KR20050059158A

KR20050059158A - 신규 뎁시펩타이드 화합물

Info

Publication number: KR20050059158A
Application number: KR1020057003351A
Authority: KR
Inventors: 고지 나가이; 마사토시 다니구치; 노부아키 신도; 요 데라다; 마사미치 모리; 노부아키 아미노; 겐이치 스즈무라; 이사오 다카하시; 미쓰오 아마세
Original assignee: 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-08-28
Publication date: 2005-06-17
Also published as: JP3987909B2; EP1548026A1; WO2004020460A1; EP1548026A4; US20050209134A1; AU2003261801A1; JPWO2004020460A1; CA2497281A1; CN1281618C; US7098186B2; CN1678627A

Abstract

본 발명은 HDAC가 관여하는 질환, 특히 종양 또는 세포증식성 질환의 예방 또는 치료제로서 유용한 신규 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 뎁시펩타이드 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 양호한 HDAC 억제작용 및 사람 암세포의 증식 억제활성을 가지며, 히스톤의 아세틸화가 관여하는 질환이나 병리학적 상태, 특히 종양이나 세포증식성 질환의 치료 및 개선에 유용하다.

Description

신규 뎁시펩타이드 화합물{Novel depsipeptide compound}

본 발명은 의약, 특히 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 항종양제로서 유용한, 신규 뎁시펩타이드 화합물에 관한 것이다.

히스톤의 아세틸화는 히스톤 아세틸화 효소(히스톤 아세틸트랜스퍼라제(Histone Acetyltransferase); HAT)와 히스톤 탈아세틸화 효소(히스톤데아세틸라제(Histone Deacetylase); HDAC)의 균형에 의해 제어되고 있는 것으로 공지되어 있으며, 최근에는 몇개의 HAT 및 HDAC가 동정되어 이의 전사조절에서의 중요성이 보고되고 있다[참조: Ogryzko, V. V. et al Cell 87, 953-959, 1996; Brown, C. E. et al Trends Biochem. Sci. 25(1), 15-19, 2000; Grozinger, C. M. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4868-4873, 1999].

한편, 세포 주기 정지, 형질전환 세포의 형태 정상화, 분화유도 등 다채로운 작용을 갖는 부티르산은 세포내에 고아세틸화 히스톤을 축적시켜, HDAC 억제작용을 갖는 것으로 이전부터 공지되어 있었다[참조: Counsens, L. S. et al J. Biol. Chem. 254, 1716-1723, 1979]. 또한, 미생물 대사산물인 트리코스타틴A(Trichostatin A, TSA)는 세포 주기의 정지, 분화유도를 나타내며[참조: Yoshida, M. et al Cancer Res 47, 3688-3691, 1987; Yoshida, M. et al Exp. Cell Res 177, 122-131, 1988], 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것으로 밝혀졌다. TSA는 세포내에 고아세틸화 히스톤을 축적시켜, 부분 정제한 HDAC를 사용한 검토에서 TSA가 강력한 HDAC 억제제라는 것이 밝혀졌다[참조: Yoshida, M. et al J. Biol. Chem. 265, 17174-17179, 1990].

HDAC 억제제는 세포 주기 정지, 형질전환 세포의 형태 정상화, 분화유도, 아폽토시스 유도, 혈관신생 억제작용 등을 갖는 점에서, 항종양제로서의 효과가 기대되고 있다[참조: Marks, P. A. et al J. Natl. Cancer Inst., 92, 1210-1216, 2000; Kim, M. S. et al Nature Med. 7 437-443, 2001]. 또한, 이외에도, 예를 들면 감염증, 자가면역질환, 피부병[참조: Darkin-Rattray, S. J. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13143-13147, 1996] 등의 세포 증식성 질환의 치료·개선제, 또한 헌팅턴병 등의 진행성 신경변성 질환의 예방·치료약[참조: Steffan, J. S. et al Nature 413, 739-743, 2001], 도입 유전자의 발현항진[참조: Chen, W. Y. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5798-5803, 1997] 등 다양한 응용도 시도되고 있으며, 유용한 의약이 될 것으로 기대되고 있다.

