KR101092965B1 - 참김 유래의 새로운 프로모터 및 이를 함유하는 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해조류 분자생물학에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국 고유의 참김(Porphyra tenera Kjellman)에서 분리된 새로운 프로모터 즉, 서열번호 1의 염기서열, 또는 그의 변이체로서 프로모터의 기능을 유지하는 범위 내에서 치환, 결실 또는 삽입된 염기서열로 구성되는 프로모터와 이를 함유하는 벡터 및 이들을 활용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 고유의 참김으로부터 해조류 및 다양한 생물체에 적용가능한 새로운 프로모터를 활용할 수 있게 되어 김을 비롯한 다양한 해조류 및 식물체의 품종개량이 용이하게 이루어질 수 있게 된다.
또한 본 발명에서는, 해조류로부터 새로운 프로모터를 발견하였고, 이 프로모터가 형질전환벡터에서 확실하게 작동할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명을 이용하여 종래 형질전환의 재현성이 부족하여 어려움이 있었던 해조류 형질전환 연구 및 이를 이용한 신품종 개발 분야에 널리 활용될 수 있게 된다.

Description

참김 유래의 새로운 프로모터 및 이를 함유하는 벡터{A novel promoter, and Vectors having the promoter}

본 발명은 해조류 분자생물학에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국 고유의 참김(Porphyra tenera Kjellman)에서 분리된 새로운 프로모터 및 이를 함유하는 벡터 및 이들을 활용하는 방법에 관한 것이다.

최근 유전공학 및 세포공학과 같은 생명공학의 발전에 따라 바람직한 유전자를 생물체에 직접 도입하여 유용물질을 생산하거나 독특한 생리적 특성을 가지는 형질전환 생물체를 획득하는 품종개량 시스템이 정착되었다. 이러한 시스템을 통해 획득된 다양한 신품종들을 경제적으로 활용하는 사례가 점차 증가하고 있다. 그러나 이러한 품종개량 시스템은 주로 미생물이나 몇몇 유용한 농작물(육상식물)들을 대상으로 활용되고 있는 것이 현실이다.

한편, 해양생물은 지구상에 서식하는 생물종의 약 80%를 차지하고 있으며, 이중 해조류는 식품, 비료, 건강식품 등으로 이용될 뿐만 아니라, 유용물질의 생산, 신 물질 탐색 및 biomonitoring 이나 bioremediation 등을 위한 소재로도 활용되는 중요한 생물자원이자 유전자원으로 중요성이 부각되고 있다. 해조류의 가치와 중요성이 인식되면서 2012년부터 해조류도 품종보호 대상으로 인정받게 되었는데, 이에 따라 외국품종의 도입에 따른 로열티 지급이 급격하게 증가할 것으로 예상된다.

특히 김은 미역, 다시마와 함께 우리나라에서 양식되고 있는 대표 해조류로서, 김의 연간 생산량은 약 21만톤이고, 생산액은 약 1,784억원으로 전체 해조류 연간 총생산액의 약 54%를 차지하고 있다(농림수산식품부 어업생산통계 2009).

현재 국내에서는 참김(Porphyra tenera Kjellman), 방사무늬김(P. yezoensis Ueda), 모무늬돌김(P. seriata Kjellman) 그리고 잇바디돌김(P. dentata Kjellman) 등 4종이 주로 양식되고 있다. 그 중 참김은 고유의 맛과 향을 가진 종이므로 향후 참김을 이용한 양식종이 개발될 경우 부드러운 촉감과 특유의 향미로 지역특산종으로 개발될 가능성이 크다. 그러나 현재 주로 양식되고 있는 김의 상당한 비율이 일본품종의 사상체 형태로 유통되고 있는 실정이다.

따라서 종자전쟁이라고도 불리는 신품종보호제도를 대비하고, 국내 자생품종을 육종하여 신품종을 개발한다면 외국 품종에 대한 로열티 지급을 최대한 방지하고, 나아가 자생품종 유래의 신품종 수출을 통하여 로열티 수익을 창출할 수 있게 될 것이다. 이를 위해 고부가가치, 고기능성 해조류 신품종 개발을 위한 기반기술로서 해조류의 형질전환 기술을 선점할 필요성이 강하게 요구되고 있다.

