KR20050078712A

KR20050078712A - 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는 항혈전제

Info

Publication number: KR20050078712A
Application number: KR1020040006485A
Authority: KR
Inventors: 박종범; 이덕근; 윤여표
Original assignee: 삼아약품 주식회사
Priority date: 2004-01-31
Filing date: 2004-01-31
Publication date: 2005-08-08
Also published as: KR100531947B1

Abstract

본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨 및 에피카테킨 갈레이트를 포함하며, 혈전형성 억제활성을 가지는 녹차 카테킨 조성물을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항혈전제에 관한 것이다. 본 발명의 녹차카테킨 조성물은 70 내지 97%의 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 1.5 내지 15%의 에피카테킨 갈레이트(ECG) 및 1.5 내지 15%의 에피갈로카테킨(EGC)을 포함한다. 본 발명의 녹차카테킨 조성물은 항혈전 효과를 나타내면서도, 정상적으로 발생되는 응혈현상을 크게 저해하지 않으므로, 보다 안전한 항혈전 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는 항혈전제{Antithrombotic Agent Comprising Green Tea Catechins as Active Ingredient}

본 발명은 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는 항혈전제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨 및 에피카테킨 갈레이트를 포함하며, 혈전형성 억제활성을 가지는 녹차 카테킨 조성물을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항혈전제에 관한 것이다.

정상 환경하에서, 혈관내부에 존재하는 혈관 내피세포가 손상되어 출혈되는 경우에는, 가용성 피브리노겐이 불용성 피브린으로 전환되어, 혈소판과 함게 국소 응혈 또는 혈전을 형성시키는 일련의 응고반응이 수행되어 지혈된다. 지혈 후, 상처가 회복되면, 응혈 또는 혈전이 제거되어 혈류의 흐름이 신속하게 회복된다.

이러한 응혈 또는 혈전의 형성은 손상 부위에서의 혈액 손실을 방지하기 위하여 필요한 기작이지만, 응혈 또는 혈전이 정맥 또는 동맥에서 부적절하게 발생할 경우에는, 심근 경색, 불안정형 협심증, 심방세동, 뇌졸중, 신장애, 경피 경관 관상동맥 혈관형성, 파종성 혈관내 응고, 패혈증, 폐 색전증, 심정맥 혈전증 등의 심각한 손상을 초래할 수도 있다. 또한, 환자에게 인공적으로 이식된 이식물에서 응혈 또는 혈전이 발생할 경우에는, 환자의 증세를 악화시킬 수도 있다.

이처럼 부적절하게 발생되는 혈전을 치료하기 위하여, 다양한 종류의 혈전치료제가 개발되었으며, 몇 종류의 혈전치료제는 임상적으로 사용되고 있다. 가장 일반적으로 사용되는 혈전치료제는 황산염화 헤테로폴리사카라이드 헤파린, 저분자량(LMW) 헤파린 등의 헤파린 유도체로서, 트롬빈 억제제인 항트롬빈 Ⅲ을 활성화 시키고, 대부분의 응혈인자를 불활성화시켜서, 부적절한 응혈 또는 혈전을 신속하게 치료할 수 있다. 그러나, 이러한 헤파린 유도체는 정상적으로 발생되는 응혈현상까지도 억제한다는 단점이 지적되었다.

이러한 헤파린 유도체의 단점을 극복하기 위하여 개발된 혈전치료제로서 쿠마린 유도체인 와르파린(warfarin)이 개발되었는데, 이는 프로트롬빈 및 다른 비타민 K 의존적 응혈인자와 경쟁적으로 작용하여, 부적절한 응혈의 형성을 억제하므로, 헤파린의 부작용을 감소시킬 수 있었으나, 필요량을 초과하여 투여할 경우에는 정상적으로 발생되는 응혈현상을 억제하여, 이를 개선하려는 노력이 계속되고 있다.

