KR20060064068A - 신경세포 보호활성을 갖는 아세틸시코닌을 포함하는퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지치(Lithospermum erythrorhizon Sieb. Et Zucc)로부터 추출 및 분리한 아세틸시코닌(acetylshikonin)에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 신경세포 보호활성기능을 가지고 있어 허혈성 신경계질환을 차단시키는 작용효과가 탁월할 뿐만 아니라 인체에 무해하여, 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환 즉, 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병 및 크로이츠펠트-야콥병 등을 예방 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품으로 사용할 수 있다.

신경세포 보호, 아세틸시코닌, 뇌허혈, 퇴행성 뇌질환, 의약품, 건강기능식품.

Description

신경세포 보호활성을 갖는 아세틸시코닌을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising the acetylshikonin having neuro-protective activity}

도 1은 지치로부터 아세틸시코닌 화합물을 분리 및 정제하는 과정을 설명한 도이며,

도 2a는 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)로 활성화 시킨 BV-2 세포에 아세틸시코닌을 처리했을 때 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성량을 나타낸 그래프이며, 도 2b는 지질다당체로 활성화시킨 1차 마이크로글라이아 세포(microglia)에 아세틸시코닌을 처리했을 때 산화질소의 생성량을 나타낸 그래프이며,

도 3a는 지질다당체로 활성화시킨 1차 마이크로글라이아 세포에 있어서, 아세틸시코닌에 의한 유도성 산화질소 생성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS), 인터류킨-1beta(Interleukin-1beta, IL-1beta), 암세포사멸인자-alpha(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-alpha)의 전사 리보 핵산(messenger RNA, mRNA) 발현억제효과를 역전사중합효소연쇄반응(reverse transcription - polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 확인한 도이고, 도 3b는 지질다당체로 활 성화시킨 1차 마이크로글라이아 세포에 있어서, 아세틸시코닌에 의한 iNOS, IL-1 beta의 발현 억제효과를 나타낸 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)도이며,

도 4는 MCAo 방법을 이용한 흰쥐의 국소뇌허혈 모델에서 본 발명의 아세틸시코닌의 방어효과를 나타낸 도로서, 대조군과 비교한 도이다.

본 발명은 신경세포 보호활성이 있는 아세틸시코닌을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환 등을 예방 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능 식품에 관한 것이다.

신경계는 신경세포와 신경교세포(neurogliocyte)로 구성되어 있으며, 그중 신경교세포는 수적으로 전체 뇌 세포의 90%를 차지하고 있고, 부피로는 뇌 전체의 50%를 차지하고 있다. 중추신경계의 신경교세포는 아스트로사이트(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 그리고 마이크로글라이아(microglia)로 구분되며, 이중 마이크로글라이아 세포는 전체 뇌세포의 5내지 10%를 차지하는 신경계의 염증세포로서 정상상태의 뇌에서의 그 역할은 아직 잘 알려져 있지 않으나 외상, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 등 여러 가지 원인에 의해 뇌 손상이 발생시 활성화되어 대식세포(macrophage)와 유사한 면역작용을 담당한다(Minghetti L, et al., Prog. Neurobio. I. 54(1), pp99-125, 1998). 활성화된 마이크로글라이아 세포는 정상상 태와 달리 포식작용(phagocytosis)이 활발해지고 세포증식을 하며 각종 사이토카인(cytokine), 유도형 산화질소 생성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(cyloocygenase-2, COX-2) 등의 유전자를 발현시켜 각종 염증매개 물질을 생산한다(Dawson VL, et al., J. Neurosci., 13, pp2651-2661, 1993). 이와 같은 경로로 생산된 염증매개 물질이 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중 및 치매 같은 퇴행성 뇌질환이 원인이 된다는 많은 증거가 제시되고 있다(Wood PL, et al., Neurol. Res., 17, pp242-248, 1995).

