KR20050010916A - 염증 유전자 활성 및 콜레스테롤 생합성의 억제제 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 및 파르네소이드 X 수용체(FXR)의 억제제로서 효과적인 제제를 동정하는 방법 및 상기 방법에서 사용되는 프로모터, 세포주 및 벡터가 기술되어 있다. 피험자에서 염증 유전자 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 상태를 예방 및/또는 치료하는 방법을 포함하는, 짧은 이종이량체 단백질(SHP)의 억제제로서 효과적인 제제를 제조 및 사용하는 방법도 기술되어 있다. 피험자에서 염증 유전자 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성을 감소시키는데 효과적인 조성물을 포함하는, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 및 파르네소이드 X 수용체(FXR)의 억제제로서 효과적인 제제 및 이를 포함하는 조성물이 기술된다.
Description
염증 유전자 발현은 증가되는 수의 의학적 상태 및 질환과 관련된다. 예를들어, 죽상동맥경화증, 신장 및 염증성 장 질환은 과학 문헌에서 염증 유전자 발현과 관련되어 왔다. 염증 질환에 대한 감수성을 부여하거나 이러한 질환의 하위부류에 의해 공유되는 비정상적 염증 과정에 기여하는 공통된 유전적 변이체가 존재하는 것으로 주장되어 왔다. 이들 상태의 조합된 영향은 특히, 각각의 이들 질환이 단독으로 심각한 의학 문제를 대표하는 경우에 실질적 공중위생 문제를 대표한다.
콜레스테롤 생합성 경로도 또한 사람에서 심각한 의학 상태에 연루된다. 예를 들어, 죽상동맥경화증 또는 동맥의 경화는 선진국에서 모든 사망율의 절반 이상의 원인이며 미국에서는 제1의 사망 원인이다. 이것이 관상 동맥에 작용하는 경우(예: 관상 심장 질환 또는 CHD), 대부분의 심장 발작의 근본적 원인이 되며 울혈성 심부전 및 부정맥의 공통된 원인이 된다.
병리학적 과정은 매우 조기에는 동맥의 내막에 침착된 지질로 이루어진 지방 선조로 개시된다. 포말 세포로 공지된 변형된 대식세포가 플레이크 영역에 축적된다. 이러한 포말 세포는 지질, 특히 산화된 저밀도 지단백질(LDL)을 축적시킨다. 이들 지단백질 및 콜레스테롤 에스테르는 내막하 섬유모세포에 의한 콜라겐 합성을유도한다. 병변이 섬유상 물질로 침유되면, 동맥의 루멘내로 돌출된다. 상기 병변은 그 자체로는 동맥을 거의 폐색시키지 않지만, 채널을 차단하는 플레이크의 최상단에 형성되는 혈병이다.
만성 병변은 경화되고 혈관의 탄성은 감소된다. 이러한 동맥의 경화는 혈류에 대한 저항성을 증가시켜 혈압을 증가시킨다. 이론상으로 체내의 모든 혈관이죽상동맥경화증에 의해 영향을 받을 수 있지만, 대동맥, 관상동맥, 경동맥 및 회장동맥이 가장 빈번하게 영향을 받는다. 특정 영역의 허혈 또는 경색은 특정 증상 및 임상적 결과를 유발한다.
고혈압, 상승된 콜레스테롤, 낮은 HDL(고밀도 지단백질), 흡연, 당뇨병, 연령, 성, 운동부족 및 심장 질환의 가족력은 죽상동맥경화증 발병의 위험 요인이다.
죽상동맥경화 질환은 동적 과정이며 죽상 형성의 진행은 혈장 지단백질이 감소되는 경우에 둔화될 것이다. 몇가지 약리학적 접근법은 고지혈증의 근본적 원인에 따라 성공적이다. 식이 제한은 가장 먼저 이행되지만 약물 요법의 일부로서 지속되어야만 한다.
대부분의 고지혈증 환자는 콜레스테롤 및 포화 지방이 제한된 식이에 잘 응할 것이다. 총 지방 열량은 20 내지 25%여야하며, 이 중 포화 지방은 총 칼로리의 8% 미만이고 콜레스테롤은 200mg/d여야한다. 증가된 섬유질 및 복합 탄수화물이 권장된다. 이러한 식이는 혈청 콜레스테롤을 20 내지 30%로 감소시킬 수 있다.
니아신(니코틴산)은 LDL 생산을 억제함으로써 혈장 LDL 수준을 감소시킨다. 간의 콜레스테롤 합성도 또한 억제된다. HDL 수준은 HDL 파괴가 감소됨으로 인해 증가된다. 응혈 단백질 피브리노겐은 감소되고 '응혈 제거제'인 조직 플라스미노겐 활성화인자는 증가되는데, 이 두가지 모두는 플라크에서 응혈 형성을 제한하는데 중요할 수 있다.
부작용에는 피부에서의 혈관확장 및 온감각, 오심, 복부 불쾌감, 발진 또는 건조한 피부가 포함된다. 니아신은 비타민이나, 콜레스테롤을 저하시키는 용량에서 일부 부작용을 가질 수 있어 니아신을 수용하는 환자를 내과의가 모니터링해야 한다.
클로피브레이트는 트리글리세라이드가 풍부한 지단백질의 제거율을 증가시키고 간에서의 콜레스테롤 생합성을 간접적으로 억제한다. 이의 작용은 지단백질을 파괴하는 효소의 자극을 통한 것이다. 가장 통상적인 부작용은 복부 불쾌감 및 오심이다. 드문 독성 작용에는 피부염, 간기능장애, 골수 억제작용(bone marrow depression)이 포함되며 때로는 남성 성욕 감소가 포함된다.
콜레스티폴과 같은 담즙산 결합 수지는 경구 투여되는 가장 큰 양이온성 교환 수지이다. 창자에서 이는 답즙산에 결합하여 이의 재흡수를 방지한다. 그 결과는 답즙산의 배출율 증가 및 혈장중 LDL 수준의 저하이다. 가장 통상적인 부작용은 변비, 복부팽만, 흉부작열감 및 설사이다.
네오마이신은 혈장 LDL를 감소시킴으로써 장의 콜레스테롤 및 담즙산 재흡수를 억제하는 항생제이다. 심지어 저용량의 네오마신에서도 몇가지 부작용이 일어날 수 있다. 오심, 복통, 설사 및 흡수불량이 일어날 수 있다. 또한, 내성 미생물이 증식하여 소장결장염(장 및 결장의 염증)을 유도할 수 있다.
스타틴은 현재 입수가능한 가장 효과적인 콜레스테롤 저하 약물이다. 스타틴에는 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴이 포함된다. 스타틴은 혈중의 LDL 콜레스테롤(나뿐 콜레스테롤로서 고려됨)와 트리글리세라이드를 저하시키는 반면에, HDL 콜레스테롤은 증가시킨다. HDL 콜레스테롤은 콜레스테롤을 콜레스테롤이 분해될 수 있는 간으로 운반하기 때문에 "좋은 콜레스테롤"로서 고려된다. 이들 약물은 주로 이의 효능, 트리글리세라이드를 저하시키는 능력 및 비용에 있어 상이하다. 그러나, 스타틴은 일반적으로 약 50% 이하로만 효과적이다.