녹차는 차나무(Theae sinensis L., Theaceae)의 잎을 말린 것으로서, 녹차엽에 존재하는 성분으로는 녹차탄닌류, 카페인, 아스코르빈산, 토코페롤류, 훌라보놀류, 다당류 및 베타카로텐 등이 있으며, 이중에서 카페인, 아스코르빈산 및 녹차탄닌류 등이 주류를 이룬다. 이 중, 카페인 및 아스코르빈산은 다른 식물 유래의 차에도 포함되어 있으나, 카테킨류로 대표되는 녹차탄닌류는 녹차에서만 찾아볼 수 있는 고유의 성분으로서, 에피카테킨(epicatechin: EC), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate: ECG), 에피갈로카테킨(epigallocatechin: EGC), 및 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate : EGCG)의 4종류를 주성분으로 함유한다. 이러한 녹차카테킨은 혈압강하작용(참조: Hara Y. et al., Nippon nogeikagaku kaishi, 61:803, 1987), 암 예방작용(참조: Xu Y. et al., Cancer Res., 52:3875, 1992), 충치예방(참조: Otake S. et al., Cancer Res., 25:438, 1991), 혈소판응집저해활성(참조: Sagesaka-mitane Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 38:790, 1990), 혈당강하작용(참조: Natsuki Matsumoto et al., Biosci. Biotech. Biochem., 57:525, 1993) 등의 다양한 생리활성에 관여함이 보고되었다.

아울러, 몇몇의 연구자들은 녹차로부터 혈소판응집억제능을 지닌 약리성분을 추출하였다. 예를 들면, 왕(Wang) 등은 녹차로부터 추출한 다당류가 실험실적 및 생체내 조건에서 혈전용해의 효과를 가지는 보고하고 있으며(참조 : Wang Shuru et al., Zhoogcaoyao, 23(5), 254-256, 1992), 센(Shen) 등은 녹차로부터 추출한 폴리페놀이 실험실적 조건에서 혈전의 형성을 감소시키는 것을 보고하고 있다(참조 : Shen Xinnan et al., Yingyang Xuebao, 15(2) : 147-151(1993)). 또한, 일본 특허공개 평2-184626호에는 녹차로부터 수득한 30% ECG 및 70% EGCG를 함유하는 차카테킨류 분획을 유효성분으로 하는 혈소판 응집 억제제가 개시되어 있고, 대한민국 특허 제 125847호에는 폴리페놀류 25 내지 30%, 에피갈로카테킨 갈레이트 40 내지 70% 및 에피카테킨 및 에피갈로카테킨의 조성물 0 내지 35%로 구성된 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전제가 개시되어 있다. 그러나, 이들 녹차추출물은 녹차로부터 각 카테킨성분을 개별적으로 정제한 것이 아니라, 카테킨을 다량으로 포함하는 분획을 추출한 것이므로, 항혈전효과를 나타내는 구체적인 유효 카테킨 성분을 제시하지 못하고 있으며, 정상적인 응혈작용에 대한 결과가 없어, 종래사용되던 항혈전제의 단점을 개선할 수 있는 항혈전제로서 사용할 수 없다는 단점이 있다.

따라서, 항혈전 효과를 나타내면서도, 정상적인 응혈작용을 저해하지 않는 물질을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 항혈전 효과를 나타내면서도, 정상적인 응혈작용을 저해하지 않는 물질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 녹차카테킨의 성분인 다량의 에피갈로카테킨 갈레이트와 소량의 에피카테킨 갈레이트 및 에피갈로카테킨을 포함하는 녹차카테킨 조성물이 항혈전효과를 나타내면서도, 정상적인 응혈작용을 크게 저해하지 않음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 녹차카테킨을 유효성분으로 포함하고, 항혈전 효과를 나타내면서도, 정상적인 응혈작용을 저해하지 않는 개선된 항혈전제를 제공하는 것이다.

본 발명의 항혈전제는 70 내지 97%의 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 1.5 내지 15%의 에피카테킨 갈레이트(ECG) 및 1.5 내지 15%의 에피갈로카테킨(EGC)을 포함하며, 혈전형성 억제활성을 가지는 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명자들은 녹차추출물에서 추출된 녹차카테킨의 각 성분인 에피카테킨(EC), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨(EGC) 및 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)의 항혈전효과를 개별적으로 측정한 결과, EGCG가 주된 항혈전효과를 나타냄을 확인하였다. 그러나, EGCG를 단독으로 처리할 경우에는 정상적으로 발생되는 응혈현상까지도 억제됨을 알게 되어, 이러한 단점을 극복하고자 EGCG와 다른 녹차카테킨을 혼합하여, 항혈전효과를 나타내면서도, 정상적으로 발생되는 응혈현상이 억제되지 않는 조성물을 개발하고자 하였다. 그 결과, EGCG, EGC 및 ECG의 일정한 성분비로 포함하는 녹차카테킨 조성물을 사용할 경우, 항혈전효과를 나타내면서도, 정상적으로 발생되는 응혈현상을 크게 저해하지 않음을 알 수 있었다.

