KR20050099705A - 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 및 이를이용한 식물의 제초제 저항성 증대방법 - Google Patents

합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 및 이를이용한 식물의 제초제 저항성 증대방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protoporphyrinogen oxidase) 유전자 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성 증대방법에 관한 것으로서 본 발명은 미생물 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 아미노산 서열은 변경하지 않고 염기 서열만을 식물이 선호하는 코돈으로 변환시킨 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 및 상기 유전자를 식물에 도입함으로써 식물의 제초제 저항성을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하여 형질전환된 식물을 선발하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 식물에 도입하는 경우 천연 유전자에 비해 식물의 제초제에 대한 저항성을 현저히 증가시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 합성 유전자는 형질전환 세포주의 선발을 위한 제초제 저항성 선발 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성 증대방법{Synthetic protoporphyrinogen oxidase gene and method for improving herbicide resistance of plant}
본 발명은 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protoporphyrinogen oxidase) 유전자 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성 증대방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 미생물 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 아미노산 서열은 변경하지 않고 염기 서열만을 식물이 선호하는 코돈으로 변환시켜 합성한 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 및 상기 유전자를 식물에 도입함으로써 식물의 제초제 저항성을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하여 형질전환된 식물을 선발하는 방법에 관한 것이다.
프로토포르피리노겐 IX(Protoporphyrinogen IX)으로부터 프로토포르피린 IX(Protoporphyrin IX)으로의 산화과정을 촉매하는 프로토포르피리노겐 옥시다아제는 엽록소 및 헴(Heme)을 생합성하는 포르피린 경로에서 분지점(branch point)의 마지막 단계에 관여하는 효소이다. 따라서, 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 생합성이 억제되고, 기질인 프로토포르피리노겐 IX이 정상적인 포르피린 합성경로에서 이탈되어 원형질막의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유사효소에 의해 프로토포르피린 IX으로 축적되게 한다. 이렇게 축적된 프로토포르피린 IX은 광상태 하에서 산소분자로부터 일중항 산소(singlet oxygen, 1O2)를 발생시켜 식물막 파괴를 일으킴으로써 식물체를 죽게한다(Jacobs et al., Plant Physiol. 97, 197-302, 1991; Lee et al., Plant Physiol. 102, 881-889, 1993).
상기 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 저해제로는 디페닐에테르(diphenyl ether), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피페리딘(piperidine), LS 유사체(LS analogue ), N-페닐이미드(N-phenylimide), M&B 유사체(M&B analogue), 옥사디아존 (oxadiazon), F-6285, 피라졸 페닐 에테르(pyrazole phenyl ether) 및 피롤리딘 (pyrrolidine) 등이 알려져 있다(Lee, Kor. J. Weed Sci. 17:243-255, 1997). 이러한 프로토포르피리노겐 옥시다아제 저해제들은 전세계적으로 재배되는 주요 작물들인 대두, 벼, 목화 및 땅콩 등의 재배지에 빈발하고 있는 일년생 화본과 잡초 및 광엽 잡초를 방제하는 제초제로서 광범위하게 사용되어 지고 있다(Lee, Kor. J. Weed Sci. 17, 243-255, 1997).
한편, 상기 프로토포르피리노겐 옥시다아제는 원핵 및 진핵 미생물로부터 수십 종이 클로닝되었고 그 특성이 규명된 바 있다. 상기 프로토포르피리노겐 옥시다아제는 제초제에 저항성을 가지는 유전자군과 민감성을 가지는 유전자군으로 분류된다. 상기 제초제 저항성 유전자군 및 제초제 민감성 유전자군들은 모두 식물에 제초제 저항성이 부여되도록 하기 위해 사용된 바 있다. 문헌에는 바실러스 서브틸리스 유래의 제초제 저항성 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 담배 또는 벼에 형질전환시킴으로써 상기 형질전환된 담배 또는 벼에 디페닐에테르계 제초제에 속하는 옥시플루오펜(oxyfluorfen)에 대한 저항성이 부여되었음이 보고된 바 있으며(Choi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:558-560, 1998; Lee et al., Plant Cell Physiol. 41:743-749, 2000), 애기장대 유래의 제초제 민감성 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 담배에 형질전환시킴으로써 액시플루오르펜 (acifluorfen)에 대한 저항성이 부여되었음이 보고 된 바 있다(Lemontova and Grimm, Plant Physiol., 2000:75-83, 2000).
또한, 대한민국특허 공개공보 제2003-84677호에는 마이소코쿠스 산투스 (Myxococcus xanthus) 유래의 제초제 민감성 프로토포르피리노겐 옥시다아제로 식물을 형질전환시켜 식물에 제초제 저항성이 부여되도록 한 바 있다.
상기 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제는 제초제에 의해 효소 활성이 강력히 저해되는 매우 높은 제초제 민감성을 가진 유전자로 알려져 있다. 그러나, 상기 제초제 민감성 유전자를 식물에 도입하는 경우에는 상기 유전자가 식물의 엽록체와 미토콘드리아에서 동시에 발현되어 오히려 식물의 제초제에 대한 저항성을 크게 증가시키는 특징이 있다.
한편, 상기 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자는 구아노신+사이토신(G+C) 함량이 70%로서, 식물 유전자의 평균 G+C 함량인 33-45% 보다 높으며(Do et al., Gene, 325, 17-24), 코돈 사용법이 식물 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자와 매우 상이하다. 즉, 상기 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자는 식물체가 자주 사용하지 않는 코돈으로 구성되어 있어, 상기 유전자를 식물체에 도입하는 경우 단백질 전이율이 매우 낮은 것으로 알려져 있다(Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328, 1991).
이에, 본 발명자들은 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 아미노산 서열은 변경되지 않도록 하면서 상기 유전자의 염기서열을 식물이 선호하는 코돈으로 변환시켜 인공적으로 합성하고 상기 합성 유전자로 식물을 형질전환시킨 다음 상기 식물의 제초제 저항성을 조사한 결과, 마이소코쿠스 산투스 유래의 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자로 형질전환한 식물에 비해 본 발명의 합성 유전자로 형질전환한 식물의 제초제 저항성이 현저히 증가됨을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen oxidase) 유전자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 합성 유전자를 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 제초제에 대한 저항성을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 합성 유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주의 선발 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen oxidase) 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 합성 유전자를 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 제초제에 대한 저항성을 증대시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 합성 유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주의 선발 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자는 마이소코쿠스 산투스 유래의 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 염기서열을 식물의 선호 코돈으로 변환시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 식물 내에서 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 발현율을 증대시킬 수 있도록 미생물 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 염기서열을 식물의 선호 코돈으로 인위적으로 변환하되 최종적인 아미노산 서열에는 변화를 주지 않는 합성 유전자를 고안하였다.
이를 위해 본 발명자들은 공지된 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자(GenBank Accession No. AF098938)를 기초로 하고 애기장대 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 코돈 사용례(Narita et al., Gene, 182:169-175, 1996)를 참고로 하여 총 길이가 1416bp인 마이소코쿠스 산투스 유래 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 중에서 327bp의 염기 서열을 변환하였으며, 472개의 코돈 중에서 323개의 코돈을 식물이 선호하는 코돈으로 변환하여 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 합성 유전자를 인위적으로 설계하였다. 이때, 상기 합성 유전자에 의해 암호화되는 471개의 아미노산은 천연 유전자와 동일하게 되도록 하였다.
