KR20050085246A - 코엔자임ｑ-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법, 그리고분석시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 검체중의 코엔자임Q-10과 그 2전자 환원체의 함유량을 정확하게 분석할 수 있는 분석방법 및 분석시스템에 관한 것으로, 전처리로서, 검체로서의 인간의 혈장을 이소프로필 알콜과 혼합하고, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 이소프로필 알콜로 추출한다. 추출액은 분석할 때까지의 동안 4℃의 온도에서 보관한다. 추출액을 분석시료로 해서, 송액기구, 전환기구, 농축 컬럼, 분리 컬럼, 환원 컬럼, 자외흡수 검출기 및 전기화학 검출기를 구비하는 분석시스템으로 분석한다.
Description
본 발명은, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법 및 분석시스템에 관한 것이다.
코엔자임Q(조효소Q:CoQ)는 벤조퀴논 유도체이며, 널리 생물계에 존재하는 점에서 유비퀴논이라고 명명되어 있다. 유비퀴논을 2전자 환원한 히드로퀴논체가 유비퀴놀이다.
유비퀴논은, 화합물명이 2,3-디메톡시-5-메틸-6-폴리프레닐-1,4-벤조퀴논이며, 이소프렌단위가 n=1∼12인 다수의 동족체가 천연으로 존재하고, 인간 등의 고등동물에 대해서는 n=10이다. 이하의 설명에서는, 특별히 기재하지 않는 한, 인간 등의 유비퀴논에 대해서 코엔자임Q-10으로 표시함과 아울러, 인간 등의 유비퀴놀에 대해서 코엔자임Q-10의 2전자 환원체로 표시한다.
코엔자임Q-10의 2전자 환원체는, 강한 항산화작용이 있어, 활성산소에 의한 세포의 손상을 막는 등 노화방지에 효과가 있다고 되어 있다.
산화 스트레스는, 생체내의 산화와 항산화의 밸런스가 무너져서 산화로 기울어진, 생체에 있어서 바람직하지 못한 상태로 되어 있지만, 코엔자임Q-10과 그 2전자 환원체의 비율은, 이 산화 스트레스의 정도를 반영하고 있다라고 생각되므로, 산화 스트레스의 양호한 마커로 될 수 있다고 생각되어지고 있다.
이렇게, 코엔자임Q-10과 그 2전자 환원체의 거동을 알 수 있는 것은 매우 유용하기 때문에, 이들의 성분을 적확하게 분석하는 방법이 요구된다.
분석방법으로서, 고전적인 것으로서 자외흡수법 등이 있지만, 제3물질의 영향을 받기 쉬워 번잡한 전처리를 필요로 한다.
최근에서는, 고감도로 정확하게 분석할 수 있는 방법으로서 고속액체 크로마토그래피(이하, HPLC로 표시한다.)가 널리 사용되고 있다. 코엔자임Q-10의 검출에는 275nm의 자외흡수가 이용되고 있다. 그러나, 종래의 HPLC에 의한 분석방법은, 혈장중의 코엔자임Q-10을 검출하기 위해서는 감도가 불충분하다.
이 때문에, 코엔자임Q-10을 2전자 환원체로 환원해서, 환원 전후의 차를 코엔자임Q-10으로서 정량하는 방법도 제안되고 있다. 그런데, 이 분석방법에서는, 검체의 전처리를 행함과 아울러, HPLC에의 시료주입을 2번 행할 필요가 있다.
이 때문에, 본 출원인은, 도1에 나타내듯이, 역상의 분리 컬럼(스펠코사제 LC-8)(1)으로 코엔자임Q-10과 그 2전자 환원체를 분리한 후, 환원컬럼(시세이도제 SHISEIDO CQ)(2) 또는 쿨로매트릭 전극을 이용하여 코엔자임Q-10을 2전자 환원체로 환원해서 전기화학 검출기(3)로 측정하는 방법을, 앞서 제안하고 있다(예를 들면Satosi Yamasita and Yorihiro Yamamoto ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 250, 66-73(1997)참조). 또, 도1중, 참조부호 4는 이동상을, 참조부호 5는 펌프를, 참조부호 6은 시료주입기를, 참조부호 7은 보호 컬럼을, 참조부호 8은 자외흡수 검출기를 각각 나타낸다.