한편, 본 발명의 항혈전제의 유효성분으로 함유되는 녹차카테킨 조성물은 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제와 같은 약학적 제제로 제조될 수 있다.

녹차카테킨 조성물의 급성독성실험

6 내지 7주령 된 비설치류 비글견(beagle)을 대상으로 본 발명의 녹차카테킨 조성물을 경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 5g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 녹차카테킨 조성물은 kg당 5g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 항혈전제로서 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.

유효량

본 발명에 있어서 항혈전제 유효성분인 녹차카테킨 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 6 내지 30㎎을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 녹차카테킨의 항혈전효과 측정

녹차카테킨의 주성분인 EC, EGC, ECG 및 EGCG의 항혈전효과를 알아보기 위하여, Aggrecorder II Pa-3220(Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd., 일본)를 사용하여, 각 성분의 혈소판 응집억제효과를 측정하였다.

먼저, 혈소판 기능이 정상인 건강한 사람으로부터 항 응고제로 3.8% 소디움 시트레이트 튜브에 1:9의 비율로 채혈한 후, 160 ×g에서 10분간 원심분리하고, 상등액인 약 2 x 10⁵ - 2 x 10⁵/㎣의 혈소판을 갖는 혈소판풍부혈장(platelets rich plasma, PRP)를 수득하고, 전기 PRP의 일부를 2,000 ×g에서 10분동안 추가로 원심분리하여, 상등액인 혈소판결여혈장(platelets poor plasma, PPP)을 수득하였다.

이어, Aggrecorder II Pa-3220(37℃, 1,000rpm)에 1㎖ PRP와, 각각의 EC, EGC, ECG 및 EGCG(10㎎/㎖) 100㎕의 조성물을 넣고, 5분간 방치한 다음, 혈소판 응집 촉진물질(ADP, 에피네프린(epinephrine), 콜라겐, 리스토세틴(ristocetin))을 가한 후, 10분간 반응시켜서, 응집정도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 녹차카테킨 및 혈소판 응집 촉진물질이 처리되지 않은 PPP를 사용하고, 응집정도는 대조군의 응집정도에 대한 각 실험군의 응집정도의 비율로 표시하였다(참조: 표 1).

각 녹차카테킨 성분의 항혈전 효과

녹차카테킨	혈소판 응집 촉진물질에 의한 혈전유발율(%)
녹차카테킨	ADP	에피네프린	콜라겐	리스토세틴
EC	97.7	98.0	98.7	98.1
EGC	96.7	92.4	96.0	97.8
ECG	99.1	93.5	94.4	94.2
EGCG	50	13.5	74.7	73.5

상기 표 1에서 보듯이, 각 녹차카테킨 성분중에서, EGCG만이 혈소판 응집반응을 유의하게 억제함을 알 수 있었다.

실시예 2: EGCG의 투여량에 따른 항혈전 효과의 변화

상기 실시예 1에서 보듯이, 각 녹차카테킨 성분중에서 EGCG만이 실험실 조건에서 혈소판 응집을 억제하였으므로, 생체내 조건에서도 동일한 정도의 항혈전효과를 나타내는지를 EGCG의 처리농도별로 측정하였다.

먼저, 체중 약 40g 정도의 숫컷 ICR 마우스에 각각 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 400㎕를 복강에 투여(체중(g)당 투여량: 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 및 200㎍)하고, 2시간 동안 방치한 다음, 200㎕의 혈소판 응집 촉진용액(생리식염수 100㎕당 15㎍ 콜라겐 및 400μM 에피네프린)을 마우스의 꼬리정맥에 주사하고, 10시간이 경과한 후, 치사되거나 또는 마우스 뒷다리가 마비된 마우스를 계수하여, EGCG의 항혈전 효과를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 대한민국 특허 제 125845호에 개시된 녹차추출물이 10㎎/㎖의 농도로 용해된 생리식염수용액 400㎕를 복강에 투여한 실험군을 사용하고, 뒷다리가 마비된 마우스의 판정은 15분 이상 뒷다리의 기능을 상실하거나 떨림 상태가 지속될 때를 기준으로 하였다(참조: 표 2).