최근에 와서, HDAC 억제작용을 갖는 미생물 배양물 유래의 뎁시펩타이드 화합물, 예를 들면, FK228[참조: 비특허문헌 1; Nakajima, H. 등, 「Experimental Cell Research.」, 1998년, 제241권, 제126-133페이지] 및 하기 화학식 A, B 및 C의 화합물[참조: 특허문헌 1; 국제공개 제WO 00/42062호 및 특허문헌 2; 일본 특허출원 공개공보 제2001-348340호]이 보고되어 있다. 이러한 화합물은 양호한 HDAC 억제작용을 가지고 있으며, 새로운 형태의 항종양제로서 기대되고 있다.

그러나, 현재도 활성강도, 안정성, 체내 동태 및 독성 등의 더욱 개선된 약제의 창제가 요망되고 있다.

도 1은 화합물 Q의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 2는 화합물 Q의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 3은 화합물 R의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 4는 화합물 R의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 도시한다.

본 발명자 등은 천연에 존재하는 많은 미생물이 생성하는 화합물에 관하여, 예의 검토한 결과, 슈도모나스(Pseudmonas)속에 속하는 신종의 미생물 Q71576 균주를 찾아내고, 당해 배양물로부터 사람 암세포에 대한 우수한 세포증식 억제활성을 갖는 신규 뎁시펩타이드 화합물(상기의 화학식 A, B 및 C의 화합물)을 분리하였다. 그리고, 이러한 화합물이 우수한 HDAC 억제작용을 갖는 것을 밝혀내고, 먼저 특허출원하였다[참조: 특허문헌 1 및 특허문헌 2].

본 발명자 등은 또한 미생물 Q71576 균주의 배양물중의 미량성분을 분리하기 위해 배양조건 및 정제조건 등을 예의 검토하여, 우수한 HDAC 억제작용 및 사람 암세포에 대한 세포증식 억제활성을 갖는 신규한 유연체 화합물을 분리하는데 성공하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 HDAC 억제제 및 항종양제로서 유용한, 화학식Ⅰ의 뎁시펩타이드 화합물(화합물 Q라고 약기한다) 또는 화학식 II의 뎁시펩타이드 화합물(화합물 R이라고 약기한다), 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염, 바람직하게는 화학식Ⅰ의 평면구조식을 가지며 또한 시광도 [α]²⁵ _D -349.3°(c 0.05, 메탄올 용매)를 가짐을 특징으로 하는 뎁시펩타이드 화합물의 이성체, 또는 화학식 II의 평면구조식을 가지며 또한 시광도 [α]²⁵ _D -65.3°(c 0.20, 메탄올 용매)를 가짐을 특징으로 하는 뎁시펩타이드 화합물의 이성체, 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염에 관한 것이다. 또한, 시광도 [α]²⁵ _D은 데이터의 성질상 측정조건에 따라 다소 변할 수 있기 때문에, 이성체의 동일성 인정에 있어서 이의 수치를 엄밀하게 해석해서는 안된다.

또한, 본 발명은 화학식 I 또는 화학식 Ⅱ의 뎁시펩타이드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물, 특히 항종양제에 관한 것이다.

또한, 항종양제인 의약의 제조를 위한 상기 화학식 I 또는 화학식 Ⅱ의 뎁시펩타이드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염의 용도 및 유효량의 화학식 I 또는 화학식Ⅱ의 뎁시펩타이드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염을 환자에게 투여함을 포함하는, 암 환자의 치료방법도 포함된다.

이하, 본 발명에 관하여 상술한다.

본 발명의 뎁시펩타이드 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 슈도모나스속에 속하는 당해 화합물 생산균을 영양 배지에서 배양하고, 당해 화합물을 축적시킨 배양물로부터 통상적인 방법에 의해서 수득된다. 당해 화합물의 제조방법에서 사용하는 미생물은 슈도모나스속에 속하며 당해 화합물의 생산능을 갖는 미생물이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 이러한 미생물로는 예를 들면, 나가노켄 키타사쿠군 모치즈키마치에서 채집된 토양에서 분리된 슈도모나스속에 속하는 세균 슈도모나스 에스피.(Pseudomonas sp.) Q71576 균주를 들 수 있다. 본 균주의 균학적 성상은 문헌[참조: 국제공개 제W0 00/42062호]에 기재된 바와 같다. 또, 본 균주는 슈도모나스 에스피. Q71576로서 독립행정법인 산업기술종합연구소내 특허생물 기탁센터(통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소)에 수탁번호 FERM 제BP-6944호(기탁일 1999년 1월 8일)로서 국제기탁되어 있다. 또한, 미생물은 인공적으로 또는 천연적으로 변이를 유발하기 쉽기 때문에, 본 발명에서 사용되는 슈도모나스 에스피. Q71576 균주는 천연에서 분리된 미생물 외에, 이러한 미생물을 자외선, X선 및 화학약제 등으로 인공적으로 변이시킨 균주 및 이들의 천연 변이주를 또한 포함한다.

