KR20060002740A - 면역질환 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MHC(Major Histocompatibility Complex) Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질 및 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로 이루어진 그룹으로부터 2종 이상 선택된 물질을 활성 성분으로 포함하여 T 림프구의 활성화를 억제하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

면역질환 치료용 약제학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF IMMUNOLOGICAL DISORDERS}
본 발명은 MHC(Major Histocompatibility Complex) Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질 및 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로 이루어진 그룹으로부터 2종 이상 선택된 물질을 활성 성분으로 포함하여 T 림프구의 활성화를 억제하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
종래기술
면역 반응이란 각종 이물질, 세균 또는 바이러스 등의 자신이 아닌 것으로부터 자신을 보호하는 과정으로, 자신은 공격하지 않도록 정교하게 설계되어 있다. 그러나 이러한 면역 반응이 오히려 자신을 공격하여 자신에게 해를 미치는 경우가 있는데, 대표적인 예가 장기 또는 조직 이식 후와 자가면역이다.
장기 또는 조직 이식에 의한 질병 치료에 있어서, 가장 큰 문제점은 수령자가 공여자로부터 조직 또는 장기를 이식받은 후에 심각한 장기이식 합병증을 보인다는 것이다. 장기이식 합병증은 이식편의 공여자와 수령자간의 유전적 배경이 상이함에 따라 서로를 이물질로 인식하여 배제하려는 면역반응을 의미한다. 이러한 장기이식 합병증은 T 림프구에 의한 세포성 면역과 항체에 의한 체액성 면역이 복잡하게 제휴된 형태로 일어나지만, 주로 T 림프구에 의한 세포성 면역이다.
장기이식 합병증을 치료하기 위한 하나의 방법으로 T 림프구의 활성을 억제하는 화합물들이 이용되고 있다. 예를 들면, 미조리빈(mizoribine; MZ), 사이클로스포린(cyclosporin; CsA), 타크롤리무스(tacrolimus; FK-506), 아자티오프린(azathioprine; AZ), 레플루노마이드(leflunomide; LEF), 프레도니졸론(predonisolon) 또는 메틸프레도니졸론(methylpredonisolon) 등의 부신피질 스테로이드, 데옥시퍼구알린(deoxypergualin; DGS) 및 시롤리무스(sirolimus) 등이 있다.
국제특허공개 WO 1999/65908호는 피롤로[2,3-디] 피리미딘 화합물을 면역 억제제로 이용하여 자가면역 질환을 치료하는 방법을 개시하고 있으며, 국제특허공개 WO 2000/21979호는 사이클릭 테트라펩티드 화합물을 이용하여 장기 이식 거부 반응 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 개시하고 있다. 한편, 면역 세포가 자신과 외부 물질을 구별하지 못하고 자신을 공격하는 경우가 있는데 이러한 현상을 "자가면역(autoimmune)" 이라고 한다. 이러한 자가 면역은 인체의 모든 부위에 걸쳐서 질병을 유발시킬 수 있는데, 예를들면, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 다발성 경화증((Multiple Sclerosis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레브스병(Grave' s Disease), 하시모토씨 갑상선염(Hashimoto's Thyroiditis), 애디슨병(Addison' s Disease), 백반증(Vitilligo), 경피증 (Scleroderma), 굿패스쳐 신드롬(Goodpasture syndrome), 베제트병(Becet's Disease), 크론병(Crohn' s Disease), 강직성 척추염(Ankylosing Spondylitis), 포도막염(Uveitis), 혈소판 감 소성 자반증(Thrombocytopenic purpura), 심상성 천포창(Pemphigus vulgaris), 소아 당뇨병(Diabetes), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune Anemia), 크라일로글로불린증(Cryoglobulinemia), 부신백질이영양증(ALD), 전신성 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus, SLE) 등이 있다.
국제특허공개 WO 1996/40246호는 다발성 경화증과 같은 T 림프구 매개된 자기면역 질환을 치료 및 예방하는 방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 피검자에게 접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 림프구의 표면상의 수용체의 길항제를 치료 또는 예방 유효량으로 투여하는 방법에 관한 것이다. 상기 길항제로는 T 림프구 수용체 gp39에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이 이용된다.
국제특허공개 WO 2002/22212호는 하나 이상의 면역조절항체 및 하나 이상의 B 림프구 고갈 항체, 예를 들어 CD20, CD19, CD22, CD23 또는 CD27을 표적화하는 항체의 조합을 이용하여 자가면역 질환, 바람직하게는 B 림프구 매개 자가면역 질환을 치료하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 상술한 화합물을 이용하여 면역질환을 치료하는 경우에는 그 부작용이 심각하여 사용이 제한적이며, 국제특허공개 WO 1996/40246 호와 같이 항체를 단독으로 투여하는 경우에는 충분한 치료 효과를 달성하기 어렵다. 또한, 자가면역 질환 또는 장기 이식 합병증은 T 림프구의 활성화에 의해 시작되므로 국제특허공개 WO 2002/22212호와 같이 B 림프구의 기능을 차단하는 것은 효율적인 면역 반응의 억제로 이어지지 못한다.
발명의 요약
보다 효과적인 면역 억제제를 개발하기 위하여 본 발명자들은 T 림프구의 활성화에 관여하는 여러 군의 단백질 중 적어도 둘 이상의 군에서 선택된 단백질을 동시에 차단하였을 때 T 림프구의 활성을 공지된 방법들과 비교했을 때 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 한 관점으로 MHC Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질 및 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로 이루어진 그룹으로부터 2종 이상 선택된 물질을 활성 성분으로 포함하여 T 림프구의 활성화를 억제하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따른 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pLAG33Ig의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR1/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pTR21Ig-Top'의 유전자를 지도를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질([CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2) 및 연쇄 융합된 이량체 단백질([CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2)이 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질(1:[TNFR1/Fc]2, 2:[TNFR2/Fc]2) 및 연쇄 융합된 이량체 단백질(3:[TNFR2-TNFR1/Fc]2, 4:[TNFR2-TNFR2/Fc]2)와 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질([TNFR2/Fc]2, [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2)이 T-림프구의 증식을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질의 혼합물([CTLA4/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + TNFR2/Fc]2, ([CTLA4/Fc]2 + [CD2/Fc]2, ([CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2)이 T-림프구의 증식을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 6c은 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질([TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2)이 T 림프구의 증식을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 6d는 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질의 혼합물([CTLA4- CTLA4/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [LAG3-LAG3/Fc]2)이 T 림프구의 증식을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질([TNFR2/Fc]2, [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2)이 관절염을 완화시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질의 혼합물([CTLA4/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + TNFR2/Fc]2, ([CTLA4/Fc]2 + [CD2/Fc]2, ([CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2)이 관절염을 완화시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질([TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2)이 관절염을 완화시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7d는 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질의 혼합물([CTLA4-CTLA4/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [LAG3-LAG3/Fc]2)이 관절염을 완화시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질([CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2)이 이식편대 숙주질환에 대한 생존율을 증가시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질의 혼합물([CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2, [CD2/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2)이 이식편대 숙주질환에 대한 생존율을 증가시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CTLA4-CTLA4/Fc]2이 이식편대 숙주질환에 대한 생존율을 증가시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8d는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR2/Fc]2 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR2-TNFR2/Fc]2이 이식편대 숙주질환에 대한 생존율을 증가시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8e는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR2/Fc]2 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질([TNFR2-TNFR1/Fc]2 또는 [TNFR2-TNFR2/Fc]2)이 이식편대 숙주질환에 대한 생존율을 증가시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8f은 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질([CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2) 또는 이들의 혼합물([CD2CD2/Fc]2 + [CTLA4- CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2)이 이식편대 숙주질환에 대한 생존율을 증가시키는 정도를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 MHC Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질 및 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로 이루어진 그룹으로부터 2종 이상 선택된 물질을 활성 성분으로 포함하여 T 림프구의 활성화를 억제하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
당업계에 알려진 바와 같이 T 림프구는 항원 제시 세포(Antigenic Presenting Cell) 표면상의 "MHC(Major Histocompatibility Complex) Class II 분자" 와 결합된 형태의 항원만을 인식하게 되며, 이어서 활성화되어 상기 항원에 대항할 수 있는 면역 반응을 일으킨다. 이 때, 상기 MHC Class II 분자 이외에 T 림프구에 활성화 신호를 보내는 분자를 "공조자극 분자(Costimulatory Molecules)" 라고 하며, 신호를 보내는 기능과 함께 항원 제시 세포와 T 림프구의 접촉을 견고하게 하는 분자를 "부착 분자(Adhesive Molecules)" 라고 한다. 한편, 다양한 "사이토카인 (Cytokine)" 이 T 림프구의 활성화를 포함한 면역 반응에 관여하고 있다.
상기 "MHC Class II 분자" 는 T 림프구의 활성화를 개시하는 분자로서, 이의 수용체에는 CD4와 LAG3가 있다. MHC Class II 분자는 항원과 결합된 다음 T 림프구의 표면상에 위치한 MHC Class II 분자의 수용체(CD4)에 의해 인식되어 T 림프구를 활성화시킨다. 따라서, 이러한 MHC Class II 분자의 기능은 MHC Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단함으로써 억제할 수 있다. 그러한 작용을 할 수 있는 물질에는 이에 제한되는 것은 아니지만 MHC Class II 분자의 항체 및 유리 형태의 MHC Class II 분자의 수용체가 포함된다. 여기서, 상기 유리 형태의 MHC Class II 수용체는 MHC Class II 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 모든 수용체를 포함하며, MHC Class II 수용체 또는 이의 세포외역 가용성 부위가 면역글로불린 전체 또는 이의 Fc 단편과 결합된 Ig 융합 단백질 형태인 것이 바람직하다. 더 나아가, 상기 Ig 융합 단백질은 추가로 당쇄화된(glycoslyatded) Ig 융합 단백질일 수도 있다.