상기의 분석방법을 사용함으로써, 코엔자임Q-10과 그 2전자 환원체의 고감도동시측정이 가능하다. 얻어지는 크로마토그램의 일례를 도2에 나타낸다. 도2중, 「1」이 코엔자임Q-10의 피크이며, 「2」가 코엔자임Q-10의 2전자 환원체의 피크이다.
이 경우, 검체중의 예를 들면 비타민C나 요산 등의 수용성 항산화물질이 측정에 영향을 주는 점에서, 검체를 메탄올/헥산으로 추출 처리하고, 수용성 항산화 물질을 메탄올상으로, 코엔자임Q-10 등을 헥산상으로 분배하는 전처리를 행하고 있다.
그러나, 상기의 메탄올/헥산으로 추출처리하는 전처리방법은, 헥산 추출액중의 코엔자임Q-10이 화학적으로 불안정하며, 전처리후, 처리액을 HPLC에 주입해서 분석할 때까지의 동안에 있어서, 도3에 나타내듯이 상당률로 코엔자임Q-10의 2전자 환원체가 산화되어버리기 때문에, 검체 추출후, 신속히 분석하는 것이 필요했다. 정확한 분석을 행하기 위해서는, HPLC에 주입하기 직전에 추출조작을 행하는 것이 필수이기 때문에, 대량의 검체를 일괄적으로 처리하는 것이 매우 곤란했다. 또, 도3중, 각 온도는 헥산 추출액의 보관온도를 나타낸다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부의 도면을 참조하면서 이하의 상세한 설명을 통해 한층 명료하게 될 것이다.
도1은, 종래의 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석시스템의 개략적인 구성을 나타내는 도면이다.
도2는, 도1의 분석시스템에서 얻어지는 크로마토그램의 일례이다.
도3A는, 코엔자임Q-10의 2전자 환원체에 대해서, 도1의 분석시스템의 제공시료를 보관했을 때의 성분의 경시변화를 나타내는 그래프이며, B는, 코엔자임Q-10에 대해서, 도1의 분석시스템의 제공시료를 보관했을 때의 성분의 경시변화를 나타내는 그래프이다.
도4는, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서의 전처리공정을 설명하기 위한 도면이다.
도5A는, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 양에 대해서, 본 실시예에 따른 분석방법에 있어서의 전처리후의 추출액을 보관할 때의 성분의 경시변화를 나타내는 그래프이며, B는, 코엔자임Q-10의 몰 분률에 대해서, 본 실시예에 따른 분석방법에 있어서의 전처리후의 추출액을 보관할 때의 성분의 경시변화를 나타내는 그래프이다.
도6은, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석시스템의 개략적인 구성을 나타내는 도면이다.
도7은, 검체로서 혈장을 사용한 경우에 있어서, 도6의 분석시스템에서 얻어지는 크로마토그램의 일례이다.
도8은, 검체로서 타액을 사용한 경우에 있어서, 도6의 분석시스템에서 얻어지는 크로마토그램의 일례이다.
본 발명은, 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하는, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법 및 분석시스템을 제공하는 것을 총괄적인 목적으로 하고 있다.
본 발명의 보다 상세한 목적은, 검체중의 코엔자임Q-10과 그 2전자 환원체의 함유량을 정확하게 정량할 수 있는 분석방법 및 분석시스템을 실현하는 것을 목적으로 한다.
이 목적을 달성하기 위해서, 본 출원인이 예의검토한 결과, 전처리에 사용하는 추출 용제로서 메탄올/헥산 대신에 이소프로필 알콜을 사용하는 것이 보다 바람직한 것을 발견하여, 이 지견에 기초하여 이하의 발명에 이르렀다.
본 발명에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법은, 전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 적어도 어느 한쪽을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하는 것을 특징으로 한다.
