KR20050033091A

KR20050033091A - 리토스퍼믹에시드 ｂ 메틸에스테르 및 그 유도체, 및 이를함유하는 간 보호 및 간 섬유화/경화 치료제 조성물

Info

Publication number: KR20050033091A
Application number: KR1020030069000A
Authority: KR
Inventors: 손동환; 김윤철; 박은전
Original assignee: 학교법인 원광학원
Priority date: 2003-10-04
Filing date: 2003-10-04
Publication date: 2005-04-12
Also published as: KR100549058B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하여 간을 보호함과 동시에 간 섬유화/경화를 억제할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 1) 간세포의 자가사멸 및 괴사를 억제함으로써 간세포를 보호하고; 2) 결합조직을 과다 생성하는 활성화된 간성상세포의 자가사멸을 촉진함으로써, 간섬유증 및 간경화증의 특징적 소견인 콜라겐의 과다축적을 저지할 수 있는 간섬유증 및 간경화증 치료제 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

Description

리토스퍼믹에시드 Ｂ 메틸에스테르 및 그 유도체, 및 이를 함유하는 간 보호 및 간 섬유화/경화 치료제 조성물{Lithospermic acid B methylester and the derivatives thereof, and a composition containing the lithospermic acid B methylester and the derivatives thereof for treating liver fibrosis/cirrhosis and liver injury}

본 발명은 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하여 간을 보호함과 동시에 간 섬유화/경화를 억제할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 1) 간세포의 자가사멸 및 괴사를 억제함으로써 간세포를 보호하고; 2) 결합조직을 과다 생성하는 활성화된 간성상세포의 자가사멸을 촉진함으로써, 간섬유증 및 간경화증의 특징적 소견인 콜라겐의 과다축적을 저지할 수 있는 간섬유증 및 간경화증을 치료할 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 소화기계로 들어온 생체외물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 일단 생체내로 들어온 생체외물질이 간을 통과하는 까닭에 간은 영양소외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상당할 확률도 다른 장기에 비해 높다.

간조직 중에는 영양물질 흡수 및 대사, 저장, 혈장단백질 합성 등 간의 주요기능을 수행하는 간세포(hepatocyte), 간내 거식세포(macrophage)인 쿠퍼세포(Kupffer cell), 간손상시 결합조직을 과다합성함으로써 간섬유화를 초래하는 간성상세포(hepatic stellate cell), 내피세포(Endothelial cell), 피트세포(Pit cell) 등이 존재한다. 이중 간세포는 간조직의 전체세포의 90%이상을 차지하며, 간의 주요기능을 수행하는 실질세포(parenchymal cell)로 간질환시 간기능 저하는 바로 이 간세포 손상으로 초래된다.

간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 간세포 손상의 경우에는 충분히 정상으로 회복된다. 그러나 지속적으로 손상될 경우 간세포가 완전히 파괴되면서 파괴된 부분이 정상적으로 회복되지 못하고 결합조직이 과다축적되면서 간조직에 상흔(scar)이 형성되고 간 기능이 정상으로 회복되지 못하는 상태가 된다(Lissoos et al., 1992). 간손상의 원인은 알콜, 담즙, 바이러스 등으로 매우 다양하지만 손상이 지속되어 만성 간질환(chronic liver disease; CLD) 상태가 되면 그 원인과는 상관없이 모두 염증상태 지속, 세포외기질(extracellular matrix; ECM)의 질적·양적 변화가 유발된다. 세포수준에서의 변화로는 활성화된 간성상세포, 거식세포와 쿠퍼세포가 관여하게 되며, 분자적 수준에서는 여러 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), ECM 조직체 및 구조 변화, 그리고 산화적 스트레스 관련 물질(oxidative stress-related molecule)이 주요한 역할을 담당한다. 원인 및 간섬유화 진행정도가 각기 다른 만성간질환 및 실험적 만성 간질환 모델 모두 공통적으로 산화적 스트레스가 유발되는 것으로 보고되고 있다. 산화적 스트레스가 관측되는 간질환으로는 임상에서는 만성 HCV 감염, 알콜에 의한 간질환(alcohol liver disease), 유전적 혈색소증(genetic hemochromatosis), 윌슨씨병(Wilson's disease), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis) 및 기타 담즙울체성 간질환(cholestatic disease), 실험동물 모델로는 담관결찰(bile duct ligation) 모델, CCl₄ 투여(administration), 에탄올 투여(ethanol administration), 철분과부하(iron overload) 모델, 구리과부하(copper overload) 모델 등에서 관찰되고 있다. 산화적 스트레스란 산화적 스트레스 관련 물질이 세포의 산화방지제에 의한 보호(cellular antioxidant defence)를 능가하여 세포내 단백질, 지질 탄수화물, 핵산 등에 산화적 손상이 가해지는 현상이다. 세포내/외로부터 유래되는 산화적 스트레스 관련 물질로는 (1)과산화수소 및 초산화 음이온(superoxide anion)과 같은 반응성 산소 중간물질(reactive oxygen intermediates; ROI), (2)지질과산화에 의한 알데히드 최종물질(aldehydic end-products) 등이 있다.

