KR20060034879A

KR20060034879A - 항당뇨 효과를 나타내는 발효구아바 조성물

Info

Publication number: KR20060034879A
Application number: KR1020040083894A
Authority: KR
Inventors: 문상욱; 김세재; 박수영; 강신해; 최수연; 진영준
Original assignee: 문상욱
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2004-10-20
Publication date: 2006-04-26
Also published as: KR100661334B1

Abstract

본 발명은 항당뇨 효과를 갖는 발효구아바 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 미생물 발효에 의해 제조된 발효구아바 조성물의 제조방법은, 구아바 분말에 당분을 첨가하여 혼합한 다음, 가수하고, 멸균한 후 젖산균, 효모, 바실러스 중 단일종 또는 2종 이상의 미생물을 접종하고 배양하여 발효구아바 조성물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명의 발효구아바 조성물 또는 그 건조분말은, 당뇨병의 증상인 혈당 상승의 억제 및 강하, 췌장기능 증진, 인슐린분비 촉진, 항염증 등의 효과를 나타내며, 또한 의약품, 건강보조식품, 식품, 향장품, 사료첨가제 등의 원료 또는 첨가제 등으로 사용할 수 있다.

구아바 , 항당뇨, 혈당상승억제, 췌장기능, 인슐린, 항염증

Description

항당뇨 효과를 나타내는 발효구아바 조성물{FERMENTED GUAVA COMPOSITION HAVING ANTI-DIABETES EFFECT}

도 1은 본 발명의 발효구아바 조성물의 제조공정도

도 2는 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말의 제조공정도

도 3은 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말이 LPS에 의해 유발된 대식세포의 NO생성 억제효과를 나타낸 그래프

도 4는 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말이 세포내 신호전달 단백질에 미치는 영향을 나타낸 그래프

도 5은 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말이 췌장 β세포(HIT-T15)의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프

A : 비발효구아바 조성물의 농축분말

B : 발효구아바 조성물의 농축분말

도 6는 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말의 혈당조절 효과를 나타낸 그래프

왼쪽부터, 첫 번째 막대선 : 정상 대조군

두 번째 막대선 : 당뇨 대조군

세 번째 막대선 : 비발효구아바 조성물의 추출분말

네 번째 막대선 : 발효구아바 조성물의 추출분말

도 7는 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말이 내당능에 미치는 영향에 대한 그래프

도 8은 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말이 마우스 췌장에 미치는 영향을 나타낸 그래프

A : 정상 대조군

B : STZ 투여 및 구아바 무투여군

C : STZ 투여 및 비발효구아바 조성물의 농축분말 투여군

D : STZ 투여 및 발효구아바 조성물의 농축분말 투여군

본 발명은 항당뇨 효과를 나타내는 발효구아바 조성물에 관한 것이다.

최근, 생활 수준의 향상으로 인하여 생활 여건이 향상되면서 전반적인 식생활의 향상으로 섭취 열량이 크게 증가하고 운동부족 현상을 초래하며 과도한 스트레스에 노출되는 생활이 지속되면서 인슐린의 활성이 떨어져서 야기되는 제2형의 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병)이 증가하고 있다.

제2형 당뇨병의 병인에는 표적 조직에서의 인슐린저항성과 췌장 베타세포의 기능이상에 의한 인슐린 분비의 장애가 관여하나 어느 것이 일차적인 원인인지는 알려져 있지 않다.

제2형 당뇨병의 발병과정에서 먼저 식후 고혈당의 발생에는 인슐린저항성이 원인으로 작용하나 이후의 공복 혈당의 상승에는 인슐린저항성외에 인슐린 분비의 감소가 관여한다.

한편, 제2형 당뇨병의 자연 경과에서 설폰요소제에 대한 내성과 함께 점진적인 베타세포 기능의 감소가 관찰된다.

이러한 베타세포 기능의 감소에는 "포도당 독성", 췌소도의 아밀린 침착 및 지진성 제1형 당뇨병 환자의 포함 등이 관여한다고 알려져 있으나, 제2형 당뇨병이 하나의 원인으로 설명할 수 없는 이질적인 질환군으로 나타나고 있다.

베타세포 기능의 감소는 제2형 당뇨병의 발병 뿐만 아니라 진행에 증요한 역할을 하며 이의 병태생리는 복잡하여 여러 가지 생화학적 및 유전적 요인이 관여한다고 생각된다.

제2형 당뇨병에서 시간이 경과함에 따라 베타세포 기능이 점진적으로 감소하므로 상기한 여러 가지 요인들을 고려하여 베타세포 기능을 보전하기 위한 치료가 보다 장기간의 당뇨치료 측면에서 더 우수한 혈당 조절을 가능하게 한다.

따라서, 경구용 혈당 강하제만으로는 혈당이 효과적으로 떨어지지 않고 이미 알려진 대부분의 당뇨치료용 약물에서 부작용이 나타나므로, 보다 안전하며 췌장기능을 증진시키면서 혈당조절을 일으키는 당뇨병 치료제나 당뇨병 예방제의 개발이 시급한 실정이다.

일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 기존약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학이나 식용으로 사용해 온 소재들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며, 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성 염려가 적은 장점이 있다.

한편, 구아바(Psidium guajava L.)는 도금양과(Myrtaceae과) Psidium속의 미국산 열대성 식물로서, 화분식물은 물론 잎, 나무껍질, 열매 등을 건강식 및 약용으로 이용할 수 있는 약용식물이다.

구아바에는 비타민C, 마그네슘, 칼륨, 칼슘 등 비타민과 미네랄등이 많이 함유되어 있으며, 과산화변이억제 작용(암예방), 과산화수소 소거 작용(노화방지), 활성산소발생억제작용(미백효과), 항비만 작용(아밀라제 억제), 항당뇨증작용 (당흡수억제, 유사 인슐린 작용-함유하고 있는 폴리페놀 성분), 항 알레르기 작용(히스타민류 억제) 등이 보고되어 있다.