상기에서 인위적으로 설계한 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자는 당 분야에 공지된 기술로 합성할 수 있다. 본 발명자들은 상기 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 제조하기 위해 상기 합성 유전자를 다수개의 이중가닥 DNA 단편으로 나누어서 각각 합성한 다음, 각기 합성된 DNA 단편을 서로 중합하는 방법을 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 제조하기 위해 상기 합성 유전자 전체를 6부분으로 나누어 6개의 이중가닥 DNA 단편을 합성하였다. 상기 6개의 이중가닥 DNA 단편은 각각 184∼294bp의 염기로 이루어져 있다(도 1a 참조). 상기 6개의 이중가닥 DNA 단편은 각 단편 당 49∼78 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 4개를 이용하여 제조하였다. 따라서, 본 발명자들은 6개의 이중가닥 DNA 단편을 제조하기 위해 24개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2 내지 서열번호 25)를 합성하였다. 상기 각각의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드는 2개씩 한 쌍을 이루도록 하고 각각의 올리고뉴클레오타이드 쌍의 3' 또는 5' 말단에 존재하는 염기의 일부분이 상보적이 되도록 설계하였다(도 1b 참조). 상기 올리고뉴클레오타이드는 당분야 공지된 올리고뉴클레오타이드 합성법에 따라 제조하였다. 당분야에 공지된 올리고뉴클레오타이드 합성법으로는 고상 포스파이트 트리에스테르 합성법(Narang S. A., Synthesis and Applications of DNA and RNA, Academic Press, 1987)이 대표적이며, 당업계에 상용화된 자동 핵산 합성기를 사용할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 합성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드의 각 쌍에 DNA 중합효소를 첨가하여 이중가닥 DNA 단편 당 2개의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 상기에서 합성된 2개의 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 결찰 (ligation)한 후 상기 결찰된 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 하여 PCR 증폭반응을 수행함으로써 6개의 이중가닥 DNA 단편 A, B, C, D, E 및 F를 합성하였다. 상기에서 합성한 6개의 이중가닥 DNA 단편을 중합하여 전체 길이가 1416bp로 이루어진 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 제조하였다(도 2 참조).
그 다음 본 발명자들은 본 발명의 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터 제조하고 이를 이용하여 식물에 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 도입시켰다.
본 발명의 합성 유전자를 삽입하기에 적합한 벡터는 본 발명의 합성 유전자를 식물 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 상기 "벡터"는 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명의 유전자는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 식물 세포 내로 본 발명의 유전자를 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드, 뿌리 유도성(Ri) 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다. 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자라면 상기에서 예시한 벡터 외에도 본 발명에 따른 유전자의 핵산 서열을 도입시키는 데 적합한 벡터를 선택할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바이너리 벡터 pGA1611:C(기탁번호 KCTC 0692BP)를 사용하였다. 상기 바이너리 벡터 pGA1611:C는 공지의 벡터 pGA1611 (Kang et al., Plant Mol. Biol. 38, 1021-1029, 1998)에 바실러스 섭틸리스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자가 삽입된 것이다. 본 발명자들은 당업계에서 잘 알려진 분자생물학적 기법을 사용하여, 상기의 바이너리 벡터 pGA1611:C에서 바실러스 섭틸리스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 제거하고, 여기에 본 발명의 합성 유전자를 삽입함으로써 재조합 벡터 pGA1611:SynMP를 제조하였다(도 3 참조).
또한, 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 방법으로는 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌 등에 공지되어 있다(An et al., EMBO J 4:227-288, 1985). 형질전환용 숙주로 사용되는 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용된다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 합성 유전자가 도입되도록 하였다(실시예 3 참조).
따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물을 제공한다. 상기 미생물로는 박테리아가 바람직하며, 그 예로는 대장균 또는 아그로박테리움 속 미생물이 있다.
한편, 상기와 같은 방법으로 본 발명의 합성 유전자가 도입된 형질전환 식물 들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기와 같은 방법으로 벼에 본 발명의 합성 유전자를 도입한 다음 재분화시킨 후 형질전환된 벼 게놈으로 도입된 본 발명의 합성 유전자가 다음 세대로 안정하게 전달되는지 여부를 확인하기 위하여, 하이그로마이신 저항성을 갖는 T0 세대의 형질전환 벼를 자가수분시켜 생산된 종자(T1 세대)를 하이그로마이신을 함유하는 배지에서 발아시켰을 때 나타나는 각 형질전환 세포주의 하이그로마이신 저항성 개체와 감수성 개체의 분리비를 조사하였다. 그 결과, 분리비는 약 3:1로 나타나 벼의 게놈에 1 카피로 삽입된 본 발명의 합성 유전자는 멘델의 법칙에 따라 분리 및 발현됨을 확인하였다(표 1참조).
나아가, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 합성 유전자가 형질전환된 벼의 게놈으로 안정하게 도입되었는지 여부 및 그 삽입 수를 평가하기 위해, T0 세대의 형질전환 벼 게놈 DNA를 추출하여 서던 블롯 방법을 수행한 결과, 형질전환 세포주의 게놈 DNA에 본 발명의 합성 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명의 합성 유전자가 mRNA 및 단백질로 안정하게 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, T1 세대의 형질전환 벼에 대하여 노던 블롯 분석을 수행한 결과, 형질전환 식물에서 본 발명의 합성 유전자의 mRNA가 발현됨을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 본 발명의 합성 유전자가 도입된 식물의 제초제 저항성을 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 도입시킨 식물과 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 합성 유전자가 도입된 식물이 천연 유전자가 도입된 식물에 비해 더 높은 제초제 저항성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6a 및 도 6b 참조).
따라서, 본 발명은 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 제초제에 대한 저항성을 증대시키는 방법을 제공한다.
상기에서 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 삽입하기에 적합한 벡터의 종류는 상술한 바와 같으며 이를 식물에 도입하는 방법도 상술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 제초제는 프로토포르피리노겐 옥시다아제 저해성 제초제인 것이 바람직하다. 상기 프로토포르피리노겐 옥시다아제 저해성 제초제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들면, 디페닐에테르계(diphenylethers), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 트리아졸리논계(triazo linones) 및 티아디아졸계(thiadiazoles) 등을 들 수 있다. 상기 디페닐에테르계 제초제로는 이에 한정되지는 않으나, 액시플루오르펜(acifluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 비페녹스(bifenox), 포메사펜(fomesafen), 락토펜(lactofen) 및 옥시플루오르펜(oxyfluorfen) 등이 포함된다. 상기 옥사디아졸계 제초제로는 이에 한정되지는 않으나, 옥사디아존(oxadiazon)이 포함된다. 상기 페닐프탈이미드계 제초제로는 이에 한정되지는 않으나, 플루미옥사진(flumioxazin) 및 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl)이 포함된다. 상기 트리아졸리논계 제초제로는 이에 한정되지는 않으나, 카펜트라존(carfentrazone) 및 설펜트라존(sulfentrazone)이 포함된다. 상기 티아디아졸계 제초제로는 이에 한정되지는 않으나, 플루티아셋-메틸 (fluthiacet-methyl) 및 티디아지민(thidiazimin)이 포함된다.
