KR20050113290A - 복분자 추출물을 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복분자 추출물을 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암세포에 대하여 특이적인 증식 억제 효과를 나타내며, 암 세포의 DNA 합성을 억제하며, 암세포 사멸(apoptosis)을 유도할 수 있는 복분자 추출물을 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

Description

복분자 추출물을 포함하는 항암 조성물{ANTICANCER COMPOSITION CONTAINING RUBUS COREANUM EXTRACT}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 복분자 추출물을 포함하는 항암 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 세포주에 특이적인 증식 억제 효과를 포함하며, 암세포 DNA 합성을 억제하며, 암 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 복분자 추출물에 관한 것이다.

[종래기술]

경제가 발달하고 식생활이 서구화됨에 따라 발병하는 질병의 형태가 변화되면서, 암 발생과 암에 의한 사망률이 현격히 증가하고 있는 추세이다. 한국중앙암등록사업 2002년도 보고서에 의하면 2002년 한 해 동안 등록된 암환자는 99,025명으로 2001년에 비해 7.7%가 증가하였다(한국중앙암등록사업 2002년도 보고서, 2004). 또한 각종 암으로 사망할 확률이 남자는 25.4%, 여자는 14.0%으로 나타나, 암이 순환기 질환과 더불어 주요 사망 원인으로 조사되었다(2001년 생명선 작성 결과, 2004). 여러 환경의 변화에 의해 암이 발생하는 신체 부위도 변화하여, 발생 빈도가 비교적 낮았던 대장암, 전립선암, 유방암의 발생 빈도가 급증하고 있다(한국중앙암등록사업 2002년도 보고서, 2004).

암 치료는, 종래엔 암이 처음 발생한 부위에 국한되어 다른 부위로 전이되지 않은 경우에는 수술 및 방사선 치료 등을 시행하고, 암이 전신에 퍼져 있거나 전이가 된 환자 또는 재발한 환자는 항암제를 이용한 항암 화학요법을 실시하였다. 그러나 최근에는 근치적인 수술이나 방사선 치료 후 재발의 방지 또는 완전 치유를 위하여 미리 예방적 항암 화학요법을 실시하기도 한다. 그러나 항암화학요법에서 환자에게 투여되는 항암제는 암세포만 골라 죽이지 못하므로 정상세포들도 손상을 입게 되며 이로 인하여 여러 가지 부작용들이 유발되어, 암 예방 및 치료 효과가 뛰어나며서 부작용이 없는 암예방제나 항암제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

부작용이 없는 암예방제나 항암제를 개발하기 위한 일환으로, 천연물로부터 항암 효능을 갖는 물질을 찾는 연구가 세계 각국에서 활발하게 이루어지고 있으며, 우리나라에서도 자생하는 채소나 약용 식물 등의 항암 연구가 진행되고 있다(Hwang YK et al., 1998; Kim J-B et al., 2001; Bae J-H & Kim J-E, 2004; Yim H-B et al., 2004).

한편, 복분자는 장미과의 낙엽관목인 루부스 코리아넘(Rubus coreanum)의 덜 익은 열매, 즉 미성숙과실을 일컫는다. 복분자는 예로부터 식용으로 이용되고 있을 뿐만 아니라 한방이나 민간에서 치료의 목적으로 약재로 사용되고 있다. 복분자는 보간신, 명목 및 이뇨 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Bae GH. The medicinal plants of korea. p.231 Kyohak Publishing Co. Ltd, 2000).

