치한다는 점에서 유리하다. 또는, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청을 별도로 투여할 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 대상을 사이토카인으로 처리하여 면역 세포 활성 및(또는) Fcα또는 Fcγ수용체의 발현 또는 활성을 조절하는, 예를 들어 증가 또는 억제하는 물질로 대상체를 추가로 처리할 수 있다. 다중특이적 분자로의 처리 동안 투여되는 바람직한 사이토카인으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ), 및 종양 괴사 인자 (TNFα)를 들 수 있다.
또한 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 사용하여 예를 들어 수상세포를 표적화, 예를 들어 수상세포를 표지할 수 있다. 이러한 용도의 경우, 결합제를 검출될 수 있는 분자에 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은 생체외 또는 시험관내에서 수상세포를 국소화하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 수상세포 또는 수상세포 항원에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부와 수상세포 또는 수상세포 항원 사이의 결합체의 형성을 허용하는 조건하에 샘플 및 대조구 샘플을 상기 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 수상세포 또는 수상세포 항원의 존재를 검출하거나 수상세포 또는 수상세포 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서, 결합체의 형성을 검출하는데, 이 때 대조구 샘플과 비교하여 샘플간의 결합체 형성에 있어서의 차이는 샘플 중의 수상세포 또는 수상세포 항원의 존재를 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 수상세포의 존재를 검출하거나, 그의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 검출가능한 마커에 연결된 본 발명의 조성물 (예, 다중특이적 또는 이중특이적 분자) 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계, 및 (ii) 상기 대상체를, 상기 검출가능한 마커를 검출하는 수단에 노출시켜 수상세포를 포함하는 부위를 확인하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명의 조성물 (예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및 사용 지침서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위내에 든다. 이 키트는 하나 이상의 추가의 시약, 예를 들어 사이토카인 또는 보체, 또는 본 발명의 하나 이상의 다른 인간 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와는 다른 수상세포 상의 에피토프에 결합하는 보체 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이는 본 발명을 한정하기 위한 것으로 생각해서는 안된다. 본 명세서에서 언급된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허문헌 및 공개 특허 출원서의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
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[실시예]
실시예 1: 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조
수상세포 시료로 HuMAb 마우스의 HCO7 종을 면역화하여 인간 항-수상세포 모노클로날 항체를 생성하였다. 전체 개시 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,770,429호 및 동 제5,545,806호에 기재된 바와 같이 HC07 HuMAb 마우스를 발생시켰다.
구체적으로, 프로인트 (Freund's) 면역보강제 중에 유화된 인간 수상세포를 복강내 주사하여 HCO7 마우스를 4회 면역화하였다. 요컨대, 수상세포는 다음과 같이 제조하였다. 전혈 또는 류코팩 (Leukopak) 혈소판 성분채집술 시료를 밀도 구배 원심분리하여 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 얻었다. 단핵구를 2시간 동안 조직 배양 플라스크에 부착시켜 단리한 다음, 5 내지 9일 동안 대식세포 혈청 무함유 배지 (Gibco) 중에서 2 ng/ml GM-CSF 및 10 ng/ml IL-4와 인큐베이션하여 수상세포로 분화시켰다. 면역화를 위한 세포는 즉석에서 사용하거나 -80℃에서 동결 보관하였다. 마우스를 2 내지 3주마다 면역화하였다. 마지막으로, 인산염 완충 염수 (PBS) 중의 수상세포를 정맥내 주사한 다음, 비장절제술을 수행하였다. 반응하는 마우스의 비장세포를 모으고, 단일 세포로 분산시켰다.
항-수상세포 항체를 생산하는 하이브리도마를 만들기 위해, 항-수상세포 항체를 포함하는 혈장을 갖는 마우스로부터 얻은 비장 세포를 P3X63-Ag8.653 골수종 세포 (ATCC CRL 1580 비-분비 마우스 골수종 세포로 지칭됨, ATCC에 기탁됨) 및 PEG와 함께 융합하였다. HAT 함유 배지 중에서 배양하여 하이브리도마를 선별하였다. 하이브리도마를 배양 (약 10 내지 14일)한 다음, 항-인간 IgG ELISA를 사용하여 하이브리도마를 포함하는 각 웰을 인간 IgG의 생산에 대하여 스크리닝하였다.
양성 하이브리도마를 스크리닝하고, (1) 인간 IgG 항체의 생산 및 (2) 수상세포와의 결합을 기준으로 선별하였다: .
인간 IgG를 분비하는 하이브리도마를 플로우 사이토메트리에 의해 각종 유형의 혈액 세포와의 반응성에 대하여 시험하였다. GM-CSF 및 IL-4를 보충한 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 수상세포를 부착성 단핵 세포로부터 얻었다. 과립구 (PMN), 단핵구 및 림프구를 헤파린처리된 전혈로부터 얻었다. 세포를 4℃에서 IgG-양성 클론으로부터의 하이브리도마 상층액과 인큐베이션하였다. FITC-표지된 염소 항-인간 IgG (Fc) 프로브를 사용하여 결합을 검출하였다. 세포 관련 형광을 FACScalibur 장치를 이용하는 분석에 의해 측정하였다.
스크리닝된 여러 하이브리도마는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 플로우 사이토메트리에 의해 평가된 바와 같이 수상세포와의 반응성을 나타내는 인간 IgG1κ항체 (예, A3, A5, A23, A24, A33, B9, B11, B33, B47, C8, C10, C20, C28, C29, C30, C35, E1, E8, E10, E18, E20, E21 및 E24)를 생산하였다. 일부 인간 항체들 은 다른 혈액 세포 유형에 비해 수상세포와 매우 높고 우세한 반응성을 나타내었다.
Figure 112006056146383-PAT00001
실시예 2: 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체의 특징규명
I. 수상세포에 대한 정제된 인간 항-수상세포 항체의 결합 특이성
수상세포에 대한 특이성을 갖는 인간 IgG 항체를 분비하는 여러 하이브리도마를 서브클로닝하고, 정제를 위해 증식시켰다. 5％ CO2를 포함하는 가습 인큐베이터 중의 스핀너 플라스크에서 배양시킨 하이브리도마 배양물의 상층액으로부터 모노클로날 항체를 단리하였다. 제조자의 설명서에 따라 단백질 A-아가로스 칼럼 (Pierce, Rockford IL) 상의 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다.
