KR20050085377A - 아실 플라보노이드 유도체의 효소적 생산 - Google Patents

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Abstract

플라보노이드 에스테르류 및 플라보노이드 유도체들의 효소적 합성 방법으로서, a) 유기 용매, 글리코실화 플라보노이드 또는 아글리콘 플라보노이드, 아실기 공여체 및 효소적 촉매를 함유한 반응 매질을 제조하고, b) 상기 반응 동안 플라보노이드 및/또는 아실 공여체 추가량을 임의적으로 첨가하고, c) 수득된 에스테르를, 효소 입자 및 용매를 제거하여 정제하는 방법을 개시한다. 본 발명의 방법은 상기 반응 동안 형성된 물 및/또는 알콜의 농도를 150 mM 이하로 유지되도록 조절하는 것을 특징으로 한다.

Description

아실 플라보노이드 유도체의 효소적 생산 {ENZYMATIC PRODUCTION OF ACYL FLAVONOID DERIVATIVES}
본 발명은 전반적으로 식물화학 및 생화학에 관한 것이며, 좀 더 구체적으로, 식품 및 미용 및 약학 제제에서의 사용을 위한 플라보노이드 (flavonoid) 유도체의 효소적 생산 방법에 관한 것이다.
플라보노이드의 생물학적 효과는 다년간 충분히 공지되어 왔다. 이들은 다양한 산화 화학종들을 포획함으로써, DNA, 지질 및 단백질 등의 생체분자에 대한 산화적 손상을 예방한다. 항산화 검정에서, 일부 플라보노이드들은 비타민 C 및 E 보다 더욱 효과적이다. 이러한 주된 특성은 차치하고라도, 효소 작용 및 동물 세포, 바이러스 및 세균의 증식 억제를 포함한, 다른 여러 생물학적 효과가 증명되었다. 이들은 또한 혈관계에 영향을 미치며 상당한 항산화 역량을 갖고 있다.
피부-보호 및 피부-청결 특성 및 노화 방지, 피부 변색 방지 및 피부의 외관에 미치는 작용때문에, 플라보노이드는 또한 미용 또는 피부약학 (dermapharmaceutical) 조성물의 구성성분으로 사용되어 왔다. 이들은 또한 모발의 기계적 특성에도 작용한다.
플라보노이드의 항산화 특성은 이들의 분자 구조에 좌우된다. 구조/작용 관계에 대한 연구는 상기 항산화 작용이 상기 분자의 B 고리에서의 오르토-수산화반응, 유리 히드록실기의 수, C 고리 내의 2 및 3 탄소 사이의 이중 결합의 존재, 및 3 탄소에서의 히드록실기의 존재에 기초하는 것으로 나타났다(도 1).
한편으로는 수성 매질 및 유기 매질 둘 다에서의 용해도가 매우 낮기 때문에, 그리고 다른 한편으로는, 안정성이 낮기 때문에, 이들 분자를 사용하는 것은 근본적으로 제한된다. 플라보노이드는 빛, 산소 또는 산화제, 및 온도 증가에 의해 분해된다. 이 제한 요소들은 식품 및 미용 및 약학 조성물에서 이들의 유효한 사용을 방해한다.
이러한 안정성 문제를 제거하기 위하여, 캡슐화 및 항산화제와 함께의 제형화를 포함한, 충분히 공지된 다양한 전략들이 있다. 불행히도, 이 해결책들 중 어느 것도 완전히 만족스럽지 못하며, 안정성이 증가된 신규한 글리코실화 플라보노이드 및 아글리콘플라보노이드 (aglyconflavonoid) 에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
이들 분자의 특성을 향상시킬 목적으로, 효소적 및 화학적 수식 (modification) 이 제안되었다. 따라서, JP 55157580 및 JP 58131911 은 피리딘의 존재하에서 디옥산 (dioxane) 중의 지방산 클로라이드를 이용한 쿠에르세틴 (quercetin) 의 아실화를 언급한다. 그러나, 이 특허들에서 상기 아실화는 독성 용매의 존재하에서 수행된다. 기질전환 수율은 낮다. 동일한 방법으로 플라본 (flavone), 플라보놀 (flavonol) 및 플라바논 (flavanone) 을 아실화하는 것이 Coletica 특허 FR 2778663 (US 6235294) 에 기술되어 있다. 이 반응은 지방산 클로라이드 또는 무수물의 존재하에서 화학적으로 수행되었다. 이들 반응은 활성화된 지방산 및 독성 용매 (피리딘, 클로로포름 및 톨루엔) 를 사용하는 것을 수반하고 또한 높은 온도 (100 ℃) 를 포함한다. 이의 기질전환 수율은 낮다(대략 10 내지 60 %). 또한, 이들 반응은 선택적이지 않아서 폴리아실화 (polyacylated) 산물을 일으킨다. WO 09966062 는 지방산 (라우릴산 (laurylic acid), 부티르산 (butyric acid), 아세트산 ...) 에 의한 플라보노이드 (쿠에르세틴, 갈란긴 (galangin), (+)-카테콜 (catechol)) 의 화학적 아실화 및 그 후의 Mucor miehei 의 리파아제 (lipase) 에 의한 효소적 가수분해 단계를 언급한다. 이 발명은 FR 2778663 (US 6235294) 와 동일한 단점을 갖고 있다. 초기 아실화 반응 후, 생성된 산물은 폴리아실화된다. 모노에스테르가 필요한 경우, 효소적 가수분해는 상기 효소의 불활성화를 막기 위하여 제 1 반응에서 사용된 용매를 제거한 후 제 2 단계에서 수행되어야 한다. 또한 EP 0618203 에도 플라보노이드 수식이 기술되어 있는데, 여기에서는 에틸 아세테이트 및 에틸 프로피오네이트에 의한 (+/-)-카테콜의 아실화 및 페닐 프로피오네이트 및 부티레이트에 의한 에피갈롤카테콜 (epigallolcatechol) 의 아실화가 언급되어 있다. 이 반응에는 고비용의 효소 (스트렙토마이세스 로체이 (Streptomyces rochei) 의 카르복실라제 (carboxylase)) 가 필요하며, 상기 두 기질의 전환 수율은 매우 낮다(상기 아실 공여체의 1% 미만). 마지막으로, WO 0179245 (Henkel/Cognis) 에는 다양한 산 (p-클로로페닐아세트산, 스테아르산, 12-히드록시스테아르산, 팔미트산, 라우르산 (lauric acid), 카프르산 (capric acid), 4-히드록시페닐아세트산, 5-페닐발레르산, 쿠마르산, 올레산 (oleic acid), 리놀레산 (linoleic acid)) 에 의한 플라보노이드류 (나린진 (naringin), 루틴 (rutin), 아스파라틴 (asparatin), 오리엔틴 (orientin), 쿠에르세틴, 켐페롤 (kaempferol), 시스-오리엔틴, 이소쿠에르시트린 (isoquercitrin)) 의 효소적 아실화가 기술되어 있다. 이 특허에는, 고농도의 Candida antarctica (40 g/ℓ) 및 - 상기 플라보노이드류를 기준으로 - 과량의 아실 공여체를 사용하는 방법이 기술되어 있다. 상기 기질의 전환 수율은 낮다(10 내지 20 %).