현재 김에 대한 유전체 연구가 이루어지지 않고, 유전자 발현 기작 및 양상의 정보가 부족하기 때문에 안정적인 형질전환 기술이 확보되어 있지 않다. 최근 (2008, 2009) 일본 방사무늬김에서 단순히 일회성 형질전환에 성공한 바 있으나, 형질전환된 특성이 안정적으로 유지되지 못하였다.

Fukuda S, Mikami K, Uji T, Park EJ, Ohba T, Asada K, Kitade Y, Endo H, Kato I, Saga N (2008) Factors influencing efficiency of transient gene expression in the red macrophyte Porphyra yezoensis. Plant Science. 174:329-339. Mikami K, Uji T, Li L, Takahashi M, Yasui H, Saga N. (2009) Visualization of phosphoinositides via the development of the transient expression system of a cyan fluorescent protein in the red alga Porphyra yezoensis Mar Biotechnol (NY). 2009 Sep-Oct;11(5):563-9.

본 발명은 한국 고유의 참김으로부터 새로운 프로모터 및 이를 함유하는 형질전환벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 상기 형질전환벡터가 도입된 숙주 및 이 숙주를 이용한 유용물질 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 참김으로부터 분리한 것으로서 하기와 같은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 프로모터에 관한 것이다.

<서열번호 1>

GATCCGAACCTGCCCCCGGGTGGTTGCGGCGGGAGGGGCAGAGGCGGCTGCGTGGAAGATTCCAGCCTCACCACCCTCGCAGGTTGGCGGCCGGCAAGCTCTCAGCGGCAATGCTCCACAGCCGCCCCCCAGGCAATGAAAGCCGTTGTGTGACAAGGGAGGCCAGGGGACGCGTGGGTGCGGCAGGCACGTCGTGCCAGTCGGGTGTGGCGCACTCGCCAGGCACTCTCGCCGTAAGCTGGGCGGCTAACCGCGGGCGGGCACCCTCAAGGATGGCGCTGAAAGGGGGTGCGTGCGTAGATTCGACTGCTCCCAGCGGCCCCCCTTGGATATCCCGATATCGTTGCCAACCCGTTCCGAGCGTGCCTGTTTCCTGCGAAGGCCACGGCTGCTGGTTCTTCTAGTCGAGTCGAGCCTGCGCCTTGTCACTCTCGAGACTGGGACTACCAGGTGGGCCAGGAAGGGGGCGAGACAGTGACGCACGAGGCCCCCGACCACGCACGGGAGCATCTCGTCAACCCAGCTGTGCGACGACGAAGTGAGAATTCGAAGCGGCCCGGAGATAGTGGCTGCTTTTCGCTATGAACACAGGCAATCCAAATTAGGTACAACGAAAGAAGTTGTACAACAGCTTCTGAGTATGCATTGTACAGTTGAAATTAACCGCTTCTGACAATTTTATAATTTCACTTCTACGATTCTTGCTAGTACGTGCCACGTTGGTCGCCGTGGACGTCTTCCGATGTTTCTGGAGGGGGCCACCCTACCCTTGTCAACGTGGCTGTTGGGTGGAAGATCCAGTCCATTGGCCGTTTCACTCCAGGCCCTCCAGCGCCGACGCAATTTGCCGGGGTCAACGTCGACGTCGCAACCCCCGCGGCCGTGCATTGATCCACGTGTAGTCCGACGGCGGTGTCGTTCGGGCACGAAGACGACGTCGTCCGTTCCGCACCCCGTTGTCGGCAGCCTTTGCGGCTCCCCAGGTCATCTTCCTCGCCCTTTGACGCTCCTCTCCCGTGTGCACCCGACG

본 발명의 기술적 사상 및 발명의 취지에 의하면, 서열번호 1의 염기서열의 변이체이면서 프로모터로서 기능을 유지하는 범위 내에서 적절하게 치환, 결실, 삽입 등과 같은 변형이 가능하며, 이렇게 변형된 염기서열도 본 발명의 권리범위/기술적 범위에 속함은 명백하다. 구체적으로, 본 발명에 의한 프로모터는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 염기서열일 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 프로모터와 목적 유전자의 코딩 서열이 발현가능하게 연결된 형질전환벡터에 관한 것이다. 이때 상기 벡터는, 종래 알려진 다양한 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 중의 어느 하나일 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 형질전환벡터를 함유하는 형질전환 숙주에 관한 것이다. 특히 상기 숙주는 해조류, 더욱 바람직하게는 김인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은, 상기 본 발명에 의한 형질전환 숙주를 배양하여 단백질이나 의약품 등 다양한 목적물질을 수득하는 목적물질의 제조방법에 관한 것이다.

