KR20060070697A - 고정화된 히드로겔 또는 ｐｅｇ－히드로겔 공중합체를이용한 핵산의 분리 및 정제 방법 - Google Patents

고정화된 히드로겔 또는 ｐｅｇ－히드로겔 공중합체를이용한 핵산의 분리 및 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기판 상에 작용기를 갖는 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 고정화하는 단계; 상기 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체가 고정된 기판에 염과 핵산이 포함된 시료의 혼합 용액을 첨가하여 상기 핵산을 상기 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체에 결합시키는 단계; 상기 핵산이 결합된 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 세정하는 단계; 및 용출 용매를 사용하여 상기 결합된 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 고정화된 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 기판 상에 고정화하여 기판 상에서 DNA를 분리, 정제하는 경우 별도의 화학물질의 첨가 없이 DNA를 결합 및 용출시키고, PCR 과 같은 후속 공정에 대한 영향을 최소화할 수 있으며, PEG 농도 조절에 따라 결합되는 DNA의 양 및 결합의 세기를 조절할 수 있으며, 히드로겔 형태의 화합물이 기판 상에 존재하기 때문에 패터닝이 가능하다.

Description

고정화된 히드로겔 또는 ＰＥＧ－히드로겔 공중합체를 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법 {Method for isolating and purifying nucleic acids using immobilized hydrogel or PEG-hydrogel co-polymer}
도 1은 본 발명의 방법을 이용하여 핵산을 분리 및 정제하는 일예를 나타내는 모식도이다.
도 2는 PEG-히드로겔 공중합체의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 3은 기판 상에서 PEG-히드로겔 공중합체의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 4는 시간 경과에 따른 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 팽윤되는 과정을 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5는 PEG 비율에 따라 GAPS로 코팅된 실리콘 기판 상에서 합성된 상이한 PEG 도입 비율을 가지는 PEG-히드로겔 공중합체와 FITC의 반응 결과를 상대적인 형광 값으로 나타낸 것이다.
도 6은 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드가 상기 PEG-히드로겔 공중합체에 결합된 상태와 용출 후의 상태의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것이다.
도 7은 PEG 도입 비율에 따른 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 70% EtOH 세정 후, 물 용출 후 및 10X PCR 완충액 용출 후에 잔존하는 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것이다.
도 8은 물 또는 10X PCR 완충액의 용출 용매에 따른 DNA 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 상이한 PEG 도입 비율을 가지는 고정화된 PEG-히드로겔 공중합체에 의해 분리된 DNA를 주형으로 한 PCR 결과를 Ct 로 나타낸 것이다.
도 10은 상이한 PEG 도입 비율을 가지는 고정화된 PEG-히드로겔 공중합체에 의해 분리된 DNA를 주형으로 한 PCR 결과를 증폭된 DNA의 농도로 나타낸 것이다.
도 11은 1M NaCl 유무에 따른 2가지 카르복실 작용기를 가지는 기판에 결합된 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것이다.
본 발명은 고정화된 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.
세포로부터 DNA의 분리 방법은 DNA를 결합하는 경향을 갖는 물질을 이용하여 수행되었다. DNA의 분리를 위한 물질의 예는 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지, 및 자성 비드이다(Rudi, K. 등, Biotechniqures 22, 506-511 (1997); 및 Deggerdal, A. 등, Biotechniqures 22, 554-557 (1997)). 수작업 단계를 피하고, 작업자 오차를 제거하기 위해, 몇 가지 자동화 기계가 대량 DNA 추출을 위해 개발되었다.
종래 고상 물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,234,809호에는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 시간이 오래 소요되기 때문에 복잡하며, 랩온어칩에 부적합하다. 또한, 상기 방법은 반드시 카오트로픽 물질을 사용하여야 하는 문제점이 있었다. 즉, 상기 카오트로픽 물질을 사용하지 않는 경우에는 고상 물질에 핵산이 결합하지 않는다.
또한, 미국특허 제6,291,166호에는 고상 매트릭스를 이용한 핵산의 집적(archiving) 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 핵산이 고상 매트릭스에 비가역적으로 결합하기 때문에, 상기 핵산 고상 매트릭스 복합체를 보관한 후 나중에 분석 (delayed analysis)하거나 반복 분석 (repeated analysis)하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 이 방법에 의하면, 알루미나와 같은 표면에 양전하를 띠는 물질을 NaOH와 같은 염기성 물질로 활성화하여야 하고, 핵산은 이렇게 활성화된 알루미나에는 비가역적으로 결합하기 때문에 알루미나로부터 분리할 수 없게 된다.
