KR20050036855A

KR20050036855A - 정상 재생조직의 형성방법과 정상 재생조직 및 감수성등의 검정방법

Info

Publication number: KR20050036855A
Application number: KR1020047005511A
Authority: KR
Inventors: 나카츠가와시게카즈
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2005-04-20
Also published as: NO20042015L; WO2003039611A1; JPWO2003039611A1; EP1444994B1; EP1444994A1; JP4183619B2; US20040241837A1; US20140147831A1; US8592176B2; EP1444994A4; KR100777993B1; DK1444994T3; US9695396B2

Abstract

장기유래의 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직에 방사선 조사하여 피더 레이어를 형성하고, 그 후 상피세포를 배양하여 이것을 중층화함으로써, 정상 재생조직을 형성하고, 또한 간편하고 또 확실하게 인간유래 정상조직을 베이스로 3차원 배양에 의한 재생조직을 실현하고, 그리고 이것에 의해서 각각의 재생조직을 각 장기의 모델로 하여 의약품 등의 화학물질의 작용이나 부작용의 검정시스템 또는 감수성 등의 검정을 위한 시스템으로 한다.

Description

정상 재생조직의 형성방법과 정상 재생조직 및 감수성 등의 검정방법{METHOD OF FORMING NORMAL REGENERATED TISSUE, THE NORMAL REGENERATED TISSUE, AND METHOD OF CALIBRATING SENSITIVITY AND SO ON}

본 출원의 발명은 정상 재생조직의 형성방법과 정상 재생조직 및 감수성 등의 검정방법에 관한 것이다.

뇌사 후 장기이식에서조차 지지부진하여 좀처럼 궤도에 오르지 못한 우리나라이지만, 이미 재생 의학의료에 대해서 주로 조직 간세포(TS)의 3차원 배양이 정착되어 있다. 또한, 배성 간세포(ES) 조차도 윤리적인 측면에서 한정된 형태이기는 하지만 응용되고 있다. 그러나, 이들 기술로는 이른바 기능을 충분히 발휘할 수 있는 재생장기를 만들기에는 아직까지 역부족인 것이 현실이다. 또한, 한편으로 제약메이커 각 사가 기대하는 게놈창약과 대치하는 형태로, 인간의 장기조직 뱅크를 창설하여 유지하는 움직임이 활발하다. 이와 같은 상황에 있어서, 종래보다는 간편하고 또 확실하게 인간유래 정상조직을 중층화하고 분화유도함으로써 재생조직을 형성하는 것에 대한 기대가 커서, 이것을 실현하는 것이 중요한 과제가 되어 있다. 각각의 재생조직을 각 장기모델로 함으로써, 의약품을 중심으로 한 화학물질의 작용, 부작용의 검정 시스템 또는 감수성 예지 시스템을 구축하는 것이 가능해지기 때문이다.

현상황의 약제작용이나 감수성 예지 시스템에 대해서 개관하면, 예컨대 콜라겐 겔에 의한 HDRA(Histoculture Drug Response Assay)가 비교적 유효한 것으로서 알려져 있다.

그러나, HDRA에는 여전히 임상적으로 약 60% 미만의 true positive rate 밖에 없다는 결점이 있다. HDRA는 true negative rate가 80% 이상으로 되어 있으므로, 미국에서도 HDRA는 효과가 없는 항암제를 판단하기 위해서만 메디케어에서 채용되고 있다. 즉, 가장 효과적인 약제를 선택할 수 있는 오더메이드 의료로서 인지되어 있다고는 말하기 어렵다. 그럼에도, 우리나라에서는 고도 선진의료로서 인식되어 있지만, 약 50%의 확률만으로 유효약제를 선택할 수밖에 없다는 사실에 많은 임상의들은 만족하고 있지 않다.

그리고, 정상조직의 부작용을 동시에 예측하는 것도 불가능하다.

또한, HDRA법 이외의 방법으로는 CD-DST(Collagen gel droplet embedded culture sensitivity test)가 알려져 있다. 그러나, 이 방법에 있어서는 True positive rate는 70~83%로 현저하게 향상되어 있지만, 암세포의 증식불량율(대조군에서도 증식하지 않음)이 25%를 초과하고, 오염률과 합하여 30% 이상이 실패로 끝난다는 중대한 결점이 있다. 즉, 이 2개의 비율을 곱하면 결국 60% 미만의 환자에게서만 감수성을 예측할 수밖에 없다. 또한, 난소암에서의 데이터로부터는 조직형태에 따라 예측이 달라질 가능성이 시사되어 있다. 또한, 이 방법에서도 정상조직의 부작용의 강도는 예측할 수 없다.

따라서, 종래의 암치료 감수성 시험에서는 암세포, 암조직의 치료에 대한 감수성을 검토할 수 있어도, 정상조직의 부작용을 동시에 검정할 수 없었다. 효과가 높고, 부작용이 적은 것을 선택한다고 하는 테라메이드 암치료의 이상과는 거리가 멀다.

예컨대, 이상과 같은 현상황으로부터도 의약품의 작용이나 감수성 예지 등에 대해서, 종래에서는 상정할 수 없었던 고레벨의 검지, 평가를 위한 시스템을 재생조직에 의해서 실현하는 것이 초미의 과제로 되어 있다.

그래서, 본 출원의 발명은 이상과 같은 종래기술의 한계와 과제를 극복하고, 간편하고 또 확실하게 인간유래 정상조직을 베이스로 하여 3차원 배양에 의한 재생조직을 실현하는 것, 그리고 이것에 의해서 각각의 재생조직을 각 장기의 모델로 하여 의약품 등의 화학물질의 작용이나, 부작용의 검정 시스템 또는 감수성 등의 검정을 위한 시스템을 구축하기 위한 방책을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

도 1은 본 출원의 발명의 방법을 예시한 개요도이다.

도 2는 도 1의 프로세스에 부가되는 방법을 예시한 개요도이다.

도 3은 실시예 1에 있어서, 정상폐선유아세포와 혈관내피세포의 공배양에서 X선 20Gy 조사 전의 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 4는 상기 조사 후 24시간에서 기관상피세포를 배양하여 24시간 후의 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 5는 1주일 후의 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 6은 부분적이지만, 4층 이상으로 중층화된 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 7은 본 발명의 방법에 의한 정상 재생조직에 있어서의 재생기관지 상피세포를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 8은 X선 10Gy 조사 3일 후의 재생기관지 상피세포를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 9는 X선 20Gy 조사 3일 후의 재생기관지 상피세포를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 10은 본 발명의 방법에 의해 형성된 재생기관지 상피세포층에 콜라겐 겔을 보충하고, 그 위에 인간 폐암유래 AOI 세포를 이식한지 3일 후의 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 11은 도 10의 경우와 동일하게 하여 이식한지 3시간 후에 20Gy X선을 조사하고, 그 직후의 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 12는 도 11의 경우에 있어서, 조사 3일 후의 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 13은 도 12의 경우에 있어서, X선을 10Gy에서 조사했을 때의 상태를 나타낸 현미경사진 도면이다.

도 14는 실시예 2에 있어서, 중층화된 위장근위 요세관 상피세포(RPTEC)의 경우의 현미경사진 도면이다.

도 15는 중층화된 메산지움세포(MHMC)의 경우의 현미경사진 도면이다.

도 16은 중층화된 전립선 상피세포(PrEC)의 경우의 현미경사진 도면이다.

도 17은 중층화된 신경전구세포(NHMP)의 경우의 현미경사진 도면이다.

도 18은 중층화된 인간 간세포(NHeps)의 경우의 현미경사진 도면이다.

도 19는 중층화된 유선상피세포(HMEC)의 경우의 현미경사진 도면이다.

도 20, 도 21, 도 22 및 도 23은 각각 MTTassay에 의한 암치료 감수성 시험의 결과를 상기 중층화된 NHMP, PrEC, NHMC, PRTEC의 경우에 대해서 예시한 도면이다.

도 24, 도 25, 도 26, 도 27, 도 28 및 도 29는 실시예 3에서, 중층화된 NHBE에 있어서, 피더 레이어가 SuSa(피부유래)인 경우, 암치료 감수성 MTTassay의 결과를 예시한 도면이다.

도 30 및 도 31은 증층화된 NHBE에 있어서, 피더 레이어가 NHLF(폐유래)인 경우의 암치료 감수성 MTTassay의 결과를 예시한 도면이다.

도 32, 도 33 및 도 34는 중층화된 PrEC에 있어서, 피더 레이어가 SuSa(피부유래)인 경우의 암치료 감수성 MTTassay의 결과를 예시한 도면이다.

