KR20060057291A

KR20060057291A - 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계화합물을 유효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20060057291A
Application number: KR1020040096391A
Authority: KR
Inventors: 허태련; 최수임
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2004-11-23
Filing date: 2004-11-23
Publication date: 2006-05-26
Also published as: KR100589050B1

Abstract

본 발명은 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 황기 추출물은 히알루로니데이즈의 활성을 저해하고, 관절을 보호하며, 또한 황기로부터 분리한 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 관절조직의 기질 성분의 분해를 일으키는 인터루킨-1 베타의 활성을 저해하여 관절을 보호함으로써, 관절염의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising Astragali Radix extract and isoflavonoid compound isolated from the same as an effective component for preventing and treating arthritis}

도 1은 본 발명에 따른 황기로부터 이소플라보노이드계 화합물을 추출·분리·정제하는 과정을 나타낸 도식도이다.

도 2는 본 발명의 황기 추출물의 연골세포 아그리칸 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 황기 추출물의 히알루로니데이즈로 처리된 관절 연골조직으로부터 글리코사미노글리칸의 분해 저해 효과를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 황기 추출물로부터 분리한 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드의 인터루킨-1 베타로 처리된 관절 연골조직의 글리코사미노글리칸의 분해 저해 효과를 나타낸 도이다.

관절염은 연골 관련 질환의 대표적인 것으로, 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 퇴행성 관절염(degenerative arthritis)으로 대별되며, 교통사고나 과도한 운동으로 무릎관절 연골이 손상된 경우도 흔히 발견된다. 현재, 우리나라에서 100만명 정도의 관절염 환자가 있으며, 여성이 남성보다 배이상 많고 그 중에서도 특히 갱년기 여성에게서 많이 볼 수 있는 질환이다.

류마티스 관절염은 자가면역 질환의 일종으로, 30~50세의 여성에게 1:4의 비율로 많이 나타나며, 증상은 손가락, 팔꿈치, 무릎 등의 관절이 좌우대칭적으로 염증을 일으켜 부어서 아프고 굳어지며, 특히 새벽에 심하며 몸이 쇠약해지고 미열도 난다. 급성관절 류마티스의 관절증세는 몇 일에서 몇 주 이내에 없어지는데 반하여, 류마티스 관절염은 몇 달 몇 년 동안이나 계속되다가, 관절의 변형과 탈구, 근(筋)·건(腱)의 구축(拘縮) 및 강직(强直)을 일으켜 심한 불구가 되기도 한다.

퇴행성 관절염은 관절 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로서, 골관절염(osteoarthritis) 또는 골관절증 이라고도 한다. 골관절염은 노령화와 밀접한 연관을 갖는 대표적인 퇴행성 질환으로, 전 인구의 10~15% 정도가 앓고 있으며, 특히 65세 이상의 고령인구 중 60~80% 정도가 골관절염을 앓고 있다.

퇴행성 관절염의 원인은 노쇠 현상이나 과다한 체중과 관계가 깊으며, 나이 가 많아질수록 여성에게서 더 많이 그리고 더 심하게 나타난다. 초기 증상은 한개 또는 두개의 관절이 강직과 함께 쑤시는 듯한 동통이 나타나며, 장기화 되면 관절의 변형 등을 초래하게 된다.

관절연골의 퇴행성 변화의 원인은 아직 규명되어 있지는 않지만, 연골세포 수의 절대적 감소와 연골세포(chondrocytes)에서 일어나는 연골기질 합성과 분해의 불균형이 하나의 원인으로 알려져 있다. 따라서, 관절연골의 퇴행성 변화는 연골기질의 분해로 인하여 연골 강도와 쿠션으로서의 능력이 감소된다.

연골의 구성성분은 콜라겐 등의 단백질과 함께 당단백질인 프로테오글리칸이 함유되어 있다. 프로테오글리칸(proteoglycan)은 히알루론산과 콘드로이틴유산, 케라틴유산, 헤파린, 헤파린유산 등의 글리코사미노글리칸의 집합체이며 이들의 주요 구성성분은 글루코사민으로 그 대사경로가 계속 밝혀지고 있다.