상기 기술한 모든 연구는 저 수율이 특징이다. 또한, 상기 화학 수식은 독성 용매의 사용을 수반하며, 상기 반응은 생성물 혼합물을 초래하는 비-특이적인 것이며, 상기 기술한 효소적 반응은 글리코실화 플라보노이드류로 제한된다. 상기 선행기술에서 언급된 저 전환 수율은 사용된 방법들이 용해도가 낮은 기질들을 이용한 반응에 적합하게 되지 않고 상기 반응 동안 형성되는 물에 의해 심하게 손상된다는 사실에 기인한다.
본 발명은
a) 유기 용매, 글리코실화 플라보노이드 또는 아글리콘 플라보노이드, 아실기 공여체 및 효소적 촉매를 함유한 반응 매질을 제조하고,
b) 상기 반응 동안 플라보노이드 및/또는 아실 공여체 추가량을 임의적으로 첨가하고,
c) 이렇게 수득된 에스테르를, 효소 입자 및 용매를 제거하여 정제하는, 플라보노이드 에스테르류 및 유도체들의 효소적 합성 방법으로서, 상기 반응 동안 형성된 물 및/또는 알콜의 농도를 150 mM 이하로 남아있도록 조절하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명 - 글리코실화 플라보노이드류 및 아글리콘 플라보노이드류의 선택적 아실화 방법 - 은 다양한 제제들에서 플라보노이드 유도체의 안정성 및 용해도를 향상시키는데, 이때 이들의 항산화 특성은 손상되지 않고 남아있거나 또는 향상된다. 이들 개질된 플라보노이드류로 얻을 수 있는 또 다른 특별한 이점은 생물학적 활성이 보다 높은 2작용기성 (bifunctional) 분자가 생성된다는 점이다.
선행기술로부터 공지된 방법들과 비교할 때, 본 발명에 따른 방법으로써, 합성 후의 복잡하고 정교한 정제 작업이 줄어들면서도, 플라보노이드 에스테르류의 최종 농도, 전환 수율 (최초에 존재한 플라보노이드류 및 아실 공여체 둘 다에 대하여) 및, 특히, 생산성의 점에서 뚜렷한 향상을 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 위험한 용매가 없는 온건한 온도 및 압력 조건을 사용한 효소 기술에 기초하고, 상기 플라보노이드 에스테르류는 하기 반응식에 따른 직접적인 에스테르화 또는 에스테르 교환반응 (transesterification) 로 형성된다:
플라보노이드 + RCOOH → 플라보노이드-OCOR + H20
플라보노이드 + RCOOR' → 플라보노이드-OCOR + R'OH
(식 중, R' 은 C1-4 알킬기, 바람직하게는 C1-2 알킬기이다).
이 방법의 특징은 상기 반응 매질에서 먼저 물을 제거하여 상기 반응 시작 전에 존재하는 물이 제거되도록하고, 상기 반응 동안 형성된 물 또는 알콜을 온라인 (on-line) 으로 제거하는 것이다. 물 및/또는 알콜은 사용되는 용매 및 기질에 적합한 농도로 유지시키는데, 바람직하게는 150 mM 이하의 농도로, 좀 더 특히는 100 mM 이하의 농도로 유지시킨다.
상기 방법은 다수의 아글리콘 플라보노이드류 및 글리코실화 플라보노이드류에 적합하고, 이러한 온건한 효소적 방법으로 수득된 전환 수율은 지금까지 수득된 것들 이상으로서, 즉 50 내지 99 % 범위이다.
상기 효소적 합성은 화학적 합성보다 더 온건한 조건하에서 수행되며, 피리딘, 벤젠 및 THF 등의 독성 용매의 사용 및 추가적인 정제 단계를 요하는 염 또는 플라보노이드 분해 산물 등의 2차 생성물의 형성을 피한다.
상기 언급한 공지된 방법들과 비교할 때, 본 발명으로, 합성 후의 복잡하고 정교한 정제 작업이 줄어들면서도, 플라보노이드 에스테르류의 최종 농도, 전환 수율 (최초에 존재한 플라보노이드류 및 아실 공여체 둘 다에 대하여) 및, 특히, 생산성의 점에서 뚜렷한 향상을 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 방법과 공지된 방법들 사이의 한가지 차이점은 상당히 더 높은 수율을 제공하는 상기 효소적 방법을 수행하는 방식에 있고, 또한 사용될 수 있는 상이한 플라보노이드류의 수 (글리코실화 형태 및 아글리콘 형태 둘 다) 가 많다는 데 있다.
본 발명의 주된 목적은 상기 언급한 기존의 아실화 방법의 모든 단점을 감소시키고, 상기 언급한 공지된 방법들과 비교하여 합성 후의 복잡하고 정교한 정제 작업을 줄이면서도, 플라보노이드 에스테르류의 최종 농도, 전환 수율 (최초에 존재한 플라보노이드류 및 아실 공여체 둘 다에 대하여) 및, 특히, 생산성의 점에서 뚜렷한 향상을 수득할 수 있게 하는 플라보노이드 에스테르류의 효소적 합성 방법을 제공하는 것이다.
