KR20060028676A

KR20060028676A - 헤파린 결합 활성을 지닌 신규한 항미생물 펩타이드

Info

Publication number: KR20060028676A
Application number: KR1020057021961A
Authority: KR
Inventors: 아르투르 슈미트헨; 마르틴 마름스텐
Original assignee: 데르마겐 아베
Priority date: 2003-05-19
Filing date: 2004-05-19
Publication date: 2006-03-31
Also published as: CN1791612A; KR101160474B1; JP4611979B2; CN100362017C; CN101161284A; CA2523998C; CA2523998A1; WO2005061535A1; EP1625155B1; JP2007531691A; US20090074864A1; SE0301431D0; EP1625155A1; HK1119390A1; US20070185019A1; AU2004303728A1; ES2395206T3; CN101161284B; AU2004303728B2; US8551954B2

Abstract

본 발명은 라미닌 동형, 보체 인자 C3, 히스티딘-풍부 당단백질 및 키니노겐으로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 항미생물 활성이 실질적으로 없는 내인성 포유동물 단백질로부터 기원하고, 10 내지 36개 아미노산 잔기를 지닌, 헤파린 결합 활성을 갖는 항미생물 펩타이드에 관한 것로서, 이때, 항미생물 펩타이드는 K, R 및 H로 이루어진 그룹 중에서 선택된 4개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다. 본 발명은 또한 상기 항미생물 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 항미생물 펩타이드 및/또는 항미생물제/약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

항미생물 펩타이드, 헤파린 결합 활성, 라미닌 동형, 보체 인자 C3, 히스티딘-풍부 당단백질 및 키니노겐

Description

헤파린 결합 활성을 지닌 신규한 항미생물 펩타이드{Novel antimicrobial peptides with heparin binding activity}

본 발명은 라미닌 동형(laminin isoform), 보체 인자 C3, 히스티딘-풍부 당단백질 및 키니노겐으로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 항미생물 활성이 실질적으로 없는 내인성 포유동물 단백질로부터 기원하고, 10 내지 36개의 아미노산을 지닌 헤파린 결합 활성을 갖는 항미생물 펩타이드에 관한 것으로서, 이때, 항미생물 펩타이드는 K, R 및 H로 이루어진 그룹 중에서 선택된 4개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다. 본 발명은 또한 상기 항미생물 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 항미생물 펩타이드 및/또는 항미생물제/약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

몇몇 감염은 사람과 같은 포유동물의 면역 시스템에 의해 성공적으로 퇴치된다. 그러나, 일부의 경우에, 세균, 진균 또는 바이러스는 항상 제거되지는 않아서, 국소 또는 전신의 급성 감염을 유발할 수 있다. 이는 출생전후기, 출생기, 또는 중환자실에 있는 개체, 및 면역약화된 개체에서 심각한 우려가 된다. 다른 경우에, 상피 표면에서 연속적인 세균 존속은 만성 질병을 유발하거나 악화시킬 수 있다. 사람에서, 이는 만성 피부 궤양, 아토피성 피부염 및 기타 유형의 습진, 여드름 또는 비뇨생식기 감염으로 예시된다.

증상 감염은 각종 의약으로 치료할 수 있다. 일부 질병은 또한 예를 들면, 백신으로 퇴치할 수 있다. 그러나, 백신은 항상 우수한 치료 선택이 아니며 특정 미생물에 대하여는 백신이 유용하지 않다. 방어가 가능하지 않은 경우, 질병의 치료가 수행된다. 흔히 치료는 미생물을 사멸시키는 항생제를 사용하여 수행된다. 그러나, 지난 수년동안 몇가지 미생물은 항생제에 대해 내성을 갖게 되었다. 아마도, 내성 문제는 가까운 미래에 증가할 것이다. 또한, 몇몇 개체는 항생제에 대해 알레르기를 일으킴으로써 특정 항생제를 효과적으로 사용하기 위한 가능성을 감소시킨다.

각종 생물체의 상피 표면은 세균에 연속적으로 노출된다. 최근 수년동안 항세균성 펩타이드에 기초한 선천적 면역계는 감염에 민감한 생물학적 경계에 있는 세균의 초기 제거시 중요한 역활을 담당하여 왔다[참조: Lehrer, R. I., and Ganz, T. (1999) Curr Opin Immunol 11: 23-27, Boman, H. G. (2000) Immunol. Rev. 173, 5-16]. 항미생물 펩타이드는 세균의 막을 침투함으로써 세균을 사멸시키므로, 특정 분자 미생물 표적의 결핍은 내성 발달을 최소화한다.

본원과 기술된 펩타이드와 무관한 몇몇 항미생물 펩타이드 및 단백질은 당해 분야에 공지되어 있다.

미국 특허 제6,503,881호는 항미생물 펩타이드로서 사용될 인돌리시딘 유사체인 양이온성 펩타이드를 기술하고 있다. 당해 양이온성 펩타이드는 동물 및 식 물을 포함하는 상이한 종으로부터 기원한다.

미국 특허 제5,912,230호는 항-진균 및 항-세균 히스타틴계 펩타이드를 기술하고 있다. 당해 펩타이드는 천연적으로 존재하는 사람 히스티딘의 아미노산 서열의 정의된 일부분, 및 진균 및 세균 감염의 치료 방법을 기본으로 한다.

미국 특허 제5,717,064호는 메틸화된 라이신이 풍부한 펩타이드를 기술하고 있다. 용해성 펩타이드는 트립신 분해 내성이며 비-천연적이다. 당해 용해성 펩타이드는 생체내 투여에 적합하다.

미국 특허 제5,646,014호는 항미생물 펩타이드를 기술하고 있다. 당해 펩타이드는 누에 혈액림프(silkworm hemolymph)로부터의 항미생물 분획에서 분리되었다. 당해 펩타이드는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 같은 몇몇 세균 균주에 대해 탁월한 항미생물 활성을 나타낸다.

문헌[참조: McCabe et al. , J. Biol. Chem. Vol 277: 27477-27488, 2002]은 헤파린 결합 컨센수스 모티프 XBBXBX 및 XBBBXXBX를 함유하는 37kDa의 항미생물성 및 화학주성 단백질인, 아주로시딘(azurocidin)을 기술하고 있다.

제WO2004016653호는 아주로시딘의 20 내지 44번 서열을 기본으로 하는 펩타이드를 기술하고 있다. 당해 펩타이드는 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 루프 구조를 함유한다.

미국 특허 제6495516호 및 관련 특허들은 살세균성 55kDa의 단백질 살세균성/침투 증진성 단백질(BPI)을 기본으로 하는 펩타이드를 기술하고 있다. 당해 펩타 이드는 항미생물 효과를 나타내며 헤파린 및 LPS-중화 능력을 지녔다.

제WO 01/81578호는 다수의 질병에 사용될 수 있는 G-커플링된 단백질-수용체 관련 폴리펩타이드를 암호화하는 다수의 서열을 기술하고 있다.

제WO 00/27415호는 혈관형성 억제에 적합한 펩타이드를 기술하고 있다. 당해 펩타이드는 고 분자량 키니노겐 5의 유사체이다. BLASTp 연구는, 보존된 영역의 작용에 대하여 또는 이들이 작은 펩타이드로서 작용을 조금이라도 가지는 지에 대하여 어떠한 제시도 없이, 키니노겐과 같은 상이한 종 중에서 유사성을 지니거나 보존된 서열을 나타낸다.

현재, 700개 이상의 상이한 항미생물 펩타이드 서열이 공지되어 있으며(참조: www. bbcm. univ. trieste. it/-tossi/search. htm), 세크로핀, 데펜신 마가이닌 및 카텔리시딘을 포함한다.

심지어 현재 유용한 대량의 항미생물 펩타이드가 존재한다고 해도, 새로운 개선된 항미생물 펩타이드의 요구가 여전히 증가하고 있다. 항미생물 펩타이드는 미생물을 박멸하는데 사용될 수 있으며 항생제 및/또는 기타 항미생물제에 대해 내성(resistant) 또는 관용성(tolerant)이다. 또한, 사람과 같은 포유동물내로 도입되는 경우 비-알레르기성인 새로운 항미생물 펩타이드가 요구되고 있다. 세균은 현저한 내성을 유발하지 않으면서 진화 동안 내생적으로 생산된 항미생물 펩타이드에 직면하여 왔다.