본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 특별히 한정되지 않으며 단자엽 또는 쌍자엽의 모든 식물에 적용이 가능하다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 보리, 평지, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장 및 벼 등을 포함할 수 있다. 상기 쌍자엽 식물의 예로는 사탕수수, 대두, 담배 및 목화 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주의 선발 방법을 제공한다. 상기 선발 마커 유전자는 목적으로 하는 유전자가 식물 세포 내에 효과적으로 삽입되었는지의 여부를 선택적으로 식별하기 위해 사용된다. 즉, 본 발명의 합성 유전자를 선발 마커 유전자로 사용하는 경우에 식물에 목적으로 하는 유용 유전자와 본 발명의 합성 유전자를 함께 도입하여 형질전환체를 제조하고 상기 형질전환체를 제초제가 함유된 배지에서 배양하여 상기 형질전환체의 성장여부를 관찰함으로써 목적으로 하는 유용 유전자가 도입되었는지의 여부를 판단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
식물의 선호 코돈으로 변환한 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 합성
1-1) 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 염기서열 설계
미생물 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 암호화하는 유전자의 아미노산 서열은 변경하지 않고 염기서열만을 식물의 선호 코돈으로 변환되도록 설계하였다. 즉, 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 염기서열을 애기장대 유래 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 코돈 사용례를 기준으로 하여(Narita et al., Gene 182, 169-175, 1996) 변환함으로써 합성 염기서열을 고안하였다. 예를 들어, 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자에서 알라닌(alanine)을 암호화하는 코돈 중 GCG 및 GCC을 가장 많은 빈도로 사용하지만, 애기장대의 경우에는 상기 GCG 및 GCC 코돈을 가장 적게 사용한다. 반대로 발린(valine)을 암호화하는 코돈 중 GTT는 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자에서는 전혀 사용하지 않으나, 애기장대에서는 가장 많은 빈도로 사용된다. 일반적으로 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자는 코돈의 둘째 및 세 번째 뉴클레오타이드를 선택시 구아노신(Guanosine) 및 사이토신(Cytosine)을 선택하지만, 애기장대의 경우에는 아데노신(Adenosine) 및 티민(Thymine)을 선택하는 특성이 나타난다. 이런 경향으로 인하여, 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 경우에 구아노신+사이토신 함량(G+C)이 70%에 이르고, 애기장대의 경우에는 46% 정도가 되어진다. 따라서, 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 식물 수준의 구아노신+사이토신 함량(G+C)이 되도록 하기 위하여, 애기장대 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제가 선호하는 코돈으로 변환하였으며, 변환된 코돈은 아미노산 서열을 그대로 유지하면서 설계하였다. 상기의 원칙으로 설계한 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다.
1-2) 이중가닥 DNA 단편의 제작을 위한 단일가닥 올리고뉴클레오타이드의 합성
상기 실시예 1-1)에서 설계한 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 합성하기 위하여 상기 유전자를 6 부분으로 나누어 6개의 A, B, C, D, E, F 이중가닥 DNA 단편을 설계하였다. 상기 이중 가닥 DNA 단편을 제작하기 위해 각 이중가닥 DNA 단편마다 4개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 고안하여 총 24개의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
즉, 이중가닥 DNA 단편 A를 제조하기 위해 67개의 염기로 이루어진 A1(서열번호 2) 및 A2 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3)를 고안하였으며 72개의 염기로 이루어진 A3(서열번호 4) 및 A4 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 5)를 고안하였다. 이때, 상기 A1의 3'말단과 A2의 5'말단의 14개의 DNA가 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였고 A2의 3'말단에는 XhoI 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다. 또한, 상기 A3의 3'말단과 A4의 5'말단의 12개의 DNA가 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였으며, A3의 5'말단에는 XhoI 제한효소 인식부위가 포함되도록 하였다.
이중가닥 DNA 단편 B의 제조를 위해서는 75개의 염기로 이루어진 B1(서열번호 6) 및 B2 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 7)를 고안하였으며 75개의 염기로 이루어진 B3(서열번호 8) 및 73개의 염기로 이루어진 B4 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 9)를 고안하였다. 이때, 상기 B1의 3'말단과 B2의 5'말단의 12개의 DNA가 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였고 B2의 3'말단에는 SacI 제한효소 염기서열이 포함되도록 하였다. 또한, 상기 B3의 3'말단과 B4의 5'말단의 13개의 DNA가 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였으며, B3의 5'말단에는 SacI 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다.
이중가닥 DNA 단편 C의 제조를 위해서는 각각 72개 및 69개의 염기로 이루어진 C1(서열번호 10) 및 C2 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 11)를 고안하였으며 78개의 염기로 이루어진 C3(서열번호 12) 및 C4 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 13)를 고안하였다. 이때, 상기 C1의 3'말단과 C2의 5'말단의 12개의 DNA가 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였고 C2의 3'말단에는 AccIIII 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다. 또한, 상기 C3의 3'말단과 C4의 5'말단의 12개의 DNA가 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였으며, C3의 5'말단에는 AccIIII 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다.
이중가닥 DNA 단편 D의 제조를 위해서는 각각 52개 및 49개의 염기로 이루어진 D1(서열번호 14) 및 D2 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 15)를 고안하였으며 각각 67개 및 66개의 염기로 이루어진 D3(서열번호 16) 및 D4 단일가닥 올리고뉴크레오타이드(서열번호 17)를 고안하였다. 이때, 상기 D1의 3'말단과 D2의 5'말단의 12개의 DNA는 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였고 D2의 3'말단에는 NheI 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다. 또한, 상기 D3의 3'말단과 D4의 5'말단의 12개의 DNA는 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였으며, D3의 5'말단에는 NheI 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다.
이중가닥 DNA 단편 E의 제조를 위해서는 각각 60개 및 68개의 염기로 이루어진 E1(서열번호 18) 및 E2 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 19)를 고안하였으며 각각 63개 및 68개의 염기로 이루어진 E3(서열번호 20) 및 E4 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 21)를 고안하였다. 이때, 상기 E1의 3' 말단과 E2의 5'말단의 12개의 DNA는 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였고 E2의 3'말단에는 BssHII 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다. 또한, 상기 E3의 3' 말단과 E4의 5'말단의 12개의 DNA는 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였으며, E3의 5'말단에는 BssHII 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다.
이중가닥 DNA 단편 F의 제조를 위해서는 각각 66개 및 70개의 염기로 이루어진 F1(서열번호 22) 및 F2 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 23)를 고안하였으며 각각 59개 및 58개의 염기로 이루어진 F3(서열번호 24) 및 F4 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(서열번호 25)를 고안하였다. 이때, 상기 F1의 3' 말단과 F2의 5'말단의 12개의 염기는 서로 상보적인 염기서열을 갖도록 하였고 F2의 3'말단에는 NsiI 제한효소 인식 부위가 포함되도록 하였다. 또한, 상기 F3의 3' 말단과 F4의 5'말단의 12개의 염기는 서로 상보적인 서열을 갖도록 하였으며, F3의 5' 말단에는 NsiI 제한효소 인식부위가 포함되도록 하였다.
상기에서 고안한 24개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드는 바이오니아 사(청원군, 대한민국)에 주문 제작하여 사용하였다.
1-3) 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 합성하기 위한 이중가닥 DNA 단편의 제조
상기 실시예 1-2)의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 6개의 이중가닥 DNA 단편 A 내지 F(서열번호 26 내지 서열번호 31)를 제조하였다.
이중가닥 DNA 단편 A는 상기 실시예 1-2)의 4개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(A1, A2, A3, A4)를 이용하여 합성하였다. A1 및 A2를 0.5mM dNTP을 첨가한 반응물에 넣고, 온도를 85℃에 2분간 가열한 후, 20초당 1℃씩 서냉복원 (annealing) 하였다. 25℃까지 서냉복원한 후, DNA 중합효소와 중합효소 버퍼를 첨가하고(Invitrogen, USA), 37℃에 30분간 반응시켜 이중 사슬 DNA(A1+A2)를 합성하였다. 상기에서 합성된 120bp 크기의 이중가닥 DNA(A1+A2) 혼합물을 에탄올에 침전시켜 DNA 침전물을 획득 한 후, XhoI 제한효소를 처리하여 3'부분을 점착성 말단화(sticky end)하였다. 그 후 75℃에서 10분간 가열하여 제한효소를 비활성화하였다. 상기와 동일한 방법으로 A3와 A4로부터, 132bp 크기의 이중가닥 DNA(A3+A4)를 합성하였고, 합성된 A3+A4 이중가닥 DNA를 XhoI으로 처리하여 5' 부분을 점착성 말단화(sticky end) 하였다. 상기와 동일한 방법으로 제한효소를 비활성화 하였다. 합성된 상기의 A1+A2 및 A3+A4 이중가닥 DNA를 21℃에서 90분간 결찰 (ligation)하였다.