미국 특허 제5,705,628호에는 DNA를 포함하는 용액을 염 및 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 카르복실기로 코팅된 표면을 갖는 자성 마이크로입자를 결합시켜 가역적 및 비특이적으로 DNA를 결합시키는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법은 DNA를 분리하기 위해 카르복실기 표면을 갖는 자성 입자, 염 및 폴리에틸렌 글리콜을 이용하고 있으나, 본 발명의 기판 상에 고정된 카르복실기 표면을 갖는 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 이용한 DNA 분리에 대한 기재는 없다.
기존의 핵산의 분리 및 정제 방법은 DNA를 결합시키기 위해 별도로 고농도의 시약을 첨가해야 하는데 이는 PCR과 같은 후속 공정에 영향을 줄 수 있으며, 또한 LOC 상에 적용하기 힘들다는 문제점이 있었다. 따라서, 기판과 같은 고체 표면상에 별도의 시약의 첨가 없이 DNA를 결합시킬 수 있으며, 또한 후속 공정에 영향 없이 DNA를 분리할 수 있는 시약을 고정화함으로써 DNA를 분리하는 방법의 필요성이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 기판 상에 고정화하여 기판 상에서 DNA를 분리 및 정제하는 경우 결합 시약을 별도로 첨가할 필요가 없으며, 기판 상에서 DNA를 용출하는 과정에서 후속 공정에 영향을 주는 화학물질이 나오지 않으며, 패터닝이 용이함을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 별도의 화학물질의 첨가 없이 DNA를 결합 및 용출시키고, PCR 과 같은 후속 공정에 대한 영향을 최소화할 수 있는 고정화된 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
기판 상에 작용기를 갖는 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 고정화하는 단계;
상기 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체가 고정된 기판에 염과 핵산이 포 함된 시료의 혼합 용액을 첨가하여 상기 핵산을 상기 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체에 결합시키는 단계;
상기 핵산이 결합된 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 세정하는 단계; 및
용출 용매를 사용하여 상기 결합된 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 고정화된 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 기판 상에 작용기를 갖는 히드로겔을 고정화하는 단계를 포함한다. 히드로겔을 기판 상에 고정화하기 위해 히드로겔 전구체를 이용하여 기판 상에서 합성한다.
히드로겔은 넓은 표면적을 가지며, pH, 전기, 열, 이온 등의 다양한 자극에 반응하여 팽윤(swelling), 이온화된다. 따라서, 물을 함유한 히드로겔은 식품 첨가제, 혈액 접촉 물질, 생접착제, 콘택트 렌즈, 상처 드레싱, 인공 장기, 약물 전달, DNA 백신, 조절 방출형 제제, 멤브레인, 초흡수제, 셀 캡슐화 및 면역격리 물질, 및 약물을 포함한 생활성제 전달용 운반체를 비롯하여 다양한 용도를 갖는다. 히드로겔은 음이온성 히드로겔과 양이온성 히드로겔로 분류될 수 있다. 폴리아크릴산과 같은 음이온성 히드로겔은 pH가 높을수록, 염 농도가 낮을수록, 온도가 낮을수록 팽윤 및 이온화가 잘 된다. 반면에, 폴리(N,N-에틸아미노에틸 메타크릴레이트)와 같은 양이온성 히드로겔은 pH가 낮을수록, 염 농도가 높을수록 팽윤 및 이온화가 잘 된다.
DNA를 고정화하는 물질은 DNA와 가역적으로 결합할 수 있어야 하며, 별도의 화학물질의 첨가 없이 DNA와 결합할 수 있어야 한다. 또한 상기 물질은 표면적이 넓어야 하며, LOC 에 응용을 위해 기판 상에서 패터닝과 같은 가공이 가능해야 한다.