콜레스테롤은 죽상동맥경화증에서 관찰된 혈관내의 해로운 플라크 형성에의 관여를 포함하는 이의 심각한 부작용에 대해 익히 공지되어있으나, 콜레스테롤은 스테로이드 호르몬 및 답즙산의 합성에도 사용되며 세포막의 성분으로서 중요하다. 식이로서 소비되는 콜레스테롤 이외에도, 신체는 콜레스테롤을 생산하기도 한다. 일반적으로, 세포내의 콜레스테롤 합성에 있어 속도 제한 단계는 HMG-CoA 리덕타제로 지칭되는 효소의 작용을 포함하는 것으로 사료된다. HMG-CoA 리덕타제 억제제로서도 지칭되는 스타틴은 이러한 효소를 억제하여, 콜레스테롤을 합성하는 세포의 능력을 감소시킨다.
죽상동맥경화증 유래의 손상은 협소해진 동맥을 통해 혈류를 제한하는 죽상경화성 플라크 뿐만 아니라 취약한 플라크의 파열로 인해 초래된다. 사실, 대부분의 문제는 혈병 형성을 개시하는 물질을 방출하는 파열된 플라크로부터 기인한다. 플라크내의 콜레스테롤로 충전된 스캐빈저형 세포는 플라크가 파열될 수 있도록 하는 물질을 분비한다. 스타틴은 플라크를 안정화시키는 것으로 보인다. 최근의 연구는 스타틴이 내피 세포층을 개선시킨다고 제시한 바 있다. 내피는 혈병 형성 및 용해에 관여하고, 관상 질환을 앓는 환자에서 제대로 기능하지 않는 것으로 보인다.
스타틴은 각종 부작용과 관련되므로 많은 환자에 의해 잘 허용되지 않는다.예를 들어, 스타틴에 의한 간 독성의 위험이 있어 혈액 시험이 통상적으로 모니터링된다. 게다가, 이들 약물과 상호작용하는 다수의 약물 및 일부 식품이 있다. 일부 환자에서 스타틴은 근육 염증(근육병증)을 유발한다. 사실, 이는 일부 기타 콜레스테롤 저하 약물 또는 에리트로마이신을 투여받은 환자에서 흔히 일어난다. 근육 통증의 발생은 매우 심각할 수 있다. 다수의 경우에 근육 경련은 횡문근융해증으로 공지된 중증 형태의 근육 염증으로 진행되며 신부전을 유발할 수 있다. 폐경기 여성에 대한 이들 약물의 추가의 잇점은 이들 약물이 골다공증 및 이로 인한 골절의 위험을 골 성장을 자극함으로써 감소시킬 수 있다는 점이다.
콜레스테롤을 저하시키는 다양한 일반 의약품(Over-the-Counter; OTC) 보충제는 미장유로부터 제조된다. 이는 비타민 E와 유사한 활성을 갖는 토코트리에놀을 함유한다. 이는 신체에 의한 콜레스테롤의 합성을 감소시키는데 있어 스타틴과 유사하게 작용한다. 아직까지 이의 효능과 안정성은 확립되지 않앗다.
상기한 요법이 불충분하기 때문에, 죽상동맥경화증에 연루된 경로를 이해하고자 상당한 노력을 해왔다. 특히, 예를 들어, 개선된 콜레스테롤 저하제를 동정하기 위해 콜레스테롤 항상성 경로를 이해하고자 하는 노력을 해왔다. 예를 들어, SHP가 콜레스테롤 항상성 경로에서 지적되어 왔다. 구체적으로는, 간의 담즙산 항상성은 담즙산의 흡수 및 합성에 관여하는 유전자의 음성 피드백 억제에 의해 조절되고 담즙산은 억제성 핵 수용체로서 작용하는 SHP의 답즙산 수용체(fxr) 활성화를 통해 담즙산 합성의 속도 제한 유전자인 콜레스테롤 7알파-하이드록실라제(cyp7a)를 하향조절하는 것으로 보고되어 왔다[참조: Denson et al., Gastroenterology,121(1) :218-20 (2001)]. SHP 유전자에 의해 암호화된 단백질은 추정상의 리간드-결합 도메인을 함유하지만 통상의 DNA-결합 도메인이 결여된 고아 수용체(orphan receptor)이다. 상기 단백질은 소형 소수성 호르몬에 의해 조절되는 전사 인자 그룹인 핵 호르몬 수용체 계열의 구성원으로서, 상기 그룹의 하위부류는 공지된 리간드를 갖지 않으며 고아 핵 수용체로서 지칭된다. 사람 고아 핵 호르몬 수용체 SHP 단백질은 처음에 문헌[참조: Seol, W. et al., Science, 272: 1336-39 (1996)]에 의해 특성화되었다. 그러나, 현재까지 아무도 SHP를 억제할 수 있는 화합물을 동정하지 못했다.
죽상동맥경화증의 예는 예시적이며, 유사 경우가 예를 들어, 신장 질환 및 염증성 장 질환과 같은 광범위한 기타 상태 및 질환에 대해 있을 수 있다. 각 경우에, 상태의 예방 및/또는 치료에 대한 이전의 접근법은 이의 효능 및/또는 환자에 의한 허용성의 측면에서 불충분하다. 따라서, 염증 유전자 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 상태에 대한 효과적이고 환자에 의해 잘 허용되는 제제에 대한 상당한 요구가 지속되어 왔다.
게다가, 이전에는 염증 유전자 경로 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP 또는 FXR의 활성을 억제하는데 효과적인 제제를 효과적이면서 신뢰할 수 있으며 저렴하게 동정하거나, 이에 근거하여, 피험자에서 염증 질환 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 상태에 대해 효과적인 제품을 개발하기 위해 유용한 방법이 없었다.
따라서, 염증 유전자 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성을 감소시키는데 효과적인 제제의 동정뿐만 아니라, 상기 제제를 동정하는데 사용되는 감염된 세포주, 백신 및 프로모터에 대한 요구가 지속되어 왔다. 또한, SHP 및 FXR과 같은 핵 수용체의 억제제로서 효과적인 제제 뿐만 아니라 이를 포함하는 치료학적 조성물에 대한 요구가 지속되어 왔다. 또한, 상승된 콜레스테롤 수준을 감소시키는데 효과적인 조성물 및 죽상동맥경화증 및 상승된 콜레스테롤 수준과 관련된 기타 상태의 예방 및 치료에 대한 요구뿐만 아니라, 염증성 장 질환 및 신장 질환과 같은 염증 질환에 대해 효과적인 조성물에 대한 요구가 지속되어 왔다. 게다가, 염증 유전자 활성 및 콜레스테롤 생합성과 관련된 상태와 같은 수많은 관련 상태에 대해 일반적으로 효과적인 조성물 및 요법이 요구된다. 또한, 상기 조성물의 효과적인 제조 및 투여 방법도 또한 요구된다.
발명의 요약
상기한 요구 및 기타 요구를 충족하기 위해, 이러한 목적의 측면에서 본 발명은 염증 질환 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성의 억제제로서 효과적인 제제를 동정, 제조 및 투여하는 방법 및 상기 방법에서 사용하기 위한 감염된 세포주, 벡터 및 프로모터를 제공한다. 당해 제제의 동정 방법은 정확하고 매우 효과적이며 저렴하다.