히알루론산(hyaluronic acid)은 생체 내 연골조직에 많이 함유되어 있는 물질로, 연골조직의 탄력성을 높이는데 큰 역할을 하며, 수분 함유량이 높고, 뛰어난 점탄성(viscoelasticity)을 지니고 있다. 일반적으로 골관절염 환자에게서 히알루론산의 분해 촉진이 관찰되고 있다. 또한 콜라게나제(collagenase)와 히알루로니데이즈(hyaluronidase) 등이 관절연골세포의 세포사를 증가시키고, 연골세포의 대사작용을 감소시켜 연골조직의 퇴행성 변화를 촉진한다는 연구보고가 있다. 따라서, 히알루론산의 분해효소인 히알루로니데이즈를 저해하면 골관절염의 치료효과 가능성이 있을 것으로 생각된다.

현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성 관절염의 치료는 약물치료제(진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등)나 연골보호제(히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등)를 이용하거나 수술적 처치(관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절 부분 치환술, 슬관절 전치환술 등)에 의한다. 그러나 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며, 연골보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다. 또한 스테로이드성 제제는 장기간 복용 시 칼슘의 손실로 골다공증, 고혈압, 당뇨병 등을 초래할 수 있는 부작용이 있다. 따라서 약물치료는 대부분의 경우 통증을 감소시키는 목적으로만 사용되고 있고, 영구적인 인공관절 치환술이 주를 이루고 있지만 근본적인 치료효과를 주는 약물이나 수술법은 현재까지 없는 실정이다.

최근 들어 한방 치료제 및 영양보조제를 통한 관절염 치료제가 개발되고 있지만 그 치료효과와 작용기전에 관해서는 밝혀져 있지 않다. 따라서 이들 관절염 질환은 기존의 단순 대증요법제인 소염 진통제만으로는 그 질환을 효과적으로 조절하기가 어려울 뿐만 아니라 약물의 장기간 복용에 따른 부작용으로 인하여 현실적으로 환자의 대부분인 노년층에게는 치료에 많은 어려움을 초래하고 있다.

따라서, 관절염의 치료를 위해서는 약제를 장기간 복용할 필요가 있기 때문에, 부작용이 적은 약제의 개발이 요구되고 있다.

한편, 황기(黃耆, Astragalus membranaceus (Fisch) Bunge.)는 두과(豆科)에 속한 다년생 초본 식물로서 주근(主根)은 깊고 길며 막대기 모양이고 약간 목질을 띤다. 줄기는 직립하고 상부에서 많이 분지되며 매끄럽고 광택이 있거나 약간의 털 로 덮여 있다. 황기의 주요 성분은 폴리사카라이드(polysaccharide)와 사포닌(saponin)이며 그 외에 수크로즈(sucrose), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 칼리코신(calycosin), 포르모네틴(formonetin), 베타-아미노부티릭산(β-aminobutyric acid) 등이 함유되어 있다. 또한 황기의 생리활성으로는 세포성 및 체액성 면역 증강효과, 항산화 효과, 항노화 효과, 항염작용, 강장작용, 이뇨작용, 혈압강하작용 등이 보고된 바 있다. 황기는 오래전부터 인체를 보하는 약재로서 한방에서는 황기건중탕(黃耆建中湯), 십전대보탕(十全大補湯), 황기계지오물탕(黃耆桂枝五物湯), 방기황기탕(防己黃耆湯) 등의 많은 한방 처방에서 황기를 인삼 다음의 보기약(補氣藥)으로서 사용해오던 재료로 인체에 대한 안정성이 이미 확인되어있다.

이에 본 발명자들은 생약 추출물 중에서 히알루로니데이즈를 저해하는 물질에 대해 탐색하던 중, 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물이 히알루로니데이즈의 활성을 저해하여 관절을 보호하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물을 유 효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 관절염 예방 및 치료에 유용한 약학 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물의 추출, 분리 및 정제 방법은 다음과 같다.

건조한 황기 뿌리를 세절 한 후, 95% 에탄올로 24시간씩 5회 반복하여 교반 추출한 다음 여과지에 여과한 후 여액을 감압농축하여 에탄올 추출물을 얻는다.