간세포 손상은 간질환에서 일반적 현상으로 산화적 스트레스의 정도에 따라 간세포의 괴사(necrosis) 또는 자가사멸을 유도한다. 급성 간장애와 같이 산화적 스트레스가 심한 상태에서는 주요 세포 구조(미토콘드리아와 cytoskeletal protein), 거대분자(DNA, 지질, 효소단백질) 및 대사경로(metabolic pathway)가 손상되어 결국 괴사를 초래하게 된다. 산화적 스트레스가 상대적으로 약한 경우 즉, 미토콘드리아 기능을 비가역적으로 완전히 손상시킬 수 없는 경우에는 간세포가 괴사보다는 자가사멸이 유도되는 것으로 보고되고 있다. CLD 상태에서는 대부분 중등도의 산화적 스트레스가 유지되는 것으로 생각되며 간섬유화 상태에서도 중등도의 산화적 스트레스가 유지되는 것으로 여겨지고 있다.

자가사멸(Apoptosis, programmed cell death)은 1972년 Kerr에 의해 소개된 명칭으로 1980년대 중반이후 많이 연구되기 시작한 분야이다. 자가사멸은 조직의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 필수 과정으로 정상조직에서 세포신생과 균형을 유지하고 있는 세포 손실과정이다. 자가사멸 유도시 세포는 손상되지 않은 세포기관(intact organelle)과 원형질막(plasma membrane)의 막결합(membrane-bound) 소체로 단편화된다. 지시된 DNA 단편화(fragmentation)는 자가사멸의 대표적인 특징으로 자가사멸 유도에 의해 활성화된 엔도뉴클리아제(endonuclease)는 DNA를 먼저 50-에서 300-kb의 크기로 절단후 다시 180-200 염기쌍(base pair)의 단편으로 조각낸다. 이러한 DNA 단편화(DNA laddering)는 고사세포(apoptotic cell) 대부분에서 관찰된다. 자가사멸이 완전히 진행된 세포는 자가사멸 소체(apoptotic body)라 지칭되며, 이러한 자가사멸 소체는 생체 내에서 탐식세포(phagocytes)에 의해 제거된다. 일반적으로 고사세포는 세포내 구성성분이 세포내 그대로 존재하는 상태로, 세포내 구성성분이 세포 외부로 유출되는 괴사와는 달리 염증반응을 유발하지 않고 제거된다. 염증유발 없이 세포를 제거할 수 있다는 점에서 자가사멸이 암세포 제거방법으로 각광받고 있다.

자가사멸에 의해 염증반응이 유발되지 않으므로 세포의 자가사멸은 생리적 변화에 미치는 영향이 크지 않은 것이 일반적이지만, 간세포 자가사멸은 이러한 일반적인 상태와는 많이 다른 것으로 보고되고 있다. 간세포 자가사멸이 심각한 경우 간세포내 여러 효소수치가 혈중 증가되며 또 탐식세포에 의한 제거가 충분하지 못한 상태가 되어 결국에는 염증반응이 유발되며 간조직의 정상적인 구조가 파괴된다. 과거에 괴사에 의해서 유도된다고 알려졌던 많은 질환들에서도 자가사멸이 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 알콜, 바이러스 및 담즙정체 등으로 인한 간질환에서도 심각한 간손상 및 간기능 저하는 간세포 자가사멸임이 보고되고 있다.

담즙정체(cholestasis)는 여러 만성 진행성 간질환(chronic progressive liver disease)에서 발견되는 특징으로 결국에는 간부전(liver failure), 간경변증(cirrhosis)을 유발하며 결국 사망까지 초래한다. 담즙정체시 케노데옥시콜레이트(chenodeoxycholate)와 데옥시콜레이트(deoxycholate)와 같은 소수성 담즙산염(hydrophobic bile salt)이 간세포내 축적됨으로써 간손상이 유도된다. 담즙정체에 의한 간손상시 임상에서의 조직관찰 결과 간세포 괴사보다 간세포의 자가사멸이 더 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 1차 배양한 간세포에 20-100μM의 glycochenodeoxycholate(GCDC)와 같은 소수성 담즙산염을 처리함으로써 간세포 자가사멸을 유도하는 in vitro 모델은 내인성 독성물질에 의한 간세포 자가사멸 연구에 유용하게 사용되고 있다. GCDC와 같은 소수성 산(hydrophobic acid)은 Fas 올리고머화(oligomerization)를 유도함으로써 자가사멸을 유발시킨다. Fas 올리고머화에 의해 procaspase-8이 caspase-8으로 분할(cleavage) 및 활성화되어 아래 단계의 caspase(effector caspase; caspase-3,-6,-7)를 활성화시킴으로써 자가사멸이 유도된다. 또 GCDC는 단백질 키나아제 C(PKC)의 활성화 및 전위(translocation)에 의해 세포내 마그네슘이 증가되어 Mg²⁺에 의존하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)가 활성화됨으로써 DNA 분할이 유발된다고도 보고되고 있다.