(제조방법)

본 발명의 화합물은 슈도모나스속에 속하며 본 발명의 화합물 생산능을 갖는 미생물을 배양함으로써 수득된다. 배양은 일반 미생물의 배양방법에 준하여 이루어진다.

배양에 사용되는 배지로는 슈도모나스 에스피. Q71576 균주가 이용하는 영양원을 함유하는 배지이면 양호하며, 합성 배지, 반합성 배지 또는 천연 배지가 사용된다. 배지에 첨가하는 영양물로서 공지된 것을 사용할 수 있다. 배지의 조성은 예를 들면 탄소원으로서는 D-글루코스, D-만노스, D-프럭토스, 이노시톨, D-만니톨, D-갈락토스, 트레할로스, 크산틴, 전분, 포도당, 덱스트린, 글리세린, 식물유 등을 들 수 있다. 질소원으로서는 고기 추출액, 펩톤, 글루텐밀, 면실박, 대두분, 낙화생분, 어분, 옥수수 침지액, 건조 효모, 효모 추출액, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 요산 등의 유기, 무기의 질소원이 사용된다. 또, 금속염으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 아연, 철, 코발트 등의 황산염, 질산염, 탄산염, 인산염 등이 필요에 따라서 첨가된다. 또한, 필요에 따라 메티오닌, 시스테인, 시스틴, 티오황산염, 올레산메틸, 라드유, 실리콘유, 계면활성제 등의 생성촉진 화합물 또는 소포제를 첨가할 수 있다.

배양 조건으로는 호기적 조건하에서 배양하는 것이 일반적으로 유리하고, 배양온도는 3 내지 32℃의 범위, 바람직하게는 20 내지 28℃ 부근에서 실시된다. 배지의 pH는 약 4.5 내지 9, 바람직하게는 약 5 내지 7.5의 범위로 조정하면 바람직한 결과가 수득된다. 배양기간은 배지의 조성, 온도조건에 따라 적절하게 설정되지만, 통상적으로 1 내지 10일 정도, 바람직하게는 2 내지 7일 정도이다.

배양물로부터 목적하는 본 발명의 화합물을 분리하기 위해서는 미생물이 생성하는 대사산물에 대해 사용하는 통상의 추출, 정제의 수단을 적절하게 이용할 수 있다. 예를 들면 배양 화합물중의 당해 화합물은 배양액을 그대로, 또는 원심분리 또는 배양물에 여과조제를 첨가하여 여과하여 수득된 배양액에 아세트산에틸 등의 물과 혼화되지 않은 유기용제를 가하여 추출한다. 또한, 배양액을 적절하게 담체에 접촉시켜 여과액중의 생산 화합물을 흡착시키고, 이어서 적당한 용매로 용출시킴으로써 당해 화합물을 추출할 수 있다. 예를 들면, 앰버라이트(Amberlite)(등록상표) XAD-2, 다이아이온(Diaion)(등록상표, 이하 동일) HP-20, 다이아이온 CHP-20, 또는 다이아이온 SP-900과 같은 다공성 흡착수지에 접촉시켜 당해 화합물을 흡착시킨다. 이어서 메탄올, 에탄올, 아세톤, 부탄올, 아세토니트릴 또는 클로로포름 등의 유기용매를 단독으로 또는 이들의 혼합한 용매를 사용하거나 당해 용매와 물의 혼합액을 사용하여 당해 화합물을 용출시킨다. 이때의 유기용매의 혼합 비율을 저농도로부터 단계적으로 또는 연속적으로 고농도까지 상승시킴으로써, 당해 화합물을 포함하는 분획을 효율적으로 수득할 수 있는 경우가 있다. 아세트산에틸, 클로로포름 등의 유기용매로 추출하는 경우에는 배양 여과액에 이러한 용매를 첨가하고, 적절하게 진탕하여 당해 화합물을 추출한다. 다음에, 상기의 각 조작법을 사용하여 수득한 당해 화합물 함유 분획은 실리카겔 및 ODS 등을 사용한 칼럼 크로마토그래피, 원심액 분배 크로마토그래피 및 ODS를 사용한 고속액체 크로마토그래피(HPLC), 재결정 등의 정법에 의해 더욱 순수하게 분리 정제할 수 있다.