본 발명은 또한, 상기 히드로겔이 고정된 기판에 염과 핵산이 포함된 시료의 혼합 용액을 첨가하여 상기 핵산을 상기 히드로겔에 결합시키는 단계를 포함한다. 상기 작용기를 갖는 히드로겔이 고정된 기판에 염과 핵산이 포함된 시료의 혼합 용액을 첨가하면, 시료 중의 핵산이 히드로겔에 결합하게 된다. 양이온성 히드로겔의 경우에는 핵산과 직접 정전기적 인력에 의해 결합하며, 음이온성 히드로겔의 경우에는 염 또는 폴리에틸렌 글리콜/염을 매개체로 하여 핵산과 결합한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산이 결합된 히드로겔을 세정하는 단계를 포함한다. 세정 단계는 히드로겔에 결합되지 않은 물질을 제거하기 위함이다. 세정액은 70% 에탄올 같은 유기 용매를 이용할 수 있으며, 세정 조건은 히드로겔 및 분리하고자 하는 핵산의 종류에 따라 변할 수 있다.
본 발명은 또한, 용출 용매를 사용하여 상기 결합된 핵산을 용출하는 단계를 포함한다. 상기 세정액을 이용하여 핵산이 결합된 히드로겔을 세정하고, 공기 중에서 건조시켜 세정액을 제거한 후에 용출 용매를 사용하여 결합된 핵산을 용출한다. 용출 용매로는 물, Tris-HCl/pH 8, Na2CO3/pH 10, 10X PCR 완충액과 같은 용매를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용출 용매 중에서 물이 바람직 하다. 이는 10X PCR 완충액을 용출 용매로 사용할 경우에는 DNA 회수율은 물보다 우수하나, PCR 이 되지 않는 문제가 발생한다. 따라서, 10X PCR 완충액보다는 DNA 회수율이 다소 떨어지나 PCR 이 잘되는 물이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 고정화된 히드로겔은 폴리에틸렌 글리콜과 공중합체 형태로 되어 있을 수 있다. PEG-히드로겔 공중합체를 기판 상에 고정화하기 위해 PEG와 히드로겔 전구체를 이용하여 PEG-히드로겔 공중합체를 기판 상에서 합성한다. 기존의 연구 결과를 참고하면 PEG가 존재할 경우 염 존재하에서 DNA와 카르복실기간의 상호작용이 증가하여 보다 많은 양의 DNA가 결합할 수 있다. 합성 방법의 일예로 하기 제조예 2와 같은 과정에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 히드로겔의 작용기는 카르복실기이다. 상기 카르복실기는 카르복실기 유도체로부터 제조되며, 이 유도체는 카르복실 무수물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 히드로겔의 전구체는 하기 화학식 I의 중합체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)일 수 있다.
[화학식 I]
Figure 112004060216991-PAT00001
(식 중,
R1 내지 R6는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 히드록시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기, 혹은 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴옥시기를 나타내며, n은 2 내지 100,000의 정수이다).
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알킬기는 탄소수 1 내지 20의 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함하며, 바람직하게는 1 내지 약 12 탄소원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 알킬 라디칼은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬이다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, iso-아밀, 헥실 등을 들 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬 라디칼이 더욱 더 바람직하다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알콕시기는 탄소수 1 내지 20의 알킬 부분을 각각 갖는 산소-함유 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함한다. 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 저급 알콕시 라디칼이 더욱 바람직한 알콕시 라디칼이다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 t-부톡시를 들 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 알콕시 라디칼이 더욱 더 바람 직하다. 상기 알콕시 라디칼은 플루오로, 클로로 또는 브로모와 같은 하나 이상의 할로 원자로 더 치환된 할로알콕시 라디칼을 제공할 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 할로알콕시 라디칼이 더욱 더 바람직하다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 플루오로메톡시, 클로로메톡시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 플루오로에톡시 및 플루오로프로폭시를 들 수 있다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알케닐기는 탄소-탄소 이중결합을 함유하는 탄소수 2 내지 30의 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소기를 의미한다. 바람직한 알케닐기는 쇄 내에 2 내지 12개의 탄소원자를 가지며, 더욱 바람직하게는 쇄 내에 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는다. 