상기 "공조자극 분자" 에는 B7(B7.1 및 B7.2), CD154, CD70, OX40L, ICOS-L, 4-1BBL, HVEM, FASL, PDL(PDL-1 및 PDL-2)이 있으며, 이들의 수용체는 각각 CD28과 CTLA-4, CD40, CD27, OX40, ICOS, 4-1BB(CD137), LIGHT, FAS(CD95), PD-1이다. 공조자극 분자는 항원 제시 세포의 표면상에 발현되어 있으며, T 림프구의 표면상에 발현되어 있는 상기 공조자극 분자의 수용체와 결합하여 T 림프구를 활성화시킨다. 따라서, 공조자극 분자에 의한 T 림프구 활성화는 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단함으로써 억제할 수 있다. 그러한 작용을 할 수 있는 물질에는 이에 제한되는 것은 아니지만 공조자극 분자의 항체 또는 유리 형태의 공조자극 분자의 수용체가 포함된다. 이 때, 상기 유리 형태의 공조자극 분자의 수용체는 공조자극 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 모든 수용체를 포함하며, 공조자극 분자의 수용체 또는 이의 세포외역 가용성 부위가 면역글로불린 또는 이의 Fc 단편과 결합된 Ig 융합 단백질 형태인 것이 바람직하다. 더 나아가, 상기 Ig 융합 단백질은 추가로 당쇄화된 Ig 융합 단백질일 수도 있다.
상기 "부착 분자" 에는 LFA-3, ICAM-1, VCAM-1이 있으며, 이들의 수용체는 각각 CD2, LFA-1, VLA-4이다. 부착 분자는 항원 제시 세포의 표면상에 발현되어 있으며, T 림프구의 표면상에 발현되어 있는 상기 부착 분자의 수용체와 결합하여 T 림프구를 활성화시킨다. 따라서, 부착 분자에 의한 T 림프구의 활성화는 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단함으로써 억제할 수 있으며, 그러한 작용을 할 수 있는 물질에는 이에 제한되는 것은 아니지만 부착 분자의 항체 또는 유리 형태의 부착 분자의 수용체가 포함된다. 이 때, 상기 유리 형태의 부착 분자의 수용체는 부착 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 모든 수용체를 포함하며, 부착 분자의 수용체 또는 이의 세포외역 가용성 부위가 면역글로불린 또는 이의 Fc 단편과 결합된 Ig 융합 단백질 형태인 것이 바람직하다. 더 나아가, 상기 Ig 융합 단백질은 추가로 당쇄화된 Ig 융합 단백질일 수도 있다.
상기 "사이토카인" 에는 이들로 한정되는 것은 아니지만 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF 등이 있으며, 이들의 수용체는 각각 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, TNFR, TGFR, IFNR(예, IFN-γR α-쇄, IFN-γR β-쇄), 인터페론-α R, -β R 및 -γ R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMpl, gp130이다. 사이토카인은 B 림프구 또는 T 림프구에 위치한 사이토카인의 수용체와 결합하여 면역 반응을 일으킨다. 따라서 사이토카인에 의한 면역 반응은 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단함으로써 억제할 수 있다. 그러한 작용을 할 수 있는 물질에는 이에 제한되는 것은 아니지만 사이토카인에 대한 항체 또는 유리 형태의 사이토카인의 수용체가 포함된다. 이 때, 상기 유리 형태의 사이토카인의 수용체는 사이토카인과 특이적으로 결합할 수 있는 모든 수용체를 포함하며, 사이토카인의 수용체 또는 이의 세포외역 가용성 부위가 면역글로불린 또는 이의 Fc 단편과 결합된 Ig 융합 단백질 형태인 것이 바람직하다. 더 나아가, 상기 Ig 융합 단백질은 추가로 당쇄화된 Ig 융합 단백질일 수도 있다.
I. 항체
본 발명에서 MHC Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 MHC Class II 분자의 항체가, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 공조자극 분자의 항체가, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 부착 분자의 항체가, 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 사이토카인의 항체가 각각 포함될 수 있다.
상기 항체는 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal) 일 수 있으며, 이들은 모두 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 일반적으로 포유동물을 적절한 양의 항원으로 1 회 이상의 회수로 면역화시키고 역가가 일정 수치에 이르렀을 때, 상기 포유동물의 항혈청으로부터 회수하여, 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고, 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 포유동물에 항원을 주입하여 생긴 B 림프구를 분리해서 마이엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 만들고 이를 배양하여 항체를 제조할 수 있다. 이러한 공정의 상세한 사항들은 당업계에 잘 알려져 있다.
II. Ig 융합 단백질
본 발명에서 MHC Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 MHC Class II 분자의 수용체의 Ig 융합 단백질이, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 공조자극 분자의 수용체의 Ig 융합 단백질이, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 부착 분자의 수용체의 Ig 융합 단백질이, 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로는 사이토카인 수용체의 Ig 융합 단백질이 포함될 수 있다. 이하에서, MHC 수용체, 공조자극 분자의 수용체, 부착 분자의 수용체 및 사이토카인의 수용체는 모두 "수용체" 라 통칭한다.
본 발명에서 "Ig 융합 단백질" 은 수용체 단백질 또는 이의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 또는 이의 Fc 단편이 연결된 형태를 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 구체적으로 상기 Ig 융합 단백질에는 단순 융합된 단량체, 단순 융합된 이량체, 연쇄 융합된 단량체, 연쇄 융합된 이량체 및 이들의 당쇄화된 단백질이 포함된다.
본 발명에서 "세포외역 가용성 부위(soluble extracellular domain)"는 인지질로 구성된 세포막을 관통하는 단백질(integral protein)에서 소수성 아미노산으로 구성되어 있어 세포막을 통과하는 부분(transmembrane domain)을 기준으로 세포외부로 노출되어 있는 부분을 가리킨다. 이 부위는 대부분 친수성 아미노산이 단백질 표면으로 향하는 구조(folding)를 하고 있어서 수용액상에서 가용성(soluble)을 나타낸다. 대부분의 세포표면 수용체 단백질에서 리간드와 결합하는 기능을 담당하는 것은 세포외역 부위이며 세포내역 부위(intracellular domain)는 세포내 신호전달 기능을 담당하고 있다.
본 발명에서 "면역글로불린" 은 다양한 종류의 항원을 특이적으로 인식하도록 B 림프구에 의해 생성되고 B 림프구의 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 가리킨다. 이 분자는 Y 모양으로 두 개의 동일한 경쇄와 두 개의 동일한 중쇄로 구성된다. 경쇄와 중쇄 모두는 가변 및 고정 영역을 포함한다. 4 개의 쇄는 힌지 영역이라고 하는 중쇄의 플렉서블 영역(flexible region)에 위치한 디설파이드 결합에 의해 함께 고정되어 있다. 중쇄와 경쇄 모두의 가변 영역은 결합하여 두 개의 동일한 항원-결합 부위를 형성한다. 중쇄 고정 영역에 의해 면역글로불린 A(IgA), D(IgD), E(IgE), G(IgG) 및 M(IgM)인 다섯개 부류로 나누어진다. 보체 활성화, 식세포-Fc 수용체에의 결합, 항원-의존 세포독성과 같은 면역글로불린 분자의 기능은 중쇄의 Fc 영역에 존재하는 구조적 결정소에 의해 매개된다. 이러한 중쇄의 Fc 영역은 본 발명에 따른 Ig 융합 단백질의 구성 요소로서 사용되며 상기 모든 부류의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 단편" 은 면역글로불린 분자를 기능적으로 구분되는 단편들로 나누어지는데 이 가운데 항원 결합력은 없으나 쉽게 결정체를 형성하는 단편으로서 힌지 부위(hinge region), CH2 와 CH3 도메인이 결합하여 이루어지고 항체에서 효과물질 및 세포들과의 결합에 관여하는 부분을 가리킨다.
본 발명에서 "연쇄 융합된" 이란 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단에 또 다른 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단이 펩타이드 결합되어 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위 두 개가 하나의 긴 폴리펩타이드를 형성하고 있는 형태를 의미한다.
본 발명에서 "단순 융합된 단량체 단백질" 은 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 Ig 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 단량체 단백질은 편의상 "수용체 단백질 명칭/Fc" 로 표기할 수 있다. 예를 들면 LAG3 의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 단편이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질은 LAG3/Fc 로 표기된다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 단편이 IgG1 으로부터 유래된 경우에는 LAG3/IgG1Fc 로 표기된다.
본 발명에서 "단순 융합된 이량체 단백질" 은 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 이량체 구조의 Ig 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[수용체 단백질 명칭/Fc]2" 로 표기할 수 있다. 예를 들면 LAG3 의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 단편이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [LAG3/Fc]2 로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 단편의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 단편이 IgG1 으로부터 유래된 경우에는 [LAG3/IgG1Fc]2로 표기된다.
본 발명에서 "연쇄 융합된 단량체 단백질" 은 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 직렬의 연쇄체 형태로 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 Ig 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 단량체 단백질은 편의상 "수용체 단백질 명칭-수용체 단백질 명칭/Fc" 로 표기할 수 있다. 예를 들면, LAG3 의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 단편이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질의 LAG3 의 세포외역 가용성 부위에 또 다른 LAG3 의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질은 LAG3-LAG3/Fc 로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 단편의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 단편이 IgG1 으로부터 유래된 경우에는 LAG3-LAG3/IgG1Fc 로 표기된다.
본 발명에서 "연쇄 융합된 이량체 단백질" 은 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 이량체 구조의 Ig 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[수용체 단백질 명칭-수용체 단백질 명칭/Fc]2" 로 표기할 수 있다. 예를들면, LAG3 의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 단편이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질의 LAG3 의 세포외역 가용성 부위에 또 다른 LAG3 의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [LAG3-LAG3/Fc]2 로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 단편의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 단편이 IgG1 으로부터 유래된 경우에는 [LAG3-LAG3/IgG1Fc]2로 표기된다.