상기 결찰산물을 주형으로 하여, HindIII 제한효소 인식 부위를 포함하는 AF 프라이머(서열번호 32) 및 EcoRI 제한효소 인식 부위를 포함하는 AR 프라이머(서열번호 33)로 PCR 증폭하였다.
AF 프라이머(센스 프라이머, 서열번호 32)
5'-atcaagctta tgcatcacat gccaaga-3'
AR 프라이머(안티센스 프라이머, 서열번호 33)
5'-cgcgaattcg tccttcaaga ttaagagctg ctgctag-3'
상기에서 PCR 증폭은 10×Tag 중합효소 완충액 5㎕, dNTP 혼합액 5㎕에 Taq DNA 중합효소 및 상기 프라이머를 가한 후 잘 혼합하고 92℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 조건으로 30회 반복하는 조건으로 수행하였다.
상기 PCR 증폭 결과 생성된 산물을 회수하여 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 절단한 후 겔 정제하여 253bp 크기의 이중가닥 DNA 단편 A를 수득하였다.
이중가닥 DNA 단편 B는 상기 실시예 1-2)의 4개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(B1, B2, B3, B4)를 이용하여 합성하였다. B1 및 B2를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 138bp 크기의 이중가닥 DNA(B1+B2)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 SacI으로 처리하여 3' 부분을 점착성 말단화하였다. 또한, B3 및 B4를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 135bp 크기의 이중가닥 DNA(B3+B4)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 SacI으로 처리하여 5'부분을 점착성 말단화하였다. 합성된 상기의 B1+B2 및 B3+B4 이중가닥 DNA를 상기와 동일한 방법으로 결찰하고, 상기 결찰산물을 주형으로 하여, EcoRI 제한효소 인식 부위를 포함하는 BF 프라이머(서열번호 34) 및 MunI 제한효소 인식 부위를 포함하는 BR 프라이머(서열번호 35)로 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 상기 A 단편의 제조시와 동일하게 수행하였다. PCR 증폭 결과 생성된 산물을 회수하고 제한효소 EcoRI 및 MunI으로 처리하여 절단 한 후 겔 정제하여 272bp 크기의 이중가닥 DNA 단편 B를 수득하였다.
BF 프라이머(센스 프라이머, 서열번호 34)
5'-ggcgaattcg cgctgctgat cctgctgca-3'
BR 프라이머(안티센스 프라이머, 서열번호 35)
5'-actcaattgt tccacatctc cagcgtagat-3'
이중가닥 DNA 단편 C는 상기 실시예 1-2)의 4개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(C1, C2, C3, C4)를 이용하여 합성하였다. C1 및 C2를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 129bp 크기의 이중가닥 DNA(C1+C2)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 AccIIII으로 처리하여 3'부분을 점착성 말단화하였다. 또한, C3 및 C4를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 144bp 크기의 이중가닥 DNA(C3+C4)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 AccIIII으로 처리하여 5'부분을 점착성 말단화하였다. 합성된 상기의 C1+C2 및 C3+C4 이중가닥 DNA를 상기와 동일한 방법으로 결찰하고, 상기 결찰산물을 주형으로 하여, MunI 제한효소 인식 부위를 포함하는 CF 프라이머(서열번호 36) 및 SacI 제한효소 인식 부위를 포함하는 CR 프라이머(서열번호 37)로 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 상기 A 단편의 제조시와 동일하게 수행하였다. PCR 증폭 결과 생성된 산물을 회수하고 제한효소 SacI 및 MunI으로 처리하여 절단 한 후 겔 정제하여 294bp 크기의 이중가닥 DNA 단편 C를 수득하였다.
CF 프라이머(센스 프라이머, 서열번호 36)
5'-acaattgagt gtcgctgcaa cttttcctatg-3'
CR 프라이머(안티센스 프라이머, 서열번호 37)
5'-agagctctgc gcgacgacca tgctcttcga taataagtct-3'
이중가닥 DNA 단편 D는 상기 실시예 1-2)의 4개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(D1, D2, D3, D4)를 이용하여 합성하였다. D1 및 D2를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 89bp 크기의 이중가닥 DNA(D1+D2)를 합성하고 상기 이중 가닥 DNA를 NheI으로 처리하여 3'부분을 점착성 말단화하였다. 또한, D3 및 D4를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 121bp 크기의 이중가닥 DNA(D3+D4)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 NheI으로 처리하여 5'부분을 점착성 말단화하였다. 합성된 상기의 D1+D2 및 D3+D4 이중가닥 DNA를 상기와 동일한 방법으로 결찰하고, 상기 결찰산물을 주형으로 하여, SacI 제한효소 인식 부위를 포함하는 DF 프라이머(서열번호 38) 및 PstI 제한효소 인식 부위를 포함하는 DR 프라이머(서열번호 39)로 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 상기 A 단편의 제조시와 동일하게 수행하였다. PCR 증폭 결과 생성된 산물을 회수하고 제한효소 SacI 및 PstI으로 처리하여 절단 한 후 겔 정제하여 184bp 크기의 이중가닥 DNA 단편 D를 수득하였다.
DF 프라이머(센스 프라이머, 서열번호 38)
5'-gcagagctct ctgttgca-3'
DR 프라이머(안티센스 프라이머, 서열번호 39)
5'-ctcttctgca ggcaccag-3'
이중가닥 DNA 단편 E는 상기 실시예 1-2)의 4개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(E1, E2, E3, E4)를 이용하여 합성하였다. E1 및 E2 를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 116bp 크기의 이중가닥 DNA(E1+E2)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 BssHII로 처리하여 3'부분을 점착성 말단화하였다. 또한, E3 및 E4를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 119bp 크기의 이중가닥 DNA(E3+E4)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 BssHII로 처리하여 5'부분을 점착성 말단화하였다. 합성된 상기의 E1+E2 및 E3+E4 이중가닥 DNA를 상기와 동일한 방법으로 결찰하고, 상기 결찰산물을 주형으로 하여, PstI 제한효소 인식 부위를 포함하는 EF 프라이머(서열번호 40) 및 XhoI 제한효소 인식 부위를 포함하는 ER 프라이머(서열번호 41)로 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 상기 A 단편의 제조시와 동일하게 수행하였다. PCR 증폭 결과 생성된 산물을 회수하고 제한효소 PstI 및 XhoI으로 처리하여 절단 한 후 겔 정제하여 207bp 크기의 이중가닥 DNA 단편 E를 수득하였다.
EF 프라이머(센스 프라이머, 서열번호 40)
5'-gtgcctgcag aagagcaa-3'
ER 프라이머(안티센스 프라이머, 서열번호 41)
5'-aaacactcga gtaaatga-3'
이중가닥 DNA 단편 F는 상기 실시예 1-2)의 4개의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(F1, F2, F3, F4)를 이용하여 합성하였다. F1 및 F2를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 124bp 크기의 이중가닥 DNA(F1+F2)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 NsiI로 처리하여 3'부분을 점착성 말단화하였다. 또한, F3 및 F4를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 105bp 크기의 이중가닥 DNA(F3+F4)를 합성하고 상기 이중가닥 DNA를 NsiI로 처리하여 5'부분을 점착성 말단화하였다. 합성된 상기의 F1+F2 및 F3+F4 이중가닥 DNA를 상기와 동일한 방법으로 결찰하고, 상기 결찰산물을 주형으로 하여, XhoI 제한효소 인식 부위를 포함하는 FF 프라이머(서열번호 42) 및 KpnI 제한효소 인식 부위를 포함하는 FR 프라이머(서열번호 43)로 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 상기 A 단편의 제조시와 동일하게 수행하였다. PCR 증폭 결과 생성된 산물을 회수하고 제한효소 XhoI 및 KpnI으로 처리하여 절단 한 후 겔 정제하여 206bp 크기의 이중가닥 DNA 단편 F를 수득하였다.