최근 국내에서 구아바를 이용한 건강보조식품이나 건강음료에 관한 많은 연구가 이루어지고 있다.

대한민국 공개특허공보 10-2003-0005387(구아바잎을 주성분으로 한 당뇨병 치료용, 비만개선용, 노화방지용 차의 효과적인 조성물 및 이를 함유한 건강식품)에는 구아바열매를 가수습식분쇄기로 씨를 제거한 후 분쇄하고, 건조한 뒤 구아바 잎 분말 20.0 ~ 50.0 중량%와 구아바열매 분말 5.0 ~ 30.0 중량%, 유당, CMC-Ca, 스테아린산마그네슘, 비타민C 및 만니톨을 첨가하는 것을 특징으로 하는 타블렛 제조방법이 공개되어있다.

대한민국 특허출원 10-2001-0031801(구아바로부터 얻은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B 저해용 활성분획 조성물)에는 구아바를 분쇄한 후 알콜 수용액을 함량대비 3 ~ 10 배를 넣어 용매 추출하여 얻어진 여액을 농축하고 농축액을 실리카겔 레진에 로딩한 후 혼합용매를 사용하여 비활성 부분을 제거한 후 메탄올을 사용하여 용출하고 용출액을 농축하여 RP - 18레진에 로딩한 다음 40 % 아세토나이트릴을 사용하여 활성물을 용출, 농축하여 엑기스를 얻어 1 ~ 2배의 증류수에 현탁하여 동결건조 시키는 방법이 공개되어 있다.

그러나, 이러한 구아바를 활용한 생물소재의 이용에는 본래 구아바가 갖고 있는 기능적 측면만을 부각시키는데 멈추어 당뇨 예방 및 치료와 관련하여 손상된 췌장의 치료나 점진적으로 췌장의 기능을 증진시키는 측면에서 더욱 유효한 구아바 관련 소재의 개발은 아직까지 수행되지 않고 있는 실정이다.

한편, 본 발명은 본 발명의 출원인이 선출원하고 미공개 상태인 특허출원 10-2004-0044400(미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효구아바 조성물)의 개량발명이다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 젖산균, 효모, 바실러스 중 1 종 이상의 미생물을 이용한 발효구아바 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 췌장세포의 파괴 억제와 더불어 췌장 β세포의 기능을 증진 시키는 것을 통해 제1형 및 제2형 당뇨병의 예방과 치료제, 또한 제2형 당뇨병의 수준에서 인슐인 의존적 당뇨병으로의 진행을 차단시킬 수 있는 항당뇨 효과를 나타내는 발효구아바 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 항당뇨병 효과를 나타내는 발효구아바 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 발효구아바 조성물은, 구아바 분말에 현미분말을 구아바 분말의 중량대비 10 ~ 80 중량%, 당밀을 10 ~ 20 중량%로 넣고 혼합하는 제1공정, 제1공정에서 얻어진 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균한 다음, 25 ℃로 냉각하는 제2공정, 제2공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 바실러스, 젖산균, 효모 중 1종 이상의 미생물을 접종하여 발효시키는 제3공정에 의해 발효구아바 조성물을 제조하는 것으로 구성된다.

또한, 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말은, 상기의 발효구아바 조성물에 물을 1 : 0.1 ∼ 1 : 2(V/V)의 비율로 첨가하여 85 ℃에서 6 시간 동안 1차추출하는 제1공정, 제1공정에서 얻어진 1차추출물을 1차추출물 부피의 10 ~ 20 %로 감압농축하여 제1농축액을 제조하는 제2공정, 제2공정에서 얻어진 제1농축액에 물 또는 유기용매를 첨가하여 2차 추출하는 제3공정, 제3공정에서 얻어진 2차 추출물을 냉각하고 여과시키는 제4공정, 제4공정에서 얻어진 여과물을 감압농축하여 제2농축액을 제조하는 제5공정, 제5공정에서 얻어진 제2농축액을 건조하는 제6공정, 제6공정에서 얻어진 건조물을 분쇄하여 분말로 제조하는 제7공정에 의해 발효구아 바 조성물의 농축분말을 제조하는 것으로 구성된다.

한편, 본 발명의 주재료인 구아바는 도금양과(Myrtaceae과) Psidium속의 미국산 열대성 식물로서, 화분식물은 물론 잎, 나무껍질, 열매 등을 건강식 및 약용으로 이용할 수 있는 약용식물이다.

구아바에는 비타민C, 마그네슘, 칼륨, 칼슘 등 비타민과 미네랄등이 많이 함유되어 있으며, 과산화변이억제 작용(암예방), 과산화수소 소거 작용(노화방지), 활성산소발생억제작용(미백효과), 항비만 작용(아밀라제 억제), 항당뇨증작용(당흡수억제, 유사 인슐린 작용-함유하고 있는 폴리페놀 성분), 항 알레르기 작용(히스타민류 억제) 등이 보고되어 있다.

본 발명의 발효구아바 조성물은, 구아바(Psidium guajava L.), 캐틀레이 구아바(Cattley Guava), 스트로우베리 구아바(Strawberry Guava ; Psidium cattleranum Sabine), 브라질리안 구아바(Brazilian Guava ; Feijoa sellowiana Berg.), 구이사로(Guisaro ; Psidium guinense SW.), 코스타 리칸 구아바(Costa Rican Guava ; Psidium friendrichsthalianum Ndz.), 파라 구아바(Para Guava ; Psidium acutangulum DC.), 구아바베리(Guavaberry ; Myrciaria floribunda Berg.), 파인애플 구아바(Pineapple Guava ; feijoa) 중 선택된 1 종을 이용하여 본 발명의 발효구아바 조성물을 제조한다.