한편, 단순 융합된 단량체 단백질 또는 단순 융합된 이량체 단백질은 모두 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있으며, 연쇄 융합된 단량체 단백질 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허공개 WO 2003/010202 호에 기술된 제조방법을 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질은 (a) 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 유전자와 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자로부터 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하고, (b) 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물과 또 다른 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응으로 삽입하며, (c) 상기 제한효소 인식서열과 일치하는 제한효소를 사용하여, 상기 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물과 상기 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자의 제한효소 인식서열 부위를 절단하고, (d) 양쪽 DNA 서열의 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하며, (e) 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물을 벡터에 작동적으로 연결하여 재조합 발현 플라스미드를 작제하고, (f) 작제된 재조합 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키며, (g) 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적절한 조건하에서 배양하여 배양물로부터 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질을 분리 정제함으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 당쇄화된 Ig 융합 단백질은 부가적인 당쇄 결합 부위를 갖도록 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 서열상에 O-형 또는 N-형 당쇄수식이 발생하도록 하나 이상의 뉴클레오타이드를 변이시킨 후 그 DNA 를 진핵 숙주 세포를 통해 발현하면서 자연적으로 당쇄수식이 일어나도록 함으로써 제조할 수 있다. 한 가지 양태로서, 본 발명에 따른 당쇄화된 Ig 융합 단백질은 N-형 당쇄수식이 일어날 수 있는 Asn-X-Ser/Thr 서열이 부가 및/또는 증가하도록 수용체 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 서열을 변이시킴으로써 달성된다.
본 발명에서는 MHC Class II 분자를 포함하여 공조자극 분자로는 B7 분자를, 부착 분자로는 LFA-3 분자를, 사이토카인으로는 TNF를 예로서 설명하고자 한다.
"MHC Class II 분자" 의 경우 이 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체에는 CD4 및 LAG3가 있다. 따라서, MHC Class II 분자와 CD4의 결합을 차단하기 위하여 LAG3의 Ig 융합 단백질을 이용할 수 있다. 구체적으로 MHC Class II 분자와 CD4의 결합을 차단할 수 있는 물질에는 (1) MHC Class II 분자의 항체; (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 LAG3의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질; (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질; (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 LAG3의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 LAG3의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질; (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질; (6) 상기 (2) 내지 (5)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질이 포함된다.
"B7 분자" 의 경우 이 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체는 CD28과 CTLA4이다. 특히, B7 분자는 T 림프구의 표면상에 발현되어 있는 CD28과 결합하여 T 림프구를 활성화시키는데 반하여 또 다른 수용체인 CTLA4(T 림프구가 활성화된 이후에 발현된다)와 결합하게 되면 T 림프구의 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, B7 분자와 CD28의 결합을 차단하기 위하여 CTLA4의 Ig 융합 단백질을 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 B7 분자와 CD28의 결합을 차단할 수 있는 물질에는 (1) B7 분자의 항체; (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 CTLA4의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질; (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질; (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 CTLA4의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 CTLA4의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질; (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질; (6) 상기 (2) 내지 (6)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질이 모두 포함된다.
"LFA3 분자" 의 T 림프구 활성화 기능은 LFA-3과 T 림프구 표면상의 CD2와의 결합을 차단함으로써 억제할 수 있는데 그러한 물질로는 (1) LFA-3의 항체; (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 CD2의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질; (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질; (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 CD2의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 CD2의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질; (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질; (6) 상기 (2) 내지 (5)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질이 모두 포함된다.
"TNF" 의 면역 반응 활성화 기능은 TNF 와 T 림프구 표면상의 TNFR 의 결합을 차단함으로써 억제할 수 있는데 그러한 물질로는 (1) TNF 의 항체; (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 TNFR 의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질; (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질; (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 TNFR 의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 TNFR 의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질; (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질; (6) 상기 (2) 내지 (5)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질이 모두 포함된다.
III. 면역질환
본 발명에 따른 활성 성분은 T 림프구의 활성화를 억제할 수 있기 때문에 원치 않는 T 림프구의 활성으로 인하여 유발되는 각종 질병을 치료하는데 이용할 수 있다. 그러한 질병의 대표적인 예로는 장기 이식 합병증과 자가면역 질환이 있다.
"장기이식 합병증(Transplantation Rejection)"이란, 이식편(이식되는 생체의 일부로 세포, 조직 또는 장기)의 공여자와 수령자간의 유전적 배경이 상이하여 (1) 공여자의 이식편 유래 면역 세포가 수령자를 외부물질로 인식하여 공격함으로써 유발되는 질환(즉, 이식편대 숙주질환) 및 (2) 수령자가 공여자의 이식편을 외부물질로 인식하여 공격함으로써 유발되는 질환(즉, 이식편 거부반응)을 의미한다.
한편, 면역 세포가 자신과 이물질을 구별하지 못하고 자신을 공격하여 발생하는 질병을 자가면역 질환이라고 통칭하는데 구체적으로, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 다발성 경화증((Multiple Sclerosis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레브스 병(Grave' s Disease), 하시모토씨 갑상선염(Hashimoto' s Thyroiditis), 애디슨병(Addison' s Disease), 백반증(Vitilligo), 경피증(Scleroderma), 굿패스쳐 신드롬(Goodpasture syndrome), 베제트병(Becet' s Disease), 크론병(Crohn' s Disease), 강직성 척추염(Ankylosing Spondylitis), 포도막염(Uveitis), 혈소판 감소성 자반증(Thrombocytopenic purpura), 심상성 천포창(Pemphigus vulgaris), 소아당뇨병(Diabetes), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune Anemia), 크라일로글로불린증(Cryoglobulinemia), 부신백질이영양증(ALD), 전신성 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus, SLE) 등이 있다.
IV. 약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은 MHC Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질 및 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로 이루어진 그룹으로부터 2종 이상 선택된 활성 성분을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체에 혼입시킨 형태로 제공하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 "약제학적으로 허용되는 담체" 라고 한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈-계기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 약제학적 조성물은 국부, 경구, 비경구, 안내, 경피, 직장, 장관 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "비경구" 는 피하, 비내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 심장내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
한 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구적 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank' s solution), 링거 용액(Ringer' s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspension)으로 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수 양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 비휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시메틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.
앞서 제조된 액상 조성물은 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 또는 방사를 혼입시켜 대개 살균된다. 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형 조성물을 수득하여 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.
본 발명에 따른 활성 성분을 함유한 약제학적 조성물은 실온에서의 안정성을 증가시키고, 값비싼 저온 저장의 필요성을 줄이며, 저장 수명(shelf-life)을 연장하기 위해 동결건조시킬 수 있다. 동결건조 공정은 동결, 일차 건조 및 이차 건조의 연속 단계로 이루어질 수 있다. 조성물을 동결시킨 후의 이차 건조 공정은 압력을 강하하고 수증기의 승화를 위해 가열하는 것이다. 이차 건조 단계는 건조물로부터 흡수된 잔여 수분을 증발시키는 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물과 관련하여 사용되는 용어 "치료학적 유효량" 은 본 발명의 조성물이 적용되는 면역질환에 대하여 목적한 개선 또는 치료 효과를 달성할 수 있는 활성 성분의 양을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서 치료학적 유효량은 환자의 연령, 성별, 적용부위, 투여회수, 투여시간, 제형, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있지만, 예를 들면 0.01~1000㎍/kg/일, 보다 바람직하게는 0.1∼500㎍/kg/일, 가장 바람직하게는 1~100㎍/kg/일로 투여한다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나 이들 실시예는 단순히 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예 1은 LAG3에 관한 것이며, LAG3/Fc 또는 LAG3-LAG3/Fc의 아미노산 서열 및 코딩 DNA 서열 그리고 이들의 제조에 이용된 프라이머 서열들을 하기 표 1에 요약하였다.
〈표 1〉
LAG3-LAG3/Fc 서열 및 이의 제조에 이용된 프라이머 서열
Figure 112005032335836-PCT00001
〈실시예 1〉
본 발명에 따른 Ig 융합 단백질을 코딩하는 DNA 작제물의 제조
A. 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조
a. LAG3의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편
LAG3의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 EcoR I의 인식서열과 리더서열(서열번호 8의 펩타이드 1-22)의 코딩서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 한 프라이머(서열번호 1의 뉴클레오타이드)와, 제한효소 Spe I의 인식서열과 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머(서열번호 4번의 뉴클레오타이드)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
건강한 성인의 혈액을 채취하여 알피엠아이-1640[RPMI-1640(Gibco BRL, USA)] 배지와 1:1로 희석하고 이를 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque(Amersham, USA)]을 사용하여 밀도구배 원심분리(density-gradient centrifugation)하여 상부에 형성된 T 림프구 세포층을 얻었다. 그리고 알피엠아이-1640 배지로 3회 세척하고 여기에 10% 우태아혈청(FBS, Gibco BRL,5 USA) 함유 알피엠아이-1640 배지를 가하여 T 림프구 세포가 5× 105개/ml로 하고, 파이토헤마굴루티닌-엠[Phytohemagglutinin-M (Calbiochem, Germany)]을 2㎍/㎖로 첨가하여 자극하였다.
mRNA는 트리리에이젠트 [Tri-Reagent(MRC, USA)] mRNA 분리 키트를 이용하여 순수 분리하였다. 우선 인간 T 림프구 2× 107개의 세포를 인산완충 생리식염수용액(phosphate buffered saline, PBS, pH7.2)으로 3회 세척한 후 1㎖ 트리리젠트로 수차례 섞어서 RNA를 용해시켰다. 이 튜브에 0.2㎖ 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 강하게 흔들어준 후, 실온에서 15분간 방치한 다음, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 1.5㎖ 튜브로 옮기고 0.5㎖ 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버린 후, 침전물에, 75% 에탄올(Ethanol)-25% 디이피씨[DEPC(Sigma, USA)]를 처리한 3차 증류수를 1㎖ 첨가하여 2∼3회 섞은 후 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고 공기 중에서 건조시켜 잔여 에탄올을 제거한 후 RNA를 디이피씨를 처리한 3차 증류수 50㎕로 녹였다.
cDNA 합성은 1.5㎖ 튜브에 정제된 2㎍ mRNA와 1㎕ 올리고 디티[oligo dT(dT30, Promega, USA)] 프라이머를 10μM의 농도로 혼합하고, 70℃에서 2분간 가열한 후, 얼음에 넣어 2분간 냉각시켰다. 이 혼합물에 200U 엠-엠엘브이(M-MLV) 역전사효소[reverse transcriptase(Promega, USA)], 10㎕ 5× 반응완충용액(reaction buffer) [250mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 8.3, 375mM 염화칼륨(KCl), 15mM 염화마그네슘(MgCl2), 50mM 디티티(DTT)], 1㎕ 디엔티피[dNTP(각각 10mM의 농도, Takara, Japan)]를 넣고 디이피씨를 처리한 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후, 42℃에서 1시간 반응시켜 1차 cDNA를 합성하였다.
b. 면역글로불린 G1의 Fc 단편을 코딩하는 DNA 단편
면역글로블린 G1의 Fc 단편을 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 Spe I 의 인식서열과 IgG1의 힌지의 5' 말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호 5의 뉴클레오타이드)와 Xba I 의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호 6번의 뉴클레오타이드)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액세포(B 림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
c. 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물
상기 생성된 LAG3의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 면역글로브린 G1의 Fc 단편을 코딩하는 DNA 단편을 제한효소 Spe I 으로 소화시키고 티포 디엔에이 라이게이즈(T4 DNA ligase, USB, USA)를 이용하여 결합시킴으로써 단순 단량체 형태의 LAG3/Fc 유전자를 제작하였다.
d. 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝
상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(Stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS II(+)]의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호 7). 이때 생성된 융합 단백질은 단순 융합된 단량체 단백질로서 LAG3/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 서열번호 8에 해당한다.