여러 원인에 의한 만성 간손상은 공통적으로 간섬유화를 초래하게 되며 그 기전을 요약하면 다음과 같다. 여러 원인에 의해 간세포가 손상되고, 간내 거식세포인 쿠퍼세포가 활성화되어 여러 사이토카인을 분비하게 되면 이 사이토카인에 의해 간성상세포가 활성화되어 결합조직을 생성한다. 간 손상이 지속되게 되면 손상당한 간세포가 결합조직으로 대치되는 간질 회복(stromal repair)이 유발되어 간조직내 결합조직 과다축적으로 인한 상흔이 형성되고 또 간세포 손상으로 인해 간기능이 저하되면서 간섬유화, 간경화가 초래된다(Rojkind et al., clinical Hepatology., 1983; Rubin et al., Essenstial pathology., second, 339-41, 1995). 간섬유화 치료제는 간섬유화시 가장 문제가 되는 과다한 결합조직을 생성하는 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)에 초점이 모아지고 있다. 기존 간섬유화 치료제 연구는 페니실라민, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2, 콜키친, 글루코코티코이드, 말로틸산(malotilate), 감마 인터페론, 펜톡시필린(pentoxifylline), 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸) 아미드 등의 약물과 같이 간성상세포 활성 억제 또는 결합조직 합성억제 및 분해 촉진에 초점을 맞추어 연구되었으나(Boker et al., J. Hepatol., 13, s35, 1991; Tamayo et al., ibid, 3, 112, 1983; Jenkins et al., ibid, 1, 489, 1985; Kershenobich et al., ibid, 7, 1104, 1987; Svegliati et al., 18, 209A, 1993; Guzelian et al., Gastro., 86, 897, 1984; Ala-Kokko et al., J. Lab. Clin. Med., 113, 177, 1989), 근래 실험적 간섬유화 모델에서 간섬유화 회복시 HSC의 자가사멸이 보고되면서 HSC 자가사멸 촉진이 새로운 간섬유화 치료법으로 관심이 모아지고 있다.

그러나, 많은 연구에도 불구하고 아직까지 독성없이 임상에서 확실한 효과를 나타내는 간섬유화 치료제는 없는 실정이다. 간은 침묵의 장기로 완충작용이 탁월하여 간의 일부가 손상을 당해 그 기능을 수행하지 못하여도 남은 일부가 그 기능까지 수행함으로써 간 질환시 초기에 자각증상을 거의 느끼지 못하여 조기진단이 어렵고 말기에서야 발견되기 때문에 그 치료가 쉽지 않으며, 적당한 치료제도 없는 실정으로 사망률 또한 높아 사회적인 문제를 야기하고 있다.

이에, 본 발명자들은 간을 보호하고 간 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 물질을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 단삼(Salvia miltiorrhiza) 메탄올 추출물의 간경화 억제효과를 발견한 바 있고(한국특허출원 제 2001-5841 호), 계속된 연구의 결과로서 간 독성을 유발하지 않으면서, 간을 보호할 수 있고, 또 간 섬유화를 억제할 수 있는 신규 리토스퍼믹에시드 B 에스테르를 분리·정제하고 구조를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 간을 보호하면서 동시에 간 섬유화를 억제할 수 있는 단삼 물 추출물로부터 분리한 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 리토스퍼믹에시드 B로부터 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 유도체들을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 섬유화 억제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 단삼 물 추출물로부터 분리한 하기 화학식 1로 표현되는 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(lithospermic acid B methylester)에 관한 것이다:

예로부터 단삼(Salviae Radix)은 활혈거어(活血祛瘀), 양혈소종(凉血消腫), 청심안신(淸心安神) 등의 효능으로 무월경, 월경불순, 협심증, 화농성 피부질환, 불면증 등의 치료에 이용되어 왔다.

본 발명에서 사용한 단삼은 서울 경동시장에서 구입하여 물리화학적 품질평가를 통하여 확인 검증한 후 사용한다.

본 발명에 따른 리토스퍼믹에시드 B 에스테르의 추출방법은 다음과 같다:

1) 단삼(Salviae Radix)을 증류수로 가열 추출한 다음;

2) 이 추출물을 용매 분획하여 에틸아세테이트 가용부를 얻고; 및

3) 이것을 Sephadex LH-20 및 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리하여 순수물질인 리토스퍼믹에시드 B 에스테르를 획득한다.

또한, 본 발명은 리토스퍼믹에시드 B로부터 하기 화학식 2로 표현되는 리토스퍼믹에시드 B 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 리토스퍼믹에시드 B 에스테르는 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체들을 포함한다.

상기에서 R은 CH₃-, CH₃CH₂- 및 CH₃CH₂CH₂- 이다.

본 발명에 의한 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 유도체는 리토스퍼믹에시드 B에 산과 알콜을 첨가하고, 40∼50℃에서 반응시키는 통상적인 에스테르 제조방법을 통해 제조한다. 이 과정은 하기 반응식 1과 실시예 3에 나타내었다:

본 발명에 의한 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 유도체는 산조건에서 알콜을 첨가하고 40∼50℃에서 반응시키는 통상적인 에스테르 제조방법으로 제조한다.

또한 본 발명은 상기 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 섬유화 억제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 간섬유증 및 간경화 치료제로서 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체를 1∼2,000㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[실시예 1]

흰 쥐의 일차배양 간세포를 이용하여 터셔리-부틸히드로퍼옥사이드 (tertiary-butylhydroperoxide)로 유발한 괴사를 억제하는 효과 및 GCDC에 의한 손상(apoptosis)시 caspase-3 활성을 억제하는 효과를 나타내는 분획을 추적하여 아래와 같은 방법으로 단삼으로부터 간 섬유화 억제물질을 분리 정제하였다.