여기에서, 코엔자임Q-10이 유비퀴논을 나타내고, 코엔자임Q-10의 2전자 환원체가 유비퀴놀을 나타내는 것은 상기와 바와 같다. 수용성 유기용매는, 이소프로필 알콜이 바람직하지만, 이것에 한정되지 않고, 이소프로필 알콜과 동등한 극성을 갖는 용매를 사용할 수 있고, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 n-프로필알콜을 혼합해서 극성을 조정한 혼합용매 등을 사용할 수 있다. 또, 전처리후의 분석시료를 분석하는 방법은, 이하에 설명하는 본 발명의 분석방법에 한정되지 않고, 상기한 종래의 분석방법 등 적당한 방법을 채용할 수도 있다.
본 발명의 상기의 구성에 의해, 분석시료를 분석할 때까지의 동안의 성분의 변화를 억제함으로써 정확하게 분석할 수 있다. 또한 검체를 추출한 후에 즉시 분석을 행할 필요가 없다.
이 경우, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도, 보다 바람직하게는 4℃전후의 온도에서 보관해 두면, 성분의 변화를 보다 확실하게 억제할 수 있어서 바람직하다. 여기에서, 추출액의 융점은, 추출에 사용하는 수용성 유기용제의 융점과 실질적으로 같다.
또한 이 경우, 상기 분석시료(추출액)를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하면, 분석시료의 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 농도가 낮은 경우에 있어서도 정확하게 또한 고감도로 분석할 수 있어 바람직하다.
또한 이 경우, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 해서, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하면, 종래와 같이 HPLC에 분석시료를 2번 주입할 필요가 없어, 능률적으로 분석할 수 있어서 바람직하다.
또한 상기 본 발명의 분석방법을 바람직하게 실현하기 위해서, 본 발명에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석시스템은, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 사용하는 분석시스템으로서, 분석시료를 제1이동상과 함께 송액하는 제1계열과 제2이동상만을 송액하는 제2계열로 이루어지는 송액기구와, 상기 송액기구의 2개의 계열의 이동상의 송액경로를 전환하는 전환기구와, 상기 제1계열의 이동상을 수용해서 상기 분석시료를 농축한 후, 상기 제2이동상을 수용하는 농축 컬럼과, 상기 농축 컬럼으로부터 송출되는 액을 수용해서 분리하는 분리 컬럼과, 상기 분리 컬럼으로부터 송출된 액을 수용해서 환원하는 환원 컬럼과, 상기 환원 컬럼으로부터 송출된 액을 검출처리하는 전기화학 검출기를 갖는 것을 특징으로 한다.
이 경우, 검출기로서 또한 자외흡수 검출기를 가지면, 검체중의 콜레스테롤 등의 전기화학 검출에서는 고감도로 검출할 수 없는 성분을 동시 분석할 수 있어 바람직하다.
다음에 본 발명에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법 및 분석시스템의 바람직한 실시형태(이하, 형태예라고 한다.)에 대하여, 도면을 참조해서 설명한다.
이하 설명하는 제1형태예에 있어서는, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 함유하는 검체로서 인간의 혈장을 사용한다. 또한 제2형태예에 있어서는, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 함유하는 검체로서 인간의 타액을 이용한다.
먼저, 제1형태예에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서의 전처리에 대해서, 도4를 참조해서 설명한다.
검체로서의 인간의 혈장을 50㎕ 채취하고(도4중, S-1), 이것에 이소프로필 알콜을 950㎕ 첨가해서(도4중, S-2), 충분하게 혼합시킨다. 계속해서, 4℃의 온도하, 12000rpm의 회전속도로 3분간 원심기로 가한다. 이것에 의해, 검체로부터 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체가 이소프로필 알콜상으로 추출된다(도4중S-3).
그리고, 코엔자임Q-10 등을 추출한 추출액은, 4℃전후의 온도에서 보관함으로써(도4중, S-4), 도5에 나타내듯이, 적어도 11시간후에 있어서도 코엔자임Q-10의 2전자 환원체가 거의 산화를 받아들이지 않아, 보관중의 분석시료의 변질을 방지할 수 있다. 또, 도5B중, 세로축의 코엔자임Q-10은, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 총량에 차지하는 코엔자임Q-10의 비율(몰비)을 나타낸다.