루부스 코리아넘의 줄기에서 탄닌 성분 (-)-에피카테킨, (+)-카테킨 및 프로안토시아니딘이 함유되어 있음이 확인되었고(Lee YA & Lee MW, Korean J Pharmacogn 26: 27-30, 1995), 다양한 플라보노이드 화합물이 잎에 함유되어 있음이 확인되었다(Lee MW. Yakhak Hoeji 39: 200-204, 1995; Kim MS, Pang GC, Lee MW. Yakhak Hoeji 41: 1-6, 1997). 또한 루부스 코리아넘의 미숙과, 완숙과 및 잎에서의 추출방법에 따른 추출물의 생리활성 비교실험이 이루어졌으며, 실험결과 추출 용매에 따른 차이는 없으나 미숙과가 완숙과와 잎에 비해 전자공여능과 아질산염 소거율이 우수하고, SOD (superoxide dismutase) 유사활성이 완숙과에 비하여 낮다는 것이 확인되었다(Cha H-S, Park M-S, Park K-M. Korean J Food Sci Technol 33(4): 409-415, 2001). 또한 윤 등(Yoon I, Cho J-Y, Kuk J-H, Wee J-H, Jang M-Y, Ahn T-H, Park K-H. Korean J Food Sci Technol 34(5): 898-904, 2002)은 복분자 완숙과 착즙액의 에틸아세테이트 가용 산성획분에서 항산화 활성이 있는 4-하이드록시벤조익산, 4-하이드록시-3-메톡시벤조익산, 3,4-디하이드록시벤조익산, 3,4,5-트리하이드록시벤조익산, 3,4-디하이드록시시나믹산 등을 동정하여 이를 보고한 바 있다.

그러나, 루부스 코리아넘 추출물의 항산화 활성에 관한 연구만 진행되고 있을 뿐, 특정 질환 특히 암에 대한 예방 또는 치료 효과에 관한 직접적인 연구는 이루어지지 못한 실정이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 복분자 추출물을 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 항암 효과가 우수하며 부작용이 없는 복분자 추출물을 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 복분자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 인체 안전성이 확보된 식물체를 대상으로 항암제를 연구하던 중, 복분자 추출물이 암세포 증식을 특이적으로 억제하며 암세포 세포사멸을 유도할 수 있음을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 복분자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다. 복분자는 시중에 유통되는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 또는 복분자 나무의 미성숙 열매 또는 성숙 열매를 사용할 수 있다.

복분자 추출물은 물 또는 유기용매로 추출 및/또는 분획하여 제조할 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 저가 알콜 또는 알콜희석수, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 아세톤일 수 있으며, 상기 저가 알콜은 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하기로는 물로 열수추출한 복분자 물추출물, 에탄올 희석수로 추출한 에탄올 추출물, 상기 복분자 물추출물을 에틸아세테이트로 층분리한 복분자 에틸아세테이트 추출물 또는 상기 복분자 물추출물을 에틸아세테이트로 층분리하여 복분자 에틸아세테이트 추출물을 제거하고 남은 잔류물을 폴리스티렌/디비닐벤젠 수지가 충진된 컬럼상에서 용출시킨 분획일 수 있다. 상기 분획은 용출 용매, 예컨대 증류수, 알콜 또는 알콜 희석수에 따라 각각 수득할 수 있으며, 바람직하기로는 50 % 에탄올로 용출시켜 수득할 수 있다.

일예로, 복분자 추출물은 복분자 100 g당 물 또는 유기용매 0.2 내지 2 L를 가한 후 추출액 또는 층분리된 분액을 분리하는 방법으로 실시된다. 추출 및 층분리 온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다. 다만 복분자 물추출물은 50 내지 120 ℃에서 열수추출하는 것이 좋다. 추출시간은 한정되진 않으나 2 내지 24시간일 수 있다. 상기 추출액 및 분액은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 용매를 제거한다.

본 발명에 따른 복분자 추출물은 암세포주의 증식을 억제하며, 특히 복분자 물추출물은 전립선암, 유방암 및 대장암 세포에 대하여 현저한 암세포 증식 억제 활성을 나타낸다(도 1a-도1c). 반면에 정상세포에 대해선 매우 낮은 수준의 세포 증식 억제 활성을 나타낸다(도 1d). 뿐만 아니라 복분자 에탄올 추출물(도 2), 복분자 에틸아세테이트 추출물(도 3) 및 복분자 분획(도 3) 역시 현저한 항암활성을 갖는다. 상기한 항암활성은 복분자 추출물의 암세포 DNA 합성 억제(도 4) 및 암세포사멸 유도(도 5 및 6) 효과와 관련있는 것으로 추정된다.

이에, 본 발명에서는 상기 복분자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다. 상기 복분자 추출물은 바람직하기로는 복분자 물 추출물, 복분자 에탄올 추출물, 복분자 에틸아세테이트 추출물 또는 복분자 분획이다.