도 35는 실시예 4에 있어서, PrEC에 대해서 콜라겐만을 첨가하여 중층화 재생시킨 경우의 현미경사진 도면이다. 한편, 도 36은 콜라겐을 사용하지 않고 피브로넥틴만을 사용한 경우의 현미경사진 도면이다.

도 37은 실시예 5에 있어서, 인간 피부유래의 선유아세포의 피더 레이어 상에 NHDF-Ad:인간 피부각화세포를 중층화 재생시킬 때에, 콜라겐에 피브로넥틴과 라미닌을 1:1 및 1:2의 비율로 첨가한 경우의 현미경사진 도면이다.

도 38a 및 38b은 콜라겐 겔만의 경우로, 피브로넥틴:라미닌을 2:1의 비율로 첨가한 경우의 결과를 나타낸 현미경사진이다.

도 39는 실시예 6으로서, 중층화 재생된 NHDF-Ad에 있어서 인간 악성 흑색종유래 SK-Me126 세포의 침윤능 시험을, 콜라겐과 함께 피브로넥틴과 라미닌을 첨가하여 행한 경우의 결과를 예시한 현미경사진이다.

도 40a 및 40b, 도 41a 및 41b 및 도 42a 및 42b는 실시예 7에서 PrEC 배양 중층화에 있어서, 콜라겐으로의 피브로넥틴과 라미닌의 첨가효과를 케이스 1~12로서 예시한 현미경사진이다.

도 43 및 도 44는 실시예 8로서 중층화 재생시킨 인간 위장근위 요세관 상피세포(RPTEC) 및 메산지움세포(NHMC) 각각에 대해서 인간 위암유래 ACHN-L4 세포에 의한 감수성 시험결과를 도시한 것이다.

도 45는 중층화 RPTEC에 대해서 피부 각화세포유래 NHDF-Ad 세포의 배양상청의 첨가효과를 예시한 도면이다.

도 46a, 46b 및 46c는 상기 경우의 감수성 변화를 예시한 현미경사진 도면이다.

본 출원의 발명은 상기와 같은 특징을 가진 것이지만, 이하에 그 실시형태에 대해서 설명한다.

우선, 본 출원의 발명의 배경에 대해서 약간 설명하면, 1970년대 이후, 특히 암의 전이연구 등을 통해서 MD 앤더슨 암센터의 J.Fidler 교수 등에 의해서, 이른바 동소성 이식의 의의가 설명되어 세계를 석권하여 왔다. 즉, 폐에는 폐특유의 증식인자, 사이트카인 등 액성 인자에 의한 항상성 유지와 세포상호 접착에 의해서 생기는 환경이 있다. 따라서, 「폐유래의 예컨대 선유아세포 등 각각의 세포는 그와 같은 환경 하에서 가장 그 본래의 형질을 나타낼 수 있다」라는 것이 시사되어 있다. 최근에는, 그의 그룹은 각 장기유래의 선유아세포는 각각 특유의 돌연변이를 일으키고 있어 상이하게 된다는 보고까지 하고 있다. 그렇다고는 하나, 이것은 널리 받아들여지고 있는 것은 아니다. 그러나, 최근에는 계대(繼代)에 의해 피부의 선유아세포에서는 p16의 유도가 보이지 않지만, 폐의 선유아세포에서는 p16의 유도가 보인다는 보고가 있다.

이와 같은 배경에 대해서도 고려하면서, 본 출원의 발명은, 종래의 3차원 배양이 내재성 바이러스가 존재하는 마우스 유래의 NIH3T3 세포를 피더 레이어(FL)로서 사용하거나, 보편적 세포외 매트릭스인 콜라겐 겔만을 사용하는 방법에 비해서 매우 효율적인 신규 3차원 배양법을 제공한다. 그 특징으로는, 상기 동소성 이식의 특성을 살리면서, 생체 내에서는 암세포만이 정상조직없이 존재하는 것은 있을 수 없다는 사실이나, 또는 조사를 받은 세포, FL로부터의 유전자 발현 프로파일로의 노이즈가 거의 없다는 점, 암세포는 그렇다 하고 정상(상피)조직은 통상 겔상에서는 중층화한 증식을 하기 어렵다는 점, 조사를 받은 세포, FL의 MTTassay 상의 노이즈도 무시할 수 있다는 점 등의 특징을 살리고 있다.

즉, 본 출원의 발명에서는 장기유래의 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직에 방사선을 조사하여 피더 레이어를 형성하고, 그 후 상피세포를 배양하여 이것을 중층화하는 것을 특징으로 하고, 이 경우의 결합직 또는 지지조직은 당연하게도 증식인자, 사이트카인 등을 생산하는 모지이다.

결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직의 역할을 부여하기 위한 대표적인 것으로는 장기유래의 선유아세포, 내피세포 및 그들의 구성조직 중 어느 하나의 것이 예시된다. 그 중에서도, 본 발명에서는 선유아세포와 혈관내피세포를 예시할 수 있다. 그 외로는 각종의 것이 고려되지만, 예컨대 신경교세포, 평활근세포나 심근 등의 근육 등을 예시할 수 있다.

그리고, 특히 본 출원의 발명에 있어서는, 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직과 상피세포는 유래하는 장기가 피부, 위장, 기관지, 신경 등의 동일한 장기라는 동소성을 갖고 있는 것이 하나의 중요한 형태이다. 이 동소성에 의해서 상피세포의 중층화는 매우 효율적으로 실현되게 된다.

또한, 본 출원의 발명에서는 보다 구체적으로도 배지에서 장기유래의 선유아세포 상에 혈관내피세포를 배양한 후에 방사선을 조사하여 피더 레이어를 형성하고, 그 후 상피세포를 배양하여 그것을 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을 제공한다.

본 출원의 발명의 방법에 있어서는, 상피세포를 배양한 후에 세포외 매트릭스의 1종 이상을 첨가하여 상피세포를 중층화하며, 예컨대 세포외 매트릭스로는 세포외 기질의 구성요소 또는 접착성 분자를 사용하고, 보다 구체적으로 예시하면, 예컨대 세포외 매트릭스는 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌 및 테네스틴 중 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또, 각 장기유래의 증식인자를 첨가함으로써 중층화 효율이 더욱 향상된다.

또한, 상피세포를 배양한 후에 콜라겐 또는 콜라겐과 피브로넥틴 및 라미닌을 첨가하여 상피세포를 중층화하는 것이나, 방사선이 X선 또는 γ선인 것을 바람직한 형태로 하고 있다. 또한, 결합직 또는 구성세포 또는 지지조직을 동소성을 갖는 장기유래의 별종의 구조세포 및 그 배양상청 중 1종 이상과 함께 공배양한 후에 방사선 조사하여 피더 레이어를 형성하는 것이나, 동소성을 갖는 장기유래의 별종 구조세포, 상피세포 및 그들의 배양상청 중 1종 이상과 함께 공배양하여 중층화하는 것, 그리고 상피세포의 중층화는 탄산가스 농도 5~15%, 대기농도 85~95%로 하고, 20~40℃의 온도범위에서 행하는 것도 바람직하다.

이상과 같은 본 출원의 발명의 방법에 의하면, 장기유래의 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직으로부터의 피더 레이어에 중층화된 상피세포층을 갖고 있는 정상 재생조직이 얻어지게 된다.

이 경우의 상피세포는 각종의 것이어도 좋고, 예컨대 신경, 구강점막, 피부, 기관지, 유선, 간장 또는 위장 등의 각종의 장기유래의 것이 예시된다.

중층화는 본 출원의 발명에 의하면 3층, 4층 그리고 5층 이상의, 즉 약 4층 이상의 것이 입수용이하게 된다. 그리고, 얻어진 정상 재생조직은 기판 상에 배치하여도 좋고, 배지 또는 배양액이 이것에 접하여 유통하는 것이나 재생장기 모델체로 하는 것 등이 가능하다.

그리고, 본 출원의 발명에 의하면, 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중층화된 상피세포층에 암세포를 배양하고, 화학물질의 첨가나 방사선 조사에 의해 암세포의 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법이나, 이것을 구체화한 저산소화 상황에서 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법, 암세포를 배양한 후에 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 보충하거나, 또는 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 보충한 후에 암세포를 배양하고, 이어서 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법이 실현된다.

또한, 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중층화된 상피세포층에 암세포를 배양하고, 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 보충하고, 그 위에 혈관내피세포를 배양하고, 화학물질의 첨가에 따른 암세포의 혈관신생능을 검정하는 것을 특징으로 하는 혈관신생능의 검정방법이나, 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중복화된 상피세포에 암세포를 배양하고, 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 적재하여 전체를 상하 역전시킴으로써, 전이 또는 침윤능을 검정하는 것을 특징으로 하는 전이 또는 침윤능 검정방법, 정상 재생조직에 대해서 화학물질의 첨가나 방사선 조사에 의해 정상 재생조직의 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성의 검정방법, 정상 재생조직에 있어서 유전자 도입의 효율을 검정하는 방법 등이 실현되게 된다.