이어서 플로우 사이토메트리를 이용하여 정제된 인간 항체를, 수상세포 및 다양한 다른 조혈 세포 유형을 나타내는 세포주와의 반응성에 대하여 시험하였다. 요컨대, 상기 설명한 바와 같이 GM-CSF 및 IL-4를 보충한 배지중에서 5 내지 7일 동안 배양하여 부착성 단핵 세포로부터 수상세포를 얻었다. 10％ 태아소 혈청을 보충한 배지중에서 U937, CEM, THP-1 및 L540 세포주를 배양하였다. 세포를 모아 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 포화 농도의 인간 모노클로날 항체 B11, C20, E21 또는 이소타입 대조구 (인간 IgG1)와 함께 인큐베이션하였다. 4℃에서 1시간 동안 FITC-표지된 염소 항-인간 IgG (Fc) 프로브와 함께 추가로 인큐베이션하여 항체 결합을 검출하였다. 세포를 세척하고, 1％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 셀퀘스트 (CellQuest) 소프트웨어를 구비한 FACScalibur (Beckton Dickinson) 장치를 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 인간 모노클로날 항체 B11은 전적으로 수상세포에 결합하였다. 모노클로날 항체 C20는 수상세포에 특이적으로 결합하였으며, 또한 단핵구-유사 세포주 U-937 및 THP-1, 및 호지킨 (Hodgkin's) 림프종 세포주 L540와의 반응성 수준이 낮은 것으로 입증되었다. 마찬가지로, 인간 모노클로날 항체 E21은 수상세포에 주로 결합하지만, L540 세포 및 THP-1 세포와도 낮은 수준으로 반응하였다. 이러한 데이타는 인간 모노클로날 항체 B11, C20 및 E21이 상이한 항원을 인식하며, 이들이 조혈계의 다른 세포에 비해 수상세포에 주로 결합한다는 사실을 입증한다.
II. 정제된 인간 항-수상세포 항체와 수상세포의 투여량-의존적 결합
정제된 인간 항-수상세포 모노클로날 항체 B11, C20 및 E21과 수상세포와의 투여량-의존적 반응성을 플로우 사이토메트리에 의해 조사하였다.
수상세포를 상기와 같이 부착성 단핵 세포로부터 얻었다. 세포를 모으고, 4℃에서 다양한 농도의 모노클로날 항체 B11, C20, E21, 또는 이소타입 대조구와 함께 인큐베이션하였다. 항체 결합을 FITC-표지된 염소 항-인간 IgG (Fc) 프로브로 검출하고, 셀퀘스트 (CellQuest) 소프트웨어를 구비한 FACScalibur 장치를 이용하여 세포에 결합된 형광을 측정하였다.
각 모노클로날 항체는 도 2에 나타낸 바와 같이 이소타입 매치된 대조구 IgG 항체에 비해 수상세포에 대하여 투여량 의존적으로 결합하는 것으로 입증되었다. 이러한 데이타는 정제된 인간 모노클로날 항체 B11, C20 및 E21이 농도 의존적인 방식으로 수상세포에 결합한다는 사실을 입증한다. 항-수상세포 항체들 사이의 다양한 결합 강도는 이들 항체가 수상세포 상의 특정 분자 또는 에피토프를 인식한다는 사실을 나타낸다.
III. 인간 항체 B11과 CD34+ 줄기세포-유래의 수상세포의 결합
순환성 혈액 단핵구로부터 분화된 수상세포는 그의 이용가능성으로 인해 연구 및 임상 분야에 있어서 가장 통상적으로 사용되는 형태의 수상세포이다. 그러나, 조상 줄기세포로부터 유래하는 수상세포 또한 사용할 수 있고, 이 줄기세포는 인간 조직에서 수상세포를 보다 정확하게 나타낼 수 있다. 따라서, 하기 연구에서, CD34+ 조상세포로부터 분화된 수상세포를 플로우 사이토메트리에 의해 인간 모노클로날 항체 B11과의 반응성에 대하여 평가하였다.
정제된 모노클로날 항체 B11은 형광 이소티오시아네이트 (FITC)로의 표지화를 위해 pH 9.5의 0.3 M 탄산나트륨 완충액에 대하여 광범위하게 투석하였다. 고상 FITC 1 mg을 DMSO 1 ml 중에 용해시켜 원액 FITC 용액을 제조하였다. 항체 단백질 mg 당 FITC 50 ㎍을 제공하는 양으로 원액 FITC를 일정하게 혼합하면서 적가하였다. FITC를 가한 다음, 용액을 실온에서 1 내지 3시간 동안 암조건하에서 인큐베이션하였다. PBS 중에서 평형화된 세파덱스 (Sephadex) G-10 칼럼상에서의 겔 여과에 의해 FITC 표지된 항체를 단리하였다.
CD34+ 조상세포 및 수상세포 분화 배지는 포에틱 테크놀러지, 인크 (Poetic Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD))사로부터 입수하였다. 제조자의 지시에 따라 세포를 분화시켰다. 수상세포를 모으고, 4℃에서 다양한 농도의 B11-FITC 또는 이소타입 대조구 항체 (인간 IgG-FITC)와 함께 인큐베이션하였다. 셀퀘스트 (CellQuest) 소프트웨어를 구비한 FACScalibur 장치를 이용하여 세포에 결합된 형광을 측정하였다.
결과는 도 3에 나타나 있으며, 인간 모노클로날 항체 B11이 투여량 의존적인 방식으로 CD34+ 줄기세포로부터 분화된 수상세포에 결합한다는 사실을 입증한다. 따라서, B11 표적 항원은 단핵구 및 조상 줄기세포로부터 유도된 수상세포 상에서 발현된다.