본 발명의 양태는 제제를 (i) 짧은 이종이량체 단백질(short heterodimer protein; SHP) 또는 (ii) 파르네소이드 X 수용체(farnesoid X receptor; FXR)를 발현하고 NF-κB 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 포함하는 세포 배양물에투여하는 단계 및 세포 배양물내에서 상기 검출가능한 물질의 증가를 유발하는 제제를 선별하는 단계를 포함하는, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)을 억제하는데 효과적인 인자를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 본원에서 기술하는 본 발명의 방법 중 어느 하나에 의해 선별된 제제를 투여함을 포함하여, 피험자에서 염증 유전자 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 상태를 예방하거나 개선시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 본원에서 기술하는 본 발명의 방법 중 어느 하나에 의해 선별된 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 핵 전사 인자 NF-κB 프로모터/루시페라제(luc) 유전자 리포터를 포함하는 벡터로 감염되었거나 형질감염되었거나 변경된, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)을 발현하는 세포 배양물에 투여한 경우에 루시페라제의 증가를 유발함을 특징으로 하는 인자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 NF-κB 프로모터 및 검출가능한 물질 유전자를 포함하는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 제공하며, 여기서 상기 NF-κB 프로모터는 상기 검출가능한 물질 유전자의 앞에 위치한다.
본 발명의 추가의 양태는 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8 또는 이들의 배합물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 CYP7A1, CYP8B1 또는 SHP 프로모터를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 비천연적으로 탈활성화된 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR) 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 서열 1 내지 4 중 어느 하나에 결합하는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기한 일반적 설명 및 하기의 상세한 설명은 예시적이며, 본 발명을 제한하하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 염증 질환 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성의 억제제로서 효과적인 제제를 동정하는 방법 및 죽상동맥경화증, 염증성 장 질환, 신장 질환과 같은 염증 질환 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 상기 제제를 포함하는 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 염증 유전자 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성의 억제제로서 효과적인 제제에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 짧은 이종이량체(SHP) 및 파르네소이드 X 수용체(FXR)과 같은 핵 수용체의 억제제에 관한 것이다. 본 발명은 염증 유전자 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 질환 또는 상태를 예방 및/또는 치료하는데 효과적인 조성물을 포함하여, 이러한 억제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 염증 유전자 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성을 억제하는 제제를 제조하고 동정하는데 사용하기 위한 감염된 세포주 및 벡터에 관한 것이다.
도 1은 에티닐에스트라디올에 의해 IL-1β 유전자 발현이 억제됨을 예시하는 선 그래프이다.
도 2는 IL-1β에 의한 HepG2 내의 SHP 발현의 억제를 예시하는 선 그래프이다.
도 3a, 3b 및 3c는 Fnk, JAB 및 LIX의 에티닐에스트라디올 억제가 IL-1β에 특이적임을 예시하는 막대 그래프이다.
도 4a, 4b, 4c, 4d 및 4e는 에티닐에스트라디올이 에스트로겐 수용체(ER) 의존작 기작에 의해 유전자 발현의 IL-1β유도를 차단함을 예시하는 막대 그래프이다.
도 5a, 5b, 5c, 5d 및 5e는 ERα가 간내에서 에티닐에스트라디올 조절을 위해 필요함을 예시하는 막대 그래프이다.
도 6a 및 6b는 유전자 발현의 에티닐에스트라디올 유도가 IL-1β유전자 유도의 ERα에 필요하지 않음을 예시하는 막대 그래프이다.
도 7a, 7b, 7c, 7d 및 7e는 IL-1β의 에티닐에스트라디올 억제가 폐에서 부재임을 예시하는 막대 그래프이다.
도 8은 HepG2 세포에서 NFκB 활성의 IL-1β유도의 ERα및 Erβ 억제를 도시하는 막대 그래프이다.
도 9는 마우스 간에서 ERα에 의한 SHP 발현의 조절을 도시하는 막대 그래프이다.
도 10은 랫트 간에서 에스트로겐에 의한 SHP의 조절을 예시하는 막대 그래프이다.
도 11a 및 11b는 ERα가 사람 세포에서 hSHP 프로모터 활성을 조절함을 예시하는 막대 그래프이다.
도 12a 및 12b는 ERα가 293 세포에서 hSHP 프로모터 활성을 조절함을 예시하는 막대 그래프이다.
도 12c는 ERα가 293 세포에서 hSHP 프로모터 활성을 조절함을 예시하는 선 그래프이다.
도 13은 293 세포내의 E2 반응 요소의 위치를 예시하는 지도이다.
도 14a, 14b 및 14c는 SHP의 ER 유도가 CYP7A1 및 CYP8B1을 억제하지 못함을 예시하는 막대 그래프이다.
도 15는 CYP7A1 및 CYP8B1의 콜레이트 억제가 SHP 유도를 필요로 하지 않음을 예시하는 선 그래프이다.
도 16은 HepG2에서 HNF4/pSI에 의해 유도된 CYP8B1 프로모터에 대한 SHP/pSI의 역가측정으로 초래된 루시페라제 활성을 도시한 것이다.
도 17은 간의 TNF-알파, VCAM-1 및 RANTES mRNA의 수준의 용량 의존적 유도를 예시하는 그래프이다.
도 18a 및 18b는 UDCA 및 CA를 사용한 경우의 상대적 SHP 발현을 예시하는 그래프이다.
도 19는 HepG2 세포내의 CDCA의 상대적 발현을 예시하는 그래프이다.
도 20a는 HepG2 세포내의 GW 4064의 상대적 발현을 예시하는 그래프이다.
도 20b는 CDCA 또는 GW 4064 처리에 의해 용량 의존적 방식으로 유도된 M-CSF 발현을 예시하는 그래프이다.
도 21a 내지 21d는 콜레이트에 대한 염증 유전자 발현 의존성을 예시하는 막대 그래프이다.
도 22a 및 22b는 급성 콜레이트 처리가 용량 의존적 방식으로 염증 유전자 발현을 유도함을 예시하는 선 그래프이다.
도 23a 및 23b는 UDCA가 염증 유전자 발현을 유도하지 않음을 예시하는 막대 그래프이다.
도 24a 및 24b는 FXR 효능제가 HepG2 세포에서 ICAM-1 발현을 유도함을 예시하는 선 그래프이다.
도 25는 GW 4064가 생체내에서 ICAM-1 발현을 유도함을 예시하는 선 그래프이다.
도 26은 GW 4064가 ICAM-1 프로모터 발현을 유도함을 예시하는 막대 그래프이다.
담즙산은 장으로부터의 지용성 영양소의 분해 및 흡수에 필수적인 양쪽성 스테로이드 세정제로서, 담즙산과 콜레스테롤 대사를 조절하는 핵 수용체 파르네소이드 X 수용체(FXR)에 대한 리간드인 것으로 제시되었다. 담즙산은 간에서 합성되고 담즙산으로 배출되어 회장에서 재흡수된 다음, 문맥순환을 통해 다시 간으로 수송되어, 속도 제한 효소인 콜레스테롤 7α-하이드록실라제(cyp7a)를 암호화하는 유전자를 억제함으로써 담즙산 합성을 억제한다. 고아 핵 수용체 SHP(짧은 이종이량체 단백질)의 FXR-매개된 유도는 cyp7a 발현을 조절하는 전사 인자인 LRH-1(간 수용체 동족체-1) 활성의 SHP의 길항작용을 통해 cyp7a의 억제를 야기한다[참조: Goodwin '00 Cell & Lu'00 Cell]. 따라서, 고지혈증 및 담즙정체성 간 질환을 조절하는데 있어 FXR 및 SHP 길항제의 치료학적 가능성이 제안되어 왔다.