발명의 개요

제 1측면에 따라서, 본 발명은 라미닌 동형, 보체 인자 C3, 히스티딘-풍부 당단백질 및 키니노겐으로 이루어진 그룹 중에서 선택된,항미생물 활성이 실질적으로 없는 내인성 포유동물 단백질로부터 기원하고, 10 내지 36개의 아미노산 잔기를 지닌 헤파린 결합 활성을 갖는 항미생물 펩타이드에 관한 것으로서, 이때, 항미생물 펩타이드는 K, R 및 H로 이루어진 그룹 중에서 선택된 4개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다.

이러한 항미생물 펩타이드를 제공함으로써, 항미생물 펩타이드에 대한 알레르기 반응에 대한 위험성은 감소될 수 있는데, 이는 펩타이드가 내인성 단백질 및/또는 펩타이드로부터 기원한다는 사실에 기인한다. 짧은 펩타이드를 사용함에 의해 펩타이드의 안정성을 증가시킬 수 있고, 보다 긴 펩타이드 및 단백질과 비교하여 생산 비용을 감소시킴으로써, 본 발명은 경제적으로 유리하다. 본 발명은, 본원의 우선일 이후에 공개된 문헌[참조: Andersson et al., Eur J Biochem, 2004, 271:1219-1226]에 기술된 바와 같이 내인성의 비-항미생물 단백질로 부터 기원한 헤파린-결합 모티프를 지닌 펩타이드가 항미생물 활성을 나타낸다는 발견에서 비롯된 것이다. 각종 단백질에서 헤파린-결합 모티프의 존재 및 헤파린 결합을 위한 구조적 전제조건은 일반적으로 잘 문서화되어 있다. 이러한 그룹의 분자들은 각종 라미닌 동형, 피브로넥틴, 응고 인자, 성장 인자, 케모킨, 히스티딘-풍부 당단백질, 키니노겐 및 많은 다른 것들[참조: Andersson et al., (2004) Eur J Biochem 271; 271:1219-26 및 당해 문헌에 인용된 참조 문헌]을 포함하며, 이들 중 어느 것도 본질적으로 항미생물성이 아니다.

본 발명에 따른 항미생물 펩타이드 및 상응하는 항미생물제/약제학적 조성물은 미생물의 효과적인 예방, 감소 또는 제거를 촉진시키는 펩타이드 및 조성물을 제공한다. 이에 의해 항생제에 대해 내성 또는 관용성인 미생물을 퇴치할 가능성은 증가할 수 있다. 더우기, 시판되는 항미생물제에 대해 알레르기성인 포유동물이 치료될 수 있다. 내인성 단백질로부터 기원한 항미생물제/약제학적 조성물을 제공함에 의해, 포유동물이 이들 특정 펩타이드에 대해 알레르기를 일으킬 가능성은 감소하거나 심지어 제거될 수 있다. 이는, 항미생물제/약제학적 조성물이 감염을 예방하기 위한 약제 또는 첨가제로서 포유동물과 접촉하는 몇몇 적용에 유용하도록 한다.

또한, 짧은 펩타이드의 용도는 생체이용율을 향상시킨다. 또한, 그람-음성 및 그람-양성 세균, 또는 진균에서 특정 또는 바람직한 작용을 갖는 구조적으로 상이한 페파린-결합 항미생물 펩타이드의 사용은 각종 미생물의 특이적 표적화를 가능하도록 함으로써 내성 및 생태학적 문제의 발생을 최소화시킨다. 포유동물에 이미 존재하는 펩타이드를 공급함으로써, 신규 항생제에 의한 추가의 생태학적 압력의 위험이 또한 제거된다. 최종적으로, 당해 제형은 또한 내인성 항미생물 펩타이드의 효과를 향상시킬 수 있다.

제 2 측면에 따라서, 본 발명은 위에서 정의한 하나 이상의 항미생물 펩타이드, 및 약제학적으로 허용되는 완충제, 희석제, 담체, 보조제 또는 부형제를 포함하는 항미생물제/약제학적 조성물에 관한 것이다.

제 3 측면에 따라서, 본 발명은 이후 본원에 정의된 항미생물 펩타이드 및/ 또는 항미생물제/약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 항미생물 펩타이드는 사람과 같은 포유동물을 침입하거나 감염시키는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 모든 종류의 적용에서 미생물을 예방하거나, 감소시키거나 또는 제거하기 위한 선택을 도와주는 항미생물제의 목록을 증가시킨다.

도 1A 내지 1C는 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)상에서 펩타이드의 항세균 효과를 입증하는 다이아그램이다.

도 2A 및 2B는 고도로 활성인 펩타이드 세트를 사용한 방사 확산 검정을 나타내는 페트리 디쉬이다.

도 3A 내지 3C는 히스티딘-풍부 펩타이드의 항세균 효과를 기술하는 다이아그램 및 표이다.

도 4A 내지 4H는 항미생물 펩타이드에 의해 처리된 슈도모나스 아레루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 분석을 나타내는 전자현미경 사진이다.

도 5A 내지 5C는 보체 C3, 히스티딘-풍부 당단백질 및 키니노겐으로부터 기원한 펩타이드의 헤파린 결합 활성을 나타내는 사진이다.

도 6은 니켈-세파로즈상에서 히스티딘을 함유하는 항미생물 단편의 정제를 나타내는 사진이다.

정의

본원 및 본 발명의 내용에서 다음 용어들이 적용된다:

용어 "뉴클레오타이드 서열"은 2개 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 뉴클레오타이드는 게놈성 DNA, cDNA, RNA, 반-합성 또는 합성 오리진 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 당해 용어는 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 DNA 또는 RNA를 포함한다.

용어 "항미생물 펩타이드"는 약 10 내지 약 36개의 아미노산 잔기를 포함하고, 항미생물 및 헤파린 결합 활성을 가지며, 본질적으로 항미생물 효과를 갖지 않는 내인성 포유동물로부터 기원하는 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. "항미생물 펩타이드"는 미생물을 예방하거나, 억제하거나, 감소시키거나 파괴한다. 항미생물 활성은 예를 들면 실시예 2, 4 또는 5에서의 방법에 의해 측정할 수 있다.

용어 "헤파린 결합 친화도"는 헤파린에 직접 또는 간접적으로 결합하는 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 헤파린 결합 활성은 예를 들면, 실시예 7에서의 방법으로 측정할 수 있다. 헤파린에 대해 친화성을 나타내는, 본 발명의 항미생물 펩타이드는 또한 데르마탄 설페이트에 결합한다. 따라서, 헤파린 결합 항미생물 펩타이드는 또한 내인성 글리코사미노글리칸 데르마탄 설페이트와 상호작용한다.

용어 "양친매성"은 α-나선 구조, β-쇄의, 직쇄, 환형 또는 기타 2차 구조의 마주보는 면을 따라 친수성 및 소수성 아미노산 잔기가 분포함으로써, 분자의 한쪽 면이 우세하게 하전되고 다른 면이 우세하게 친수성이 되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 펩타이드의 양친매성도는 예를 들면, http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl.에서 발견되는 것과 같은 각종 웹-기반 알코리즘에 의해 아미노산 잔기의 서열을 플롯팅함으로써 평가할 수 있다. 소수성 잔기의 분포는 나선 휠 다이아그램으로 가시화시킬 수 있다. GORIV와 같은 2차 구조 예견 알고리즘은 www.expasy.com에서 찾을 수 있다.

용어 "양이온성"은 pH 범위가 약 4 내지 약 12인 순 양성 전하를 갖는 분자를 의미하는 것으로 의도된다.

용어 "미생물"은 모든 살아있는 미생물을 의미하는 것으로 의도된다. 미생물의 예는 세균, 진균, 바이러스, 기생충 및 효모이다.

용어 "항미생물제"는 미생물을 예방하거나, 억제하거나, 또는 이의 삶을 파괴하는 모든 제제를 의미하는 것으로 의도된다. 항미생물제의 예는 항미생물 치료요법에 대한 샌드포드 가이드[The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy(32nd edition, Antimicrobial Therapy, Inc. US)]에서 발견할 수 있다.

본 문맥에서, 아미노산 명칭 및 원자명은 IUPAC 명명법[아미노산 및 펩타이드에 대한 IUPAC 명명법 및 기호화(잔기명, 원자명 등), Eur J Biochem., 138, 9-37 (1984)]과 함게 이들의 교정본[참조: Eur J Biochem., 152, 1 (1985)]을 기초로하는 단백질 데이타벵크(PNB)(www.pdb.org)에 의해 정의된 것을 사용한다. 용어 "아미노산"은 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글라이신(Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소루이신(Ile 또는 I), 라이신(Lys 또는 K), 루이신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라긴(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(Gln 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(Val 또는 V), 트립토판(Trp 또는 W) 및 타이로신(Tyr 또는 Y), 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산을 나타내는 것으로 의도된다.