본 발명의 발효구아바 조성물 및 발효구아바 조성물의 농축분말 제조방법에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.

1. 발효구아바 조성물의 제조

1)제1공정 : 혼합

구아바를 구입한 후 세척하여 준비한다.

준비한 구아바의 잎 또는 줄기 또는 뿌리를 60 ℃에서 건조하고, 분쇄기로 2 ~ 3 mm 의 직경으로 분쇄하여 분말로 준비한다.

당으로는 당밀 또는 흑설탕 중 어느 것도 괜찮으나 당밀을 사용하는 것이 배양 효율과 경제성의 측면에서 바람직하다.

현미분말은 현미를 100 ℃에서 볶아 분쇄한 것으로 시중에서 구입하여 사용한다.

준비한 구아바 분말에 현미분말을 구아바 분말의 중량대비 10 ~ 80 중량%, 당밀을 10 ~ 20 중량%로 넣고 혼합한다.

2) 제2공정 : 멸균 및 냉각

제1공정에서 얻어진 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균하고, 25 ℃로 냉각한다.

고체 배양인 경우에는 구아바, 당밀, 현미 혼합물의 습도가 50 ∼ 70 %가 되게 하여 혼합한 후 멸균하며, 이때 상부방향으로 통기가 되는 병에 주입하여 120 ℃에서 30 분간 멸균하고 냉각한다.

액체배양인 경우에는 제1공정의 혼합물에 1 : 10 ∼ 1 : 30(W/V)의 비율로 가수한 다음, 120 ℃에서 25 분간 멸균하고, 25 ℃로 냉각한다.

3) 제3공정 : 발효

제2공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 바실러스, 젖산균, 효모 등의 미생물 중에서 1종 이상의 복합미생물을 3 % (w/v) 접종한다.

복합미생물을 접종할 경우에는 각 미생물이 10⁸ cells/ml이 되게 조정하여 1 : 1 또는 1 : 1 : 1의 중량비로 혼합한 혼합물을 3 % (w/v) 접종한다.

미생물 중 젖산균은 스트렙토코코스 더모필루스(Streptoco ccus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus),락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactoba cillus plantarum) 등이 대표적이고, 효모는 사카로마이세스세레비세(Saccharomyces cerevisiae) 등이 대표적이고, 바실러스는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등이 대표적이다.

배양온도 및 기간은 접종미생물의 생장특성에 따라 달라진다. 그 중 젖산균이 포함된 경우에는 38 ℃ 에서 7 일 동안 배양하여 2차발효한다.

그 밖의 경우는 35 ~ 40 ℃에서 5 ~ 10 일동안 배양한다.

그러나, 상기 미생물들에 한정되지 않는다.

2. 발효구아바 조성물의 농축분말 제조방법

1) 제1공정 : 1차추출

상기에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비한다.

발효구아바 조성물에 물을 1 : 0.1 ∼ 1 : 2(V/V)의 비율로 첨가하고 85 ℃에서 6 시간 동안 추출한다.

2) 제2공정 : 감압농축

제1공정의 1차추출물을 1차추출물 부피의 10 ∼ 20 %로 감압농축한다.

3) 제3공정 : 2차추출

제2공정의 농축액에 물 또는 유기용매를 1 : 5 ∼ 1 : 10(V/V)의 비율로 첨가하여 90 ℃ 에서 24 시간 추출한다.

이 때, 유기용매로는 알코올, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올 등을 사용한다.

3) 제4공정 : 냉각 및 여과

제3공정의 2차추출물을 23 ℃로 냉각 하고 여과(≤1㎛)한다.

4) 제5공정 : 감압농축

제4공정의 여과물을 여과물의 부피의 5 ~ 10 %로 감압농축한다.

5) 제6공정 : 건조

제5공정의 농축액을 건조한다.

이때, 부형제를 이용하는 경우는 분무건조기로 건조하며, 부형제를 이용하지 않는 경우는 동결건조기로 건조한다.

6) 제7공정 : 분쇄

제6공정의 건조물을 분쇄하여 발효구아바 조성물의 농축분말을 제조한다.

본 발명의 발효구아바 농축분말은 췌장의 파괴 억제와 그 기능 증진을 통해 혈당조절 효과를 나타내었다.

본 발명은 구아바를 미생물 발효에 의해 처리하여 기존의 구아바와 비교할 때 당뇨병에 차별적이고 더욱 우수한 효과를 나타내었으며 이에 대해 측정하였다.

발효구아바 추출물은 구아바 추출물보다 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해효과가 낮았으나, 스트렙토조톡신을 투여한 마우스에서 혈당조절, 내당능 시험, 췌장파괴 정도 등의 측면에서 상대적으로 우수한 효과를 나타내었다.

즉, 발효구아바 및 그 추출물은 비발효구아바와 비교할 때 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해효과가 낮게 나타나 당뇨개선 및 치료에 대한 효능이 적을 것으로 예측하였으나, 의외로 발효구아바 및 그 추출물은 비발효구아바에 비교하여 손상된 췌장의 회복, 내당능 장애 치료, 혈당조절, 항염증 등의 분야에서 상대적으로 더욱 우수한 효과를 나타내는 것을 처음으로 관찰하여, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방과 치료를 위한 활성 조성물을 개발하였다.

본 발명에 따른 활성 조성물 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 타블렛, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.

상기 활성 분획물로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 1000 mg／㎏(몸무게)／1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 발효구아바 조성물의 제조 1

구아바(Psidium guajava L.)잎, 현미분말, 당밀 등을 시중에서 준비하였다.

준비한 구아바는 분쇄하여 분말로 준비하였다.

현미는 100 ℃에서 볶아 분쇄한 것으로 시중에서 구입하여 준비하였다.