본 발명의 뎁시펩타이드 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 무기 또는 유기 염기와의 염이고, 구체적으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등 무기 염기, 또는 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민, 리신, 오르니틴 등의 유기 염기와의 염, 또는 철 등과의 착염 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 비대칭 탄소원자 및 2중 결합을 갖기 때문에, 이에 기초하는 입체이성체(라세미체, 광학이성체 및 디아스테레오머 등) 및 기하이성체(시스체 또는 트랜스체)가 존재한다. 따라서 본 발명의 화합물은 이러한 입체이성체 또는 기하이성체의 혼합물 또는 분리된 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 당해 화합물의 수화물 또는 각종 용매화물 뿐만 아니라 당해 화합물의 결정다형도 포함한다.

이하에 본 발명의 화합물을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물의 제조방법과 사용방법을 상술한다.

본 발명의 뎁시펩타이드 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 1종 또는 2종 이상을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물은 통상적으로 사용되고 있는 제제용의 담체 또는 부형제, 그 밖의 첨가제를 사용하여, 정제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 환제, 액제, 주사제, 좌제, 연고, 첩부제 등으로 조제되며, 경구적 또는 비경구적으로 투여된다.

본 발명의 화합물의 사람에 대한 임상 투여량은 통상적으로 경구 투여의 경우, 1일 투여량은 체표면적당 약 1 내지 10,OOOmg/㎡, 바람직하게는 1O 내지 5,OOOmg/㎡이 적당하고, 이것을 1회에 또는 2 내지 4회로 나누어 투여한다. 정맥투여되는 경우는 1일 투여량은 체표면적당 약 O.1 내지 1,OOOmg/㎡가 적당하고, 1일 1회 내지 여러번으로 나누어 투여한다. 투여량은 증상, 연령 및 성별 등을 고려하여 개개의 경우에 따라서 적절하게 결정된다.

본 발명에 의한 경구 투여를 위한 고체 조성물로서는 정제, 산제 및 과립제 등이 사용된다. 이러한 고체 조성물에 있어서는 하나 또는 그 이상의 활성 화합물이, 하나 이상의 불활성인 희석제, 예를 들면 유당, 만니톨, 포도당, 하이드록시프로필 셀룰로스, 미세결정 셀룰로스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘과 혼합된다. 조성물은 통상적인 방법에 따라서, 불활성인 희석제 이외의 첨가제, 예를 들면 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제나 섬유소 글리콜산칼슘과 같은 붕괴제, 안정화제 및 용해보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는 필요에 따라 자당, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 등의 당의 또는 위용성 또는 장용성 화합물의 필름으로 피막할 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 조성물은 약제적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하며, 일반적으로 사용되는 불활성인 희석제, 예를 들면, 정제수, 에틸알콜을 포함한다. 이러한 조성물은 불활성 희석제 이외에 용해 보조제, 습윤제 및 현탁화제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유할 수 있다.

