KR20050058153A - 아실 코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 신규한에노익산 아미드계 화합물, 그의 제조방법 및 이를함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 신규한 에노익산 아미드계 화합물, 그의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 에노익산 아미드계 화합물은 마이라센 2(Mylacen 2) 또는 마이라센 3(Mylacen 3)임을 특징으로 한다.

본 발명의 에노익산 아미드계 화합물인 마이라센 2 또는 마이라센 3는 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 활성을 효과적으로 억제하므로, 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소와 관련된 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

아실 코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 신규한 에노익산 아미드계 화합물, 그의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물{New enoic acid amide compounds having inhibitory activity against acyl-CoA:cholesterol acyltransferase, process of preparation thereof and composition comprising the same}

본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성(acyl-CoA:cholesterol acyltransferase; ACAT)을 갖는 신규한 에노익산 아미드계 화합물, 그의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 에노익산 아미드계 화합물은 마이라센 2(Mylacen 2) 또는 마이라센 3(Mylacen 3)임을 특징으로 한다.

심장순환계 질환은 현재 전세계적으로 사망율 1위를 차지하는 질병으로 구미 등 선진국에서는 이로 인한 사망이 전체 사망의 1/3 이상을 차지하고 있으며, 우리나라의 경우도 비슷한 경향을 보이고 있다.

심장순환계 질환의 대표적인 질환인 동맥경화증은 동맥이 비후되고 경화되어 탄력을 잃고 약해진 것으로서, 노화와 더불어 발생하는 주요 질환 중의 하나이다. 동맥경화는 뇌동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬운데, 뇌동맥경화증의 경우에는 두통, 현기증, 정신장애를 나타내고 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화증의 경우에는 심장부에 동통과 부정맥을 일으켜 협심증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한 이로 인해 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발되어, 동맥경화증으로 인한 질병이 현대 사회에 있어, 특히 50∼60대의 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 부각되고 있다.

심장순환계 질환은 혈장내 콜레스테롤 농도가 높으면 발병하는 것으로, 심장순환계 질환의 예방을 목적으로 혈장내 총콜레스테롤 농도를 낮출 수 있는 약물을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어왔다. 그 결과 인체내에서 콜레스테롤의 생합성을 저해하는 물질들이 다수 개발되어 상품화 되었다. 그러나 이러한 약물들에 의한 부작용들이 보고되면서 이를 개선하기 위하여, 최근에는 보다 선택적으로 혈중 콜레스테롤만을 조절할 수 있는 화합물을 찾기 위한 연구가 집중적으로 행해지고 있으며, 그 중 대표적인 것이 ACAT 억제제에 관한 것이다.

ACAT는 일반적으로 콜레스테롤을 에스테르화 하는 효소로서, 그 작용 기작은 크게 체내의 세 부위(장, 간, 그리고 혈관벽 세포)에서 일어난다.

첫째, 장에서 ACAT는 섭취된 콜레스테롤을 에스테르의 형태로 바꾸어 장내로 흡수되는 것을 촉진시킨다. 둘째, 외부로부터 흡수되거나 체내에서 생합성된 콜레스테롤은 간에서 VLDL(very low density lipoprotein)이라는 운반체안에 축적된 후 혈관을 통해 신체 각 기관으로 공급되는데, 이때 ACAT에 의하여 콜레스테롤이 콜레스테릴 에스테르 형태로 전환됨으로써 운반체 내에 콜레스테롤 축적이 가능하게 된다. 셋째, 동맥혈관벽을 이루는 세포내에서 ACAT는 콜레스테롤을 그의 에스테르 형태로 전환시켜 세포내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 촉진시키는데, 이는 동맥경화를 일으키는 직접적인 원인이 된다.