구아바 잎 분말 100 g, 현미분말 50 g, 당밀 15 g을 혼합하고, 물을 1.6 ℓ가하여 혼합한 후, 120 ℃ 에서 25 분 동안 멸균하였다.

멸균후, 25 ℃로 냉각 하여 발효시 접종한 미생물은 락토바실러스 종(Lactobacillus spp)과 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 38 ℃에서 10일간 배양하여 본 발명의 발효구아바 조성물을 제조하였다.

<실시예 2> 발효구아바 조성물의 제조 2

상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효구아바 조성물을 제조하였다.

이 때, 발효시 접종한 미생물은 바실러스 종(Bacillus spp), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 38 ℃에서 10일간 배양하여 본 발명의 발효구아바 조성물을 제조하였다.

<실시예 3> 발효구아바 조성물의 제조 3

이 때, 발효시 접종한 미생물은 바실러스 종(Bacillus spp), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 38 ℃에서 10일간 배양하여 본 발명의 발효구아바를 제조하였다.

<실시예 4> 발효구아바 조성물의 제조 4

이 때, 발효시 접종한 미생물은 바실러스 종(Bacillus spp), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 38 ℃에서 10일간 배양하여 본 발명의 발효구아바를 제조하였다.

<실시예 5> 발효구아바 조성물의 농축분말의 제조 1

실시예 1에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비하였다.

발효구아바 조성물에 1 : 5의 비율로 90 % 에탄올을 첨가하여 85 ℃에서 6 시간 동안 추출하고, 전체를 20 ~ 30 %로 감압 농축하였다.

실온으로 냉각 후 여과하여 농축하고, 동결건조기로 분말화하여 본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.

<실시예 6> 발효구아바 조성물의 농축분말의 제조 2

실시예 2에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비하였다.

실시예 5와 같은 방법으로 발효구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.

<실시예 7> 발효구아바 조성물의 농축분말의 제조 3

실시예 3에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비하였다.

<실시예 8> 발효구아바 조성물의 농축분말의 제조 4

실시예 4에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비하였다.

<실시예 9> 발효구아바 조성물의 농축분말을 이용한 타블렛의 제조

실시예 5에서 제조한 발효구아바 조성물의 농축분말을 준비하였다.

준비한 발효구아바 조성물의 농축분말 10 g과, 락토스 70 g, 결정성 셀룰로오스 15 g, 마그네슘 스테아레이트 5 g의 총량 100 g을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법에 의해 타블렛을 제조하였다.

각 타블렛의 총량은 100 mg이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 mg이다.

<실시예 10> 발효구아바 조성물의 농축분말을 이용한 캡슐제의 제조

준비한 발효구아바 조성물의 농축분말 10 g과, 옥수수 전분 50 g, 카르복시 셀룰로오스 40 g의 총량 100 g을 잘게 부숴 혼합한 후 분말을 제조하였다.

9 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

<비교예 1> 비발효구아바 조성물의 농축분말의 제조

구아바 잎은 시중에서 준비하였다.

준비한 구아바 잎은 분쇄하여 미세한 분말로 준비하였다.

구아바 잎 분말은 1 : 10 (w/v)으로 가수하여 혼합한 후 혼합물에 1 : 5의 비율로 90 % 에탄올을 첨가하여 85 ℃에서 6시간 추출하였다.

실온으로 냉각 후 여과하여 농축하고, 동결건조기로 건조하여 분말화하여 비발효구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.

<실험예 1> PTP 1B 저해효과

1. 실험 재료 준비

실시예 8의 발효구아바 조성물의 농축분말을 준비하였다.

또한, 비교예 1의 비발효구아바 농축분말을 준비하였다.

2. PTP 1B 저해실험

단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B (PTP 1B)는 BIOMOL에서 제조한 제품을 구입하여 실험에 사용하였다.

분광학적으로 효소활성을 측정하였으며, 0.5 ㎍/㎖ 농도의 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B, 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 완충용액(50 mM citrate, pH 6.0, 0.1 M DTT), 저해제, 20 mM pNPP를 첨가하고 가볍게 흔들어 준 다음 1시간동안 30 ℃에서 반응시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. 실험결과

비교예 1의 비발효구아바 농축분말(A)과 본 발명의 실시예 8의 발효구아바 농축분말(B)의 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해효과를 <표 1>에 나타내었다.

<표 1> 구아바 농축분말의 PTP1B 저해활성 실험결과

구 분	PTP1B 저해활성 (IC_50,mg/ml)^_a
비교예 1(A)	0.62 ± 0.68
실시예 8(B)	6.39 ± 0.06

* IC50 값은 전체적으로 7 농도로 조절하고, 각 단계별 농도의 시료를 3반복으로 하여 얻어진 값들로부터 회귀곡선을 구하여 계산된 값이다.

본 발명의 실시예 8의 발효구아바 농축분말(B)이 비교예 1의 비발효구아바 농축분말(A)보다 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해효과가 낮게 나타났다(표 1).

이로부터 발효구아바 농축분말이 비발효구아바 농축분말보다 혈당조절 활성이 저하된 것으로 판단되었으며, 동시에 발효과정에 의해 생리활성효과의 측면에서 원재료의 특성이 변화되는 것으로 나타났다.

<실험예 2> 각 구아바 조성물의 In vitro 평가

1. 세포배양

HIT-T15세포는 한국 세포주 은행에서 분양받아 10 % 우태아혈청(Sigma)과 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin 10,000U/㎖, streptomycin 10,000㎍/㎖; Gibco BRL.)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle media; Gibco BRL.)을 이용하여 5 % CO₂ 와 37 ℃의 조건에서 배양하였다.

