KR20060027015A - 클로렐라 바이러스 유래 신규 프로모터 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로렐라 바이러스 유래의 프로모터 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 A 박스 하나 이상 및/또는 (b) 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 B 박스 하나 이상을 함유하는 프로모터, 이를 함유하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류를 이용한 목적단백질을 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 프로모터는 클로렐라에서 외래 유전자를 강력하게 발현하는 기능을 가지고 있어, 클로렐라 및 식물에서 고농도의 재조합단백질을 제조할 수 있다.

클로렐라 바이러스, 프로모터, 형질전환식물, 형질전환 미세조류

Description

클로렐라 바이러스 유래 신규 프로모터 및 그 용도 {Novel Promoter Originated from Chlorella Virus and Use Thereof}

도 1은 한국 담수로부터 분리된 클로렐라 바이러스를 SDS-PAGE한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 클로렐라 바이러스 SS-1; 레인 2: 클로렐라 바이러스 SS-2; 및 레인 3: 클로렐라 바이러스 KH-1).

도 2는 한국 담수로부터 분리된 클로렐라 바이러스의 게놈 DNA를 제한효소로 처리하여 전기영동한 사진으로, a)는 BamHI으로 처리한 사진이고, b)는 HindIII로 처리한 사진이다 (레인 1: 클로렐라 바이러스 SS-1; 레인 2: 클로렐라 바이러스 SS-2; 및 레인 3: 클로렐라 바이러스 KH-1).

도 3은 각 바이러스에 따른 A 박스와 B 박스의 반복 구조를 나타낸 모식도와 각 바이러스의 A 박스 및 B 박스의 핵산 염기서열을 나타낸 것이다.

도 4는 클로렐라 형질전환 재조합벡터인 pCTV의 모식도이다.

도 5는 본 발명에 따른 재조합벡터 pMGFPble, pTGFPble, pKGFPble 및 pSGFPble의 모식도이다.

도 6은 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아에서 GFP의 발현을 형광현미경으로 관찰한 사진이다 (WT: 야생형의 클로렐라; 35S: pMinGFPble로 형질전환된 클로렐 라; ABABA: pTGFPble로 형질전환된 클로렐라; CABA: pKGFPble로 형질전환된 클로렐라; 및 AA: pSGFPble로 형질전환된 클로렐라).

본 발명은 클로렐라 바이러스 유래의 프로모터 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 A 박스 하나 이상 및/또는 (b) 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열 가지는 B 박스 하나 이상을 함유하는 프로모터, 이를 함유하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류를 이용한 목적단백질을 제조방법에 관한 것이다.

형질전환 식물을 이용하여 단백질을 생산하는 것은 응용식물 생명공학의 새로운 분야로서 분자유전학, 식물세포생리학, 식물형질전환 기법을 이용한 분자농업이라고 할 수 있다. 형질전환 기술의 발전으로 1980년대부터 형질전환 식물의 조직으로부터 외래 단백질의 생산과 정제에 관한 보고가 있었으며(Hiatt, A. et al., Nature., 76:78, 1989; Salmon, V. et al., Protein Expr Purif., 127:135, 1998), 형질전환 식물을 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법은 기존의 다른 단백질 발현 시스템보다 이용 가능성이 높은 고가의 단백질을 산업화 수준으로 생산할 수 있다(Zhong, R. et al., Plant Physiol., 53:64, 1999).

이중에서도 최근 단세포 진핵 녹조류인 클로렐라가 생물반응기로서의 활용이 각광받고 있다. 이는 클로렐라가 이종 단백질의 발현에 적합한 시스템을 지녔기 때문이다. 일정량의 빛과 탄소원만 있으면 값싸게 대량 배양이 가능하며 하루에 2~9번 분열하기 때문에 성장속도가 빠르다 (Sorokin, C. et al., Plant Physiol., 179:183, 1958). 또한 진핵생물인 클로렐라는 일반 진핵생물들과 마찬가지로 유전자를 전사한 후 변형 과정을 거치므로, 이종 진핵생물의 유전자로 형질전환시킬 경우, 생물학적 활성을 지닌 단백질을 만들 수 있는 등의 이점이 있다. 클로렐라에서의 동종 또는 이종 구성형 단백질의 일시적인 발현은 1990년대부터 보고되었으며(Javis, E.E. et al., Curr Genet., 317:321. 1991; Dowson, H.N. et al., Curr Microbiol., 356:362. 1997; Hawkins, R.L. et al., Curr Microbiol., 335:341, 1999), 최근에는 클로렐라에서 넙치 성장 호르몬을 안정적으로 발현시킨 연구가 보고되었다 (Kim, D.H. et al., Mar. Biotechnol., 63:73, 2002).