세절한 단삼 600g을 3ℓ의 증류수로 100℃에서 2시간 환류추출한 다음, 이 추출액을 감압 농축하여 전체 용량을 1ℓ로 하였다. 이 수용액을 분액깔대기에 옮기고 디클로로메탄 800㎖를 넣은 다음 진탕하여 디클로로메탄 분획을 얻었으며, 이 조작은 2회 반복하였다. 디클로로메탄 분획을 제거한 수층은 다시 에틸아세테이트 800㎖를 이용하여 2회 반복 진탕하여 에틸아세테이트 가용부를 얻었으며, 에틸아세테이트 가용부를 감압농축하여 875㎎의 고형물을 얻었다. 간 섬유화 억제활성을 나타낸 에틸아세테이트 분획물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(용출용매: 클로로포름 - 메탄올 - 증류수, 17:3:0.3)에 의하여 4개의 분획(E-1001∼1004)으로 나누었으며, 네 번째 분획물인 E-1004(297㎎)가 간 섬유화 억제효과를 나타내었다. E-1004는 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피(용출용매: 메탄올)를 실시하여 2개의 소분획(E-10041, 10042)으로 나누었다. 간 섬유화 억제활성을 나타낸 E-10041(247mg)은 다시 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피(용출용매: 디클로로메탄 - 메탄올, 1:1)를 시행하여 소량의 불순물을 제거한 간 섬유화 억제활성을 나타내는 소분획(E-100411) 196mg을 얻었다. 상기 소분획물 E-100411을 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피(용출용매: 디클로로메탄 - 메탄올, 8:1)를 이용하여 정제한 결과 단일물질인 E-1004111(189mg)을 얻었으며, 이 물질은 간 섬유화 억제활성을 나타내었다.

[실시예 2]

상기 실시예 1에서 얻은 간 섬유화 억제활성물질인 E-1004111의 구조를 결정하였다. 이 물질은 백색 분말로서, 탄소 핵 자기공명분석 및 ESI질량 분석 결과 ([M-H]^- = 745)를 토대로 분자식은 C₃₈H₃₄O₁₆으로 추정되었으며, 따라서 22개의 불포화도를 가짐을 확인할 수 있었다. DEPT 측정 결과는 분자내의 27개의 수소가 탄소와 화학결합을 이루고 있으며, 예상되는 분자식과 DEPT 결과의 비교 분석으로부터 화합물 E-1004111은 7개의 하이드록실기를 지니고 있음을 알 수 있다. 도 1 및 도 2는 상기 실시예 1에서 얻은 간 섬유화 억제활성물질인 E-1004111의 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 결과를 보여준다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼의 해석결과 및 DEPT 실험결과는 화합물 E-1004111이 1,2,4번 위치에 수소를 지닌 3개의 벤젠 고리형 부분구조 및 1,2-위치 수소를 함유한 벤젠환 형태의 부분구조가 존재함이 제시되었다. 또한 4개의 카르복실 형태의 탄소 피크가 ¹³C NMR 스펙트럼에서 관찰되었으며, 추가적으로 2개의 메톡실기가 존재함이 확인되었다. 도 3은 화합물 E-1004111의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 결과를 보여주는 것으로서, ¹H-¹H COSY로부터 화합물 E-1004111이 위에서 예상되는 부분 구조 외에 2쌍의 CH-CH₂ 및 CH-CH 스핀 시스템을 가지고 있음을 확인하였다. 이상의 화합물 E-1004111에 대한 종합적인 구조정보는 화합물 E-1004111이 전형적인 카페인산(caffeic acid)의 사량체(tetramer)형의 화합물임을 제시하였으며, 특히 단삼에서 분리 보고된바 있는 하기 화학식 3으로 표현되는 리토스퍼믹에시드 B와 유사한 것으로 예상되었다.

리토스퍼믹에시드 B

리토스퍼믹에시드 B와 화합물 E-1004111의 유사성은 두 화합물간의 NMR 스펙트럼의 비교(표 1 및 참고문헌 다나카등, Chem.. Pharm. Bull. 37 (2), 340-344 ,1989 참조. 표 1에서 분석에 사용된 용매는 아세톤-d6이다)를 통하여 확인할 수 있으며, 결과적으로 두 화합물 간의 구조적인 차이는 화합물 E-1004111에 존재하는 2개의 메톡실기임이 확인되었다. 화합물 E-1004111에 존재하는 2개의 메톡실기의 분자 내 위치를 확인하기 위하여 HMQC, 및 HMBC 분석을 하였으며, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. HMQC 및 HMBC 분석을 통하여 완전한 분자의 구조를 확인하였으며, 특히 HMBC에서 관찰된 메톡실기의 메틸 수소(3.62 ppm)와 카르복실 탄소(169.39 ppm) 및 메틸 수소(3.63 ppm)와 카르복실 탄소(170.15 ppm)간의 이종 핵간 커플링은 화합물 E-1004111이 2개의 메틸에스테르기를 지니는 화합물임을 확인시켜 주었으며, 이상의 결과로부터 화합물 E-1004111이 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B)임을 확인하였다. 도 6은 화합물 E-1004111의 ES 질량 스펙트럼 결과이다.

화합물의 3차원 공간 구조는 화합물 E-1004111이 리토스퍼믹에시드 B의 NMR 스펙트럼과의 비교에서 관찰되는 커플링상수의 유사성으로부터 미루어 화합물 E-1004111내의 키랄탄소의 배향은 리토스퍼믹에시드 B와 동일한 것으로 판단된다.

[실시예 3]

리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 및 그 유도체들은 리토스퍼믹에시드 B와 다양한 종류의 일차, 이차 및 삼차 알코올간의 반응으로부터 얻을 수 있다. 보다 상세히 설명하면, 리토스퍼믹에시드 B(512mg)와 amberlite IR-120(H⁺ form) 1,000 mg을 함유한 메탄올 50ml를 40-50℃에서 24시간 교반한 다음 TLC분석을 통하여 반응물(리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르)이 생성되는 것을 확인하였다(Rf=0.17). 용매를 농축한 후 얻어진 반응물을 실리카겔 컬럼을 사용하여 분리 정제하여 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(460.8 mg)를 얻었다.