분지형은 하나 이상의 저급알킬 또는 저급알케닐기가 알케닐 직쇄에 부착된 것을 의미한다. 이러한 알케닐기는 치환되지 않거나, 할로, 카르복시, 히드록시, 포밀, 설포, 설피노, 카바모일, 아미노 및 이미노를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 하나 이상의 기에 의해 독립적으로 치환될 수 있다. 이와 같은 알케닐기의 예로서는 에테닐, 프로페닐, 카르복시에테닐, 카르복시프로페닐, 설피노에테닐 및 설포노에테닐 등이 있다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 아릴기는 단독 또는 조합하여 사용되어, 하나 이상의 고리를 포함하는 탄소원자수 6 내지 20개의 카보사이클 방향족 시스템을 의미하며 상기 고리들은 펜던트 방법으로 함께 부착되거나 또는 융합될 수 있다. 아릴이라는 용어는 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인단 및 비페닐(biphenyl)과 같은 방향족 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 아릴은 페닐이다. 상기 아릴기는 히드록시, 할로, 할로알킬, 니트로, 시아노, 알콕시 및 저급 알 킬아미노와 같은 1 내지 3개의 치환기를 가질 수 있다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 아릴옥시기는 아릴-O-를 의미한다. 아릴옥시기중 아릴에 대한 정의는 상기한 바와 같다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 헤테로아릴기는 N, O 또는 S 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리원자가 C인 고리원자수 6 내지 20의 1가 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 라디칼을 의미한다. 또한, 상기 용어는 고리내 헤테로원자가 산화되거나 사원화되어, 예를 들어 N-옥사이드 또는 4차 염을 형성하는 1가 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 라디칼을 의미한다. 대표적인 예로는 티에닐, 벤조티에닐, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 퀴놀리닐, 퀴녹살리닐, 이미다졸릴, 푸라닐, 벤조푸라닐, 티아졸릴, 이속사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 트리아졸릴, 피라졸릴, 피롤릴,인돌릴, 2-피리도닐, 4-피리도닐, N-알킬-2-피리도닐, 피라지노닐, 피리다지노닐, 피리미디노닐, 옥사졸로닐, 및 이들의 상응하는 N-옥사이드(예를 들어, 피리딜 N-옥사이드, 퀴놀리닐 N-옥사이드), 이들의 4차 염 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 헤테로아릴옥시기는 헤테로아릴-O- 을 의미하며, 헤테로아릴옥시기중 헤테로아릴에 대한 정의는 상기 정의한 바와 같다.
상기 화합물의 각 단위체인 말레산 무수물이 가수분해되면 카르복실산이 되는데, 이는 음이온성 히드로겔인 폴리아크릴산(PAA)과 유사한 구조를 갖게 된다. 또한, 히드로겔의 특성을 가지기 때문에 표면적이 넓고 기판 상에서 패터닝이 가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 기판은 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 금속판, 폴리스티렌, 막 등을 포함할 수 있다. 상기 기판은 히드로겔 중합체가 고정될 수 있는 것이면 어느 것이라도 가능하나, 물에 용해되지 않는 특성을 가져야 한다. 만약 물에 용해된다면 핵산 함유 용액과 기판을 분리하기가 어렵기 때문이다. 또한, 상기 기판은 표면적이 넓은 것이 히드로겔 중합체를 많이 결합할 수 있어서 바람직할 수 있으며, 표면적을 넓히기 위해 글라스나 웨이퍼 같은 평평한 기판의 경우 기둥(pillar) 형태로 표면을 가공하는 것도 가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 염은 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 할로겐염이며, 염의 농도는 0.5∼5M 일 수 있다. 히드로겔에 핵산을 결합하기에 적합한 염에는 염화나트륨, 염화리튬, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화바륨, 염화마그네슘 및 염화세슘과 같은 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 할로겐염이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 염화나트륨을 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 염 농도는 0.5∼5.0M 인 것이 바람직한데, 이는 상기 농도가 0.5M 미만이거나 5.0M 을 초과하면 히드로겔에 결합되는 핵산의 효율이 감소하기 때문이다. 더욱 바람직하게는 염 농도는 약 1M 로 조절된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 핵산은 올리고뉴클레오티드, 플라스미드 DNA, 람다 DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 2,000∼10,000 의 범위일 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 도입 비율은 카르복실기에 대해 1∼50몰%의 범위일 수 있다. 1분자의 말레산기가 가수분해되면 2분자의 카르복실기가 생성되는데, 이 중 1분자의 카르복실기만이 폴리에틸렌 글리콜과 에스테르 결합을 형성한다. 따라서, 폴리에틸렌 글리콜의 도입 비율은 카르복실기에 대해 최대로 50몰% 까지 가능하다.