활성화된 마이크로글라이아 세포로부터 생산된 많은 염증매개물질로 인해 산화질소(nitric oxide, NO)가 생성된다(Feldman PL, et al., Chem. Eng. News., 12, pp26-38, 1993). 이 효소는 신경전달기능, 혈액응고 및 혈압조절 기능 등의 정상적인 생리기능을 위한 산화질소를 생성을 담당하는 일반형 산화질소 생성효소(constitutive NOS, cNOS)와 특별한 상황에서 유도되는 유도형 산화질소 생성효소로 구분된다. 일반형 산화질소 생성효소(cNOS)는 칼슘(Ca++)과 칼모듈린(Calmodulin, CaM)에 의존적이고, 자극에 의해 단시간동안 소량의 산화질소를 생성하는 반면에, 유도형 산화질소 생성효소(iNOS)는 칼슘에 비의존적이며 평소에는 활성화되지 않으나 일단 지질다당체의 자극에 의해 그 발현이 유도되면 장시간 동안 다량의 산화질소를 생성하고, 인터페론-gamma(Interferon-gamma, INF-gamma), 인터루킨-1beta, 암세포사멸인자-alpha 등의 염증성 사이토카인을 생성한다(Mayer B. , et al., FEBS Lett, 288, pp187-191, 1991). 유도형 산화질소 생성효소에 의해 생 성된 과도한 산화질소와 염증성 사이토카인의 생성은 패혈증 환자에게 혈관확장으로 인한 과도한 혈압강하, COX-2의 활성화를 통한 프로스타글란딘(progtaglandins)과 같은 염증매개체의 생합성 촉진으로 인해 염증의 심화 및 신경세포사멸로 인한 뇌질환의 발생 및 심화 등에 관여하게 된다.

현재, 염증을 심화시키고 뇌질환을 유발하는 염증성 사이토카인의 발현을 유의적으로 억제하고 부작용 없이 안전한 뇌신경 보호제의 개발이 요구되고 있으며, 실제로 신경보호관련 의약품시장에 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

본 실험에서 사용한 아세틸시코닌은 전통적으로 한국 및 중국에서 주로 피부염치료에 사용하고 있는 한약재인 지치(Lithospermum erythrorhizon Sieb. Et Zucc)로부터 추출 및 분리한 나프토퀴논(naphtoquinone) 계열의 화합물이다. 지치는 지초(芝草), 자초(紫草), 지혈(芝血), 자근(紫根) 등으로 부르는 여러해살이풀로 뿌리는 아세틸시코닌, 시코닌(shikonin), 알카난(alkannan), 이소부티릴 시코닌(isobutyryl shikonin),베타,베타-디메틸아크릴시코닌(beta,beta-dimethylacrylshikonin), 베타 -하이드로옥시이소발레릴시코닌(beta-hydroxyisovalerylshikonin), 테트라아크릴시코닌(teracrylshikonin)을 함유하며 특히 뿌리의 보랏빛은 아세틸시코닌이라는 성분을 포함하고 있기 때문이다. 시코닌이나 아세틸시코닌에는 부종(浮腫)의 억제작용, 육아증식작용(肉芽增殖作用), 창상치료촉진작용(創傷治療促進作用), 게다가 화상(火傷)이나 궤양(潰瘍)으로 괴사한 조직의 부활작용이 있다. 그리고 모세혈관(毛細血管)을 투과(透過)하는 강한 작용을 지니고 있으며 세균이나 바이러스에 대한 항균작용도 있다. 그밖에 혈액의 순환 을 촉진 시켜주는 작용, 혈당강하작용, 항종양작용 등의 역할도 하는 것으로 알려져 있다(정보섭, 신민교, 향약대사전, 1998, pp891-892). 그러나 아직까지 아세틸시코닌이 염증성 사이토카인의 억제 및 신경세포사멸 보호로 인한 뇌질환의 치료효과에 관하여는 연구 된 바가 없다.

이에 본 발명에서는 여러 생화학적인 실험을 통해 아세틸시코닌의 염증성 사이토카인에 대한 영향을 알아보고, 이로 인한 산화질소와 염증성 사이토카인의 차단을 분자생물학적인 실험을 통하여 실시하였고, 국소 뇌허혈을 유발한 동물실험을 통하여 아세틸시코닌의 뇌허혈성 신경세포사의 보호기전을 확인하였다.