B. 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조
LAG3의 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합된 유전자를 만들기 위해, 즉 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 만들기 위해, 제한효소 EcoR I의 인식서열과 리더서열(서열번호 8의 펩타이드 1-22)의 코딩서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 한 프라이머(서열번호 1의 뉴클레오타이드)와 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머(서열번호 2의 뉴클레오타이드)를 사용하여 하나의 LAG3 세포외역 가용성 부위의 단편을 증폭하였고, 또한 LAG3 세포외역 가용성부위의 리더 서열이 종료되는 부위(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 한 프라이머(서열번호 3의 뉴클레오타이드)와 제한효소 Xba I 의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호 6의 뉴클레오타이드)를 사용하여 다른 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 단편을 증폭하였다. 이 반응은 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 주형으로 사용하였다.
중합효소 연쇄반응은 1㎕ 1차 cDNA, 2U 피에프유(Pfu) DNA 중합효소[polymerase (Stratagene, USA)], 10㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [200mM 트리스-HCI, pH8.75, 100mM 황산암모늄 [(NH4)2SO4], 100mM 염화칼륨(KCl), 20mM 염화마그네숨(MgCl2)], 1% 트리톤(등록상표 Triton) X-100, 1mg/㎖ 우혈청알부민(BSA), 3㎕ 프라이머1(10μM), 3㎕ 프라이머2(10μM), 2㎕ 디엔티피(dNTP, 각각 10mM)를 넣고 3차 증류수로 100㎕가 되도록 첨가한 후 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 처리한 다음 95℃ 1분, 58℃ 1분30초, 72℃ 1분30초씩 31회 반응시키고, 72℃ 15분간 더 반응시켜 중합효소 연쇄반응 산물이 완전한 평활 말단(blunt end)이 되도록 하였다.
중합효소 연쇄반응 산물들을 0.8% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex II gel extraction kit(Qiagen, USA)]를 이용하여 순수 분리하였다. 순수분리된 중합효소 연쇄반응 산물들을 제한효소 BamHI으로 처리한 후 페놀/클로로포름 추출 방법으로 순수분리하였다. 이어서, BamHI으로 처리된 두 종류의 DNA 단편을 라이게이즈로 결합시켰다.
C. 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝
상기 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoR I 과 Xba I 으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 백터인 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KSⅡ(+), Stratagene, USA)]의 EcoR I /Xba I 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호 9). 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 LAG3-LAG3/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 서열번호 10에 해당한다.
벡터로 사용할 10㎕ 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KSⅡ (+), Stratagene, USA)]를 15U EcoRI과 15U XbaI, 5㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [100mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100mM 염화마그네슘(MgCl2), 10mM 디티티 (DTT), 500nM 염화나트륨(NaCl)], 5㎕ 0.1% 우혈청알부민[BSA(Takara, Japan)]을 섞은 후, 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켜 DNA를 소화시켰다. 반응물을 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트 [Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]로 순수 분리하였다.
EcoRI과 XbaI으로 소화된 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA] 100ng과 제한효소로 소화시킨 20ng의 중합효소 연쇄반응 산물을 혼합하고 0.5U 티포(T4) DNA 라이게이즈[ligase(Amersham, USA)], 1㎕ 10X반응완충용액(reaction buffer) [300mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 7.8, 100mM 염화마그네슘(MgCl2), 100mM 디티티(DTT), 10mM 에이티피(ATP)]를 넣은 후 3차 증류수로 10㎕가 되도록 첨가한 후 16℃ 수조(water bath)에서 16시간 동안 반응시켰다.
한편, 대장균[E. coli Top10(Novex, USA)]을 리비듐 클로라이드(RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA)법으로 컴피턴트 세포(competent cell)를 만든 후 앞서 제조된 플라스미드로 형질전환시켜 암피실린(ampicillin, Sigma, USA)을 50㎍/㎖ 함유한 엘비(LB) 고체 배지에 도말하고 37℃에서 16시간 배양하였다. 생성된 콜로니들을 암피실린이 50㎍/㎖ 함유된 엘비(LB) 액체배지 4㎖에 접종한 후 37℃에서 16시간동안 진탕 배양하였다. 이 중 1.5㎖을 샘브룩(Sambrook J) 등의 문헌(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7.29, 1989)에 기술된 알칼리 분해(alkaline lysis)법으로 플라스미드를 소량 추출한 후, EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 클로닝의 유무를 확인하였다.
전체 코딩영역 서열은 다이데옥시 체인 터미네이션 [Dideoxy chain termination (Sanger F. et al. PNAS USA, 1977, vol.74, p.5483)] 법을 이용한 다음과 같은 DNA 서열화 방법에 의해 확인하였다. 상기의 알칼리 분해법으로 추출한 플라스미드와 시쿼네이즈(등록상표 Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA) 및 35S 디에이티피(dATP, Amersham, USA)를 사용하여 제품 사용법에 준하는 방법으로 DNA 서열화 반응을 진행시켰다. 6% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 위의 시료를 로딩(loading)하고 전압을 1800∼2000V 사이로 유지하여 젤의 온도를 50℃로 유지하면서 2시간 전기영동한 후, 건조시킨 다음 엑스레이 필름(Kodak, USA)에 2일 동안 노출시킨 후 DNA 염기 서열을 판독하였다.
〈실시예 2〉
본 발명에 따른 Ig 융합 단백질을 코딩하는 DNA 작제물의 제조
다른 단백질인 TNFR1, TNFR2, CD2 또는 CTLA4의 단순 융합된 이량체 단백질 및 연쇄 융합된 이량체 단백질은 전술한 실시예 1과 동일한 절차에 따라 제조할 수 있다. 보다 자세한 제조방법은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허공개 WO 2003/010202호를 통하여 확인할 수 있다. 관련된 TNFR1, TNFR2, CD2 또는 CTLA4 서열들을 아래 표 2에 나타내었다.
〈표 2〉
본 발명에 따른 Ig 융합 단백질 및 이의 코딩 서열
Figure 112005032335836-PCT00002
〈실시예 3〉
단순/연쇄 융합된 이량체 LAG3 융합 단백질의 발현 및 정제
챠이니즈 햄스터 난소 세포주 케이원(CHO-K1, ATCC CCL-61, Ovary, Chinese hamster, Cricetulus griseus)에서 융합 단백질을 발현시키기 위하여, LAG3-LAG3/Fc 융합 유전자를 포함한 블루스크립트 케이에스투 플러스 플라스미드를 형질 전환된 대장균에서 추출한 후, 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 얻은 LAG3-LAG3/Fc 단편을 동물세포 발현 벡터인 피씨알쓰리(pCRTM3, Invitrogen, USA) 플라스미드의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여, 재조합 발현 플라스미드를 pLAG33Ig를 제조하였다(도 3). 이 플라스미드를 pLAG33-Top10'이라 명명하였고, 2004년 1월 13일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM, 대한민국 서울시 서대문구 홍제 1동 361-221 유림빌딩 소재)에 기탁번호 KCCM-10556로 기탁하였다.
형질 감염은 상기 LAG3-LAG3/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드 pLAG33Ig DNA를 지브코 비알엘(Gibco BRL, USA)사의 리포펙타민(LipofectamineTM) 시약과 혼합함으로써 수정하였다. 1∼3× 105 세포/구의 농도의 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 케이원(CHO-K1) 세포를 6구 조직 배양판 (six-well tissue culture plate, Nunc, USA)에 접종하고 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 디엠이엠(DMEM) 배지에서 세포가 50∼80%가 되도록 배양한 후, 혈청이 없는 디엠이엠(DMEM) 배지에서 플라스미드 pLAG33Ig DNA를 1∼2㎍ 취하고, 리포펙타민(Gibco BRL,USA)을 2∼25㎕ 취하여 상온에서 15∼45분간 반응시킨 DNA-리포좀 혼합체(Liposome complex)를 세포 배양판에 첨가시켰다. 5시간동안 배양한 후 혈청이 20%가 함유된 디엠이엠(DMEM) 배지를 첨가하여 18∼24시간 배양하였다. 최초 형질 감염 후에 세포를 1.5mg/㎖의 제네티신(Geneticin, G418, Gibco BRL, USA)이 첨가된 10% 우태아혈청 디엠이엠(DMEM) 배지에서 3주간 배양하고, 형성된 집락을 분리하여 증폭배양하였다. 융합 유전자의 발현 여부는 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 사용한 효소 면역 검사법(ELISA)을 통해 검사하였다.