이때, 상기 반응에서 사용한 메탄올 대신 다른 일급 또는 이급 알코올(에탄올, 프로판올 등)을 사용하면 사용된 알코올에 상응하는 리토스퍼믹에시드 B 에스테르 형태의 화합물을 얻을 수 있다.

리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 NMR 스펙트럼(500 MHz)

번호	¹³C NMR(δ_C)	¹H NMR(δ_C; multiplicity,J in Hz)	HMBC (H# →C#)
1	123.65	--
2	125.25	--
3	147.79	--
4	143.83	--
5	117.61	6.92 (d, 8.7)	1, 3, 4
6	120.91	7.29 (d, 8.7)	2, 3, 4, 7
7	142.52	7.70 (d, 16.0)	1, 2, 6, 8, 9
8	115.54	6.34 (d, 16.0)	1, 9
9	165.95	--
10	73.29	5.18 (dd, 7.8, 5.0)	9, 11, 12, 18
11	36.68	2.95 (m), 3.05 (m)	10, 12, 13, 17, 18
12	127.88	--
13	120.91	6.62 (dd, 7.8, 1.8)	11, 15, 17
14	115.36	6.74 (d, 7.8)	12, 16
15	144.05	--
16	144.91	--
17	116.49	6.79 (d, 1.8)	11, 13, 15
18	170.15	--
19	170.44	--
20	55.92	4.50 (d, 4.6)	2, 3, 19, 21, 22
21	86.65	5.85 (d, 4.6)	2, 3, 19, 20, 22, 23, 27
22	132.42	--
23	112.46	6.82 (d, 2.3)	21, 27
24	145.28	--
25	145.48	--
26	115.43	6.81 (d, 7.8)	22, 24
27	117.39	6.69 (dd, 7.8, 2.3)	21, 23, 25
28	74.28	5.21 (dd, 9.2, 4.6)	29, 30, 36
29	36.30	3.01 (m), 2.91 (m)	28, 30, 31, 35, 36
30	127.56	--
31	116.37	6.70 (d, 2.3)	29, 35
32	144.85	--
33	144.06	--
34	115.26	6.68 (d, 7.8)	30, 32
35	120.94	6.47 (dd, 7.8, 2.3)	29, 31, 33
36	169.39	--
37	51.55	3.63 (s)	18
38	51.76	3.62 (s)	36

[참고실시예 1] 흰쥐로부터 간세포 분리, 배양, 담즙산염 및 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B;LBME) 처리

간세포는 흰쥐로부터 새글랜(Seglen) 등의 방법에 따라 분리하였다. 간단히 설명하면, 흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여, 5% CO₂및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca²⁺, Mg²⁺-없는 행크의 균형염 용액(Ca ²⁺, Mg²⁺-free Hank's balaced salt solution)을 관에 흘려보내 간내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라게나아제(collagenase type IV) 및 1mM CaCl₂ 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음, 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리한 후, 침전된 간세포를 취해 Ca²⁺, Mg²⁺-없는 행크의 균형염 용액으로 2회 세척한 다음 1형 콜라겐으로 코팅된 배양용기에 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 10^-8M 인슐린, 50U/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖mL의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams' Medium E; WME, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여, 세포수가 1×10⁶ 세포수/㎖ 되도록한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 2시간 배양후 세포를 행크의 균형염 용액으로 세척하여 붙지 않은 간세포는 제거하고 새 배양액으로 교체한 다음 5% CO₂, 37℃의 조건에서 16시간동안 배양시킨 다음 실험에 사용하였다.

[참고실시예 2] 1차 배양 간세포에서 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸 유도 및 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B;LBME) 처리

참고실시예 1에서와 같이 분리, 배양한 간세포에 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(LBME) 또는 리토스퍼믹에시드 B(LB)를 처리한 다음 glycochenodeoxycholate (GCDC)를 처리하였다. GCDC에 의한 간세포 사멸을 유발하기 위하여 100μM GCDC와 LBME 또는 100μM GCDC와 LB를 함유한 배양액 중에서 간세포를 4시간 동안 배양하였다. GCDC는 HBSS에 용해한 다음 0.22㎛ 필터로 여과한 다음 사용하였으며, LBME 및 LB는 DMSO에 100㎍/㎕의 농도가 되도록 용해한 다음 사용하였다. 실험군은 다음과 같다.

구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	100μM GCDC 함유 배양액 처리
3군	100μM GCDC 및 LBME(50㎍/㎖) 함유 배양액 처리
4군	100μM GCDC 및 LBME(30㎍/㎖) 함유 배양액 처리
5군	100μM GCDC 및 LBME(15㎍/㎖) 함유 배양액 처리
6군	100μM GCDC 및 LB(50㎍/㎖) 함유 배양액 처리
7군	100μM GCDC 및 LB(30㎍/㎖) 함유 배양액 처리
8군	100μM GCDC 및 LB(15㎍/㎖) 함유 배양액 처리

[참고실시예 3] 1차배양 간세포에서 산화적 손상 유도 및 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B;LBME) 처리

참고실시예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포를 산화적 손상을 유발하기 위하여 1.5mM tert-부틸히드로퍼옥사이드(tBH, Sigma, USA)를 사용하였다. 간세포에 LBME 또는 LB를 함유하는 배양액을 가한 다음 1.5mM tBH를 1.0시간 동안 처리하였다. tBH는 150mM이 되도록 HBSS로 희석한 다음 배양액에 가하여 1.5mM이 되도록 하였다. 실험군은 다음과 같다.