본 발명의 항암 조성물은, 상기 유효성분을 각각 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 유효성분은 항산화성 조성물에 0.1 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으나, 통상 0.001 내지 50 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 항암 조성물은 각종 암, 예컨대 위암, 유방암, 대장암, 전립선암 또는 간암의 예방 및 치료의 목적으로 사용가능하다.

상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용가능하다. 또한 항암 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 항암 조성물은 약제, 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제 등으로 사용가능하다. 항암 조성물은 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있으나, 바람직하기로는 경구 투여이다. 항암 조성물은 약제로 사용되는 경우 항암제일 수 있으며, 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제로 사용되는 경우, 각종 식품류, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 항암 조성물은 최종 제조된 약제, 식품 또는 음료에 0.001 내지 50 중량%으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

항암 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

본 발명에 따른 항암 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 항암 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나, 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되진 않는다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 복분자 물추출물 제조

복분자는 복분자 딸기의 미숙과를 건조한 것으로 구입하였다. 증류수 1 L에 복분자 100 g을 넣고 100 ℃로 가열하여 12시간 추출하였다. 추출액은 왓트만 여과지(Whatman filter)로 여과한 다음 -70 ℃로 냉동시킨 후 동결 건조기로 분말 상태가 될 때까지 건조하여 제조하였다.

실시예 2: 복분자 에탄올 추출물 제조

95% 에탄올 1L에 복분자 100 g을 넣고 70 ℃로 가열하여 12시간 추출 한 후 왓트만 여과지로 여과하였다. 여과액은 진공회전증발기로 에탄올을 제거 및 농축한 다음 동결건조기로 분말 상태가 될 때까지 건조시켜 제조하였다.

실시예 3: 복분자 분획 제조

실시예 1의 방법으로 제조한 복분자 물추출물 건조물 18 g을 200 ㎖의 증류수에 녹이고, 여기에 에탄올(주정)을 가하여 에탄올 농도 70%가 되도록 한 후 4 ℃에서 24시간 방치하여 불용성 고분자 물질 (분획1)과 70% 에탄올 가용성 수용액(분획2)으로 분리하였다. 분획2를 농축하여 에탄올을 제거하고, 여기에 에틸아세테이트를 가한 후 분획하여 저분자성 비극성 물질(분획3)과 잔류물(분획4)를 각각 분리하였다. 분획 4를 농축하여 용매를 제거하고, 증류수에 용해시켜 이온교환수지(Diaion HP-20)가 충진된 컬럼(40 mm x 500 mm)에 주입하였다. 용출 용매로 증류수 100%를 흘려주어 용출되는 분획물을 분획5로 수득하고, 용출 용매로 증류수 및 에탄올 혼합물(1 : 1 부피)을 2차로 흘려주어 용출되는 분획6을 수득하였으며, 다시 에탄올 100 %로 흘려주어 용출되는 분획7을 수득하였다.

상기에서 수득한 분획1 내지 분획7은 각각 감압농축 및 동결건조하여 분말화하였다.

실험예

가. 암 세포주 및 시약

인간의 대장암 세포인 HT-29 세포, 인간의 전립선암 세포인 DU145 세포, 인간의 유방암 세포인 MCF-7 세포와 흰 쥐의 소장 상피 세포인 IEC-6 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포 배지는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutrient Mixture Ham's F12)를 사용하였으며, 상기 배지, FBS(fetal bovine serum), 트립신-EDTA, 페니실린-스트렙토마이신, 트랜스페린 및 셀레늄 등은 Gibco/BRL(Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. BSA(Bovine serum albumin, DMSO(dimethysulpoxide), 7-아미노-액티노마이신D, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 등의 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한 아넥신 V 피코에리트린(Phycoerythrin: PE)는 BD Biosciences Phamingen (Franklin Lakes, NJ, USA)에서, 세포 증식 ELISA 및 BrdU (colorimetric) 분석 키트는 Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Germany)에서 구입하였다. 아울러, 세포 배양에 사용한 1회용 멸균 용기는 Corning (Corning, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다.