세포는 4일 마다 기존 배지를 제거하고 1×PBS로 세척한 뒤 트립신-EDTA (Gibco BRL.)로 세포를 수확하여 원심분리한 후 새로운 배지로 희석하여 계대 배양하였다.

2. MTT 에세이

세포 생존율에 미치는 각 구아바 조성물의 영향을 분석하기 위해서 HIT-T15를 96 well plate(2.0×10⁴cells/well)에 24 시간 동안 배양한 후 일정 농도의 각 구아바 조성물을 첨가하여 72 시간 동안 배양하였다.

3 일 후 배양세포에 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma) 50 ㎕를 첨가하여 4 시간 동안 배양한 후 생성된 포마즌(formazan)을 DMSO 150 ㎕에 녹여 ELISA(BIO-TEK)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. 전기영동 및 웨스턴블랏 분석

배양이 끝난 세포를 직접 5 %의 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 포함한 램리 샘플버퍼(Laemmli sample buffer ; 15)에 녹여 균질화시켰다.

70 ^oC에서 10 분간 가열하고 4 ~ 12 %의 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamid gel)에 전기영동하고 PVDF(poly vinylidene difluoride)에 흡착시켰다.

PVDF 막을 blocking buffer(Tris-buffered saline-0.1%(w/v) Tween-20) (TBS-T)으로 상온에서 1 시간 동안 반응시키고 난 뒤, 여러 가지 1차 항체 (1 : 1000 ~ 1 : 3000)가 들어있는 TBS-T에서 1 시간(25 ^oC) 또는 16 시간(4 ^oC)동안 반응시켰다.

BS-T로 3 회 세척하고 HRP-conjugated 2 차 항체와 상온에서 30 분 반응시킨 뒤 Enhanced Chemiluminescence(ECL) 방법으로 각 밴드의 영상을 얻었다.

4. 발효구아바 조성물의 LPS 유발한 대식세포의 NO 생성 억제효과

가. 세포배양

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 2 × 106 cells/well 이 되도록 6 well에 접종하고 5 % CO2 항온기에서 24 시간 전배양하였다.

이후 배지를 제거하고 시험물질을 1시간 동안 전처리한 후 LPS를 100 ㎎/ml의 농도롤 처리하여 전배양과 동일 조건에서 24시간 배양하였다.

생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였으며 세포로부터 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis)에 사용하였다.

나. NO 에세이

세포배양 상등액 100 ml와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 ml를 혼합하여 96 well plates에서 10 분 동안 반응 시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

표준농도 곡선은 아질산나트륨(sodium nitrite , NaNO₂)를 계단희석(serial dilution)하여 얻었다(1 ~ 100 mM).

NO 생성양은 3 번 이상의 독립적인 실험 결과이며 이들의 평균 표준편차로 표시하였고 통계처리는 티 검정(t-test)을 실시하였다.

통계적인 유의수준은 p 값이 0.05 미만인 경우로 하였다.

다. 웨스턴 블랏 분석

세포를 2 ~ 3 회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척 후 0.1 ml의 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고, 30 분 ~ 1 시간 동안 라이시스(lysis) 시킨 후 12,000 rpm에서 15 분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다.

단백질 농도는 우태혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다.

50 mg의 lysate를 8 % mini gel SPS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF 막에 200 mA로 2 시간 동안 transfer하였다.

그리고 막의 블라킹은 5 % skin milk가 함유된 TTBS(TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 overnight 실시하였다.

iNOS 단백질의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (1:1000)를, COX-2 단백질의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (1:1000)를 TTBS 용액에서 희석하여 4 ℃에서 overnight 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다.

2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시킨 후, TTBS로 3 회 세정하여 ECL기질과 1 분간 반응 후 X-ray 필름에서 감광하였다.

5. 실험결과

가. 발효구아바 조성물의 세포내 신호전달 단백질에 미치는 영향

세포내 스트레스성 신호전달 단백질에는 extracellular signal-regulated protein kinase (ERK), c-jun NH2-terminal kinase (JNK), p38MAP kinase들과 같은 MAP kinase family들이 있다.

HepG2 세포에 발효구아바 조성물을 처리하면 이러한 세포내 신호전달 단백질 중에서 주로 ERK의 인산화(phosphorylation)를 통하여 이들 효소의 활성을 증가시킨다는 결과를 얻었다.

이러한 활성은 처리한 발효구아바 조성물의 농도에 따라 농도의존적으로 증가하는 양상을 나타내었다(도 4).

또한, 발효시키지않은 구아바 조성물은 발효구아바 조성물과 다르게 JNK (c- Jun NH2 kinase)의 인산화가 유도되었다.

따라서, 발효구아바 조성물은 발효시키지 않은 조성물과는 다른 경로를 매개하여 ERK를 활성화시키는 것으로 판단되었다.

나. 발효구아바 조성물에 대한 LPS에 의해 유발된 대식세포의 NO생성 억 제효과

NO 생성의 억제효과를 관찰하기 전에 먼저 두 시료(발효구아바 조성물(A)과 비발효구아바 조성물(B))가 대식세포의 생존에 영향을 미치지 않는 농도를 결정하기 위해 31, 62, 125, 250, 500 mg/ml의 농도에서 MTT reduction법에 의해 세포 생존률을 조사하였다.

그 결과 발효구아바 조성물은 500 mg/ml의 농도까지 세포의 생존에 영향을 주지 않았으나, 비발효구아바 조성물의 경우는 500 mg/ml에서 세포 생존률이 현저히 감소하였다.

LPS로 유발한 대식세포의 NO 생성에 미치는 효과를 세포의 생존력에 영향을 주지 않은 농도(발효구아바 조성물 62, 125, 250, 500 mg/ml 비발효구아바 조성물(31, 62, 125, 250 mg/ml)에서 관찰하였다.