구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	1.5mM tBH 함유 배양액 처리
3군	1.5mM tBH 및 LBME(50㎍/㎖) 함유 배양액 처리
4군	1.5mM tBH 및 LBME(30㎍/㎖) 함유 배양액 처리
5군	1.5mM tBH 및 LBME(15㎍/㎖) 함유 배양액 처리
6군	1.5mM tBH 및 LB(50㎍/㎖) 함유 배양액 처리
7군	1.5mM tBH 및 LB(30㎍/㎖) 함유 배양액 처리
8군	1.5mM tBH 및 LB(15㎍/㎖) 함유 배양액 처리

[참고실시예 4] 간성상세포 분리배양 및 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 (Dimethyl lithospermate B;LBME) 처리

간섬유증 간에서 결합조직이 과다하게 축적되는 데에 있어서, 간성상세포는 결정적인 역할을 하며, 정상간에서는 약 7%의 비율로 존재한다.

간성상세포는 흰쥐로부터 프리에드만(Friedman) 등의 방법을 수정하여 분리하였다. 간단히 설명하면, 흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여, 5% CO₂및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca²⁺, Mg²⁺-없는 행크의 균형염 용액(Ca²⁺, Mg²⁺-free Hank's balaced salt solution)을 관에 흘려보내 간내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라게나아제(collagenase type IV) 및 1mM CaCl₂ 용액을 흘려보냈다.

간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음, 간세포현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리한 후, 침전된 간세포를 제거한다. 간세포가 제거된 상층을 11.5% 및 17% 메트리자마이드(metrizamide, Sigma)층 위에 쌓고, 1,700×g에서 15분간 원심분리하여, 간성상세포층을 얻는다. 이 간성상세포층을 행크의 균형염 용액으로 세척한 다음, 코팅되지 않은 배양용기에 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 50U/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖mL의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams' Medium E; WME, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여, 세포수가 5×10⁵ 세포수/㎖ 되도록 한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 계대배양한 간성상세포를 10% 대신 1%의 FBS가 첨가된 배양액으로 바꿔 LBME을 처리하였다. LBME은 50㎍/㎖로 2일간 처리하였다.

[시험예 1] 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸시 caspase-3 활성에 미치는 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B)의 보호효과

간세포 자가사멸 과정 중 활성이 증대되는 caspase-3의 활성은 시판되는 caspase-3 activity colorimetric assay kit(R&D Systems,Inc.,USA)를 이용하여 참고실시예 2에서와 같이 처리한 간세포 실험군에서 측정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에서 보는 바와 같이, LBME는 100μM GCDC 처리시 활성이 증대되는 caspase-3의 활성을 유의적으로 감소시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 반면에 LB는 caspase-3의 활성에는 아무런 영향도 미치지 못함을 확인하였다.

군번호	Caspase-3 활성 (%)	군번호	Caspase-3 활성(%)
1	30.1±2.7	5	67.7±8.5^a,b
2	100.0±21.3^a	6	98.4±8.9^a
3	27.5±6.6^b	7	105.7±10.1^a
4	43±5.7^a,b	8	99.3±12.7^a
^aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 ^bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

[시험예 2] 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸시 DNA 단편화(fragmentation)에 미치는 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B)의 보호효과

자가사멸에 의한 간세포내 DNA 단편화에 미치는 LBME의 효과는 참고실시예 2의 실험군에서 다음과 같이 실시하였다. 간세포내 DNA를 시판되는 Wizard Genomic DNA 정제 키트(Promega, USA)를 이용하여 추출후 정량한 다음 30㎍의 DNA를 2% 아가로오스 겔에서 50mV, 40분간 전기영동하여 UV하에 DNA 단편화를 확인하였으며, 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 100μM GCDC 처리시 간세포의 DNA 단편화가 유도되었으나, LBME와 100μM GCDC를 같이 처리한 간세포의 경우 DNA 단편화 유도가 억제됨을 확인하였다. 반면에 LB는 100μM GCDC 처리시 유도되는 간세포의 DNA 단편화를 억제하는 효과가 없음을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸시 poly(ADP-ribose) 중합효소 분할에 미치는 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B)의 보호효과

자가사멸에 의한 간세포내 poly(ADP-ribose) 중합효소 분할(PARP cleavage)에 미치는 LBME의 효과는 참고실시예 2의 간세포 실험군에서 다음과 같이 실시하였다. GCDC와 LBME 또는 LB를 처리한 간세포를 용균 완충액(10mM Tris, pH 8.0, 120mM NaCl, 0.5% NP-40, 1mM EDTA, 0.1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 1㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin))으로 용해한 다음 14000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리후 상층의 단백질 농도를 Bio-Rad DC 단백질 검사 키트(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 측정한 다음 단백질 20㎍을 각각 10%(w/v) SDS 겔(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 200 V로 1시간동안 전기영동하였다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량크기에 따라 분리되고, 이러한 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)(Millipore)에 30mA로 16시간동안 트랜스퍼(transfer)하였다. 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 200배 희석된 마우스 항-PARP 항체(purified mouse anti-human PARP monoclonal antibody; BD Pharmingen)를 1차 항체로 사용하여, 2시간동안 실온에서 반응시켰다. 2차 항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-마우스 면역글로블린 G(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-mouse IgG; Santacruz)를 2,000배 희석한 것을 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 발색은 강화된 화학발광 웨스턴 블랏 검출 시스템 키트(Enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection system kit; Amersham)를 이용하여, 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름(Agfa, EC)에 노출시켜 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, 100μM GCDC에 의해 분할되는 PARP을 LBME가 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 반면, LB는 PARP 분할을 억제하는 효과가 없음을 확인하였다.