이 때문에, 본 발명은, 반응 매질을 제조하기 위하여, 소정량의 플라보노이드 (글리코실화 형태 및 아글리콘 형태) 또는 플라보노이드 유도체, 아실기 공여체, 유기 용매 - 이는 아실 공여체일 수 있음 - 및 효소적 촉매를, 먼저 반응 매질을 물 농도가 150 mM 이하, 바람직하게는 물 농도가 100 mM 이하가 되도록 건조시키고, 상기 반응 동안 형성된 물 및/또는 알콜의 농도를 미리 예정된 150 mM 이하, 바람직하게는 100 mM 이하의 값으로 유지시킬 수 있는 조건하의 상응하게 설계된 반응기 내로 도입하는 것을 특징으로 하는 플라보노이드 에스테르류의 효소적 합성 방법에 관한 것이다. 형성된 물 및/또는 알콜을 분자체 상에서의 흡착으로, 증류함 또는 투과기화법 (pervaporation) 으로 온라인 제거함으로써 상기 농도를 이 예정된 값으로 유지시킨다. 이 반응은 회분식 (batch) 방법으로 또는 하나 이상의 기질을 가진 유가식 (fed batch) 방법으로도 수행할 수 있다. 상기 유가식 방법에서, 아실 공여체에 대한 플라보노이드의 몰비는 상기 반응 동안 적당한 기질 첨가 프로필 (profile) 로 일정하게 유지시킬 수 있다. 따라서, 상기 반응 매질의 조성이 시간의 함수로서 어떻게 전개되는지 제어할 수 있고, 따라서, 상기 효소적 반응을 단일- 또는 다중아실화된 화합물을 최대한으로 생산하도록 조정하고, 동시에 까다로운 반응들을 제한하는 것이 가능하다. 최종적으로, 이렇게 수득한 플라보노이드 에스테르류를 최소한 효소 입자 (예를 들어 경사분리 (decantation), 여과 또는 원심분리로써) 및 용매 (예를 들어 증발, 증류 또는 막여과로써) 를 제거하여 정제시킨다.
본 발명에 따라, 상기 반응은 먼저 고농도의 플라보노이드류, 아실 공여체 또는 축적된 물의 존재하에서 관찰되는 효소 반응 저해 또는 불활성화를 제한함으로써 수행된다. 상기 반응 동안 기질들은, 상기 효소 반응을 저해시킬 농도에 도달하지 않도록 제어하에 점차적으로 첨가될 수 있다.
상기 반응은, 플라보노이드:아실 공여체 몰비를 0.01 내지 20:1, 바람직하게는 0.02 내지 10:1 로 하여 수행될 수 있다. 상기 반응 매질에서 상기 몰비에 대한 값을 상기 언급한 범위로 유지시킴으로써, 보다 고속의 반응 속도 또는 최대 백분율의 단일아실화된 플라보노이드류를 수득할 수 있다. 시간의 함수로서 첨가되는 시약들의 종류 및 양을 조절함으로써, 상기 반응 동안 상기 몰비를 일정하게 유지시키거나 제어하에 변화시켜, 시간의 함수로서 일정한 변화 프로필을 통과하나 상기 반응 전체에 걸쳐 여전히 상기 언급한 범위로 남아있게 할 수 있다. 상기 합성 반응은 상기 반응 매질의 구성성분 하나 이상을 주기적으로 또는 연속적으로 제거함으로써 최적화될 수 있다. 제거된 구성성분(들)은, 가능하게는 분별 (fractionation) 후, 상기 반응기로 복귀시킬 수 있다.
본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 전체 반응 매질을 주기적으로 또는 연속적으로 제거시키고, 제거된 매질의 구성성분 하나 이상을 분별 후 상기 반응기내로 재-주입시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 사용되는 반응 용기 또는 반응기는 바람직하게는 온도, 물 및/또는 알콜 함량 및 압력을 조절하는 장치, 시약 첨가 장치 및 생성물 제거 장치를 갖추고 있다.
상기 합성 반응 동안, 상기 온도는 유리하게는 20 내지 100 ℃ 로 유지시키고, 상기 반응 매질에 걸친 부분압은 유리하게는 10 mbar (103 Pa) 내지 1,000 mbar (105 Pa) 의 값으로 조절하고, 물 함량을 150mM 이하, 바람직하게는 100 mM 이하의 농도로 조절하는 것에서 시작하여, 물 및/또는 알콜의 양을 150 mM 이하, 바람직하게는 100 mM 이하로 유지시키고, 상기 반응 매질을 유리하게는 온건하게 교반한다.
또한, 고도로 순수한 플라보노이드 에스테르류의 제제를 수득하기 위하여, 예를 들어, 잔여 플라보노이드 또는 지방을 유기 용매 또는 초임계 유체 (supercritical fluid) 로의 추출, 증류 또는 분자 증류, 침전 또는 결정화로 제거함으로써, 추가적인 완결적 분별을 수행할 수 있다.
본 발명의 목적상 사용되는 아글리콘 플라보노이드 또는 글리코실화 플라보노이드 또는 플라보노이드 유도체는 칼콘 (chalcone), 플라본, 플라바놀 (flavanol), 안토시안 (anthocyan) 및 플라바논, 플라바놀, 쿠마린 (coumarin), 이소플라본류 및 크산톤(xanthone)류로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 화합물일 수 있다.
상기 아실 공여체 화합물은 공지된 지방산류 또는 이들의 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 에스테르류에서 선택된다. 이 지방산은 바람직하게는 탄소수가 22 이하이고 히드록실, 아미노, 메르캅토, 할로겐 및 알킬-S,S-알킬로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 선형 또는 분지형, 포화, 불포화 또는 환형 지방족 산, 예를 들어 팔미트산, 16-히드록시헥사데칸산, 12-히드록시스테아르산, 11-메르캅토운데칸산, 티오옥탄산 또는 퀴닌산 (quinic acid), 탄소수 22 이하의 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 지방족 2산, 예를 들어 헥사데칸 2산 또는 아젤라익산 (azelaic acid), 아릴지방족 산 및 이에서 유래한 이량체 산, 신남산 (cinnamic acid) 으로서 히드록실, 니트로, 알킬, 알콕시 및 할로겐 원자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 신남산, 예를 들어 카페인산 (caffeic acid) (3,4-디히드록시신남산), 페룰린산 (ferulic acid) (4-히드록시-3-메톡시신남산) 또는 쿠마르산 (4-히드록시신남산), 벤조산으로서 히드록실, 니트로, 알킬, 알콕시 및 할로겐 원자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 벤조산, 예를 들어 갈산 (gallic acid) (3,4,5-트리히드록시벤조산), 바닐산 (vanillic acid) (4-히드록시-3-메톡시벤조산) 또는 프로토카테쿠산 (protocatechu acid) (3,4-디히드록시벤조산) 으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 지방산 에스테르류는 바람직하게는 상기 화합물들의 메틸 또는 에틸 에스테르류로부터 선택된다.