IV. 인간 항체 B11과 대식세포 및 수상세포의 결합
인간 항-수상세포 모노클로날 항체 B11이 대식세포와 결합하는 능력을 플로우 사이토메트리를 이용하여 수상세포와 비교하여 평가하였다.
수상세포를 상기와 같이 부착성 단핵 세포로부터 얻었다. M-CSF와 5 내지 7일 동안 배양하여 부착성 단핵 세포로부터 대식세포를 제조하였다. 세포를 모으고, 4℃에서 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 B11 또는 이소타입 대조구 항체와 함께 인큐베이션하였다. FITC-표지된 염소 항-인간 IgG (Fc) 프로브를 이용하여 인간 항체 결합을 검출하였다. 셀퀘스트 (CellQuest) 소프트웨어를 구비한 FACScalibur 장치를 이용하여 세포에 결합된 형광을 측정하였다.
결과는 도 4에 나타나 있으며, 이는 인간 항체 B11이 수상세포보다 적은 정도로 대식세포에 결합한다는 것을 입증한다. 따라서, B11 표적 항원은 발현 수준이 수상세포상에서 관찰되는 것보다 더 낮음에도 불구하고 대식세포상에서 발현된다. 수상세포와 대식세포 사이에는 유사성이 있기 때문에, 모노클로날 항체 B11과 대식세포의 반응성은 놀란만한 것은 아니다. 이러한 두가지 세포 유형은 T 및 B 림프구 반응을 자극하는 능력을 비롯하여 구조 및 기능적 특성 모두를 공유하기 때문에, 항체 B11과 대식세포와의 교차 반응성은 항원 제시 세포를 표적화하는 데 있어서 이로울 수 있다.
V. THP-1 세포상에서 인간 항체 B11 표적 항원의 유도
인간 단핵구 백혈병으로부터 유도된 단핵구-유사 세포주인 THP-1 세포를 유도하여 수상세포 형태로 분화시키기 이전 및 이후에, 플로우 사이토메트리를 이용하여 상기 세포에 결합하는 인간 모노클로날 항체 B11을 시험하였다.
요컨대, THP-1 세포를 표준 배양 배지 또는 GM-CSF 및 IL-4를 보충한 배지 중에서 배양하였다. 세포를 4℃에서 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 B11-FITC 또는 이소타입 대조구 항체 (인간 IgG-FITC)와 함께 인큐베이션하였다. 셀퀘스트 (CellQuest) 소프트웨어를 구비한 FACScalibur 장치를 이용하여 세포에 결합된 형광을 측정하였다. 결과는 도 5에 나타나 있다.
이러한 데이타는, 통상의 배양 조건하에서, THP-1 세포가 B11 표적 항원을 발현시키지 않는다는 것을 입증한다. 그러나, GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 배지 중에서 THP-1 세포를 배양하여 수상세포 형태로 유도하는 경우, B11 표적 항원의 발현은 동시적으로 유도된다. 따라서, 이러한 결과에 의해, 수상세포와 특이적으로 결합하는 표적 항원 (B11)에 대한 B11 인간 항체의 특이성을 추가로 확인하게 되었다.
VI. 인간 항체 B11과 마카크 수상세포의 결합
시아노몰구스 마카크의 동물 (원숭이) 모델은 항체의 임상적 이용에 대한 관련 정보를 제공할 수 있는데, 단 표적 항원이 영장류들 중에서 보존되는 것을 전제로 한다. 따라서, 플로우 사이토메트리에 의해 인간 모노클로날 항체 B11과 시아노몰구스 원숭이로부터의 수상세포와의 교차-반응성을 평가하였다.
시아노몰구스의 새 혈액을 시에라 바이오메디칼즈 (Sierra Biomedicals)로부터 입수하였으며, 수상세포는 GM-CSF 및 IL4와 함께 배양하여 부착성 단핵 세포로부터 얻었다. 수상세포를 4℃에서 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 B11-FITC 또는 이소타입 대조구 항체 (인간 IgG-FITC)와 함께 인큐베이션하였다. FACScalibur 장치를 이용하여 세포에 결합된 형광을 측정하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 인간 모노클로날 항체 B11은 시아노몰구스 마카크로부터 유래하는 수상세포에 결합하며, 이는 B11 표적 항원이 영장류에서 보존된다는 사실을 시사한다.
VII. 인간 항체 B11과 인간 조직내의 수상세포의 결합
인간 모노클로날 항체 B11과, 인간 조직으로부터 얻은 수상세포와의 반응성을 면역조직화학법에 의해 평가하였다. 또한, 이들 실험은 항체 B11과, 인간 조직의 다른 세포 또는 항원과의 임의의 잠재적인 교차-반응성을 평가하기 위해 디자인하였다.
인간 조직의 냉동 절편을 검시 또는 수술적 생검을 통해 얻고, 조직-Tek O.C.T. 배지 중에 넣고, -70℃ 미만에서 동결 보관하였다. 조직을 5 mm로 자르고, 아세톤으로 10분 동안 고정시키고, 밤새 건조하였다. 슬라이드를 10초 동안 10％ 중성-완충된 포르말린으로 고정시킨 다음, 염색한다. 간접적인 이뮤노퍼옥시다제 기술을 이용하였다. 먼저 절편을, Fc-의존성 결합을 차단하는 가열 응집된 IgG를 포함하는 PBS 중에 희석된 B11 FITC 또는 이소타입-매치-FITC 항체로 염색하였다. 토끼 항-FITC 항체에 이어서 퍼옥시다제로 표지된 항-토끼 시약을 이용하여 1차 항체를 검출하였다. 검증된 병리학자가 각 슬라이드를 판독하였으며, 다음과 같은 기준에 따라 결합을 나누었다: +/- (보다 약함), 1+ (약함), 2+ (중간), 3+ (강함), 4+ (보다 강함), Neg. (음성). 하기 표 2에 나타낸 결과는 검사된 모든 조직에서 수상세포 및 임의의 대식세포의 뚜렷한 염색을 보여주었다. 이소타입 대조구 항체에서는 특이적 염색이 관찰되지 않았다.