나. 세포배양

HT-29 세포, DU145 세포, MCF-7 세포와 IEC-6 세포는 37℃ 습윤한 CO₂ incubator (5% CO₂/95% air)에서 배양하였다.

HT-29 세포, DU145 세포, MCF-7 세포는 DMEM/F12 배지에 10% FBS, 100 units/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가한 배양액에서 배양하고, IEC-6 세포는 여기에 10 ㎍/㎖ 인슐린이 더욱 첨가된 배지에서 배양하였다. 세포가 80% 컨플루언트로 배양되면 PHS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% 트립신-2.65 mM EDTA를 처리하여 계대 배양하였고 배지는 2일마다 교체하였다.

다. 복분자 추출물의 암 세포 증식 억제 효과 검증

각 암 세포를 FBS가 포함된 배지로 희석하여 50,000 세포/웰의 밀도로 24 웰 플레이트에 분주하였다. 24시간 후 FBS가 없는 혈청 결핍성 배지(DMEM/F12, 트랜스페린 5 ㎍/㎖, 셀레늄 5 ng/㎖, BSA 0.1 mg/㎖)로 교환한 다음 24시간 배양하였다. 이후 다시 실시예 1 내지 3의 복분자 추출물이 각각 농도별로 포함된 혈청 결핍성 배지를 제조하여 교체하였다. 실시예 1의 복분자 물추출물은 혈청 결핍성 배지에 용해시켜 사용하였고, 실시예 2의 복분자 에탄올추출물는 DMSO에 용해시켜 사용하였으며, 실시예 3의 각 복분자 물추출물 분획은 혈청 결핍성 배지에 용해시켜 40 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 또한 복분자 추출물II 실험시에는 DMSO의 영향을 배제하기 위해 모든 군에 동일량(0.4%)의 DMSO를 첨가하였다.

복분자 추출물을 첨가한 후 24 시간 또는 48 시간 배양한 후, MTT 분석(Denizot F, Lang R. J Immunological Methods 1986; 89: 271-277.) 방법으로 살아있는 세포수를 측정하여 복분자 추출물이 세포 증식에 미치는 영향을 조사하였다. MTT 분석은 미토콘드리아 내에 존재하는 숙시네이트-디하이드로게나제가 MTT를 환원하여 푸른색의 포르마잔을 형성한다는 원리에 기초한 방법으로, 본 실험에서는 다음과 같이 실시하였다. 세포 배양액을 제거한 후 1 mg/ml의 농도로 MTT를 포함하는 DMEM/F12를 24-웰 플레이트에 웰당 1 ml씩 첨가하고 37℃ 습윤한 CO₂ 배양기(5% CO₂/95% air)에서 3 시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 형성된 포르마잔을 0.5 ml 이소프로판올을 첨가하여 용해시킨 후 이를 570 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

도 1a 내지 1d는 복분자 물추출물의 암세포 증식 억제효과를 나타낸 그래프(mean ± SEM, n = 6)로, a는 대장암 세포인 HT-29 세포이고, b는 전립선암 세포인 DU145 세포이고, c는 유방암 세포인 MCF-7 세포이고, d는 흰 쥐의 소장 상피에서 유래한 정상세포인 IEC-6 세포이다.

도 1a 내지 1d에서, 복분자 물추출물에 의한 대장암 세포 증식 억제 작용은 복분자 물추출물 첨가 후 24시간부터 나타났으며 시간이 지날수록 세포 증식 억제 작용은 현저히 나타났고, 복분자 물추출물의 처리 농도에 의존적으로 세포 증식이 억제되었다(도 1a). 또한 복분자 물추출물은 전립선암 세포인 DU145 세포의 세포 증식을 현저히 억제하였으며 복분자 물추출물을 400 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 경우 48 시간 경과시 약 71.5%의 세포 증식 억제가 확인되었다(도 1b). 유방암 세포에서는 복분자 물 추출물에 의한 세포 증식 억제효과가 관찰되었으나 대장암 세포와 전립선암 세포에서의 억제 효과에 비하여 낮게 확인되었다(도 1c). 아울러, 복분자 물추출물의 정상세포의 증식에 미치는 영향을 조사한 결과, 복분자 물추출물 처리 24시간 후 IEC-6 세포의 증식에 유의적인 억제 효과가 관찰되지 않았고, 48 경과시 200 ㎍/㎖ 또는 400 ㎍/㎖로 처리한 군에서 각각 14.5% 및 16.8%의 세포 증식 억제가 관찰되었으나(도 1d), 이는 암세포 증식 억제 효과에 비하여 현저히 낮다.