개발가능성을 가진 유전자의 수는 엄청나며 앞으로는 이들의 분리 및 구조해석과 더불어 삽입 유전자를 어떤 생물체에서 어느 시기 또는 어떤 조직에서 발현시키느냐가 중요한 과제이다. 하지만 외래 유용 유전자의 발현은 목적유전자를 분리하고, 적합한 형질전환 식물체를 선택하는 것만으로 충족될 수 없다. 형질전환 식물을 이용하여 저비용으로 부가가치가 높은 단백질을 대량으로 생산하기 위해서, 우선적으로 고려되어야 할 여러 조건 가운데 하나가 식물에서 높은 활성을 가지는 프로모터를 개발하는 것이다 (Norre, F. et al., Plant Mol Biol., 699:712, 2002). 실제 진핵생물의 유전자 구조는 대장균 등의 원핵생물과는 다르며 프로모터, 인헨서, 사일런서 등과 같은 조절요소가 관여하고 있다. 프로모터의 경우 전사 의 시기와 양을 조절하는 유전인자들을 포함하고 있어 직접적으로 전사의 효율을 조절한다.

지금까지 개발된 프로모터 가운데 식물에서 기원한 프로모터의 수는 많지 않기 때문에 과학자들은 식물 바이러스와 뿌리혹박테리아 Ti플라스미드의 프로모터에 많은 관심을 가져왔다. 식물 단백질 발현 분야에서 최초이자 가장 중요한 발명 중의 하나는 유전자 변형 식물에서 이종 유전자를 강력하고 구성적으로 발현시키는 식물 바이러스 유래의 프로모터를 사용하게 된 것이다. 콜리플라워 모자이크 바이러스[Cauliflower mosaic virus(CaMV)]로 부터의 35S 및 19S 프로모터가 분리되어 널리 이용되고 있으며(유럽특허 제0131623호), 그 밖에 아그로박테리움의 T-DNA에서 유래한 노파린 합성 유전자(nos), 만노핀 합성 유전자(mas)및 옥토핀 합성 유전자(cos) (유럽특허 제0122791호, 유럽특허 제0126546호, 유럽특허 제0145338호), 그리고 식물 유래 유비퀴틴 프로모터가 이용되고 있다 (유럽특허 제342926호).

이중 CaMV의 35S 프로모터는 식물에서 도입시킨 유전자를 지속적이고 효율적으로 발현시키기 위해 가장 널리 사용되고 있는 프로모터 중의 하나로 상기 기재된 외래 유용 단백질의 생산에 대부분 이용되었다. 하지만 이 프로모터는 모든 숙주식물에서 상시 강력한 발현을 유도하는 것은 아니어서, 쌍떡잎 식물에서 보다 유용하게 사용되고 있으며 프로모터의 염기서열 중 21bp가 뿌리에 집중적인 조직발현을 유도한다고 보고되도 있다 (Lam, E. et al., PANS, 7890:7894, 1989).

따라서, 이들 프로모터의 발현 수준을 높이기 위한 시도가 있어왔다. 이에 대한 예로는 두 배로 강화된 35S 프로모터(미국특허 제5,164,316) 및 보다 최근으 로는 아그로박테리움 프로모터의 부분들을 결합시킨 수퍼프로모터(유럽특허 제729514호)가 있다.

