KR20060052908A - 인공 관절의 제작 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 목적의 형상으로 가공한 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜, 연골 조직으로 분화시킬 수 있는 조건 하에서 상기 세포 덩어리를 배양하는 것을 특징으로 하는 연골의 제작 방법, 및 원하는 관절의 형상으로 가공한 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜, 연골 조직으로 분화시킬 수 있는 조건 하에서 상기 세포 덩어리를 배양하는 것을 특징으로 하는 인공 관절의 제작 방법이다.

Description

인공 관절의 제작 방법{METHOD OF CONSTRUCTING ARTIFICIAL JOINT}

본 발명은 인공 관절의 제작 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 임의 곡면에 적절한 두께를 갖는 세포층을 로드하여, 연골층을 관절면 전체에 미쳐 수복하기 위한 기초 기술에 관한 것이다.

연골은 연골 세포와 연골 기질로 구성되는 결합 조직이고, 관절 뼈는 충분히 두께가 있는 연골에 의해 덮여져 있는 조직이다. 그리고, 관절은 부드러운 움직임이 가능하도록 연골에 의해서 지탱되고 있다. 그러나, 연골이 일단 손상되거나 파괴되면, 자연 치유되는 경우는 매우 드물다. 그래서 종래, 변형성 관절증이나, 관절 류머티즘 등에 의해, 관절로서의 기능이 고도로 저하된 증례(症例)에 대하여는 금속이나 세라믹스, 폴리에틸렌으로 이루어지는 인공 관절 치환술이 선택되어 왔다. 이 방법은 손상된 관절 연골을 절제하여, 금속이나 세라믹스나 폴리에틸렌 등의 인공물로 관절면을 덮도록 씌우는 수술법으로, 전 세계에 널리 보급되어, 현재에도 주요한 치료법이다. 또한, 오랜 세월에 걸쳐 소재의 개량 또는 디자인의 개량 등으로, 10년 이상의 장기간에 걸쳐 유용성이 확인되어 있다.

그러나, 금속이나 세라믹스, 폴리에틸렌은 생체에 있어서 이물(異物)이고, 또한 자기 수복 능력을 바랄 수 없는 소재이다. 또 소재에 기인하는 여러 문 제, 예를 들어, 마찰, 부식 피로, 인공 관절과 뼈 계면의 헐거움, 가라앉음, 감염 등이 발생된다. 실제로, 인공 관절이 마모 및 손상되어, 부득이하게 재수술을 해야 하는 증례는 수없이 많다.

따라서, 인공물을 소재로서 이용하는 현재의 인공 관절을 사용한 치료법을 대체하는 새로운 치료법의 개발이 요망되고 있었다.

최근, ES 세포나, 자기 유래의 세포를 베이스로 한 조직이나 기관을 재생시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 관절 연골에 있어서도, 부분 결손에 관하여 여러 조직 공학을 이용한 기술이 개발되어 왔다. 예를 들어, 결손부에 자기 유래의 세포를 이식함으로써, 주위의 건상부로부터의 재생 인자의 분비를 유도하여, 결손의 치유를 기대하는 방법이 개발되었다 (Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 1994 Oct 6; 331(14): 889-95). 그러나, 이 기술은 결손부를 메우는 방법에 불과하기 때문에, 광범위한 관절 파괴에 대한 치료법으로서 응용하기는 어렵다.

한편, Vacanti 들에 의해서, 결손된 귓바퀴나 손가락의 재생 방법에 관한 연구가 발표되었다 (Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear. Plast Reconstr Surg. 1997 Aug; 100(2): 297-302). 이 방법은 미리 귀나 손가락의 형태로 성형한 폴리머 등의 담체 위에 환자의 세포를 부착시켜, 이것을 누드 마우스의 피하에 이식하고, 마우스로부터 공급되는 영양을 이용하여 콜라겐 등의 세포외 매트릭스의 생성을 촉진시켜, 이식 조직의 형상을 얻는다는 방법이다. 누드 마우스는 면역계가 결손된 마우스이고, 환자 유래의 세포를 마우스 체내에서 증식시킨 후, 환자에게 재이식하더라도, 거절 반응이 없다는 특징을 갖기 때문에 이용 가치가 높다.