연구 결과, 본 발명에 따른 아세틸시코닌은 시험관시험에서 마이크로글라이어의 유도형 산화질소 생성효소를 비롯한 여러 염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로서 산화질소의 과도한 생성을 차단하고, 중대뇌동맥 폐쇄법을 이용하여 흰쥐에게 국소 뇌허혈을 유발한 실험에서 뇌허혈로 인한 신경세포사멸에 대한 보호 작용의 생리활성 메카니즘을 규명하였으며, 결과적으로 허혈성 뇌질환에 대한 치료효과와 치료기전을 약리학적으로 관찰하여 아세틸시코닌이 신경보호 활성 및 신경세포사멸 억제기능을 갖는다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 지치로부터 분리된 신경세포 보호활성을 갖는 아세틸시코닌 화합물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학조성물 또는 건강기능 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 아세틸시코닌 화합물을 유효성분으로 포함하여 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하며, 신경세포사에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환으로는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병 및 크로이츠펠트-야콥병이 포함될 수 있다.

상세하게는, 본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 아세틸시코닌 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 아세틸시코닌은 지치 뿌리의 분말 시료 중량의 약 1 내지 10배 부피의, 바람직하게는 약 1내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름 등과 같은 비극성 용매를 가하여 상온에서 약 7일 내지 20일, 바람직하게는 약 7일 내지 10일 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 냉침 추출법으로 수회 반복하여 추출한 후 여과하고 여과한 추출물을 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 30 내지 70 ℃에서 진공농축한 후 얻어지는 비극성 용매 가용추출물을 얻은 후, 이를 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 헥산과 에틸아세테이트 혼합용매(Hexane : EtOAc = 30:1→→1:11)와 에틸아세테이트와 메탄올 혼 합용매(EtOAc : MeOH = 25:1→→1:2)를 단계적으로 극성을 높여가는 용출용매 시스템으로 용출시키는 과정을 수회 반복함으로서 본 발명의 아세틸시코닌 화합물을 정제 및 분리할 수 있다.

본 발명의 상기 제법으로부터 얻어진 아세틸시코닌 화합물은 시험관내 실험(in vitro)에서 중대뇌동맥 폐쇄로 유발한 실험동물의 국소 뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대하여 신경세포를 보호하여, 뇌허혈에 의한 신경세포 손상을 현저히 예방 및 치료할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로부터 수득된 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학조성물을 제공한다.

또한, 상기 화합물의 각 성분은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

상기 본 발명의 화합물을 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.001 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 아세틸시코닌을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 복합생약제 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로 골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 기타 식품의 주, 부원료 및 식품첨가제로서 사용이 가능하다.

또한, 본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 상기 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량 %로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 식품에는 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합 하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지치 뿌리 분말 시료의 추출 및 제조

한국에서 재배한 지치 뿌리 시료는 2003년 서울에 제기동에 위치한 한국생약협회 상설매장에서 구입한 후 경희대학교 동서의학대학원 한약리학교실의 검증을 받았다. 상기의 건조된 지치 뿌리 시료는 분쇄하여 사용하였다. 지치 뿌리의 분말 시료 3 kg에 헥산 12 ℓ를 넣고 10일 동안 상온에 방치하여 추출하였다. 총 4회까지 동일한 방법으로 추출하여 매 추출마다 여과한 후 여과액을 40 ℃이하에서 진공 농축하였으며, 5회, 6회 추출은 각각 남아있는 시료 잔사에 용매 6 ℓ 정도만 추가하여 넣고 상온 진탕 추출한 후 여과하여 진공 농축하여 헥산 가용액 26 g을 수득하였다.