도 1은 본 발명의 방법을 이용하여 핵산을 분리 및 정제하는 일예를 나타내는 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
제조예 1: PEG-히드로겔 공중합체의 합성
도 2는 PEG-히드로겔 공중합체의 합성을 나타내는 개략도이다. 구체적으로, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)(평균 분자량: 300,000) 1.0g, 폴리에틸렌 글리콜 (분자량: 10,000) 0.5g을 30ml N,N-디메틸포름아미드에 용해하였다. 온도를 40℃로 유지하고 교반하면서 트리에틸아민 200㎕를 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 온도를 상온으로 유지하면서 물 50ml을 첨가하였다. 30분 동안 추가로 교반한 후, 1N HCl을 첨가하여 pH를 약 3 정도가 되도록 한 후 백색 고체를 여과하여 진공 건조시켰다.
제조예 2: 기판 상에서 PEG-히드로겔 공중합체의 합성
도 3은 기판 상에서 PEG-히드로겔 공중합체의 합성을 나타내는 개략도이다. 구체적으로, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)(평균 분자량: 300,000) 0.010g, 폴리에틸렌 글리콜 (분자량: 10,000) 0.158g (20% PEG 가 도입된 공중합체의 경우에는 PEG 0.158g, 50% PEG 가 도입된 공중합체의 경우에는 PEG 0.396g, 80% PEG 가 도입된 공중합체의 경우에는 PEG 0.634g)을 10ml N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해하였다. 여기에 트리에틸아민(TEA) 110㎕ (20% PEG 가 도입된 공중합체의 경우에는 TEA 110㎕, 50% PEG 가 도입된 공중합체의 경우에는 TEA 270㎕, 80% PEG 가 도입된 공중합체의 경우에는 TEA 450㎕)를 첨가하고, 잘 혼합하였다. 상기 용액을 GAPS(γ-아미노프로필실란)로 코팅된 실리콘 기판(각각 5개)이 포함된 반응 용기에 첨가하고 40℃ 오븐에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 300ml DMF로 2회, 300ml 아세톤으로 2회 세정한 후, 진공 건조시켰다. 건조된 기판을 다시 반응기에 넣고 여기에 0.1M Tris 완충액(pH 7.5) 10ml을 첨가하였다. 이를 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 반응이 종료된 후, 300ml 물로 2회, 300ml 아세톤으로 2회 세정한 후, 진공 건조시켰다.
실시예 1: PEG-히드로겔 공중합체의 팽윤 특성
PEG-히드로겔 공중합체의 팽윤(swelling) 특성을 알아 보기 위해, 상기 제조예 1에서 합성한 PEG-히드로겔 공중합체 0.1mg에 pH 8.0 NaHCO3 (0.025M) 용액 1ml 를 첨가한 후, 시간에 따른 팽윤 특성을 관찰하였다. 도 4는 시간 경과에 따른 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 팽윤되는 과정을 현미경으로 촬영한 사진이다. 도 4에 보여주는 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 PEG-히드로겔 공중합체가 팽윤되어 부피가 현저하게 증가함을 알 수 있었다.