이상과 같이 본 발명에 의하면 고유의 참김으로부터 해조류 및 다양한 생물체에 적용가능한 새로운 프로모터를 활용할 수 있게 되어 김을 비롯한 다양한 해조류 및 식물체의 품종개량이 용이하게 이루어질 수 있게 된다.

또한 본 발명에서는, 해조류로부터 새로운 프로모터를 발견하였고, 이 프로모터가 형질전환벡터에서 확실하게 작동할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명을 이용하여 종래 형질전환의 재현성이 부족하여 어려움이 있었던 해조류 형질전환 연구 및 이를 이용한 신품종 개발 분야에 널리 활용될 수 있게 된다.

도 1은 참김과 방사무늬김, 모무늬돌김의 HSP 70의 5'UTR 부분의 서열을 비교하여 보여주는 도표.
도 2는 본 발명에 의한 벡터의 특징부를 보여주는 개념도.
도 3은 본 발명에 의한 프로모터가 적용된 형질전환벡터가 정상적으로 기능함을 보여주는 현미경 사진.

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

본 발명자들은 김의 heat shock protein 70(이하 "HSP 70"이라 함)에 관한 연구를 수행하는 과정에서 참김으로부터 신규한 프로모터를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 의한 프로모터는 참김에서 유래한 것으로서 1030bp 크기인 서열번호 1의 염기서열로 구성되어 있으며, 지금까지 보고된 바 없는 새로운 프로모터인 것으로 확인되었다. 본 발명에 의한 상기 프로모터와 적절한 테스트용 목적 유전자를 함유하는 형질전환 벡터를 제작하여 참김에 형질전환한 결과, 이들 형질전환체에서 목적 유전자가 발현됨을 확인하였다.

한편, 본 발명에 의한 상기 프로모터는, 하기 실시예에 예시적으로 제시된 서열번호 12, 15의 프라이머 세트를 적용하여 참김의 total DNA를 주형으로 하는 통상의 PCR을 수행함으로써 이용하게 분리할 수 있다. 이에 상기 프로모터의 기탁을 생략한다.

실시예

실시예 1 : 참김 유래의 프로모터 클로닝 및 서열결정

참김 고유의 프로모터를 클로닝하기 위하여 참김의 genomic DNA로부터 Adapter ligation mediated PCR 방법(O'Malley 등 2007)을 수행하였다.

먼저, 참김의 어린 엽체로부터 정제된 genomic DNA를 BamHI, XbaI, XhoI, EcoRI, HindIII 제한효소로 각각 4시간 처리한 후 각각의 제한효소 adapter primer 및 long adapter primer(표 1)로 연결(ligation)하였다.

ligation된 재료를 주형으로 하여 specific primer 조합(표 2)으로 O'Malley 등 (2007)의 방법에 준하여 PCR을 수행하였다.

AP1 과 AP2 primer는 long adapter에 binding 하도록 설계된 것이고, HSP70 specific primer (R1, R2, R3)는 모무늬 돌김 및 방사무늬김 HSP70 유전자 EST sequence를 기준으로 잘 보존된 부위를 선정하여 설계된 것이다.

AP1, AP2와 Pt HSP70 R1, R2, R3 primer 조합으로 PCR을 수행한 결과 XhoI digested 처리구에서, 2nd PCR조건에서 약 600bp의 PCR product를 확보하였다. 이를 pGEM-T easy vector에 클로닝하고 염기서열을 분석한 결과 HSP70 promoter 부위임을 확인하였다. 이렇게 얻은 600bp 염기서열을 기반으로 다시 PtHSP70 R4, R5 primer를 제작하고 다시 adapter ligation 방법을 수행한 결과 역시 2nd PCR 조건에서 다시 약 600 bp의 PCR product를 확보하였다. 이후 확보된 염기서열을 근거로 서열번호 12와 15의 프라이머 세트를 활용하여 PCR방법으로 증폭하여 하나의 클론을 확보하였다. PCR방법으로 증폭된 DNA fragment를 gel elution kit(Bioneer co. Korea)를 사용하여 분리한 후, pGEM T-easy 벡터에 도입하여 염기서열을 결정하였다.