이상에서 설명한 본 실시에 따른 제1형태예의 전처리방법에 의하면, 검체로부터 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 추출한 분석시료를 장시간 안정된 상태로 보관할 수 있다. 그리고, 이 추출액을 분석시료로 함으로써, 정확하게 분석할 수 있다. 또한 이 때문에, 예를 들면 4℃로 온도를 제어한 오토 샘플러에 추출액을 분석시료로서 셋트함으로써 대량의 검체를 연속 자동처리할 수 있다.
또, 4℃라는 온도는, 생체시료를 검체로 할 때의 통상의 취급 온도이며, 이 온도에 생체시료를 유지함으로써, 다른 성분의 변질도 피할 수 있다. 이 온도를 크게 초과하는 온도에서 생체시료를 취급하면, 코엔자임Q-10의 2전자 환원체를 비롯한 성분의 변질을 피할 수 없고, 한편, 생체시료를 냉동 보관하면, 분석시에 생체시료를 해동하는 순서가 필요하게 되고, 또한 상기한 오토 샘플러 등을 사용한 연속 자동처리를 용이하게 실현할 수 없다.
따라서, 본 발명에서 말하는 4℃ 전후라는 온도는, 상기한 생체시료의 취급을 가능하게 하는 한, 4℃보다 높은 온도 및 4℃보다 낮은 온도 양쪽을 포함하는 의미이다. 즉, 추출액의 보관 온도는, 추출용의 수용성 유기용매의 융점 내지 상온의 범위이어도 좋다. 제1형태예에 있어서는, 추출용의 수용성 유기용매로서 이소프로필 알콜을 사용하므로, 보관 온도의 하한치는, 이소프로필 알콜의 융점인 -89.5℃로 된다.
다음에, 상기의 전처리를 실시하여, 소정시간 보관한 추출액을 분석시료로 해서, HPLC로 분석하는 방법에 대해서, 이하에 설명한다.
우선, 도6을 참조하고, 본 실시에 따른 분석방법에 사용하는 분석시스템에 대해서 설명한다. 본 실시에 따른 분석시스템(10)은, 송액기구(12)와, 전환기구(14)와, 농축 컬럼(16)과, 분리 컬럼(18)과, 환원 컬럼(20)과, 전기화학 검출기(22)와, 자외흡수 검출기(24)를 구비한다.
송액기구(12)는, 제1 및 제2계열로 구성되고, 각 계열은, 각각, 이동상의 저류용기(25a,25b)와, 저류용기(25a,25b)의 이동상을 송액하는 펌프(26a,26b)를 구비한다. 제1계열에는, 시료주입기(28)를 또한 구비한다.
제1계열의 저류용기(25a)에는, 이동상으로서, 과염소산 나트륨 50mM을 함유하는 메탄올과 물의 혼합용액(메탄올 95%수용액)을 저류한다. 한편, 제2계열의 저류용기(25b)에는, 이동상으로서, 과염소산 나트륨 50mM를 함유하는 메탄올과 이소프로필 알콜의 혼합 용액(메탄올 90%용액)을 저류한다.
펌프(26a,26b)는, 예를 들면 모두, 시세이도제의 이너트 펌프(3001)를 사용할 수 있다. 이 이너트 펌프(3001)는 펄스모터에 의한 정류량, 정압방식의 듀얼 피스톤 펌프이며, 유량이 1∼3000㎕/min, 토출 상한압력 35MPa이다.
제1계열에 설치되는 시료주입기(28)는, 제1계열의 이동상에 분석시료를 동반시키기 위한 것으로, 적당한 장치를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 오토 샘플러를 사용한다.
시료주입기(28)로서 오토 샘플러를 사용할 경우, 예를 들면 시세이도제의 오토 샘플러(3023)를 사용할 수 있다. 오토 샘플러(3023)는, 시료주입량 0.1∼400㎕(0.1㎕단위로 제어가능), 시료처리수 100∼200개이며, 전자냉각에 의해 4∼20℃의 범위내에서 온도를 제어할 수 있다.