본 출원의 발명은 상기 과제를 해결하는 것으로서, 제1로는 장기유래의 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직에 방사선 조사하여 피더 레이어(feeder layer)를 형성하고, 그 후 상피세포를 배양하여 이것을 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을 제공하고, 제2로는 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직과 상피세포가 유래장기의 동소성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제3으로는, 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직은 장기유래 선유아세포, 내피세포 및 그들의 구성조직 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제4로는 배지에서 장기유래의 선유아세포 상에 혈관내피세포를 배양한 후에 방사선 조사하여 피더 레이어를 형성하고, 그 후 상피세포를 배양하여 이것을 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을 제공한다.

또한, 제5로는 상피세포를 배양한 후에 세포외 매트릭스의 1종 이상을 첨가하여 상피세포를 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제6으로는 세포외 매트릭스는 세포외 기질의 구조요소 또는 접착성 분자인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제7로는 세포외 매트릭스는 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌 및 테네스틴 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법, 제8로는 상피세포를 배양한 후에 콜라겐 또는 콜라겐과 피브로넥틴 및 라미닌을 첨가하여 겔화하고, 상피세포를 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제9로는 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직을 동소성을 갖는 장기유래의 별종의 구성세포 및 그 배양상청 중 1종 이상과 함께 공배양한 후에 방사선 조사하여 피더 레이어를 형성하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제10으로는 동소성을 갖는 장기유래의 별종의 구성세포, 상피세포 및 그들의 배양상청 중 1종 이상과 함께 공배양하여 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제11로는 방사선이 X선 또는 γ선인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을, 제12로는 탄산가스 농도를 5~15%, 대기농도를 85~95%로 하고, 20~40℃의 온도범위에서 배양하여 상피세포를 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법을 제공한다.

또한, 본 출원발명은 제13으로는 장기유래의 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직으로부터의 피더 레이어에 중층화된 상피세포층을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을 제공하고, 제14로는 상피세포층은 신경, 구강점막, 피부, 기관지, 유선, 간장, 또는 위장유래의 것인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을, 제15로는 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직과 상피세포가 유래장기의 동소성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을, 제16으로는 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직은 장기유래 선유아세포, 내피세포 및 그들의 구성조직 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을, 제17로는 피더 레이어층이 장기유래 선유아세포와 혈관내피세포로 구성되고, 피더 레이어층 상에는 중층화된 상피세포층이 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을 제공하고, 제18로는 상피세포가 약 4층 이상 중층화되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을 제공한다.

제19로는, 상기 어느 하나의 정상 재생조직이 기판 상에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을 제공하고, 제20으로는, 배지 또는 배양액이 정상 재생조직에 접하여 유통하도록 되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을, 제21로는 정상 재생조직의 복수의 것이 배지 또는 배양액의 유통로로 통과되는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을, 제22로는 정상 재생조직이 재생장기 모델체를 구성하고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직을 제공한다.

그리고, 본 출원의 발명은, 제23으로는 상기 어느 하나의 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중층화된 상피세포층에 암세포를 배양하고, 화학물질의 첨가나 방사선 조사에 의해 암세포의 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법을 제공하고, 제24로는 저산소화 상태에서 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법을, 제25로는 암세포를 배양한 후에 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중의 1종 이상을 보충하거나 또는 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 보충한 후에 암세포를 배양하고, 이어서 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법을 제공한다.

제26으로는, 본 출원의 발명은 상기 어느 하나의 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중층화된 상피세포층에 암세포를 배양하고, 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 보충하고, 그 위에 혈관내피세포를 배양하고, 화학물질의 첨가에 따른 암세포의 혈관신생능을 검정하는 것을 특징으로 하는 혈관신생능의 검정방법을 제공한다.

제27로는, 상기 어느 하나의 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중복화된 상피세포에 암세포를 배양하고, 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 적재하여 전체를 상하 역전시킴으로써, 전이 또는 침윤저해제의 작용평가 등을 위해 전이 또는 침윤능을 검정하는 것을 특징으로 하는 전이 또는 침윤능의 검정방법을 제공한다.

제28로는, 상기 어느 하나의 정상 재생조직에 대해서, 화학물질의 첨가나 방사선 조사에 의해 정상 재생조직의 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법을 제공한다.

제29로는, 상기 어느 하나의 정상 재생조직에 있어서 유전자 도입의 효율을 검정하는 것을 특징으로 하는 유전자 도입의 검정방법을 제공한다.

제30으로는, 재생 상피세포의 증식을 억제하기 위해서 조사하는 방사선은 X선 또는 γ선인 것을 특징으로 하는 상기 어느 하나의 방법을 제공한다.

이하에, 첨부된 개요도면을 참고하면서, 발명의 실시예에 대해서 예시설명한다.

<실시예 1>

예컨대, 감수성 검정을 위한 시스템에 관해서는 6공, 12공, 24공 접시 등 다공접시를 사용할 수 있다. 우선, 목적으로 하는 장기유래의 선유아세포 및 혈관내피세포를 수술의 적출조직으로부터, 세포 1개 1개까지 제각기 흩어짐이 없을 정도의 마일드한 콜라게나제, 트리푸신 처리 후, 모노클로날 항체, 유세포 분류기 등을 사용하여 동정분리한다. 그리고, 도 1에 예시하듯이, 예컨데 15% 우배아 혈청첨가 유지배지(1)에서, 예컨대 약 0.5×10⁵개/㎠의 선유아세포(비율 10)(2) 상에 혈관내피세포(비율 1의 비율로)(3)를 배양하고, 예컨대 그 후 약 6~24시간 이내에 선유아세포의 증식을 억제시키면서, 약 2주간 이상 베이스로서의 조직구축을 유지하기 위한 프리컨디션닝 선량(20Gy 이하)의 X선(4)을 조사하여 FL(5)을 작성한다.

이 FL(5) 상에, 예컨대 동일 적출조직으로부터 마일드한 분산처리에 의해 분리한 상피세포층(약 1.0×10⁵개/㎠)(6)을 배양한다. 상피세포(6)는 3차원으로 중층화하여 재생 상피(7)가 된다. 공여자가 고령이거나, 고도 흡연력 등 상피의 증식능이 낮을 가능성이 있는 경우 등은 그 위부터 멸균한 후, 빙온 부근까지 냉각한 액상 상태[비교적 낮은 온도의 각종 증식인자를 첨가한 배지(유지배지보다도 증식인자는 약 1/2 이하로 저농도로 함)로 희석하여 작성함]에서, 콜라겐(8)을 적재한 후, 온도를 예컨대 37℃로 상승시켜 겔화한다. 재생조직을 유지하는 경우, 통상보다도 탄산가스 농도를 약간 더 올리고, 예컨대 10%로 하고, 대기를 90%로 하고, 37.0℃에서 배양한다. 탄산가스의 농도는 5~15%, 대기는 85~95% 정도가, 또 온도는 20~40℃가 고려된다. 그 사이, 예컨대 주 3회 배지교환을 행한다. 약 2주간 이내에 약 4층 이상, 즉 4층 또는 3층 이상으로 하는 형태로 중층화한 단계에서 정상조직으로의 주작용, 부작용 또는 독성을 각 농도의 각각의 조합의 약물처리 후, 또는 방사선 조사 후 약 수~24시간 이내에 MTTassay나 유전자 발현 프로파일, 단백질 프로파일 등을 사용하여 검토한다.

표 1은 중층화의 전단계에서의 사용이 고려되는 NHBE(예컨대, 유선상피나 기관지상피용)과 고인자 NHBE(기관지상피 등의 특별한 증식촉진용) 및 중층화 시에 사용이 고려되는 유지배지의 조성에 대해서 예시한 것이다.