실시예 2: PEG 비율에 따른 기판 상에서의 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 합성
상이한 PEG 비율에 따라 GAPS로 코팅된 실리콘 기판 상에서 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 합성 여부를 알아 보기 위해, FITC(플루오레신 이소티오시아네이트) 반응을 수행하였다. 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)은 평균 분자량이 300,000 인 것을 사용하고, PEG 를 말레산기에 대해 0%, 20%, 50%, 80% 첨가한 것을 제외하고는 제조예 2의 방법에 따라 PEG-히드로겔 공중합체를 합성하였다. 도 5는 PEG 비율에 따라 GAPS로 코팅된 실리콘 기판 상에서 합성된 상이한 PEG 도입 비율을 가지는 PEG-히드로겔 공중합체와 FITC의 반응 결과를 상대적인 형광 값으로 나타낸 것이다. FITC 는 기판 상의 유리 아민기와 반응하여 형광을 나타내는데, 형광이 강하면 기판 상에 유리 아민기가 많이 존재하다는 것을 나타내며, 이는 PEG-히드로겔 공중합체의 합성이 적다는 것을 의미하는 것이다. 도 5에 보여주는 바와 같이, 합성 전에는 형광 값이 16764 로 매우 높으나, 합성 후에는 형광 값이 현저하게 감소한다는 것을 알 수 있다. 즉, 합성 전의 실리콘 기판에 비해 형광 강도가 감소하였으므로, 실리콘 기판 표면의 유리 아민기가 반응하여 PEG-히드로겔 공중합체의 합성이 진행되었음을 알 수 있다. 또한, PEG 비율이 증가할수록 형광 강도가 증가 하는 것을 알 수 있는데, 이는 PEG-히드로겔 공중합체의 합성이 되지 않아 유리 아민기가 많이 남아 있어서 그런 것이 아니라 PEG 의 반응하지 않은 히드록실기와 FITC가 반응하여 형광 강도를 증가시킨 것으로 생각된다.
실시예 3: 기판 상의 상기 PEG-히드로겔 공중합체에 의한 DNA의 분리
실제 기판 상에 고정화된 상기 PEG-히드로겔 공중합체에 의한 DNA 분리 및 정제가 가능하지 알아 보기 위해, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)은 평균 분자량이 300,000인 것을 사용하고, PEG 를 말레산기에 대해 2.5% 첨가한 것을 제외하고는 제조예 2의 방법에 따라 합성된 PEG-히드로겔 공중합체를 이용하였다. 상기 합성된 PEG-히드로겔 공중합체가 고정화된 기판 상에 최종 농도 1M의 NaCl 및 최종 농도 10nM의 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 사용한 결합 완충액은 각각 0.1M 인산염(pH7.0) 및 0.1M 탄산나트륨(pH10.0) 이었다. 이어서, 70% EtOH 60㎕로 5분 동안 상기 올리고뉴클레오티드가 결합된 히드로겔을 1회 세정하고, 증류수 60㎕를 이용하여 10분 동안 결합된 올리고뉴클레오티드를 용출시켰다. 도 6은 상기 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드가 상기 PEG-히드로겔 공중합체에 결합된 상태와 용출 후 상태의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것이다. 형광 강도가 클수록 올리고뉴클레오티드는 더 많이 결합한 것을 나타낸다. 도 6에 보여주는 바와 같이, 상기 PEG-히드로겔 공중합체가 고정화된 기판을 이용하여 DNA를 결합 및 용출할 수 있음을 알 수 있으며, 또한, pH10.0 보다 pH7.0에서 DNA가 약 2.5배 결합이 더 잘 됨을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 알 수 있는 것이다.
실시예 4: PEG 비율에 따른 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 DNA 분리 효율
PEG 비율에 따른 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 DNA 분리 효율을 알아 보기 위해, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)은 평균 분자량이 300,000 대신에 150,000인 것을 사용하고, PEG 를 말레산기에 대해 0%, 20%, 50%, 80% 첨가한 것을 제외하고는 제조예 2의 방법에 따라 합성된 PEG-히드로겔 공중합체를 이용하였다. 결합 완충액은 0.1M 인산염(pH7.0)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 도 7은 PEG 도입 비율에 따른 상기 PEG-히드로겔 공중합체의 70% EtOH 세정 후, 물 용출 후 및 10X PCR 완충액 용출 후에 잔존하는 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것이다. 형광 강도가 클수록 올리고뉴클레오티드는 더 많이 결합한 것을 나타낸다. 도 7에 보여주는 바와 같이, PEG 비율이 20% 일 때 가장 많은 올리고뉴클레오티드가 결합하였으며, 물 또는 10X PCR 완충액(750mM Tris-HCl, 150mM (NH4)2SO4 , 10㎍/ml BSA, 25mM MgCl2)의 용출 용매로 용출 후에는 형광 강도가 현저히 감소한 것으로 보아 결합된 올리고뉴클레오티드가 상기 용출 용매에 의해 대부분 용출되었다는 것을 알 수 있다. 도 8은 물 또는 10X PCR 완충액의 용출 용매에 따른 DNA 회수율을 나타낸 그래프이다. 도 8에 보여주는 바와 같이, PEG 20%에서 가장 많은 양의 DNA 가 회수되고, 회수율은 PEG 의 양이 많을수록 낮아진다는 것을 알 수 있다. 또한, DNA 회수율은 10X PCR 완충액의 경우가 물의 경우보다 회수율이 양호함을 알 수 있다.