예상치못하게도, FXR 신호전달 경로에 대한 새로운 기능이 간에서의 염증 유전자 발현을 유도하는 가능성과 관련된다는 것이 발견되었다. 담즙산은 간의 대식세포에서 특성화되지 않은 기작을 통해 염증 사이토킨을 유도하는 것으로 이전에 입증되었다[참조: Miyake et al '00 JBC 275: 21805]. FXR을 통한 신호전달 이외에도, 담즙산은 염증 유전자 발현을 또한 야기할 수 있는 단백질 키나제 C 신호전달 경로[참조: Stravitz '95 JLR]를 직접적으로 활성화시키는 것으로 나타났다. 본원에서, 본 발명자들은 간 세포주인 HepG2에서 염증 유전자 발현을 직접적으로활성화시키는 활성화된 FXR의 능력을 입증한다. HepG2 세포를 담즙산, 케노디옥시콜산(CDCA) 또는 합성 FXR 리간드 GW 4064로 처리한 결과, 염증 유전자 세포내 부착 분자(ICAM-1) 및 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)가 유도되었다. 게다가, 다음의 증거는 FXR 신호전달이 SHP 발현의 유도를 통해 NF-κB 매개된 염증 유전자 발현을 유도함을 나타낸다. 이러한 결과는 염증 유전자 발현을 촉진하는데 있어서의 활성화된 FXR의 새로운 역활을 제안한다. FXR이 주로 간, 장, 부신 및 신장에서 발현되기 때문에, FXR 또는 SHP 길항제는 예를 들어, 죽상동맥경화증, 염증성 장 질환 및 신장 질환과 같은 질환에서 소염 활성을 나타낼 수 있다.
상기한 예상치 못한 발견을 토대로 하여, 콜레스테롤 생합성 경로 및/또는 염증 유전자 발현 경로에서 FXR 및/또는 SHP를 억제하는 제제를 동정하는 방법이 본원에서 제공된다.
"조성물" 또는 "치료학적 조성물" 또는 "조성물들" 또는 "치료학적 조성물들"이란 용어는 각각 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 복수형은 각 용어의 단수형을 포함하며 단수형은 각 용어의 복수형을 포함한다.
특정 성분을 "포함하는" 것으로 기술되는 조성물은 동일한 성분으로 본질적으로 이루어지거나 동일한 성분으로 이루어진 조성물을 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료학적 조성물"이란 용어는 세포, 조직, 기관 또는 시스템을 내적으로 및 외적으로 치료하기에 유용한 조성물을 의미한다.
본원에서 사용되는 "치료학적 유효량"이란 용어는 목적하는 의학 상태를 치료하기에 유효한 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는"이란 용어는 이렇게 기술되는 조성물 또는 이의 성분이 과도한 독성, 부적합성, 불안정성, 알레르기 반응 등이 없이 피부, 조직 또는 막에서 사용하기에 충분히 순도가 높고 적합함을 의미한다.
"상승된 콜레스테롤 수준"이란 용어는 당해 분야의 숙련가가 건강에 해로우며 일부 종류의 치료용으로 부적절한 대상으로서 고려할 수 있는 저밀도 지단백질(LDL) 콜레스테롤의 혈청 수준을 의미한다. 통상적으로, 220mg/dL(L당 5.7mmol)을 초과하는 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 건강하지 못한 것으로 고려되며 치료 대상이 된다.
본 발명은 염증 질환 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성의 억제제로서 효과적인 제제 및 조성물을 제조하고 동정하는 방법 및 상기 조성물을 사용하여 피험자에서 콜레스테롤 생합성과 관련된 염증 질환 또는 상태를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 염증 유전자 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성을 억제하는 제제를 제조하고 동정하는데 사용하기 위한 감염된 세포주 및 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 염증 유전자 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성의 억제제로서 효과적인, 본 발명의 방법으로 동정된 제제를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 및 파르네소이드 X 수용체(FXR)와 같은 핵 수용체의 억제제 및 특히, 염증 유전자 경로 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP 및 FXR의 억제제에 관한 것이다. 본 발명은 죽상동맥경화증, 염증성 장 질환 및 신장 질환과 같은 염증 유전자 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 질환 또는 상태를 예방 및/또는 치료하는데 효과적인 조성물을 포함하여, 이러한 억제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 상승된 콜레스테롤 수준 및 관련 질환, 예를 들어, 죽상동맥경화증을 개선시키고 예방하는 조성물 및 방법을 제공한다. 상승된 콜레스테롤 수준 및 관련 상태를 개선 및 예방하는데 유용한 조성물을 동정하기 위해, 본원에서는 콜레스테롤 항상성 경로에서 SHP 활성을 억제하는 제제를 스크리닝하는데 매우 효율적이고 효과적인 방법이 제공된다.
본 발명의 치료학적 조성물은 단독으로 또는 임의의 기타 의학적 및/또는 치료 접근법과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 치료학적 조성물의 사용과 관련되는 유해한 부작용 또는 문제는 공지되어 있지 않다.
본 발명의 조성물 및 방법은 상태를 앓지는 않지만 특정 상태 또는 조합된 상태의 위험이 정상보다 높은 것으로 간주될 수 있는 개체에게 적절하다.
예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 일부 경우에, 콜레스테롤 수준이 상승되지 않았지만 콜레스테롤 수준의 상승 또는 이와 관련된 질환의 위험이 있는 것으로 간주될 수 있는 개체에게도 적절하다. 광범위한 위험 요소, 예를 들어, 고혈압, 상승된 콜레스테롤, 낮은 HDL(고밀도 지단백질), 흡연, 당뇨병, 연령, 성(35세 내지 44세의 백인 남성은 사망율은 백인 여성에 비해 6배 높다), 운동 부족, 심장 질환의 가족력 등이 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 고려될 수 있다. 예를 들어, 제한됨이 없이, 본 발명의 조성물은 유전적으로, 상승된 콜레스테롤 수준 또는 이와 유전적으로 관련된 질환, 예를 들어, 죽상동맥경화증에 걸리기 쉬운것으로 밝혀진 사람, 저밀도 지단백질(LDL) 수준이 낮은 사람, 혈압이 높은 사람, 특정 연령대의 사람 등에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 낮은 LDL의 경우, 상승된 혈청 고밀도 지단백질(HDL) 콜레스테롤 수준은 심장보호성인 것으로 사료되는 한편, 낮은 LDL 수준은 조기 CHD(관상 심장 질환)의 잠재적 예측인자이다. 분리된 낮은 HDL 수준은 dL당 35mg(L당 0.90mmol) 이하의 HDL 콜레스테롤 수준, dL당 160mg(L당 4.15mmol) 미만의 LDL 콜레스테롤 수준 및 dL당 250mg(L당 2.83mmol) 미만의 트리글리세라이드 수준으로서 정의된다. 물론, 신규한 조사법이 이용가능해짐에 따라 상기한 모든 위험 요소가 시간에 따라 변화될 수 있다. 본 발명은 임의의 이러한 변화를 고려하는 것으로 의도된다. 추가로, 당해 분야의 숙련가라면 이러한 상황을 용이하게 확인하고 본원에서 제공되는 지침에 근거하여 본 발명의 조성물을 적절히 투여할 수 있을 것이다.