	유지배지 총량 420ml	NHBE	고인자 NHBE
F-12	100ml/420ml
트랜스페린	5.0㎍/ml	10㎍/ml	10㎍/ml
인슐린	5.0㎍/ml	5㎍/ml	5㎍/ml
하이드로코르티존	0.4㎍/ml	0.5㎍/ml	5.0㎍/ml
트리요오도티로닌	2×10^-9M	6.51×10^-9M	6.51×10^-9M
h-EGF	0.05㎍/ml	0.005㎍/ml	0.05㎍/ml
콜레라톡신	1×10^-9M		1×10^-9M
BSA-FAF		0.02mg/ml	0.02mgml
BPE		7.5㎍/ml	7.5㎍/ml
에피네프린		0.5㎍/ml	0.5㎍/ml
레틴산		0.1㎍/ml	0.1㎍/ml
GA-1000		겐타마이신50㎍/ml암포테리신 B0.05㎍/ml	겐타마이신50㎍/ml암포테리신 B0.05㎍/ml
CaCl₂
BSA
아스코르브산
FCS
FBS	5%

그리고, 본 출원의 발명에서는 특징이 있는 3차원 배양에 의해 구축되는 정상 재생조직 패널 또는 칩, 재생장기 모델체도 제공된다.

경질유리, 석영 등의 기판 상에 상기 재생조직을 형성하고, 또 그 배양액이 유통되도록 한다. 복수 종의 정상 재생조직을 배양액의 유로로 하여 연통해도 좋다. 또한, 패널 또는 칩의 경우에는 미리 기판표면에 라미닌, 피브로넥틴 등의 기질을 코팅하여 두는 것도 고려된다.

실제로, 발명자에 의해서 표 2와 같은 종류의 장기유래의 정상 재생조직이나, 신경, 피부, 유선, 간장, 위장 등 유래의 정상 재생조직의 구축이 가능한 것이 확인되어 있다.

기관ㆍ기관지1) 점막ㆍ상 피: 무선모세포, 선모세포, 배세포, 기저세포, 신경분비세포, 중간세포ㆍ고유층: 교원선유, 탄성선유, 선유아세포, 모세혈관ㆍ점막하조직2) 기관선(기관지선)ㆍ점액세포, 장액세포3) 종말세기관지ㆍ선모세포, 클라라세포 폐포1) 페포중격ㆍ지지조직, 탄력선유, 교원선유, 격자형상 선유, 평활근ㆍ페포중내에서 보이는 세포: 간질세포(중격세포), 선유세포, contractile interstitial cell, 식세포, 비만세포, 혈액유래의 것2) 페포공3) 모세혈관: 모세혈관강, 내피세포, 주피세포4) 페포상피세포ㆍI형 폐포상피세포(편평 폐포상피세포)ㆍII형 폐포상피세포(대형 폐포상피세포)ㆍ페포쇄자세포

각각의 패널 또는 칩을 조직 또는 장기 모델로 하고, 약제 등 화학물질, 또는 호르몬 등의 추출물질도 포함하여 주작용, 부작용을 검출하기 위한 수단으로서 확립할 수 있다. 현재까지, 상업적으로 입수한 기관지, 유선, 전립선, 간장, 신경이나 동일한 토대로 하여 입수한 세포로서의 병례유래 피부, 두경부 점막 등의 3차원 배양을 시험하여 각각의 장기유래 조직 모두의 재생조직의 확립에 성공하였다. 또한, 심장, 간장 등도 포함하여 약제 등의 표적 장기 모두를 망라하여 약제의 주작용, 부작용을 검정하는 패널로서 응용할 수 있게 된다. 물론, 제암제의 감수성 시험을 위한 수단으로서도 응용할 수 있다.

각각의 패널 또는 칩용 배지를 혼합함으로써, 내분비 호르몬계나 오토클라인이나 파라클라인 증식인자는 말할 필요도 없이 가까운 장래, 신경도 포함하여 인간에게 우수한 화학물질의 검정 시스템으로서 도움이 되게 된다.

예컨대, 항암제나 각종 분할법에 의한 방사선 치료 등과의 조합하여 감수성을 조절할 경우에는, 도 1에도 예시하였듯이, 상기 중층화한 재생 상피(7)에 그 증식을 억제하기 위해 20Gy 이하의 X선 또는 γ선(9)을 조사하여 새롭게 FL로 한 후, 수술조직으로부터 분리하여 1~3mm각으로 얇게 절단하고, 상기 FL의 컨디션배지에서 작성한 콜라겐 겔 중에서 유지하여 있던 암세포(약 1000개/㎠의 농도)(10) 또는 정상선유조직이나 혈관 등 종양간질을 함유하는 조직을 배양한다. 그리고, 배지를 증식인자를 가능한 한 저농도로 한 배지로 치환하고, 예컨대 약 12~24시간 후에 상기 각종의 처리를 행한 후, 약 48~96시간에서 MTTassay나 약 6~48시간 후에 유전자 발현 프로파일, 단백질 프로파일 등을 사용하여 검토한다. 암세포(10)를 배양한 경우에는 필요에 따라서 콜라겐 겔을 보충하고, 화학물질의 첨가나 방사선 조사(11)에 의해서 암세포의 감수성을 검정할 수 있다. 또한, 콜라겐 겔 상에 3차원적으로 암조직이 3~5mm각 이상으로 증식한 것을 확인가능한 단계에서, 그 위부터 콜라겐을 더 적재하여, 저산소 상태에 가까운 환경을 작성하여 혈관내피세포를 콜라겐 겔의 외측에 배양하고, 혈관신생 저해제를 검정할 목적으로, 개개의 암종의 혈관신생능의 검토에 응용할 수 있다. 또한, 배양계에서 저산소 상태를 형성하는 방법으로는, 선회배양 등으로 암세포군이 「마리모」와 같이 구형상으로 증식하는 스페로이드의 경우가 알려져 있다. 이 경우, 약 200~400마이크론 이상의 직경으로 이루어지면, 중심부에 저산소 상태를 형성한다. 이와 같은 지견으로부터, 본 출원의 발명에서도 동일하게 겔로 둘러싸인 암조직이 3차원적으로 증식되어, 중심부에 저산소상태를 형성할 수 있다. 또한, IV형 콜라겐 등으로 작성한 겔을 적재하고, 상하를 반전하면 전이 또는 침윤 저해제의 검정을 위한 침윤능을 검토하는 시스템으로서 응용할 수 있다.

암세포의 감수성의 검정과는 별도로, 예컨대 도 2에 나타내었듯이, 중층화된 상피세포층에 콜라겐 겔(12)을 보충하고, 그 위에 암조직(13)을 배양하고, 이어서 화학물질이나 방사선 등에 대한 암조직의 감수성을 검정할 수 있다.

한편, 도면에 나타낸 중층화한 상피세포(7)층을 갖는 정상 재생조직에 대해서는 필요에 따라서 콜라겐 겔(12)을 보충하고, 화학물질이나 방사선 등에 대한 정상조직의 감수성을 검정할 수 있게 된다.

그리고, 본 출원의 발명에 의한 의약품의 주작용과 부작용의 검정에 관해서는 건강인 유래의 정상 재생조직과 함께 오히려 생활습관병 등의 병태가 있는 정상 재생조직(암이 없다는 의미로)을 사용하는 것에 의의가 있는 것이 고려된다. 실제, 당뇨병 등의 병례에 대한 주작용ㆍ부작용의 검정계로서 바람직하다.

예컨대, 이상 예시한 바와 같은 본 출원의 발명의 방법에서는, 종래의 콜라겐 겔에 의해 HDRA(Histoculture Drug Response Assay)나 CD-DST가 여전히 임상적으로는 약 60% 미만의 true positive rate 밖에 없다는 결점을 충분히 보충하여 true positive rate를 향상시킬 수 있다. 가장 효과적인 약제를 선택할 수 있는 오더메이드 의료로서 인지되어 있다고는 말하기 어렵고, 약 50%의 확률만으로 유효약제를 선택할 수밖에 없다는 사실에 많은 임상의들은 만족하고 있지 않은 HDRA나 CD-DST에 대해서, 본 출원의 발명에 의하면 외래성의 배지 중의 증식인자를 저농도로 억제하고, 개개의 병례로부터의 정상조직을 사용하여 정상조직으로의 부작용과, 정상조직과 공존하는 암조직의 감수성을 동시에 검출가능하고, 이른바 오더메이드 암치료를 실현하게 된다. 또한, 이 방법은 재생조직 또는 장기를 TS 이외의 간세포로부터 작성하는 경우에, 분화유도를 약제나 외래 생물학적 인자를 과잉으로 첨가하지 않고도 작성하는 방법으로도 응용할 수 있다.

또한, 본 출원의 발명은 유전자치료의 인비트로 검정계로서도 유용하다. 유전자 도입의 효과 등은 종래 2차원 배양계에서 검정되고 있었지만, 이것에는 큰 제약이 있다. 실제 장기의 모델로서의 본 출원의 발명의 재생조직은 3차원성을 갖는 것으로서 의의가 있는 것이다.