효소 면역 검사법(ELISA)은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 1mg/㎖ 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 0.1M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)에 1:2000으로 희석한 후, 96구 효소 면역 검사판(96-well flexible plate, Falcon, USA)에 100㎕씩 분주하고 랩으로 봉한 후 4℃에서 16시간 이상 방치하여 항체가 검사판 표면에 코팅되게 하였다. 이를 세척완충용액(washing buffer) [0.1% 트윈-20(Tween-20) 함유, 1X 인산완충 생리식염수(PBS, Phosphate buffered saline)]으로 3회 세척한 후 희석용액[(diluent buffer) 1X 인산완충 생리식염수 48.5㎖, 우태아 혈청 1.5㎖, 트윈-20 50㎕]을 180㎕씩 분주하였다. 첫 구(well)에 배양한 상층액 20㎕를 넣은 후 마이크로 피펫 (micropipette)을 이용하여 연속적으로 희석하였고, 양성 대조군으로 0.01㎍/㎕ 인간 면역글로블린(human IgG, Sigma, USA)을, 음성 대조군으로 형질감염되지 않은 챠이니즈 햄스터의 난소 케이원(CHO-K1) 세포의 배양액을 사용하여 동일하게 희석하였다. 희석이 끝난 96구 효소 면역 검사판(Falcon, USA)을 호일로 싸서 37℃에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 세척용액으로 3회 세척하였다. 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항-인간 면역글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 희석용액으로 1:5000 희석한 다음 이를 100㎕씩 분주하고 호일로 싼 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 세척용액으로 3회 세척한 후 티엠비 퍼옥시데이즈 시스템(TMB microwell peroxidase substrate system, KPL, USA)을 이용하여 발색시키고, 흡광기(microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan)로 파장 630nm에 대한 흡광도를 측정하여 발현 여부를 확인하였다.
이렇게 제조된 형질전환체(transfectant)가 생산한 융합 단백질을 정제할 목적으로 무혈청배지(serum free media) 중 CHO-S-SFM Ⅱ (Gibco BRL, USA)에 적응시키기 위하여 다음의 과정으로 진행하였다. 약 3× 105개의 세포를 6구판(6-well plate)에 접종한 후 16시간동안 5% CO2 37℃ 배양기에서 배양하여 정착시킨 후 현미경 하에서 약 30∼50%의 면적에 세포가 부착된 것을 확인하고 10% 우태아 혈청 함유 DMEM와 CHO-S-SFM Ⅱ의 비율을 8:2가 되도록 배지를 교체하여 배양하였다. 이 비율로 3회 계대 배양한 후, 각각 6:4의 비율로 3회, 4:6의 비율로 3회, 3:7의 비율로 3회, 2:8의 비율로 3회, 및 1:9의 비율로 3회 계대 배양한 후 최종적으로 100%, CHO-S-SFM Ⅱ 배지에서 계대 배양하여, 이의 발현량을 효소 면역 검사법을 이용하여 측정하였다.
이 세포들을 우혈청배지가 없는 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA) 배지에서 대량 배양후 각각의 융합 단백질을 함유한 배양액을 200× g, 12분간 원심분리하여 세포 찌꺼기들을 완전히 제거하고 프로테인 에이 컬럼(HiTrap protein A column, Amersham, USA)을 이용한 다음의 방법으로 순수 분리하였다. 20mM 인산화 나트륨(Sodium phosphate, pH 7.0, Sigma, USA)을 1㎖/min의 속도로 2분간 통과시킨 후, 10㎖ 배양액을 동일한 속도로 컬럼을 통과시켜 프로테인 에이에 융합 단백질이 결합하도록 하였다. 20mM 인산화 나트륨(pH 7.0)을 2분간 동일 속도로 통과시켜 세척한 후, 0.1M 시트르산(C6H8O7 . H2O. citric acid, pH 3.0, Sigma, USA)을 3분간 동일속도로 통과시키면서 500㎕씩 1.5㎖ 튜브에 순차적으로 추출물을 분주하였다. 이를 1M 트리스(Tris, pH 11.0, USB, Sigma)를 이용하여 pH 7.0으로 적정하였으며 각 튜브의 융합 단백질의 존재 유무는 상기에 기술한 효소면역 검사법(ELISA)을 통하여 확인하였다. 순수 분리한 융합 단백질은 센트리콘 30(Centricon 30, Amicon, USA)을 사용하여 4℃에서 2000× g, 30분간 원심분리하여 농축하였다.
〈실시예 4〉
단순/연쇄 융합된 이량체 단백질 CD2, CTLA4, TNFR의 발현 및 정제
단순/연쇄 융합된 이량체 단백질 CD2, CTLA4, TNFR의 발현 및 정제는 전술한 실시예 3과 동일한 절차에 따라 제조할 수 있었다. 보다 자세한 방법은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허공개 WO 2003/010202호를 통하여 확인할 수 있다. 한편, 이로부터 수득한 재조합 발현 플라스미드는 각각 pCD22Ig(도 1), pCT44Ig(도 2), pTR2Ig-Top'(도 4)이라 명명하였다.
아울러, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 순수 정제된 단백질들이 목적한 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [(CTLA4/Fc]2 및 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CD2-CD2/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2가 맞는지 여부를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시하였고 (도 5a), 마찬가지로 [TNFR1/Fc]2, [TNFR2/Fc]2, [TNFR2-TNFR1/Fc]2, [TNFR2-TNFR2/Fc]2에 대해서도 SDS-PAGE를 실시하였다(도 5b).
〈실시예 5〉
단순 융합된 이량체 단백질 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 또는 복합 처리에 따른 T 림프구의 증식 억제 효과 확인
A. 단순 융합된 이량체 단백질의 단독 처리에 따른 T 림프구의 증식 억제 효과 확인
발열 환자의 B 림프구에 엡스타인-바 바이러스(Ebstein-Barr virus)를 형질감염시켜 만든 B 림프구 세포주인 WT100B1S를 T 림프구의 항원제시세포로 사용하기 위하여 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 배양하였다. 이를 2,000rpm에서 2분간 침전시킨 후 5.0×105/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 다시 푼 다음 3,000 라드(rd)의 감마선(γ-ray)으로 조사(irradiation)시켰다.
T 림프구는 건강한 사람의 혈액에서 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque(Amersham, USA)]을 이용하여 분리한 다음 2.0×106세포/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640으로 배양하였다.
1차 혼합 림프구 반응[Primary Mixed Lymphocyte Reaction(MLR)]을 실행하기 위하여 상기 WT100B1S와 T 림프구를 150mm 세포 배양 접시에 각각 15㎖씩 섞고 3일간 배양한 후에 15㎖의 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640을 첨가하여 3일간 더 배양하였다. 총 6일간 배양한 후에 상기의 방법대로 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque (Amersham, USA)]을 이용하여 살아있는 T 림프구를 순수 분리하였다. 이렇게 분리한 림프구는 45%, 우태아 혈청, 45% 알피엠아이(RPMI) 1640, 10% 디엠에스오(DMSO)로 만든 배지를 이용하여 얼린 후 액체질소에 보관하였다.
1차 혼합 림프구 반응을 시킨 T 림프구를 2차 혼합 림프구 반응을 실시하기 위하여 녹인 후, 알피엠아이(RPMI) 1640 배지를 이동하여 2회 세척하였고 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 3.0×105cells/㎖이 되도록 하였다.
항원제시세포로 사용할 WT100B1S는 상기의 방법대로 새로 배양한 후 3,000라드의 감마선(γ-ray)으로 조사(irradiation)시켜 준비하고 7.5×104cells/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 준비하였다. 이렇게 준비된 WT100B1S를 100㎕씩 96구 평판 세포 배양판에 넣고 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR2/FC]2, [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2을 각각 최종 농도 10, 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4㎍/㎖가 되도록 혼합한 후 상기 1차 혼합 림프구 반응을 시킨 T 림프구를 100㎕씩 첨가하였다. 이를 5% CO2 37℃ 배양기에서 2일간 배양한 후, 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640를 100㎕ 첨가하고 2일간 더 배양하였다. 총 4일간의 배양 중 마지막 6시간은 3H-타이미딘 [thymidine(Amersham)]을 1.2μCi/㎖가 되도록 첨가하여 배양하였다.
배양이 종료된 후 96구 세포 배양판을 4℃, 110×g, 10분간 원심 분리하여 T-림프구를 침전시켜 상층액을 제거하였고, 200㎕ 1X 인산완충용액으로 세척하였다. 동일한 조건으로 원심 분리한 후 인산완충용액을 제거하고, 남아있는 3H-타이미딘 [thymidine (Amersham)]을 제거하기 위해 차가운 200㎕ 10% 티씨에이 [trichloridic acid(TCA, Merck)]를 첨가하고 2분간 흔들어 준 후 5분간 4℃에서 반응시켰다.
위와 동일한 조건에서 원심 분리한 후 상층액을 제거하였으며 차가운 200㎕의 70% 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 5분간 방치하여 T 림프구를 고정하였다. 원심 분리한 후 상층액을 제거하였고, 상기의 방법과 동일한 조건으로 10% 티씨에이(TCA)를 처리하여 남아있는 3H-타이미딘 [thymidine(Amersham)]을 완전히 제거하였다.
여기에 100㎕의 2% 에스디에스 [SDS(pH 8.0)]/0.5N 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켜 세포 용해를 실시하였고, 25℃ 110×g 10분간 원심 분리하여 T 림프구를 침전시키고 상층액 중 50㎕를 96구 샘플판(Wallac)으로 옮겼다. 상층액에 1.5배의 옵티페이스 슈퍼믹스 [OptiPhase SuperMix(Wallac)]를 넣어 5분간 흔들어 준 후 액체흡광기 [1450 MicroBeta TriLux microplate liquid scintillation and luminescence counter(Wallac)]를 이용하여 3H에 대한 cpm값을 측정하여 T 림프구의 증식 여부를 확인하였다(도 6a).
도 6a에 나타낸 바와 같이 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR2/Fc]2, [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2은 모두 T 림프구의 증식을 억제하였으며, 이들 중에서도 [CTLA4/Fc]2와 [LAG3/Fc]2가 [TNFR2/Fc]2와 [CD2/Fc]2에 비하여 보다 효과적으로 T 림프구의 증식을 억제하였다.
B. 단순 융합된 이량체의 복합 투여에 따른 T 림프구의 증식 억제 효과확인
상기 실시예 5의 A와 동일한 절차에 따라 진행하되, 단순 융합된 이량체 단백질 대신에 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [TNFR2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2를 이용하여 T 림프구의 증식 억제 효과를 확인하였다(도 6b).
도 6b에 나타낸 바와 같이 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [TNFR2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2가 모두 T 림프구의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다. 또한, 단순 융합된 이량체 단백질을 복합 투여하는 경우가 단독 투여하는 경우 보다 T 림프구의 증식을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.
C. 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 투여에 따른 T 림프구의 증식 억제 효과 확인
상기 실시예 5의 A와 동일한 절차에 따라 진행하되, 단순 융합된 이량체 단백질 대신에 [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2를 이용하여 T 림프구의 증식 억제 효과를 확인하였다(도 6c).