위의 결과로부터 LBME는 100μM GCDC에 의해 유도된 caspase-3 활성화 억제, DNA 단편화 저지 및 PARP 분할을 억제함으로써 자가사멸로부터 간세포 보호작용이 있음을 확인하였다. 반면에 LB는 GCDC에 의한 간세포 자가사멸에는 아무런 영향도 없음을 확인할 수 있었다. 이로부터 LBME는 자가사멸에 의한 간세포 손상에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었으며, 간세포 보호제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

[시험예 4] 산화적 손상시 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르 (Dimethyl lithospermate B; LBME)의 간세포 보호효과

참고실시예 3에서와 같이 간세포에 tBH를 처리한 다음 산화적 손상에 의해 간세포로부터 배양액 중으로 흘러나온 락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH)치를 세포독성 검출 키트(cytotoxicity detection kit; Roche)를 이용하여 측정하였다. LDH치로부터 간세포 보호효과는 다음 식에 의하여 산출하였다.

LDH 보호효과(%) = (2군 LDH치- 각군 LDH치) x 100 / (2군 LDH치 - 1군 LDH치)

간세포의 생존율을 측정하기 위하여 tBH와 LBME 또는 LB 함유 배양액을 걷어내고, 3-(4,5-dimethylthiazol-1-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 0.5mg/ml를 함유하는 배양액 중에서 2시간 동안 배양한 다음 살아있는 간세포에 의해 생성된 포마잔(formazan)을 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide)에 용해하여 540nm에서의 흡광도치를 구하였다. 흡광도치로부터 보호효과는 다음 식에 의하여 산출하였다.

생존율 보호효과(%) = (2군 흡광도치- 각군 흡광도치) x 100 / (2군 흡광도치 - 1군 흡광도치)

상기 결과를 표 3에 나타내었다.

군번호	LDH (%)	생존율(%)	군번호	LDH (%)	생존율(%)
1	100.0±4.7	100±1.5	5	42.0±2.2^a	43.7±9.5^a,b
2	0.0±7.7^a	0.0±16.1^a	6	23.4±5.4^a	7.0±6.7^a
3	86.4±2.1^a,b	68.8±5.3^a,b	7	32.6±8.9^a	7.3±4.3^a
4	63.0±3.2^a,b	54.4±0.7^a,b	8	23.4±7.5^a	6.2±5.6^a
^aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 ^bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

표 3의 결과로부터, 본 발명의 LBME는 산화적 손상에 의한 간세포 손상유도시 LDH leakage 억제 및 세포 사멸(cell death)을 억제함으로써 간세포 보호효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 반면에 LB는 산화적 손상시 이러한 보호작용이 없음을 확인할 수 있었다. 위 결과는 LBME가 간세포 보호제로 사용될 수 있음을 보여주고 있다.

[시험예 5] 산화적 손상시 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B; LBME)의 ROS 생성 및 지질과산화 억제효과

간세포에서의 활성산소종(Reactive oxygen species)의 생성정도를 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)를 이용하여 측정하였다. DCFH-DA는 비극성 화합물(nonpolar compound)로 세포내 용이하게 도입된 후 형광을 띠지 않는 DCFH로 가수분해되어 세포내 잔류하며, ROS 등의 산화성 물질에 의해 형광을 띠는 2',7'-dichlorofluorescein(DCF)로 변환되는 특징을 갖는 물질로 세포내 ROS의 존재정도를 측정하는데 사용된다. 참고실시예 3에서와 같이 LBME와 tBH 또는 LB와 tBH를 처리한 간세포에 20μM DCFH-DA를 가하여 15분 동안 배양한 다음 간세포중 형광강도를 excitation 파장 485nm, emission 파장 530nm에서 형광광도계(RF-5301, Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정하였다. 각 실험군의 DCF 생성능은 2군에서의 DCF 형광강도를 100%로 하여 산출하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

간세포에서의 과산화지질의 생성정도를 TBA(thiobarbituric acid)법을 이용하여 TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)를 측정하여 비교하였다. 간세포에서의 과산화지질인 말론다이알데히드(malondialdehyde)는 생리적(physiologic) pH에서는 음이온 에놀레이트(enolate anion) 형인 수용성 상태로 존재하므로 대부분의 말론다이알데히드는 배양액에 존재하게 된다. 따라서, 과산화지질은 배양액 중에서 측정하였다. 배양액 1mL에 TBA액(TBA 0.375g, 12N HCl 2.1mL, 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 30g in 100mL DDW) 1mL를 가하고 95℃에서 20분간 반응시킨 다음 부탄올 3mL를 가하여 10초간 볼텍스(vortex)한 후 3000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상층을 취하여 excitation 파장 532nm, emission 파장 553nm에서 형광강도를 측정하였다. 표준물질로는 1,1',3,3'-테트라에톡시프로판(Sigma, USA)을 사용하였다. 각 실험군의 TBARS의 양은 2군에서의 형광강도를 100%로 하여 산출하였으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다.

군번호	DCF (%)	TBARS(%)	군번호	DCF (%)	TBARS(%)
1	39.2±4.7	0.74±0.06	5	63.2±7.4^a	69.2±7.7^a,b
2	100.0±9.7^a	100.0±14.8^a	6	70.1±3.9^a,b	81.3±8.2^a
3	42.7±5.2^a,b	35.5±9.2^a,b	7	81.8±5.4^a	95.1±4.5^a
4	53.7±4.9^a,b	50.3±7.1^a,b	8	84.8±8.0^a	96.0±9.5^a
^aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 ^bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

위 결과로부터 LBME는 간세포내 산화적 손상의 원인이 되는 ROS를 유의적으로 감소시키며, 또한 지질과산화를 유의적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 이에 반하여 LB는 50㎍/㎖의 농도에서만 ROS를 약 30% 감소시키는 효과를 보였으며, 지질과산화 억제효과는 없음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 LBME는 간세포의 산화적 손상을 효과적으로 억제함으로써 간보호제로 사용될 수 있음을 보여준다.