또한, 정상조직의 3차원 배양에는 점막하층에 많은 선유아세포의 증식이 압도적으로 빠르기 때문에, 이 조직레벨에서의 배제를 고려할 필요가 있고, 예컨대 이하의 조작이 전제로서 고려된다.

1. 수술시, 또는 생검시, 채취된 조직점막 등을 항생물질액(페니실린 G100유니트/ml, 카나마이신 0.1mg/ml, 펀지존(fungizone) 0.25㎍/ml를 함유함)을 함유하는 인산완충 생리식염수(Ca이온, Mg이온 비함유)로 잘 세정한다.

2. 분산제(100유니트/ml)를 함유하는 DME(FCS 함유)로 4.0℃ 이하에서 약 24시간 처리한다.

3. 그 후, 상피층과 점막하층을 물리적으로 분리한다.

4. 상피층만 트립신(0.25% 및 0.05% EDTA 함유(트립신의 효과가 나쁜 경우만)) 용액 중에서 30분간 처리한다.

5. 마그네틱 교반기를 사용하여 교반하여 상피세포를 분리한다.

6. 나일론 메시에 여과시켜 상피세포를 추출한다.

7. 마찬가지로 점막하층으로부터 혈관내피세포, 선유아세포 콜라게나제 용액 등을 사용하여 분리한다.

8. 상기에서 얻은 세포를 모노클로날 항체 표식에 의해 더 분류하여 각각의 분획을 단리한다.

9. 혈청을 포함하여 증식인자 등 첨가인자를 1/10으로 내리거나 또는 무혈청배지 중에서 3일간 배양함으로써 선유아세포의 증식을 억제한다.

암조직의 3차원 배양에 반입하기 쉬운 조직레벨에서의 검토에서는 상기와 같이 적출암조직으로부터 조직간질을 함유하는 1~3mm각의 암조직을 작성하고, 다공배양접시 내에서 콜라겐 겔 상에 적재하고, 정상조직의 3차원적 배양이 4층 이상으로 달할 때까지 기다리는 것이 바람직하다.

또한, 인간장기유래의 세포(조직)에 대해서는, 예컨대 다음의 표 3, 표 4의 것이 시판품으로서 입수가능하다.

	회사명	세포제품번호	기초배지제품번호	첨가인자제품번호
기관지상피	Sanko Junyaku Co. Ltd.(Clontics)	CC-2540	CC-3119	CC-4124
세기관지상피	상동	CC-2547	CC-3119	CC-4124
전립선상피	상동	CC-2555	CC-3165	CC-4177
유선상피	상동	CC-2551	CC-3151	CC-4136
폐미소혈관내피	상동	CC-2527	CC-3156	CC-4147
인간 간세포	Asahi Techno Glass Co.,Ltd.(Clontics)	CC-2591	CC-3198
인간 신경망포세포	상동	CC-2599	CC-3209	CC-4123
인간 근위요세관정맥내피세포	상동	CC-2553	CC-3190
인간 피부유래 선유아세포	이시자키 료지	SuSa	DulbeccoMEM	10% FBS
인간 폐유래선유아세포	Asahi Techno Glass Co.,Ltd.(Clontics)	Normal Imgfibroblast
		CC-2512	CC-3131	CC-4123
인간 제대정맥내피세포	상동	HUVEC	CC-3156	CC-4176
		CC-2517	-

세포명	세포제품번호
기관지상피(NHBE)	CCS-2540
폐미소혈관내피	CCS-2527
페섬유아세포(NHLF)	CCS-2512
소기도(SAEC)	CCS-2547
전립선상피(PrEC)	CCS-2555
유선상피(HMEC)	CCS-2551
위장근위 요세관 상피세포(RPTEC)	CCS-2553
메산지움세포(NHMC)	CCS-2559
신경전구세포(NHMP)	CCM-2599
인간 간세포(Nheps)	CCS-2591

이들 세포에 대해서 본 출원의 발명에서는 시료로서의 사용이 고려되고 있다. 물론, 이상 예시한 것에 한정되는 것은 아니다.

첨부한 도 3, 도 4, 도 5 및 도 6은 시판의 인간유래의 정상조직에 대해서 3차원의 배양을 검증한 결과를 예시한 사진이다. 이들 사진은 다음의 것을 나타내고 있다.

도 3: 정상폐선유아세포와 혈관내피세포의 공배양에서 X선 20Gy 조사 전의 것

도 4: 상기 조사 후 24시간에서 기관상피세포를 배양하여 24시간 후

도 5: 1주 후

도 6: 부분적이지만, 4층 이상으로 중층화한 것

이상의 예로부터는, 본 출원의 발명의 정상 재생조직의 형성이 확인된다.

또한, 도 7, 도 8 및 도 9는 이하의 것을 나타낸다:

도 7: 본 발명의 발명에 의한 정상 재생조직에 있어서의 재생기관지 상피세포

도 8: X선 10Gy 조사 3일 후의 재생기관지 상피세포

도 9: X선 20Gy 조사 3일 후의 재생기관지 상피세포

이들 사진으로부터 명백해 지듯이, X선에 대한 정상세포조직의 감수성을 검정하는 것이 가능한 것을 알 수 있다.

또한, 도 10, 도 11, 도 12 및 도 13은 이하의 것을 나타내고 있다.

도 10: 본 발명의 방법에 의해 형성된 재생기관지 상피세포층에 콜라겐 겔을 보충하고, 그 위에 인간 폐암유래 AOI 세포를 이식한지 3일 후의 상태

도 11: 도 10의 경우와 동일하게 하여 이식한지 3시간 후에 20Gy X선을 조사한 직후의 상태

도 12: 도 11의 경우에 있어서, 조사 3일 후의 상태

도 13: 도 12의 경우에 있어서, X선을 10Gy에서 조사했을 때의 상태

이상의 도 10~도 12에 의해서, 폐암세포의 X선 조사에 대한 감수성과, X선 조사에 의한 항암작용에 대해서의 검정이 가능한 것을 알 수 있다. 제암제에 대해서도 동일하게 하여 검정가능하게 된다.

<실시예 2>

상기와 동일하게 하여 각종의 인간 장기유래의 재생조직을 형성하고, 이것을 암치료 감수성 시험에 제공하였다.

1. 점막시트의 작성

1. 1. SuSa(Feeder Layer)의 조정

피더 레이어로서 SuSa(인간 선유아세포)를 사용하였다. 배지에는 10% Foetal calf Serum(SIGMA CHEMICAL CO., LTD. 제품, 이하 FCS) 함유 Dulbecco's Modified Eagle Medium(SIGMA CHEMICAL CO., LTD. 제품, 이하 DEME)을 사용하였다. 24공 플레이트에 1공 당 5×10⁴/㎠이 되도록 파종하고, 24시간 후에 X선을 20Gy 조사하였다.

1.2. 상피세포의 조정

상피세포는 위장근위 요세관 상피세포(RPTEC), 메산지움세포(NHMC), 전립선 상피세포(PrEC), 신경전구세포(NHMP), 인간 간세포(NHeps), 유선상피세포(HMEC)(모두 Clonetics사 제품)를 사용하였다. 배지에는 RPTEC는 6.15ng/ml 트리요오도티로닌, 0.5㎍/ml 에피네프린, 1㎍/ml GA-1000, 10㎍/ml 트란스페린, 5㎍/ml 인슐린, 0.5㎍/ml 하이드로코르티손, 0.01㎍/ml hEGF, 0.5% FBS 함유 RENAL EPITHELIAL CELL BASAL MEDIUM(Clonetics사 제품, REBM), NHMC는 1㎍/ml GA-1000, 5% FBS 함유 MESANGIAL CELL BASAL MEDIUM(Clonetics사 제품, MsBM), PrEC는 13㎍/ml BPE, 5㎍/ml 인슐린, 0.1 ㎍/ml GA-1000, 0.1ng/ml 레틴산, 10㎍/ml 트란스페린, 6.51ng/ml 트리요오도티로닌, 0.5㎍/ml 하이드로코르티손, 0.5㎍/ml 에피네프린, 0.01㎍/ml hEGF 함유 PROSTATE EPITHELIAL CELL BASAL MEDIUM(Clonetics사 제품, RrEBM), NHMP는 0.01㎍/ml hEGF-8, 0.01㎍/ml hEGF, 0.8% NSF, 1㎍/ml GA-1000 함유 NEURALPROGENITOR BASAL MEDIUM(Clonetics사 제품, NPBM), NHEPS는 0.5㎍/ml 하이드로코르티손, 0.01㎍/ml hEGF, BSA, 아스코르브산, 10㎍/ml 트란스페린, 5㎍/ml 인슐린, 1㎍/ml GA-1000 함유 HEPATOCYTE BASAL MEDIUM(Clonetics사 제품, HBM) HMEC는 5㎍/ml 인슐린, 1㎍/ml GA-1000, 0.01㎍/ml hEGF, 13㎍/ml BPE, 0.5㎍/ml 하이드로코르티손 함유 MAMARY EPITHELIAL BASAL MEDIUM(Clonetics사 제품, MEBM)을 사용하였다. 콜라겐 접시(IWAKI)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터 배양하고, 80~90% 융합적으로(confluent) 된 후 1종류의 세포 당 24공 플레이트를 6매 준비하고, 미리 준비된 상기 피더 레이어 상에 1공 당 5×10³㎠이 되도록 파종하였다.