도 6c에 나타낸 바와 같이 [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2가 모두 T 림프구의 증식을 억제함을 확인할 수 있었으며, 단순 융합된 이량체 단백질을 단독 투여할 때 보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질을 단독 투여할 때에 T 림프구의 증식이 보다 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
D. 연쇄 융합된 이량체 단백질의 복합 투여에 따른 T 림프구의 증식 억제 효과 확인
상기 실시예 5의 A와 동일한 절차에 따라 진행하되, 단순 융합된 이량체 단백질 대신에 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [TNFR2- TNFR2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [LAG3-LAG3/Fc]2를 이용하여 T 림프구의 증식 억제 효과를 확인하였다(도 6d).
도 6d에 나타낸 바와 같이 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [LAG3-LAG3/Fc]2가 모두 T 림프구의 증식을 억제함을 확인할 수 있었으며, 연쇄 융합된 이량체 단백질을 복합 투여한 경우가 단독 투여한 경우보다 T 림프구의 증식을 더욱 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 아울러, 이들 중에서도 [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [LAG3-LAG3/Fc]2 가 T 림프구 증식 억제 효과가 가장 뛰어남을 확인할 수 있었다.
〈실시예 6〉
단순 융합된 이량체 단백질 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 또는 복합 처리에 따른 콜라겐 유도 관절염의 완화 효과 확인
A. 단순 융합된 이량체 단백질의 단독 처리에 따른 관절염 완화 효과 확인
아스로젠 씨아이에이 보조제(Arthrogen-CIA adjuvant, Chondrex, USA) 중의 0.05M의 아세트산에 2mg/㎖의 농도로 녹인 타입 Ⅱ 콜라겐을 DBA/1 생쥐 한 마리당 꼬리에 100㎍씩 주입하여 콜라겐 유도 관절염(CIA; Collagen Induced Arthritis)을 발병시켰다. 부스팅(Boosting)은 3주 후에 하였으며 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freund's adjuvant, Difco, USA)를 이용하였다.
DBA/1 생쥐에 타입 Ⅱ 콜라겐 100㎍으로 면역화시킨 후에 3-4 주 후에 관절염 증상이 나타났다. 증상이 나타난 후 3-5일이 지나면 생쥐의 발이 빨갛게 부어오르며, 염증성 관절염(inflammatory arthritis)은 3-4주 이상 지속되었으며, 염증이 약화되어도 관절은 영구히 경직되었다. 관절염 심도의 주관적 척도를 나타내는 표 3에 근거하여 1주일에 2-3회 측정하였다(각 실험군에서 5마리 생쥐에서의 평균값을 구함).
〈표 3〉
관절염의 심도 스코어
Figure 112005032335836-PCT00003
관절염에 걸린 생쥐에 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR2/Fc]2, [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 또는 [LAG3/Fc]2를 각각 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 복강내 투여하였다. CD2/Fc, TNFR2/Fc, CTLA4/Fc 그리고 LAG3/Fc를 실험군당 5마리의 생쥐에 19일 내지 45일동안 2일에 한번씩 10 ㎍을 주사하고 관절염 심도의 변화를 관찰하였다(도 7a).
도 7a에 나타낸 바와 같이 단순 융합된 이량체 단백질을 단독 투여한 경우가 대조군으로 인산완충용액을 주사한 생쥐에서 나타난 관절염 심도의 정도와 비교할 때 45일 기준으로 약 26∼38% 감소된 효과를 보였다.
B. 단순 융합된 이량체 단백질의 복합 투여에 따른 관절염 완화 효과 확인
상기 실시예 6의 A와 동일한 절차에 따라 진행하되, 단순 융합된 이량체 단백질 대신에 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [TNFR2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2를 이용하여 관절염 완화 효과를 확인하였다(도 7b).
도 7b에 나타낸 바와 같이 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [TNFR2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2가 관절염을 완화시키는 것을 확인할 수 있었으며, 단순 융합된 이량체 단백질을 복합 투여하는 경우가 단독 투여하는 경우보다 관절염을 완화시키는 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.
C. 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 투여에 따른 관절염 완화 효과 확인
상기 실시예 6의 A와 동일한 절차에 따라 진행하되, 단순 융합된 이량체 단백질 대신에 [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2를 이용하여 관절염 완화 효과를 확인하였다(도 7c).
도 7c에 나타낸 바와 같이 [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2가 관절염을 완화시키는 것을 확인할 수 있었다. 이 때, 단순 융합된 이량체 단백질을 단독 투여한 경우보다 우수하고 단순 융합된 이량체 단백질을 복합 투여한 경우와 비슷한 정도의 관절염 완화 효과를 발휘하였다.
D. 연쇄 융합된 이량체 단백질의 복합 투여에 따른 관절염 완화 효과 확인
상기 실시예 6의 A와 동일한 절차에 따라 진행하되, 단순 융합된 이량체 단백질 대신에 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [TNFR2- TNFR2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [LAG3-LAG3/Fc]2를 이용하여 관절염 완화 효과를 확인하였다(도 7d).
도 7d에 나타낸 바와 같이 [CTLA4/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [TNFR2-TNFR2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2 + [LAG3-LAG3/Fc]2가 관절염을 완화시키는 것을 확인할 수 있었으며 특히, 연쇄 융합된 이량체 단백질을 복합 투여하는 경우가 단독 투여하는 경우 보다 관절염 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
〈실시예 7〉
단순 융합된 이량체 단백질 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 또는 복합 처리에 따른 이식편대 숙주질환 치료 효과 확인
A. 단순 융합된 이량체 단백질의 이식편대 숙주질환 치료효과
본 발명에서 사용한 마우스는 몸무게 20~25g의 8~12주령 암컷 마우스 C57BL/6과 BDF1[(C57BL/6 x DBA/2)F1]이며, 멸균된 사육장(filter-top microisolator)에서 사육하였다. 수령 마우스에게는 공여 마우스의 비장 세포를 주입하기 하루 전에 박트림(bactrim)을 투여하였다. BDF1 (H-2Kb/d) 수령 마우스는 연세대학교의 미생물학 교실로부터 전신에 700cGy의 감마선을 조사(irradiation)받은 것을 이용하였다. 공여 마우스로부터 수득한 비장 세포는 10% 알피엠아이(RPMI)에 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에 준비하였고, 세포는 400g에서 10분간 원심분리하여 수득하였다.
이식편대 숙주질환을 유발하기 위하여 앞서 감마선에 의해 조사된 BDF1 수령 마우스에게 동종 공여 마우스인 C57BL/6 마우스(H-2Kb)의 살아있는 비장 세포(25 x 106개)를 역방향 주입 방법을 이용하여 이식하였다.
상기 이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에게 단순 융합된 이량체 단백질인 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 각각을 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 여기서, 대조군 수령 마우스에게는 PBS를 투여하였으며, 상기 수령 마우스들의 생존율을 비교하기 위해서 격일로 몸무게를 측정하여 생존율을 계산하였다(도 8a).
도 8a에 나타낸 바와 같이 대조군 수령 마우스의 경우 이식편대 숙주질환으로 인하여 체중이 빠르게 감소하였고, 공여 마우스의 활성화된 T 림프구의 증식으로 인하여 수령 마우스의 비장 세포 수가 감소하였다. 결국은 비장 세포를 수령 마우스로 이식한지 2주 정도 경과한 후에 본 발명에 사용된 모든 대조군 마우스가 심각한 체중 감소를 나타냈으며, 사망에 이르렀다. 한편, 단순 융합된 이량체 단백질인 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [CTLA4/Fc]2를 각각 단독 투여받은 마우스의 경우에는 모두 이식편대 숙주질환에 의한 치사율이 대조군에 비하여 감소하였다. 상기와 같이 단순 융합된 이량체 단백질을 단독 투여한 경우에 [LAG3/Fc]2가 약 4주의 생존 기간을 보여서 가장 좋은 면역억제 효과를 나타내었으며, [CTLA4/Fc]2, [CD2/Fc]2의 순서로 생존율이 증가하는 결과를 보여주었다.
B. 단순 융합된 이량체 단백질의 단독 및 복합 투여에 따른 이식편대 숙주질환 치료효과
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 각각을 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 또 다른 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질의 혼합물 [CD2/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2 또는 [LAG3/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2를 각각 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 8b).
도 8b에 나타낸 바와 같이 실시예 7의 A에 따른 결과와 비교했을 때 단순 융합된 이량체 단백질을 단독으로 투여한 경우보다는 복합적으로 투여한 경우에 더 높은 생존율이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 특히 [LAG3/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2 혼합물을 투여한 경우에 개체 전원이 약 40일 이상의 생존기간을 나타냄으로써 이식편대 숙주질환에 의한 치사율을 가장 많이 감소시킴을 보여주었다. 이 결과를 각각 10마리의 마우스에서 평균생존기간을 계산하여 도표화하였으며(표 4), 이러한 결과는 이식편대 숙주질환의 치료에는 단순 융합 이량체 단백질을 1종 단독으로 사용하는 것보다는 2종 이상 복합적으로 투여하는 것이 더 좋은 치료효과를 달성함 수 있음을 보여주는 것이다.
〈표 4〉
단순 융합된 이량체 단백질의 단독 및 복합 투여에 의한 이식편대 숙주질환 치료효과 비교
Figure 112005032335836-PCT00004
C. 단순 융합된 이량체 단백질 및 연쇄 융합된 이량체 단백질에 의한 이식편대 숙주질환 치료효과 비교
(1) CTLA-4의 경우
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질인 [CTLA4/Fc]2을 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 8c).
도 8c에 나타낸 바와 같이 이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에게 [CTLA4/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 26일의 최대 생존 기간을 보인 반면에, [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 38일의 최대 생존 기간을 보였다. 이 결과를 각각 10마리의 마우스에서 평균생존기간을 계산하여 도표화하였다(표 5). 이러한 결과들은 단순 융합된 이량체 단백질보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질이 이식편대 숙주질환에 더 좋은 효과를 가지고 있음을 보여주는 것이다.
〈표 5〉
단순 융합된 이량체 단백질 및 연쇄 융합된 이랑체 단백질에 의한 이식편대 숙주질환 치료효과 비교
Figure 112005032335836-PCT00005
(2) TNFR2의 경우
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 8d).