FF 프라이머(센스 프라이머, 서열번호 42)
5'-actcgagtgt ttcgctgg-3'
FR 프라이머(안티센스 프라이머, 서열번호 43)
5'-gggtacccta cggtgcatg-3'
1-4) 이중가닥 DNA 단편의 벡터로의 클로닝 및 염기서열 확인
상기 실시예 1-3)에서 제조한 각각의 이중 가닥 DNA 단편 A 내지 F를 pBluescript 벡터(Strategene, USA)내의 동일한 제한 효소 자리에 삽입한 다음 염기서열의 이상 여부를 확인하였다. 즉, 253bp 크기의 A 단편을 pBluscript 벡터 (Strategene, USA)의 HindIII 및 EcoRI 자리에 결찰(ligation)하기 위해 상기 A 단편과 pBluscript 벡터를 5×결찰효소 완충액 5㎕ 및 결찰효소 1.5㎕와 혼합한 후, 21℃에서 90분간 반응시켰다. 상기 A 단편이 삽입된 플라스미드를 공지의 방법으로 대장균에 형질전환 후, 형질전환된 대장균을 배양하였다. 상기 배양한 대장균으로부터 Qiagen 플라스미드 킷트(미국)를 이용하여 A 단편이 삽입된 플라스미드를 회수함으로써 pBlue: A 플라스미드를 수득하였다.
B, C, D 단편을 pBluescript(Strategene, USA)의 EcoRI/PstI 자리에 상기와 동일한 방법으로 결찰하고 이를 대장균에 형질전환시킨 후 상기 대장균으로부터 pBlue:B+C+D 플라스미드를 수득하였다. 또한, E, F 단편을 pBluescript (Strategene, USA)의 PstI/KpnI 자리로 상기와 동일한 방법으로 결찰하고 이를 대장균에 형질전환 한 다음 상기 대장균으로부터 pBlue : E+F 플라스미드를 수득하였다. 상기에서 수득된 pBlue:A, pBlue:B+C+D, pBlue:E+F 플라스미드의 삽입 염기서열은 바이오니아 사(청원군, 대한민국)에 의뢰하여 분석하였다.
1-5) 본 발명에 따른 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 합성
상기 실시예 1-3)에서 합성한 이중 가닥 DNA 단편 A 내지 F를 중합하여 전체 길이 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자(1416bp)를 합성하였다. 즉, A 단편이 삽입된 벡터(pBlue:A)에 HindIII 및 EcoRI을 처리하여 HindIII/EcoR I 점착성 말단을 가지는 DNA 단편 A(253 염기쌍)와, B, C, D 단편이 삽입된 벡터 (pBlue:B+C+D)에 EcoRI 및 PstI를 처리하여 EcoRI/PstI 점착성 말단을 가지는 DNA 단편 B+C+D(750 염기쌍) 및 E, F 단편이 삽입된 벡터(pBlue:E+F)에 PstI 및 KpnI을 처리하여 PstI/KpnI 점착성 말단을 가지는 DNA 단편 E+F(413 염기쌍)로 각각 분리하였다.
상기 유전자 단편 A, B+C+D, 및 E+F를 HindIII/KpnI으로 절개한 pBluescript의 HindIII/KpnI 자리에 결찰하였다.
상기에서 결찰된 DNA를 Qiagen 플라스미드 정제 킷트(미국)를 사용하여 정제하였으며, 염기서열은 바이오니아 사(청원군, 대한민국)에 분석을 의뢰하여 확인하고 1416bp 크기의 A+B+C+D+E+F로 이루어진 프로토포르피리노겐 옥시다아제 합성 유전자(서열번호 1)를 수득하였다.
<실시예 2>
합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 이용한 벼의 형질전환
2-1) 벼 형질전환용 벡터의 제조
벼의 형질전환에 사용하기 위한 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 포함하는 벡터를 제조하였다. 상기 벡터를 제조하기 위해 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 포함하는 바이너리 벡터 pGA1611:C(기탁번호 KCTC 0692BP)를 사용하였다. 상기 바이너리 벡터 pGA1611:C에 포함된 바실러스 섭틸리스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 제한 효소 HindIII 및 KpnI를 이용하여 절단하고, 절단된 부위에 실시예 1-5)에서 제조한 본 발명의 합성 유전자를 삽입시켜, 합성된 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 전장 유전자를 발현할 수 있는 바이너리 벡터 pGA1611:SynMP를 제조하였다.
벼 형질전환용 벡터의 제조과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저, 상기 실시예 1-5)에서 제조한 본 발명의 합성 유전자를 주형으로 하고 센스 프라이머(서열번호 44) 및 안티센스 프라이머(서열번호 45)를 사용하여 상기 실시예 1-3)과 동일한 방법으로 PCR 증폭시켰다. 이때, 상기 프라이머들은 증폭 유전자의 간편한 서브클로닝을 위해 각각 HindIII 및 KpnI 제한효소 인식 부위가 추가되었다. 하기에 기재된 프라이머의 각각의 염기서열에 밑줄 친 부분이 상기 제한효소 인식 부위를 나타낸다.
센스 프라이머(서열번호 44)
5'-atcaagcttat gcatcacatg ccaaga-3'
안티센스 프라이머(서열번호 45)
5'-gggtacccta cggtgcatga gaagt-3'
상기에서 수득된 PCR 반응 산물을 제한효소 HindIII 및 KpnI으로 절단하고, 겔 정제한 후, 벡터 pBluescript(Strategene, USA)내의 동일한 제한효소 부위내로 삽입시켜 삽입된 염기서열의 이상 여부를 바이오니아 사(청원군, 대한민국)에 분석 서비스를 의뢰하여 확인하였다. 그 다음 상기 합성 유전자를 미리 동일한 제한효소로 처리한 pGA1611:C(기탁번호 KCTC 0692BP) 벡터에 리가아제(ligase)를 사용하여 결찰(ligation)시켜 옥수수 유비퀴틴 프로모터(Ubi-P)의 조절 하에 위치하게 함으로써, 바이너리 벡터 pGA1611:SynMP를 제작하였다(도 3).
2-2) 벼 형질전환 및 재분화
상기 실시예 2-1)에서 제조한 pGA1611:SynMP 재조합 벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환하고 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 벼를 형질전환하였다.
먼저, 상기 실시예 2-1)에서 제조한 pGA1611:SynMP 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주에 형질전환시켰다. 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 테트라사이클린 5μg/mL 및 하이그로마이신 40μg/mL을 포함하는 YEP 배지(1% 박토-펩톤, 1% 박토 효모 추출물 및 0.5% NaCl 함유)에서 28℃의 조건으로 하룻밤동안 배양시켰다. 상기 배양물을 원심분리시키고 펠릿들을 동일 부피의 아세토시링곤(acetosyringone) 100μM이 함유된 AA 배지(Hiei et al., Plant Mol. Biol. 35, 205-218, 1997)에 현탁시켜 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 현탁액을 제조하였다.