상기 반응은 용매로서의 아실 공여체와 함께 또는 유기 화합물 또는 유기 화합물들의 혼합물일 수 있는 적당한 용매 중에서 수행될 수 있는데, 이때 선택되는 플라보노이드류 또는 플라보노이드 유도체 및 아실 공여체들은 완전히 또는 부분적으로 용해된다. 따라서, 상기 용매(들)은 특히 하기 물질들로부터 선택된다: 프로판-2-올, 부탄-2-올, 이소부탄올, 아세톤, 프로파논, 부타논, 펜탄-2-온, 에탄-1,2-디올, 부탄-2,3-디올, 디옥산, 아세토니트릴, 2-메틸부탄-2-올, tert-부탄올, 2-메틸프로판올 및 4-히드록시-2-메틸펜타논, 지방족 탄화수소류, 예컨대 헵탄, 헥산, 또는 이들 용매 중 둘 이상의 혼합물.
사용되는 효소적 촉매는 물론 아실 공여체에서 플라보노이드 또는 플라보노이드 유도체로의 아실기의 이동을 이루고 촉진해야 하고, 이롭게는, 예를 들어 Candida antarctica, Rhizomucor miehei, Candida cylindracea, Rhizopus arrhizus 로부터의, 프로테아제 (protease) 또는 리파아제 (lipase) 로서, 바람직하게는 담체 상에 고정화된 것이다.
상기 언급한 다양한 특징때문에, 특히 사용되는 시약의 성질 및 성취될 바람직한 목적물의 점에서, 본 발명에 대한 가능한 다양한 구현예가 존재한다.
따라서, 첫번째 가능한 구현예는 회분식 반응기 (두 기질이 용매 및 효소를 가진 반응기 내로 도입됨) 에서의 합성 방법이다. 이 경우, 상기 반응기는 초기에 용매, 필요한 개질된 플라보노이드류의 최종 양을 수득하기 위해 필요한 총량의 플라보노이드류 (일반적으로 1 g/ℓ 내지 200 g/ℓ) 및 최초에 필요한, 일반적으로 0.01 내지 20:1 의 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비에 해당하는 양의 아실 공여체로서의 유리산 (free acid) 을 수용한다. 상기 반응기 내의 물의 양에 있어서 100 mM 미만의 고정된 값을 얻기 위하여, 상기 매질을 진공 상태 (10 내지 500 mbar, 바람직하게는 50 내지 250 mbar) 에서 20 내지 1OO ℃ 의 온도로, 바람직하게는 40 내지 80 ℃ 의 온도로 가열하고, 생성된 증기 혼합물을 분자체로 채워진 컬럼에서 건조시킨 후, 응축시키고 상기 반응기로 복귀시킨다. 필요할 경우, 상기 응축물을 분자체로 채워진 제 2 의 컬럼을 경유하여 복귀시킨다. 상기 효소를 그 후 가용 또는 고정화 형태로 첨가한다 (1 g/ℓ 내지 100 g/ℓ, 바람직하게는 5 g/ℓ 내지 20 g/ℓ). 반응기 내의 진공 상태 및 온도를 적절히 조절하여 분자체로 채워진 상기 컬럼을 통해 상기 반응 동안 형성된 물을 제거한다.
따라서, 본 발명의 두번째 가능한 구현예는, 상기 반응 동안 아실 공여체 및 용매를 첨가하는 합성 방법이다. 이 경우, 상기 반응기는 초기에는 용매, 필요한 개질된 플라보노이드류의 최종 양을 수득하기 위해 필요한 총량의 플라보노이드류 (일반적으로 1 g/ℓ 내지 200 g/ℓ) 및 최초에 필요한, 일반적으로 0.01 내지 20:1 의 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비에 해당하는 양의 아실 공여체로서의 유리산을 수용한다. 상기 반응기 내의 물의 양에 있어서 100 mM 미만의 고정된 값을 얻기 위하여, 상기 매질을 진공 상태 (10 내지 500 mbar, 바람직하게는 50 내지 250 mbar) 에서 20 내지 100 ℃ 의 온도로, 바람직하게는 40 내지 80 ℃ 의 온도로 가열하고, 생성된 증기 혼합물을 분자체로 채워진 컬럼에서 건조시킨 후, 응축시키고 상기 반응기로 복귀시킨다. 필요할 경우, 상기 응축물을 분자체로 채워진 제 2 의 컬럼을 경유하여 복귀시킨다. 상기 효소를 그 후 가용 또는 고정화 형태로 첨가한다 (1 g/ℓ 내지 100 g/ℓ, 바람직하게는 5 g/ℓ 내지 20 g/ℓ). 상기 반응 동안, 용매를 첨가하여, 상기 용매의 일부가 분자체로 채워진 컬럼을 통해 증발하게 한다. 상기 기상 (vapor phase) 에서의 교환으로 물을 제거한다. 상기 증기를 응축시키고 수집 용기 (collecting vessel) 에 모은다. 용매의 양을 비교적 일정하게 유지시키기 위하여, 상기 반응 동안 아실 공여체를, 단위 시간당, 상기 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비가 필요한 값으로 유지되는 양으로 온라인으로 도입한다. 따라서, 이 몰비를 상기 반응 동안 일정하게 유지시키는 것이 유리할 경우, 상기 아실 공여체를, 상기 반응에서 소비되는 속도에 해당하는 비율로 첨가한다. 이 소비율은 사용되는 효소 반응의 예비 반응속도 분석으로 결정될 수 있다. 상기 반응 동안 단위 시간당 첨가되는 아실 공여체의 양은 일반적으로, 상기 반응기 내에서 시간당 효소 촉매 1 g 당 0.01 내지 10 g 에 달한다.