핵 호르몬 수용체는 다양한 생리학적 과정, 발달 과정 및 독성학적 과정에 관여하는 리간드-활성화된 전사 인자이다[참조: Mangelsdorf et al. , 1995; Blumberg and Evans, 1998; Kliewer et al. , 1999]. 이들 수용체는 고도로 보존된 DNA 및 리간드 결합 도메인을 갖으며 이의 이량체화 특성에 기초하여 두 그룹으로 세분화된다. 제1 그룹은 에스트로겐, 프로게스테론 및 글루코코르티코이드 수용체를 포함하며, 이들 모두는 이의 동족 DNA 반응 요소에 이량체로서 결합한다. 제2 그룹은 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체(PPAR), 레티노산 수용체(RAR), 비타민 D 수용체 및 갑상선 호르몬이 포함되며, 이들 모두는 레티노이드 X 수용체(RXR)로서 공지된 공통된 파트너와 함께 이량체를 형성한다.
고도로 보존된 핵 수용체 슈퍼패밀리 DNA 결합 도메인[참조: Forman et al., 1995]으로부터 유래된 축퇴 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 랫트 간 cDNA 라이브러리로부터 분리된 파르네소이드 X 수용체(FXR)는 상기 제2 그룹에 속한다. 메발로네이트 경로의 이소프렌 대사물인 고농도의 파르네솔은 FXR을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Forman et al., 1995]. 마우스 오르톨로그(ortholog) RIP14는 효모 2하이브리드 검정에서 미끼(bait)로서 사람 FXR 리간드 결합 도메인을 사용하여 클로닝되었으며 파르네소이드에 의해서만 미약하게 활성화되는 것으로 밝혀졌다[참조: Seol et al., 1995]. 대신에, 레티노산 및 합성 레티노산 TTNPB {(E)-4-[2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프틸레닐)-l-프로페닐]벤조산)은 생리학적량 이상의 농도에서도 FXR의 잠재적 활성화인자인 것으로 입증되었다[참조: Zaviacki et al., 1997]. 파르네소이드 및 레티노이드는 유익한 FXR의 초기 특성화를 가능하게 하는 한편, 활성화에 필요한 고농도는 이들 화합물이 내인성 리간드에 대한 전구체이거나 일부 기타 관련 생리학적 리간드(들)을 모사한다는 것을 제시한다.
SHP는 미공지된 리간드를 갖는 핵 호르몬 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. SHP 단백질의 상동성을 이용한 분자 모델링은, SHP(백색 선)가 레티노산(적색 선)과 복합체화된 RXR의 리간드 결합 도메인에 대해 모델링되어 있는 도면에 하기 제시하는 바와 같이 고전적 리간드 결합된 수용체 입체형태를 달성할 수 있음을 제안한다. SHP는 필수적 소수성 아미노산 및 공활성화인자 또는 공억제인자와의 전하 클램프(charge clamp) 상호작용의 형성을 위해 필수적인 음하전된 아미노산을 포함하는 고전적 나선 12를 함유한다.
다음은 본원에서 서열 1로서 지정된, 짧은 이종이량체 단백질(SHP)를 암호화하는 유전자에 대한 핵산 서열이다.
SHP 유저자의 핵산 서열(서열 1)
다음은 본원에서 서열 2로서 지정된, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 폴리펩타이드의 아미노산 서열이다.
SHP 폴리펩타이드의 아미노산 서열(서열 2)
다음은 FXR을 암호화하는 유전자의 핵산 서열이다.
FXR 유전자의 핵산 서열(서열 3)
다음은 FXR의 아미노산 서열이다.
FXR 폴리펩타이드의 아미노산 서열(서열 4)
본 발명은, 예를 들어, SHP 또는 FXR에 결합하거나 이와 경쟁함으로써 염증 유전자 경로 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP 및/또는 FXR의 활성을 억제하는 제제(예: 소형 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 재조합 수용체, 항체 등)의 동정 및/또는 개발에 관한 것이다. 이들 제제는 콜레스테롤 항상성 경로에서 담즙산 합성에 미치는 SHP 또는 FXR의 음성 효과를 억제하여 혈청 LDL 콜레스테롤 수준을 효과적으로 저하시키고/시키거나 염증 유전자 발현 경로에서 SHP 또는 FXR의 음성 효과를 억제할 수 있다.
SHP 또는 FXR 억제제의 동정 방법
SHP 또는 FXR에 대한 공지된 리간드가 없기 때문에, 이들의 활성에 영향을 미치는 분자를 동정하는 결합 검정은 불가능하다. 본 발명은 염증 유전자 발현 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP 및/또는 FXR 활성을 억제하는 제제를 동정하기 위한 신규한 접근법에 관한 것이다.
본원에서 예시로서 입증되는 바와 같이, 본 발명자들은 에스트로겐이 ERα 의존적 기작을 통해 SHP의 발현을 유도할 수 있음을 확립하였다. 이러한 SHP의 유도는 담즙산 합성 및 간세포내의 담즙산 수준을 감소시킨다고 단정될 수 있었다. 이는 혈장 트리글리세라드의 증가를 동반한 FXR의 감소된 활성 및 apoCII의 감소된 생성을 초래할 수 있다. 게다가, 담즙산 합성의 감소는, 담즙내의 담즙산 대 콜레스테롤의 비를 감소시킴으로써 담석 형성 경향의 감소를 유도할 수 있다. 놀랍게도, 호르몬 대체 요법 중인 여성은 이러한 2가지 효과를 나타낸다: 이들은 트리글리세라이드 수준이 증가되었으며 담석 발생율이 증가되었다. 이는 SHP 활성의 약리학적 조작이 관찰가능한 생리학적 변화를 초래함을 제안한다. 따라서, SHP 활성의 억제는 콜레스테롤의 담즙산으로의 전환을 증가시키고 트리글리세라이드 수준을 감소시킨다. 이것은 죽상동맥경화증을 앓는 환자에서 매우 바람직한 효과이다.
본 발명의 양태에 따라서, 염증 유전자 발현 경로 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP 또는 FXR 억제제를 동정하는 방법은 스크리닝 검정을 포함한다. 상기 스크리닝 검정은 후보 제제를 입수한 다음, 이 후보 제제를 (i) SHP 또는 (ii) FXR을 발현하고 NF-κB 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 포함하는 세포 배양물에 투여함을 포함한다. SHP 및/또는 FXR을 억제하는 후보 제제는 검출가능한 물질의 증가를 유발할 것이다. 따라서, 효과적 억제제는 각 후보 인자를 투여한 후에 감염된 세포 배양물 내의 검출가능한 물질의 증가에 대해 모니터링함으로써 임의의 수많은 가능한 후보 인자로부터 선별할 수 있다.
양태에 따라서, NF-κB 프로모터는 티미딘 키나제(TK) 프로모터를 포함하며,상기 TK 프로모터의 상부에는 NF-κB 반응 요소의 2개의 복사체가 존재한다.