설명

항미생물 펩타이드

본 발명은 항미생물 활성이 실질적으로 없는 내인성 포유동물 단백질로부터 기원하며 10 내지 36개 아미노산 잔기를 가지는, 헤파린 결합 활성을 갖는 항미생물 펩타이드에 관한 것으로서, 이때, 항미생물 펩타이드는 K, R 및 H로 이루어진 그룹 중에서 선택된 4개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다. 아미노산 잔기중 2개는 인접할 수 있다. B 아미노산 잔기간의 ~20Å의 거리는 문헌(참조: Margalit et al., 1993 J Biol Chem 268, 19228-31)에 보고된 바와 같은 펩타이드 구조와는 무관하게 헤파린 결합을 위한 필수조건을 구성한다. 짧은 펩타이드의 사용은 예를 들면 증가된 피부 침투 능력을 통해 보다 긴 펩타이드 또는 단백질과 비교하여 보다 짧은 펩타이드의 생체이용율을 증가시키며, 생산 및 정제 비용을 감소시킨다. 본 발명의 항미생물 펩타이드는 현재 시판되며, 이용가능한 항미생물제에 대해 관용성 및/또는 내성인 미생물을 퇴치할 가능성을 증가시키는 항미생물 펩타이드에 대한 보체이다. 내인성 비-항미생물 단백질로부터 새로운 항미생물 펩타이드를 유도시킴에 의해, 당해 펩타이드를 기본으로 하는 포유동물에 대해 비-알레르기성인 새로운 펩타이드를 동정할 수 있다

또한, 펩타이드 작용의 증가된 지식 및 각종 염 및 이온 환경의 의존성은 펩타이드 효과를 향상시키고 조절하는 특정 조성물을 설계할 수 있도록 한다. 진균에서의 작용을 위해 제거된 펩타이드는 또한 점막 부위에서 세균 생태에 현저히 영향을 미치지 않으면서 점막에서 효모 감염과 같은 특정 질병을 표적화하는데 유리할 것이다. 항미생물 펩타이드가 세균막에서 작용한다는 사실은, 이들이 항생제와 함께 상승적으로 작용할 수 있음을 제안한다. 따라서, 항생제와 펩타이드의 배합은 치료학적으로 유리할 수 있다. 최종적으로, 미생물의 성장을 예방하는데 필수적인 상이한 종류의 생성물에 사용될 저 비용 및 비-알레르기성 항생제가 요구되고 있다.

또한, 그람-음성 및 그람-양성 세균, 또는 진균에서 특정의 또는 바람직한 작용을 갖는 구조적으로 상이한 헤파린에 결합하는 짧은 항미생물 펩타이드의 사용은 각종 미생물의 특정 표적화를 가능하도록 함으로써 내성 및 생태학적 문제를 최소화한다. 생물체 속에 이미 존재하는 펩타이드를 보충함으로서, 신규 항생제에 의한 추가의 생태학적 압력 위험을 또한 제거한다. 펩타이드 효과를 향상시키는 특정 제형의 도입은 치료된 부위밖에서 내성 유발과 같은 펩타이드의 부작용 위험성을 추가로 최소화시키는 외래로 공급된 펩타이드를 국재화하고 향상시킨다. 최종적으로, 이들 제형은 또한 내인성 항미생물 펩타이드의 효과를 향상시킬 수 있다. 항미생물 펩타이드를 개발하여 사람에서 미생물을 박멸하는데 사용하는 경우, 내인성 항미생물 펩타이드는 사람 내인성 단백질로부터 기원한다. 말, 소, 돼지 또는 가금류와 같은 다른 동물에도 동일하게 적용된다. 항미생물 펩타이드는 혈장, 혈액, 결합 조직 및 구성 세포에 존재하는 펩타이드 및/또는 단백질의 구조에 기초할 수 있으며 헤파린 결합 단백질; 라미닌 동형, 폰 빌레블란트 인자(von Willebrand factor), 비트로넥틴, 단백질 C 억제제, 피브로넥틴, 응고 인자, 성장 인자, 케모킨, 히스티딘-풍부 당단백질, 키니노겐 또는 보체 인자 C3로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 항미생물 펩타이드는 헤파린에 대해 약 10nM 내지 약 20μM의 결합 친화성(Kd)을 지닌다.

당해 펩타이드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 아미노산 잔기의 크기를 지닐 수 있다. 펩타이드의 길이 및 서열은, 항미생물 펩타이드의 기원, 펩타이드를 사용하여 미생물을 예방하거나, 억제하거나, 감소시키거나, 또는 파괴하는 경우 퇴치할 미생물의 종류, 미생물이 존재하는 환경의 유형, 및 미생물 펩타이드가 투여후 직면하게될 환경의 유형에 따른다.

제 1 양태에 따라, 본 발명은 키니노겐 단백질 또는 히스티딘-풍부 당단백질를 기본으로 하는 항미생물 펩타이드에 관한 것이며, 여기서, 아미노산 잔기중 20% 이상이 H이다. 항미생물 펩타이드는 30, 40 또는 심지어 50% 이상의 H, R 및/또는 K 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정의 예에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 잔기는 H이다. 예를 들어, 항미생물 펩타이드는 서열번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 당해 펩타이드는 비-항미생물 단백질 키니노겐 및 히스티딘-풍부 당단백질의 헤파린-결합 도메인으로부터 각각 기원하며 H 잔기가 풍부한다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 본 발명은 보체 인자 단백질에 기초한 항미생물 펩타이드에 관한 것이다. 예를 들어, 항미생물 펩타이드는 서열, 5, 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 서열번호 5, 6 및 7 펩타이드는 보체 인자 C3 분자의 잘 정의된 나선 분절로부터 기원한다. 휴글리(Hugli) 및 공동 연구자에 의해 밝혀진 바와 같이[참조: Chazin et al., (1988) Biochemistry 27,9139-48, Hugli, Current topics in Microbiology and Immunology, 1989, 153, 181-208], C3-기원한 C3a 분자의 나선 영역은 19 내지 28번 분절(서열번호 5로 나타냄) 및 47 내지 70번 분절(서열번호 6 및 7로 나타냄)로 정의된다. 홀로단백질(holoprotein) C3는 항미생물 효과를 나타내지 않는다. C3로부터 기원한 펩타이드 분절의 헤파린 결합 및 항미생물 능력은 최근에 기술되어 있다(참조: Andersson et al., Eur J Biochem, 2004, 271; 271: 1219-1226).

제 3의 양태에 따라서, 본 발명은 라미닌 단백질의 그룹으로부터 기원한 항미생물 펩타이드에 관한 것이다. 예를 들어, 항미생물 펩타이드는 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 라미닌 α-쇄 LG-도메인은 헤파린 및 기타 세포-표면 수용체에 대한 결합 부위로서 동정된 5개(1-5)의 LG-모듈로 구성되어 있다(참조: Timpl., et al., Matrix Biol, 2000, 19, 309-317). 이들 모듈 단백질은 상처 치유와 같은 발달 과정동안 합성되며 LG-모듈의 단백질분해 과정은 이러한 상태동안에 일어나는 것으로 기술되어 있다. 앞서 기술되지 않는 LG-모듈의 헤파린-결합 에피토프의 항미생물 작용은 최근에 기술되었다(참조: Andersson et al., Eur J Biochem, 2004, 271; 271: 1219-1226).

비록 펩타이드가 내인성 단백질로부터 기원한다해도, 이들은 반합성 또는 심지어 합성 펩타이드로서 및 미생물속에서 생산될 수 있다.

항미생물 펩타이드는 1 내지 100개 아미노산 잔기, 5 내지 50개 아미노산 잔기 또는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30개 아미노산 잔기와 같은 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 연장될 수 있다. 이러한 추가의 아미노산은 비-항미생물 단백질로부터 기원한 항미생물 펩타이드의 서열에 연속된 서열을 중복시킬 수 있다. 가해질 잔기의 수는 펩타이드의 안정성, 독성, 치료할 포유동물, 또는 생성물 내에 펩타이드 가 있어야할 위치, 항미생물 펩타이드가 기초로 하는 펩타이드 구조를 포함하는, 퇴치할 미생물의 종류에 따른다. 펩타이드에 가해질 아미노산 잔기의 수는 또한 생산방법의 선택, 예를 들면, 발현 벡터 및 발현 숙주 및 항미생물제/약제학적 조성물의 제조 선택에 의존한다. 연장은 펩타이드의 항미생물 효과를 파괴하지 않는 한 항미생물 펩타이드의 N- 또는 C-말단부 또는 이들 말단부 둘다에서 이루어질 수 있다. 항미생물 펩타이드는 또한 융합 단백질일 수 있으며, 여기서, 항미생물 펩타이드는 다른 펩타이드에 융합된다.