따라서, ACAT의 활성을 억제하는 약물은 첫째, 장내 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 체내로 유입되는 콜레스테롤의 양을 감소시킬 수 있을 것이며, 둘째, 간에서 혈관내로 콜레스테롤이 방출되는 것을 억제하여 혈중 콜레스테롤 농도를 떨어뜨릴 수 있고, 셋째, 혈관벽 세포에 콜레스테롤이 축적되는 것을 방지하여 직접적으로 동맥경화를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

지금까지 보고된 ACAT 활성 저해제는 쥐간 마이크로좀 ACAT 또는 쥐간 대식세포(J774) ACAT 에 대한 활성 저해제이다.

사람의 ACAT는 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2가 있는데, 사람 ACAT-1(50 kDa)은 성인의 간, 부신, 대식세포, 신장에서 주로 작용하며, 사람 ACAT-2(46 kDa)는 소장에서 작용한다(Rudel, L. L. et al., Curr. Opin. Lipidol 12, 121-127, 2001). 사람 ACAT 활성을 저해하는 물질은 음식으로부터 유입되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 혈관내벽에 콜레스테릴 에스테르의 축적을 억제하는 기작을 통해 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석 또는 동맥경화 예방 및 치료제의 표적이 되고 있다(Buhman, K. K. et al., Nature Medicine 6, 1341-1347, 2000).

한편, 반묘(斑猫, Mylabris phalerate Pallas)는 가래과(Meloidae) 길나잡이의 건사체로서 중국에서는 예로부터 진통, 이뇨, 소염약으로 사용되어 왔다. 우리 나라에서는 약 10년 전에 제주도에서 자생하는 것이 처음으로 밝혀진 이래 민간에서 암치료 보조약, 신경계 질환, 당뇨병 등의 만성 성인병 치료에 사용되어 왔다.

이에 본 발명자들은 새로운 고지혈증, 동맥경화 치료제를 개발하기 위해 국내의 전통 약재 및 민간 약재를 연구하던 중, 반묘 추출물에서 분리·정제한 에노익산 아미드계 화합물에서 ACAT 활성을 저해하는 작용이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 신규한 에노익산 아미드계 화합물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 에노익산 아미드계 화합물의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 에노익산 아미드계 화합물을 유효성분으로 하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2) 및 하기 화학식 2로 표시되는 신규한 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 3)을 제공한다.

본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 에노익산 아미드계 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)은 반묘로부터 추출·분리·정제하여 사용하였으며, 통상적인 모든 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 반묘로부터 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)의 추출, 분리 및 정제방법은 다음과 같다.

건조된 반묘 분말을 메탄올로 추출하여 농축한 후, 물과 n-헥산으로 추출하여 헥산층과 물층으로 분리한다. 물층은 다시 클로로포름으로 추출하여 클로로포름층과 물층으로 분리한다. 상기 물층은 다시 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분리한다.

상기 과정에서 얻은 헥산층, 클로로포름층, 에틸아세테이트층 및 물층에 대하여 ACAT 활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트층에서 ACAT 활성이 강하게 억제됨을 확인하고, 에틸아세테이트층을 감압하에서 농축, 건조시켜 흑갈색의 유성 (oily) 물질을 얻는다.

상기 에틸아세테이트 농축액을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 이 때, 클로로포름:메탄올 = 100~0:0~100 (v/v)인 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 클로로포름 100%인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리된다.

상기 활성분획을 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 이 때, n-헥산:에틸아세테이트 = 100~50:0~50 (v/v) 인 용매를 사용하는 것이 바람직하며, n-헥산:에틸아세테이트 = 2:1(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리된다.

상기 활성분획을 다시 물과 메탄올 용액의 비율을 변화시켜가며 C-18 역상 칼럼 크로마토그래피(C-18; Merck, 칼럼 크기 : Φ2.0 x 15.0㎝)를 사용하여 분리한다. 이 때, 물:메탄올 = 1:4(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리된다.

상기 활성분획을 다시 물과 메탄올 용액의 비율을 변화시켜가며 고속 역상 크로마토그래피(HPLC; hydrosphere C-18: s-5㎛, 칼럼 크기 : Φ250 x 20.0㎜ I.D.)를 사용하여 분리한다. 물:메탄올 = 1:9(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리된다.