전환기구(14)는, 송액기구(12)의 2개의 계열의 이동상의 송액경로를 전환하기 위한 것인다. 도6중, 화살표 A1의 모드(이하 모드 A1이라고 한다.)에 있어서, 제1계열의 이동상이 농축 컬럼(16)에 보내지고, 농축 컬럼(16)을 나온 코엔자임Q-10 등이 제거된 액이 배출된다.
한편, 제2계열의 이동상이 농축 컬럼(16)을 바이패스해서 분리 컬럼(18)에 직접 보내진다. 이것에 대해서, 화살표 A2의 모드(이하, 모드 A2이라고 한다.)에 있어서, 제1계열의 이동상이 계외로 배출되어서 농축 컬럼(16)으로의 송액이 정지됨과 아울러, 제2계열의 이동상이 농축 컬럼(16)에 보내져서, 농축된 분석시료를 동반한 액(제2이동상을 주체로 하는 액)이 농축 컬럼(16)으로부터 분리 컬럼(18)에 보내진다. 이것에 의해, 농축된 분석시료가 제2계열의 이동상에 동반해서 분리 컬럼(18)에 보내진다.
전환기구(14)는, 예를 들면 전환밸브로 구성되고, 이러한 전환밸브로서는, 예를 들면 시세이도제의 고압 전환 6방 밸브(3011)를 사용할 수 있다. 고압 전환 6방 밸브(3011)는 SUS 6포트 2포지션 밸브이며, 내압이 35MPa이다. 또, 이 전환기구(14)에서 이용되는 배관류를 비롯해서 분석시스템(10)에서 이용되는 배관류의 접속 관계는 도6으로부터 명확하며, 또한 배관재료에 대해서는, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 흡착을 막기 위해서, SUS를 사용한다.
농축 컬럼(16)은, 이미 설명한 바와 같이, 예를 들면 충전제의 흡착작용 등 을 이용하여 분석시료를 농축하기 위한 것이고, 예를 들면 스펠코사제의 LC-8을 사용할 수 있다.
분리 컬럼(18)은, 농축 컬럼(16)으로부터 송출된 액을 분리하기 위한 것으로, 예를 들면 스펠코사제의 LC-8을 사용할 수 있다.
환원 컬럼(20)은, 분리 컬럼으로부터 송출된 액을 환원하기 위한 것이며, 구체적으로는, 분석시료중의 코엔자임Q-10을 그 2전자 환원체로 변환하는 것을 목적으로 한 컬럼이다. 환원 컬럼(20)은, 예를 들면 시세이도제 SHISEIDO CQ를 사용할 수 있다.
전기화학 검출기(22)는, 전기화학적으로 고감도로 검출할 수 있는 코엔자임Q-10의 2전자 환원체를 분석하는 것을 목적으로 하는 것이며, 예를 들면 시세이도제의 전기화학 검출기(3005)를 사용할 수 있다. 전기화학 검출기(3005)는 3극 정전위방식이며, ±1990mV의 범위내에서 10mV 단위로 가전압을 디지털 설정할 수 있다.
자외흡수 검출기(24)는, 분석시료인 혈장에 함유되는 콜레스테롤 등의 자외선의 흡수감도가 높은 성분을 필요에 따라서 분석하기 위한 것이다. 자외흡수 검출기(22)는, 예를 들면 시세이도제의 UV-VIS 검출기(3002)를 사용할 수 있다. UV-VIS 검출기(3002)는 더블빔 싱글셀방식이며, 파장범위가 195∼700nm이다.
이상에서 설명한 본 실시에 따른 분석시스템(10)을 사용한 제1형태예에 따른 분석방법을 다음에 설명한다.
상기한 전처리후의 추출액을 분석시료로 해서 40㎕준비한다. 이 40㎕의 분석시료중에는, 2.0㎕의 인간의 혈장이 함유된다.
우선, 전환기구(14)를 모드 A2로 하고, 저류용기(25b)에 저류한 제2계열의 이동상(메탄올 90%용액)을 펌프(26b)로 농축 컬럼(16), 분리 컬럼(18)및 환원 컬럼(20)의 각 컬럼에 흘려보내어, 각 컬럼을 안정화시킨다. 이 때, 필요에 따라서 분리 컬럼(18) 및 환원 컬럼(20)에는, 모드 A1로 송액해도 좋다.