그러나, 마우스의 크기에는 한계가 있기 때문에, 이 방법으로 제작가능한 조직의 크기는 마우스의 크기에 의존한다. 또한, 이 방법에는 종교상의, 또는 동물 애호의 관점에서 문제가 생긴다. 또, 동물에 대한 거부감, 광우병으로 대표되는 감염증의 리스크 등을 항상 고려해야만 한다. 마우스보다 대형의 동물, 예를 들어 돼지의 면역능을 결손시켜, 재생 의료에 응용하는 시도도 있지만, 이 경우에도, 타종 동물의 체내를 거친 조직을 인간에게 이식하는 행위에 대한 혐오감이나 미지의 감염증의 리스크 등과 같은 문제점에 아무런 해결점을 찾지 못하고 있다.

또한, 겔로 주형을 만들고, 주형의 주위에 세포 현탁액을 부착한 뒤에, 폴리머 등에 세포를 부착시키는 방법이 개시되어 있다 (일본 공개특허공보 2003-144139호). 이 방법은 세포 현탁액의 부착을 목적으로 하는 것이기 때문에, 실제로는 막 형상의 것이 제작되는 것에 지나지 않아, 관절 연골처럼 두께를 갖는 조직을 제작하기는 어렵다.

이 때문에, 관절 연골에 상당하는 부분에 두께를 갖게 하게 위해서, 미리 분해성 폴리머로 제작한, 솜 형상의 골격에 연골 세포를 부착시켜 두께를 갖게 하는 방법이 발표되어 있다. 그러나, 이 방법에 의하면 관절 연골 부분에 폴리머가 잔존하기 때문에, 분해되는 과정에서 유독 물질로 변하여, 세포에 악영향을 미칠 가능성이 우려된다 (Chondrogenesis in a cell-polymer-bioreactor system. Exp Cell Res. 1998 Apr 10; 240(1): 58-65.).

한편, 콜라겐 겔 내에 세포를 매몰시켜 연골을 재생하는 시도가 이루어지고 있지만, 콜라겐은 소 등 다른 동물 유래인 점, 이식 모상과의 친화성에 관해서 문제가 있다고 생각된다 (Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering in the treatment of cartilage defects of the knee. J Bone Joint Surg Br. 2002 May; 84(4): 571-8.)).

발명의 개시

상기한 바와 같이, 지금까지의 금속이나 세라믹스, 폴리에틸렌에 의한 인공 관절을 대체하여, 광범위한 관절 파괴에 유효하고, 또한 타종 동물을 사용하는 것에 대한 혐오감이나 미지의 감염증의 리스크를 불식시킬 수 있는, 새로운 인공 관절의 개발이 요망되고 있었다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 임의 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜 소정 조건에서 배양함으로써, 목적으로 하는 연골이 형성되는 것을 발견하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 목적의 형상으로 가공한 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜, 연골 조직으로의 분화 유도 조건 하에서 상기 세포 덩어리를 배양하는 것을 특징으로 하는 연골의 제작 방법이다. 또, 본 발명은 원하는 관절의 형상으로 가공한 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜, 연골 조직으로의 분화 유도 조건 하에서 상기 세포 덩어리를 배양하는 것을 특징으로 하는 인공 관절의 제작 방법이다.

관절면으로서는, 세포, 세포가 생성하는 매트릭스 또는 이들의 조합에 의해 형성되는 것을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 담체로서는 트리인산칼슘제의 것을 예시할 수 있고, 그 표면이 미세 구멍을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 세포로서는 간엽계 줄기 세포 또는 연골 세포를 들 수 있다. 상기 배양은 예를 들어 생체외 또한 성장 인자 또는 증식 인자의 존재 하에서 행해진다.

도 1 은 세포만으로 이루어지는 구상의 관절면을 나타내는 도면이다.