실시예 2. 아세틸시코닌의 분리 및 정제

상기에서 얻은 총 6회에 거쳐 농축한 헥산 가용액(26 g)은 l.6 kg의 실리카겔이 충진 된 직경 (5 X 40 cm)의 오픈 실리카겔 칼럼에서 칼럼크로마토그래피법을 실시하였다(도 1참조). 용출용매로는 헥산과 에틸아세테이트 혼합용매 (Hexane : EtOAc = 30:1→→1:11)와 에틸아세테이트와 메탄올 혼합용매 (EtOAc : MeOH = 25:1→→1:2)를 단계적으로 극성을 높여가며 순차적으로 사용하였다. 혼합용매는 각 조성별로 10 ℓ에서 4 ℓ 정도씩 혼합용매 조성에 따라 사용을 조금씩 달리하면서 용출시켰으며, 500 ㎖ 단위로 분취하여 총 421개 분획을 분취하였다. 각 분취 분획은 UV 검출기 520 nm의 파장에서 HPLC 정성 분석으로 동일성을 확인한 후 유사한 패턴의 분획들은 서로 합쳐 재농축하여 최종 농축 분획 30개(Fr. 1 ∼ 30)를 얻었다. 분취한 분획들의 동일성 확인을 위한 정성평가는 HPLC 분석으로 UV 검출기 539 nm의 파장에서 실시하였는데, 이들 30개의 최종 분획 중 Fr. 6, 7 분획으로부터 하기 화학식 및 물성치를 가진 아세틸시코닌(1.1 g)을 분리 및 정제할 수 있었고, 이 화합물의 NMR 분석 데이터는 문헌치에 기재된 데이터와 일치함을 확인 하였다(S. Y. Hwang, et al., Kor. J. Pharmacogn. 31(3) pp295-299, 2000, H. W. Cheng, et al., Int. J. Pharm. 120 pp137-144, 1995).

칼럼크로마토그래피 실시로 분취한 분획들의 동일성 확인을 위한 정성평가는 HPLC 분석으로 UV 검출기 539 nm의 파장에서 실시하였는데, HPLC system은 TSP사의 P4000 pump와 AS1000 autosampler가 사용되었고 UV 검출기는 TSP사의 Spectra focus UV 검출기를 사용하였다. HPLC 컬럼은 YMC사 (Japan)의 YMC-Pack ODS-AM (150 X 4.6 mm, 4 ㎛) 역상칼럼을 사용하였으며 이동상 용매는 모두 HPLC급 용매를 사용하였다.

실험예 1. 아세틸시코닌의 NO 생성억제 효과

1-1. LPS로 활성화 시킨 BV-2세포와 마이크로글라이아 세포에서 아세틸시코닌의 NO 생성억제 작용

아세틸시코닌이 뇌에 존재하는 대식세포인 마이크로글라이아 세포의 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 지질다당체로 활성화시킨 뇌신경교세포 세포주인 BV-2와 1차 마이크로글라이아 세포에서 산화질소의 생성량을 측정하였다(Min Kim J, et al., Neuroreport, 14(15), pp1941-1944, 2003).

BV-2세포 (고려대학교, 최의주박사 연구실)는 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL, 영국) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicilline-streptomycine; Gibco-BRL, 영국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium; Gibco-BRL, 영국) 배지에서 유지하였고, 1차 마이크로글라이아 세포의 경우 생후 1일 이내의 스프라그-도올리 래트(Sprague-Dawley rat, 타코닉, 일본)의 뇌를 적출한 후, 뇌조직 세포를 75T 플라스크에서 BV-2 세포와 같은 DMEM 배지를 사용하여 약 2주간 세포 배양하고 1차 마이크로글라이아 세포만을 취하였다. BV-2 세포 및 1차 마이크로글라이아 세포는 96웰 플레이트에 4 X 10⁴ 세포/웰의 농도로 분주하고 37 ℃, 5% 이산화탄소 조건의 세포배양기에서 하룻밤동안 배양하였다. 본 발명의 아세틸시코닌의 각 0.1, 0.5, 1 uM농도를 DMSO (dimetyl sulfoxide, sigma, 미국)에 최종 처리 농도가 0.1% 이하가 되도록 BV-2 세포와 1차 마이크로글라이아 세포에 처리하고, 지질다당체 100 ng/ml을 동시에 처리하여 활성화시켰다. 또한, 실험의 양성대조군으로 NOS 억제제인 N^GMMA (N super(G)-monomethyl-L-arginine, sigma, 미국)를 0.5mM 농도를 지질다당체 100ng/ml과 처리하였다. BV-2 세포와 1차 마이크로글라이아 세포는 24시간 후에, 배양액 50㎕를 취하여 그리고 반응용액(Griess reagent) 50㎕과 섞어 주었고, 10분간 실온에 방치한 후 엘라이저리더(Elyzerleader, Moleulat Device, 미국)로 570㎚의 흡광도에서 측정하고 소디움 나이트라이트(sodium nitirte)를 표준으로 삼아 농도를 계산하였다.