본 발명의 세번째 구현예에서, 상기 합성 반응은 또한 플라보노이드류 및 용매 첨가로 수행될 수 있다. 이 경우, 상기 반응기는 초기에 용매, 필요한 개질된 플라보노이드류의 최종 양을 수득하기 위해 필요한 총량의 아실 공여체로서의 유리산 (일반적으로 1 g/ℓ 내지 500 g/ℓ) 및 최초에 필요한 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비에 해당하는 양 (일반적으로 1 g/ℓ 내지 200 g/ℓ) 의 플라보노이드를 수용한다. 상기 반응기 내의 물의 양에 있어서 100 mM 미만의 고정된 값을 얻기 위하여, 상기 매질을 진공 상태 (10 내지 500 mbar, 바람직하게는 50 내지 250 mbar) 에서 20 내지 100 ℃ 의 온도로, 바람직하게는 40 내지 80 ℃ 의 온도로 가열하고, 생성된 증기 혼합물을 분자체로 채워진 컬럼에서 건조시킨 후, 응축시키고 상기 반응기로 복귀시킨다. 필요할 경우, 상기 응축물을 분자체로 채워진 제 2 의 컬럼을 경유하여 복귀시킨다. 상기 효소를 그 후 가용 또는 고정화 형태로 첨가한다 (1 g/ℓ 내지 100 g/ℓ, 바람직하게는 5 g/ℓ 내지 20 g/ℓ). 상기 반응 동안, 용매를 첨가하고, 진공을 가하여 상기 용매의 일부 및 형성된 물이 증발로 제거되게 한다. 증발율은 상기 진공 상태 및 온도를 알맞게 제어하여 조절한다. 생성된 상기 증기를 분자체로 채워진 컬럼으로 통과시킨다. 상기 분자체와의 접촉으로 물을 제거한다. 물 제거 후, 상기 증기를 응축시키고, 이후 상기 반응기로의 복귀를 위해 수집 용기 (collecting vessel) 에 모은다. 무수(無水) 용매를 임의적으로는, 증발 손실을 만회하고 용매의 양을 비교적 일정하게 유지시키기 위하여, 상기 반응 동안 도입한다. 또한, 플라보노이드를, 단위 시간당, 상기 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비가 필요한 값으로 유지되는 양으로 도입한다. 따라서, 이 몰비를 상기 반응 동안 일정하게 유지시키는 것이 유리할 경우, 플라보노이드를, 상기 반응에서 소비되는 속도에 해당하는 비율로 첨가한다. 이 소비율은 사용되는 효소 반응의 예비 반응속도 분석으로 결정될 수 있다. 상기 반응 동안 단위 시간당 첨가되는 플라보노이드의 양은 일반적으로, 상기 반응기 내에서 시간당 효소 촉매 1 g 당 0.01 내지 10 g 에 달한다.
본 발명의 네번째 구현예에서, 상기 합성 반응은 또한 플라보노이드류, 아실 공여체 및 용매 첨가로 수행될 수 있다. 이 네번째 경우, 상기 반응기는 초기에 용매, 다양한 농도의 (바람직하게는 상기 용매 중의 플라보노이드의 용해도를 초과하는) 플라보노이드, 및 최초에 필요한 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비에 해당하는 양의 아실 공여체로서의 유리산을 수용한다. 상기 반응기 내의 물의 양에 있어서 100 mM 미만의 고정된 값을 얻기 위하여, 상기 매질을 진공 상태 (10 내지 500 mbar, 바람직하게는 50 내지 250 mbar) 에서 20 내지 100 ℃ 의 온도로, 바람직하게는 40 내지 80 ℃ 의 온도로 가열하고, 생성된 증기 혼합물을 분자체로 채워진 컬럼에서 건조시킨 후, 응축시키고 상기 반응기로 복귀시킨다. 필요할 경우, 상기 응축물을 분자체로 채워진 제 2 의 컬럼을 경유하여 복귀시킨다. 상기 효소를 그 후 가용 또는 고정화 형태로 첨가한다 (1 g/ℓ 내지 100 g/ℓ, 바람직하게는 5 g/ℓ 내지 20 g/ℓ). 상기 반응 동안, 용매를 첨가하고, 10 내지 500 mbar, 바람직하게는 100 내지 250 mbar 의 진공을 가한다. 물을 제거하기 위하여, 생성된 상기 증기를 분자체로 채워진 컬럼으로 통과시킨다. 상기 증기를 응축시키고, 수집 용기에 모은다. 무수 용매를 임의적으로는, 증발 손실을 만회하고 용매의 양을 비교적 일정하게 유지시키기 위하여, 상기 반응 동안 도입한다. 또한, 플라보노이드를, 단위 시간당, 상기 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비가 필요한 값으로 유지되는 양으로 도입한다. 이 몰비를 상기 반응 동안 일정하게 유지시키는 것이 유리할 경우, 플라보노이드 및 아실 공여체를, 단위 시간당, 상기 반응에서 소비되는 속도에 해당하는 양으로 첨가한다. 이 소비율은 사용되는 효소 반응의 예비 반응속도 분석으로 결정될 수 있다.
본 발명의 다섯번째 구현예에서, 상기 연속 합성 방법은, 플라보노이드, 아실 공여체 및/또는 용매, 및 가능하게는, 효소 촉매의 첨가 및 제거로 다르게 수행될 수 있다. 이 다섯번째 경우에서, 상기 반응기는 초기에 용매, 다양한 농도의 (바람직하게는 상기 용매 중의 플라보노이드의 용해도를 초과하는) 플라보노이드, 및 최초에 필요한 (용해된 플라보노이드/아실 공여체의) 몰비에 해당하는 양의 아실 공여체로서의 유리산을 보유한다. 상기 반응기 내의 물의 양에 있어서 100 mM 미만의 고정된 값을 얻기 위하여, 상기 매질을 진공 상태 (10 내지 500 mbar, 바람직하게는 50 내지 250 mbar) 에서 20 내지 100 ℃ 의 온도로, 바람직하게는 40 내지 80 ℃ 의 온도로 가열하고, 생성된 증기 혼합물을 분자체로 채워진 컬럼에서 건조시킨 후, 응축시키고 상기 반응기로 복귀시킨다. 필요할 경우, 상기 응축물을 분자체로 채워진 제 2 의 컬럼을 경유하여 복귀시킨다. 상기 효소를 그 후 가용 또는 고정화 형태로 첨가한다. 상기 반응이 진행되는 동안, 상기 반응 매질로부터 물질들을 연속적으로 또는 주기적으로 제거한다. 상기 효소가 고정화 형태로 존재하는 경우, 이는 반응기 내에 유지된다. 분리 후, 상기 용매 및 가능하게는 상기 플라보노이드 및/또는 상기 아실 공여체를 상기 반응기로 복귀시킬 수 있다. 증발 및 제거에 의한 손실을 만회하기 위하여 상기 반응 동안 무수 용매를 첨가한다. 또한, 플라보노이드 및 아실 공여체를, 단위 시간당, 이들 두 구성성분들의 몰비가 필요한 값으로 유지되는 양으로 도입한다. 상기 기술한 바와 같이, 분자체를 통과시켜 물을 제거한다. 물 제거 후, 상기 증발된 용매를 응축시키고 상기 반응기로 복귀시킨다. 이 몰비를 상기 반응 동안 일정하게 유지시키는 것이 유리할 경우, 플라보노이드 및 아실 공여체를, 단위 시간당, 상기 반응에서 소비되는 속도에 해당하는 양으로 첨가한다.