도 2 는 토끼 대퇴골 원위(遠位)부의 3차원 데이터를 바탕으로 설계한 담체의 도면이다.

도 3 은 담체에 세포 덩어리를 부착시킨 것을 나타내는 도면이다.

도 4 는 담체에 세포 덩어리를 다시 부착시킨 것을 나타내는 도면이다.

도 5 는 토끼 대퇴골 원위 관절면의 전체 이미지를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포층이 필요충분한 두께를 갖고, 임의 곡면에 부여할 수 있는 자기 세포 유래의 연골 및 인공 관절을 제작하는 방법을 제공하는 것으로, 미리 목적의 형상으로 가공한 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜, 이것을 연골 조직으 로 분화시킬 수 있는 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 그럼으로써, 세포 덩어리는 담체의 형상을 따라 세포 덩어리끼리가 융합하여 관절면이 재생되고, 인공 관절로서 기능한다. 또, 성장 인자의 첨가나 역학적 부하에 의해, 세포외 매트릭스의 생성이 증진되고, 강도 면에서도 이상적인 관절 연골을 생체외에서 제작시키는 것을 특징으로 하는 것이다.

1. 세포

배양의 대상이 되는 세포는 줄기 세포 (ES 세포, 제대혈 유래 세포, 미분화 간엽계 줄기 세포 등) 등의 미분화 세포 또는 그 분화형 세포이다. 특히, 미분화 간엽계 줄기 세포가 바람직하다.

골아 세포, 연골 세포는 미분화 간엽계 줄기 세포로부터 용이하게 분화 유도할 수 있기 때문에, 이들 분화 유도한 세포 (관절 연골 세포, 뼈 세포 등) 도 사용할 수 있다. 또한, 성체 간엽계 줄기 세포를 사용할 수도 있다.

또, 줄기 세포는 복수 종류의 세포, 예를 들어 뼈 세포와 연골 세포를 조합하여 임의 부위에 혼합하여 배양할 수 있다. 예를 들어, 상층이 연골 세포로 만든 세포 덩어리만으로 이루어지는 층, 하층이 뼈 세포 유래의 세포 덩어리처럼 2층으로 조합할 수 있다. 또한, 대퇴골의 경우에는, 관절 부분은 연골계 세포 덩어리를 접착시키고, 뼈 부분은 골계의 세포 덩어리를 접착시킬 수 있다. 이러한 혼합 배양은 관절면을 포함하는 뼈 전체의 재생에 응용할 수 있다.

상기 세포는 예를 들어 마우스, 토끼, 래트, 몰모트, 개, 돼지, 염소, 소 등의 실험 동물 또는 환자의 골수로부터, Dexter 법, 자기 비드법, 셀 소팅법 등의 공지된 수법에 의해 채취할 수 있다.

그런데, 세포에는 부유계 세포와 골격 의존성 세포로 크게 분류되는데, 전자에는 혈액계나 면역계의 세포가 속하고, 후자에게는 피부나 뼈 등의 세포가 속한다. 피부나 뼈 등의 세포는 배양액 중에서 떠 있는 상태에서는 죽어 버리기 때문에, 유리 등의 샬레에 부착함으로써 증식시킨다. 이 때문에, 테플론 (등록상표) 중에 세포를 1군데에 모으도록 하면, 세포는 골격을 찾아, 서로 접착하여, 세포 응집 덩어리, 즉 스페로이드가 형성된다. 또, 스페로이드끼리가 접착·융합하면 큰 형상의 것이 생성된다.