실험결과, 도 2a 및 2b에서처럼 산화질소의 생성저해 효과는 BV-2 세포와 1차 마이크로글라이아 세포에서 각 아세틸시코닌 1 uM 처리군이 각각 양성대조군과 동일한 억제 효과를 보였다.

실험예 2. 아세틸시코닌의 iNOS 발현억제 효과

2-1. 아세틸시코닌에 의한 iNOS의 mRNA 발현 억제 작용

아세틸시코닌으로 인한 유도형 산화질소 생성효소의 전사 리보 핵산 발현 억제 작용을 알아보기 위해 역전사중합효소연쇄반응을 실시하였다.

10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지에 1차 마이크로글라이아 세포를 6웰 플레이트에 4 X 10⁶셀/웰의 농도로 분주한 후 24시간 배양하고 100 ng/㎖ 농도의 지질다당체와 각 0.1, 1 uM 의 아세틸시코닌을 동시 처리한 후 24시간 동안 활성화시켰으며, 이때 지질다당체 무처리군을 대조군으로 하였다. 24 시간 활성화 후 배양액을 제거하고 차가운 PBS(Phosphate Base Solution)으로 세척하였고, 이를 트립신 처리한 후 PBS 1 ㎖로 세포를 취하였으며 2분 동안 12000 rpm으로 원심 분리하여 세포만을 취하였다. 취한 세포에서 RNA를 취하기 위하여 RNA 분리용액 (easyblue)을 넣어 15분 동안 12000 rpm 으로 원심 분리하여 클로로포름(Chloroform)을 가한 후 다시 25분간 13,000rpm에서 원심분리하여 상층액만 취하여 아이소프로파놀(isopropanol)로 세척한 다음 RNA를 분리해 내었다. 각각 5 ug의 RNA와 5 pmol의 프라이머(primer)를 45 ℃에서 cDNA로 합성한 후 95 ℃에서 5분간 변성시키고 94 ℃에서 50초, 50 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 PCR 싸이클을 32회 진행한 후, 72 ℃에서 5분간 반응시켰다. 생성물을 이티디움브로마이드(etidium bromide)로 착색한 1.5% 아가로스 젤(agarose gel)을 이용하여 전기 영동시킨 후 확인하였다.

실험결과, 도 3a에서와 같이 아세틸시코닌이 1차 마이크로글라이아 세포에서 iNOS, IL-1beta, TNF-alpha의 mRNA 발현을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 농도에 의존적인 경향을 보여줌을 확인할 수 있었다.

2-2. 아세틸시코닌의 iNOS 발현 억제 작용

아세틸시코닌의 유도형 산화질소 생성효소에 대한 발현 억제 작용을 알아보기 위해 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다.