실시예 5: 용출된 DNA 의 PCR 증폭 효율
Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드 대신에 B형 간염 바이러스(HBV) 플라스미드 DNA(7kb)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 4의 방법으로 각각 분리된 DNA를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. PCR 증폭은 LightCycler 기기 (Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)를 이용하여 20㎕ 에서 수행하였으며 정방향 프라이머(서열 번호 1) 및 역방향 프라이머(서열 번호 2)를 이용하여 B형 간염 바이러스(HBV) 게놈의 코아 영역을 증폭하였다. LightCycler 반응의 마스터믹스는 다음과 같이 제조하였다: 2 ㎕ LightCycler 마스터 (Fast start DNA master SYBR Green I; Roche Diagnostics), 3.2㎕ MgCl2 (5 mM), 1.0㎕ 정방향-역방향 프라이머 혼합물 (1.0 μM), 4.0㎕ UNG (Uracil-N-Glycosylase, 0.2 유닛) 및 4.8㎕ H2O. 분석할 5㎕ 시료를 상기 혼합물에 첨가하였다. 두 종류의 Taq DNA 중합효소(Roche Hot-start Taq DNA 중합효소 및 Solgent Taq DNA 중합효소)를 LightCycler 마스터를 준비하는데 사용하였다.
Taq DNA 중합효소(Roche Hot-start Taq DNA 중합효소)의 경우에는 50℃에서 10분, 95℃에서 10분 동안 예비변성 후, 35 사이클(95℃에서 5초 동안 변성, 62℃에서 15초 동안 어닐링 및 신장)동안 수행하였고, Taq DNA 중합효소(Solgent)의 경우에는 50℃에서 10분, 95℃에서 1분 동안 예비변성 후, 35 사이클(95℃에서 5초 동안 변성, 62℃에서 15초 동안 어닐링 및 신장)동안 수행하였다.
증폭된 DNA 를 시판되는 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에서 분석하였다.
도 9는 상이한 PEG 도입 비율을 가지는 고정화된 PEG-히드로겔 공중합체에 의해 분리된 DNA를 주형으로 한 PCR 결과를 Ct 로 나타낸 것이다. PTC는 양성 대조군으로서 HBV 플라스미드 DNA를 이용하여 PCR을 한 것이고, NTC는 음성 대조군으로서 증류수를 이용하여 PCR을 한 것이다. PCR 결과를 Ct(Count of thereshold)로 나타내었는데, Ct는 실시간 PCR 반응에서 최초의 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말하며, PCR 반응에서 초기 주형 DNA 분자수가 많을수록 Ct는 낮게 나오고, DNA 분자수가 적을수록 Ct는 높게 나온다. 도 9에 보여주는 바와 같이, 4 종류의 PEG 비율 모두에 대해 PCR이 되는 것을 알 수 있으며, PEG 비율이 20%인 경우가 가장 Ct 값이 낮다는 것을 알 수 있다. 이는 PEG 비율이 20%인 경우에 DNA가 가장 많이 분리되었다는 것을 의미하는 것이다. 또한, 상기 결과는 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드를 이용한 실시예 4의 결과에서 PEG 비율이 20%일 때 DNA 회수율이 가장 높은 결과와도 일치함을 알 수 있다.
상기 Ct 값이 원하는 PCR 생성물의 생성과 직접적인 연관이 있는지를 알아보기 위해, 즉, 원하는 PCR 생성물이 많이 생성되어 Ct 값이 낮게 나왔는지를 확인하기 위해, 원하는 PCR 생성물의 농도를 측정하였다. 도 10은 상이한 PEG 도입 비율을 가지는 고정화된 PEG-히드로겔 공중합체에 의해 분리된 DNA를 주형으로 한 PCR 결과를 증폭된 DNA의 농도로 나타낸 것이다. PTC는 양성 대조군으로서 HBV 플라스미드 DNA를 이용하여 PCR을 한 것이고, NTC는 음성 대조군으로서 증류수를 이용하 여 PCR을 한 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 생성물의 양은 Agilent 2100 BioAnalyzer의 사용으로 정량화되었다. 도 10에 보여주는 바와 같이, 4 종류의 PEG 비율 모두에 대해 PCR 산물이 생성되었으며, PEG 비율이 20%인 경우에 가장 많은 양의 PCR 산물이 생성되었음을 알 수 있다.