이후 일본 추고꾸 국립연구소(Chugoku National Agricultural Experiment Station)의 Fukuoka등의 과학자들은 Plant Cell Reports지에 대두 클로로틱 모틀 바이러스(Soybean chlorotic mottle virus(SoyCMV)}에서 분리한 NCR 프로모터를 분리하였고 이는 담배와 벼의 엽육세포의 원형질체에 삽입시킨 유전자의 강력한 발현을 유도한다고 보고하였다 (Fukuoka, H. et al., Plant Cell Reports, 815:820, 2000).

이외에도 프랑스의 Rance 등의 과학자들은 코멜리나 엘로우 모자이크 바이러스{Commelina yellow mosaic virus(CoYMV)}, 카사바 베인 모자이크 바이러스{Cassava vein mosaic virus(CsVMV)}의 염기서열 및 CaMV의 35S 프로모터의 활성 염기서열을 결합시킨 새로운 종류의 프로모터를 개발하였으며, 이들은 쌍자엽 식물인 담배와 단자엽 식물인 옥수수에서 락토페린의 생산에 이용되었으며 35S 프로모터보다 강한 활성을 가진다고 보고되었다 (Norre, F. et al., Plant Mol Biol., 699:712, 2002 ).

또한 최근에는 빛이나 온도, 스트레스에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 프로모터들이 분리, 보고되고 있으며, 대표적으로 퍼옥시다제의 유전자 프로모터가 식물에서 보고되었다 (Kwak, S.S. et al., Plant Mol. Biol., 831:838, 2003. ). 퍼옥시다제는 노화와 질병의 원인이 되는 활성산소를 제거하는 항산화물질의 일종으로 특히 상처나 저온, 자외선, 오존 등에 의하여 강하게 발현된다. 이 프로모터 의 경우 항암제인 택솔 등 고부가가치의 치료용 단백질 및 약리활성물질 등을 생산하는데 활용되며 장기적으로 환경스트레스 조건에서도 잘 자라는 환경내성 식물 개발에도 활용될 전망으로 있다.

그러나 많은 경우에 이 프로모터들은 이상적인 프로모터의 기준을 충족시키지 못한다. 상기 기재된 모든 프로모터는 분명한 형태의 조직, 또는 생장 특이적인 발현을 나타내지만, 빈번하게 이 프로모터에서 나타나는 발현 형태는 넓은 범위에 동일한 발현률을 나타내진 못하므로 각각의 경우 특이적인 프로모터 개발이 필요하다.

최근에는 식물뿐만 아니라 형질전환된 미세조류를 이용하여 유용 단백질을 생산하려는 노력이 시도되고 있는 시점에서 이에 적합한 프로모터의 개발이 동시에 수반되어야한다.

이에, 본 발명자들은 형질전환 미세조류에서 이종유전자를 강력하게 발현할 수 있는 프로모터를 개발하고자 예의 노력한 결과, 클로렐라 바이러스의 tRNA 유전자 클러스터의 프로모터를 분리하여, 이를 이용한 벡터를 제작한 결과, 클로렐라에서 외래 유전자를 강력하게 발현하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 클로렐라 바이러스 유래의 신규 프로모터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 프로모터를 함유하는 벡터 및 상기 벡터로 형 질전환된 미세조류를 이용한 목적단백질을 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 A 박스 하나 이상 및/또는 (b) 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 B 박스 하나 이상을 함유하는 프로모터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 AA, ABA 또는 ABABA 형의 반복된 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 클로렐라 바이러스 유래인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한 상기 프로모터는 서열번호 4의 C 박스를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, CABA형의 반복된 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프로모터를 함유하는 벡터 및 상기 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 각각 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 형질전환 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미세조류 및 상기 형질전환된 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환된 식물체 또는 그 조직 및 상기 형질전환된 식물체 또는 그 조직을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

클로렐라 바이러스는 330kb이상의 선형 DNA를 지니며 200-300개의 단백질을 코딩하고 있으며, 보통의 바이러스들이 숙주세포의 tRNA를 사용하여 단백질을 합성하는데 반하여, 특이하게 tRNA 유전자 클러스터를 가지고 있어, 자체 tRNA를 합성한다. 이러한 특징에 의해 클로렐라 바이러스는 유용 유전자 및 전사 조절 요소의 소스로 이용되고 있으며 본 실험에서 분리된 tRNA 유전자 클러스터의 프로모터의 경우 클로렐라 바이러스의 발현 카세트를 지니므로 클로렐라를 이용한 이종 구성유전자의 발현에 유리할 것이라 예상되었다. 또한 tRNA 유전자는 클로렐라 내에서 선 발현 유전자로 발현되어 단백질의 합성과정 동안 상시적으로 발현될 것이므로 강력한 발현을 계속적으로 유지할 수 있다.