본 발명의 양태에 따른 SHP 억제제를 동정하는 또 다른 방법은, 일반적으로 전체길이 LRH-1 및 SHP 클론을 작제하고, LRH-1 수용체를 구축하고, 아데노바이러스 작제물을 개발하고, 세포주를 선별하고, 스크리닝 패러다임을 확립함을 포함한다. 본 발명의 실시에 따라서, 본 과정은 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터를 클로닝하는 단계; 클로닝된 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터를 검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 앞에서 벡터내로 삽입하여 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 리포터를 형성하는 단계; SHP 및 임의로 HNF4α를 발현하는 세포 배양물을 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 리포터로 감염, 형질감염 또는 변경하여, 감염된 세포 배양물을 형성하는 단계; 감염된 세포 배양물에 제제를 투여하는 단계; 및 감염된 세포 배양물내에서 검출가능한 물질(예: 루시페라제)의 증가를 검출하는 단계를 포함한다.
콜레스테롤 생합성 경로 및/또는 염증 유전자 발현 경로 둘다에서 억제제로서 효과적인 특정 제제를 동정하는 방법이 본원에서 제공된다. 본 발명의 다른 실시에 따라서, 본 과정은 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터를 클로닝하는 단계; 클로닝된 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터를 검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 앞에서 벡터내로 삽입하여 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 리포터를 형성하는 단계; SHP 및 임의로 HNF4α를 발현하는 세포 배양물을 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 리포터로 감염시켜 감염된 세포 배양물을 형성하는 단계; 감염된 세포 배양물에 제제를 투여하는 단계; 및 감염된 세포 배양물내에서 검출가능한 물질(예: 루시페라제)의 증가를 검출하는 단계; CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터를 클로닝하는 단계; 클로닝된 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터를 검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 앞에서 벡터내로 삽입하여 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 리포터를 형성하는 단계; SHP 및 임의로 HNF4α를 발현하는 세포 배양물을 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자(예: 루시페라제(luc) 유전자) 리포터로 감염시켜 감염된 세포 배양물을 형성하는 단계; 감염된 세포 배양물에 제제를 투여하는 단계; 및 감염된 세포 배양물내에서 검출가능한 물질(예: 루시페라제)의 증가를 검출하는 단계를 포함한다.
양태에 따라서, SHP 및/또는 FXR의 단백질 수준을 모니터링하여 당해 제제가 단백질에 작용하는지 또는 뉴클레오타드 수준에서 작용하는지를 결정한다. 예를 들어, SHP를 발현하는 세포를 태그화(예를 들어, 에피토프 태그화에 의해 또는 6개 또는 7개의 아미노산의 플래그 태그를 사용하여)한 다음, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 일부 적합한 기술을 사용하여 수준을 모니터링한다.
다음 내용은 상기한 방법을 실시하기 위한 다양한 양태를 설명한다. 추가로, 임의의 후보 화합물이 SHP 억제제인지를 동정하기 위한 특이적 검정의 경쟁적 수행을 나타내는 구체적 예가 하기에 제시된다(실시예 3 및 4 참조). 실시예 3은세포 배양물의 플라스미드로의 형질감염을 사용하여 본 발명의 한가지 실시에 따른 검정을 수행하기 위한 특수한 과정을 제공한다. 실시예 4는 세포 배양물을 아데노바이러스로 감염시키기에 바람직한 특수한 과정을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여, SHP 및 FXR 억제제를 동정할 수 있다. 본원에서 제공된 내용에 기초하여, 당해 분야의 숙련가라면 상기 방법을 본 발명의 다양한 양태에 따라서 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 따라서, 당해 분야의 숙련가는 본원에서 제공된 정보에 기초하여 SHP 또는 FXR 억제를 동정하기 위한 검정을 용이하게 구성할 수 있을 것이다.
발현 시스템 및 벡터
숙주 세포(및 이를 포함하는 세포 배양물)는 발현 시스템, 이의 일부분 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 혼입되도록 유전적으로 조작한다. 숙주 세포내로 폴리뉴클레오타이드의 도입은 예를 들어, 문헌[참조: Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) and Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]의 방법, 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 트랜스벡션(transvection), 미세주사(microinjection), 초음파, 양이온성 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크레이퍼 부하(scrape loading), 탄도성 도입 또는 감염과 같은 다수의 표준 실험실 편람에 기술된 방법을 사용하여 달성한다.
적합한 숙주의 대표적 예로는 랫트 세포(예: 배양된 랫트 간암 세포), 마우스 세포(예: 마우스 간세포), 토끼 세포, 사람 세포 등과 같은 포유동물 세포가 포함된다. 예를 들어, 적합한 세포로는 HELA, 사람 간모세포종 세포주(HepG2), 사람 배아 신장 293 세포주(HEK293), 랫트 FTO-2B 세포, 랫트 McA-RH7777 또는 이들의 배합물이 포함된다.
재조합에 의해 제조된 폴리펩타이드는 고성능 액체 크로마토그래피, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 익히 공지된 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제한다.
매우 다양한 발현 시스템이 사용되고 있다. 이러한 시스템으로는 특히, 염색체, 에피좀성 및 바이러스 유래의 시스템, 예를 들어, 세균 플라스미드, 약독화된 세균(예: 살모넬라, 참조: 미국 특허 제4,837,151호), 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피좀, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스, 예를 들어, 우두 및 기타 폭스바이러스, 신드비스, 아데노바이러스, 배큘로바이러스, 파포바 바이러스(예: SV40), 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스, 알파바이러스(예: 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 참조: 미국 특허 제5,643,576호), 비분절 음성 쇄 RNA 바이러스(예: 수포성구염 바이러스, 참조: 미국 특허 제6,168,943)로부터 유래된 벡터 및 이들의 배합물로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 플라스미드와 박테리오파지 유전 요소(예: 코스미드 및 파지미드)로부터 유래된 벡터가 포함된다. 발현 시스템은 발현을 조절할 뿐만 아니라 유발하는 조절 영역, 예를 들어, 프로모터 및 기타 조절 요소(예: 폴리아데닐화 시그날)를 포함해야 한다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드를 유지시키거나 증가시키거나 발현하여 숙주내에서 폴리펩타이드를 생산하기에 적합한 모든 시스템 또는 벡터를 사용할 수 있다. 적절한 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 각각 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (supra)] 및 문헌[참조: Zhang et al., Journal of Biological Chemistry, 276 (45): 41690-41699 (2001); Goodwin et al., Molecular Cell, 6: 517- 526 (2000); and Sinal et al. Cell, 102: 731-744 (2000)]에 제시된 기법과 같은 익히 공지되어 있고 통상적인 다양한 기법 중 어느 하나를 사용하여 발현 시스템에 삽입시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 벡터(예: 발현 벡터, 서열화 벡터, 클로닝 벡터), 본 발명의 벡터로 유전전적으로 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 제조법을 제공한다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 제조하기 위해 세포 비함유 전사 시스템(cell-free translation system)을 사용할 수 있다.
바람직한 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 우두 바이러스, 배큘로바이러스 및 목적하는 세포 향성(向性)을 갖는 기타 재조합 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, 기능성 또는 돌연변이 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자를 바이러스 벡터를 사용하거나 DNA의 직접 도입을 통해 시험관내에서 도입할수 있다. 표적화된 조직내 발현은 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드를 이용하거나 조직 특이적 프로모터를 이용하거나 이들 둘다를 이용하여 형질전환 벡터를 특정 세포로 표적화하여 달성할 수 있다. 표적화된 유전자 전달은 PCT 공개공보 제WO 95/28494호에 기재되어 있다.