도 8d에 나타낸 바와 같이 이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에게 [TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 20일의 최대 생존 기간을 보인 반면에, [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 35일의 최대 생존 기간을 보였다. 이러한 결과들은 단순 융합된 이량체 단백질보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질이 이식편대 숙주질환에 더 좋은 효과를 가지고 있음을 보여주는 것이다.
D. [TNFR2-TNFR2/Fc]2와 [TNFR2-TNFR2/Fc]2 및 [TNFR2-TNFR1/Fc]2에 의한 이식편대 숙주질환 치료효과 비교
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2-TNFR2/Fc]2 또는 [TNFR2-TNFR1/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 8e).
도 8e에 나타낸 바와 같이 이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에게 [TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 20일의 최대 생존 기간을 보인 반면에, [TNFR2-TNFR1/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 30일의 최대 생존 기간을 보였으며, [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에는 약 35일의 최대 생존기간을 보였다. 이러한 결과들은 단순 융합된 이량체 단백질보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질이 이식편대 숙주질환에 더 좋은 효과를 가지고 있음을 보여주는 것이다. 또한, [TNFR2-TNFR1/Fc]2와 [TNFR2-TNFR2/Fc]2는 효과면에서 거의 유사하였지만, [TNFR2-TNFR2/Fc]2가 보다 우수한 면역억제효과를 보유하고 있음을 확인하였다.
E. 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 또는 복합 투여에 따른 이식편대 숙주질환 치료효과
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [CD2-CD2/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [TNFR2-TNFR1/Fc]2를 각각 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질의 복합체인 [CD2-CD2/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2 또는 [LAG3-LAG3/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 각각 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 8f).
도 8f에 나타낸 바와 같이 대조군 마우스의 경우 상기 결과와 유사하게 약 2주 후에는 100% 치사율을 나타내었다(표 6). 실시예 7의 B에 따른 단순 융합된 이량체 단백질의 경우와 유사하게, 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 투여보다는 복합 투여가 보다 좋은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다. 연쇄 융합된 이량체 단백질을 복합 투여한 [CD2-CD2/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2와 [LAG3-LAG3/Fc]2 +[CTLA4-CTLA4/Fc]2의 경우에 비장세포 주입 후 약 10주까지도 각각 40%와 50%의 생존율을 나타내었다. 이러한 결과들은 이식편대 숙주질환의 치료를 위하여 연쇄 융합된 단백질을 복합적으로 투여하는 것이 더욱 좋은 치료 효과를 달성할 수 있음을 시사하는 것이다.
〈표 6〉
연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 또는 복합 투여에 따른 이식편대 숙주질환 치료효과 비교
Figure 112005032335836-PCT00006
본 발명에 따른 Ig 융합 단백질은 모두 T 림프구의 활성화를 억제함을 확인할 수 있었다. 특히, 단순 융합된 이량체 단백질 보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질의 억제 효과가 보다 우수하였다. 또한, 단순 융합된 이량체 단백질 및 연쇄 융합된 이량체 단백질은 단독 투여 보다는 복합 투여하는 경우에 T 림프구의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
기탁된 미생물 또는 기타 생물학적 재료의 표시사항
Figure 112005032335836-PCT00007
<110> MEDEXGEN CO., LTD <120> Pharmaceutical Composition for treatment of Transplantation Rejection comprising Concatameric Immunoadhesin <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer, oligo-LAG3-F-EcoRI <400> 1 ggaattcatg tgggaggctc agttcctggg c 31 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer, oligo-LAG3-R-5P <400> 2 agtgaggtta tacatgatgg agacgttg 28 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer, oligo-LAG3-F-5P <400> 3 ctccagccag gggctgaggt c 21 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer, oligo-LAG3-R-SpeI <400> 4 gactagttgg gggctccaga cccagaacag 30 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer, hIgG-F-SpeI <400> 5 gagtagtgca gagcccaaat cttgtgac 28 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer, hIgG-R-XbaI <400> 6 gctctagagc tcatttaccc ggagacaggg agag 34 <210> 7 <211> 1503 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(66) <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <223> LAG3/Fc <400> 7 atg tgg gag gct cag ttc ctg ggc ttg ctg ttt ctg cag ccg ctt tgg 48 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 gtg gct cca gtg aag cct ctc cag cca ggg gct gag gtc ccg gtg gtg 96 Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30 tgg gcc cag gag ggg gct cct gcc cag ctc ccc tgc agc ccc aca atc 144 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 ccc ctc cag gat ctc agc ctt ctg cga aga gca ggg gtc act tgg cag 192 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 cat cag cca gac agt ggc ccg ccc gct gcc gcc ccc ggc cat ccc ctg 240 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80 gcc ccc ggc cct cac ccg gcg gcg ccc tcc tcc tgg ggg ccc agg ccc 288 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 cgc cgc tac acg gtg ctg agc gtg ggt ccc gga ggc ctg cgc agc ggg 336 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 agg ctg ccc ctg cag ccc cgc gtc cag ctg gat gag cgc ggc cgg cag 384 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 cgc ggg gac ttc tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc 432 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 ggc gag tac cgc gcc gcg gtg cac ctc agg gac cgc gcc ctc tcc tgc 480 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 cgc ctc cgt ctg cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca 528 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 gga tct ctc aga gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc 576 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 cgc cct gac cgc cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag 624 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 ggc cga gtc cct gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc 672 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 ttc ctc ttc ctg ccc caa gtc agc ccc atg gac tct ggg ccc tgg ggc 720 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240 tgc atc ctc acc tac aga gat ggc ttc aac gtc tcc atc atg tat aac 768 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 ctc act gtt ctg ggt ctg gag ccc cca act agt gca gag ccc aaa tct 816 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Ser Ala Glu Pro Lys Ser 260 265 270 tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 864 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 275 280 285 ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 912 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 960 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 1008 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 1056 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 1104 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 1152 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 1200 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 1248 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 1296 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1344 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc 1392 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1440 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 1488 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 tcc ccg ggt aaa tga 1503 Ser Pro Gly Lys 500 <210> 8 <211> 500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Ser Ala Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly Lys 500 <210> 9 <211> 2211 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(66) <220> <221> CDS <222> (1)..(2208) <223> LAG3-LAG3/Fc <400> 9 atg tgg gag gct cag ttc ctg ggc ttg ctg ttt ctg cag ccg ctt tgg 48 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 gtg gct cca gtg aag cct ctc cag cca ggg gct gag gtc ccg gtg gtg 96 Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30 tgg gcc cag gag ggg gct cct gcc cag ctc ccc tgc agc ccc aca atc 144 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 ccc ctc cag gat ctc agc ctt ctg cga aga gca ggg gtc act tgg cag 192 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 cat cag cca gac agt ggc ccg ccc gct gcc gcc ccc ggc cat ccc ctg 240 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80 gcc ccc ggc cct cac ccg gcg gcg ccc tcc tcc tgg ggg ccc agg ccc 288 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 cgc cgc tac acg gtg ctg agc gtg ggt ccc gga ggc ctg cgc agc ggg 336 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 agg ctg ccc ctg cag ccc cgc gtc cag ctg gat gag cgc ggc cgg cag 384 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 cgc ggg gac ttc tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc 432 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 ggc gag tac cgc gcc gcg gtg cac ctc agg gac cgc gcc ctc tcc tgc 480 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 cgc ctc cgt ctg cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca 528 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 gga tct ctc aga gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc 576 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 cgc cct gac cgc cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag 624 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 ggc cga gtc cct gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc 672 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 ttc ctc ttc ctg ccc caa gtc agc ccc atg gac tct ggg ccc tgg ggc 720 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240 tgc atc ctc acc tac aga gat ggc ttc aac gtc tcc atc atg tat aac 768 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 ctc act ctc cag cca ggg gct gag gtc ccg gtg gtg tgg gcc cag gag 816 Leu Thr Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu 260 265 270 ggg gct cct gcc cag ctc ccc tgc agc ccc aca atc ccc ctc cag gat 864 Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp 275 280 285 ctc agc ctt ctg cga aga gca ggg gtc act tgg cag cat cag cca gac 912 Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp 290 295 300 agt ggc ccg ccc gct gcc gcc ccc ggc cat ccc ctg gcc ccc ggc cct 960 Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro 305 310 315 320 cac ccg gcg gcg ccc tcc tcc tgg ggg ccc agg ccc cgc cgc tac acg 1008 His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr 325 330 335 gtg ctg agc gtg ggt ccc gga ggc ctg cgc agc ggg agg ctg ccc ctg 1056 Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu 340 345 350 cag ccc cgc gtc cag ctg gat gag cgc ggc cgg cag cgc ggg gac ttc 1104 Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe 355 360 365 tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc ggc gag tac cgc 1152 Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg 370 375 380 gcc gcg gtg cac ctc agg gac cgc gcc ctc tcc tgc cgc ctc cgt ctg 1200 Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu 385 390 395 400 cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca gga tct ctc aga 1248 Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg 405 410 415 gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc cgc cct gac cgc 1296 Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg 420 425 430 cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag ggc cga gtc cct 1344 Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro 435 440 445 gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc ttc ctc ttc ctg 1392 Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu 450 455 460 ccc caa gtc agc ccc atg gac tct ggg ccc tgg ggc tgc atc ctc acc 1440 Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr 465 470 475 480 tac aga gat ggc ttc aac gtc tcc atc atg tat aac ctc act gtt ctg 1488 Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu 485 490 495 ggt ctg gag ccc cca act agt gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act 1536 Gly Leu Glu Pro Pro Thr Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 500 505 510 cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca 1584 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 515 520 525 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 1632 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 530 535 540 acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 1680 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 545 550 555 560 gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 1728 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 565 570 575 aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc 1776 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 580 585 590 agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 1824 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 595 600 605 aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1872 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 610 615 620 atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1920 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 625 630 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Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu 260 265 270 Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp 275 280 285 Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp 290 295 300 Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro 305 310 315 320 His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr 325 330 335 Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu 340 345 350 Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe 355 360 365 Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg 370 375 380 Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu 385 390 395 400 Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg 405 410 415 Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg 420 425 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cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa 192 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac 240 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt 288 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg 336 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg 384 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc 432 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg 480 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg 528 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg 576 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt 624 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc 672 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc 720 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca gct gaa ggg agc act ggc 768 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 gac gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 816 Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 260 265 270 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 864 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 275 280 285 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 912 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 290 295 300 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 960 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 305 310 315 320 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 1008 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 325 330 335 gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 1056 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 340 345 350 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 1104 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 355 360 365 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 1152 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 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Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 260 265 270 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 275 280 285 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 290 295 300 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 305 310 315 320 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 325 330 335 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 340 345 350 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 355 360 365 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 370 375 380 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 385 390 395 400 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 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tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca 1536 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 500 505 510 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 1584 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 515 520 525 acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 1632 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 530 535 540 gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 1680 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 545 550 555 560 aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc 1728 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 565 570 575 agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 1776 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 580 585 590 aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1824 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 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Leu Ser Pro Gly Lys 705 710 715 720 tga 2163 <210> 14 <211> 720 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 610 615 620 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 625 630 635 640 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 645 650 655 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 660 665 670 Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 675 680 685 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 690 695 700 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 705 710 715 720 <210> 15 <211> 1314 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1311) <223> CD2/Fc <400> 15 atg agc ttt cca tgt aaa ttt gta gcc agc ttc ctt ctg att ttc aat 48 Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 gtt tct tcc aaa ggt gca gtc tcc aaa gag att acg aat gcc ttg gaa 96 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac att cct agt ttt 144 Thr 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aac aac tac aag acc acg 1152 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 370 375 380 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 1200 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 385 390 395 400 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 1248 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 405 410 415 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 1296 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 420 425 430 ctg tct ccg ggt aaa tga 1314 Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 16 <211> 437 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr 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ggt gca gtc tcc aaa gag att acg aat gcc ttg gaa 96 