또한, 항미생물 펩타이드는 다른 펩타이드, 단백질, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 다른 유기 화합물 또는 무기 물질과 같은 다른 공지된 항미생물 펩타이드 또는 기타 물질에 작동가능하게 결합될 수 있다. 예를 들어, 항미생물 펩타이드는 항미생물 펩타이드가 미생물을 억제하거나, 예방하거나, 또는 이의 삶을 파괴시키기 전에 포유동물내에서 분해되는 것으로부터 항미생물 펩타이드를 보호하는 물질과 커플링시킬 수 있다.

따라서, 항미생물 펩타이드는 아실화, 아세틸화, 페길화(PEGylation), 알킬화 등에 의해 N-말단부에서 및 아미드화 또는 에스테르화에 의해 C-말단부에서 변형시킬 수 있다.

또한, 비-항미생물 홀로-단백질의 기능성 항미생물 분절로부터 기원한 펩타이드를 1개 내지 6개 아미노산의 치환에 의해 변형시킬 수 있다.

항미생물 펩타이드에 의해 억제되거나, 예방되거나, 또는 파괴되는 미생물의 예는 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 그람-양성 및 그람-음성 세균, 바이러스, 기생충, 진균 및 효모, 예를 들면, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis)이다.

항미생물 펩타이드는 사람 세포, c-DNA, 게놈성 클론과 같이 천연적으로 존재하는 공급원으로부터 수득되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 세포 공급원으로부터 발현 산물로서 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다.

항미생물 펩타이드는 자동화 공정에 의한 합성을 포함하는 표준 화학 방법에 의해 합성할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드 유사체는 커플링 제제로서 HATU (N- [디메틸아미노-1H-1.2.3.-트리아졸로[4,5-B]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드) 또는 HOAt-1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸과 같은 다른 커플링제를 사용하는 표준 고체상 Fmoc 보호 방법을 기초로 합성한다. 당해 펩타이드를, 적절한 스캐빈저를 함유하는 트리플루오로아세트산을 지닌 고체상 수지로부터 잘라내며, 이는 또한 측쇄 작용 그룹을 탈보호시킨다. 조 펩타이드는 또한 분취용(preparative) 역상 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제한다. 분배 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 전기영동 또는 이온-교환 크로마토그래피와 같은 기타 정제 방법을 사용할 수 있다. 당해 분야에 공지된 다른 합성 기술, 예를 들면, tBoc 보호 방법, 또는 상이한 커플링 시약 등의 사용을 이용하여 동등한 펩타이드를 생산할 수 있다.

펩타이드를 재조합 제조(참조: 미국 특허 제5,593,866호)에 의해 다르게 합성할 수 있다. 이. 콜라이와 같은 세균, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아(pichia)와 같은 효모, Sf9와 같은 곤충 및 CHO 또는 COS-7과 같은 포유동물 세포를 포함하는 각종의 숙주 시스템이 펩타이드 유사체의 생산에 적합하다. 숙주 각각에 사용될 이용가능한 많은 발현 벡터가 존재하며, 본 발명은 벡터 및 숙주가 항미생물 펩타이드를 생산할 수 있는 한 이중 어느 것에 한정되지 않는다. 이. 콜라이내에서 클로닝 및 발현시키기 위한 벡터 및 과정은 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al. (Molecular Cloning.: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1987) 및 Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., 1995]에서 찾을 수 있다.

최종적으로, 펩타이드는 혈장, 혈액, 각종 조직 등으로부터 정제할 수 있다. 당해 펩타이드는 내인성일 수 있거나, 정제된 단백질의 효소적 또는 화학적 분해 후 생성될 수 있다. 예를 들어, 헤파린 결합 단백질은 트립신에 의해 분해될 수 있으며 수득되는 항세균 특성은 또한 대규모로 분리될 수 있다.

항미생물 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 숙주에 적합한 발현 벡터내로 도입된다. 바람직한 양태에서, 유전자를 벡터내로 클로닝시켜 융합 단백질을 생성한다. 펩타이드 서열의 분리를 촉진시키기 위해, 화학적 분해(예: CNBr) 또는 효소적 분해(예: V8 프로테아제, 트립신)에 민감한 아미노산을 사용하여 펩타이드와 융합 파트너를 브릿지한다. 이. 콜라이내에서 발현시키기 위해, 융합 파트너는 바람직하게는 봉입체 형성에 대해 발현을 지시하는 정상 세포내 단백질이다. 이 경우, 분해시켜 최종 생성물을 방출시킨 후, 펩타이드의 재생은 요구되지 않는다. 본 발명에서, 융합 파트너 및 펩타이드 유전자를 포함하는 DNA 카세트는 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 숙주내에서 삽입된 DNA 서열의 효율적인 전사를 촉진하는 유도성 또는 구성적 프로모터를 함유하는 플라스미드이다.

발현 벡터는 칼슘-매개된 기술, 전기영동 또는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 기타 방법에 의해 숙주내로 도입될 수 있다. 항미생물 펩타이드를 암호화하는 서열은 포유동물 세포, 기존 cDNA 또는 게놈성 클론과 같은 천연 공급원으로부터 유도되거나 합성될 수 있다. 사용될 수 있는 하나의 방법은 항미생물 DNA 주형의 5' 및 3' 말단으로부터 기원하고 벡터의 클로닝 부위에 대해 선택된 제한 부위를 통상적으로 도입한 증폭 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 항미생물 펩타이드를 증폭시키는 것이다. 경우에 따라, 해독 개시 및 종결 코돈을 프라이머 서열로 가공할 수 있다. 항미생물 펩타이드를 암호화하는 서열이, 코돈의 선택이 치료될 최종 포유동물을 고려하여 제조되는 한, 특정 숙주내에서 발현을 용이하게 하기위해 코돈-최적화시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항미생물 펩타이드가 세균내에서 발현되는 경우, 코돈은 세균에 대해 최적화된다.

발현 벡터는 프로모터 서열을 함유함으로써 도입된 미생물 펩타이드의 발현을 촉진한다. 경우에 따라, 하나 이상의 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 서열, 분비 시그날 서열, 복제 오리진, 선별가능한 마커 등과 같은 조절 서열이 또한 포함될 수 있다. 조절 서열은 각각 서로 작동가능하게 결합하여 전사 및 후속적인 해독을 가능하도록 한다. 항미생물 펩타이드가 세균내에서 발현되는 경우, 조절 서열은 세균내에서 발현되도록 설계되고 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 것들이다. 구성적 프로모터 및 유도성 프로모터와 같은 적합한 프로모터가 광범위하게 이용될 수 있으며 T5, T7, T3, SP6 파아지 및 trp, lpp 및 lac 오페론으로부터의 프로모터를 포함한다.

항미생물 펩타이드를 함유하는 벡터를 세균내에서 발현시키는 경우, 오리진의 예는 낮은 카피수를 가져오는 것들 또는 높은 카피 수를 가져오는 것들, 예를 들면, f1-ori 또는 col E1 ori이다.

바람직하게는, 플라스미드는 숙주내에서 작용성인 하나 이상의 선택가능한 마커를 포함하며, 이는 형질전환된 세포를 동정하고/하거나 선택적으로 성장하도록 한다. 세균 숙주용으로 적합한 선택가능한 마커 유전자는 암피실린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자 및 당해 분야에 공지된 다른 것들을 포함한다.

세균내에서 발현시키기 위한 플라스미드의 예는 pET 발현 벡터 pET3a, pET 1 la, pET 12a-c 및 pET 15b(위스콘신주 메디슨 소재의 Novagen으로부터 시판)을 포함한다. 저 카피 수 벡터(예: pPD100)은 이. 콜라이 숙주에 유해한 펩타이드의 효율적인 과생산을 위해 사용할 수 있다(참조: Dersch et al. , FEMS Microbiol. Lett. 123:19, 1994).

적합한 숙주의 예는 세균, 효모, 곤충 및 포유동물 세포이다. 그러나, 흔히 이. 콜라이와 같은 세균을 사용한다.

발현된 항미생물 펩타이드는 친화성, 크기 배출 또는 이온 교환 크로마토그래피, HPLC 등과 같은 통상의 분리 기술로 분리한다. 다른 정제 기술은 문헌[참조: A Biologist's Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry (eds. Wilson and Golding, Edward Arnold, London, or in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc)]에서 찾을 수 있다.