상기 에탄올 추출물을 증류수로 현탁하고 n-헥산에 용해시켜 가용성 분획과 불용성 분획을 얻는다. 상기 n-헥산 불용성 분획을, 클로로포름에 용해시켜 가용성 분획과 불용성 분획을 얻는다. 상기 클로로포름 불용성 분획을, 에틸아세테이트에 용해시켜 가용성 분획과 불용성 분획을 얻는다. 상기 에틸아세테이트 불용성 분획을, n-부탄올에 용해시켜 가용성 분획을 얻는다.

각각의 분획에 대하여 히알루로니데이즈 활성을 측정한 결과, n-부탄올 가용성 분획에서 히알루로니데이즈 활성 저해가 가장 우수함을 확인하고, 상기 n-부탄올 가용성 분획을 감압하에서 농축 및 건조시킨다.

상기에서 얻은 농축된 황기 n-부탄올 가용성 분획을 에틸아세테이트와 메탄올의 혼합물을 이동상으로 하여 비율(에틸아세테이트 : 메탄올 = 8:2, 6:4, 4:6, 2:8 및 0:1, 각각 800㎖)을 변화시켜가며 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 6개의 분획(AB-1 ~ AB-6)으로 분리하고, 활성분획(AB-4)을 얻는다. 용매 유속은 2.5 ㎖/min으로 한다.

상기 활성분획(AB-4)을 물과 메탄올의 혼합물을 이동상으로 하여 비율(물 : 메탄올 = 10:1, 5:1, 1:1 및 0:1, 각각 240㎖)을 변화시켜가며 C₁₈ 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 4개의 분획(AB-4-1 ~ AB-4-4)으로 분리하고, 활성분획(AB-4-3)을 얻는다.

상기 활성분획(AB-4-3)을 85% 메탄올로 평형화된 컬럼에 주입한 후 85% 메탄올을 이동상으로 하여 3㎖/min의 유속으로 용출하여, 분취 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 5개의 분획(AB-4-3-1 ~ AB-4-3-5)으로 분리하고, 활성분획(AB-4-3-4)을 얻는다.

상기 활성분획(AB-4-3-4)을 분석 크로마토그래피 HPLC, Hypersil ODS 컬럼, UV 검출기(254 ㎚)를 사용하여 정제하여 이소플라보노이드계 화합물인 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드를 얻는다. 용매 유속은 0.5 ㎖/min으로 한다.

상기 이소플라보노이드계 화합물인 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.

또한, 상기 이소플라보노이드계 화합물인 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 통상적인 모든 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 시약을 사용할 수 있다.

본 발명의 황기 추출물의 활성분획인 n-부탄올 가용성 분획으로 처리한 군은 연골세포 아그리칸 발현에서 히알루로니데이즈 단독 처리군보다 현저히 발현되고, 히알루로니데이즈 처리 후 관절조직으로부터 분해되는 글리코사미노글리칸의 양을 현저히 감소시킨다.

또한, 본 발명의 황기 추출물로부터 분리한 활성성분인 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 인터루킨-1 베타를 처리한 관절조직으로부터 글리코사미노글리칸의 분해를 저해한다.

따라서, 본 발명의 황기 추출물이 히알루로니데이즈의 활성을 저해하고, 관절을 보호하며, 또한 황기로부터 분리한 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 관절조직의 기질 성분의 분해를 일으키는 인터루킨-1 베타의 활성을 저해하여 관절을 보호함으로써, 관절염의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡 슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 경구투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 1~100㎎/㎏의 양을 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 관절염의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 관절염에 기인하는 질환의 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때 첨가하는 양은 건강식품 조성물일 경우 전체 식품 중량의 1~15 중량%, 바람직하게는 10 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물일 경우 100 ㎖를 기준으로 1~3 g, 바람직하게는 2 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 2~5g, 바람직하게는 약 4 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 1~10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 황기 추출물의 제조

건조한 황기 뿌리 15㎏을 세절 한 후, 95% 에탄올 18ℓ로 24시간씩 5회 반복하여 교반 추출한 다음 여과지에 여과한 후 여액을 감압농축하여 에탄올 추출물을 얻었다.