이러한 데이타는 인간 모노클로날 항체 B11이 적은 정도일지라도 인간 조직에서 수상세포뿐 아니라 대식세포에도 결합한다는 사실을 보여준다. 비장의 단핵 세포 및 골수 조상세포에 대한 B11의 최소 결합은 미성숙 수상세포에 대한 결합을 나타낼 수 있다. 인간 항체 B11은 시험될 샘플 중의 다른 세포 유형 또는 조직과 교차반응하지 않았으며, 이는 수상세포 및 적은 정도로는 대식세포에 대한 상기 항체의 특이성을 추가로 입증한다.
Figure 112006056146383-PAT00002
VIII. 인간 항체 B11 단일쇄 Fv (ScFv) 단편과 인간 수상세포의 결합
인간 모노클로날 항체 B11의 단일쇄 Fv 단편과 인간 조직으로부터의 수상세포의 반응성을 플로우 사이토메트리에 의해 평가하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이 인간 모노클로날 항체 B11의 VL (서열 1 및 2)과 VH (서열 3 및 4) 도메인을 연결하여 B11 ScFv를 제작하였다. ScFv의 수상세포로의 결합을 검출하기 위해 항-EFG 항체를 사용하여 EGF 서열을 혼입시켰다. 수상세포를 4℃에서 1시간 동안 B11-ScFv와 함께 인큐베이션하고, 이어서 세척한 다음, 4℃에서 1시간 동안 항-EFG-FITC 프로브와 함께 인큐베이션하였다. FACS 분석을 이용하여 샘플을 분석하였다.
FACS 분석의 결과는 인간 모노클로날 항체 B11의 B11 ScFv 단편이 인간 수상세포에 결합하였음을 입증하였다. 따라서, ScFv를 선택된 항원 또는 독소에 각각 연결하여 ScFv를 백신 또는 면역독소로 사용할 수 있다.
IX. 인간 항체 B11의 F(ab') 2 단편과 인간 수상세포의 결합
인간 모노클로날 항체 B11의 F(ab')2 단편과 인간 조직으로부터의 수상세포의 반응성을 플로우 사이토메트리에 의해 평가하였다. 또한, 이러한 실험을 설계하여 인간 항체 B11의 Fc 부위가 B11과 수상세포의 결합에 상당히 관여하는 지를 평가하였다.
정제된 B11 mAb를 표준 조건하에 펩신으로 절단하여 F(ab')2 단편을 제조하였다. 단백질 L 크로마토그래피에 의해 F(ab')2 단편을 정제하였다. GM-CSF 및 IL-4 중의 배양에 의해 인간 단핵구로부터 새로 분화된 수상세포를 4℃에서 1시간 동안 전체 항체 또는 F(ab')2 항체 단편과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 다음, 4℃에서 1시간 동안 항-인간 IgG F(ab')2-PE 프로브와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 다시 세척하고, FACScalibur 장치 및 셀퀘스트 (Cellquest) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, FACS 분석의 결과는 전체 인간 모노클로날 항체 B11 및 B11의 F(ab')2 단편이 유사한 반응속도로 수상세포에 결합하였음을 입증하였으며, 이는 전체 모노클로날 항체의 Fc 부위가 B11과 수상세포의 결합에 상당히 기여하지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 3: B11 표적 항원의 특징규명
I. 수상세포로부터의 인간 모노클로날 항체 B11-표적 항원의 면역침전
인간 모노클로날 항체 B11을 사용하여 수상세포로부터의 그의 동족체 표적 항원을 면역침전시켰다.
요컨대, 수상세포로부터의 세포 용해물을 제조하고, 4℃에서 모노클로날 항체 B11 또는 이소타입 대조구 IgG 항체와 함께 인큐베이션하였다. 항체-항원 결합체를 항-인간 IgG-아가로스로 포획하고, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다.
약 180 킬로달톤의 분자량에 상응하는 밴드는 2가지 른 수상세포 용해물 시료의의 항체 B11 면역침전물 중에서는 분명하였지만, 대조구 샘플에서는 그렇지 않았다. 따라서, 이러한 면역침전 연구 결과는 인간 모노클로날 항체 B11이, SDS-PAGE에 의해 분석한 바로는, 대략 180 킬로달톤의 분자량을 갖는, 수상세포 상의 표적 항원을 인식한다는 것을 나타냈다.
II. 수상세포로부터의 인간 모노클로날 항체 B11 표적 항원의 N-말단 시퀀싱
상기 면역침전 이후에, B11 표적 항원의 N-말단 아미노산 시퀀싱하여 공지된 단백질과의 상동성을 결정하였다.
세포 용해물을 수상세포로부터 제조하고, 4℃에서 모노클로날 항체 B11과 함께 인큐베이션하였다. 항체-항원 결합체를 항-인간 IgG-아가로스로 포획하고, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로스로 옮기고, 모노클로날 항체 B11 표적 항원에 상응하는 밴드를 용출시켜 N-말단 아미노산 시퀀싱하였다. N-말단 시퀀싱 및 데이타베이스 검색을 문헌 (Midwest Analytical, Inc. (St. Louis, MO))에 따라 수행하였다.
모노클로날 항체 B11 표적 항원 N-말단의 15개의 아미노산 잔기의 시퀀싱은 하기와 같이 인간 대식세포 만노스 수용체와의 단백질 서열 상동성을 밝혀냈다.
DDXXQFLIXXEDXKR (서열 5) B11 항원
LDTRQFLIYNEDHKR (서열 6) 대식세포 만노스 수용체
인간 단백질 데이타베이스의 컴퓨터 분석에 의해 B11 항원과 상당한 상동성을 갖는 어떤 다른 단백질도 확인되지 않았다.