항미생물제 /약제학적 조성물

추가로, 본 발명은 위에서 기술한 바와 같은 항미생물 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 완충제, 담체, 보조제 또는 부형제를 포함하는 항미생물제/약제학적 조성물에 관한 것이다. 추가의 화합물이 조성물에 포함될 수 있다. 이들은 예를 들면, EDTA, EGTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제를 포함한다. 충분히 저장 안정성이고 사람 및 동물에 투여하기에 적합한 항미생물제/약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 방식으로 제조할 수 있다. 약제학적 조성물은 동결 건조, 분무 건조 또는 분무 냉각을 통해 동결건조시킬 수 있다.

"약제학적으로 허용되는"은 활성 성분, 즉, 항미생물 펩타이드(들)의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않는 무독성 물질을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 완충제, 담체 또는 부형제는 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R Gennaro, Ed. , Mack Publishing Company (1990) and handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)].

용어 "완충제"는 pH를 안정화시킬 목적의 산-염기 혼합물을 함유하는 수용액을 의미하는 것으로 의도된다. 완충제의 예는 트리즈마, 비킨, 트리킨, MOPS, MOPSO, MOBS, 트리스, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO, TES, 트리킨이다.

용어 "희석제"는 약제학적 제제속에 펩타이드를 희석시킬 목적의 수성 또는 비-수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 하나 이상의 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예: 잇꽃 오일, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 면화씨 오일 또는 참깨 오일)일 수 있다.

용어 "보조제"는 펩타이드의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제형에 가해진 특정 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 보조제는 상이한 음이온과의 아연, 구리 또는 은 염 중의 하나 이상, 예를 들면, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 티오시아네이트, 설파이트, 하이드록사이드, 포스페이트, 카르보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르트레이트 및 상이한 아실 조성물의 아세테이트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

부형제는 하나 이상의 탄수화물, 중합체, 지질 및 무기물일 수 있다. 탄수화물의 예는 예를 들면, 동결건조를 용이하게 하기 위해 조성물에 첨가되는 락토즈, 슈크로즈, 만니톨 및 사이클로덱스트린을 포함한다.

중합체의 예로는 전분, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 카복실메틸셀룰로즈, 알기네이트, 카라기난, 하이알루론산, 폴리아크릴산, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 가수분해도가 상이한 폴리비닐알콜/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈 (분자량이 상이한 것 모두)이 있으며, 예를 들면, 점도 조절를, 생체부착을 달성하기 위해 또는 화학 및 단백질분해적 분해로부터 지질을 보호하기 위해 조성물에 가해진다. 지질의 예로는 지방산, 인지질, 모노-, 디- 및 트리글리세라이드, 세라미드, 스핑고지질 및 당지질 (상이한 아실 쇄 길이와 포화도를 가진 것 모두), 달걀 레시틴, 대두 레시틴, 수소화된 달걀 및 대두 레시틴이 있으며, 중합체에 대한 이유와 유사한 이유로 조성물에 가해진다. 무기물의 예로는 활석, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티탄이 있으며, 이들을 조성물에 가하여 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 잇점을 수득한다.

담체의 특성은 투여 경로에 따른다. 투여의 한가지 경로는 국소 투여이다. 예를 들어, 국소 투여의 경우, 바람직한 담체는 활성 펩타이드를 포함하는 유화된 크림이나, 특정의 석유/무기물계 및 식물성 연고와 같은 다른 통상의 담체, 및 중합체 겔, 액체 결정성 상 및 미세유액을 사용할 수 있다.

항미생물제/약제학적 조성물은 당해 항미생물제/약제학적 조성물속에 1,2,3 또는 4개의 상이한 펩타이드와 같은 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 상이한 펩타이드의 조합을 사용함에 의해 항미생물 효과를 증가시키고 박멸하기 위한 미생물이 항미생물제에 대한 내성 및/또는 관용성일 수 있는 가능성을 감소시킬 수 있다.

특히 짧은 펩타이드로서 히스티딘-풍부 펩타이드 및/또는 키니노겐계 펩타이드는 제한된 항미생물 활성을 지닌다. 그러나, 이들 펩타이드가 염을 포함하고/하거나 pH가 약 5.0 내지 약 7.0인 조성물속에 존재하는 경우, 당해 펩타이드는 활성이 되는데, 즉, 향상된 효과는 염을 첨가하고/하거나 특정 pH 범위를 선택함으로써 수득된다.

염으로서의 펩타이드는 염산, 황산, 질산, 브롬화수소산, 인산, 퍼클로르산, 티오시안산, 붕산 등과 같은 무기산 또는 포름산, 아세트산, 할로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 시트르산, 타르타르산, 석신산, 글루콘산, 락트산, 말론산, 푸마르산, 안트라닐산, 벤조산, 신남산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산, 설파닐산 등과 같은 유기산과의 산 부가물일 수 있다. 모두 상응하는 음이온과의 일가 나트륨, 칼륨 또는 이가 아연, 마그네슘, 구리, 칼슘과 같은 무기 염을 첨가하여 항미생물 조성물의 생물학적 활성을 증진시킬 수 있다. 키니노겐 및 히스티딘-풍부 당단백질을 기본으로 하는 H가 풍부한 항미생물 펩타이드를, pH가 한정되고 조절된(예: pH 5.5 내지 6.0) 겔과 같은 한정된 용액 속에서 사용하여, 항미생물 펩타이드의 효과를 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 이온성 환경의 존재 또는 부재하에, 약 5.0 내지 약 7.0, 예를 들어 약 5.5 내지 약 6.0의 pH의 한정된 pH를 갖는 겔, 연고 또는 붕대는 항미생물 펩타이드의 작용을 향상시키고, 조절하며 국재화시킬 것이다.

본 발명의 항미생물제/약제학적 조성물은 또한 리포좀의 형태일 수 있으며, 이때, 당해 펩타이드는 다른 약제학적으로 허용되는 담체외에, 미셀, 불용성 단층 및 액체 결정으로서 응집된 형태로 존재하는 지질과 같은 양친매성 제제와 배합된다. 리포좀 제형으로 적합한 지질은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 라이소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 리포좀 제형의 제조는 예를 들면, 미국 특허 제4,235,871호에서 찾을 수 있다.

본 발명의 항미생물제/약제학적 조성물은 생체분해가능한 미세구의 형태일 수 있다. 폴리(락트산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), PLA 및 PGA의 공중합체(PLGA) 또는 폴리(카프롤락톤)(PCL), 및 폴리안하이드라이드와 같은 지방족 폴리에스테르가 미세구의 제조시 생체분해가능한 중합체로서 광범위하게 사용되어 왔다. 이러한 미세구의 제조는 미국 특허 제5,851,451호 및 유럽 특허 제0213303호에서 찾을 수 있다.

달리는, 항미생물 펩타이드는 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예: 잇꽃 오일, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 면화씨 오일 또는 참깨 오일), 트라가칸트 검 및/또는 각종 완충제속에 용해시킬 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항미생물 펩타이드의 작용을 강화시키기 위한 이온 및 규정된 pH를 포함할 수 있다.

항미생물제/약제학적 조성물은 멸균과 같은 통상의 약제학적 공정에 적용시킬 수 있고/있거나 본원에 또한 기술된 것으로서 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 완충제, 충전제 등과 같은 통상의 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 항미생물제/약제학적 조성물은 국소적으로 또는 전신계로 투여될 수 있다. 투여 경로는 국소, 안내, 비강, 폐내, 볼내, 비경구(정맥내, 피하내 및 근육내), 경구, 비경구, 질내 및 직장내 투여를 포함한다. 삽입물(implant)로부터의 투여도 또한 가능하다. 적합한 항미생물 제제 형은 예를 들면, 입제, 산제, 정제, 제피 정제, (마이크로) 캅셀제, 좌제, 시럽제, 유제, 미세유제(물, 오일 및 표면활성제로 이루어진 광학적으로 등방성인 열역학적으로 안정한 시스템으로 정의됨), 액체 결정성 상(장기 범위 질서적이나 단기 범위 무질서인 것으로 특징화되는 시스템으로 정의됨)(예를 들면, 수- 또는 오일 연속성인 라멜라, 6각형 및 입방체 상을 포함한다) 또는 이들의 분산된 대응물, 겔제, 연고제, 분산제, 현탁제, 크림제, 에어로졸제, 앰플 형태의 주사가능한 용액 또는 점적제, 및 활성 화합물이 연장 방출되는 제제이며, 이러한 제제속에서 부형제, 희석제, 보조제 또는 담체는 통상적으로 상기 기술된 바와 같이 사용된다. 약제학적 조성물은 또한 붕대 또는 플라스터 등으로 제공될 수 있다.