Molecular Biology of the cell 제3판에 기재되어 있는 바와 같이, 효소 처리 등에 의해 흩어지게 한 세포는 자연적으로 응집되는 것이 알려져 있고, 이 현상은 성게 등의 하등 동물부터 포유류의 세포에서도 관찰되는 것으로 알려져 있다. 이 자연 응집은 카드헤린을 함유하는 Cell adhesion molecule (CAM) 이라는 세포외 접착 인자에 의해서 야기되고 있고, 생물의 발생 초기의 사지 형성시에 일어나는 간엽계 줄기 세포 응집과 거의 동일한 현상이, 성숙 개체에서도 재현되는 것으로 생각된다 (Gerisch, G. Curr. Top. Dev. Biol. 14: 243-270. 1980.; Hennings, H. Exp. Cell Res. 143: 127-142. 1983.; Moscona, A.A.; Hausman, R.E. Biological and biochemical studies on embryonic cell-cell recognition. In Cell and Tissue Interactions, Society of General Physiologists Series (J.W. Lash, M.M. Burger, eds.), Vol.32, pp.173-185. New York: Raven Press, 1977.; Roth, S.; Weston, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58: 974-980. 1967.).

또 최근, 간엽계 줄기 세포로부터 연골 세포로의 분화시에는 카드헤린을 통한 세포끼리의 접착이 스위치가 되어, 콜라겐 등의 발현이 시작되는 것을 시사하는 보고가 이루어졌다 (Yoon YM, J Cell Biochem 2002; 87(3): 342-59).

그래서 본 발명에서는 일단 스페로이드로 한 다음 소정 형상으로 형성하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서는 상기 간엽계 줄기 세포 등을 단층 배양한 후, 발수성 또는 세포 비접착성의 환저(丸底) 멀티 웰 또는 U 자형 웰에 옮겨 인큐베이트한다. 그 결과, 세포는 자연적으로 응집하여 세포 덩어리 (세포 응집 덩어리) 를 생성한다. 세포 덩어리를 생성하기까지의 인큐베이트 시간은 6∼48시간, 바람직하게는 24∼48시간이다. 세포 덩어리의 제작 방법은 상기 방법 외에, 선회하고 있는 용액 속에 세포 현탁액을 넣는 선회 배양법, 시험관에 세포 현탁액을 넣어, 원심 분리기로 침전시키는 방법, 알기네이트 비드법 등이 채용되고, 특별히 한정되지 않는다. 균일한 세포 덩어리를 대량 처리할 수 있는 점에서, 발수성이나 세포 비접착성의 멀티 웰에 세포 현탁액을 넣는 방법이, 효율이 좋은 점에서 바람직하다.

상기 스페로이드를 형성함으로써, 세포는 세포 주기에 있어서의 정지기로 이행하고, 단백질의 생성이 증가한다고 생각된다. 또, 세포를 정지기로 유도한 다음 분화시키는 것을「세포가 증식 사이클로부터 벗어나, 세포 분화로 이행한다」고 한다.

2. 세포 덩어리의 배양

다음으로, 미리 임의 형상으로 성형해 둔 담체에 상기한 바와 같이 제작한 세포 덩어리를 부착시켜 배양한다. 세포 덩어리의 개수는 특별히 한정되지 않고, 임의로 설정할 수 있다. 또, 필요하다면, 부착 후에 다시 세포 덩어리를 추가하여 부착시키더라도, 기존의 세포 덩어리와도 융합한다.

본 발명에 있어서, 세포 덩어리를 부착시키는 담체는 인간이나 토끼의 관절 구조에 따라 임의로 형상을 설계할 수 있다. 또 귓바퀴, 코 등, 입체적인 형상을 얻는 목적인 경우에는, 미리 3차원 데이터를 바탕으로 한 주형을 설계하여 담체를 제작할 수 있다.

「담체」란 세포 덩어리를 접착할 수 있는 소재로서 인공 관절의 전체 또는 일부를 구성하고, 세포 덩어리의 지지체로서 기능하는 것을 의미한다. 이 담체는 생체 적합성의 소재가 있어, 생체내에서 흡수, 자기 조직으로 치환되는 것이 바람직하다. 또한, 담체의 표면은 미세 구멍을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이러한 담체로서, 예를 들어 트리인산칼슘제의 담체를 들 수 있고, 고분자의 락트산폴리머 등의 생체 분해성의 폴리머도 적용할 수 있다.