상기와 같은 방법에 의하여, 건조된 반묘 500g으로부터 순수 활성물질인 마이라센 2는 8㎎, 마이라센 3는 6㎎을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 에노익산 아미드계 화합물을 유효성분으로 하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 반묘 추출물로부터 분리·정제된 마이라센 2는 쥐간 ACAT, 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2에 대한 IC₅₀치가 각각 162 μM, 85 μM, 61 μM 이고, 마이라센 3은 쥐간 ACAT, 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2에 대한 IC₅₀치가 각각 150 μM, 72 μM, 54 μM 로, ACAT 활성을 효과적으로 억제한다.

따라서, 본 발명의 조성물은 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2 또는 마이라센 3)에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화학식 1, 화학식 2의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 마이라센 2(또는 마이라센 3)가 약 0.1~100㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5~10㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)을 마우스에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)의 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1g/㎏으로 나타나, 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 심장순환계 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 심장순환계 질환의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2 또는 마이라센 3)을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 마이라센 2 또는 마이라센 3를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2 또는 마이라센 3)는 원료에 대하여 1~20 중량%, 바람직하게는 5~10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 반묘로부터 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)의 추출, 분리 및 정제

1. 반묘로부터 추출

건조된 반묘 500g을 세척하여 건조시킨 후, 분쇄기를 사용하여 분쇄하여 분말로 만들었다.

반묘 분말을 메탄올 1.5ℓ에 넣어 상온에서 24시간 동안 방치한 후, 메탄올 용액을 교반시키고 여과지로 여과하여 액상을 분리하였다. 상기와 같은 추출과정을 모두 2번 반복하여 액상만을 모으고 감압하에서 농축하였다.

상기에서 얻은 메탄올 추출물을 물 500㎖에 현탁시키고, 여기에 다시 n-헥산 500㎖를 가하였다. 분별깔대기를 이용하여 헥산층(9.4g)과 물층으로 분리하였다.

물층은 클로로포름을 가하여 다시 추출하고 분별깔대기를 이용하여 클로로포름층(17.2g)과 물층으로 분리하였다.

상기 분리된 물층은 에틸아세테이트를 가하여 다시 추출하고 분별깔대기를 이용하여 에틸아세테이트층(22.0g)과 물층으로 분리하였다.

상기 과정에서 얻은 헥산층, 클로로포름층, 에틸아세테이트층 및 물층에 대하여 ACAT 활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트층에서 ACAT 활성이 강하게 억제되었다.

따라서, 에틸아세테이트층을 감압하에서 농축, 건조시켜 흑갈색의 유성 (oily) 물질을 얻었다.

2. 에틸아세테이트 추출물의 분리 및 정제

상기 1에서 얻은 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름과 메탄올의 비율을 변화시켜 가며 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(실리카겔; Merck, Art 9385, 칼럼 크기 : Φ7.5 x 21.5㎝)를 사용하여 분리하였다. 클로로포름 100%인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되었으며, 이 때 활성분획 8.8 g을 얻었다.

이 활성분획을 다시 n-헥산과 에틸세테이트 용액의 비율을 변화시켜가며 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(실리카겔; Merck, Art 9385, 칼럼 크기 : Φ3.5 x 19.0㎝)를 사용하여 분리하였다. n-헥산:에틸아세테이트 = 2:1(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되었으며, 이 때 활성분획 1.2g을 얻었다.

상기 활성분획을 다시 물과 메탄올 용액의 비율을 변화시켜가며 역상 C-18 칼럼 크로마토그래피(C-18; Merck, 칼럼 크기 : Φ2.0 x 15.0㎝)를 사용하여 분리하였다. 물:메탄올 = 1:4(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되었다.

상기 활성분획을 다시 물과 메탄올 용액의 비율을 변화시켜가며 고속 역상 크로마토그래피(HPLC; hydrosphere C-18: s-5㎛, 칼럼 크기 : Φ250 x 20.0㎜ I.D.)를 사용하여 분리하였다. 물:메탄올 = 1:9(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되었으며, 이 때 순수 활성물질인 마이라센 2는 8㎎, 마이라센 3는 6㎎을 얻었다.