약제학적 조성물은 환자에게 약제학적 유효 투여량으로 투여될 것이다. "약제학적 유효 투여량"은 당해 약제학적 조성물이 투여되는 상태와 관련하여 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 투여량을 의미한다. 정확한 투여량은 화합물의 활성, 투여 방식, 장애의 특성 및 중증도, 환자의 연령 및 체중에 따르며 상이한 투여량이 요구될 수 있다. 당해 투여량의 투여는 1개 용량 단위 또는 수개의 작은 용량 단위의 형태로 단일 투여에 의해 및 또한 특정 간격으로 분할된 용량의 다수 투여에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로, 또는 항세균제, 항진균제, 항바이러스제 및 항기생충제와 같은 항생제 또는 방부제와 같은 기타 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예에는 페니실린, 세팔로스포린, 카르바세펨, 세파마이신, 카르바페넴, 모노박탐, 아미노글리코사이드, 글리코펩타이드, 퀴놀론, 테트라사이클린, 마크롤라이드 및 플루오로퀴놀론이다. 방부제는 요오드, 은, 구리, 클로르헥시딘, 폴리헥사나이드 및 기타 비구아나이드, 키토산, 아세트산, 및 과산화수소를 포함한다. 이들 제제는 동일한 약제학적 조성물의 일부로 혼입되거나 별개로 투여될 수 있다.

본 발명은 사람 및 다른 동물 중에서 말, 개, 고양이, 소, 돼지, 낙타와 같은 기타 포유동물 둘다에 관한 것이다. 즉, 당해 방법은 사람 치료요법 및 가축 치료 둘다에 적용가능하다. 이러한 치료에 적합한 대상은 열, 맥박, 생물체 배양 등과 같은 감염의 잘 확립된 특징으로 확인할 수 있다. 항미생물 펩타이드로 치료할 수 있는 감염은 미생물에 의해서 또는 미생물에 기인하여 유발된 것들을 포함한다. 미생물의 예는 세균(예: 그람-양성, 그람-음성), 진균(예: 효모 및 곰팡이), 기생충(예: 원생동물, 선충류, 촌충류 및 흡충류), 바이러스 및 프리온(prion)을 포함한다. 이러한 부류의 특정 생물체는 잘 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Davis et al., Microbiology, 3.sup.rd edition, Harper & Row, 1980). 감염은 만성 피부 궤양, 감염된 급성 상처 및 화상, 감염된 피부 습진, 고름 딱지증, 아토피성 피부염, 여드름, 외이도염, 질 감염, 지루성 피부염, 경구 감염 및 치주염, 칸디다 간찰진, 결막염 및 기타 눈 감염, 및 폐렴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

따라서, 항미생물제/약제학적 조성물은 수술 후 및 피부 외상 후 화상의 예방적 치료에 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 콘택트렌즈, 정형외과 이식물 및 카테터와 같이 인체와 접촉하는 외부 물질의 처리 및 보관을 위해 의도된 용액속에 포함될 수 있다.

추가로, 항미생물제/약제학적 조성물은 아토피성 피부염, 고름딱지증, 만성 피부 궤양, 감염된 급성 상처 및 화상, 여드름, 외이도염, 진균 감염, 폐렴, 지루성 피부염, 칸디다 간찰진, 칸디다 질염, 입인두 칸디다증, 눈 감염(세균성 결막염), 및 비강 감염(MRSA 수송)의 치료에 사용할 수 있다.

항미생물제/약제학적 조성물은 또한 렌즈 소독제 및 보관 용액과 같은 세정 용액에 사용되거나 비뇨 카테터 용도 및 중심 혈관 카테터의 사용과 관련하여 세균 감염을 예방하는데 사용될 수 있다.

또한, 항미생물 조성물은 석고, 부착제, 봉합에서의 수술후 감염을 예방하는데 사용하거나, 상처 드레싱에 혼입시킬 수 있다.

항미생물 펩타이드는 또한 중합체, 직물 등에 사용하여 항세균 표면 또는 화장품을 생성시킬 수 있으며, 개인용 보호 제품(비누, 샴푸, 치약, 항-여드름제, 선크림, 탐폰, 기저귀 등)에 항미생물제/약제학적 조성물을 보충시킬 수 있다.

항미생물 사람 펩타이드 및/또는 단백질을 확인하는 방법

본 발명은 또한 포유동물에 침입한 미생물에 대해 효과적이고 낮은 알레르기항원성을 갖는 새로운 세트의 항미생물 펩타이드를 사람과 같은 포유동물에게 제공할 가능성이 있는 하나 이상의 항미생물 펩타이드를 확인하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 의해 새로이 개선된 항미생물 특성이 유용하게 될 것이며, 이는 시판되는 항생제에 대해 현재 일반적인 내성 및/또는 관용성 문제를 감소시키거나 심지어 제거하는 항미생물제의 광범위한 수집을 제공한다.

당해 방법은 내인성 펩타이드 및/또는 단백질을 제공하는 단계, 헤파린을 제공하는 단계, 내인성 펩타이드 및/또는 단백질을 헤파린과 혼합하여 펩타이드 및/또는 단백질 헤파린 복합체를 생성시키는 단계, 당해 펩타이드 및/또는 단백질 헤파린 복합체를 검출하는 단계 및 항미생물성 사람 내인성 펩타이드 및/또는 단백질을 확인하는 단계를 포함한다. 또한, 니켈세파로즈와 같은 니켈을 헤파린대신 사용할 수 있다. 헤파린은 용액속에 존재하거나, 매트릭스에 연결될 수 있다. 후자의 경우, 헤파린은 분리 목적(h.p.l.c 또는 f.p.l.c) 또는 바이오코어 분석에 접합하다. 분리 목적의 경우, 헤파린-세파로즈, 또는 유사한 매질을 사용할 수 있다. 항미생물 펩타이드는 또한 다른 글리코사미노글리칸과 상호작용하므로, 신규한 항미생물 펩타이드를 정제하기 위해 더마탄 또는 헤파란 설페이트와 같은 분자를 사용하는 것도 가능하다. 헤파린, 헤파란 설페이트, 및 더마탄 설페이트는 산재되고 공간적으로 한정된 설포- 또는 카복실-그룹을 함유한다. 원칙적으로, 이러한 글리코사미노글리칸과 같은 유사한 상호작용 능력의 어떠한 다른 중합체성 화합물도 항미생물 펩타이드의 특정 결합을 위해 사용할 수 있다. 추가로, H가 풍부한 펩타이드를 니켈-세파로즈 또는 유사 매질에서 단독으로 또는 헤파린-크로마토그래피와 조합하여 정제할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 어떠한 방식, 유형 또는 형태로 명확하게 또는 함축적으로 본 발명을 나열하기 위한 것이나, 이에 한정되지는 않는다.

미생물

만성 정맥 궤양으로부터 입수한 엔테로코쿠스 파에칼리스 2374, 에스케리키아 콜라이 37.4, 슈도모나스 아에루기노사 27.4, 및 아토피성 습진 환자로부터 입수한 진균 칸디다 알비칸스 BM 4435를 본 실험에서 사용하였다.

실시예 1

항미생물 펩타이드

하기 서열 목록 및 표 1에 나타낸 미생물 펩타이드는 Innovagen AB (Ideon, SE-22370, Lund, Sweden)에 의해 합성되었다. 이들 펩타이드의 순도 및 분자량은 질량 분광 분석(MALDI.TOF Voyager)로 확인하였다.

실시예 2

아르기닌과 라이신이 풍부한 펩타이드의 항세균 효과

도 1은 엔테로코쿠스 파에칼리스에서 아르기닌과 라이신이 풍부한 펩타이드(서열 목록)의 살세균 효과를 기술한다. 세균을 토드-에빗(Todd-Hewitt: TH) 배지에서 중-대수기 상태로 성장시켰다. 세균을 세척하고 5mM 글루코스를 함유하는 10mM 트리스, pH 7.4 속에서 희석시켰다. 세균(50㎕; 2x10⁶ cfu/ml)을 37℃에서 2시간 동안, 0.03 내지 60μM 범위 농도의 합성 펩타이드와 함께 항온배양하였다. 살세균 활성을 정량화하기 위해, 항온배양 혼합물의 일련의 희석물을 TH 아가에 평판배양한 후 37℃에서 밤새 항온배양하고 콜로니 형성 단위의 수를 측정하였다.