본 발명에서는 한국 담수에서 클로렐라 바이러스 SS-1, SS-2, KH-1을 분리하였으며, 이들 클로렐라 바이러스의 게놈 DNA로부터 tRNA 클러스터의 프로모터를 분리하였다. 상기 프로모터들은 유사한 반복서열인 A 박스 및 B 박스를 지니고 있었으며 각각 33 및 84개의 핵산염기로 구성되어 있었다. 이들 A 및 B 박스의 구성은 각각 SS-1의 경우 AA, KH-1의 경우 CABA, SS-2의 경우 ABABA로 이루어져 있었다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 목적단백질로 GFP만을 예시하였지만, GFP 대신에, 효소, 효소저해제, 호르몬, 호르몬 유사체, 항체, 신호전달단백질, 단일사슬항체, 항원, 펩타이드, 폴리펩타이드, 결합단백질, 결합도메인, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 각종 조절 인자 및 그들의 일부분 등을 포함하는 목적단백질을 본 발명의 프로모터를 이용하여 발현시키는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 본 발명의 벡터를 클로렐라에 형질전환시켜 재조합 단백질의 발현을 확인하였지만, 그 외의 담배, 애기장대, 토마토 등의 식물체에 형질전환시켜 재조합 단백질을 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예 1: 클로렐라 바이러스의 분리

본 발명에 사용된 클로렐라 바이러스는 한국의 9개 도시에서 수집된 담수를 클로렐라 바이러스의 숙주인 클로렐라에 적용한 후, 감염된 클로렐라 세포를 용해시켜 분리하였다. 먼저, 수집된 민물을 0.22μm Al₂O₃ 필터(Whatman, 미국)를 사용하여 약 20kPa의 압력으로 여과시켰다. 본 실시예에서는 Chlorella NC64A를 MBBM 배지(modified Bold's basal medium, Van Etten, J.L. et al., Virology, 126:117, 1983)에서 배양하였다.

상기 여과시킨 민물시료 5ml을 100ml의 Chlorella NC64A 배양액 100ml에 첨가하고, 25℃, 광조건에서 5일간 진탕배양하였다. 클로렐라 배양액이 완전히 용해 된 후, 상층액을 10^-6~10^-7배 희석한 후 5㎕를 취하여, 4ml의 Chlorella (4.0x10⁸cells/ml), 2ml의 0.75% (in MBBM 배지) 아가와 혼합한 후 1.5% 아가가 첨가된 MBBM 배지가 들어있는 배양접시 위에 깔았다. 배양접시에 형성된 단일 플라크(plaque)를 취하여 100ml 새로운 클로렐라 배양액에 접종하였다. 상기 클로렐라의 용해액을 새로운 배양접시에 접종하고 단일 플라크를 얻는 과정을 3회 반복하여 순수한 클로렐라 바이러스를 분리하여, 클로렐라 바이러스 SS-1, SS-2 및 KH-1을 얻었다.

실시예 2: 클로렐라 바이러스의 정제

실시예 1에서 분리한 바이러스를 포함한 클로렐라 NC64A가 완전히 용해될 때까지 배양한 후, 용해액을 5000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮겨, 트리톤 X-100을 최종농도 0.1%가 되도록 첨가한 후, 4℃에서 20분간 섞어주었다. 섞어진 용액을 20,000rpm에서 60분간 원심분리하여, 바이러스 입자를 침전시켰다. 상기 과정에서 얻어진 펠렛을 50mM Tris-버퍼(pH 7.8)에 현탁시켜, 10~40% 비연속 슈크로오스 그래디언트 용액에서 4℃, 20,000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 바이러스가 포함된 30~40% 구간의 분획을 수득하여, 27,000 rpm에서 3 시간 동안 원심분리하여 침전시킨 후, 50mM Tris-HCl 버퍼에 현탁시켜, 이후 SDS-PAGE와 게놈 DNA 분리에 사용하였다.