3. 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)의 구조 분석

상기 실시예를 통하여 얻은 물질은, VG 고분해능 GC/MS 분광기(VG high resolution GC/MS spectrometer, Election Ionization MS, Autospec-Ultima)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였으며, 선광도는 편광기(Jasco DIP-181 digital polarimeter)를 사용하여 측정하였다. 또한 핵자기공명(NMR) 분석(Bruker AMX 300)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, 호모-코지(HOMO-COSY), HMQC(¹H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻고, 분자구조를 결정하였다.

측정 결과는 하기와 같으며, 화학식 1의 화합물은 마이라센 2, 화학식 2의 화합물은 마이라센 3의 신규한 화합물로 동정하였다.

[마이라센 2]

1) 물성 : 무정형 분말

2) 선광도 : [α]_D ²⁵ 0(c=0.6, CHCl₃)

3) 분자량 : 279

4) 분자식 : C₁₈H₃₃NO

5) ¹H-NMR(CDCl₃, 500MHz) δ 5.24(4H, m, H-5, H-6, H-8, H-9 ) 2.67(2H, t, J = 6.5㎐, H-7), 2.09(2H, t, J = 7.5㎐, H-2) 1.96 (4H, m, H-4 or H-10), 1.50(2H, m, H-3), 1.28-1.19(14H, m, H-11 H-12, H-13, H-14, H-15, H-16, H-17), 0.81(3H, t, J = 6.5㎐, H-18)

6) ¹³C-NMR(CDCl₃, 125MHz) δ 179.3(C-1) 130.9(C-5), 130.8(C-9), 129.1(C-6), 129.0(C-8), 36.5(C-2), 32.7(C-16), 30.7(C-11), 30.5(C-12), 30.4(C-13), 30.3(C-14), 30.2(C-15 ), 28.1(C-4 or C-10), 28.1(C-4 or C-10), 26.9(C-3), 26.5(C-7), 23.5(C-17), 14.4(C-18)

7) FAB-MS : m/z [M+H]⁺ 279(80), 220(20), 150(25), 109(35), 95(60), 81(80), 67(90), 59(100)

[마이라센 3]

1) 물성 : 무정형 분말

2) 선광도 : [α]_D ²⁵ 0(c=0.6, CHCl₃)

3) 분자량 : 218

4) 분자식 : C₁₈H₃₅NO

5) ¹H-NMR(CDCl₃, 500MHz) δ 5.24(2H, m, H-5, H-6), 2.09(2H, t, J = 7.5㎐, H-2), 1.93(4H, m, H-4 or H-7), 1.50(2H, m, H-3), 1.23-1.19(20H, m, H-8, H-9, H-10, H-11 H-12, H-13, H-14, H-15, H-16 , H-17), 0.81(3H, t, J = 6.6㎐, H-18)

6) ¹³C-NMR(CDCl₃, 125MHz) δ 179.3(C-1) 130.9(C-5), 130.8(C-6), 36.5(C-2), 33.1(C-16), 30.84(C-8), 30.81(C-9), 30.62(C-10), 30.64(C-11), 30.61(C-12), 30.45(C-13), 30.35(C-14), 30.24(C-15), 28.1(C-4 or C-10), 28.1(C-4 or C-10), 26.9(C-3), 23.7(C-17), 14.5(C-18)

7) FAB-MS : m/z [M+H]⁺ 281(50), 264(25), 126(30), 98(25), 83(20), 72(90), 59(100)

실험예 1 : 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3)의 ACAT 활성에 미치는 영향

본 발명에 따른 반묘로부터 추출·분리·정제한 마이라센 2 및 마이라센 3의 ACAT 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1. ACAT 효소원의 제조