이. 파에칼리스(분리체 2374)의 2 x 10⁶ 개 콜로니-형성 단위(CFU) x ml^-1을 0.03 내지 60μM 범위의 농도의 펩타이드와 함께 50㎕에서 항온배양하였다 (A) 합성 펩타이드는 라미닌으로부터 기원하였다. α5 쇄의 LG-도메인으로 부터의 펩타이드(PPP25: 서열번호 13, LGT25: 서열번호 12, RLR22: 서열번호 14, PGR11: 서열번호 15) 및 α1 쇄(SRN16: 서열번호 8, SRN29: 서열번호 9, KDF15: 서열번호 10, SAV15: 서열번호 11)의 효과를 나타낸다. 하나의 펩타이드(RIQ18: 서열번호 16)은 β1 쇄로부터 기원한다. (B) 3개의 펩타이드는 보체 인자 C3(LRK 26: 서열번호 5, LGE27: 서열번호 6 및 CNY21: 서열번호 7), 비트로넥틴으로부터의 AKK15, 단백질 C 억제제로부터의 SEK20: 서열번호 19, 피브로넥틴으로부터의 QPP18: 서열번호 17, 및 폰 빌레브란트 인자로부터의 YIG23: 서열번호 18로 부터 기원하였다. (C) 헤파린-결합 콘센서스 서열 (AKKARA)_n (n = 1-4) 및 (ARKKAAKA)_n (n = 1-3)의 항세균 효과. n=l 펩타이드는 항미생물 효과를 전혀 나타내지 않았다. 헤파린과 상호작용하지 않는 펩타이드; GHRPLDKKREEAPSLRPA, LVTSKGDKELRTGKEKVTS 및 KNNQKSEPLIGRKKT(참조: Andersson et al. , Eur J Biochem, 2004, 271; 271: 1219-1226)는 항미생물성이 아니었다.

실시예 3

항미생물 펩타이드의 방사 확산 검정 분석(표 2)

방사 확산 검정(RDA)을 본질적으로 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다(참조: Andersson et al., Eur J Biochem, 2004, 271:1219-1226). 요약하면, 세균(이. 콜라이) 또는 진균(씨, 알비칸스)를 10ml의 완전 농도(3% w/v) 트립티카제 대두 브로쓰(TSB)(미들랜드주 콕키스빌 소재의 Becton-Dickinson 제조원)속에서 중간-대수기 상으로 성장시켰다. 미생물을 10mM 트리스, pH 7.4로 1회 세척하고, 4 x 10⁶ 세균 cfu 또는 1 x 10⁵ 진균 cfu를 0.03%(w/v) TSB, 1% (w/v) 저-전자엔드오스모시스타입(low-electroendosmosistype)(Low-EEO) 아가로즈(미쥬리주 세인트루이스 소재의 Sigma 제조원) 및 0.02% (v/v)의 최종 농도의 트윈 20 (Sigma 제조원)으로 이루어진 언더레이(underlay) 아가로즈 겔 5ml에 가하였다. 당해 언더레이를 Φ85mm 페트리 디쉬에 부었다. 아가로즈를 고화시킨 후, 4mm 직경의 웰을 펀칭하고 6㎕의 시험 샘플을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 항온배양하여 펩타이드가 확산되도록 한다. 이후에 언더레이 겔을 5ml의 용융된 오우버레이(overlay)(dH₂O중 6% TSB 및 1% 저-EEO 아가로즈)로 도포하였다. 펩타이드의 항미생물 활성은 37℃에서 18 내지 24시간 항온배양한 후 각각의 웰 주변의 선명한 영역으로 가시화된다. 합성 펩타이드를 100μM 농도에서 시험하여 공지된 펩타이드 LL-37에 대한 항세균 효과를 측정하였다. 실험간의 변동을 최소화시키기 위해, LL-37 표준물(100μM)을 각각의 플레이트에 포함시켰다. 당해 펩타이드의 활성은 방사 확산 단위[(선명한 영역의 직경(mm) - 웰 직경) x 10]로 나타낸다. 결과는 하기 표 2에 나타낸다.

실시예 4

이. 콜라이 및 씨. 알비칸스에 대한 펩타이드의 방사 확산 검정(도 2)

도 2는 항미생물 펩타이드 세트를 사용한 방사 확산 검정을 나타낸다. 당해 검정은 상기와 같이 수행하였다. 펩타이드의 항미생물 활성은 이. 파에칼리스 세균(패널 A)의 경우 37℃에서 및 칸디다 알비칸스(패널 B)의 경우 28℃에서 18 내지 24시간 항온배양한 후 각각의 웰 주변의 선명한 영역으로 가시화되었다.

실시예 5

히스티딘-풍부 펩타이드의 항세균 효과

도 3은 히스티딘-풍부 펩타이드의 살세균 효과를 기술한다. 이. 파에칼리스 세균을 토드-헤빗(TH) 배지에서 중-대수기 상으로 성장시켰다. 세균을 세척하고, 50μM ZnCl의 존재 또는 부재하에 5mM 글루코즈를 함유하는 10mM 트리스, pH 7.4에서, 또는 10mM MES-완충액, 5mM 글루코즈, pH 5.5에서 희석시켰다. 세균(50㎕; 2x10⁶ cfu/ml)을 37℃에서 2시간 동안, 0.03 내지 60μM (아연의 존재 또는 부재하의 트리스-완충액), 또는 30 및 60μM(트리스 및 MES-완충액) 범위의 농도에서 합성 펩타이드와 함께 항온배양하였다. 세균 활성을 정량화하기 위해, 항온배양 혼합물의 일련의 희석물을 TH 아가에 평판배양한 후 37℃에서 밤새 항온배양하고 콜로니-형성 단위의 수를 측정하였다. (A): 50μM ZnCl의 존재 또는 부재하에 히스티딘-풍부 당단백질(GHH20: 서열번호 4) 및 키니노겐(KHN20: 서열번호 3, GGH20: 서열번호 2 및 HKH20: 서열번호 1)의 헤파린-결합 도메인으로부터의 펩타이드의 효과를 나타낸다. (B): 5mM 글루코즈를 함유하는 10mM 트리스, pH 7.4, 또는 10mM MES-완충액, 5mM 글루코즈, pH 5.5 중 펩타이드(30 및 60μM)의 효과. 수는 100%를 대조군(펩타이드 부재)으로 한 경우의 생존 %을 나타낸다. (C): 고정된 펩타이드/아연 몰비(1:100)의 존재하에 이. 파에칼리스에서 펩타이드 AHH24:1 및 AHH24:2의 효과. 아연 부재하에 펩타이드는 항미생물 활성을 나타내지 않았다.

실시예 6

펩타이드 효과의 전자현미경에 의한 분석

도 4는 항미생물 펩타이드에 속하는 슈도모나스 아에루기노사 세균의 전자 현미경 분석을 나타낸다. (A) 대조군. (B-H) 필요한 살세균 농도의 약 50%에서 펩타이드로 처리한 세균의 분석. HKH20을 또한 200%에서 분석하였다. 200%의 살세균 농도에서 (B) LL-37, (C) ARK24, (D) SEK20, (E) AKK24, (F) LGT25, (G)HKH20, (H) HKH20. 바는 G 및 H(0.5㎛)를 제외한 1㎛을 나타낸다. 펩타이드로 처리한 세균의 전자 현미경 분석은, 대조군과 비교하여 처리한 세균의 형태학에 있어서의 명백한 차이를 입증하였다. 카텔리키딘 LL-37은 국소 혼란을 유발하였고 피. 아에루기노사 세균 세포 막을 따라 파괴하였으며, 때때로 세포내 물질이 세포외에서 발견되었고 유사한 발견을 본원에 기술한 내인성 항미생물 펩타이드를 사용하여 수득하였다.

실시예 7

내인성 항미생물 펩타이드의 헤파린 결합(도 5)

펩타이드를 헤파린 활성에 대해 시험하였다. 펩타이드를 니트로셀룰로즈 막(Hybond, Amersham Biosciences 제조원) 상에 적용시켰다. 막을 1시간 동안 차단(PBS, pH 7.4, 0.25% 트윈 20, 3% 소 혈청 알부민)하고 동일한 완충액속에서 1시간 동안 방사표지된 헤파린과 함께 항온배양하였다. 히스티딘-풍부 펩타이드를 50μM ZnCl의 존재 또는 부재하에서 헤파린-결합에 대해 시험하였다. 헤파린의 방사성요오드화를 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다(참조: Andersson et al., Eur J Biochem, 2004, 271; 271:1219-1226). 표지되지 않은 폴리사카라이드(2mg/ml)를 결합의 경쟁를 위해 가하였다. 막을 세척(PBS, pH 7.4, 0.25% 트윈 20중에서 3 x 10분)하였다. Bas 2000 방사성이미지화 시스템(Fuji 제조원)을 사용하여 방사성활성을 가시화하였다. 표지되지 않은 헤파린(6m/ml)은 C3-기원한 펩타이드 LRK26 및 LGE27 및 LL-37(상단 부분)에 대해 ¹²⁵I-헤파린의 결합을 억제하였다.