1.3. 재생시트의 배양

점막시트의 배양에는 DMEM(-)을 사용하였다. 배지에는 5㎍/ml 인슐린, 5㎍/ml 트란스페린, 2×10^-4M 트리요오도티로닌, 1×10^-9M 콜레라톡신, 0.5㎍/ml 하이드로코르티손, 10ng/ml 인간 상피세포 증식인자(EGF; Takara Shuzo Co. Ltd. 제품), 1000U/ml 페닐실린 G(MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. 제품), 1mg/ml 카나마이신(Sigma, st, Louis, MO, USA), 2.5㎍/ml 펀지존(GIBCO, Grand Iskl and, NY, USA)의 농도로 조정된 1% Anti-B 및 10% 우태아혈청(JRH BIOSCIENCES., 이하 FBS)을 첨가하였다. 37℃, 10% CO₂ 인큐베이터에서 배양하고, 배지교환은 2일마다 행하였다. 10일 후에 배지를 제거한 후, 겔매트릭스 Type A 겔과 10×MEM(NaOH 비함유)과 2.2% NaOH 및 200mM HEPS를 함유하는 0.05N-NaOH(Nitta Gelatin Inc. 제품)를 8:1:1로 혼합한 콜라겐 겔을 24공 플레이트에 1공 당 0.5ml 적재하였다. 20일간 배양한 후, MTTassay용으로 2매로 나누고, RPTEC와 NHMC는 ACHN-L4, PrEC는 DU145, NHNP는 A7, NHep는 Alex, HMEC는 MDA-MB-453을 5×10⁴㎠이 되도록 파종하였다. 파종한 후 4시간 후에 10㎍/ml CDDP를 첨가하고, 24시간 후에 각각 X선을 0Gy(대조군), 10Gy 조사하였다. 조사 72시간 후에 MTTassay의 샘플링을 행하였다.

2. MTTassay

CDDP투여 후, 72시간 후에 배지를 제거한 후, 콜라겐 겔을 약 3mm각으로 절단하고, 0.2% 콜라게나제를 첨가하고, 37℃에서 진동시켜 용해시킨 후, 1000rpm, 5분간 원심분리하여 세포를 분리시켜서 배지에서 재부유시킨 후 24공 플레이트에 복귀시켰다. 0.5mg/ml MTT 라벨링제(Roche Diagnostics K.K. 제품, 이하 Roche)를 첨가하고 4시간 37℃, 10% CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하고, 배지와 등량의 가용화 용액(Roche)을 첨가하여 24시간 37℃, 10% CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하였다. 그 후 각각의 구멍으로부터 96공 플레이트로 200㎕씩 이동시키고, 멀티플레이트 리더에 의해 파장 600nm에서 흡광도를 측정하여 3공의 평균치로 표시하였다.

3. 재생가능 장기유래 조직의 종류에 대해서

금회 사용된 위장근위 요세관 상피세포(RPTEC: 도 14), 메산지움세포(NHMC: 도 15), 전립선 상피세포(PrEC: 도 16), 신경전구세포(NHMP: 도 17), 인간 간세포(NHeps: 도 18), 유선상피세포(HMEC: 도 19)는 모두 배양개시 후, 10일 이내에 중층화되었다. 또한 3주 이내에 거의 4층에 달하여 있었다. 또한, 예컨대 메산지움세포(NHMC)에 대해서 겔을 적재하기 전인 5일 후에 이미 중층화가 관찰되었으므로, 콜라겐 겔이 재생에 필수가 아닌 것도 확인되었다.

4. 암치료 감수성 시험의 결과

MTTassay에 의한 감수성 시험의 결과를 도 20~23에 나타내었다. 도면 중의 겔+암이 종래의 HDRA법에 상당한다. 본 출원의 발명의 감수성 시험은 상피+겔+암이 대표하고, 상피+겔이 정상조직의 감수성을 나타낸다. 암세포만 분리되었으므로, 상피+겔+암의 MTTassay는 암조직과 20Gy 조사를 받아 피더 레이어화된 정상조직 양쪽 모두 충분한 결과가 얻어졌다.

암세포에서는 누드마우스 이식종양 및 임상적으로 방사선 화학치료법에 저항성이 다형 신경교아종 유래 A7세포가 MTTassay에서는 HDRA법 이상으로 저항성을 나타내었다(도 20). 간세포암 Alex는 MTTassay에서는 HDRA법과의 사이에 유의차가 확인되었지만, 시스프라틴과의 병용효과에서 차가 나타났다. 전립선 암세포 DU145는 MTTassay에서는 HDRA법에서 극단적으로 방사선 감수성이 높게 나타났지만, 임상적으로 누드마우스 이식종양의 실험에서도 그만큼 고감수성이지 않은 것이 확인되었고, 본 출원의 발명의 감수성 편의 감수성이 보다 가까운 결과가 되었다. 마지막으로 임상적으로도 누드마우스 이식종양에서도 방사선 저항성의 위암 AGHN-L4는 지지조직이 메산지움세포 NHMC 유래나, 위장근위 요세관 상피세포 RPTEC 유래나 모두 반사선 감수성이 다른 것이 명백해졌다(도 22 및 23). 즉, 지지조직의 차이에서도 동일한 암세포의 감수성에 차이가 나타나는 것을 시사하는 매우 흥미진진한 결과가 얻어졌다. 또한, 시스프라틴 감수성으로부터는 본 출원의 발명의 감수성 시험의 편이 누드마우스 이식종양의 결과에 가까운 것이 확인되었다. 각 암세포의 감수성을 신규 감수성 시험에서 MTTassay와 비교하면 시스프라틴 고감수성의 ACHN-L4 세포의 결과와 합치하였다.

<실시예 3>

암치료 감수성 시험을 종래의 2차원 배양에서의 MTTassay계와 비교하여 행하였다.

도 24~도 34는 그 결과를 나타낸 것이다. 이들 도면에 있어서는 암세포 각각의 컬럼(예: AOI)이 2차원 배양의 암세포의 감수성에 상당하고 있다. 2번째 컬럼(예: AOI/(NHBE+AOI)은 재생정상조직의 위에서 3차원 배양한 암조직에 치료를 행하는 암조직만을 취하여 MTTassay를 행했을 때의 감수성에 상당한다. 3번째(예: NHBE/(NHBE+AOI))는 최초에는 정상조직에서만 도중에 암조직과 공배양하여 치료를 행한 후, 암조직을 제거한 후의 3차원적 재생정상조직만의 감수성에 상당한다. 또한, 이들 도면에 있어서는 MTTassay의 표시 하의 괄호안은 왼쪽부터 사용한 정상 상피세포명(지금은 기관지상피(NHBE) 또는 전립선상피(PrEC)), 배지농도(1/10배 또는 1배), 이것으로부터 피더 레이어에 사용된 선유아세포명(피부유래(SuSa) 또는 폐유래(NHLF))을 나타내고 있다. 비교군은 무처리군의 MTTassay의 결과를, X선은 10Gy 1회 조사 후 72시간 후의 MTTassay의 결과를, 또한 5FU는 5FU를 10㎍/ml에서 72시간 약제처리후 MTTassay 데이터를, 5FU+X선은 5FU를 10㎍/ml에서 3시간 처리 후에 10Gy 조사를 병용하여 5FU 첨가 후 72시간 약제를 더 병용처리 후의 MTTassay 데이터를 나타내고 있다. 또한, 금회 3종류의 약제처리는 모두 10㎍/ml에서 72시간 처리를 행하고 있다.

구체적으로는 약제처리는 항암제 3종류(CDDP, MMC, 5FU)의 비교로서 행하여 있다.

<A> 피부유래 선유아세포(SuSa)를 피더 레이어로서 사용한 결과

1. 결과로서, 예컨대 1/10 농도배지에서는 증식인자의 농도가 1/10이기 때문인지 암조직과 공존하고 있던 3차원적 정상조직은 단독 정상조직보다도 방사선이나 MMC 단독이나 MMC+X선에 대해서 저항성인 것을 알 수 있다. 또 2차원 배양 AOI 폐암세포보다도 정상조직과 공존하고 있던 3차원적 AOI 암조직 쪽이 MMC 단독이나 MMC+X선에 대해서 저항성인 것을 알 수 있다.