또, 담체 중 세포 덩어리를 부착시킬 필요가 없는 영역은 발수성이나 세포 비접착성의 소재로 마스킹할 수도 있다.

담체 상에 부착시킨 세포 덩어리끼리는 생체가 원래 구비하고 있는 창상(創傷) 치유와 거의 동등한 기전에 기초하여, 각각이 융합하고, 결과적으로 원하는 크기 및 세포 구조를 갖는 구조체를 형성한다.

본 발명에서는 입체 구조를 갖는 담체에 대한 세포 덩어리의 부착을 목적으로 하기 때문에, 세로 방향 (높이 또는 두께) 을 길게 할 필요가 있다. 그 결 과, 세포는 액면으로부터 깊은 곳에 존재하게 되어, 가스 교환의 효율이 저하되게 된다.

그래서 본 발명에서는 배양액을, 세포 덩어리의 일부가 기상에 약간 닿는 정도 (기상에 닿더라도 건조되지 않는 정도) 의 양으로 조절하는 것으로 하였다. 그리고, 담체의 미세 구멍으로부터 배양액이 출입하여, 세포 덩어리에 도달하도록 하였다. 「미세 구멍」이란 세포 덩어리는 통과시키지 않고, 배양액은 통과시킬 수 있는 정도의 크기의 구멍을 의미한다 (직경 10∼500μm). 미세 구멍은 담체 자체의 성형 과정에서 생기는 경우도 있지만, 담체를 가는 바늘로 찔러 형성할 수도 있다.

배양액은 자유롭게 담체의 미세 구멍을 통과할 수 있기 때문에, 배양액을 항상 세포에 공급할 수 있고, 세포 덩어리는 분화·성숙·세포 덩어리끼리의 융합, 성숙을 만족스럽게 행할 수 있다. 또, 이 경우의 성숙이란, 세포가 생성하는 각종 콜라겐이나 프로테오글리칸 등의 세포외 매트릭스의 증가를 가리키고 있고, 원래, 생체내의 세포는 풍부한 세포외 매트릭스에 둘러싸여 있는 경우가 많다.

배양액의 양은 세포가 증식·분화할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 1개의 세포 덩어리당, 전량(全量)으로 적어도 0.5ml 의 배양액이 필요하다.

배양에 사용되는 배양액으로서는 10% FBS 함유 DMEM 배지, 혈청 무첨가 DMEM 하이글루코스 배양액 등을 들 수 있다.

배양은 세포 덩어리가 연골로 분화하여 유도될 수 있는 조건 하에서 행해진다. 세포 덩어리로부터 연골로의 분화 유도는 성장 인자 또는 세포 증식 인자 의 존재 하에서 배양하면 된다. 성장 인자 또는 세포 증식 인자로서는 뼈 형성 단백질 (BMP: Bone Morphogenetic Protein), 섬유아 세포 증식 인자 (FGF: Fibroblast Growth Factor), 트랜스포밍 증식 인자 (TGF-β: Transforming Growth Factor-β), 인슐린형 증식 인자 (IGF: Insulin-like Growth Factor), 혈소판 유래 증식 인자 (PDGF: Platelet Derived Growth Factor), 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor) 등을 사용할 수 있다.

상기 인자는, 증식시키는 크기, 세포외 매트릭스의 생성량에 따라, 단독으로, 또는 적절히 조합하여 종류나 양을 조정하여 첨가한다. 예를 들어, 간엽계 줄기 세포로부터 연골 세포로 분화시키기 위해서는 TGF-β 를 첨가하지만, 나아가, BMP, FGF, IGF 등을 추가함으로써, 보다 콜라겐이 풍부한 연골형 조직을 얻을 수 있다.