추가의 연구에서, 항-마우스 IgG로 채워진 아가로스와 밤새 인큐베이션하여 수상세포 용해물에서 비-특이적 결합 단백질을 제거하였다. 아가로스를 원심분리하여 제거하고, 투명한 상층액을 회수하고, 항체 B11으로 미리 채워진 항-인간 IgG-아가로스와 밤새 인큐베이션하였다. 아가로스를 PBS로 세척하고, 환원성 로딩 완충액과 함께 끓였다. 마지막으로, 아가로스를 원심분리하여 제거하고, 상층액을 겔상에 로딩하였다. 항체 B11은 약 150 내지 180 kD의 단백질을 면역침전시켰다. 이 단백질을 PVDF 막상에 블롯팅하고, 마이크로시퀀싱을 위해 미드웨스트 애널리티컬, 인크. (Midwest Analytical, Inc.)사로 전달했다.
모노클로날 항체 B11 표적 항원의 N-말단 마이크로시퀀싱 결과는 단백질 서열 LLDTR QFLIY LEDTK RCVDA (서열 7)를 밝혀냈다. 이 서열은 마찬가지로 국립 센터의 바이오테크놀로지 인포메이션 웹 사이트 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)의 BLAST 알고리즘을 사용하여 측정된 바와 같이 인간 대식세포 만노스 수용체 (GenBank Accession #NP_NP002429)의 서열과 20개의 아미노산에 대하여 100％의 동일성으로 매치되었다. 이 데이타는 인간 모노클로날 항체 B11에 의해 인식된 수상세포상의 표적 분자가 대식세포 만노스 수용체라는 것을 나타낸다.
III. B11은 수상세포에 의한 FITC-덱스트란 수용을 억제한다
하기 실험은, 항체 B11이 만노스 수용체를 차단함으로 인해, 예를 들어 병원체와 만노스 수용체의 상호작용 (예, 세포 감염)을 방지 또는 억제할 수 있는지를 시험하기 위해 디자인하였다.
수상세포를 도 11에 나타낸 온도에서 30분 동안 FITC-덱스트란 (500 ㎍/ml) 및 이소타입 대조구 인간 IgG 또는 B11 HuMAb (25 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 덱스트란 분자는 만노스 수용체를 통해 수상세포에 의해 특이적으로 내재화되는 것으로 알려져 있다 (F. Sallusto et. al. J. Exp. Med. 1995,185: 389-400). 표지된 (FITC)-덱스트란 수용을 FACS 분석에 의해 측정하였다 (즉, FACScalibur 장치를 이용하여 수상세포 샘플의 형광 강도를 결정함). FITC-덱스트란 수용 비율은 37℃에서 100％, 4℃에서 0％이었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 항체 B11은 상기 조건하에 FITC-덱스트란의 수용을 61.5％까지 차단하였다. 이러한 결과는 인간 모노클로날 항체 B11을 사용하여 병원체와 만노스 수용체의 상호작용을 차단시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 인간 항-수상세포 항체의 활성
I. 수상세포에 의한 인간 모노크로날 항체 B11의 내재화
항체 B11이 수상세포에 결합한 다음 내재화되는 정도를 플로우 사이토메트리에 의해 평가하였다.
수상세포를 상기와 같이 부착성 단핵 세포로부터 얻었다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 포화 농도의 모노클로날 항체 B11-FITC와 함께 인큐베이션하여 항체의 최대 표면 결합을 허용하고, 냉각 PBS로 세척하여 과량의 항체를 제거한 다음, 37℃에서 여러 시간 동안 인큐베이션하여 항체를 내재화시켰다. 이어서, 샘플을 냉각 PBS로 세척하여 반응을 중지시키고, 0.1％ PBA (pH 2.5)로 추가로 세척하여 세포로부터 표면 결합된 항체를 제거하였다. 잔류 형광은 내재화된 항체 B11-FITC이다. 대조구 세포를 0.1％ PBA (pH 2.5)로 즉시 세척하고 4℃에서 유지하여 최소 내재화시키거나, 0.1％ PBA (pH 7)로만 세척하여 항체 B11-FITC를 최대 로딩하였다. 항체 내재화율을 하기 식으로 계산하였다:
내재화율 (％) = (샘플의 평균 형광 강도 - 산으로 세척된 4℃ 대조구의 평균 형광 강도) / (PBS로 세척된 4℃ 대조구의 평균 형광 강도 - 산으로 세척된 4℃ 대조구의 평균 형광 강도)
도 7에 나타낸 결과는 인간 모노클로날 항체 B11이 수상세포에 결합한 다음에 효과적으로 내재화된다는 것을 입증한다. 인간 항-수상세포 모노클로날 항체 B11의 이러한 예상치 못한 특성은, 이 항체를 사용하여 항원 및 독소와 같은 물질을 수상세포의 내부로 전달할 수 있음을 암시한다.
II. 수상세포에 의한 B11-FITC 내재화
또한 미세 시각화를 이용하여 항체 B11이 수상세포에 결합한 다음 내재화된다는 것을 확인하였다.
단핵구를 GM-CSF (10 ng/ml) 및 IL-13 (50 ng/ml)과 함께 비-부착성 조건하에 7일 동안 인큐베이션하여 수상세포를 발생시켰다. 이들을 인간 IgG (600 ㎍) 및 항-CD32 mAb IV.3 (10 ㎍)의 존재하에 mAb B11-FITC (1 ㎍)와 배합하여 비-특이적 수용을 차단시키고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 대조구 세포를 빙상에서 전체 과정 동안 인큐베이션하였다. 37℃에서 15분 및 60분간 방치한 후에, 수상세포를 빙상에 놓고, 항-CD11c-PE (1 ㎍)로 염색하였다. BioRad MRC1024 레이저 스캐닝 컨포칼 (confocal) 현미경을 이용하여 컨포칼 현미경법에 의해 mAb B11의 내재화를 조사하였다. 15 mW Kr/Ar 레이저로부터의 488 nm 라인 및 두개의 광검출기 (FITC 형광에 대한 522/35 nm 이색성 및 PE 형광에 대한 605/32 nm 이색성)를 이용하여 세포를 형광에 대하여 스캐닝하였다. 63X Plan-APO 1.4 NA 대물렌즈 (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)를 2.1의 조리개 (iris) 세팅과 함께 사용하여 대략 1.0 ㎛ 두께의 형광 이미지의 광학 절편을 검출하였다. 전체 세포를 절단한 다음, 세포의 중심을 통해 슬라이스로부터 대표적인 이미지를 선택하였다.