2. 1배 농도의 배지에서는 증식인자가 과잉으로 존재하기 때문이지 오히려 3차원적으로 증식하여 있는 정상조직이 마이트마이신 MMC 단독이나 MMC+X선에 대해서 저항성으로 되어 있다. 또한, 3차원적 AOI 암조직의 편이 공배양하여 조사를 10Gy 받고 있는 정상기관지상피로부터의 증식인자 등의 시그널이 있기 때문인지 2차원 배양의 AOI 암세포보다도 저항성으로 된다.

3. 이상의 경향은 항암제의 시스프라틴에서도 관찰되었다. 특히 3차원 배양의 AOI 암조직이 2차원 배양의 AOI 암세포 보다도 저항성으로 되는 정도가 배양액(증식인자)의 농도에 따라 강하게 영향을 받는 것이 판명되었다. 1/10배 배지에서의 방사선 조사나 5FU 투여에서는 오히려 공배양하고 있던 AOI 암조직을 제거한 후의 재생정상기관지 상피조직의 증식을 촉진하는 경향이 시사되었다. 또한 정상조직 단독으로도 부작용의 출현의 정도는 경감하는 것이 시사되었다. 1배의 배지에서는 첨가증식인자 때문인지 조사 또는 5FU 단독 처리시에는 증식이 오히려 촉진되었지만, 양자를 병용한 경우에는 그 촉진효과는 상실되었다. 재생정상조직에 대한 부작용은 오히려 첨가증식인자의 농도가 높은 경우에는 강하게 나타나는 것이 시사되었다.

4. 또한, 1/10배의 배지 하의 재생전립선 조직 중에서는 10Gy 조사한 전립선암 유래 DU-145 암세포를 제거한 후의 재생정상 전립선조직의 증식이 오히려 촉진되어 있었다. 이 암세포도 누드마우스 이식 시와 동일하게 방사 고감수성으로 판명되었다. 오히려 2차원 배양의 암세포보다도 고감수성이었다. 오히려 이 암세포는 AOI 세포와 비교하여 시스프라틴에는 저항성이고, 5FU에는 감수성이 높고, 또 마이트마이신에 대해서는 AOI 세포와 동일 정도의 감수성을 나타내었다.

<B> 폐유래의 선유아세포를 피더 레이어로서 사용한 경우

1. 1/10배의 배지 하에서 폐유래의 선유아세포를 사용한 경우에는 크게 양상이 변하였다.

즉, 3차원 배양 AOI 암조직에서는 시스프라틴에는 오히려 저항성이었다. 즉, 또한 5FU에 대해서는 어느 조직도 감수성을 나타내지 않았다. 또한, 마이트마이신에 대해서는 피부유래와 폐유래의 선유아세포를 사용한 경우 큰 차이는 없었다.

2. 1배의 배지 하에서의 폐유래의 선유아세포를 사용한 경우에는 크게 양상이 달랐다.

즉, 선유아세포의 차이에 따른 AOI 암조직의 시스프라틴에 대한 감수성의 차이는 작아졌지만, 정상조직에 대한 시스프라틴의 독성은 적어졌다. 또한, AOI 암세포 조직 및 정상조직의 5FU에 대한 감수성이 3차원에서는 낮아졌다. 또한, 3차원에 있어서의 AOI 암조직의 감수성이 높아졌다. 이 결과는 동일 암세포를 누드마우스에 이식한 경우의 결과와 정확하게 일치하고 있다.

<C> 결과로부터의 판단으로서

1. 실제 누드마우스에 이식한 AOI 종양은 누드마우스의 체중이 2/3에 가깝게 감소하는 독성이 강한 10mg/kg(배양계에서는 1㎍/ml 상당)의 시스프라틴 투여에서도 증식지연이 불과 수일만 일어나지 않는 정도의 저항성을 나타낸다. 또한, AOI 종양은 마이트마이신에 대해서 시스프라틴보다도 오히려 감수성이 높다고 말할 수 있다.

2. 이상의 것으로부터, 역시 3차원 배양한 정상조직을 사용한 감수성의 비교에서는 피더 레이어에 사용하는 선유아세포가 동일 장기유래인지 여부에 따라 감수성이 크게 달라지는 것이 판명되었다. 즉, 동일 장기유래의 선유아세포를 사용하여 피더 레이어를 작성한 편이 정확한 감수성을 검출할 수 있다.

실제로 임상재료를 사용하는 경우에는 동일 장기유래의 선유아세포의 입수가 용이하기 때문에 문제는 일어나지 않는다. 또한, 첨가증식인자의 영향이 감수성에도 크게 나타나는 경우도 있지만, 금회 1/10배 농도의 배지에서도 감수성의 검정이 오히려 정확하게 나타나는 것이 판명되었으므로 문제없다.

이상의 실험결과로부터, 이소성(폐암에 대해서 피부유래의 선유아세포를 피더 레이어로서 사용한 경우)의 피더 레이어를 사용하면, 명백하게 반응(감수성)에 큰 변화가 생기는 경우가 있다. 또한, 결과로서 전체로는 폐유래 선유아세포(결합직)와 재생기관지 상피조직을 양쪽 모두 암에 대해서는 피더로서 사용되기 때문에, 폐암유래 세포가 본래의 감수성(반응)을 나타낸 것이라고 생각된다. 이것도 동소성 작용을 증명하는 결과가 된다.

<실시예 4>

실시형태 2에 있어서, 본 출원의 발명의 장기유래 조직의 재생은 콜라겐 겔이 재생에 필수가 아니라는 것이 확인되어 있지만, 이것은 콜라겐 이외의 세포매트릭스의 일례인 피브로넥틴의 사용에 의해서도 확인할 수 있었다.

도 35는 위장 유래의 세포: PrEC에 대해서 콜라겐만을 첨가한 경우의 결과를 예시하고 있지만, 도 36은 콜라겐을 사용하지 않고, 피브로넥틴 100㎍/ml만을 사용한 결과를 예시하고 있다. 이것으로부터, 피브로넥틴에 의해서도 중층화가 실현되는 것을 알 수 있다.

<실시예 5>

콜라겐 겔 이외의 세포외 매트릭스의 첨가효과에 대해서 본 출원의 발명의 중층화에 의한 장기유래 조직의 재생을 검증하였다.

즉, 실시예 1과 동일하게 하여 인간 피부유래 선유아세포의 피더 레이어 상에 NHDF-Ad: 인간 피부각화세포를 중층화시킬 때에, 콜라겐 겔에 피브로넥틴과 라미닌을 첨가하였다.

도 37 및 도 38a, 38b는 그 결과를 예시한 것이다.

그 결과로부터, 콜라겐 겔에 2㎍/ml의 피브로넥틴과 1㎍/ml의 라미닌을 첨가한 경우(피브로넥틴:라미닌=2:1)(도 38a, 38b)의 재생효율이 가장 좋고, 이어서 1:1, 1:2의 순(도 37)이고, 콜라겐 겔만의 경우(도 38a, 38b)의 재생효율은 이들보다도 열화되어 있는 것이 확인되었다.

<실시예 6>

인간 악성 흑색종 유래 SK-Me126 세포를 0.1mg/ml의 마트리젤(matrigel)이 깔려 있는 보이덴 챔버(Boyden Chamber) 중에 5×10⁴개 파종하고, 본 출원의 발명의 방법으로 형성된 인간 피부유래 선유아세포 상에서 중층화한 각화표피세포 NHDF-Ad와 함께 배양하였다. 마트리겔을 파들어가 이면측으로 나온 세포를 관찰함으로써 침윤능 검정시험을 행하였다. 이 경우에 콜라겐 겔 중에 상기 실시예 5와 동일하게 피브로넥틴과 라미닌을 첨가하는 비율(F:L)을 변화시켰다. 그 결과를 표 39에 예시하였다. 여기에서도 전자 2㎍/ml 또는 1㎍/ml과 후자 1㎍/ml의 조합물을 첨가한 경우에 가장 침윤능이 높아지는 것이 확인되었다.

<실시예 7>

상기 실시예 4에 있어서, 인간 전립선상피 유래 PrEC 세포의 3일째 배양조건을 변화시킨 경우의 상태를 도 40a, 40b~도 42a, 42b에 사진으로 예시하였다.