형질전환을 위해 사용한 벼의 캘러스(callus)는 N6 배지(Rashid et al., Plant Cell Rep. 15:727-730, 1996; Hiei et al., Plant Mol. Biol. 35:205-218, 1997)에서 파종된 벼의 배반(품종: 동진)으로부터 유도하였다. 3 내지 4 주령의 밀집된 벼의 캘러스를 상기 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 현탁액 중에 3분 동안 침적시키고, 이후, 멸균 여과지를 현탁액에 접촉시켜 현탁액을 흡수 및 건조시킴으로써 과량의 균체를 현탁액에서 제거하였다. 이후, 현탁액 중의 캘러스를 공조배양 배지로 옮기고, 25℃의 암실에서 2일 내지 3일 동안 공조 배양시켰다. 공조 배양된 캘러스를 세포탁심(Cefotaxime) 250mg/L가 함유된 멸균수로 세척하여 잔존 세균을 제거하고, 세균이 제거된 캘러스를 세포탁심(Cefotaxime) 250mg/L 및 하이그로마이신 50mg/L을 포함하는 N6 배지로 옮겨 배양하였다. 3주 내지 4주 동안의 배양 과정 중에 선별된 캘러스들을 잎 및 뿌리 성장용 재분화 배지로 옮겨 배양시켰다. 재분화 개체들의 뿌리가 충분히 성장되면, 이들을 온실로 옮겨서 계속 성장시켰다.
2-3) T1 세대에서 하이그로마이신 저항성 식물의 분리
형질전환 벼의 T0 세대로부터 T1 세대로 트랜스 유전자가 안정하게 전달되는지를 확인하기 위하여, T0 세대 벼의 자가수분 볍씨(T1 세대)로부터 종자량이 많이 확보된 형질전환벼를 선택하였다. 즉, 7개 세포주의 T0 세대 형질전환 벼(S3, S4, S5, S8, S10, S11 및 S19)를 자가수분시켜 제조된 종자(T1 세대)를 하이그로마이신 50㎍/㎖를 포함하는 무라시게스쿠그(MS) 고형화 배지의 절반 농도에서 발아시켰을 때 나타나는 각 형질전환 세포주의 하이그로마이신 저항성 개체와 감수성 개체의 분리 비율을 조사하였다. 상기 형질전환 세포주의 하이그로마이신 저항성 분리 패턴을 하기 표 1에 나타내었다.
T1 세대 형질전환벼에서의 하이그로마이신 저항성 식물의 분리
형질전환벼 저항성(종자 수) 감수성(종자 수) 분리비(저항성:감수성) X2
S3 22 8 3:1 0.04
S4 30 2 15:1 0.00
S5 24 8 3:1 0.00
S8 20 11 3:1 1.82
S10 23 8 3:1 0.01
S11 24 7 3:1 0.10
S19 19 11 3:1 2.18
X2: X2 검정에서 편차에 대한 검정 방법으로 사용하는 값이며, 실제 표현형으로 분리된 것을 이론치로 분리된 것으로 볼 수 있는지를 적합도 검정(goodness of fit)하는 통계적 방법이며, 아래의 식으로 계산된다.
X2= ∑(관찰빈도 - 기대빈도)2/기대빈도
그 결과, S4 세포주를 제외한 모든 형질전환 세포주는 저항성 대 감수성의 분리비가 약 3:1로 나타났으며, 이는 벼의 게놈(genome)에 1 카피로 삽입된 트랜스유전자가 멘델의 법칙에 따라서 분리 및 발현되었다는 것을 의미한다.
2-4) 서던 블롯 분석을 통한 트랜스 유전자의 삽입 여부 검정
하이그로마이신 선별배지로부터 재분화된 형질전환된 세포주의 벼 게놈 내부로 본 발명의 합성 유전자가 안정하게 도입되는지의 여부와 이의 삽입 수를 측정하기 위하여, 게놈 DNA를 표준 방법에 따라 추출하였다(Ausubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, 1st ed., 1987). pGA1611:SynMP로 형질전환된 7개의 T1 세대 벼 및 대조구인 형질전환되지 않은 야생형 벼로부터 각각 추출된 게놈 DNA 5㎍을 HindIII 제한 효소로 분해시키고, 0.8%(w/v) 아가로스 겔 상에서 전기영동을 실시하여 크기별로 분획화시켰다. 이들 분획을 나일론막(Nylon 66 plus, Pharmacia Biotech.)에 블롯팅(blotting)시킨 후, 32P-표지된 본 발명의 합성 유전자와 혼성화(hybridization)시켰다.
프로브(probe)로 사용된 유전자 내부에는 HindIII 제한효소 인식부위가 존재하지 않으므로, 혼성화된 밴드의 수가 형질전환된 식물의 게놈에 삽입된 트랜스 유전자의 삽입수와 일치하게 된다.
실험 결과, 대조구인 야생형 벼에서 추출된 게놈 DNA의 경우에는 혼성화된 밴드가 검출되지 않았으며, 벼 형질전환체의 경우에는 1-2개의 혼성화 밴드가 검출되어 본 발명의 합성 유전자가 벼의 게놈에 삽입되었음이 확인되었다(도 4).
2-5) 노던 블롯 분석을 통한 트랜스 유전자의 mRNA 발현 여부 조사
본 발명의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 합성 유전자가 벼의 게놈에 안정적으로 도입되어, 효율적으로 전사되는지를 mRNA 발현 여부로 분석하였다. 상기 형질전화된 벼의 T1 세대의 전체 RNA를 TRI 시약(Sigma, 미국)을 사용하여 재배된 벼의 잎으로부터 추출하였다. 전체 RNA(10μg)를 포름알데히드를 포함한 1% 아가로스 겔 상에서 전개 완충액으로 20mM Mops(3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산) 용액을 사용하여 분획화시켰다. 전개가 완료된 겔을 나일론막에 블롯팅시키고, 전체 길이의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 합성 유전자와 혼성화시켰다. 겔의 블롯팅에 앞서, 1% 아가로스 겔상에서 전개된 RNA 시료 양의 동일성 여부는 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 사용하여 점검하였다.
검출된 혼성화 밴드의 진한 정도를 기준으로 프로토포르피리노겐 옥시다아제 합성 유전자 mRNA의 발현 여부를 조사한 결과, 형질전환하지 않은 대조구(W)에서는 상기 합성 유전자의 mRNA가 발현되지 않았다. 반면에, 형질전환된 모든 세포주에서는 상기 합성 유전자의 mRNA가 발현되었다. 특히, S4, S10 및 S11 형질전환 세포주에서 가장 높은 발현율을 나타내었고, S19, S5, S3 및 S8 형질전환 세포주 등의 순으로 발현되는 정도에 차이를 보였다(도 5).
<실시예 3>
본 발명의 합성 유전자로 형질전환된 벼의 T 2 세대에서의 제초제 저항성 발아 검정
T2 세대에서의 제초제 저항성 발아 검정을 실시하기 위하여, 본 발명의 합성 유전자를 발현하는 T2 세대의 형질전환체 S4 및 S11을 선택하였다. 획득된 T2 세대 종자로부터 종피를 제거시킨 후, 70% 에탄올 및 NaOCl을 사용하여 종자를 표면 살균하였다. 이를 제초제인 옥시플루오르펜 0, 100, 300 및 500μM이 각각 함유된 1/2 MS 배지에 치상시키고, 28℃ 배양 온도 하에서 빛이 차단된 상태로 5일 동안 배양하고, 광에 노출된 상태에서 7일 동안 연속 배양하였다. 이와 동시에, 대조구인 야생형 벼, 및 마이소코쿠스 산투스 유래의 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 T2 형질전환 벼의 종자를 동시에 치상하였다. 배양기간 동안 상기 벼의 생장상태를 각각 조사하였으며 생장한 벼를 회수하여 생체중을 측정하였다.
상기 마이소코쿠스 산투스 유래의 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 T2 형질전환 벼는 대한민국특허 공개공보 제2003-84677호에 나타낸 바와 같은 방법으로 제조하였다. 즉, 마이소코쿠스 산투스 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 포함하는 pMx-PPO 플라스미드(Dailey and Dailey, J. Biol. Chem., 271, 8714-8718, 1996)로부터 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 수득하고 이를 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법으로 pBluescript에 클로닝하여 바이너리 벡터 pGA1611:MP를 제조하였다. 상기 바이너리 벡터를 이용하여 상기 실시예 2-2)와 동일한 방법으로 벼를 형질전환하고 재분화시켰다. 상기 재분화된 형질전환 벼를 자가수분시켜 T1 종자를 수득하고 이를 다시 자가수분시킴으로써 T2 세대의 형질전환 벼의 종자를 수득하였다.