[시험예 6] 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르(Dimethyl lithospermate B;LBME)에 의한 간성상세포 자가사멸 효과

간성상세포의 자가사멸 효과를 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; PI) 핵염색과 유세포 분석기(flow cytometry), caspase-3 활성 및 DNA 단편화 측정으로 확인하였다. PI는 세포의 자가사멸(apoptosis)을 측정하기 위해 자주 사용되는 형광성 색소로 DNA와 결합하는 색소이므로 측정 세포에 대한 DNA의 작용이나 내용 등을 알 수 있게 한다. LBME를 2일간 처리한 간성상세포를 PI로 핵염색후 핵내의 DNA양을 유세포 분석기(FACS Calibur-S System, Becton Dickinson, U.S.A.)로 분석하였으며, 그 결과는 표 5와 같다. DNA 분포도에서 sub-G1 peak가 3배정도 증가함으로써 SMBE가 간성상세포 자가사멸 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 시험예 3에서와 같이 caspase-3 활성 측정시 SMBE 처리시 간성상세포에서의 caspase-3의 활성이 증가되는 것을 확인하였으며 그 결과는 표 6에 나타내었다. 참고실시예 4와 같이 SMBE를 처리한 간성상세포에서 DNA 단편화 유도 여부를 시험예 2에서와 같은 방법으로 실험하였으며, 그 결과는 도 9에 도시하였다. 도 9에서와 같이, SMBE를 2일간 처리한 간성상세포에서는 DNA 단편화가 유도되었음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 SMBE는 간성상세포 사멸을 유도함을 확인할 수 있었으며, 이로부터 SMBE를 간섬유화 치료제로의 사용 가능성을 확인할 수 있었다.

군분류	Sub-G1 (%)	Caspase-3 활성(%)
정상군	18.25±5.8	100.0±4.2
SMBE (50 ㎍/㎖)처리군	61.95±9.9^a	326.7±27.1^a
^aP< 0.001, 정상군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르는 caspase-3 활성화 억제, DNA 단편화 저지 및 PARP 분할을 억제함으로써 담즙산염으로 인한 자가사멸로부터 간세포를 보호하였으며, 이로 인해 간세포 보호제 및 간섬유화 치료제로서 사용이 가능함을 알 수 있었다.

도 1은 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 2는 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 HMBC 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 HMQC 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르의 ES 질량 스펙트럼이다.

도 7은 담즙산염에 의한 간세포 손상시 유도되는 DNA fragmentation을 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르가 억제함을 보여주는 도면이다.

도 8은 담즙산염에 의한 간세포 손상시 유도되는 세포내 poly(ADP-ribose) 중합효소 분할(cleavage)을 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르가 억제함을 보여주는 도면이다.

도 9는 본 발명의 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르에 의해 간성상세포가 자가사멸됨으로써 유도된 DNA 단편화(fragmentation)를 보여주는 도면이다.

Claims

하기 화학식 1로 표현되는 리토스퍼믹에시드 B 메틸에스테르.

[화학식 1]
하기 화학식 2로 표현되는 리토스퍼믹에시드 B 에스테르:

[화학식 2]

상기에서 R은 CH₃-, CH₃CH₂- 및 CH₃CH₂CH₂- 이다.
하기 반응식 1에 의해 제조되는 리토스퍼믹에시드 B 에스테르의 제조방법.

[반응식 1]
제 1항 또는 제 2항에 의한 리토스퍼믹에시드 B 에스테르를 함유함을 특징으로 하는 간세포 치료제 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 리토스퍼믹에시드 B 에스테르는 담즙산염 또는 산화적 손상에 의한 간손상시 간세포 자가사멸 및 괴사 억제 작용을 갖는 것임을 특징으로 하는 간세포 치료제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 리토스퍼믹에시드 B 에스테르는 상기 손상된 간세포의 락테이트 탈수소효소(Lactate dehydrogenase) leakage를 억제하는 것임을 특징으로 하는 자가사멸 및 괴사 억제용 간세포 치료제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 리토스퍼믹에시드 B 에스테르는 상기 손상된 간세포의 DNA 단편화를 억제하는 것임을 특징으로 하는 자가사멸 및 괴사 억제용 간세포 치료제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 리토스퍼믹에시드 B 에스테르는 상기 손상된 간세포의 Caspase-3 활성을 억제하는 것임을 특징으로 하는 자가사멸 및 괴사 억제용 간세포 치료제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 리토스퍼믹에시드 B 에스테르는 상기 산화적 간손상시 간세포중 활성산소 생성 억제 및 지질과산화를 억제하는 것임을 특징으로 하는 자가사멸 및 괴사 억제용 간세포 치료제 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 리토스퍼믹에시드 B 에스테르는 간성상세포의 자가사멸을 촉진시키는 것임을 특징으로 하는 간세포 증식 억제용 간세포 치료제 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 치료제 조성물은 리토스퍼믹에시드 B 에스테르를 1-2,000mg/kg체중의 농도로 함유함을 특징으로 하는 간세포 치료제 조성물.