상기 분리된 클로렐라 바이러스를 15% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 전 기영동하였다 (도 2). 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 클로렐라 바이러스는 10kDa에서 200kDa을 넘는 크기의 여러 구성 단백질을 가지고 있었다.

실시예 3: 클로렐라 바이러스 게놈 DNA의 분리

정제된 클로렐라 바이러스 400㎕에 60㎕의 10X TEN 버퍼[100mM Tris-HCl(pH7.4), 10mM EDTA, 1M NaCl], 60㎕의 1% Na-살코실(salcosyl), 0.6㎕dml 60%(w/w) CsCl 및 소량의 EtBr을 첨가하고, 75℃에서 15분간 반응시킨 후, 반응용액을 40~60%(w/w) CsCl 그래디언트 용액 위에 첨가한 후, 25℃, 35,000rpm에서 18시간 동안 원심분리하였다. EtBr로 표지된 바이러스 게놈 DNA를 포함한 부분을 수득한 후, 부탄올을 사용하여 EtBr을 추출하여 제거하였다. 바이러스 게놈 DNA는 에탄올로 침전시켜, 1×TE 버퍼[10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA]에 현탁시켰다. 상기 분리한 클로렐라 바이러스의 게놈 DNA를 제한효소 BamHI과 HindIII로 처리한 후, 0.7% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 절단패턴을 확인하였다 (도 3).

실시예 4: 클로렐라 바이러스의 tRNA 유전자 클러스터 프로모터의 분리 및 분석

본 발명에서 분리한 클로렐라 바이러스 SS-1, SS-2 및 KH-1의 tRNA 유전자 클러스터 프로모터를 분리하기 위하여 tRNA 유전자 클러스터에서 두번째 tRNA가 아이소루이신인 것에 기초해 알려진 아이소루이신의 염기서열에 상보적인 역방향 프라이머(5'-TTGGCTCATAAGACCAATGC-3': 서열번호 5)를 제작하였다. tRNA 클러스터 앞부분의 프로모터 부위의 염기서열을 확인하기 위하여, 제한효소로 절단된 바이러스 게놈의 직접 염기서열 분석을 실시하였다. 순수분리된 바이러스 게놈 DNA(3-5㎍)을 BamHI으로 15시간 이상 절단한 후 페놀/클로로폼 혼합액을 이용하여 추출한 후 에탄올을 이용하여 침전시킨 후 증류수에 현탁하였다. 염기서열 분석용 혼합액(1~1.5㎍ DNA, 1pmol 프라이머, 4㎕ terminator ready reaction 용액, 최종 20㎕로가 되도록 증류수 첨가)을 PCR 기기에 넣고 25회의 PCR 반응을 수행하였으며 PCR 반응은 95℃에서 10초간의 denaturation, 50℃에서 5초간 annealing, 그리고 60℃에서 4분간의 extension을 수행하였다. PCR 결과물은 에탄올을 이용하여 침전시키고 말린 후 25㎕의 template suppressing reagent (Perkin Elmer, 미국)에 녹인 후 95℃에서 2분간 denaturation 시킨 후 ABI PRISM 310 분석기(Perkin Elmer)를 이용하여 염기서열을 분석하여, 각각의 바이러스에 대한 tRNA 유전자 클러스터의 5'상부 비전사 영역의 염기서열을 얻었다. 상기 염기서열을 이용하여 tRNA 유전자 클러스터의 프로모터 영역에 특이적인 서열번호 6과 7의 프라이머를 제작하였다.

서열번호 6(정방향): 5'-CGTAAGCTTGAAAGAATGTAT-3'

서열번호 7(역방향): 5'-GCATACGGATCCGCGCGCGTGTAT-3'

상기 프라이머를 이용하여 바이러스의 게놈 DNA에서 tRNA 유전자 클러스터의 프로모터 영역을 PCR로 증폭하여 분리하였으며, SS-1, SS-2 및 KH-1 바이러스에 대한 각각의 크기는 372bp, 490bp 및 373bp이었다.