상기 결과는 B11 mAb가 만노스 수용체에 결합한 다음 수상세포에 의해 빠르게 내재화되었음을 확인시켜주었으며, 이는 마찬가지로 상기 항체가 항원 또는 독소를 항원 제시 세포로 효과적으로 전달할 수 있다는 것을 시사한다. FACS 데이타와 일치하는 것으로, 내재화는 15분 이내에 분명하였으며, 1시간 이내에 거의 완결되었다.
III. 인간 모노클로날 항체 B11을 사용한 표적화된 항원 전달 이후에 수상세포에 의해 증가된 항원 제시
인간 모노클로날 항체 B11을 사용하여 수상세포에 의한 항원의 프로세싱 및 제시를 증가시킬 수 있는 지를 알아보기 위해, 화학 가교결합 시약 SMCC를 사용하여 항체를 파상풍 독소 (TT) 항원에 연결하였다.
테플론 (Teflon) 용기중에서 배양한 것을 제외하고는 수상세포를 상기와 같이 부착성 단핵 세포로부터 얻다. 수상세포를 모으고, 10％ 태아소 혈청을 포함하는 대식세포 혈청-무함유 배지중의 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 웰 당 5000 세포의 농도로 다시 플레이팅하였다. 파상풍 독소에 연결된 모노클로날 항체 B11 및 파상풍 독소 단독을 다양한 농도로 수상세포에 가하였다. 단핵 세포를 파상풍 독소에 이어서 IL-2와 함께 인큐베이션하여 생성된 자가 파상풍 독소-특이적 T 세포를, 수상세포를 웰 당 50,000 세포의 농도로 포함하는 각 웰에 가하였다. 세포를 37℃에서 7일 동안 함께 배양하고, 제조자의 설명서 (Promega, Madison, WI)에 따라 MTT 기초 분석을 이용하여 생존 세포의 수에 대하여 분석하였다. 수상세포를 파상풍 독소 또는 항체 B11-파상풍 독소에 노출시킨 이후에, 수상세포가 파상풍 독소-특이적 T 림프구를 특이적으로 자극하도록 유도하는 능력을 비교하였다. 결과 (도 8)는 항원 특이적 T 세포 증식에 의해 측정되었을 때 모델 항원으로서 파상풍 독소를 B11에 연결시키는 것이 상당히 더 효과적인 항원 제시를 유발한다는 것을 보여주었다.
다른 실험에서, 3H-티미딘을 T 세포 증식에 대한 판독수단으로 사용한 다음, 수상세포를 파상풍 독소 (TT)에 연결된 B11 또는 B11 항체와 혼합된 파상풍 독소 (비-연결된 대조구)와 함께 로딩하였다. 다른 대조구로서, FcγRII (CD32)에 대한 차단 항체인 mAb IV-3를 B11-TT 컨쥬게이트를 포함하는 일부 웰에 가하여, 이러한 Fc 수용체가 B11-TT에 의한 증가된 항원 프로세싱 및 제시에 기여하였는 지를 결정하였다. 다음날, 세포를 즉석에서 해동된, 미리 확립된 파상풍 독소-특이적 T-세포와 합하여 4일 동안 두었다. 마지막날에는 세포를 37℃에서 3H-티미딘과 함께 동시-인큐베이션하였다. T 세포에 혼입된 3H의 양을 분석하였다.
앞선 실험에서와 같이, 결과 (도 12)는 항원 특이적 T 세포 증식에 의해 측정되었을 때 모델 항원으로서 파상풍 독소를 B11에 연결시키는 것이 상당히 더 효과적인 항원 제시를 유발한다는 것을 입증하였다. 과량의 mAb IV.3의 첨가도 B11-TT 컨쥬게이트에 의한 증가된 항원 제시를 크게 변화시키지는 못하였으며, 이는 B11-TT와 FcγRII의 상호작용이 이러한 활성에 요구되지 않음을 보여준다.
전반적으로, 도 8 및 12에 나타낸 이러한 연구 결과는 T 세포 자극 수준을 달성하는 데 있어서 파상풍 독소 단독에 비해 10 내지 100배 더 적은 양의 항체 B11-연결된 파상풍 독소가 필요하다는 것을 나타낸다. 또한, 도 8에 나타낸 명백한 정도의 T 세포 자극은 파상풍 독소가 항체 B11과 함께 수상세포로 표적화된 경우보다 2배 더 컸다. 따라서, 이러한 데이타는 항원이 인간 모노클로날 항체 B11에 연결될 수 있고, 항체 표적화된 항원이 비-표적화된 항원보다 더 효과적으로 프로세싱 및 제시되어, 증가된 항원-특이적 T 세포 반응이 유발된다는 것을 입증한다.
실시예 5: 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체 E21의 특징규명
I. 인간 항체 E21 항원의 분자량 분석
수상세포 용해물을 배양된 인간 수상세포로부터 제조하였다. 요컨대, 수상세포를 세척하고, 4℃에서 용해 완충액을 포함하는 Triton X-100 중에 재현탁시켰다. 비분획화된 용해물을 4-15％ SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 이어서 단백질을 니트로셀룰로스로 옮겼다. 블롯을 10 ㎍/ml E21에 이어서 항-인간 IgG-알칼리 포스파타제 프로브와 함께 인큐베이션하고, 양고추냉이 퍼옥시다제를 사용하여 시각화하였다.
이 실험 결과는 인간 모노클로날 항체 E21 항원이 대략 36 내지 40 킬로달톤의 분자량을 갖는다는 사실을 입증하였다.