EGCG의 투여량에 따른 항혈전 효과의 변화

	체중(g)당 EGCG의 투여량(㎍/g)	혈전유발율(%)
대조군	-	56
실험군	0	95
	20	90
	40	85
	60	78
	80	71
	100	64
	120	55
	140	47
	160	41
	180	32
	200	25

상기 표 2에서 보듯이, EGCG의 투여량이 증가할 수록 항혈전 효과가 증대됨을 알 수 있었고, 마우스 체중(g)당 120㎍이상으로 투여할 경우에는, 대조군과 동등하거나 우수한 항혈전 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3: EGCG의 투여량에 따른 지혈시간의 변화

체중 약 200g 정도의 숫컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트에 각각 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 2㎖를 복강에 하루에 한번씩 10일간 투여(체중(g)당 투여량: 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 및 200㎍)하고, 각 실험군에 소디움 펜토바르비탈(sodium pentobarbital: 400mg/㎏)을 복강내 투여하여 마취시킨 후, 꼬리 끝부분에서 5mm 되는 곳을 잘라 꼬리의 5cm 되는 곳까지 37.5℃의 식염수용액에 담구어 지혈될 때까지의 시간을 측정하였다(참조: 표 3).

EGCG의 투여량에 따른 지혈시간의 변화

체중(g)당 EGCG의 투여량(㎍/g)	지혈시간(초)
0	65.0 ±12.9
20	113.2 ±19.6
40	163.8 ±30.4
60	242.3 ±64.2
80	351.0 ±87.6
100	410.7 ±117.3
120	524.8 ±150.4
140	618.7 ±179.8
160	697.6 ±197.1
180	781.0 ±213.7
200	826.7 ±248.2

상기 표 3에서 보듯이, EGCG의 투여량이 증가함에 따라 지혈에 소요되는 시간이 증가함을 알 수 있었다. 이로부터, EGCG의 과량투여는 생체내에서 정상적인 응혈작용을 저해함을 알 수 있었다.

실시예 4: 녹차카테킨 조성물 투여시 지혈시간의 측정

과량의 EGCG를 투여할 경우, 정상적인 응혈작용을 억제한다는 단점을 극복하기 위하여, EGCG에 다른 녹차카테킨인 EC, EGC 및 ECG를 조합하여, 상기 EGCG의 단점을 극복하고자 하였다.

먼저, 생리식염수용액 2㎖(음성대조군), 10㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 2㎖(양성대조군, EGCG 20㎎), 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 1㎖과 10㎎/㎖의 EC 생리식염수용액 1㎖의 조성물의 조성물(실험군 1, EGCG 20㎎, EC 10㎎), 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 1㎖과 10㎎/㎖의 EGC 생리식염수용액 1㎖의 조성물(실험군 2, EGCG 20㎎, EGC 10㎎), 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 1㎖과 10㎎/㎖의 ECG 생리식염수용액 1㎖의 조성물(실험군 3, EGCG 20㎎, ECG 10㎎), 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 1㎖, 20㎎/㎖의 EGC 생리식염수용액 0.5㎖ 및 20㎎/㎖의 ECG 생리식염수용액 0.5㎖의 조성물(실험군 4, EGCG 20㎎, EGC 10㎎, ECG 10㎎), 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 1㎖, 20㎎/㎖의 EC 생리식염수용액 0.5㎖ 및 20㎎/㎖의 ECG 생리식염수용액 0.5㎖의 조성물(실험군 5, EGCG 20㎎, EC 10㎎, ECG 10㎎), 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 1㎖, 20㎎/㎖의 EC 생리식염수용액 0.5㎖ 및 20㎎/㎖의 EGC 생리식염수용액 0.5㎖의 조성물(실험군 6, EGCG 20㎎, EGC 10㎎, EC 10㎎), 20㎎/㎖의 EGCG 생리식염수용액 1㎖, 40㎎/㎖의 EGC 생리식염수용액 0.25㎖, 40㎎/㎖의 ECG 생리식염수용액 0.25㎖ 및 20㎎/㎖의 EC 생리식염수용액 0.5㎖의 조성물(실험군 7, EGCG 20㎎, EGC 10㎎, ECG 10㎎, EC 10㎎)의 시료를 각각 준비하였다. 이어, 상기 준비된 시료를 마우스에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 지혈에 소요된 시간을 측정하였다(참조: 표 4).