시험관내 과정용으로 통상적으로 사용되는 바이러스 벡터는 DNA계 벡터 및 레트로바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터를 작제하고 사용하는 방법은 당해 분야(예를 들어, 문헌[참조: Miller and Rosman, BioTechniques, 1992, 7: 980-990])에 공지되어 있다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 복제-결손인데, 즉 표적 세포에서 자율적으로 복제할 수 없다. 바람직하게는, 복제 결함성 바이러스는 최소량의 바이러스인데, 즉 게놈을 봉입하여 바이러스 입자를 생산하기 위해 필수적인 이의 게놈 서열만을 보유한다.
DNA 바이러스 벡터는 단순 포진 바이러스(HSV), 파필로마바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 약독화된 또는 결손 DNA 바이러스를 포함한다. 바이러스 유전자가 완전히 또는 거의 완전히 결여된 결손 바이러스가 바람직하다. 결손 바이러스는 세포로 도입된 후에는 감염성이 아니다. 결손 바이러스 벡터의 사용은 벡터가 다른 세포에 감염될 수 있다는 우려 없이 세포를 특정한 국소 영역에 투여할 수 있게 한다. 따라서, 특정 조직을 특이적으로 표적화할 수 있다. 특정 벡터의 예로는 결손 헤르페스 1형 바이러스(HSV1) 벡터[참조: Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 1991, 2: 320-330], 당단백질 L 유전자가 결여된 결손 헤르페스 바이러스 벡터 또는 기타 결손 헤르페스 바이러스 벡터[참조: PCT 공개공보 제WO 94/21807호 및 제WO 92/05263호]; 문헌[참조: Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 1992, 90:626-630; 또한 La Salle et al., Science, 1993,259: 988-990]에 기재된 약독화된 아데노바이러스 벡터; 및 결손 아데노-관련 바이러스 벡터[참조: Samulski et al., J. Virol., 1987, 61:3096-3101; Samulski et al., J. Virol., 1989, 63: 3822-3828; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 1988, 8: 3988-3996]가 포함된다.
Avigen, Inc.(Alameda, California; AAV 벡터), Cell Genesys(Foster City, California; 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 벡터 및 렌티바이러스 벡터), Clontech(레트로바이러스 및 배큘로바이러스 벡터), Genovo, Inc.(Sharon Hill, Pennsylvania; 아데노바이러스 및 AAV 벡터), Genvec(아데노바이러스 벡터), IntroGene(Leiden, Netherlands; 아데노바이러스 벡터), Molecular Medicine(레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 및 헤르페스 바이러스 벡터), Norgen(아데노바이러스 벡터), Oxford BioMedica(Oxford, United Kingdom; 렌티바이러스 벡터) 및 Transgene(Strasbourg, France; 아데노바이러스, 우두, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 회사들이 시판용 바이러스 벡터를 제조하고 있다.
아데노바이러스는 본 발명의 뉴클레오타이드를 다양한 세포 유형으로 효과적으로 전달하도록 변형시킬 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스의 다양한 혈청형이 존재한다. 이러한 혈청형 중에서, 본 발명의 범주내에서는 2형 또는 5형 사람 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스[참조: PCT 공개공보 제WO 94/26914호]를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 범주에서 사용할 수 있는 이러한 동물 기원의 아데노바이러스로는 개, 소, 쥐[참조: Mavl, Beard et al., Virology, 1990, 75-81], 양, 돼지, 조류 및 원숭이(예: SAV) 기원의 아데노바이러스가 포함된다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 보다 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스(예: 맨한탄 또는 A26/61 균주, 예를 들어, ATCC VR-800)이다. 다양한 복제 결손 아데노바이러스 및 최소 아데노바이러스 벡터가 기술되어 있다[참조: PCT 공개공보 제WO 94/26914호, 제WO 95/02697호, 제WO 94/28938호, 제WO 94/28152호, 제WO 94/12649호, 제WO 95/02697호, 제WO 96/22378호]. 본 발명에 따른 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 당해 분야의 숙련가에게 공된 임의의 기법[참조: Levrero et al., Gene, 1991, 101:195; 유럽 공개 공보 제EP 185 573호; Graham, EMBO J., 1984, 3:2917; Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36: 59]을 사용하여 제조할 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 당해 분야의 숙련가에 익히 공지된 표준 분자생물학 기법을 사용하여 회수 및 정제할 수 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV)는 이들이 감염되는 세포의 게놈내로 안정하고 부위-특이적인 방식으로 삽입될 수 있는 비교적 소형의 DNA 바이러스이다. 이는 세포 성장, 형태학 또는 분화에 대한 어떠한 효과도 야기하지 않으면서 광범위한 스펙트럼의 세포에 감염될 수 있으며, 사람 병리에는 관여하지 않는 것으로 보인다. AAV 게놈은 클로닝되고 서열화되고 특성화되었다. 시험관내에서 유전자를 전달하기 위한 AAV 유래의 벡터의 사용은 기재되어 있다[참조: PCT 공개공보 제WO 91/18088호 및 제WO 93/09239호; 미국 특허 제4,797,368호 및 제5,139,941호; 유럽 공개공보 제EP 488 528호]. 본 발명에 따른 복제 결손 재조합 AAV는 2개의 AAV 역방위 말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR) 영역에 의해 플랭킹되어 있는 관심대상의 핵산 서열을 함유하는 플라스미드와 AAV 캡시드형성(encapsidation) 유전자(rep 및 cap 유전자)를 보유한 플라스미드를 사람 헬퍼 바이러스(예: 아데노바이러스)로 감염된 세포주내로 공동 형질감염시켜 제조할 수 있다. 이어서, 제조된 AAV 재조합체를 표준 기법으로 정제한다.
다른 양태에서, 유전자는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제5,399,346호; Mann et al., Cell, 1983, 33:153; 미국 특허 제4,650,764호 및 제4,980,289호; Markowitz et al., J. Virol., 1988, 62:1120; 미국 특허 제5,124,263호; 유럽 공개공보 제EP 453 242호 및 제 EP 178 220호; Bernstein et al., Genet. Eng., 1985, 7:235; McCormick, BioTechnology, 1985, 3:689; PCT 공개공보 제WO 95/07358호; 및 Kuo et al., Blood, 1993, 82:845]에 기재되어 있는 바와 같은 레트로바이러스 벡터내에서 도입시킬 수 있다. 상기 레트로바이러스는 분열하는 세포에 감염되는 통합 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 2개의 LTR, 캡시드형성 서열, 3개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)를 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터에는, 일반적으로 gag, pol 및 env 유전자가 전체적으로 또는 부분적으로 결실되어 관심대상의 이종 핵산 서열로 대체되어 있다. 이들 벡터는 HIV, MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"), SNV("비장 괴사 바이러스"), RSV("라우스 육종 바이러스") 및 프랜드 바이러스와 같은 상이한 종류의 레트로바이러스로부터 작제할 수 있다. 적합한 포장 세포주, 특히 세포주 PA317[참조: 미국 특허 제4,861,719호], PsiCRIP 세포주[참조: PCT 공개공보 제WO 90/02806호] 및 GP+envAm-12 세포주[참조: PCT 공개공보 제WO 89/07150호]가 기재되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스 벡터는 전사 활성을 억제하기 위한 LTR내의 변형뿐만 아니라, gag 유전자의 일부분을 포함할 수 있는 광범위한 캡시드형성 서열을 함유할 수 있다[참조: Bender et al., J. Virol., 1987, 61: 1639]. 재조합 레트로바이러스 벡터는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 기법을 사용하여 정제한다.