이 컬럼의 안정화 조작은, 기본적으로 1번 행하면 좋고, 그 후에 복수의 분석시료를 순차적으로 분석하는 경우에 있어서도 그 때마다 상기의 안정화 조작을 반복할 필요는 없다. 단, 컬럼 스위칭법에 있어서, 보다 안정된 상태에서 처리하는 것을 목적으로 하여, 전환기구(14)의 전환 전후를 통해서 제2계열의 이동상을 정상적으로 각 컬럼에 보내도 좋다.
계속해서, 저류용기(25a)에 저류한 제1계열의 이동상(메탄올 95%수용액)을 펌프(26a)로, 도중에 시료주입기(28)에 의해 상기의 분석시료를 동반시켜서 농축 컬럼(16)에 송액한다. 이 때의 유속은 400㎕/min이며, 펌프 토출압은 1MPa이다. 농축 컬럼(16)에서는 분석시료중의 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 등의 주요한 성분이 유지된다. 나머지의 액은, 계외로 배출된다.
계속해서, 상기의 주요한 성분이 유지된 농축 컬럼(16)에, 저류용기(25b)에 저류한 제2계열의 이동상(메탄올 90%용액)을 펌프(26b)로 농축 컬럼(16)에 송액한다. 이 때의 유속은 800㎕/min이며, 펌프 토출압은 10.1MPa이다.
또, 이들의 조작은, 상기한 바와 같이 전환기구(14)를 통해 행해진다.
여기에서, 시료주입기(28)로서 오토 샘플러를 이용하여, 4℃의 온도로 유지된 분석시료를 연속적으로 자동처리할 때는, 분리 컬럼(18) 이후의 컬럼에는, 농축된 분석시료를 보내지 않는 동안, 전환기구(14)를 통해 제2계열의 이동상을 상시 송액해 두면 보다 바람직하다. 이 때의 유속은 800㎕/min이며, 펌프 토출압은 7.6MPa이다.
이것에 의해, 주요한 성분이 농축된 분석시료를 동반한 액이, 분리 컬럼(18), 환원 컬럼(20)에 순차적으로 송액되어, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 주체(분석대상성분)로 하는 분석시료중의 주요한 성분의 분리가 행해지고, 또한, 코엔자임Q-10을 주(主)로 하는 피환원성 성분이 환원된다.
환원 컬럼(20)으로 처리된 액은, 전기화학 검출기(22) 및 자외흡수 검출기(24)에 순차적으로 보내어져 검출처리된다.
전기화학 검출기(22)에 의해 얻어지는, 검체로서 인간의 혈장을 사용한 크로마토그램의 일례를 도7에 나타낸다. 전기화학 검출기(22)의 설정 가전압은 600mV이다. 도7중 화살표(1a)가 코엔자임Q-10의 2전자 환원체(유비퀴놀)의 피크를 나타내고, 화살표2a가 코엔자임Q-10(유비퀴논)의 피크를 나타낸다.
계속해서, 제2형태예에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서의 전처리에 대해서 설명한다. 상기한 제1형태예와는 검체가 다를 뿐이기 때문에(제1형태예에서는 인간의 혈장), 제1형태예의 설명과 동일하게 도4를 이용해서 설명한다.
우선, 검체로서의 인간의 타액을 40㎕ 채취해서(도4중, S-1), 이것에 이소프로필 알콜을 950㎕ 첨가하여(도4중, S-2), 충분히 혼합시킨다. 계속해서, 40℃의 온도하, 12000rpm의 회전속도로 3분간, 원심기에 공급한다. 이것에 의해, 검체로부터 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체가 이소프로필 알콜상으로 추출된다(도4중 S-3).
그리고, 코엔자임Q-10 등을 추출한 추출액은, 4℃ 전후의 온도에서 보관된다(도4중, S-4). 본 제2형태예에 있어서도, 제1형태예와 마찬가지로, 보관중의 분석시료의 변질을 방지할 수 있다. 따라서, 본 실시에 따른 제2형태예에 의해서도, 검체로부터 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 추출한 분석시료로 장시간 안정된 상태에서 보관할 수 있다. 그리고, 이 추출액을 분석시료로 함으로써, 정확하게 분석할 수 있다. 또, 다른 조건 등에 대해서는, 앞서 설명한 제1형태예와 동일하므로, 그 설명은 생략한다.