10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지에 1차 마이크로글 라이아 세포를 6웰 플레이트에 4 X 10⁶셀/웰의 농도로 분주한 후, 24시간 배양하고 100 ng/㎖ 농도의 지질다당체와 각 0.1, 1 uM의 아세틸시코닌을 동시 처리한 후 24시간 동안 활성화시켰으며, 이때 지질다당체 무처리군을 대조군으로 하였다. 24시간 활성화 후 배양액을 제거하고 차가운 PBS으로 세척하였고, 이를 트립신 처리한 후 PBS 1 ㎖로 세포를 취하였으며 2분 동안 12000 rpm으로 원심 분리하여 세포만을 취하였다. 취한 세포를 50 ㎕ 세포막 용해용액(triple lysis buffer)을 넣어 세포내 존재하는 모든 세포막을 분해한 후 30분 동안 12000 rpm 으로 원심 분리하여 단백질 부분인 상층액 만을 취하였으며, 이를 적정 농도로 희석한 후 브래드포드(Bradford)방법을 통해 단백질 정량을 하였다. 정량 후 같은 양의 단백질을 8 % 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 실시하였고, 전기영동 후 분리된 단백질을 하이본드 ECL 나이트로셀룰로즈 막(Hybond ECL nitrocellulose membrane)으로 이동(transfer)한 후 iNOS, IL-1beta 1차 항체와 2차 항체를 반응시킨 후 ECL 검사를 하였다.

실험결과, 도 3b에서와 같이 아세틸시코닌이 1차 마이크로글라이아 세포에서 iNOS, IL-1beta의 염증성 사이토카인의 발현을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 농도에 의존적인 경향을 보여줌을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 중대뇌동맥 폐쇄법을 이용한 흰쥐의 국소뇌허혈 모델에서 아세틸시코닌의 방어 효과

3-1. 실험동물의 준비

실험동물로 280 - 300 g, 8주령의 스프래그 도울리계(sprague dowly) 수컷 흰쥐를 한국 샘타고사에서 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 실험환경에 적응시킨 다음 실험에 착수하였다.

3-2. 중대뇌동맥 폐쇄법으로 유발한 흰쥐의 국소뇌허혈 모델에서 아세틸시코닌의 방어 효과

중대뇌동맥 폐쇄법를 유발하기 위해 지 롱가(Zea longa, et al., Stroke, 20, pp84-91, 1989)의 방법을 응용한 혈관 내 봉합사 삽입법(intraluminal suture method)을 사용하였다.

흰쥐의 중대뇌동맥을 폐쇄하면 일정 시간이 지난 후 중대뇌동맥 지배영역에 혈류의 부족으로 인하여 산소와 에너지원이 고갈되어 세포가 죽게 된다. 특히 지배영역 중심부인 선조체와 측두엽부위는 조직 괴사현상이 일어나며 이를 허혈성 중심부(ischemic core)라고 한다. 그리고 그 주위에 중대뇌동맥 지배영역이 아니지만 지배영역과 연접한 부위에 세포가 스스로 사멸하는 현상이 일어나면 이를 허혈성 주변부(ischemic penumbra)라고 한다. 중대뇌동맥을 폐쇄한 후 3시간이 지나면서 괴사가 시작되고 6시간이 지나면서 좀 더 심해져 뇌경색이 생긴다. 120분 유발하고 24시간이 되면 뇌경색이 일단 마무리되고 3일째부터 최대에 이르게 된다. 뇌경색의 양을 측정할 때는 뇌경색으로 인한 뇌부종으로 인하여 교정된 뇌경색 양 (correlated infarct volume, mm³)으로 측정한다. 이는 뇌경색 반대 반구(contralateral hemisphere)에서 뇌경색 양(infarct volume, mm³)을 뺀 것이 일반적으로 쓰이는 뇌경색 양이다.