대식세포를 시료의 각 농도에서 1 시간 동안 전처리 한 후 LPS를 100 mg/ml의 농도로 처리하여 24 시간동안 NO의 생성을 유도하였다.

그 결과 발효구아바 조성물은 NO 생성을 농도의존적으로 억제하였으며 125 mg/ml에서 유의성(P < 0.0005) 있게 감소하였다. 비발효구아바 조성물도 125 mg/ml 에서 유의성(P < 0.005) 있게 NO 생성이 감소하였다.

두 시료의 NO 생성 억제 효과가 iNOS의 발현 억제로 인한 것인지를 관찰하기 위하여 iNOS 발현을 iNOS 항체를 사용한 면역블로팅(immunoblotting)법에 의해 조사하였다.

iNOS발현은 LPS로 자극한 대식세포에서 쉽게 관찰되었다.

그러나, 발효구아바 조성물을 처리한 대식세포의 경우 125와 250 mg/ml에서 발현이 현저히 감소하였으며 비발효구아바 조성물도 62와 125 mg/ml에서 발현이 감소하였다.

이는 두 시료의 NO 생성 억제 효과에 이들의 iNOS 발현 억제 기전이 관여한다는 것을 나타낸다.

COX-2는 아라키돈산(arachidonic acid)을 PGEs로 전화시키는 효소 중 하나로서 iNOS처럼 LPS나 여러 가지 사이토카인(cytokine)에 의해 발현이 증가되어 염증관련 질환에 관여하는 것으로 보고되고 있다.

이에 우리는 발효구아바 조성물과 비발효구아바 조성물이 LPS로 유발한 대식세포의 COX-2 단백질 발현에 미치는 효과를 관찰하였으며 그 결과를 비교하였다.

발효구아바 조성물에서는 500 mg/ml의 농도에서 COX-2 단백질 발현이 감소되는 것을 관찰하였다(도 3).

그러나, 비발효구아바 조성물의 경우는 오히려 62 mg/ml부터 농도의존적으로 COX-2 단백질 발현을 현저히 증가시키는 것을 관찰할 수 있었다(도 3).

즉, 비발효구아바 조성물은 NO의 생성을 억제시키는 효과를 가진다 할지라도 COX-2 단백질 발현의 증가를 동반하게 되는 이원적인 작용을 가진다는 것을 보여준다.

따라서, 발효구아바 조성물은 LPS로 유도된 대식세포의 NO 생성에 대한 억제 효능을 잘 보존하고 있었다.

또한, 비발효구아바 조성물이 농도의존적으로 COX-2 단백질의 발현을 더 증가시키는 반면, 발효구아바 조성물은 고농도에서 LPS로 유도된 대식세포의 COX-2 단백질의 발현을 감소시켰다(도 3).

이상의 결과로 볼 때 과도한 NO 생성으로 인해 발생하는 패혈증 등 염증성 질환의 예방과 조절을 위한 치료 물질로 발효구아바의 조성물을 비발효구아바 조성물보다 더 안전하게 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

다. 발효구아바 조성물이 췌장 β세포(HIT-T15)의 증식에 미치는 영향

비발효구아바 조성물과 발효구아바 조성물을 각각 15, 31, 62 mg/ml의 농도에서 24 시간 배양하였다.

비발효구아바 조성물의 경우는 15 mg/ml의 농도에서 세포 증식이 대조군과 비교하였을 때 유의성 있게 122 % 증가하였다(P < 0.0005).

그러나, 31과 62 mg/ml에서는 각각 126 % (P < 0.05), 127 % (P < 0.05)로 유의성은 있으나 그 증가폭이 감소하였다.

발효구아바 조성물의 경우는 세포증식이 62 mg/ml의 농도까지 농도의존적으로 상승하는 효과를 나타내었다(도 5).

31, 62 mg/ml의 농도에서 각각 133 % (P < 0.05), 149 % (P < 0.005)까지 유의성 있게 증가하였다(도 5).

이 결과는 발효구아바 조성물이 비발효구아바 조성물보다 더 효과적으로 베타세포증식에 대한 상승효과를 가지고 있음을 나타내고 있다(도 5).

<실험예 3> 각 구아바 조성물의 In vivo 항당뇨 평가

1. 동물실험

생후 16주된 체중 약 40 g의 생쥐(ICR) 수컷을 각 실험군 당 10마리씩 총 40마리를 사용하였고 실험 기간 중 사료 및 물은 무제한 공급하였다.

실험군은 정상대조군, 당뇨대조군, 구아바잎 비발효 조성물(A) 투여 당뇨군 그리고 구아바잎 발효 조성물(B) 투여 당뇨군으로 분류하였다.

당뇨대조군과 조성물 투여 당뇨군은 스트렙토조토신(streptozotocin ; Sigma, USA)을 40 mg/kg의 용량으로 0.01 M 시트레이트 버퍼(citrate buffer ; pH 4.5)에 용해시킨 뒤 10분 이내에 생쥐 복강 내로 1일 1회씩 5일간 연속 주사하였으며 투여 시작 일을 실험 1일로 정하였다. 정상대조군은 스트렙토조토신(streptozotocin) 대신 동량의 버퍼용액으로 주사하였다.

조성물 투여 당뇨군은 스트렙토조토신(streptozotocin) 투여 시작 1주전부터 구아바잎 비발효 조성물(A) 혹은 구아바잎 발효 조성물(B)을 500 mg/kg의 용량으로 경구 투여를 하였으며 실험 기간동안 투여량을 유지하였고 당뇨대조군과 같은 시기에 스트렙토조토신(streptozotocin)을 같은 방법으로 투여하였다.

투여 시작 일을 역시 실험 1일로 정하였다.

체중 증가량은 실험 개시 일을 시작으로 충분한 양의 사료와 물을 급여하면서 3일 간격으로 일정시간에 측정하였으며, 식이 섭취량은 3일 간격으로 일정시간에 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.