비경구 투여를 위한 주사제로서는 멸균 수성 또는 비수성 용액제, 현탁제 및 유탁제를 포함한다. 수성 용액제 및 현탁제의 희석제로서는 예를 들면, 주사제용 증류수 및 생리식염수가 포함된다. 비수용성 용액제 및 현탁제의 희석제로서는 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브유와 같은 식물유, 에틸알콜과 같은 알콜류, 폴리솔베이트 80(상품명) 등이 있다. 이러한 조성물은 추가로 등장화제, 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제, 용해보조제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 세균 보류 필터에 통과시키는 여과, 살균제의 배합 또는 방사선 조사에 의해서 멸균된다. 이들은 또, 무균의 고체 조성물을 제조하고, 사용전에 멸균수 또는 멸균 주사용 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물의 용해성이 낮은 경우에는 가용화 처리할 수도 있다. 가용화 처리로는 의약제제에 적용할 수 있는 공지된 방법, 예를 들면, 계면활성제(폴리옥시에틸렌 경화 피마자유류, 폴리옥시에틸렌솔비탄 고급 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 글리콜류, 자당 지방산 에스테르류 등)을 첨가하는 방법, 약물과 가용화제, 예를 들면 고분자[하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 수용성 고분자, 카복시메틸에틸셀룰로스(CMEC), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트(HPMCP), 메타크릴산메틸-메타크릴산 공중합체(참조: 오이드라기트 L,S, 상품명; 롬앤하스사 제조) 등의 장용성 고분자]와의 고체 분산체를 형성하는 방법을 들 수 있다. 또한 필요에 따라, 가용성의 염으로 하는 방법, 사이클로덱스트린 등을 사용하여 포접 화합물을 형성시키는 방법 등도 채용할 수 있다. 가용화의 수단은 목적으로 하는 약물에 따라서 적절하게 변경할 수 있다[참조: 「최근의 제제기술과 그 응용 I」, 우츠미 이사무 등, 의약 저널 157-159(1983) 및「약학 모노그래프 No.1, 생물학적 이용능」, 나가이 츠네지 등, 소프트사이언스사, 78-82, (1988)].

이하, 실시예로 구체적으로 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

글루코스 10g, 감자전분 20g, 폴리펩톤 5g, 효모 추출액 5g, 탄산칼슘 4g, 증류수 1L를 포함하는 배지(pH 7.0) 100mL를, 500mL용의 삼각 플라스크에 분주하고, 120℃에서 20분 동안 멸균하였다. 베네트 한천 배지에서 양호하게 생육시킨 슈도모나스 에스피. Q71576 균주를 긁어모아 접종하고, 28℃, 200회전/분의 조건으로 3일 동안 진탕배양하여, 이를 종배양액으로 하였다. 다음에 만니트 40g, 폴리펩톤 5g, 고기 추출액 5g, 황산마그네슘 7수화물 2g, L-시스테인 염산염 1수화물 0.5g, 수도물 1L를 포함하는 배지(pH 5.0)를 100mL씩 500mL용의 삼각 플라스크에 분주하고, 120℃에서 20분 동안 멸균하였다. 이러한 배지에 상기 종배양액을 2mL씩 접종하여, 24℃, 220회전/분의 조건으로 3일 동안 진탕배양하였다.

이렇게 하여 배양한 배양액 1L를 6000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 1M 염산을 사용하여 pH 3.0으로 조정하고 아세트산에틸로 추출하고 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수한 후, 감압하에서 농축 건조하였다. 이러한 오일상의 조(粗)추출물을 메탄올에 용해하여, STR-PREP-ODS-M(20×250mm) 및 아세토니트릴/물(30/70)을 사용한 HPLC(유속 9ml/분)에 반복하여 적용하고, 유지시간 28분 내지 36분의 분획(1)을 수득하였다. 분획(1)을 감압하에서 농축 건조하여, 메탄올에 용해한 후, 추가로 COSMOSIL(20×250mm) 및 아세토니트릴/0.25% 트리플루오로아세트산수(40/60)를 사용한 HPLC(유속 9ml/분)을 실시하고, 유지시간 15.2분의 피크의 분획(2)과 유지시간 16.5분의 피크의 분획(3)을 수득하였다. 분획(2)을 농축 건조시켜 화합물 Q 5.6mg을, 분획(3)을 농축 건조시켜 화합물 R 11.8mg을 수득하였다.

실시예 2

글루코스 10g, 감자전분 20g, 폴리펩톤 5g, 효모추출액 5g, 탄산칼슘 4g, 증류수 1L를 포함하는 배지(pH 7.0) 100mL를, 500mL용의 삼각 플라스크에 분주하여, 120℃에서 20분 동안 멸균하였다. 베네트 한천배지에 양호하게 생육시킨 슈도모나스 에스피. Q71576 균주를 긁어모아 접종하고, 28℃, 200회전/분의 조건으로 3일 동안 진탕 배양하여, 제1단 종배양액으로 하였다. 다음에 상기와 동일한 배지 500mL를 3L용의 삼각 플라스크에 분주하고, 120℃에서 20분 동안 멸균하였다. 여기에 제1단 종배양액을 2%의 비율로 접종하고, 28℃, 200회전/분의 조건으로 3일 동안 진탕배양하여, 제2단 종배양액으로 하였다. 다음에 본 배양은 300L용 발효조(Jar fermenter)에 만니트 50g, 폴리펩톤 5g, 고기 추출액 5g, 황산마그네슘 7수화물 2g, L-시스틴 0.5g, L(-)-프롤린 0.5g, 수도물 1L를 포함하는 배지(pH 5.0) 200L를 주입하고, 120℃에서 20분 동안 멸균하였다. 여기에 제2단 종배양액을 1%의 비율로 접종하여, 20℃, 40회전/분, 매분 200L의 통기량의 조건으로 7일간 배양하였다.