먼저, 25 ㎜의 4-0 나이론 봉합사의 끝 부분에서 약 5-8 ㎜길이를 실리콘으로 코팅하되 지름이 0.30 ㎜가 되게 제작하여 실험에 사용하였다. 흰쥐를 70 % N₂O와 30 % O₂가 섞인 혼합가스에 5 %의 이소플루렌(isoflurane)으로 전신마취를 한 후 한 쪽은 채혈을 위한 주사기를, 다른 한쪽은 혈압측정용 프로브(probe)를 삽입하여 혈압을 관찰하였으며, 채혈을 한 후 혈당 및 혈액가스를 분석하여 관찰하였다. 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 조심스럽게 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인 익돌근구개동맥을 전기소작하고 외경동맥을 자르고 프로브를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 18∼20 ㎜정도 삽입한 후 실로 고정하였다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연 회복시켰다. 유발 직후 및 120분에 본 발명의 화합물을 경구 투여하였다. 이 때 약물의 용량에 따른 효능을 알아보기 위하여 시료를 100, 300 mg/kg으로 각각 흰쥐 체중 100 g당 0.3 ㎖씩의 부피로 3차 증류수로 희석하여 경구 투여하였으며, 모든 실험군은 당일에 같은 마리수를 유발하였으며 수술은 체온이 37 ± 0.5 ℃가 되게 유지하면서 관찰하였다. 수술 후 120분 후 상기와 같은 방법으로 재 마 취하여 프로브를 후퇴시켜 재관류시켰다. 재관류 후 22시간 뒤에 경추탈골시켜 2분 이내에 뇌를 적출하여 2 ㎜ 두께로 7개의 절편을 얻었다. 2 % TTC(triphenyltetrazolium chloride)가 들어 있는 16 웰 플레이트(well plate)에 조직을 충분히 담그고 37 ℃에서 30분 동안 방치한 후 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehide)로 고정시켜 조직을 관찰하였다. 모든 수술과정은 수술현미경하에서 시행하였으며, 2 %로 계속 유지하면서 수술현미경하에서 시행하였다. 체온이 37 ℃이하로 떨어지지 않도록 램프를 쬐어주었다. 조직은 디지털 카메라로 하나씩 촬영한 후 컴퓨터로 옮겼고, 이미지 분석프로그램인 옵티마스(Optimas) 6.5(Bioscan)를 이용하여 뇌허혈 유발로 인해 손상된 조직의 부피(%) 및 뇌경색의 비율(%)을 하기 수학식 1 및 수학식 2로 계산하였다.

교정된 뇌경색의 부피(%)

= (정상 좌반구의 부피)- (손상 반구의 정상 부위 부피)

뇌경색 비율(%)

= ((정상 좌반구의 부피(mm³) - 교정된 뇌경색의 부피(mm³))/ 정상 좌반구의

부피 mm³))X 100

상기 실험의 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 재관류 22시간 후 본 발명의 화합물 투여 시 1 mg/kg 에서 46.88 %, 3 mg/kg에서 68.75 %의 대조군과 비교하여 뇌조직 손상의 보호효과를 보였다.

상기 통계처리의 경우에는, 각 군에 대한 자료값은 대조군과 각 시료군을 비교하여 원-웨이 아노바 방법(Prism4, GraphicPad software)으로 분석하였다(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001).

본 발명의 화합물은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

실험예 4. 급성독성 실험

4-1. 경구투여

ICR계 마우스와 스프라그 도올리 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 화합물을 각각 100, 250, 500 및 1000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

4-2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25 ± 5 g)와 스프라그 도올리 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 화합물을 각각 25, 50, 100 및 200 ㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

실험 결과, 본 발명의 화합물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

아세틸시코닌 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

아세틸시코닌 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

아세틸시코닌 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

아세틸시코닌 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

아세틸시코닌 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

아세틸시코닌 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B₁ 0.25 g

비타민 B₂ 0.3g

물 적량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 아세틸시코닌은 뇌허혈로 인해 발생되는 신경세포사멸에 대한 보호 작용 및 저해 효과가 탁월할 뿐만 아니라 인체에 무해하여 신경세포의 괴사에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환을 예방 및 치료하기 위한 용도로 사용가능하다.

Claims (4)

1. 신경세포 보호활성을 갖는 아세틸시코닌 화합물을 유효성분으로 포함하여 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병 또는 크로이츠펠트-야콥병인 것인 약학조성물.
3. 신경세포 보호활성을 갖는 아세틸시코닌 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품.
4. 제 3항에 있어서, 정제, 환제, 캡슐제 또는 액제인 건강기능식품.

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