여섯번째 구현예에서는, 아실 공여체로서의 유리산을 이의 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 에스테르, 바람직하게는 이의 메틸 또는 에틸 에스테르로 대체시키는 것을 제외하고는, 상기 기술한 바와 같이 반응을 수행한다. 생성된 알콜을 전과 동일한 방식으로 제거한다.
일곱번째 구현예에서, 상기 아실 공여체를 용매로 사용한다.
여덟번째 구현예에서, 상기 매질에 존재하거나 및/또는 상기 반응 동안 생성된 물 및/또는 알콜을 투과기화막으로 증기 또는 액상으로 제거한다.
실시예 1
250 ml 회분식 반응기에서 Candida antarctica 리파아제 (Novozym 435) 를 이용하여 루틴 모노팔미테이트 (rutin monopalmitate) 의 합성을 수행하였다. 이는 매크로다공성 (macroporous) 아크릴 수지 상에 고정화된 리파아제이다. 상기 리파아제에 7,000 PLU x g-1 의 활성(프로필 라우레이트 (propyl laurate) 합성), 1 내지 2 중량% 의 물 함량 및 1 내지 10 중량% 의 효소 단백질 함량을 공급한다.
0.75 g (1.2 mmol) 루틴, 0.315 g (1.2 mmol) 팔미트산 및 250 ml tert-아밀알콜이 이 합성에 사용되었다. 매질을 진공 (150 mbar) 에서 60 ℃ 로 가열하고, 생성된 증기를 50 g 의 분자체로 채워진 60 ℃ 로 가열된 컬럼을 통과시켰다. 따라서, 존재하던 물을 기상으로 제거하였는데, 이는 액상으로보다 훨씬 더 효과적이었다. 상기 무수(無水) 증기를 응축시키고 동일 양의 분자체가 채워진 제 2 의 컬럼을 경유하여 상기 반응기로 복귀시켰다. 이러한 방식으로, 6 시간 후에 100 mM 미만의 출발 물 함량을 수득하였고, 상기 기질들을 가용화시켰다. 그 후, 상기 효소 (2.5 g) 를 첨가하였다. 60 ℃ 에서 진공 상태 (150 mbar) 로 상기 반응을 수행하였고, 생성된 물은 상기 최초의 건조와 동일한 방식으로 제거하여 이의 농도가 100 mM 이하로 유지되게 하였다.
이 농도는, 상기 진공상태를 조절하고 상기 응축기를 그에 따라 냉각시킴으로써 변화시킬 수 있다. 상기 기압은 10 내지 700 mbar 로 다양한 것으로 조사되었고, 상기 응축기의 온도는 -20 내지 5 ℃ 로 조사되었다. 이러한 방식으로, 상기 반응기 내의 물의 농도를 5 내지 400 mM 로 조절할 수 있었다.
48 시간동안 반응시킨 후, 생성물을 HPLC 로 분석한 결과, 상기 두 기질에 대한 전환 수율은 약 90 % 에 달했다.
반응 종료시, 여과로 상기 효소를 회수하였다. 그 후 용매를 증발시켜 상기 매질을 농축시켰다. 기질 잔류물을 제거하기 위하여, 두 추출 시스템을 사용하였다. 아세토니트릴 및 헵탄 (3:5, v:v) 혼합물을 사용하여 상기 팔미트산을 제거하고, 물/헵탄 (2:3, v:v) 으로 상기 루틴을 제거하였다.
1H-NMR 분석으로 생성물의 구조를 확인하였다:
1H-NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.8 (t, 3H), 1 (d, 3H), 1.25 (m, 24H), 1.45
(m, 2H), 2.1 (m, 2H), 3.1-3.6 (넓음, C-H 당 (sugar)), 3.7 (d, 1H), 4.45 (s, 1H), 4.65 (t, 1H), 5.3 (넓음, OH 당), 5.1 (넓음, OH 당), 5.45 (d, 1H), 6.2
(s, 1H), 6.4 (s, 1H), 6.8 (d, 1H), 7.6 (m, 2H), 12.6 (s, 1H, C5-OH) ppm.
실시예 2
팔미트산 (0.315 g, 1.2 mmol) 을 이용한 히스페리딘(hesperidin) (0.75 g, 1.2 mmol) 의 아실화를 상기 기술한 바와 같이 수행하였다.
HPLC 분석 결과, 48 시간 후에 95% 의 아실 공여체가 소비된 것으로 나타났다. 이전과 동일한 정제 방법을 사용하여, 액체/액체 추출로 히스페리딘 모노팔미테이트를 수득하였다. 1H-NMR 분석으로 히스페리딘 에스테르의 구조를 확인하였다:
1H-NMR: (400 MHz, DMSO-d6); δ 0.83 (t, 3H), 1.0 (d, 3H), 1.05 (넓음, 24H), 1.20 (m, 2H), 2.25 (m, 2H), 3.4-3.6 (넓음, C-H 당), 3.8 (s, 3H), 4.15 (s, 1H), 4.58 (s, 1H), 4.75 (m, 2H), 5.0 (m, 1H), 5.18 (dd, 1H), 5.4 (d, 1H), 5.48 (d, 1H), 6.14 (m, IH), 6.18 (s, IH), 7.0 (m, 3H), 9.15 (s, 1H), 12.05 (s, 1H) ppm.
실시예 3
실시예 1 에 기술된 바와 같이 팔미트산 (0.523 g, 2 mmol) 을 이용한 에스쿨린 (esculin) (0.75 g, 2 mmol) 의 아실화를 수행하였다. 액체 크로마토그래피 분석 결과, 48 시간 후 상기 아실 공여체의 48% 가 소비된 것으로 나타났다. 이전과 동일한 정제 방법을 사용하여, 액체/액체 추출로 에스쿨린 모노팔미테이트를 수득하였다. 1H-NMR 분석으로 에스쿨린 에스테르의 구조를 확인하였다:
1H-NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.8 (t, 3H), 1.15 (넓음, 24H), 1.4 (m, 2H), 2.25 (m, 2H), 3.2 (m, IH), 3.65 (m, 1H), 4.1 (dd, 1H), 4.35 (d, 1H), 4.85 (d, 1H), 5.25 (s, 1H), 5.35 (d, 1H), 6.2 (d, 1H), 6.8 (s, 1H), 7.3 (s, 1H), 7.85 (d, 1H) ppm.