II. 인간 항체 E21과 인간 피부 및 표피 인간 수상세포의 결합
도 1에 나타낸 바와 같이, 인간 모노클로날 Ab E21는 우선적으로 수상세포에 결합하였다. 이 실험은 동결된 피부의 E21으로의 면역조직화학 분석에 의해 피부 및 표피의 수상세포에 대한 인간 항체 E21의 반응성을 시험하기 위해 디자인하였다.
인간 피부의 동결 절편을 FITC-E21 또는 FITC-huIgG 대조구로 염색하고, 토끼 항-FITC 프로브를 사용하여 검출하였다.
면역조직화학 분석 결과는 인간 항체 E21이 인간 피부 절편에서 피부의 수상세포/대식세포 및 표피의 수상세포 (랑게르한 (Langerhan) 세포)와 반응한다는 것을 입증한다.
III. 인간 항체 E21의 마카크 수상세포로의 결합
표적 항원이 영장류에서 보존된다면 시아노몰구스 마카크의 동물 (원숭이) 모델은 항체의 임상적 사용에 대한 적절한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 인간 모노클로날 항체 E21과 시아노몰구스 원숭이로부터 얻은 수상세포의 교차 반응성을 플로우 사이토메트리에 의해 평가하였다.
시아노몰구스 단핵구를 GM-CSF 및 IL-4로 처리하여 수상세포로 분화시켰으며, 플로우 사이토메트리에 의해 E21 결합에 대하여 시험하였다. 수상세포를 4℃에서 1시간 동안 E21과 함께 인큐베이션하고, 이어서 세척한 다음, 4℃에서 1시간 동안 항-인간 IgG-FITC 프로브와 함께 인큐베이션하였다. FACScalibur 장치를 이용하여 샘플을 분석하였다.
결론
상기 실시예는 수상세포에 높은 친화도로 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체의 생성을 입증한다.
특히, 인간 모노클로날 항체 B11은 수상세포 상의 인간 대식세포 만노스 수용체를 특이적으로 인식한다. 또한, 인간 모노클로날 항체 B11은 수상세포에 의해 효과적으로 내재화되며, 수상세포에 의한 항원 프로세싱 및 제시를 증가시킨다.
인간 모노클로날 항체 E21은 인간 수상세포 상의 B11과는 다른 항원에 결합한다. E21 항체는 또한 시아노몰구스 마카크 (원숭이)로부터 유래하는 수상세포와 교차 반응하는데, 이는 E21 항원이 영장류에서 보존되며, 따라서 항체의 추가 개발을 위한 적절한 동물 모델을 제공한다는 사실을 시사한다.
이러한 결과는, 본 발명의 완전한 인간 모노클로날 항체 (그의 단편, 컨쥬게이트 및 이중특이적 분자 포함)가 수상세포 관련 질환의 진단 및 치료에 사용될 수 있다는 결론을 뒷받침한다.
동등물
당업자라면 통상의 실험만으로도 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태의 많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것이다.
수상세포와 특이적으로 반응하거나 월등히 잘 반응하는 물질, 특히 본원발명의 항체를 사용하여, 종양 또는 감염성 질환 항원에 대한 강력한 면역반응을 유도 하고, 골수 및 다른 기관 이식 또는 다른 자가면역 질환에서 강력한 APC(예컨대, 수상세포)를 없애는 독소를 전달하도록 개량하는 등 치료 및 진단 용도에 사용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Medarex, Inc. <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO DENDRITIC CELLS <130> MXI-166PC <150> USSN 60/203,126 <151> 2000-05-08 <150> USSN 60/230,739 <151> 2000-09-07 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(321) <400> 1 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agg tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc ggc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(348) <400> 3 gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg agg atc tcc tgt aag ggt tct gga gac agt ttt acc acc tac 96 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc ata tac agc ccg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 acg aga ggg gac cgg ggc gtt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1)...(15) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 5 Asp Asp Xaa Xaa Gln Phe Leu Ile Xaa Xaa Glu Asp Xaa Lys Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Asp Thr Arg Gln Phe Leu Ile Tyr Asn Glu Asp His Lys Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Leu Asp Thr Arg Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Glu Asp Thr Lys Arg 1 5 10 15 Cys Val Asp Ala 20

Claims (48)

  1. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서
    (a) 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 4의 아미노산 잔기 99-105 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하며,
    (b) 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 2의 아미노산 잔기 89-97 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하고,
    서열 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 수상세포 상의 인간 대식세포 만노스 수용체에 결합하며, 인간 수상세포에 결합된 후 내재화(internalization)하는 항체로서, 단,
    (c) 서열 4의 아미노산 잔기 50-66 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR2 서열,
    (d) 서열 2의 아미노산 잔기 50-66 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR2 서열,
    (e) 서열 4의 아미노산 잔기 31-35 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 및
    (f) 서열 2의 아미노산 잔기 24-34 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR1 서열
    을 추가로 포함하는 항체는 제외되는, 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그 의 항원 결합 부위.