상기 에탄올 추출물을 증류수로 현탁하고 n-헥산에 용해시켜 가용성 분획과 불용성 분획을 얻었다. 상기 n-헥산 불용성 분획을, 클로로포름에 용해시켜 가용성 분획과 불용성 분획을 얻었다. 상기 클로로포름 불용성 분획을, 에틸아세테이트에 용해시켜 가용성 분획과 불용성 분획을 얻었다. 상기 에틸아세테이트 불용성 분획을, n-부탄올에 용해시켜 가용성 분획을 얻었다.

각각의 분획에 대하여 TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용하여 활성물질의 수를 확인하고, 히알루로니데이즈 활성을 측정한 결과, n-부탄올 가용성 분획에서 히알루로니데이즈 활성 저해가 가장 우수함을 확인하고, 상기 n-부탄올 가용성 분획을 감압하에서 농축, 건조시켰다(19.5g).

실시예 2 : 황기 추출물로부터 활성물질의 분리 및 정제

1. 활성물질의 분리 및 정제

상기 실시예 1에서 얻은 농축된 황기 n-부탄올 가용성 분획을 에틸아세테이트와 메탄올의 혼합물을 이동상으로 하여 비율(에틸아세테이트 : 메탄올 = 8:2, 6:4, 4:6, 2:8 및 0:1, 각각 800㎖)을 변화시켜가며 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, Merck Co., Darmstadt, Germany, 컬럼 크기 : Φ30×600 ㎜, I.D)를 사용하여 6개의 분획(AB-1 ~ AB-6)으로 분리하고, 활성분획(AB-4)을 얻었다. 용매 유속은 2.5 ㎖/min으로 하였다.

상기 활성분획(AB-4)을 물과 메탄올의 혼합물을 이동상으로 하여 비율(물 : 메탄올 = 10:1, 5:1, 1:1 및 0:1, 각각 240㎖)을 변화시켜가며 C₁₈ 컬럼 크로마토그 래피(Alltech Co., Deerfield, USA, 35-75 μ, 컬럼 크기 : Φ15×300 ㎜, I.D)를 사용하여 4개의 분획(AB-4-1 ~ AB-4-4)으로 분리하고, 활성분획(AB-4-3)을 얻었다.

상기 활성분획(AB-4-3)을 85% 메탄올로 평형화된 컬럼에 주입한 후 85% 메탄올을 이동상으로 하여 3㎖/min의 유속으로 용출하여, 분취 컬럼 크로마토그래피(preparative column chromatography, JAIGEL GS 310 column 5 μm, 컬럼 크기 : Φ 20×500 ㎜ I.D)[HPLC JAI LC-908 (JAI Co., Tokyo, Japan); 인라인 탈기장치(in-line degassor) CASTORR-152 Double plunger type L-7100 펌프, UV 검출기, RI 검출기와 밀레니움 32 소프트웨어 사용]를 이용하여 5개의 분획(AB-4-3-1 ~ AB-4-3-5)으로 분리하고, 활성분획(AB-4-3-4)을 얻었다.

상기 활성분획(AB-4-3-4)을 분석 크로마토그래피 HPLC(Younglin Co., Seoul, Korea), Hypersil ODS 컬럼(역상 타입 5 μm, 4.6×250 mm I.D, Thermo Co., San Jose, USA), UV 검출기(254 ㎚)를 사용하여 정제하였다(25㎎, 0.13%(w/w)). 용매 유속은 0.5 ㎖/min으로 하였다.

2. 활성물질의 구조 분석

상기 분리한 활성물질은, 질량 분석기 [LC-MS/MS(HP-1100 High performance Liquid Chromatographyand a QUATTRO LC Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometer, Waters Ltd., Massachusetts, USA), 컬럼은 Capcell-Pak C18 UG 120 (5μ, 4.6×250 ㎜), 유속은 1㎖/min, 주입부피 : 20㎕, ESI posivive ion mode]를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한 핵자기공명(NMR) 분석(Bruker AMX 400)을 통하여 ¹H NMR 스펙트럼을 얻고, 분자구조를 결정하였다.

측정 결과는 하기와 같으며, 황기로부터 분리한 활성물질은 이소플라보노이드계 화합물인 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드(Calycosin-7-O-β-D-glycopyranoside)로 동정하였다.