이어서, 상기 전처리를 실시하고, 소정시간 보관한 추출액을 분석시료로 해서, HPLC로 분석하는 방법에 대해서 이하에 설명한다. 본 실시에 따른 제2형태예에 있어서의 분석방법도, 기본적으로는 상기한 제1형태예에 있어서의 분석방법과 동일하다. 이 때문에, 제2형태예에 있어서의 분석방법에 대해서는 간략적으로 설명하기로 한다. 또, 분석에 사용하는 HPLC 및 분석시스템은, 앞서 도6을 사용하여 설명한 것을 그대로 사용하기 때문에, HPLC 및 분석시스템의 설명은 생략하기로 한다.
상기한 전처리후의 추출액을 분석시료로서 40㎕ 준비한다. 이 40㎕의 분석시료중에는 2.0㎕의 인간의 타액이 함유된다.
우선, 전환기구(14)를 모드 A2로 해서, 저류용기(25b)에 저류한 제2계열의 이동상(메탄올 90%용액)을 펌프(26b)로 농축 컬럼(16), 분리 컬럼(18) 및 환원 컬럼(20)의 각 컬럼에 흘려보내고, 각 컬럼을 안정화시킨다. 이 때, 농축 컬럼(16)으로서는 지름 2.0mm×길이 35mm인 Capcel Pack C18 AQ S5(상품명)를 사용할 수 있다. 또한 분리 컬럼(18)으로서는 지름 2.0mm×길이 250mm인 Capcel Pack C18 AQ S5(상품명)를 사용할 수 있다. 또한, 환원 컬럼(20)으로서는 지름 2.0mm×길이 20mm인 SHISEIDO CQ(상품명)를 사용할 수 있다.
계속해서, 저류용기(25a)에 저류한 제1계열의 이동상(메탄올 95%수용액)을 펌프(26a)로, 도중에 시료주입기(28)에 의해 상기의 분석시료를 동반시켜서 농축 컬럼(16)에 송액한다. 이 때의 유속은, 예를 들면 200㎕/min이다. 농축 컬럼(16)에서는 분석시료중의 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 등의 주요한 성분이 유지된다. 나머지의 액은 계외로 배출된다.
이어서, 상기의 주요한 성분이 유지된 농축 컬럼(16)에, 저류용기(25b)에 저류한 제2계열의 이동상(메탄올 90%용액)을 펌프(26b)로 농축 컬럼(16)에 송액한다.
여기에서, 시료주입기(28)로서 오토 샘플러를 이용하여, 4℃의 온도로 유지된 분석시료를 연속적으로 분리 컬럼(18)에 공급한다. 이것에 의해, 주요한 성분이 농축된 분석시료를 동반한 액이, 분리 컬럼(18), 환원 컬럼(20)에 순차적으로 송액되어, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 주체(분석대상성분)로 하는 분석시료중의 주요한 성분의 분리가 행해지고, 또한, 코엔자임Q-10을 주로 하는 피환원성 성분이 환원된다. 이 때의 유속은, 예를 들면 400㎕/min이다. 환원 컬럼(20)에서 처리된 액은, 전기화학 검출기(22) 및 자외흡수 검출기(24)에 순차적으로 보내어져 검출처리된다.
전기화학 검출기(22)에 의해 얻어지는, 검체로서 인간의 타액을 사용한 크로마토그램의 일례를 도8에 나타낸다. 도8중, 화살표(3a)가 코엔자임Q-10의 피크를 나타내고 있다.
이상에서 설명한 제1 및 제2의 형태예에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법 및 분석시스템에 의하면, 검체로부터 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 추출한 추출액을 분석시료로 하고, 이 분석시료를 농축한 것을 분석하므로, 고감도로 정확하게 분석할 수 있다.
또한 제1 및 제2형태예에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법 및 분석시스템에 의하면, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 동시 분석하고, 또한 바람직하게는 대량의 검체를 연속적이며 자동적으로 처리하므로, 능률적으로 분석할 수 있다.