여기서, 세포에 어떠한 자극이 가해지면, 일반적으로 mRNA 량이 증가하고, 그 후 단백질의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이 점에 주목하여, 본 발명에 있어서, 배양 조건 (배양 시간, 그 밖의 조건) 을 바꿔, 세포의 성숙도를 조정하였다. 「성숙도」란 세포 덩어리를 뼈나 관절 등의 결손부에 이식하기 위해서 알맞은 정도를 의미한다. 그 이식 시기를, (1) mRNA 가 증가한 시점에서 이식할지, (2) 단백질 (이 경우, 콜라겐 등의 세포외 매트릭스) 이 증가 중인 시점에서 이식할지, 또는 (3) 단백질이 충분량 생성된 (=성숙) 시점에서 이식할지를 검토할 수 있다.

인공 관절형의 경우, 단백질이 충분히 생성된 시기에 이식하는 것이 바람직 하고, 배양 기간은 1개월 이상이 바람직하다. 이 때문에, 장기간에 걸쳐, 생체외(in vitro)에서 변성되지 않는 담체를 사용하는 것이 중요하다.

일반적으로, RNA 생성은 유도 배양 개시 2주간에서 피크가 되고, 그 후 콜라겐 생성의 상승이 관찰되고, 5∼6주에서 안정된다.

또, 각종 성장 인자 또는 증식 인자를 첨가함으로써, 세포외 매트릭스의 양을 조정할 수 있다. 또한, 정수압이나 전단 탄력 등의 기계적 자극, 초음파나 충격파 등을 가함으로써, 세포외 매트릭스를 늘릴 수 있다. 따라서, 상기 성장 인자나 정수압이나 초음파 등의 기계적 자극을 가함으로써, RNA 생성을 피크로 하는 시기를 앞당길 수 있다.

성장 인자 또는 세포 증식 인자로서는 상기와 마찬가지로 BMP, FGF, TGF-β, IGF, PDGF, VEGF 등을 사용할 수 있다.

이와 같이, 배양 조건이나 배양 기간을 조절함으로써, 성숙도를 임의로 조절할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 종래의 누드 마우스의 피하에 일시적으로 이식하여 재생 조직을 숙성시키는 방법과는 달리, 동물을 필요로 하지 않는다. 따라서, 마우스 몸의 크기에 제한되지 않고, 임의 크기의 형상이 얻어진다.

환자 본인의 미분화 간엽계 줄기 세포를 사용함으로써, 뼈, 연골 등의 자기 유래 세포를 사용한 조직을 재생할 수 있다.

이하, 실시예에 의해, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않는다.

[실시예 1]

본 실시예는 인간 고관절, 대퇴골두를 본뜬 실시예이다.

인간 골수 유래 간엽계 줄기 세포를 단층 배양하였다. 최종적으로 간엽계 줄기 세포를 15cm 접시 1장당 1.0 X 10⁶ 얻었다. 이 세포를 트립신 처리하여 세포 현탁액으로 하고, 스미토모 베이크라이트사 제조 스페로이드 플레이트에 각각 1.0 X 10⁵개의 세포가 들어가도록 파종하였다. 그 후 37℃, 5% 이산화탄소의 조건 하에서 배양하고, 다음날에는 직경이 평균 0.5mm 인 세포 덩어리가 1플레이트당 96개 얻어졌다. 이 세포 덩어리를, 반구 형상으로 가공한 트리인산칼슘 위에 부착시켰다. 그 후, TGF-β 를 0.01 ㎍/ml 량 첨가하여, 48시간 배양함으로써, 세포 덩어리를 연골로 분화시켰다. 이 곡면에 부착된 세포 덩어리끼리는 24 내지 48시간 정도에서 융합하여, 세포만으로 이루어지는 구상의 관절면이 얻어졌다 (도 1). 도 1 에서, B 는 A 의 확대도이다.

[실시예 2]

본 실시예는 토끼 대퇴골 원위 관절면의 제작예이다.

토끼 관절 연골 절편에 콜라게나제 처리를 행하고, 얻어진 연골 세포를 단층 배양하였다. 최종적으로 연골 세포를 15cm 접시 1장당 1.0 X 10⁶개 얻었다. 이 세포를 트립신 처리하여 세포 현탁액으로 하고, 스미토모 베이크라이트사 제조 스페로이드 플레이트에 각각 1.0 X 10⁵개의 세포가 들어가도록 파종하였다. 그 후 37℃, 5% 이산화탄소의 조건 하에서 배양하고, 다음날에는 직경이 평균 0.5mm 인 세포 덩어리가 1플레이트당 96개 얻어졌다.