식이 효율(food efficiency fatio; FER)은 1주간의 체중 증가량을 같은 기간의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다.

혈당의 측정은 실험 시작 1일, 7일, 14일, 21일, 28일째 같은 시간에 공복상태에서 꼬리 정맥에서 채혈한 혈액을 혈당측정기 글루코닥터(Allmedicus, Korea)를 사용하여 측정하였다.

공복상태의 생쥐에 글루코스(glucose)를 2 g/kg의 용량으로 복강주사를 하였다.

복강주사 후 0, 30, 60, 90, 120 분에 꼬리 정맥에서 채혈한 혈액에서 혈당을 측정하였다.

모든 자료는 평균 ± 표준편차로 표시하였고 통계처리는 던칸의 다중검정 (Duncan's multiple range test)으로 실시하였다.

통계적인 유의수준은 P 값이 0.05 미만인 경우로 하였다.

2. 조직처리

각 투여군의 마우스를 에테르로 마취시킨 후 해부하여 췌장을 분리하고 4 ℃에서 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde pH 7.4)에 고정하였다.

고정된 췌장을 흐르는 물에 5시간 이상 세척하였으며 세척한 조직을 자동조직 처리기(BAVIMED, Germany)를 이용하여 50 % , 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %로 1 시간씩 탈수, 자일렌(xylene)으로 30분씩 두 번 처리, 자일렌(xylene)과 파라핀(paraffin)을 1 : 1의 비율로 섞어서 30 분 처리, 파라핀을 1시간씩 두 번 처리하여 침투시켰다.

파라핀을 침투 시킨 조직을 파라핀 포매기(BAVIMED, Germany)를 이용하여 파라핀 블록을 제작하였고, 마이크로톰(RMC products, USA)을 이용하여 5 ㎛ 절편으로 section하여 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색을 실시하였다.

3. 실험결과

체중 및 식이효율은 당뇨 대조군과 당뇨 유발 실험군들이 정상 대조군에 비해 유의적으로 감소하였으며 당뇨 대조군과 구아바 조성물(A)을 투여한 당뇨 유발군들이 발효 조성물(B)을 투여한 당뇨 유발군 보다 체중과 식이효율이 더 감소하였다.

식이섭취량은 정상 대조군과 당뇨유발 실험군 간에 유의적인 차이는 없었으며 당뇨유발 실험군들 간에도 유의적인 차이는 없었다.

당뇨가 유발된 실험군들의 현저한 체중감소는 인슐린의 기능저하로 세포내 포도당 이용율이 감소하면서 간, 근육, 지방조직의 지방과 단백질이 부족한 에너지를 생산하는데 이용되었기 때문인 것으로 나타났다.

스트렙토조토신(Streptozotocin) 투여로 유발되는 고혈당에 미치는 구아바 조성물(A)과 발효구아바 조성물(B)의 억제효과를 관찰하기 위하여 스트렙토조토신 투여 일주일 전부터 매일 한 번씩 비발효구아바 조성물(A)과 발효구아바 조성물(B)을 500 mg/kg의 농도로 생쥐의 구강 내로 투여하였다.

생쥐에 스트렙토조토신 40 mg/kg을 투여한 후 일주일 간격으로 혈당을 측정한 결과를 도 6에 표시하였다.

생쥐에 스트렙토조토신을 투여하면 14 일째 후부터 혈당이 현저히 증가하여 계속 증가된 상태를 유지하였는데, 이러한 결과로 보아 스트렙토조토신에 의해 당뇨병이 유발됨을 확인할 수 있었다.

그러나, 스트렙토조토신 투여전 일주일 동안 비발효구아바 조성물(A)과 발효구아바 조성물(B)을 투여한 생쥐에 스트렙토조토신을 투여한 경우, 스트렙토조토신 투여 후 14 일째의 생쥐의 혈당은 두 실험군에서 모두 150 mg/dl 로 대조군과 비슷한 혈당치를 보였다.

또한, 비발효구아바 조성물(A)의 경우는 혈당이 21일째부터 서서히 다시 증가하는 것이 관찰되었으나 발효구아바 조성물(B)의 경우는 대조군과 비슷한 혈당치를 유지하였다(도 6).

이러한 결과로 보아 스트렙토조토신에 의해 유발되는 고혈당이 구아바잎 발효 조성물(B)의 전처리로 완전히 억제됨을 관찰 할 수 있었다.

구아바잎 비발효 조성물(A)의 경우는 혈당의 재상승이 구아바잎 비발효 조성물(A)이 고혈당을 완전히 억제시키지는 못하고 단지 지연시키는 효과를 나타내었다.

스트렙토조토신으로 당뇨병을 유발한 쥐의 췌장 베타세포의 기능에 대한 발효구아바 조성물(B)의 효과를 관찰하기 위해 글루코스 복강주사에 의한 내당능 검사를 수행하였다.

비발효구아바 조성물(A) (P < 0.05)과 구아바잎 발효 조성물(B)(P < 0.005)을 투여한 당뇨군이 이들을 처리하지 않은 당뇨대조군보다 유의적으로 더 낮은 혈당농도를 보여주었으며, 발효구아바 조성물(B)이 비발효구아바 조성물(A)보다 더 낮은 혈당농도를 보여주었다(도 7).

예를 들어, 글루코스 주사 3 시간 후에 비발효구아바 조성물(A)을 투여한 실험군에서는 177 mg/dl, 발효구아바 조성물(B)을 투여한 실험군에서는 130 mg/dl, 투여하지 않은 실험군에서는 271 mg/dl 이었다.

스트렙토조토신으로 당뇨병을 유발한 쥐의 손상된 췌장조직을 관찰하였다.