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac att cct agt ttt 144 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 caa atg agt gat gat att gac gat ata aaa tgg gaa aaa act tca gac 192 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag act ttc aag gaa 240 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu 65 70 75 80 aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg aaa att aag cat 288 Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His 85 90 95 ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca ata tat gat aca 336 Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr 100 105 110 aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg aag att caa gag 384 Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu 115 120 125 agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc aac aca acc ctg 432 Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta aac ctg tat caa 480 Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln 145 150 155 160 gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc aca cac aag tgg 528 Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp 165 170 175 acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca ggg aac aaa gtc 576 Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val 180 185 190 agc aag gaa tcc agt gtc gag cct gtc agc tgt cct aaa gag att acg 624 Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Lys Glu Ile Thr 195 200 205 aat gcc ttg gaa acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac 672 Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp 210 215 220 att cct agt ttt caa atg agt gat gat att gac gat ata aaa tgg gaa 720 Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu 225 230 235 240 aaa act tca gac aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag 768 Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu 245 250 255 act ttc aag gaa aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg 816 Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu 260 265 270 aaa att aag cat ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca 864 Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser 275 280 285 ata tat gat aca aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg 912 Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu 290 295 300 aag att caa gag agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc 960 Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile 305 310 315 320 aac aca acc ctg acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta 1008 Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu 325 330 335 aac ctg tat caa gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc 1056 Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile 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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 565 570 575 tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 1776 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 580 585 590 ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1824 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 595 600 605 aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1854 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 610 615 <210> 18 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu 65 70 75 80 Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His 85 90 95 Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr 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ctt cgg cag gct gac agc cag 192 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 50 55 60 gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc 240 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 65 70 75 80 ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg 288 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 85 90 95 aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc 336 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 100 105 110 tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc 384 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 115 120 125 aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tct 432 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 130 135 140 gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 480 Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 145 150 155 160 gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 528 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 576 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 624 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 195 200 205 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 672 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 720 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 768 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 816 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 260 265 270 ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 864 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 275 280 285 acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 912 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 960 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 1008 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 1056 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 340 345 350 ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1104 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 355 360 365 aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1134 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 20 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 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tac agc aag 1392 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 450 455 460 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1440 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 465 470 475 480 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1488 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 485 490 495 tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1509 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 22 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 1 5 10 15 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 20 25 30 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 50 55 60 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 65 70 75 80 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 85 90 95 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly 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atc tct tct tgc aca gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg 384 Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc 432 Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe 130 135 140 aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg acc gtg cac ctc tcc tgc cag gag 480 Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu 145 150 155 160 aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc cat gca ggt ttc ttt cta aga gaa 528 Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175 aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt aag aaa agc ctg gag tgc acg 576 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 180 185 190 aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat gtt aag ggc act gag gac tca 624 Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 ggc acc aca gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca 672 Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 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Ser Lys Ala 325 330 335 aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 1056 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 1104 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg 1152 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1200 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 tcc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag 1248 Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1296 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1335 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 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Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 25 <211> 2028 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2025) <223> TNFR2-TNFR1/Fc <400> 25 atg gcg ccc gtc gcc gtc tgg gcc gcg ctg gcc gtc gga ctg gag ctc 48 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac 96 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag 144 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa 192 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac 240 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt 288 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg 336 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg 384 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc 432 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg 480 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg 528 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg 576 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt 624 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc 672 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc 720 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca gct gaa ggg agc gga tcc 768 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Gly Ser 245 250 255 ggg aac att tca ctg gtc cct cac cta ggg gac agg gag aag aga gat 816 Gly Asn Ile Ser Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp 260 265 270 agt gtg tgt ccc caa gga aaa tat atc cac cct caa aat aat tcg att 864 Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile 275 280 285 tgc tgt acc aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat gac tgt cca 912 Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro 290 295 300 ggc ccg ggg cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc ttc 960 Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe 305 310 315 320 acc gct tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa tgc 1008 Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys 325 330 335 cga aag gaa atg ggt cag gtg gag atc tct tct tgc aca gtg gac cgg 1056 Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg 340 345 350 gac acc gtg tgt ggc tgc agg aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt 1104 Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser 355 360 365 gaa aac ctt ttc cag tgc ttc aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg acc 1152 Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr 370 375 380 gtg cac ctc tcc tgc cag gag aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc cat 1200 Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His 385 390 395 400 gca ggt ttc ttt cta aga gaa aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt 1248 Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys 405 410 415 aag aaa agc ctg gag tgc acg aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat 1296 Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn 420 425 430 gtt aag ggc act gag gac tca ggc acc aca gca gag ccc aaa tct tgt 1344 Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys 435 440 445 gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 1392 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 450 455 460 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 1440 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 465 470 475 480 atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 1488 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 485 490 495 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 1536 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 500 505 510 cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 1584 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 515 520 525 cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 1632 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 530 535 540 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 1680 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 545 550 555 560 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1728 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 565 570 575 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 1776 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 580 585 590 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 1824 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 595 600 605 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 1872 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 610 615 620 gtg ctg gac tcc gac ggc tcc tcc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1920 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 625 630 635 640 gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1968 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 645 650 655 cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 2016 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 660 665 670 ccg ggt aaa tga 2028 Pro Gly Lys 675 <210> 26 <211> 675 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Gly Ser 245 250 255 Gly Asn Ile Ser Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp 260 265 270 Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile 275 280 285 Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro 290 295 300 Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe 305 310 315 320 Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys 325 330 335 Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg 340 345 350 Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser 355 360 365 Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr 370 375 380 Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His 385 390 395 400 Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys 405 410 415 Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn 420 425 430 Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys 435 440 445 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 450 455 460 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 465 470 475 480 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 485 490 495 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 500 505 510 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 515 520 525 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 530 535 540 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 545 550 555 560 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 565 570 575 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 580 585 590 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 595 600 605 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 610 615 620 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 625 630 635 640 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 645 650 655 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 660 665 670 Pro Gly Lys 675

Claims (10)

  1. MHC Class II 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 공조자극 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질, 부착 분자와 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질 및 사이토카인과 이의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 물질로 이루어진 그룹으로부터 2종 이상 선택된 물질을 활성 성분으로 포함하여 T 림프구의 활성화를 억제하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 MHC Class II 분자와 CD4의 결합을 차단할 수 있는 물질은 (1) MHC Class II 분자에 대한 항체, (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 LAG3의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질, (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질, (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 LAG3의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 LAG3의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질, (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (6) 상기 (2) 내지 (5)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 공조자극 분자는 B7, CD154, CD70, OX40L, ICOS-L, 4-1BBL, HVEM, FASL, PDL이고, 이들의 수용체는 각각 CD28과 CTLA-4, CD40, CD27, OX40, ICOS, 4-1BB, LIGHT, FAS, PD-1인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 B7 분자와 CD28 의 결합을 차단할 수 있는 물질은 (1) B7 에 대한 항체, (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 CTLA4 의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질, (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질, (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 CTLA4 의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 CTLA4 의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질, (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (6) 상기 (2) 내지 (5)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 부착 분자는 LFA-3, ICAM-1, VCAM-1이고, 이들의 수용체는 각각 CD2, LFA-1, VLA-4인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 LFA-3 와 CD2 의 결합을 차단할 수 있는 물질은 (1) LFA-3 에 대한 항체, (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 CD2 의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질, (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질, (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 CD2 의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 CD2 의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질, (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (6) 상기 (2) 내지 (5)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-1, IL-2, 1L-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF이고 이의 수용체는 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, TNFR, TGFR, IFNR, 인터페론-α R, -β R 및 -γ R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMpl, gp130인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, TNF 와 TNFR 의 결합을 차단할 수 있는 물질은 (1) TNF 에 대한 항체, (2) 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 TNFR 의 세포외역 가용성 부 위가 결합하여 형성된 단순 융합된 단량체 단백질, (3) 상기 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 단순 융합된 이량체 단백질, (4) 상기 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 TNFR 의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 TNFR 의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 결합하여 형성된 연쇄 융합된 단량체 단백질, (5) 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (6) 상기 (2) 내지 (5)에 따른 단백질의 당쇄화된 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역 질환 또는 장기이식 합병증인 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 그레브스병, 하시모토씨 갑상선염, 애디슨병, 백반증, 경피증, 굿패스쳐 신드롬, 베제트병, 크론병, 강직성 척추염, 포도막염, 혈소판 감소성 자반증, 심상성 천포창, 소아 당뇨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 크라일로글로불린증, 부신백질이영양증 및 전신성 홍반성 낭창으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 치료용 약제학적 조성물.
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