한편, 토끼 대퇴골 원위 관절면의 형상을 본떠 미리 3차원 데이터를 작성하고 (도 2), 이 형상의 트리인산칼슘제 담체를 제작하였다.

상기 세포 덩어리를 트리인산칼슘 위에 부착시켰다. 이 트리인산칼슘의 대퇴골 원위 관절면에는 미세 구멍이 부여되어 있다. 그 후, TGF-β 를 0.01 ㎍/ml 량 첨가하여, 48시간 배양함으로써, 세포 덩어리를 연골로 분화시켰다. 이 곡면에 부착된 세포 덩어리끼리는 24 내지 48시간 정도에서 융합하여, 세포만으로 이루어지는 관절면이 얻어졌다 (도 3). 도 3 에 있어서, 약간 갈색의 부분이 세포 덩어리를 부착시킨 장소이다. 또 다음주 (7일 후) 에, 이렇게 하여 얻어진 관절면 (도 3) 위에 320개의 세포 덩어리를 다시 부착시켰다. 그 결과, 새롭게 부착시킨 세포 덩어리는 이미 부착되어 있는 세포 덩어리와 융합하여 스무스한 곡면을 형성하였다 (도 4A).

또 상기 관절면에 320개의 세포 덩어리를 부착시킨 결과, 최종적으로 도 4B 에 나타내는 바와 같이 원하는 관절을 제작할 수 있었다. 도 4B 에서, 갈색 부분이 세포 덩어리를 부착시킨 영역이다. 주위의 백색 부분이, 여분의 부분에 세포 덩어리가 부착되지 않도록 마스크로서 사용한 파라핀 수지이다.

도 5 에, 토끼 대퇴골 원위 관절면의 전체 이미지를 나타낸다.

도 5A 는 컴퓨터에 입력한 3차원 데이터를 바탕으로 제작한 트리인산칼슘으로 이루어지는 토끼 대퇴골 원위 관절면형의 담체 (세포 부착 전) 이다.

도 5B, 도 5C 는 세포 덩어리를 부착시킨 다음날의 대체적인 모양이다. 연골 상당 부분에만 세포층이 형성되어 있음을 알 수 있다. 도 5D 는 세포 부착부 (도 5B, C) 의 확대도이다. 약간 세포 덩어리의 경계를 판명할 수 있는 정도로 융합되어 있다.

본 발명에 의해, 연골 및 인공 관절의 제작 방법이 제공된다. 본 발명에 의해 제공되는 기술은 세포 응집 덩어리를 다량 제작하고, 각각을 융합시킴으로써, 폴리머 등의 담체를 이용할 필요가 없고, 자기 유래의 세포 단독으로 관절 연골층을 제작할 수 있다. 또, 관절을 성숙시키기 위한 동물에 대한 이식을 필요로 하지 않기 때문에, 타종 동물을 경유하지 않고, 임의 형상의 연골층을 제작할 수 있게 된다.

Claims (6)

1. 목적의 형상으로 가공한 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜, 연골 조직으로의 분화 유도 조건 하에서 상기 세포 덩어리를 배양하는 것을 특징으로 하는 연골의 제작 방법.
2. 목적의 관절의 형상으로 가공한 담체의 표면에 세포 덩어리를 부착시켜, 연골 조직으로의 분화 유도 조건 하에서 상기 세포 덩어리를 배양하는 것을 특징으로 하는 인공 관절의 제작 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   관절면이, 세포, 세포가 생성하는 매트릭스 또는 이들의 조합에 의해 형성되는 것인 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   담체가 미세 구멍을 갖는 것인 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   세포가 간엽계 줄기 세포 또는 연골 세포인 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   배양이, 생체외 또한 성장 인자 또는 증식 인자의 존재 하에서 행해지는 것인 방법.

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