도 2는 복분자 에탄올추출물의 대장암세포인 HT-29 세포에 대한 증식 억제효과를 나타낸 그래프(mean ± SEM, n = 6)이다. 복분자 에탄올추출물의 처리 농도에 비례하여 세포증식이 억제되어 48시간 경과시 200 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖의 농도에서 각각 11.0% 및 12.1%의 세포 증식 억제 효과가 관찰되었다. 그러나, 상기 도 1a에서 복분자 물추출물을 HT-29 세포에 400 ㎍/㎖의 농도로 처리한 경우 세포 증식이 약 51.5% 억제된 경우에 비하여 낮은 결과로, 이는 복분자 물추출물이 복분자 에탄올추출물에 비하여 강력한 암세포 증식 억제 효과가 있음을 의미한다.

도 3은 복분자 물추출물 분획(40 ㎍/㎖)의 대장암세포인 HT-29 세포에 대한 증식 억제효과를 나타낸 그래프(mean ± SEM, n = 6)이다. 복분자 물 추출물 분획1 내지 7은 각각 대장암 세포 증식에 다양한 영향을 나타내었으며, 특히 분획3 내지 분획7이 세포 증식 억제효과를 나타내었고 그중 분획6의 대장암세포 증식 억제효과가 매우 현저하였다.

라. 복분자 추출물의 DNA 합성 저해효과 검증

복분자 추출물이 세포의 DNA 합성에 미치는 영향을 조사하기 위해 BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)가 세포의 DNA에 삽입되는 정도를 측정하였다.

대장암세포인 HT-29를 FBS가 포함된 배지로 희석하여 6,000 세포/웰 밀도로 96 웰 플레이트에 분주하고, 24시간 경과후 혈청 결핍성 배지에서 24시간 배양하였고, 이후 복분자 물추출물을 100 내지 200 ㎍/㎖로 첨가하여 48시간 더욱 배양하였다. 이후 세포에 10 μM BrdU을 첨가하여 5시간 배양한 후 세포를 고정하였고, 항-BrdU-POD을 첨가하여 90분간 배양하였다. 기질로 테트라메틸-벤지딘을 15분간 반응시키고 1M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험은 세포 증식 ELISA, BrdU (colorimetric) 분석 키트를 이용하여 실시하였다.

도 4는 복분자 물추출물에 의한 대장암세포에서의 DNA 합성 억제효과를 나타낸 그래프로, 복분자 물추출물은 대장암세포의 DNA 합성을 현저히 억제함을 확인할 수 있다.

마. 복분자 추출물에 의한 암세포 세포사멸 유도 효과 검증

i) DNA 단편화(laddering) 측정

대장암세포 HT-29를 2 x 10⁶ 세포/배양판의 밀도로 100 mm 배양판에 분주한 후 상기 실험과 동일한 방법으로 복분자 물추출물을 처리하였다. 복분자 추출물을 첨가하여 48시간 배양한 후 차가운 PBS를 넣어 세포를 긁어 모은 후 2000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포에 추출 완충액(50 mM Tris, 20 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, pH 7.5)를 넣어 4℃에서 2시간 교반하였다. 그 후 SDS를 1%가 되도록 넣고 4℃에서 2시간 교반하고, RNase A(0.5 mg/mL)를 첨가하여 37℃에서 2시간, 프로테나제K (0.5 mg/mL)를 첨가하여 42℃에서 2시간 교반하였다. 총 부피와 동일 양의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25:24:1) 혼합액을 넣어 잘 섞은 후에 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 상층액에 0.3 M 소듐아세테이트와 2.5부피배의 100% 에탄올을 넣어 DNA를 침전시킨 후, DNA를 70% 에탄올로 세척후 건조하였다. 건조된 DNA를 TE 완충액(20 mM Tris, 1mM EDTA)으로 녹인 후 260 nm, 280 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량한 뒤, 20 ㎍의 DNA를 1.5% 아가로즈 젤상에서 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 전개된 DNA 밴드 양상을 관찰하였다.