각 녹차카테킨 조성물의 지혈시간

실험군	지혈시간(초)
음성대조군	65.0 ±12.9
양성대조군	410.7 ±117.3
1	398.7 ±96.7
2	406.4 ±104.2
3	395.7 ±87.6
4	234.2 ±77.3
5	367.9 ±91.4
6	375.3 ±89.8
7	256.4 ±97.1

상기 표 4에서 보듯이, EGCG만을 투여한 경우(양성대조군)보다 EGCG에 다른 녹차카테킨을 혼합하여 투여할 경우, 대부분 지혈시간이 단축되었고, 특히 EGC와 ECG를 혼합하여 투여한 경우(실험군 4 및 실험군 7)에는 지혈시간이 현저히 단축됨을 알 수 있었다.

실시예 5: 녹차카테킨 조성물의 성분비 결정

항혈전 효과를 나타내면서도 지혈에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있는 녹차카테킨 조성물의 성분인 EGCG, EGC 및 ECG의 성분비를 결정하기 위하여, 각 성분비로 혼합된 녹차카테킨 조성물의 체내에서 항혈전 효과와 지혈에 소요되는 시간을 측정하였다.

실시예 5-1: 체내에서의 항혈전 효과 측정

먼저, EGC 4㎎ 및 ECG 4㎎의 조성물(음성대조군), EGCG 0.8㎎, EGC 3.6㎎ 및 ECG 3.6㎎의 조성물(실험군 1), EGCG 1.6㎎, EGC 3.2㎎ 및 ECG 3.2㎎의 조성물(실험군 2), EGCG 2.4㎎, EGC 2.8㎎ 및 ECG 2.8㎎의 조성물(실험군 3), EGCG 3.2㎎, EGC 2.4㎎ 및 ECG 2.4㎎의 조성물(실험군 4), EGCG 4㎎, EGC 2㎎ 및 ECG 2㎎의 조성물(실험군 5), EGCG 4.8㎎, EGC 1.6㎎ 및 ECG 1.6㎎의 조성물(실험군 6), EGCG 5.6㎎, EGC 1.2㎎ 및 ECG 1.2㎎의 조성물(실험군 7), EGCG 6.4㎎, EGC 0.8㎎ 및 ECG 0.8㎎의 조성물(실험군 8), EGCG 7.2㎎, EGC 0.4㎎ 및 ECG 0.4㎎의 조성물(실험군 9) 및 EGCG 8㎎(양성대조군)을 각각 준비하고, 0.4㎖의 생리식염수에 용해시켜 각각의 시료를 준비하였다. 이어, 전기 준비된 각각의 시료를 마우스의 복강에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법으로 체내에서의 항혈전 효과를 측정하였다(참조: 표 5).

각 녹차카테킨 조성물의 성분비에 따른 항혈전 효과의 변화

실험군	EGCG 함량(%)	ECG 함량(%)	EGC 함량(%)	혈전유발율(%)
음성대조군	0	50	50	95
1	10	45	45	91
2	20	40	40	83
3	30	35	35	76
4	40	30	30	73
5	50	25	25	67
6	60	20	20	63
7	70	15	15	40
8	80	10	10	30
9	90	5	5	26
양성대조군	100	0	0	25

상기 표 5에서 보듯이, EGCG의 함량이 증가할 수록 혈전유발율이 저하되고, 특히, EGCG의 함량이 70% 이상인 경우에는 혈전유발율이 현저히 저하되며, EGC 및 ECG는 별다른 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다. 상기 표에서 100% EGCG를 포함하는 양성대조군과 90% EGCG를 포함하는 실험군 9는 혈전유발율이 거의 유사함을 알 수 있었는데, 이는 실험군 9에 포함된 ECG 및 EGC의 작용에 의한 것으로 유추되었다.