1) 물성 : 흰색 분말

2) 분자량 : 446.3

3) 분자식 : C₂₂H₂₂O₁₀

4) ¹H NMR (400 ㎒, CD₃OD) δppm : 3.25~3.73(6H), 3.91(3H, s, OMe), 5.14(1H, anomeric), 6.97(2H, H-5', H-6'), 7.01(1H,H-2'), 7.19(1H, H-6), 7.52(1H, H-8), 8.13(1H, H-5), 8.23 (1H, H-2)

5) LC-MS/MS(rel. int.) m/z [M+H]⁺ = 447.3

실험예 1 : 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물의 히알루로니데이즈 활성 저해도 측정

본 발명의 황기 추출물 및 그로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물의 히알루로니데이즈의 활성 저해도를 알아보기 위하여, Morgan-Elson Assay 법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

인산완충용액에 녹인 히알루론산과 5% DMSO에 녹인 황기 n-부탄올 가용성 분획 및 그로부터 분리한 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드를 각각 넣고 37℃에서 20분간 배양하였다. 배양한 후에 CaCl₂ 용액을 넣고 2차 배양하였다. 히알루론산을 넣고 3차 배양 한 후 K₃BO₃를 넣고 열탕에서 가열하여 반응을 중지시켰다. 원심분리 후, 히알루론산이 히알루로니데이즈에 의해서 분해되어 생성되는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)을 DMAB(p-dimetylaminobenzaldehyde)를 이용하여 585㎚에서 비색정량하여 활성을 검증하였다.

결과는 표 1에 나타내었다.

	활성 저해도(%)
에탄올 추출물	67.2±0.1
n-헥산 가용성 분획	3.5±0.1
클로로포름 가용성 분획	6.4±0.1
에틸아세테이트 가용성 분획	52.5±0.6
n-부탄올 가용성 분획	68.4±0.6
칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드	70.0±0.8

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 황기 추출 분획중 n-부탄올 가용성 분획과 그로부터 분리한 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드가 히알루로니데이즈의 활성을 현저히 저해함을 알 수 있다.

실험예 2 : 황기 추출물이 관절연골세포(C28/I2 cell) 증식 및 세포외기질 합성에 미치는 영향

본 발명의 황기 추출물의 Human costal 연골세포에 대한 히알루로니데이즈 효소 저해 활성과 연골세포의 세포외기질 합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 연골의 특이적인 세포외기질인 아그리칸의 발현양상을 RT-PCR을 통해 확인하였다.

Human costal 연골세포가 배양된 접시에 각각 1) 대조군(연골세포), 2) 히알루로니데이즈 처리군, 3) 황기 n-부탄올 가용성 분획 처리군, 4) 황기 n-부탄올 가용성 분획과 히알루로니데이즈 처리군으로 처리한 후 24~72 시간 관찰하였다.

단층 배양된 연골세포를 떼어낸 후 총 RNA는 Trizol Reagent(RNA extraction Kit, GIBCOBRL)를 이용하여 분리하였다. 각각의 군에 대하여 동량의 RNA를 AMV 역전사효소(BMS)를 이용하여 상보 DNA(complementary DNA; cDNA)를 만든 뒤, 이를 템플레이트(template)로 하여 아그리칸(Aggrecan)과 GAPDH에 대한 각각의 프라이머를 제작하여 PCR로 증폭시킨 후 아가로즈겔에 전기영동하여 변화를 확인하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 황기 추출물의 활성분획인 n-부탄올 가용성 분획으로 처리한 군이 연골세포 아그리칸 발현에서 히알루로니데이즈 단독 처리군보다 현저히 발현됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 황기 추출물이 히알루로니데이즈의 활성을 저해함을 알 수 있다.

실험예 3 : 황기 추출물의 히알루로니데이즈로 처리된 관절조직으로부터 글리코사미노글리칸 분해 저해 효과

본 발명의 황기 추출물의 히알루로니데이즈에 대한 활성 저해 효과를 알아보 기 위하여, 히알루로니데이즈로 처리한 후 관절조직으로부터 분해되어 나오는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 양을 Blyscan TM 방법을 이용하여 측정하였다.