그 결과, 상기 염기서열은 PtHSP70 유전자의 프로모터로서 1030bp 크기인 서열번호 1의 염기서열로 확인되었다.

참김으로부터 분리한 상기 프로모터에 포함된 5'UTR 부분을 다른 품종의 것과 비교한 결과, ATG 앞부분 약 180 bp에서 방사무늬김과 8bp가, 모무늬 돌김과는 47bp가 다른 것으로 나타났다 (도 1).

실시예 2 : 참김 유래 프로모터를 함유하는 형질전환벡터의 제작

확보된 참김 HSP70 프로모터와, 리포터 유전자로서 PyGUS가 도입된 transient 형질전환 벡터 3종을 제작하였다.

구체적으로는, 상기 프로모터 클론을 주형으로 하여 PyGUS와 연결부위가 BamHI (GGATCC)를 가지도록 Reverse primer 3종(PtHSP70P-R1, PtHSP70P-R2 PtHSP70P-R3) (표 3)과 Forward primer로 표 2의 Pt-HSP-P-1kF를 사용하여 프로모터 부위를 클로닝하였다.

이렇게 확보된 3종의 프로모터 부위를 방사무늬김용 형질전환벡터 pUC GAPDH-PyGUS (Fukuda 등 2008, 논문의 주저자 Koji Mikami 교수로부터 분양받음)의 GAPDH 프로모터부위에 치환하여 하기 표 4와 같은 3종의 벡터를 제작하였다. 이들 벡터의 특징부(프로모터-리포터 서열) 개념도를 도 2에 나타내었다.

실시예 3 : 형질전환벡터의 활성 분석

실시예 2에서 제작된 참김 고유 HSP70 프로모터를 가지는 형질전환 벡터들이 참김에서 정상적으로 유전자를 발현시킬 수 있는가를 검증하기 위하여 transient expression 효율을 조사하였다.

기내에서 1주 간격으로 계대배양중인 참김 엽체 중 직경 1~2cm 이상의 것을 고체배지에 치상하여 하여 다음과 같이, BioRad사의 PDS1000/He particle delevery system을 이용한 gene gun 방법(Fukuda 등의 방법의 변형)으로 상기 형질전환 벡터를 도입시켰다.

0.6μm 직경의 금입자에 상기 형질전환 벡터를 코팅하고, 다양한 압력 (900PSI, 1100PSI, 1350 PSI) 및 높이(3cm, 6cm) 조건에서 형질전환을 수행하였다. 이후 15℃ 암조건에서 2일간 정치배양 후 참김을 X gluc용액에 옮겨 37℃에서 12시간동안 반응시켜서 발색여부를 조사하였다.

그 결과를 도 3에 도시하였는데, 도면에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 프로모터를 포함하는 형질전환벡터에 의해 참김에서 리포터 유전자인 GUS 유전자가 정상적으로 발현됨을 확인하였다(도면에서 청색으로 나타난 개체).

이상의 결과로부터, 본 발명에 의한 신규한 참김 유래의 프로모터 및 이를 포함하는 형질전환벡터가 참김과 다른 식물체에서 정상적으로 작동함을 확인할 수 있다.

한편, 본 실시예에서는 본 발명에 의한 프로모터를 이용하여 숙주를 품종개량하거나, 숙주로보터 유용 목적물질을 생산하는 실험을 수행하지는 않았다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서, 본 발명의 기술적 사상에 기초하여 품종개량이나 유용물질 생산이 가능함은 주지의 사실일 것이다.

지금까지 본 발명을 바람직한 실시예를 참조하여 상세히 설명하였지만, 본 발명이 상기한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 특허청구범위에서 청구하는 본 발명의 기술적 요지를 벗어남이 없이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 또는 수정이 가능한 범위까지 본 발명의 기술적 사상이 미치는 것으로 이해하여야 한다.

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Claims (7)

1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 프로모터.
   
2. 목적 유전자의 코딩 서열과 발현가능하게 연결된 제1항의 프로모터를 포함하는 형질전환벡터.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 벡터는, 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 및 바이러스 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 형질전환벡터.
   
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 의한 형질전환벡터로 형질전환된 포르피라 (Porphyra) 속 숙주.
   
5. 삭제
6. 제 4 항에 의한 형질전환 숙주를 배양하여 목적물질을 수득하는 것을 특징으로 하는 목적물질의 제조방법.
   
7. 삭제

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