상기 각 프로모터의 염기 서열을 분석한 결과, SS-1, SS-2 및 KH-1 클로렐라 바이러스는 유사하게 반복되는 두 개의 서열 모티프를 가지고 있었으며, 도 2에 나타낸 바와 같이, 각각 33개와 84~100개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있었다. 이중 33개의 뉴클레오타이드를 가지는 서열을 A 박스(서열번호 1)라고 명명하고, 약84개의 뉴클레오타이드를 가지는 서열을 B 박스(서열번호 2 및 3) 및 C 박스(서열번호 4)로 명명하였다. 각 반복 염기서열 박스는 도 3에 나타낸 바와 같이, SS-1의 경우 AA, KH-1의 경우 CABA, SS-2의 경우 ABABA로 구성되어 있었다.

서열번호 1: ATTAAYTTAAGAAAYATWCTAACACCADAAWCA

여기서, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이며, D는 A 또는 G이다.

실시예 6. 클로렐라 형질전환 벡터의 제작

실시예 5에서 수득한 클로렐라 바이러스 유래의 프로모터가 형질전환 벡터에 사용가능한지를 확인하기 위하여, 상기 SS-1, SS-2 및 KH-1의 프로모터 부위를 가지는 형질전환 벡터를 제작하였다. 본 실시예의 형질전환 벡터는 도 4에 나타낸 pCTV벡터(대한민국 특허공개 10-2001-0073152)를 변형하여 제작하였다. 상기 pCTV벡터는 식물 형질전환 벡터를 변형한 것으로, 클라미도모나스 유래의 RBCS2 프로모터를 가지고, 선택마커로 플레오마이신 저항성 유전자(sh ble)를 가지고, 넙치 성장 호르몬 유전자(fGH)가 삽입되어 있다. 먼저 pCTV 벡터를 제한효소 BamHI/XhoI로 처리하여 fGH 유전자를 제거하고, 상기 제거 위치에 GFP(녹색 형광 단백질) 유전자를 삽입하여 pMinGFPble를 제작하였다. 상기 벡터는 CaMV35S 프로모터의 조절 하에 GFP 유전자를 발현하게 된다.

상기 pMinGFPble를 제한효소 HindIII/BamHI로 절단하여 CaMV35S 프로모터 부위를 제거하고, 상기 제거 위치에 SS-1, SS-2 및 KH-1 프로모터를 삽입하여 pSGFPble, pTGFPble 및 pKGFPble를 제작하였다 (도 5).

실시예 7. 클로렐라 형질전환 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조

실시예 6에서 제작한 클로렐라 바이러스의 tRNA 유전자 클러스터 프로모터를 가지는 벡터는 클로렐라 엘립소이데아(한국해양미세조류은행 KMCC C-20)에 형질전환시켰다. 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체(1×10⁸)를 400×g에서 5분 동안 원심분리하여, 0.6M 소르비톨/만니톨이 함유된 f/2배양액(배지조성 또는 제조사)으로 침전물을 재현탁시켰다. 클로렐라가 현탁된 튜브는 다시 400×g에서 5분동안 원심분리하고, 0.05M CaCl₂가 함유된 0.6M 소르비톨/만니톨 용액 1㎖로 침전물을 재현탁시켰다. 그런 다음, 1×10⁸ 세포수의 원형질체를 각각 0.4㎖씩 4개의 새 튜브로 옮기고, 상기 튜브에 각각 4㎍의 pMinGFPble, pTGFPble, pKGFPble 및 pSGFPble 벡터와 담체로써 송아지 흉선세포 DNA(Sigma Chemicals) 25㎍을 첨가하였다. 상기 튜브를 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, 200㎕의 PNC[0.8M NaCl, 0.05M CaCl2, 40% PEG 4000(Sigma)]을 첨가하고, 상온에서 30분 동안 혼합하였다.