실험 결과, 대조구인 야생형 벼의 경우에는 제초제에 의해 완전히 치사되는 것으로 나타났다. 한편, 천연의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 T2 종자와 합성 유전자를 발현하는 형질전환 벼와의 제초제 저항성을 비교한 결과, 제초제가 처리된 모든 농도(100μM, 300μM, 및 500μM)에서 본 발명의 합성 유전자가 발현된 형질전환 벼가 더욱 좋은 생장을 보임을 확인 할 수 있었다(도 6a). 즉, 본 발명의 합성 유전자가 발현되는 형질전환 벼는 500μM 옥시플루오르펜의 농도에서도, 제초제를 처리하지 않은 야생벼와 동일한 생체중을 나타냈으나, 천연 프로톡스를 발현하는 형질전환 세포주는 500μM 농도에서, 제초제를 처리하지 않은 야생벼에 비해 생체중이 20% 정도 감소하는 경향을 보였다(도 6b).
따라서, 본 발명에 따른 프로토포르피리노겐 옥시다아제 합성 유전자가 발현되는 형질전환체가 천연 유전자를 발현하는 형질전환체에 비해 보다 높은 제초제 저항성을 나타냄을 알 수 있다.
본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 식물에 도입하는 경우 천연 유전자에 비해 식물의 제초제에 대한 저항성을 현저히 증가시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 합성 유전자는 형질전환 세포주 선발을 위한 제초제 저항성 선발 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 제조를 위한 이중가닥 DNA 단편 및 상기 단편을 제조하기 위한 단일가닥 올리고뉴클레오타이드의 모식도이다.
A∼F: 이중가닥 DNA 단편
A1∼A4: 이중가닥 DNA 단편 A의 제조를 위한 단일가닥 올리고뉴클레오타이드
AF: 이중가닥 DNA 단편 A의 증폭을 위한 센스 프라이머
AR: 이중가닥 DNA 단편 A의 증폭을 위한 안티센스 프라이머
도 2는 이중가닥 DNA 단편을 이용하여 전체 길이의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
pBlue:A pBluescript 클로닝 벡터에 이중가닥 DNA 단편 A가 삽입
pBlue:B+C+D pBluescript 클로닝 벡터에 이중가닥 DNA 단편 B, C, D가 삽입
pBlue:E+F pBluescript 클로닝 벡터에 이중가닥 DNA 단편 E+F가 삽입
pBlue:SynMP pBluescript 클로닝 벡터에 이중가닥 DNA 단편 A+B+C+D+E+F가 삽입
도 3은 바이너리 벡터(binary vector) pGA1611:C 및 pGA1611:SynMP의 T-DNA 영역 개략도(A) 및 본 발명의 합성 유전자가 삽입된 pGA1611:SynMP의 벡터 모식도(B)이다.
Ubi-P: 옥수수 유비퀴틴 프로모터
Bs Protox: 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자
SynMx Protox: 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자
Tnos: 노파린 합성 종결유전자
P35S: 꽃양배추 35S 프로모터
HPT: 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(phosphotransferase)
TiA6-7: 옥토파인형 TiA6-7 종결유전자
도 4는 본 발명의 합성 유전자로 형질전환된 T0 세대 형질전환 벼의 서던 블롯(Southern blot) 분석 결과를 나타내는 사진이다.
W: 대조구(야생형 벼)
S3 내지 S19: 형질전환 벼
도 5은 본 발명의 합성 유전자로 형질전환된 T1 세대 형질전환 벼의 노던 블롯(Northern blot) 분석 결과를 나타내는 사진이다. rRNA는 로딩 대조군으로 사용되었다.
W: 대조구(야생형 벼)
S3 내지 S19: 형질전환 벼
도 6a는 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 형질전환 벼에 옥시플루오르펜을 처리하고 치상한 후 8일째의 생장 상태를 나타낸 사진이다.
W: 대조구(야생형 벼)
Mx4 및 Mx7: 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 형질전환체
S4 및 S11: 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 형질전환체
도 6b는 본 발명의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 형질전환 벼에 옥시플루오르펜을 처리하고 치상한 후 8일째 되는 유묘의 생체중의 변화를 나타낸 그래프이다.
W: 대조구(야생형 벼)
Mx4 및 Mx7: 천연 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 형질전환체
S4 및 S11: 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 발현하는 형질전환체
<110> CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Synthetic protoporphyrinogen oxidase gene and method for improving herbicide resistance of plant <160> 45 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic protoporphyrinogen oxidase gene <400> 1 atgcatcaca tgccaagaac aactggaatg aatgttgcag tagttggagg tgggatttct 60 ggtttggcag ttgcacatca tttgagatct aggggtactg atgcagtact tctcgagtca 120 tctgctagac ttggaggtgc agttggaact catgcacttg ctggatacct agtagaacaa 180 ggtcctaata gttttcttga tcgtgaacca gcaactcgtg ctctagcagc agctcttaat 240 cttgaaggac gaattcgcgc tgctgatcct gctgcaaagc gtcgatatgt atacactcgt 300 ggtagactcc gatctgtacc agcttcacct ccagcatttc ttgcatcaga tattcttcct 360 ctaggtgctc gattgcgtgt tgctggagag ctcttttcac gtagagcacc tgagggtgtt 420 gatgaatctc tagctgcatt tggccgacgt catctaggac atagggctac gcaggtactt 480 ctcgatgcag ttcagactgg tatctacgct ggagatgtgg aacaattgag tgtcgctgca 540 acttttccta tgctggttaa gatggaacgt gaacatcgaa gtcttattct cggtgcaatc 600 cgcgcacaaa 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Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide A1 <400> 2 atgcatcaca tgccaagaac aactggaatg aatgttgcag tagttggagg tgggatttct 60 ggtttgg 67 <210> 3 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide A2 <400> 3 tgactcgaga agtactgcat cagtacccct agatctcaaa tgatgtgcaa ctgccaaacc 60 agaaatc 67 <210> 4 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide A3 <400> 4 cttctcgagt catctgctag acttggaggt gcagttggaa ctcatgcact tgctggatac 60 ctagtagaac aa 72 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide A4 <400> 5 attaagagct gctgctagag cacgagttgc tggttcacga tcaagaaaac tattaggacc 60 ttgttctact ag 72 <210> 6 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide B1 <400> 6 gctgctgatc ctgctgcaaa gcgtcgatat gtatacactc gtggtagact ccgatctgta 60 ccagcttcac ctcca 75 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide B2 <400> 7 aaagagctct ccagcaacac gcaatcgagc acctagagga agaatatctg atgcaagaaa 60 tgctggaggt gaagc 75 <210> 8 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide B3 <400> 8 ggagagctct tttcacgtag agcacctgag ggtgttgatg aatctctagc tgcatttggc 60 cgacgtcatc tagga 75 <210> 9 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide B4 <400> 9 cacatctcca gcgtagatac cagtctgaac tgcatcgaga agtacctgcg tagccctatg 60 tcctagatga cgt 73 <210> 10 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide C1 <400> 10 gcaacttttc ctatgctggt taagatggaa cgtgaacatc gaagtcttat tctcggtgca 60 atccgcgcac aa 72 <210> 11 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide C2 <400> 11 tgctccggac aatttcggtg ctgttccagc tgggagcgct gcctgacgtt gagccttttg 60 tgcgcggat 69 <210> 12 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide C3 <400> 12 ttgtccggag cacttagcac gtttgatggt ggattgcaag tgctcataga tgcgcttgca 60 gcttcattgg gtgatgca 78 <210> 13 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide C4 <400> 13 ttcgataata agtctccatc cgccatcctc tcgtgctagt ccttcaacgc gtgctcctac 60 atgagctgca tcacccaa 78 <210> 14 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide D1 <400> 14 gcagagctct ctgttgcaca agtggtattg gcagctccag cgcatgctac tg 52 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide D2 <400> 15 gccgctagcg catcatcgag tggacgaagc aatttagcag tagcatgcg 49 <210> 16 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide D3 <400> 16 tgcgctagcg gcactcgtag caggtattgc ttatgctcct atcgcagttg ttcatctagg 60 ttttgat 67 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide D4 <400> 17 ctcttctgca ggcaccagga atccaaaacc atcaggagcc ggaagtgttc ctgcatcaaa 60 acctag 66 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide E1 <400> 18 gtgcctgcag aagagcaacg tcgaatgctt ggtgcaattc atgcttctac tacttttcca 60 60 <210> 19 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide E2 <400> 19 tgacgcgcgc ctcccaccat acaagaatag agaacacgtc caccttcagc