1) 쥐간 ACAT

ACAT 효소원으로 흰 쥐(male Sprague-Dawley 150~200g)의 간을 적출하였다. 1g의 간을 5㎖의 균질화 용액(0.1 M KH₂PO₄, pH 7.4, 0.1mM EDTA 및 10mM β-머캅토에탄올)에 균질화하였다. 이 균질액을 4℃에서 3,000 xg로 10분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층액을 4℃에서 15,000 xg로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액을 초원심분리 튜브(Beckman)에 넣고, 4℃에서 100,000 xg로 1시간 동안 원심분리하여 마이크로좀 펠렛을 얻은 후, 이를 3㎖의 균질화 용액에 현탁시키고 4℃에서 100,000 xg로 1시간 동안 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 1㎖의 균질화 용액에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액중의 단백질 농도를 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정하고, 단백질 농도를 4 내지 8 ㎎/㎖로 조절하였다. 얻어진 현탁액을 저온냉동기(deep freezer; Forma Scientific Inc.)에 보관하였다.

2) 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2

사람 ACAT-1 및 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 사람 ACAT-1과 ACAT-2 단백질을 얻었다.

사람 간 cDNA library screening을 통하여 얻어진 hACAT-1과 hACAT-2의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 그 후, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 hACAT-1과 hACAT-2의 재조합 바이러스를 분리한 후 3 차례의 증폭과정을 거쳐 viral stock의 titer를 높였다. 단백질 발현효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(Mutiplicity of Infection)가 1이 되도록 감염시킨 후 27℃에서 하루 동안 진탕배양하였다.

배양된 hACAT-1과 hACAT-2는 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여, 500xg에서 15분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저장완충액(hypotonic buffer)에서 급냉동 급해동 방법으로 세포를 깬 후 100,000xg 에서 한시간 동안 초원심분리하였다.

얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8㎎/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 사용 전까지 저온냉동기에 보관하였다.

2. ACAT 활성 측정

아세톤에 1㎎/㎖의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67㎕를, 아세톤중의 10% 트리톤(triton) WR-1339(Sigma Co.) 6㎕와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 얻어진 혼합물에 증류수를 가하여 콜레스테롤의 농도가 30㎎/㎖가 되도록 조절하였다.

10㎕의 콜레스테롤 수용액에, 10㎕의 1M KH₂PO₄(pH 7.4), 5㎕의 0.6mM 우혈청알부민(BSA; bovine serum albumin), 상기 1에서 얻은 10㎕의 마이크로좀 용액, 10㎕의 시료(마이라센 2, 마이라센 3) 및 45㎕의 증류수를 가하였다(총 90㎕). 혼합물을 37℃ 수욕에서 30분 동안 예비 반응시켰다.

10㎕의 (1-¹⁴C)올레일-CoA 용액(0.05 μCi, 최종 농도 : 10 μM)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 수욕에서 30분동안 반응시켰다. 여기에 500㎕의 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1(v/v)), 300㎕의 헵탄 및 200㎕의 0.1 M KH₂PO₄(pH 7.4)을 가하고, 혼합물을 볼텍스(vortex)로 격렬하게 혼합한 후, 상온에서 2분동안 방치하였다.

생성된 200㎕의 상층액을 신틸레이션 병에 넣고, 신틸레이션 액(Lumac) 4㎖을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량은 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기 (1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy, Finland)로 측정하였다.

ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 1분동안 단백질 1㎎ 당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였다.

결과는 표 1 및 표 2에 나타내었다.

마이라센 2의 ACAT에 대한 저해활성

효소원	IC50 (μM)
쥐간 ACAT	162
사람 ACAT-1	85
사람 ACAT-2	61

마이라센 3의 ACAT에 대한 저해활성

효소원	IC50 (μM)
쥐간 ACAT	150
사람 ACAT-1	72
사람 ACAT-2	54

표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 마이라센 2는 쥐간 ACAT, 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2에 대한 IC₅₀치가 각각 162 μM, 85 μM, 61 μM 이고, 마이라센 3은 쥐간 ACAT, 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2에 대한 IC₅₀치가 각각 150 μM, 72 μM, 54 μM 로 나타났다.