사람 관절 연골(Human articular cartilage) 조직이 배양된 접시에 각각 1) 황기 n-부탄올 가용성 분획 처리군(200㎍/㎖), 2) 황기 n-부탄올 가용성 분획(400㎍/㎖) + 히알루로니데이즈 처리군, 3) 황기 n-부탄올 가용성 분획(200㎍/㎖) + 히알루로니데이즈 처리군, 4) 황기 n-부탄올 가용성 분획(100㎍/㎖) + 히알루로니데이즈 처리군, 5) 히알루로니데이즈 처리군, 및 6) 대조군으로 처리한 후 5일간 관찰하였다. 처리 후, 각각의 접시에서 배양상층액만을 회수하고, Blyscan 시약과 반응시켜 조직으로부터 분해되어 생성되는 글리코사미노글리칸을 656㎚에서 비색정량하여 활성을 검증하였다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 황기 추출물의 활성분획인 n-부탄올 가용성 분획은 히알루로니데이즈 처리 후 관절조직으로부터 분해되는 글리코사미노글리칸의 양을 현저히 감소시켰음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 황기 추출물이 히알루로니데이즈의 활성을 저해하여 관절을 보호함을 알 수 있다.

실험예 4 : 황기 추출물로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물의 인터루킨-1 베타로 처리한 관절조직으로부터 글리코사미노글리칸 분해 저해 효과

본 발명의 황기 추출물로부터 분리한 이소플라보노이드계 화합물의 인터루킨 -1 베타에 대한 활성 저해 효과를 알아보기 위하여, 인터루킨-1 베타로 처리한 후 관절조직으로부터 분해되어 나오는 글리코사미노글리칸의 양을 Blyscan TM 방법을 이용하여 측정하였다.

인터루킨-1 베타는 연골세포나 조직의 대사 기능을 변경시켜 불균형을 초래하여 관절의 과도한 분해 및 용해를 일으키는 관절염의 주요 촉진물질이다.

사람 관절 연골 조직이 배양된 접시에 각각 1) 대조군(배지만 처리), 2) 인터루킨-1 베타 (20 ng/㎖) 처리군, 3) 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드 (50 ㎍/㎖) 처리군 4) 인터루킨-1 베타와 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드의 동시 처리군으로 처리한 후 48 시간 관찰하였다. 48시간 후, 각각의 접시에서 배양상층액만을 회수하고, Blyscan 시약과 반응시켜 조직으로부터 분해되어 생성되는 글리코사미노글리칸을 656㎚에서 비색정량하여 활성을 검증하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 황기 추출물의 활성성분인 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 인터루킨-1 베타를 처리한 관절조직으로부터 글리코사미노글리칸의 분해를 저해하였음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 황기로부터 분리한 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 관절조직의 기질 성분의 분해를 일으키는 인터루킨-1 베타의 활성을 저해하여 관절을 보호함을 알 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드)

2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2 : 식품의 제조

본 발명의 황기 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 20 ~ 95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 0.2 ~ 1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 0.5 ~ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 0.1 ~ 5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 5 ~ 10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분 쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드)을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 황기 n-부탄올 가용성 분획의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%),

종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%),

황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드)의 건조분말(3 중량%),

영지(0.5중량%),

지황(0.5중량%)

제제예 3 : 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O- 베타-D-글리코피라노사이드)을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

본 발명의 황기 n-부탄올 가용성 분획 (또는 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드) 1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명의 황기 추출물은 히알루로니데이즈의 활성을 저해하고, 관절을 보호 하며, 또한 황기로부터 분리한 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 관절조직의 기질 성분의 분해를 일으키는 인터루킨-1 베타의 활성을 저해하여 관절을 보호함으로써, 관절염의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

황기 추출물을 유효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 황기 추출물은 황기를 에탄올로 추출하고, 증류수로 현탁한 후, n-헥산에 용해시켜 불용성 분획을 얻고, 상기 불용성 분획을 클로로포름에 용해시켜 불용성 분획을 얻고, 상기 불용성 분획을 에틸아세테이트에 용해시켜 불용성 분획을 얻고, 상기 불용성 분획을 n-부탄올에 용해시켜 얻은 n-부탄올 가용성 분획인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드를 유효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 칼리코신-7-O-베타-D-글리코피라노사이드는 황기로부터 추출·분리·정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.