실시예 5-2: 지혈시간의 측정

먼저, EGC 20㎎ 및 ECG 20㎎의 조성물(음성대조군), EGCG 4㎎, EGC 18㎎ 및 ECG 18㎎의 조성물(실험군 1), EGCG 8㎎, EGC 16㎎ 및 ECG 16㎎의 조성물(실험군 2), EGCG 12㎎, EGC 14㎎ 및 ECG 14㎎의 조성물(실험군 3), EGCG 16㎎, EGC 12㎎ 및 ECG 12㎎의 조성물(실험군 4), EGCG 20㎎, EGC 10㎎ 및 ECG 10㎎의 조성물(실험군 5), EGCG 24㎎, EGC 8㎎ 및 ECG 8㎎의 조성물(실험군 6), EGCG 28㎎, EGC 6㎎ 및 ECG 6㎎의 조성물(실험군 7), EGCG 32㎎, EGC 4㎎ 및 ECG 4㎎의 조성물(실험군 8), EGCG 36㎎, EGC 2㎎ 및 ECG 2㎎의 조성물(실험군 9) 및 EGCG 40㎎(양성대조군)을 각각 준비하고, 2㎖의 생리식염수에 용해시켜 각각의 시료를 준비하였다. 이어, 상기 준비된 시료를 마우스에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 지혈에 소요된 시간을 측정하고, 각 실험군 간의 지혈시간증가율을 측정하였다(참조: 표 6). 이때, 지혈시간 증가율(%)은 음성대조군의 지혈시간을 기준으로 하여, EGCG 함량의 증가에 따른 지혈시간 증가율을 계산하여 측정하였다.

각 녹차카테킨 조성물의 성분비에 따른 지혈시간의 변화

실험군	EGCG함량(%)	ECG함량(%)	EGC함량(%)	지혈시간(초)	시간증가율(%)
음성대조군	0	50	50	80.0 ±12.9	-
1	10	45	45	101.6 ±19.6	127
2	20	40	40	129.1 ±30.4	161
3	30	35	35	165.2 ±48.2	206
4	40	30	30	214.7 ±61.6	268
5	50	25	25	279.6 ±67.3	349
6	60	20	20	355.1 ±70.4	443
7	70	15	15	419.0 ±99.8	523
8	80	10	10	498.6 ±117.1	622
9	90	5	5	583.3 ±141.8	729
양성대조군	100	0	0	826.7 ±248.2	1033

상기 표 6에서 보듯이, EGCG의 함량이 증가할 수록 지혈에 소요되는 시간이 증가되지만, EGCG만을 투여한 전기 표 3의 결과와 비교하면, 지혈시간이 전체적으로 단축되고, 특히 90%의 함량으로 EGCG를 투여하여도 마우스가 치사되지 않음을 알 수 있었다. 아울러, 지혈시간의 증가율을 각 실험군 별로 비교해보면, 70% 이상의 함량으로 EGCG가 투여될 경우에 지혈시간의 증가율이 크게 감소하였으며, 이는 EGC 및 ECG의 영향인 것으로 예측되었다. 그러나, EGC 및 ECG의 함량은 지혈에 소요된 시간의 단축에 별다른 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다.

상기 실시예 5-1 내지 5-2의 결과를 종합하면, EGCG의 함량이 70% 이상인 경우가 바람직한 것으로 판단되고, EGC 및 ECG는 필수적으로 첨가되어야만 함을 알 수 있었으나, 이들의 함량은 항혈전 효과 및 지혈시간의 단축에 큰 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다.

실시예 5-3: EGCG 상한선의 결정

상기 실시예 5-1 내지 5-2에서는 EGCG의 함량이 70% 이상인 녹차카테킨 조성물을 투여하는 경우가, 항혈전 효과 및 지혈시간 단축에 바람직함을 나타내고 있으나, EGCG의 최대 함량에 대하여는 불명료하므로, 이를 명확히하고자 하였다.