또한, 제2형태예에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법 및 분석시스템에 의하면, 검체로서 타액을 사용하고 있다. 타액의 채취는 혈액(혈장)의 채취와 달리 비침습이므로, 자기채취가능하며, 체내에 있어서의 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 양을 용이하게 검출하는 것이 가능하게 된다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 의하면, 전처리로서 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 적어도 어느 한쪽을 함유하는 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하므로, 정확하게 분석할 수 있다. 또한 검체를 채취한 후에 즉시 분석을 행할 필요가 없다.
또한 본 발명에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 의하면, 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하므로, 분석시료의 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 농도가 낮은 경우에 있어서도 정확하고 또한 고감도로 분석할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 의하면, 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하여 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하므로, 능률적으로 분석할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석시스템에 의하면, 분석시료를 제1이동상과 함께 송액하는 제1계열과 제2이동상만을 송액하는 제2계열로 이루어지는 송액기구와, 송액기구의 2개의 계열의 이동상의 송액경로를 전환하는 전환기구와, 제1계열의 이동상을 수용해서 분석시료를 농축한 후, 제2이동상을 수용하는 농축 컬럼과, 농축 컬럼으로부터 송출되는 액을 수용해서 분리하는 분리 컬럼과, 분리 컬럼으로부터 송출된 액을 수용해서 환원하는 환원 컬럼과, 환원 컬럼으로부터 송출된 액을 검출처리하는 전기화학 검출기를 갖기 때문에, 바람직하게 본 발명의 분석방법을 실현할 수 있다.
Claims (18)
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하고, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하고, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하고, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하고, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자환원 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하고, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하고, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 하고, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 검체에 함유되는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 정량하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 있어서,전처리로서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 중 한쪽이상을 함유하는 상기 검체를 이소프로필 알콜로 이루어지는 수용성 유기용매로 추출하고, 추출액을 분석시료로 해서 분석하고,또한, 상기 추출액을 분석할 때까지의 동안, 상기 추출액을 상기 추출액의 융점 내지 실온의 범위내의 온도에서 보관해 두고,또한, 상기 분석시료를 컬럼 스위칭법에 의해 농축하는 예비처리를 행하고,또한, 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체 양쪽을 함유하는 검체로부터의 추출액을 분석시료로 해서 상기 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체를 컬럼 분리하고, 또한 환원처리한 후, 검출기에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법.
- 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 사용하는 분석시스템으로서,분석시료를 제1이동상과 함께 송액하는 제1계열과 제2이동상만을 송액하는 제2계열로 이루어지는송액기구;상기 송액기구의 2개의 계열의 이동상의 송액경로를 전환하는 전환기구;상기 제1계열의 이동상을 수용해서 상기 분석시료를 농축한 후, 상기 제2이동상을 수용하는 농축 컬럼;상기 농축 컬럼으로부터 송출되는 액을 수용해서 분리하는 분리 컬럼;상기 분리 컬럼으로부터 송출된 액을 수용해서 환원하는 환원 컬럼; 및상기 환원 컬럼으로부터 송출된 액을 검출처리하는 전기화학 검출기를 갖는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석시스템.
- 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석방법에 사용하는 분석시스템으로서,분석시료를 제1이동상과 함께 송액하는 제1계열과 제2이동상만을 송액하는 제2계열로 이루어지는 송액기구;상기 송액기구의 2개의 계열의 이동상의 송액경로를 전환하는 전환기구;상기 제1계열의 이동상을 수용해서 상기 분석시료를 농축한 후, 상기 제2이동상을 수용하는 농축 컬럼;상기 농축 컬럼으로부터 송출되는 액을 수용해서 분리하는 분리 컬럼;상기 분리 컬럼으로부터 송출된 액을 수용해서 환원하는 환원 컬럼; 및상기 환원 컬럼으로부터 송출된 액을 검출처리하는 전기화학 검출기를 갖고,검출기로서 또한 자외흡수 검출기를 갖는 것을 특징으로 하는 코엔자임Q-10 및 그 2전자 환원체의 분석시스템.
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