실시예 4
27 ml 반응기에서 라우르산을 이용하여 루틴의 아실화를 수행하였다. 루틴 (100 mg, 0.16 mmol) 및 라우르산 (20 mg, 0.10 mol) 을 60 ℃ 에서 20 ml 건조된 tert-아밀알콜에 용해시켰다. 분자체 (4 g) 를 첨가하여 물 함량이 상기 반응 매질 내에서 100 mM 이하로 제어되도록 조절하고, 이를 유지시켰다. 0.2 g 의 Candida antarctica 리파아제 (Novozym 435) 를 첨가하여 에스테르화 반응을 일으켰다.
HPLC 분석 결과, 루틴의 모노에스테르로의 전환은 76 % 에 달하였다.
실시예 5
실시예 4 에 기술된 바와 같이, 라우르산 (54 mg, 0.27 mmol) 을 이용한 에스쿨린 (100 mg, 0.27 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
HPLC 분석 결과, 에스쿨린 모노에스테르의 전환율은 82% 였다.
실시예 6
실시예 4 에 기술된 바와 같이, 11-아미노운데칸산 (55 mg, 0.27 mmol) 을 이용한 에스쿨린 (100 mg, 0.27 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
HPLC 분석 결과 상기 모노에스테르의 전환율은 61% 였다.
실시예 7
실시예 4 에 기술된 바와 같이, 11-메르캅토운데칸산 (59 mg, 0.27 mmol) 을 이용한 에스쿨린 (100 mg, 0.27 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
에스쿨린의 상기 모노에스테르로의 전환율은 68% 에 달하였다(HPLC 분석).
실시예 8
실시예 4 에 기술된 바와 같이, 아디프산 (40 mg, 0.27 mmol) 을 이용한 에스쿨린 (100 mg, 0.27 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
HPLC 분석 결과 상기 에스쿨린 모노에스테르의 전환율은 70% 였다.
실시예 9
실시예 4 에 기술된 바와 같이, 도데칸 2산 (38 mg, 0.16 mmol 등몰)을 이용한 에스쿨린 (100 mg, 0.16 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
HPLC 분석 결과 상기 루틴 모노에스테르의 전환율은 75% 였다.
실시예 10
실시예 4 에 기술된 바와 같이, 2산 (754 mg, 3.27 mmol 산 과량) 을 이용한 루틴 (100 mg, 0.16 mmol)의 아실화를 수행하였다.
HPLC 분석 결과, 상기 루틴의 전환율은 75% 였고, 상기 디에스테르 대 모노에스테르의 비는 4:1 이었다.
실시예 11
250 ml 반응기에서 도데칸 2산을 이용한 루틴 (과량) 의 반응을 수행하였다.
루틴 (8, 13 mmol) 및 도데칸 2산 (0.3 g, 1.3 mmol) 을 200 ml tert-아밀알콜에 용해시키고 및 진공 상태 (105 내지 200 mbar) 에서 60 ℃ 로 가열하였다. 생성된 증기를 분자체가 채워진 컬럼으로 통과시키고 회수하였다. 이러한 방식으로, 수 시간 후, 상기 반응기에서 100 mM 미만의 소량의 물 함량을 수득하였다. 그 후 2 g 의 Candida antarctica 리파아제 (Novozym 435) 를 첨가하였다.
4 일 후, 도데칸 2산의 도데칸 디오일 (dioyl) 디루틴 (2산 분자로 연결된 루틴의 두 분자) 및 도데칸 디오일 루틴 (모노에스테르) 으로의 100 % 전환이 이루어졌다(HPLC 분석).
실시예 12
실시예 11 에 기술된 바대로, 도데칸 2산 (5 g, 21.7 mmol - 산 과량) 을 이용한 에스쿨린 (8, 21.7 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
HPLC 분석 결과 상기 에스쿨린 모노에스테르의 전환율은 92% 에 달한 것으로 나타났다.
실시예 13
실시예 4 에 기술된 바대로, 헥사데칸 2산 (47 mg, 0.16 mmol) 을 이용한 루틴 (100 mg, 0.16 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
상기 루틴의 87% 가 전환되었다 (HPLC 분석).
실시예 1 에 따른 액체/액체 추출 정제 방법으로 헥사데칸 디오일 루틴 (모노에스테르) 을 회수하였다. 상기 생성물의 구조를 1H-NMR 분석으로 확인하였다:
1H NMR : (400 MHz, DMSO d6) : δ 0.76 (d, 3H), 1.2 (m, 60H), 1.5 (m, 12H), 2.2 (m, 12H), 3.1-3.6 (넓음, 8H), 3.7 (d, 1H), 4.45 (s, 1H), 4.65 (t, 1H), 5.43 (d, 1H), 6.18 (d, 1H), 6.36 (ci, 1H), 6.84 (d, 1H), 7.50 (m, 2H) ppm.
실시예 14
실시예 4 에 기술된 바대로, 헥사데칸 2산 (78 mg, 0.27 mmol) 을 이용한 에스쿨린 (100 mg, 0.27 mmol) 의 아실화를 수행하였다.
HPLC 분석 결과 상기 에스쿨린 모노에스테르의 전환율은 89% 에 달한 것으로 나타났다.
실시예 15
250 ml 반응기에서 티오옥탄산 (thiooctanoic acid) 을 이용한 에스쿨린의 반응을 수행하였다. 에스쿨린 (0.87 g, 2.5 mmol) 및 티오옥탄산 (1.23 g, 6mmol) 을 250 ml tert-아밀알콜에 용해시키고, 진공 상태 (150 내지 200 mbar) 에서 60 ℃ 로 가열하였다. 생성된 증기를 분자체가 채워진 컬럼으로 통과시키고 회수하였다. 이러한 방식으로, 21 시간 후에, 상기 반응기 내에 100 mM 미만의 소량의 물 함량을 수득하였다. 그 후 2.5 g 의 Candicia antarctica 리파아제 (Novozym 435) 를 첨가하였다.
70 시간 후, 상기 에스쿨린의 50% 가 전환되었다(HPLC 분석).