  2. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서
    (a) 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 4의 아미노산 잔기 99-105 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하며,
    (b) 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 2의 아미노산 잔기 89-97 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하고,
    서열 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 수상세포 상의 인간 대식세포 만노스 수용체에 결합하며, 인간 수상세포에 결합된 후 내재화(internalization)하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 수상 세포에 대한 결합에 있어서 경쟁하는, 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  3. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서
    (a) 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 4의 아미노산 잔기 99-105 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하며,
    (b) 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 2의 아미노산 잔기 89-97 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하고,
    (c) 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 4의 아미노산 잔기 50-66 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하며,
    (d) 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 2의 아미노산 잔기 50-66 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하고,
    (e) 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열 4의 아미노산 잔기 31-35 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하며,
    (f) 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열 2의 아미노산 잔기 24-34 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하고,
    서열 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 수상세포 상의 인간 대식세포 만노스 수용체에 결합하며, 인간 수상세포에 결합된 후 내재화(internalization)하는 항체로서, 단,
    (a) 서열 4의 아미노산 잔기 50-66 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR2 서열,
    (b) 서열 2의 아미노산 잔기 50-66 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR2 서열,
    (c) 서열 4의 아미노산 잔기 31-35 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 및
    (d) 서열 2의 아미노산 잔기 24-34 및 그의 보존 서열 변형체를 포함하는 상기 인간 경쇄 가변 영역 CDR1 서열
    을 포함하는 항체는 제외되는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부 위와 수상 세포에 대한 결합에 있어서 경쟁하는, 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단핵구 또는 원시 줄기세포로부터 유래된 세포에 결합하는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피부, 편도, 간, 유방, 비장, 신장, 림프절, 뇌, 정소, 췌장, 심장, 소장, 골수 및 폐로 구성된 군으로부터 선택된 인간 조직으로부터의 비-수상세포에 결합하지 않는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 수상세포의 활성 중 하나 이상을 조절하는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 수상세포에 의한 사이토킨 방출을 유도하는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 병원체가 만노스 수용체에 결합하는 것을 억제하는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 수상세포에 결합된 후 내재화되는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄가 IgG1 또는 IgG3 중쇄를 포함하는 것인 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 (transgenic) 비-인간 동물로부터 얻은, 불멸화된 세포에 융합된 B 세포로부터 제조된 하이브리도마에 의해 생산되는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 107 M-1 이상의 결합 친화 상수로 수상세포에 결합하는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  14. 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비-인간 동물로부터 얻은, 불멸화된 세포에 융합된 B 세포를 포함하며, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 검출가능한 양으로 생산하는 하이브리도마.
  15. 제14항에 있어서, 가변 영역에 각각 서열 3 및 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항체, 및 그의 보존 서열 변형체를 생산하는 하이브리도마.
  16. 제15항에 있어서, 각각 서열 4 및 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, IgG 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항체, 및 그의 보존 서열 변형체를 생산하는 하이브리도마.
  17. 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비-인간 동물을 수상세포로 면역화시켜 항체가 상기 동물의 B 세포에 의해 생산되도록 하는 단계;
    상기 동물의 B 세포를 단리하는 단계; 및
    상기 B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 수상세포에 특이적인 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸의 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
    상기 하이브리도마의 상등액으로부터 수상세포에 결합하는 상기 인간 모노클로날 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 수상세포에 결합하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위의 제조 방법.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위, 및 표적 세포 상의 항원 또는 Fc 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표적 세포가 종양세포, 미생물 병원체, 바이러스 및 바이러스-감염 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것인 이중특이적 분자.
  20. 제18항에 있어서, 상기 제2 결합 특이적 부위가 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위인 이중특이적 분자.
  21. 항원에 결합된, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 분자 결합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항원이 병원체의 성분을 포함하는 것인 분자 결합체.
  23. 제21항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원 또는 자가항원을 포함하는 것인 분자 결합체.
  24. 제21항에 있어서, 상기 결합체의 항체 부위가 항체 단편 또는 단일쇄 항체를 포함하는 것인 분자 결합체.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부위, 제21항의 분자 결합체 또는 제18항의 이중특이적 분자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 애디슨병, 홍반성 루프스, 레이터 (Reiter's) 증후군, 그레이브스 병, 이식 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환의 치료를 위한 조성물.
  26. 상이한 에피토프에 각각 결합하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부위, 제21항의 분자 결합체 또는 제18항의 이중특이적 분자 중 두 개 이상의 임의의 배합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 애디슨병, 홍반성 루프스, 레이터 (Reiter's) 증후군, 그레이브스 병, 이식 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환의 치료를 위한 조성물.
  27. 제21항의 분자 결합체를 비-인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 대상체에서 항원을 수상세포에 표적화하는 방법.
  28. 제21항의 분자 결합체를 비-인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비-인 간 대상체에서 항원에 대한 면역반응을 유도하거나 상승시키는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 면역반응이 항원을 MHC-I 또는 MHC-II 결합체의 성분으로서 제시하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 제21항의 분자 결합체를 비-인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 대상체의 면역화 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 결합체가 수상세포에 의한 사이토킨 방출을 유도하기에 충분한 양으로 투여되는 방법.
  32. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 결합체가 수상세포 표면 상의 하나 이상의 면역조절 수용체의 발현을 조절하기에 충분한 양으로 투여되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 면역조절 수용체가 CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD40 및 CD54 (ICAM)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 수상세포와 병원체의 결합을 방해하기에 충분한 양의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 수상세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 수상세포 상의 인간 만노스 수용체와 병원체의 결합을 방해하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스 또는 박테리아인 방법.
  36. 제25항의 조성물을 종양 생장을 억제하기에 충분한 양으로 비-인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 대상체의 종양 생장의 억제 방법.
  37. 제25항의 조성물을 자가면역질환을 치료하거나 예방하기에 충분한 양으로 비-인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 대상체의 자가면역질환의 치료 또는 예방 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 질환이 이식편 대 숙주 질환인 방법.
  39. (a) 인간 VH 5-51 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vκ L15 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    인간 수상세포에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  40. 인간 수상세포를 활성화하는, 제1항 내지 제3항 및 제39항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  41. 항원에 컨쥬게이트되어 인간 수상세포에 의한 항원의 제시를 증가시키는, 제1항 내지 제3항 및 제39항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  42. 약 108 M-1 이상의 결합 친화 상수로 수상세포에 결합하는, 제1항 내지 제3항 및 제39항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  43. 약 10-3 S-1 이하의 속도 상수 (Kdis)로 수상세포로부터 해리되는, 제1항 내지 제3항 및 제39항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  44. 치료제에 연결된 제1항 내지 제3항 및 제39항 중 어느 한 항의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 면역 컨쥬게이트 (immunoconjugate).
  45. 제44항에 있어서, 상기 치료제가 세포 독소인 면역 컨쥬게이트.
  46. 제44항에 있어서, 상기 치료제가 방사성 동위원소인 면역 컨쥬게이트.
  47. 서열 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 수상세포 상의 인간 대식세 포 만노스 수용체에 결합하고 인간 수상세포에 결합한 후 내재화되는, 제1항의 인간 모노클로날 항체의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  48. 제47항에 있어서, 서열 2 또는 4에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열.
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