실시예 6: DNA의 결합에 대한 히드로겔의 효과
DNA의 결합에 대한 히드로겔의 효과를 알아 보기 위해, PEG가 공중합 되어 있지 않은 히드로겔이 고정화된 기판과 단순히 카르복실기만이 고정화된 기판을 각각 제조하였다. 본 실시예는 용출과정을 수행하지 않은 것을 제외하고는 실시예 3의 방법과 동일하게 DNA를 결합하였다. 도 11은 1M NaCl 유무에 따른 2가지 카르복실 작용기를 가지는 기판에 결합된 Cy3 표지된 50머 올리고뉴클레오티드의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것이다. 도 11에 보여주는 바와 같이, 히드로겔의 경우에는 높은 염 농도에서 DNA와 결합이 더욱 양호하다는 것을 알 수 있다. 반면에, 카르복실기만이 고정화된 기판의 경우에는 염 농도에 무관하게 DNA가 거의 결합되지 않음을 알 수 있다. 이로부터 DNA와 결합하는 주 물질은 히드로겔이며, PEG는 DNA의 결합의 양 및 세기를 증가시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
따라서, 상기 결과로부터 기판 상에 고정화된 상기 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중합체를 이용하면 DNA 를 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 히드로겔 또는 PEG-히드로겔 공중 합체를 기판 상에 고정화하여 기판 상에서 DNA 를 분리 및 정제하는 경우 별도의 화학물질의 첨가 없이 DNA를 결합 및 용출시키고, PCR 과 같은 후속 공정에 대한 영향을 최소화할 수 있으며, PEG 농도 조절에 따라 결합되는 DNA 의 양 및 결합의 세기를 조절할 수 있으며, 히드로겔 형태의 화합물이 기판 상에 존재하기 때문에 패터닝이 가능하다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Method for isolating and purifying nucleic acids using immobilized hydrogel or PEG-hydrogel co-polymer <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agtgtggatt cggcactcct 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gagttcttct tctaggggac ctg 23

Claims (11)

  1. 기판 상에 작용기 및 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 히드로겔 공중합체를 고정화하는 단계;
    상기 히드로겔 공중합체가 고정된 기판에 염과 핵산이 포함된 시료의 혼합 용액을 첨가하여 상기 핵산을 상기 히드로겔 공중합체에 결합시키는 단계;
    상기 핵산이 결합된 히드로겔 공중합체를 세정하는 단계; 및
    용출 용매를 사용하여 상기 결합된 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 고정화된 폴리에틸렌 글리콜-히드로겔 공중합체를 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법.
  2. 기판 상에 작용기를 갖는 히드로겔을 고정화하는 단계;
    상기 히드로겔이 고정된 기판에 염과 핵산이 포함된 시료의 혼합 용액을 첨가하여 상기 핵산을 상기 히드로겔에 결합시키는 단계;
    상기 핵산이 결합된 히드로겔을 세정하는 단계; 및
    용출 용매를 사용하여 상기 결합된 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 고정 화된 히드로겔을 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 히드로겔의 작용기가 카르복실기인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 히드로겔의 전구체가 하기 화학식 I의 중합체인 것을 특징으로 하는 방법:
    [화학식 I]
    Figure 112004060216991-PAT00002
    (식 중,
    R1 내지 R6는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 히드록시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기, 혹은 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴옥시기를 나타내며, n은 2 내지 100,000의 정수이다).
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 기판은 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 금속판, 폴리스티렌 및 막으로 구성된 군으로부터 선택되는 물에 용해되지 않는 고체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 염은 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 할로겐염이며, 염의 농도는 0.5∼5M 인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 염이 염화나트륨, 염화리튬, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화바륨, 염화마그네슘 및 염화세슘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 LNA 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 용출 용매가 물인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 2,000∼10,000 인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 도입 비율은 카르복실기에 대해 1∼50 몰%인 것을 특징으로 하는 방법.
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