상기 반응 후, 상기 효소를 여과시키고, 용매 증발로 반응 매질을 농축시켰다. 과량의 티오옥탄산을 제거하기 위하여, 물, 헵탄 및 아세토니트릴 (2:3:4, v:v:v) 혼합물을 추출에 사용하고, 그 후, 상기 에스테르를 디클로로메탄을 이용한 추출로 회수하였다. 상기 에스테르의 구조는 1H NMR로 증명되었다:
1H NMR : (400 MHz, DMSO d6): 12-1.9 (넓음, 8H), 2.1-2.4(넓음 4H), 3.2 (m, 2H), 3.5 (m, 1H), 3.7 (m, 1H), 4.12 (dd, 1H), 4.35 (d, 1H), 4.85 (d, 1H), 5.23 (d, 1H), 5.33 (d, 1H), 6.26(d, 1H), 6.84 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.86 (d, 1H) ppm.
실시예 16
250 ml 반응기에서 페닐프로피온산을 이용한 루틴의 반응을 수행하였다. 루틴 (8 g, 13 mmol) 및 페닐프로피온산 (10 g, 67 mmol) 을 200 ml tert-아밀알콜에 용해시키고, 진공 상태 (150 내지 200 mbar) 에서 60 ℃ 로 가열시켰다. 생성된 증기를 분자체로 채워진 컬럼으로 통과시키고, 회수하였다. 이러한 방식으로, 17 시간 후에 상기 반응기 내에 100 mM 미만의 소량의 물 함량을 수득하였다. 그 후 13 g 의 Candicia antarctica 리파아제 (Novozym 435) 를 첨가하였다.
상기 생성물의 HPLC 분석 결과, 105 시간의 반응 시간 후, 상기 루틴 모노에스테르로의 전환율은 55% 로 나타났다.

Claims (18)

  1. a) 유기 용매, 글리코실화 플라보노이드 또는 아글리콘 플라보노이드, 아실기 공여체 및 효소적 촉매를 함유한 반응 매질을 제조하고,
    b) 상기 반응 동안 플라보노이드 및/또는 아실 공여체 추가량을 임의적으로 첨가하고,
    c) 이렇게 수득된 에스테르를, 효소 입자 및 용매를 제거하여 정제하는, 플라보노이드 에스테르류 및 유도체들의 효소적 합성 방법으로서, 상기 반응 동안 형성된 물 및/또는 알콜의 농도를 150 mM 이하로 남아있도록 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 반응동안 형성된 물 및/또는 알콜의 농도를 100 mM 이하로 남아있도록 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 매질 내에서 아실 공여체에 대한 플라보노이드의 몰비가 상기 반응 동안 0.01 내지 20.00 의 범위가 되도록 이를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 매질 내에서 아실 공여체에 대한 플라보노이드의 몰비가 상기 반응 동안 0.02 내지 10.00 의 범위가 되도록 이를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 고체 형태 또는 액체 용액의 형태의 하나 이상의 플라보노이드, 용매, 가용 또는 고정화 형태의 효소적 촉매 및 상기와 같거나 또는 상기 용매에 가용화된 아실 공여체 화합물의 추가량을 연속적으로 또는 주기적으로 상기 반응 매질에 첨가하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 매질의 구성성분 하나 이상을 주기적으로 또는 연속적으로 제거하고, 분별 (fractionation) 후, 상기 반응기로 복귀시키는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 반응 동안 상기 전체 반응 매질을 주기적으로 또는 연속적으로 제거하고, 분별 후, 상기 제거된 매질의 구성성분 하나 이상을 상기 반응기 내로 재-주입하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 동안, 상기 온도는 20 내지 100 ℃ 로 유지시키고, 상기 반응 매질에 걸친 부분압은 10 mbar 내지 1,000 mbar 로 조절하고, 반응 매질을 교반하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 잔여 플라보노이드 또는 지방을 유기 용매 또는 초임계 유체 (supercritical fluid) 로의 추출, 증류, 결정화, 흡착 또는 침전으로 제거하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 생성된 플라보노이드 에스테르류를 침전 또는 크로마토그래피 분리로 분별하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 플라보노이드가, 칼콘, 플라본, 플라바놀, 플라바논, 안토시안, 플라바놀, 쿠마린, 이소플라본 및 크산톤으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 아실 공여체 화합물이, 탄소수가 22 이하이고 히드록실, 아미노, 메르캅토, 할로겐 및 알킬-S,S-알킬로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 선형 또는 분지형, 포화, 불포화 또는 환형 지방족 산, 예를 들어 팔미트산, 16-히드록시헥사데칸산, 12-히드록시스테아르산, 11-메르캅토운데칸산, 티오옥탄산 또는 퀴닌산 (quinic acid), 탄소수 22 이하의 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 지방족 2산, 예를 들어 헥사데칸 2산 또는 아젤라익산 (azelaic acid), 아릴지방족 산 및 이에서 유래한 이량체 산, 신남산 (cinnamic acid) 으로서 히드록실, 니트로, 알킬, 알콕시 및 할로겐 원자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 신남산, 예를 들어 카페인산 (caffeic acid) (3,4-디히드록시신남산), 페룰린산 (ferulic acid) (4-히드록시-3-메톡시신남산) 또는 쿠마르산 (4-히드록시신남산), 벤조산으로서 히드록실, 니트로, 알킬, 알콕시 및 할로겐 원자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 벤조산, 예를 들어 갈산 (gallic acid) (3,4,5-트리히드록시벤조산), 바닐산 (vanillic acid) (4-히드록시-3-메톡시벤조산) 또는 프로토카테쿠산 (protocatechu acid) (3,4-디히드록시벤조산) 또는 이들 화합물의 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 에스테르류로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 용매는 프로판-2-올, 부탄-2-올, 이소부탄올, 아세톤, 프로파논, 부타논, 펜탄-2-온, 에탄-1,2-디올, 부탄-2,3-디올, 디옥산, 아세토니트릴, 2-메틸부탄-2-올, tert-부탄올, 2-메틸프로판올 및 4-히드록시-2-메틸펜타논, 지방족 탄화수소류, 예컨대 헵탄 및 헥산, 및 이들 용매 중 둘 이상의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 용매가 아실 공여체인 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 효소적 촉매가 프로테아제 및/또는 리파아제를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 프로테아제 및/또는 리파아제가 담체 상에 고정화된 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 물 및/또는 알콜을 상기 매질로부터 분자체로 기상 또는 액상으로 제거하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 물 및/또는 알콜을 상기 매질로부터 투과기화로 기상 또는 액상으로 제거하는 방법.
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