도 5는 복분자 물추출물에 의한 대장암 세포 DNA의 단편화를 나타낸 것으로, 세포의 세포사멸 초기에 나타나는 특징인 올리고뉴클레오티드 단편화 양상이 현저히 관찰되었다.

ii) FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석

대장암세포 HT-29를 50,000 세포/배양판의 밀도로 24 웰 플레이트에 분주하고, 상기 실험과 동일한 방법으로 복분자 물추출물을 처리하였다. 48시간 후 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 수집하고, 7-아미노-액티노마이신D (7-AAD)와 아넥신 V를 첨가하여 어두운 곳에서 20분간 염색하였다. 이후 유속세포기(flow cytometry)에서 아넥신 V 또는 7-아미노-액티노마이신 D에 의해 염색된 세포의 수를 측정하였다.

도 6은 복분자 물추출물에 의한 대장암세포 HT-29의 세포사멸 유도를 나타낸 것으로, 생존 세포의 수는 복분자 물추출물 처리 농도에 의존적으로 감소하였고, 초기 세포 세포사멸된 세포 수는 처리 농도에 의존하여 유의적으로 증가하였다. 이러한 결과는 복분자 물 추출물의 암세포 증식 억제 및 사멸에 작용하는 기작중 하나는 세포사멸 유도인 것으로 추정된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 복분자 추출물은 암 세포주에 대하여 특이적인 증식 억제 효과를 나타내며, 암세포 DNA 합성 억제 및 암세포 사멸 유도 활성을 포함하여, 다양한 암에 대한 예방 및 치료용도로 용이하게 사용가능하다.

도 1a 내지 1d는 복분자 물추출물의 암세포 증식 억제효과를 나타낸 그래프(mean ± SEM, n = 6)로, a는 대장암 세포인 HT-29 세포이고, b는 전립선암 세포인 DU145 세포이고, c는 유방암 세포인 MCF-7 세포이고, d는 흰 쥐의 소장 상피에서 유래한 정상세포인 IEC-6 세포이다.

도 2는 복분자 에탄올추출물의 대장암세포인 HT-29 세포에 대한 증식 억제효과를 나타낸 그래프(mean ± SEM, n = 6)이다.

도 3은 복분자 물추출물 분획(40 ㎍/ml)의 대장암세포인 HT-29 세포에 대한 증식 억제효과를 나타낸 그래프(mean ± SEM, n = 6)이다.

도 4는 복분자 물추출물에 의한 대장암세포에서의 DNA 합성 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 복분자 물추출물에 의한 대장암세포에서의 DNA의 단편화를 나타낸 것이다.

도 6은 복분자 물추출물에 의한 대장암세포 HT-29의 세포사멸 유도를 나타낸 것이다.

Claims (6)

1. 복분자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 복분자 추출물을 0.001 내지 50 중량%로 포함하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 복분자 추출물은 복분자를 물, 알콜, 알콜 희석수, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것인 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 복분자 추출물은

   (a) 복분자 열수추출물 제조단계;

   (b) 상기 복분자 열수추출물 건조물에 70 % 에탄올을 가하여 에탄올 가용성 수용액을 분리하는 단계;

   (c) 상기 에탄올 가용성 수용액은 에탄올을 제거한 후 에틸아세테이트를 가하여 층분리하는 단계;

   (d) 상기 에틸아세테이트 층분리에서 비극성 물질을 제거하고 잔류물을 분리하는 단계; 및

   (e) 상기 잔류물을 농축하여 용매를 제거하고, 증류수에 용해시켜 폴리스티렌/디비닐벤젠 수지가 충진된 컬럼에 주입한 후 증류수 및 에탄올 1:1 부피비의 혼합물을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하는 단계;

   를 포함하는 방법으로 제조된 것인 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약제, 식품, 식품첨가제, 음료, 또는 음료 첨가제인 항암 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 항암 조성물은 위암, 유방암, 대장암, 전립선암 또는 간암에 적용되는 것인 항암 조성물.