따라서, 본 발명의 마이라센 2 및 마이라센 3는 ACAT 활성을 효과적으로 억제함을 알 수 있고, 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

실험예 2 : 급성 독성실험

본 발명의 마이라센 2 및 마이라센 3의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하였으며, 군당 2마리씩 나누었다. 상기 실시예에서 얻어진 화합물(마이라센 2 및 마이라센 3)을 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 1g/㎏/15㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다.

시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 1000㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 1000㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 정제의 제조

본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3) 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 정제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 실시예의 화합물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후, 적합한 용적의 정제수를 첨가하고 분말로 과립화시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 얻었다.

상기 정제의 구성성분은 하기와 같다.

마이라센 2(또는 마이라센 3) 5.0㎎

락토오스 BP 150.0㎎

전분 BP 30.0㎎

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0㎎

스테아르산 마그네슘 1.0㎎

2. 캡슐제의 제조

본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3) 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 캡슐제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 실시예의 화합물을 일정량의 부형제 및 스테아르산마그네슘과 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 캡슐을 수득하였다.

상기 캡슐제의 구성성분은 하기와 같다.

마이라센 2(또는 마이라센 3) 5.0㎎

전분 1500 100.0㎎

스테아르산마그네슘 BP 1.0㎎

3. 주사액제의 제조

본 발명의 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2, 마이라센 3) 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 상기 실시예의 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 이어서 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로된 5㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 이어서 120℃로 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 얻었다.

상기 주사액제의 구성성분은 하기와 같다.

마이라센 2(또는 마이라센 3) 100㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1㎖

제제예 2 : 식품의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3)를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 0.2 ~ 10 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 0.2 ~ 1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 0.1 ~ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 0.1 ~ 1.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 0.1 ~ 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

마이라센 2(또는 마이라센 3)를 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 마이라센 2(또는 마이라센 3)의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%),

종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%),

마이라센 2(또는 마이라센 3)의 건조분말(1 중량%),

영지(0.5중량%),

지황(0.5중량%)

제제예 3 : 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82% 주입하여 마이라센 2(또는 마이라센 3)를 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 마이라센 2(또는 마이라센 3)를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

마이라센 2(또는 마이라센 3) 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명의 마이라센 2(또는 마이라센 3)는 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 활성을 효과적으로 억제하므로, 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소와 관련된 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (11)

1. 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 2).

   <화학식 1>
2. 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 하기 화학식 2로 표시되는 에노익산 아미드계 화합물(마이라센 3).

   <화학식 2>
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에노익산 아미드계 화합물은 반묘로부터 추출·분리·정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 에노익산 아미드계 화합물.
4. 1) 건조된 반묘 분말을 메탄올로 조추출하고, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 추출하는 단계, 및

   2) 상기 1)단계에서 얻은 추출물을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 제 1항 또는 제 2항의 에노익산 아미드계 화합물로 분리하는 단계로 이루어지는,

   제 1항 또는 제 2항의 에노익산 아미드계 화합물의 추출·분리·정제방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 2)단계는,

   (1) 상기 1)단계에서 얻은 에틸아세테이트 분획을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 분리하는 단계,

   (2) 상기 활성분획을 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 분리하는 단계,

   (3) 상기 활성분획을 다시 메탄올 수용액의 비율을 변화시켜가며 역상 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하는 단계, 및

   (4) 상기 활성분획을 다시 메탄올 용액의 비율을 변화시켜가며 고속 역상 크로마토그래피를 사용하여 분리하는 단계로 이루어지는,

   제 1항 또는 제 2항의 에노익산 아미드계 화합물의 추출·분리·정제방법.
6. 에노익산 아미드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 에노익산 아미드계 화합물은 제 1항의 마이라센 2 또는 제 2항의 마이라센 3인 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 심장순환계 질환은 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증인 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
9. 에노익산 아미드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 심장순환계 질환의 개선에 유용한 식품 조성물.
10. 제 9항에 있어서, 상기 에노익산 아미드계 화합물은 제 1항의 마이라센 2 또는 제 2항의 마이라센 3인 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환의 개선에 유용한 식품 조성물.
11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 심장순환계 질환은 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증인 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환의 개선에 유용한 식품 조성물.