실시예 8

니켈- 세파로즈상에서 히스티딘-함유 항미생물 단편의 정제(도 6)

펩타이드 에피토프 KHN20, GGH20 및 HKH20을 함유하는 사람 키니노겐의 도메인 D5를 에스케리키아 콜라이 균주(BL21DE3)에서 발현시켰다. 단백질 생산은 대수적으로 성장하는 세균에 1mM 이소프로필-티오-β-D-갈락토시다제를 첨가함으로써 유도하였다. 3시간 항온배양한 후 세균을 원심분리에 의해 수거하였다. 펠렛을 50mM 포스페이트, 300mM NaCl, pH 8.0(완충액 A)속에 재현탁시키고 세균을 동결-해동의 반복된 주기로 용해하였다. 이후에 용해물을 29000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 니켈이 충전된 2ml NiNTA-세파로즈와 혼합하고 완충액 A로 평형을 유지하였다. 세파로즈를 컬럼에 충전하고 0.1% 트리톤 X-100이 들어있는 10ml 완충액 A, 10ml 완충액 A, 1M NaCl이 들어있는 5ml 완충액 A, 5ml 완충액 A, 10ml 20% 에탄올, 5mM 이미다졸이 들어있는 10ml 완충액 A, 및 30mM 이미다졸이 들어있는 완충액 A로 세척하였다. 단백질(화살표)을 500mM 이미다졸속에서 용출시켰다. 당해 도메인은 방사 확산 검정에서 이. 콜라이에 대해 항세균 효과를 나타낸다.

<110> Dermagen AB <120> Novel antimicrobial peptides with heparin binding activity <130> xxxxx <150> SE 0301431-3 <151> 2003-05-19 <150> US 60/320,204 <151> 2003-05-19 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from kininogen <400> 1 His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Asn Gly Lys His 20 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from kininogen <400> 2 Gly Gly His Val Leu Asp His Lys His Gly His Gly His Gly His Lys 1 5 10 15 Asn Lys Gly <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from kininogen <400> 3 Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu Arg Asp Gln Gly His 1 5 10 15 Gly His Gln Arg 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from histidin-rich glycoprotein <400> 4 Gly His His Pro His Gly His His Pro His Gly His His Pro His Gly 1 5 10 15 His His Pro His 20 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from complement factor C3 <400> 5 Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg Phe 1 5 10 15 Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser 20 25 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from complement factor C3 <400> 6 Leu Gly Glu Ala Cys Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile 1 5 10 15 Thr Glu Leu Arg Arg Gln His Ala Arg Ala Ser 20 25 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from complement factor C3 <400> 7 Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His 1 5 10 15 Leu Gly Leu Ala Arg 20 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 8 Ser Arg Asn Leu Ser Glu Ile Lys Leu Leu Ile Ser Gln Ala Arg Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 9 Ser Arg Asn Leu Ser Glu Ile Lys Leu Leu Ile Ser Gln Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser Ala Asp Arg 20 25 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 10 Lys Asp Phe Leu Ser Ile Glu Leu Phe Arg Gly Arg Val Lys Val 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 11 Ser Ala Val Arg Lys Lys Leu Ser Val Glu Leu Ser Ile Arg Thr 1 5 10 15 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 12 Leu Gly Thr Arg Leu Arg Ala Gln Ser Arg Gln Arg Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Trp His Lys Val Ser Val Arg Trp 20 25 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 13 Pro Pro Pro Pro Leu Thr Ser Ala Ser Lys Ala Ile Gln Val Phe Leu 1 5 10 15 Leu Gly Gly Ser Arg Lys Arg Val Leu 20 25 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 14 Arg Leu Arg Ala Gln Ser Arg Gln Arg Ser Arg Pro Gly Arg Trp His 1 5 10 15 Lys Val Ser Val Arg Trp 20 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 15 Pro Gly Arg Trp His Lys Val Ser Val Arg Trp 1 5 10 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from laminin <400> 16 Arg Ile Gln Asn Leu Leu Lys Ile Thr Asn Leu Arg Ile Lys Phe Val 1 5 10 15 Lys Leu <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from fibronectin <400> 17 Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys 1 5 10 15 Pro Gly <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from Von Willebrand Factor <400> 18 Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from protein C <400> 19 Ser Glu Lys Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln 1 5 10 15 Leu Glu Leu Tyr 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 20 Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala 1 5 10 15 Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala 20 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 21 Ala Lys Lys Ala Arg Ala Ala Lys Lys Ala Arg Ala Ala Lys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ala Ala Lys Lys Ala Arg Ala 20 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from vitronectin <400> 22 Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg 1 5 10 15

Claims

라미닌 동형(laminin isoform), 보체 인자 C3, 히스티딘-풍부 당단백질 및 키니노겐으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항미생물 활성이 실질적으로 없는 내인성 포유동물 단백질로부터 기원하며, 10 내지 36개 아미노산 잔기를 가지고, K, R 및 H로 이루어진 그룹 중에서 선택된 4개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진, 헤파린 결합 활성을 갖는 항미생물 펩타이드.
제1항에 있어서, 항미생물 펩타이드가 키니노겐 단백질 또는 히스티딘-풍부 당단백질을 기본으로 하며 아미노산 잔기의 30% 이상이 H인 항미생물 펩타이드.
제2항에 있어서, 항미생물 펩타이드의 50% 이상이 H, K 및/또는 R 아미노산 잔기를 포함하는 항미생물 펩타이드.
제2항 또는 제3항에 있어서, 항미생물 펩타이드가 서열번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항미생물 펩타이드.
제1항에 있어서, 항미생물 펩타이드가 보체 인자 단백질을 기본으로 하는 항미생물 펩타이드.
제5항에 있어서, 항미생물 펩타이드가 서열번호 5, 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항미생물 펩타이드.
제1항에 있어서, 항미생물 펩타이드가 라미닌 단백질을 기본으로 하는 항미생물 펩타이드.
제7항에 있어서, 항미생물 펩타이드가 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항미생물 펩타이드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드가 내인성의 합성 또는 반합성인 항미생물 펩타이드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드(들)가 하나 이상의 다른 항미생물 펩타이드(들) 또는 다른 물질에 연결되어 있는 항미생물 펩타이드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드(들)가 아미드화, 에스테르화, 아실화, 아세틸화, 페길화(PEGylation) 또는 알킬화에 의해 변형된 항미생물 펩타이드.
a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항미생물 펩타이드 및

b) 약제학적으로 허용되는 완충제, 희석제, 담체, 보조제 또는 부형제를 포함하는 항미생물제/약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 염을 포함하는 항미생물제/약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 염이 1가 나트륨 및 칼륨 또는 2가 아연, 마그네슘, 구리, 칼슘으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있는 항미생물제/약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 염이 2가 아연인 항미생물제/약제학적 조성물.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 pH가 약 5.0 내지 약 7.0인 항미생물제/약제학적 조성물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 1, 2, 3 또는 4개의 상이한 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 항미생물제/약제학적 조성물.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항미생물제/약제학적 조성물이 하나 이상의 항생제 및/또는 방부제(들)를 포함하는 항미생물제/약제학적 조성물.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항미생물제/약제학적 조성물이 입제, 산제, 정제, 제피 정제, 캅셀제, 좌제, 시럽제, 유제, 겔제, 연고제, 현탁제, 크림제, 에어로졸제 및 점적제의 형태 또는 주사가능한 형태인 항미생물제/약제학적 조성물.
세균, 바이러스, 기생충, 진균 및 효모로 이루어진 그룹 중에서 선택된 미생물을 예방하거나, 억제하거나, 감소시키거나, 또는 파괴하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항미생물 펩타이드 또는 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항미생물제/약제학적 조성물의 용도.
제20항에 있어서, 치료 또는 진단에 있어서 항미생물 펩타이드 또는 항미생물제/약제학적 조성물의 용도.
세균, 바이러스, 기생충, 진균 및 효모로 이루어진 그룹 중에서 선택된 미생물에 의해 유발된 항미생물 질병 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항미생물 펩타이드 또는 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항미생물제/약제학적 조성물의 용도.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 미생물에 의해 유발된 질병을 치료하기 위한 항미생물 펩타이드 또는 항미생물제/약제학적 조성물의 용도.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 미생물에 의해 유발된 질병을 치료하기 위한 항미생물 펩타이드 또는 항미생물제/약제학적 조성물의 용도.
환자에게 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 미생물에 감염된 포유동물을 치료하는 방법.