먼저, EGC 4㎎ 및 ECG 4㎎의 조성물(음성대조군), EGCG 7.20㎎, EGC 0.40㎎ 및 ECG 0.40㎎의 조성물(실험군 1) EGCG 7.28㎎, EGC 0.36㎎ 및 ECG 0.36㎎의 조성물(실험군 2) EGCG 7.36㎎, EGC 0.32㎎ 및 ECG 0.32㎎의 조성물(실험군 3) EGCG 7.44㎎, EGC 0.28㎎ 및 ECG 0.28㎎의 조성물(실험군 4) EGCG 7.52㎎, EGC 0.24㎎ 및 ECG 0.24㎎의 조성물(실험군 5) EGCG 7.60㎎, EGC 0.20㎎ 및 ECG 0.20㎎의 조성물(실험군 6) EGCG 7.68㎎, EGC 0.16㎎ 및 ECG 0.16㎎의 조성물(실험군 7) EGCG 7.76㎎, EGC 0.12㎎ 및 ECG 0.12㎎의 조성물(실험군 8) EGCG 7.84㎎, EGC 0.08㎎ 및 ECG 0.08㎎의 조성물(실험군 9) EGCG 7.92㎎, EGC 0.04㎎ 및 ECG 0.04㎎의 조성물(실험군 10) 및 EGCG 8㎎(양성대조군)을 각각 준비하고, 0.4㎖의 생리식염수에 용해시켜 각각의 시료를 준비하였다. 이어, 전기 준비된 각각의 시료를 마우스의 복강에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법으로 체내에서의 항혈전 효과를 측정하였다(참조: 표 7).

각 녹차카테킨 조성물에 있어서의 EGCG의 함량에 따른 항혈전 효과의 변화

실험군	EGCG 함량(%)	혈전유발율(%)
음성대조군	0	95
1	90	26
2	91	25
3	92	24
4	93	27
5	94	26
6	95	23
7	96	25
8	97	24
9	98	26
10	99	25
양성대조군	100	25

상기 표 7에서 보듯이, EGCG의 함량이 90% 이상인 경우에는 혈전유발율에 별다른 변동이 없었으므로, EGCG의 함량이 90% 이상인 경우에는 항혈전 효과에 차이가 없는 것으로 판단되었다.

또한, EGC 20㎎ 및 ECG 20㎎의 조성물(음성대조군), EGCG 36.0㎎, EGC 2.0㎎ 및 ECG 2.0㎎의 조성물(실험군 1), EGCG 36.4㎎, EGC 1.8㎎ 및 ECG 1.8㎎의 조성물(실험군 2), EGCG 36.8㎎, EGC 1.6㎎ 및 ECG 1.6㎎의 조성물(실험군 3), EGCG 37.2㎎, EGC 1.4㎎ 및 ECG 1.4㎎의 조성물(실험군 4), EGCG 37.6㎎, EGC 1.2㎎ 및 ECG 1.2㎎의 조성물(실험군 5), EGCG 38.0㎎, EGC 1.0㎎ 및 ECG 1.0㎎의 조성물(실험군 6), EGCG 38.4㎎, EGC 0.8㎎ 및 ECG 0.8㎎의 조성물(실험군 7), EGCG 38.8㎎, EGC 0.6㎎ 및 ECG 0.6㎎의 조성물(실험군 8), EGCG 39.2㎎, EGC 0.4㎎ 및 ECG 0.4㎎의 조성물(실험군 9), EGCG 39.6㎎, EGC 0.2㎎ 및 ECG 0.2㎎의 조성물(실험군 10) 및 EGCG 40㎎(양성대조군)을 각각 준비하고, 2㎖의 생리식염수에 용해시켜 각각의 시료를 준비하였다. 이어, 상기 준비된 시료를 마우스에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 3 및 실시예 5-2와 동일한 방법으로 지혈에 소요된 시간 및 지혈시간 증가율을 측정하였다(참조:표 8).

각 녹차카테킨 조성물에 있어서의 GCG의 함량에 따른 지혈시간의 변화

실험군	EGCG 함량(%)	지혈시간(초)	지혈시간 증가율(%)
음성대조군	0	80.0 ±12.9	-
1	90	583.3 ±141.8	729
2	91	587.4 ±138.4	734
3	92	589.7 ±148.2	737
4	93	590.8 ±137.6	738
5	94	591.3 ±135.3	739
6	95	592.8 ±137.0	741
7	96	594.1 ±138.5	742
8	97	595.4 ±141.0	744
9	98	687.6 ±191.7	859
10	99	741.9 ±210.6	927
양성대조군	100	826.7 ±248.2	1033

상기 표 8에서 보듯이, EGCG의 함량이 90 내지 97%인 경우보다, 98 내지 100%인 경우에는, 지혈시간이 현저하게 증가됨을 알 수 있었다.