이렇게 하여 배양한 배양액 200L를 황산을 사용하여 pH 3.0으로 조정하고, 샤프레스(Sharpless) 원심기로 균체와 상청액으로 분리하였다. 당해 상청액을 20L의 다이아이온 HP-20[참조: 미쓰비시카가쿠고교 제조]를 충전한 외부직경 18cm, 높이 150cm의 칼럼을 통과시켜, 목적 화합물 등을 흡착시켰다. 이어서, 50L의 수도물로 수세한 후, 30% 메탄올수 40L, 계속해서 30% 아세톤수 100L로 세정하고, 마지막으로 메탄올 60L를 사용하여 목적 화합물을 용출하였다. 이러한 용출액에 5L의 증류수를 가하여, 감압하에서 농축하여 메탄올을 제거하였다. 여기에 등량의 아세트산에틸을 첨가하고, pH 3.0로 아세트산에틸 추출을 3회 실시하였다. 아세트산에틸 추출액에 무수황산나트륨을 첨가하여 탈수한 후, 감압하에서 농축 건조하여, 목적 화합물을 함유하는 조(粗)정제물을 수득하였다.

이렇게 하여 수득한 조정제물 21.5g을 YMC RACK Pro Cl8 20×250mm(YMC) 및 아세토니트릴/물(40/60)을 사용한 HPLC(유속 8ml/분)에 반복하여 적용하고, 유지시간 18.0분 내지 19.8분의 분획(1)을 수득하였다. 분획(1)은 수용액이 될 때까지 농축후 동결건조하고, 추가로 YMC RACK Pro Cl8 20×250mm(YMC) 및 메탄올/물(60/40)을 사용한 HPLC(유속 10ml/분)에 반복하여 적용하여, 분획(2)(유지시간 17.6분) 및 분획(3)(유지시간 21.2분)을 수득하였다. 분획(2)은 수용액이 될 때까지 농축후 동결건조함으로써 화합물 Q 80mg을 수득하였다. 분획(3)은 수용액이 될 때까지 농축후 동결건조한 것을 에탄올로 재결정함으로써 화합물 R 287mg을 수득하였다.

본 발명의 화합물의 물리화학적 성상

상기의 실시예에서 수득된 화합물 Q 및 R의 물리화학적 성상을 하기 표 1에 나타낸다. 또한, NMR 차트를 하기 도 1 내지 4에 도시한다.

	화합물 Q	화합물 R
색 및 형상	백색 분말	백색 분말
시광도 [α]²⁵ _D	-349.3°(c 0.05, MeOH)	-65.3°(c 0.20, MeOH)
분자식	C₂₀H₃₁N₃O₆S₃	C₂₂H₃₅N₃O₆S₂
고분해능 질량 분석(FAB)시험치계산치	506.1442(M+H)⁺506.1453	502.2059(M+H)⁺502.2046
자외가시 흡수 스펙트럼λ_max ^MeOH nm(ε)	265(1600)	말단 파장 흡수
적외 흡수 스펙트럼ν_max(KBr)cm^-1	3320, 2960, 2930, 1740, 1660, 1550, 1510, 1430, 1320, 1260, 1160, 1040	3380, 3330, 2960, 2930, 2880, 1740, 1670, 1540, 1520, 1430, 1360, 1300, 1270, 1160

상기의 물리화학적 성상으로부터 화합물 Q 및 R의 화학구조식을 하기와 같이 결정하였다.

화합물 Q

화합물 R

또한, 화합물 R을 환원함으로써 하기 화학식 IIa의 뎁시펩타이드 화합물을 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 화학식 IIa의 뎁시펩타이드 화합물은 화합물 Q 및 R과 동일하게 HDAC 억제작용을 갖는 것으로 생각된다[참조: 일본 공개특허공보 2001-354694호].