tcgaaatgga 60 aaagtagt 68 <210> 20 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide E3 <400> 20 gaggcgcgcg tcaaccagga ctggttgaac aggatgagga tgctttggct gcactagcac 60 gag 63 <210> 21 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide E4 <400> 21 aaacactcga gtaaatgaag ggcgagctgt aacgcctgca agtgccttca gttcttctcg 60 tgctagtg 68 <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide F1 <400> 22 actcgagtgt ttcgctggcc acttggtatt cctcaataca atctcggaca tcttgaacga 60 gtggct 66 <210> 23 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide F2 <400> 23 tgtatgcatt tccaattaga tgaaggcccg gcaaacgttg tagtgccgca tcaatagcag 60 ccactcgttc 70 <210> 24 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide F3 <400> 24 gaaatgcata caagggtgtt ggactaaatg attgtattcg caacgcagct caactagca 59 <210> 25 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand oligonucleotide F4 <400> 25 gggtacccta cggtgcatga gaagtattac cggcaacgag cgcgtctgct agttgagc 58 <210> 26 <211> 253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double strand DNA fragment A <400> 26 atgcaccaca tgccgaggac aactggaatg aatgtcgccg tcgtgggagg tgggatttcg 60 ggtttggcag ttgcacatca tttgagatct aggggtactg atgcagtact tctcgagtca 120 tctgctagac ttggaggtgc agttggaact catgcacttg ctggatacct agtagaacaa 180 ggtcctaata gttttcttga tcgtgaacca gcaactcgtg ctctagcagc agctcttaat 240 cttgaaggac gaa 253 <210> 27 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double strand DNA fragment B <400> 27 ttcgcgctgc tgatcctgct gcaaagcgtc gatatgtata cactcgtggt agactccgat 60 ctgtaccagc ttcacctcca gcatttcttg catcagatat tcttcctcta ggtgctcgat 120 tgcgtgttgc tggagagctc ttttcacgta gagcacctga gggtgttgat gaatctctag 180 ctgcatttgg ccgacgtcat ctaggacata gggctacgca ggtacttctc gatgcagttc 240 agactggtat ctacgctgga gatgtggaac aa 272 <210> 28 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double strand DNA fragment C <400> 28 ttgagtgtcg ctgcaacttt tcctatgctg gttaagatgg aacgtgaaca tcgaagtctt 60 attctcggtg caatccgcgc acaaaaggct caacgtcagg cagcgctccc agctggaaca 120 gcaccgaaat tgtccggagc acttagcacg tttgatggtg gattgcaagt gctcatagat 180 gcgcttgcag cttcattggg tgatgcagct catgtaggag cacgcgttga aggactagca 240 cgagaggatg gcggatggag acttattatc gaagagcatg gtcgtcgcgc agag 294 <210> 29 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double strand DNA fragment D <400> 29 ctctctgttg cacaagtggt attggcagct ccagcgcatg ctactgctaa attgcttcgt 60 ccactcgatg atgcgctagc ggcactcgta gcaggtattg cttatgctcc tatcgcagtt 120 gttcatctag gttttgatgc aggaacactt ccggctcctg atggttttgg attcctggtg 180 cctg 184 <210> 30 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double strand DNA fragment E <400> 30 cagaagagca acgtcgaatg cttggtgcaa ttcatgcttc tactactttt ccatttcgag 60 ctgaaggtgg acgtgttctc tattcttgta tggtgggagg cgcgcgtcaa ccaggactgg 120 ttgaacagga tgaggatgct ttggctgcac tagcacgaga agaactgaag gcacttgcag 180 gcgttacagc tcgcccttca tttactc 207 <210> 31 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double strand DNA fragment F <400> 31 gagtgtttcg ctggccactt ggtattcctc aatacaatct cggacatctt gaacgagtgg 60 ctgctattga tgcggcacta caacgtttgc cgggccttca tctaattgga aatgcataca 120 agggtgttgg actaaatgat tgtattcgca acgcagctca actagcagac gcgctcgttg 180 ccggtaatac ttctcatgca ccgtag 206 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AF <400> 32 atcaagctta tgcatcacat gccaaga 27 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AR <400> 33 cgcgaattcg tccttcaaga ttaagagctg ctgctag 37 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BF <400> 34 ggcgaattcg cgctgctgat cctgctgca 29 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BR <400> 35 actcaattgt tccacatctc cagcgtagat 30 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CF <400> 36 acaattgagt gtcgctgcaa cttttcctat g 31 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CR <400> 37 agagctctgc gcgacgacca tgctcttcga taataagtct 40 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DF <400> 38 gcagagctct ctgttgca 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DR <400> 39 ctcttctgca ggcaccag 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EF <400> 40 gtgcctgcag aagagcaa 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ER <400> 41 aaacactcga gtaaatga 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FF <400> 42 actcgagtgt ttcgctgg 18 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FR <400> 43 gggtacccta cggtgcatg 19 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR of a synthetic protoporphyrinogen oxidase gene <400> 44 atcaagctta tgcatcacat gccaaga 27 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR of a synthetic protoporphyrinogen oxidase gene <400> 45 gggtacccta cggtgcatga gaagt 25

Claims (17)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen oxidase) 유전자.
  2. 제1항의 유전자를 포함하는 벡터.
  3. 제2항에 있어서, pGA1611:SynMP인 벡터.
  4. 제2항의 벡터로 형질전환된 박테리아.
  5. 제4항에 있어서, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것을 특징으로 하는 박테리아.
  6. 제1항의 유전자를 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 제초제에 대한 저항성을 증대시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물이 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 보리, 평지, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장 및 벼로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 사탕수수, 대두, 담배 및 목화로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 제초제가 프로토포르피리노겐 옥시다아제 저해성 제초제인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 프로토포르피리노겐 옥시다아제 저해성 제초제가 디페닐에테르계(diphenylethers), 옥사디아졸계(oxadiazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 트리아졸리논계(triazolinones) 및 티아디아졸계 (thiadiazoles)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 디페닐에테르계 제초제가 액시플루오르펜 (acifluorfen), 아클로니펜(aclonifen), 비페녹스(bifenox), 포메사펜(fomesafen), 락토펜(lactofen) 및 옥시플루오르펜(oxyfluorfen)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 옥사디아졸계 제초제가 옥사디아존(oxadiazon)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 페닐프탈이미드계 제초제가 플루미옥사진 (flumioxazin) 또는 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 트리아졸리논계 제초제가 카펜트라존(carfentrazone) 또는 설펜트라존(sulfentrazone)인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 티아디아졸계 제초제가 플루티아셋-메틸(fluthiacet-methyl) 또는 티디아지민(thidiazimin)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항의 유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주의 선발 방법.
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