상기 표 6 내지 표 8의 결과를 종합하면, 본 발명의 녹차카테킨 조성물에 함유된 EGCG의 함량은 70 내지 97%가 바람직함을 알 수 있고, ECG 및 EGC의 함량은 각각 1.5 내지 15%가 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 6: 항혈전제의 제제화

본 발명의 녹차카테킨 조성물은 통상의 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제 등과 같은 보조제와 혼합하여 다음과 같은 약학적 제제로 제조하였다.

실시예 6-1: 정제의 제조

녹차카테킨 조성물 10mg, 유당 20mg, 전분 20mg 및 스테아린산 마그네슘 적당량을 통상의 정제 제조방법에 따라서 50mg의 정제로 타정하여, 정제형의 항혈전제를 제조하였다.

실시예 6-2: 캅셀제의 제조

녹차카테킨 조성물 10mg, 유당 20mg, 전분 19mg, 탈크 1mg 및 스테아린산 마그네슘 적당량을 통상 캅셀제의 제조방법에 따라서 50mg 용량의 캅셀에 충진하여, 캅셀제형의 항혈전제를 제조하였다.

실시예 6-3: 액제의 제조

녹차카테킨 조성물 100mg, 이성화당 10g, 벌꿀 500mg, 니코틴산아마이드(약전) 20mg, 무수카페인(약전) 30mg 및 안식향산나트륨 70mg을 통상의 액제 제조방법에 따라서 제조하고, 100ml 용량의 갈색병에 충진한 다음, 밀전하여 저온 살균처리함으로써, 액제형의 항혈전제를 제조하였다.

실시예 6-4: 주사제의 제조

녹차카테킨 조성물 6mg 및 멸균정제수 적당량을 통상의 주사제 제조방법에 따라서 제조하고, 2ml의 앰플에 충진시킨 다음, 밀봉 및 멸균하여, 주사제형의 항혈전제를 제조하였다.

실시예 6-5: 연질캅셀의 제조

젤라틴 52체중%, 글리세린 32체중%, ANIDRISORB 35/7012체중% 및 물 5체중%를 사용하여 작제된 외피조성물에, 녹차카테킨 조성물 10mg, 폴리에틸렌글리콜 230mg 및 글리세린 13mg을 넣고, 통상의 연질캅셀 제조방법에 따라서, 연질캅셀제형의 항혈전제를 제조하였다.

실시예 6-6: 과립제의 제조

녹차카테킨 조성물 10mg 및 유당25mg을 통상의 압출조립기로 압출시켜서, 과립제형의 항혈전제를 제조하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨 및 에피카테킨 갈레이트를 포함하며, 혈전형성 억제활성을 가지는 녹차 카테킨 조성물을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항혈전제를 제공한다. 본 발명의 녹차카테킨 조성물은 70 내지 97%의 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 1.5 내지 15%의 에피카테킨 갈레이트(ECG) 및 1.5 내지 15%의 에피갈로카테킨(EGC)을 포함한다. 본 발명의 녹차카테킨 조성물은 항혈전 효과를 나타내면서도, 정상적으로 발생되는 응혈현상을 크게 저해하지 않으므로, 보다 안전한 항혈전 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

70 내지 97%의 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 1.5 내지 15%의 에피카테킨 갈레이트(ECG) 및 1.5 내지 15%의 에피갈로카테킨(EGC)을 포함하며, 혈전형성 억제활성을 가지는 녹차카테킨 조성물.
제 1항의 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항혈전제.
제 1항의 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 하는, 캅셀제형의 항혈전제.
제 1항의 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는, 액제형의 항혈전제.
제 1항의 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는, 주사제형의 항혈전제.
제 1항의 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는, 연질캅셀제형의 항혈전제.
제 1항의 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는, 과립제형의 항혈전제.
제 1항의 녹차카테킨 조성물을 유효성분으로 포함하는, 정제형의 항혈전제.