본 발명의 화합물은 하기 시험예에 나타내는 바와 같이, HDAC 억제작용을 가지며, 또한 사람 암세포에 대한 세포증식 억제활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 히스톤의 아세틸화가 관여하는 질환이나 병리학적 상태, 특히 종양이나 세포증식성 질환, 또는 헌팅턴병 등의 진행성 신경변성 질환의 예방·치료약의 치료 및 개선에 유용하다. 여기에, 세포증식성 질환으로서는 예를 들면, 감염증, 자가면역질환 및 피부병을 들 수 있다. 특히 본 발명의 화합물은 사람 암세포에 대한 양호한 세포증식 억제활성을 갖기 때문에, 항종양제로서 유용하다. 또, 본 발명의 화합물은 유전자치료에 있어서의 벡터도입의 효율화나 도입 유전자의 발현 항진에도 유용하다.

본 발명의 화합물의 유용성은 이하의 시험에 의해 확인된 것이다.

시험예 1: HDAC 억제시험

(1) HDAC의 부분정제

사람 백혈병 유래의 K562 세포로부터 분리한 핵을 요시다 등의 방법[참조: Yoshida, M. et al J. Biol. Chem 265, 17174-17179, 1990]에 따라서 추출하고, 이러한 추출액을 Q Sepharose FF 칼럼[참조: 파마시아사; 17-0510-01]을 사용하여, 0 내지 0.5M의 NaCl의 농도 구배에 의해 HDAC의 부분정제를 실시하였다. 그 후, HDA 완충액[15mm 인산칼륨(pH 7.5), 5% 글리세롤, O.2mm EDTA]로 투석하였다.

(2) HDAC 억제활성의 측정

문헌[참조: Nare, B. et al Anal. Biochem. 267, 390-396, 1999]에 따라서 합성된, 비오틴화 [³H]아세틸히스톤 H4 펩타이드(aa 14-21: 비오틴-Gly-Ala-[³H-아세틸]Lys-Arg-His-Arg-[³H-아세틸]Lys-Val-아미드[참조: Amersham Pharmacia Biotech사 제조], 이하 [³H]아세틸히스톤이라고 약기한다)를 HDAC 억제 분석(assay)의 기질로서 사용하였다.

[³H]아세틸히스톤을 60μM 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는 HDA 완충액으로 37μM로 희석하여, 이것을 25㎕ 및 (1)에서 정제·투석한 HDAC 분획 25㎕을 혼합하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1M 염산 50㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, 추가로 아세트산에틸 800㎕을 가하여 혼합·원심을 실시하고, 아세트산에틸 층 400㎕을 신틸레이터 바이알에 채취하여, 5ml의 신틸레이터를 첨가하여 유리 [³H]아세트산의 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다.

기질과 효소를 혼합하기 전에 미리 디메틸설폭사이드(DMSO)로 용해·희석한 약물 2㎕을 첨가하고, 상기의 분석을 실시함으로써, 약물의 HDAC에 대한 억제활성을 검토하였다.

본 발명의 화합물 Q 및 R은 양호한 HDAC 억제활성을 나타내며, 각각 10nM의 농도에서 50% 이상의 HDAC 효소억제활성을 나타냈다.

시험예 2: 사람 암세포에 대한 세포증식 억제시험

96웰 시험 플레이트중에 사람 대장암 유래의 WiDr 세포, 또는 사람 백혈병 유래의 K562 세포를 5×10³개/웰이 되도록 접종하고, 37℃, 0.5% C0₂ 인큐베이터 속에서 배양하였다. 18시간 후, 배지에서 희석한 용매(DMSO) 및 여러 가지 농도의 화합물 Q 또는 R을 첨가하여 37℃, 0.5% CO₂ 인큐베이터 속에서 추가로 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포의 증식을 알라마 블루(Alamar Blue)[참조: BIOSOURCE사 제조]를 사용하여 측정하고, O.1% DMSO 첨가·세포 있음 및 O.1% DMSO 첨가·세포 없음의 조건의 측정치를 각각 O% 억제, 1OO% 억제로 하여 화합물 각 농도의 증식억제%를 구하고, 증식을 50% 억제하는 농도(IC50값)를 로지스틱(logistic) 회귀에 의해 산출하였다. 그 결과, 화합물 Q의 WiDr 및 K562 세포에 대한 세포증식 억제의 IC50값은 각각 3.0nM 및 1.4nM이고 화합물 R의 WiDr 및 K562 세포에 대한 세포증식억제의 IC50값은 각각 0.9nM 및 O.6nM이고, 양호한 세포증식 억제작용을 갖고 있었다.