실험구는 총 4 구이며, 스트렙토조토신을 투여하지 않은 대조구(도 8A), 스트렙토조토신을 투여한 후 구아바 시료를 투여하지 않은 실험구(도 8B), 비발효구아바 농축분말을 투여하면서 스트렙토조토신을 투여한 실험구(도 8C), 발효구아바 농축분말을 투여하면서 스트렙토조토신을 투여한 실험구(도 8D)로 구분하였다.

스트렙토조토신만을 투여한 실험구(도 8B)에서는 췌장의 베타세포가 거의 파괴되었으며, 비발효구아바 농축분말을 투여하면서 스트렙토조토신을 투여한 실험구 (도 8C)에서는 베타세포가 대조구 수준에는 미치지 못하나 다소 회복된 것이 나타났다.

그러나, 바효구아바 농축분말을 투여하면서 스트렙토조토신을 투여한 실험구(도 8D)에서는 췌장의 베타세포가 대조구의 수준과 유사한 정도로 회복되었으며, 비발효구아바 처리구(도 8C)와 비교할 때 더욱 뚜렷한 개선효과가 나타났다.

이 실험에서 우리는 발효구아바 조성물(B)의 전처리가 비발효구아바 조성물(A)보다 더 효과적으로 스트렙토조토신에 의한 당뇨를 억제하는 예방 효과를 가진다는 것을 알게 되었다.

본 실험 결과를 토대로 하면 발효구아바 조성물(B)이 비발효구아바 조성물과 비교하여 항염증, 세포증식유도, 항산화 효소 증가 등 차별적이며 새로운 기능성을 추가적으로 갖는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 당뇨병의 치료에 더욱 효과적인 물질 또는 조성물일 것으로 사료되며, 사람의 당뇨병 치료에도 안전하고 더욱 효과적인 물질로 사용될 수 있으리라 판단하였다.

본 발명에 의해 항당뇨 효과를 나타내는 발효구아바 조성물과 그 제조방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 의해 췌장기능의 저하 및 췌장 β세포의 파괴 등에 의해 혈당이 상승하는 것을 예방 또는 치료하며, 제2형 당뇨병에서 제1형 당뇨병으로의 진행을 억제하는 당뇨병 예방 및 치료효과가 뛰어난 발효구아바 조성물의 농축분말 및 그 제조방법이 제공된다.

Claims

구아바 조성물의 제조방법에 있어서,

구아바 분말에 현미분말을 구아바 분말의 중량대비 10 ~ 80 중량%, 당밀을 10 ~ 20 중량%로 넣고 혼합하는 제1공정,

제1공정에서 얻어진 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균한 다음, 25 ℃로 냉각하는 제2공정,

제2공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 젖산균, 효모, 바실러스 중에서 선택된 1종 이상의 미생물을 접종하고 발효시켜 발효구아바 조성물을 수득하는 제3공정으로 구성된,

발효구아바 조성물의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

제1공정의 구아바분말 제조시 사용된 구아바는, 구아바(Psidium guajava L.), 캐틀레이 구아바(Cattley Guava), 스트로우베리 구아바(Strawberry Guava ; Psidium cattleranum Sabine), 브라질리안 구아바(Brazilian Guava ; Feijoa sellowiana Berg.), 구이사로(Guisaro ; Psidium guinense SW.), 코스타 리칸 구아바(Costa Rican Guava ; Psidium friendrichsthalianum Ndz.), 파라 구아바(Para Guava ; Psidium acutangulum DC.), 구아바베리(Guavaberry ; Myrciaria floribunda Berg.), 파인애플 구아바(Pineapple Guava ; feijoa) 중 선택된 1 종인 것이 특징인,

발효구아바 조성물의 제조방법.
제 1항에 있어서,

제3공정의 젖산균은 스트렙토코커스 더모필루스 (Streptoco ccus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus),락토바실러스 에시도필루, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactoba cillus plantarum) 에서 선택된 1 종이고,

효모는 사카로마이세스세레비세 (Saccharomyces cerevisiae)이며,

바실러스는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)인 것이 특징인,

발효구아바 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된,

발효구아바 조성물.
구아바의 농축분말의 제조방법에 있어서,

제4항의 발효구아바 조성물에 물을 1 : 0.1 ∼ 1 : 2(V/V)의 비율로 첨가하여 1차 추출하는 제1공정,

제1공정에서 얻어진 1차 추출물을 1차추출물 부피의 10 ~ 20 % 로 감압농축하여 제1농축액을 제조하는 제2공정,

제2공정에서 얻어진 제1농축액에 물 또는 유기용매를 첨가하여 2차추출하는 제3공정,

제3공정에서 얻어진 2차추출물을 냉각하고 여과시키는 제4공정,

제4공정에서 얻어진 여과물을 감압농축하여 제2농축액을 제조하는 제5공정,

제5공정에서 얻어진 제2농축액을 건조하는 제6공정,

제6공정에서 얻어진 건조물을 분쇄하여 농축분말을 제조하는 제7공정으로 구성된,

발효구아바 조성물의 농축분말 제조방법.
제5항에 있어서,

제3공정의 2차추출시, 유기용매는 알코올, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올 중 선택된 1종인 것이 특징이며,

선택된 유기용매를 제2공정의 제1농축액의 부피대피 1 : 5 ~ 10의 부피비율로 첨가하여 85 ℃에서 24 시간동안 추출하는 것이 특징인,

발효구아바 조성물의 농축분말 제조방법.
제5항 또는 제6항의 방법에 의해 제조된 발효구아바 조성물의 농축분말.
제7항의 발효구아바 조성물의 농축분말에 있어서,

당뇨병 예방, 개선 및 치료용 의약품, 식품, 다류, 향장품, 입욕제 또는 사료첨가제 등의 원료 또는 첨가제로 사용되는 것이 특징인,

발효구아바 조성물의 농축분말.