그 후, 0.6M 소르비톨/만니톨, 1% 효모추출액 및 1% 글루코오즈가 함유된 f/2 배양액 0.6㎖를 첨가하고, 25℃의 암조건 하에서 12시간 동안 배양하여, 클로렐라의 세포벽을 재형성시켰다. 세포들을 선택마커인 플레오마이신(1㎍/㎖)이 함유된 신선한 f/2 배지에 옮기고, 25℃ 암조건 하에서 배양하였다. 배양 5일 경부터, 클로렐라의 성장을 관찰할 수 있었으며, 15일 경에 세포성장은 정지기(stationary phase)에 도달하였다. 반대로, 형질전환되지 않은 원형질체에서는 성장을 관찰할 수 없었다.

상기 배양된 pMinGFPble, pTGFPble, pKGFPble 및 pSGFPble로 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아에서 생성되는 GFP의 형광을 측정하여, 본 발명의 tRNA 유전자 클러스터 프로모터에 의한 GFP 유전자의 발현능을 확인하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 클로렐라 바이러스 유래의 tRNA 유전자 클러스터 프로모터를 가지는 pTGFPble, pKGFPble 및 pSGFPble로 형질전환된 클로렐라가 CaMV35S 프로모터를 가지는 pMinGFPble로 형질전환된 클로렐라보다 많은 GFP를 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 반복 염기서열인 A 박스와 B 박스의 수가 증가함에 따라 발현이 강해지는 양상을 보였으며, 3개의 A 박스와 2개의 B 박스를 동시에 가지는 pSGFPble가 가장 높은 발현율을 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 목적유전자를 강력하게 발현하는 클로렐라 바이러스 유래의 신규 프로모터, 상기 프로모터를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미세조류를 이용한 목적단백질을 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 프로모터를 이용하면, 클로렐라 및 식물에서 고농도의 재조합단백질을 제조할 수 있어, 저비용으로 고부가가치의 단백질을 대량으로 생산하는 분자농업에 이용될 수 있으며 식물에 특정기능을 첨가 또는 개선시키고자하는 유전공학분야에서도 이용될 수 있을 것이다.

<110> Pukyong National University <120> Novel Promoter Originated from Chlorella Virus and Use Thereof <130> P04-393 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Chlorella virus <400> 1 attaayttaa gaaayatwct aacaccadaa wca 33 <210> 2 <211> 84 <212> DNA <213> Chlorella virus <400> 2 tcatttatta caggttcgac ccaaatcatc cgacccaaaa gataagtatt attgatatca 60 gaaatgtgat aagtatatat aaat 84 <210> 3 <211> 84 <212> DNA <213> Chlorella virus <400> 3 tcattcattg caggttcgac ccaaatcatc cgaccccaaa gataagtatt attgatatca 60 gaaatgtgat aagtatatat aaat 84 <210> 4 <211> 84 <212> DNA <213> Chlorella virus <400> 4 tcatatcgac aactaaaaca acttaagaaa cagaggtgct tacaattcaa gtaagtatac 60 aggtaagtat cacaaacgtc aaat 84 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttggctcata agaccaatgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgtaagcttg aaagaatgta t 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcatacggat ccgcgcgcgt gtat 24

Claims (12)

1. (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 A 박스 하나 이상 및/또는 (b) 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 B 박스 하나 이상을 함유하는 프로모터.
2. 제1항에 있어서, AA, ABA 또는 ABABA 형의 반복된 서열을 가지는 프로모터.
3. 제1항에 있어서, 서열번호 4의 C 박스를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
4. 제1항에 있어서, CABA형의 반복된 서열을 가지는 프로모터.
5. 제1항에 있어서, 프로모터는 클로렐라 바이러스 유래인 것을 특징으로 하는 프로모터.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프로모터를 함유하는 벡터.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터.
8. 제7항의 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 형질전환 미생물.
9. 제7항의 재조합벡터로 형질전환된 미세조류.
10. 제9항의 형질전환된 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법.
11. 제7항의 재조합벡터로 형질전환된 식물체 또는 그 조직.
12. 제11항의 형질전환된 식물체 또는 그 조직을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법.

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