시험예 3: 사람 암세포에 대한 히스톤 아세틸화 유도작용

35mm 접시중에 K562 세포를 1.5×10⁶개/접시가 되도록 접종한 후, 용매(DMSO) 및 다양한 농도(O.3 내지 30nM)의 화합물 Q 또는 R을 첨가하고, 37℃, O.5% CO₂ 인큐베이터 속에서 24시간 동안 배양하였다. 히스톤 단백질의 추출은 이하의 방법으로 실시하였다. 원심분리에 의해 회수한 세포침전물에 TEN 완충액[1OmM Tris HCl(pH8.0), 1mM EDTA, 1% NP-40, 1개 정제/1OmL Complete mini (Roche사 제조)]를 첨가하여, 빙상에서 10분 동안 방치한 후, 원심분리에 의해 상청을 회수하고, 등량의 0.4M 황산을 잘 혼합하여 빙상에서 1시간 동안 방치하였다. 원심분리에 의해 상청부분을 회수한 후, 5배량의 아세톤과 혼합하여 -20℃에서 12시간 이상 방치한 후, 침전물을 원심분리에 의해 회수하여 아세톤으로 1회 세정한 침전물을 건조시켰다. 이것을 증류수로 용해한 것을 히스톤 단백질로 하고, 단백질 농도를 브래드포드법으로 정량하였다. 히스톤 단백질은 등량으로 구비하고 정법에 따라 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯(Western blot)을 실시하였다. 1차 항체로는 항-아세틸화 히스톤 H3항체[참조: UPSTATE biotechnology사 제조]를, 2차 항체로는 HRP 표식 항-토끼 항체[참조: Amersham Pharmacia Biotech사 제조]를 사용하여, ECL[참조: Amersham Pharmacia Biotech사 제조]로 발광을 검출하였다. 그 결과, 화합물 Q 또는 R 처리 샘플에서는 용매처리 샘플과 비교하여 현저하면서 용량 의존적인 아세틸화 히스톤 H3의 밴드가 검출되었기 때문에, 본 발명의 화합물 Q 및 R은 K562 세포 내에서도 HDAC를 억제하여 히스톤의 아세틸화를 충진시키고 있는 것이 확인되었다.

서열목록 설명

이하의 서열목록의 식별번호 <223>에는 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는 서열목록의 서열 1의 서열로 표시되는 아미노산 배열에서, N 말단으로부터 3번째 및 7번째의 아미노산 Xaa이 모두 N⁶-[³H₁] 아세틸라이신인 인공적으로 합성한 펩타이드를 나타낸다.

<110> YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Novel depsipeptide compound <130> 5-1998-096251-6 <150> JP-P-2002-00255141 <151> 2002-08-30 <160> 1 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> N6-[3H1]acetyllysine <222> (7) <223> N6-[3H1]acetyllysine <400> 1 Gly Ala Xaa Arg His Arg Xaa Val 1 5

Claims

화학식 I 또는 화학식Ⅱ의 뎁시펩타이드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염.

화학식 I

화학식Ⅱ
제1항에 따르는 화학식 I의 평면구조식을 가지며 시광도 [α]²⁵ _D -349.3°(c 0.05, 메탄올 용매)를 가짐을 특징으로 하는 뎁시펩타이드 화합물의 이성체, 또는 제1항에 따르는 화학식 Ⅱ의 평면구조식을 가지며 시광도 [α]²⁵ _D -65.3°(c O.20, 메탄올 용매)를 가짐을 특징으로 하는 뎁시펩타이드 화합물의 이성체, 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염.
제1항에 따르는 뎁시펩타이드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
제3항에 있어서, 항종양제인 의약 조성물.
항종양제인 의약의 제조를 위한 제1항에 따르는 뎁시펩타이드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염의 용도.
유효량의 제1항에 따르는 뎁시펩타이드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염을 환자에게 투여함을 포함하는 암 환자의 치료방법.