홀수번호의 콜라겐 500㎕ 당 피브로넥틴 2.5㎕ 및 라미닌 2.5㎕을 첨가한 것(F:L=1:1),

짝수번호는 콜라겐 500㎕ 당 피브로넥틴 5㎕ 및 라미닌 2.5㎕을 첨가한 것(F:L=2:1)을 나타내고 있다.

또한, 1과 2는 Type 1 콜라겐만 250㎕/공,

3과 4는 Type 1을 200㎕/공과 Type 2를 50㎕/공 첨가한 것,

5와 6은 Type 1을 200㎕/공과 Type 3을 50㎕/공 첨가한 것,

7과 8은 Type 1을 200㎕/공과 Type 4를 50㎕/공 첨가한 것,

9와 10은 Type 1을 200㎕/공과 Type 5를 50㎕/공 첨가한 것,

11과 12는 Type 1을 150㎕/공, Type 2를 25㎕/공, Type 3을 25㎕/공, Type 4를 25㎕/공 및 마지막으로 Type 5를 25㎕/공 계 5종 첨가한 것을 나타내고 있다.

홀수번호의 것 전체에 있어서 중층화가 진행되어 있는 것과, 콜라겐의 Type의 차이는 전립선상피에서는 명확하지 않은 것이 확인되었다.

<실시예 8>

암세포로서 인간위암 유래 ACHN-L4를 사용하여 암치료 감수성 시험을 행하였다. 그 결과를 도 43 및 도 44에 예시하였다. ACHN-L4/pilelayer에서는 인간위장근위 요세관 상피세포(RPTEC) 및 메산지움세포(NHMC)의 각각을 중층화한 것(day 9) 상에 0.1mg/ml의 마트리겔이 깔린 보이덴 챔버를 적재하여 사용하였다. 챔버 중에 ACHN-L4를 5×10⁴개 파종하고, 24시간 후의 조사나 약제처리 72시간 후에 MTTassay 등 치료효과판정에 제공하였다. 단층에서는 단층 상태의 RPTEC 세포 또는 NHMC 세포 상에 1mg/ml 마트리겔이 깔린 보이드 챔버를 적재하여 사용하였다. 챔버 중에 ACHN-L4를 5×10⁴개 파종하고, 24시간 후의 조사나 약제처리 72시간 후에 MTTassay 등 치료효과판정에 제공하였다. 암(ACHN-L4)에서는 아래에 피더 레이어도 RPTEC 그리고 NHMC도 배양하지 않고 동일한 치료시험에 제공하였다.

금회 X선의 선량은 10Gy를, CDDP는 10㎍/ml, MMC는 100㎍/ml에서 모두 보이덴 챔버 상하에서 처리하였다.

생존율은 파장 550nm과 690nm에서 측정했을 때의 값의 차(X550-Y690)로부터 계산하였다.

또한, 도 45는 인간위장근위 요세관 상피유래 중층화 RPTEC 세포에 대해서 5:0, 4:1, 3:2 등의 비율로 중층화한 피부각화 세포유래 NHDF-Ad 세포(이소성 장기유래)의 배양 상청(2일간 배양 후)을 신선한 유지배지에 첨가한, 혼합배지 중에서의 감수성 변화를 예시하고 있다.

도 46a, 46b, 46c는 그 경우의 상태를 예시한 사진이다.

이상의 실험에서는, 우선 MTTassay는 보이덴 챔버를 사용함으로써, 암세포와 정상세포의 분리가 용이하게 되어, 정량성이 향상되는 것이 확인되었다.

또한, 결과로서 얻어진 MTTassay의 결과로부터는, 종래의 암세포 단독과 비교하여도 2차원 배양(단층)과 3차원 배양(중층)에서 다른 것도 조사하여 증명하였다. 또한, 공존시킨다고 해도 동일 인간위장유래의 정상조직의 종류에 따라서도 암세포의 반응이 다른 것도 증명할 수 있었다.

그리고, 다른 장기유래의 중층화한 조직의 배양상청이 혼합되면, 암세포의 감수성이 변화하는 것도 정량적으로 관할할 수 있었다. 확실히 독성시험 등의 경우에 장기 사이의 순환이 중요한 의미를 갖는 것이 확인되었다.

이상 상세하게 설명하였듯이, 본 출원의 방법에 의해서, 종래기술의 한계와 과제를 극복하고, 간편하고 또 확실하게 인간유래 정상조직을 베이스로 3차원 배양에 의한 재생조직을 실현하는 것, 그리고 이것에 의해서 각각의 재생조직을 각 장기의 모델로 하여 의료품 등의 화학물질의 작용이나, 부작용의 검정 시스템, 또는 감수성 등의 검정을 위한 시스템을 구축하기 위한 방책을 제공할 수 있다.

Claims

장기유래의 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직에 방사선 조사하여 피더 레이어를 형성하고, 그 후 상피세포를 배양하여 이것을 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제1항에 있어서, 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직과, 상피세포가 유래장기의 동소성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직은 장기유래 선유아세포, 내피세포 및 그들의 구성조직 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 있어서, 배지에서 장기유래의 선유아세포 상에 혈관내피세포를 배양한 후에 방사선 조사하여 피더 레이어를 형성하고, 그 후 상피세포를 배양하여 이것을 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상피세포를 배양한 후에 세포외 매트릭스의 1종 이상을 첨가하여 상피세포를 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제5항에 있어서, 세포외 매트릭스는 세포외 기질의 구조요소 또는 접착성 분자인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 세포외 매트릭스는 콜라겐, 엘라스틴, 프로데오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌 및 테네스틴 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제7항에 있어서, 상피세포를 배양한 후에 콜라겐 또는 콜라겐과 피브로넥틴 및 라미닌을 첨가하고, 상피세포를 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직을 동소성을 갖는 장기유래의 별종의 구성세포 및 그 배양상청 중 1종 이상과 함께 공배양한 후에 방사선 조사하여 피더 레이어를 형성하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 동소성을 갖는 장기유래의 별종의 구성세포, 상피세포 및 그들의 배양상청 중 1종 이상과 함께 공배양하여 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선이 X선 또는 γ선인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산가스 농도를 5~15%, 대기농도를 85~95%로 하고, 20~40℃의 온도범위에서 배양하여 상피세포를 중층화하는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직의 형성방법.
장기유래의 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직으로부터의 피더 레이어에 중층화된 상피세포층을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항에 있어서, 상피세포층은 신경, 구강점막, 피부, 기관지, 유선, 간장, 또는 위장 유래의 것인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항 또는 제14항에 있어서, 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직과 상피세포가 유래 장기의 동소성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 결합직 또는 그 구성세포 또는 지지조직은 장기유래 선유아세포, 내피세포 및 그들의 구성조직 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
피더 레이어층이 장기유래 선유아세포에 의한 하층과 혈관내피세포에 의한 상층으로 구성되고, 피더 레이어층 상에는 중층화된 상피세포층이 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상피세포가 약 4층 이상 중층화되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 정상 재생조직이 기판 상에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 또는 배양액이 정상 재생조직에 접하여 유통하도록 되어 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제19항 또는 제20항의 정상 재생조직의 복수의 것이 배지 또는 배양액의 유통로로 통과되는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 정상 재생조직의 재생장기 모델체를 구성하고 있는 것을 특징으로 하는 정상 재생조직.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중층화된 상피세포층에 암세포를 배양하고, 화학물질의 첨가나 방사선 조사에 의해 암세포의 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법.
제23항에 있어서, 저산소화 상황에서 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 암세포를 배양한 후에 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중의 1종 이상을 보충하거나 또는 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 보충한 후에 암세포를 배양하고, 이어서 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중층화된 상피세포층에 암세포를 배양하고, 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 보충하여 그 위에 혈관내피세포를 배양하고, 화학물질의 첨가에 따른 암세포의 혈관신생능을 검정하는 것을 특징으로 하는 혈관신생능의 검정방법.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 정상 재생조직에 방사선을 조사하여 재생 상피세포의 증식을 억제한 후에 중복화된 상피세포에 암세포를 배양하고, 콜라겐 및 다른 세포외 매트릭스 중 1종 이상을 적재하여 전체를 상하 역전시킴으로써, 전이 또는 침윤능을 검정하는 것을 특징으로 하는 전이 또는 침윤능의 검정방법.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 정상 재생조직에 대해서, 화학물질의 첨가나 방사선 조사에 의해 정상 재생조직의 감수성을 검정하는 것을 특징으로 하는 감수성 검정방법.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 정상 재생조직에 있어서 유전자 도입의 효율을 검정하는 것을 특징으로 하는 유전자 도입의 검정방법.
재생 상피세포의 증식을 억제하기 위해서 조사하는 방사선은 X선 또는 γ선인 것을 특징으로 하는 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 방법.