레트로바이러스 벡터는 감염성 입자로서 작용하거나 1회의 형질감염을 수행하도록 작제할 수 있다. 전자의 경우에, 바이러스는 원발암성 형질전환 특성을 담당하는 유전자를 제외한 모든 자신의 유전자를 보유하고 이종 유전자를 발현하도록 개질시킨다. 비감염성 바이러스 벡터는 바이러스 포장 신호는 파괴하되, 이종 유전자 및 포장 신호를 함유하도록 조작된 공동-도입 바이러스를 포장하는 데 필요한 구조 유전자는 보유하도록 조작한다. 따라서, 생산된 바이러스 입자는 추가로 바이러스를 생산할 수 없다.
또한 레트로바이러스 벡터를 DNA 바이러스에 의해 도입하여, 1회 사이클의 레트로바이러스 복제를 가능하게 하고 형질감염 효능을 증폭시킬 수 있다[참조: PCT 공개공보 WO 제95/22617호, WO 제95/26411호, WO 제96/39036호 및 WO 제97/19182호).
다른 양태에서, 뇌, 망막, 근육, 간 및 혈액을 포함한 몇몇 조직 유형에서 형질유전자의 직접적 전달 및 지속 발현을 위한 제제로서 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 사용할 수 있다. 당해 벡터는 이들 조직내의 분열 및 비분열 세포를 효과적으로 형질도입하고 관심있는 유전자의 장기 발현을 유지시킬 수 있다. 검토를 위해, 문헌[Naldini, Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9:457-63]을 참조하고; 또한, 문헌[Zufferey et al., J. Virol., 1998, 72:9873-80]을 참조한다. 렌티바이러스 포장 세포주는 입수가능하며 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 이들은 유전자 요법을 위한 고역가 렌티바이러스 벡터의 제조를 촉진한다. 예로는 최소 3일 내지 4일 동안 106IU/㎖ 초과의 역가로 바이러스 입자를 생산할 수 있는 테트라사이클린-유도성 VSV-G 위형(pseudotype) 렌티바이러스 포장 세포주가 있다[참조: Kafri et al., J. Virol., 1999, 73: 576-584]. 유도성 세포주에 의해 생산된 벡터는 시험관내에서 비분할 세포를 효과적으로 형질도입하는 데 필요한 만큼 농축시킬 수 있다.
양이온성 올리고펩타이드(예를 들면, PCT 특허 출원번호 WO 제95/21931호), DNA 결합 단백질로부터 유래한 펩타이드(예를 들면, PCT 특허 출원번호 WO 제96/25508호) 또는 양이온성 중합체(예를 들면, PCT 특허 출원번호 WO 제95/21931호) 또는 부피바카인(미국 특허 번호 제5,593,972호)와 같은 다른 분자도 또한 시험관내에서 핵산의 형질감염을 촉진시키는 데 유용하다.
본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 발현에 필요한 유전 물질 또는 외래 폴리펩타이드로서의 면역원성 단편을 함유하는 생 벡터, 특히 생 재조합세균, 바이러스 또는 기타 생 제제를 사용하여 포유동물에 전달시킬 수 있다. 특히, 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 예르시니아(Yersinia), 비브리오(Vibrio), 에스케리키아(Escherichia) 및 BCG와 같은 위장관에 군집하는 세균이 백신 벡터로서 개발되어 왔으며, 이들 및 다른 예는 문헌[Holmgren et al.(1992) 및 McGhee et al.(1992)] 등에 개시되어 있다.
다음은 제한 없이, 벡터 목록의 일부로서 사용될 수 있다.
모노네가바이러스 목(Order Mononegavirales)의 비분절 음성 센스(negative sense) 일본쇄 RNA 바이러스의 분류
파라믹소비리대과
파라믹소비리내 아과
파라믹소바이러스속
센다이 바이러스(제1형 마우스 파라인플루엔자 바이러스)
제1형 및 제3형 사람 파라인플루엔자 바이러스(PIV)
제3형 소 파라인플루엔자 바이러스(BPV)
루불라바이러스속
원숭이 바이러스 5(SV)(제2형 개 파라인플루엔자 바이러스)
볼거리 바이러스
뉴캐슬병 바이러스(NDV)(조류 파라믹소바이러스 1)
사람 파라인플루엔자 바이러스(제2형, 제4a형 및 제4b형 PIV)
모르빌리바이러스속
홍역 바이러스(MV)
돌고래 모르빌리바이러스
개 디스템퍼 바이러스(CDV)
가성우역(Peste-des-petits-ruminants) 바이러스
바다표범 디스템퍼 바이러스
우역 바이러스
비분류
헨드라(Hendra) 바이러스
니파(Nipah) 바이러스
뉴모비리내 아과
뉴모바이러스속
사람 호흡기 합포체 바이러스(RSV)
소 호흡기 합포체 바이러스
마우스의 폐렴 바이러스
메타뉴모바이러스속
사람 메타뉴모바이러스
조류 뉴모바이러스(종래의 칠면조 비기관지염 바이러스)
랩도비리대과
리사바이러스속
광견병 바이러스
베시쿨로바이러스속
소수포구내염 바이러스(VSV)
에페메로바이러스속
소 유행열 바이러스
필로비리대과
필로바이러스속
마르버그(Marburg) 바이러스
RNA 바이러스 벡터는 기본적으로 모노네가바이러스 목의 비분절 음성 센스 일본쇄 RNA 바이러스의 하나 이상의 유전체 또는 항유전체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 유전체, 항유전체 또는 이의 변형된 유형을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 작동적으로 연결된 프로모터, 목적하는 유전체 또는 항유전체 및 전사성 터미네이터를 암호화한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 야생형 RNA 바이러스로부터 변형된 유전체 또는 항유전체를 암호화한다. 당해 유전체 또는 항유전체 서열은 사람 또는 비-사람 바이러스로부터 유래할 수 있다. 당해 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 2개 이상의 공급원으로부터의 유전체 또는 항유전체를 재조합적으로 결합시킴으로써 형성된 키메라 유전체를 암호화할 수 있다. 예를 들면, RSV의 A 그룹으로부터의 하나 이상의 유전자를 RSV의 B 그룹의 상응하는 유전자 대신 삽입하거나; 소 PIV(BPIV),PIV-1 또는 PIV-2로부터의 하나 이상의 유전자를 PIV-3의 상응하는 유전자 대신 삽입하거나; RSV로 PIV의 유전자를 대체할 수 있는 등이다. 추가의 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 사람, 소 또는 설치류 바이러스의 모노네가바이러스 목의 RNA 바이러스에 대한 유전체 또는 항유전체를 암호화한다. 본 발명의 방법에 의해 형성된 재조합 바이러스를 치료 또는 예방의 목적으로 사용하기 때문에, 폴리뉴클레오타이드는 또한 선별된 RNA 바이러스의 약독화된 형태 또는 감염성 형태를 암호화할 수 있다. 많은 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA 바이러스의 약독화, 감염성 형태를 암호화한다. 특히 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 본원에 참조로서 인용된 문헌인 공개 국제특허출원 WO제98/13501호에 기술된 바와 같이, 3' 유전체 프로모터 영역에 하나 이상의 약독화 돌연변이 및 RNA 폴리머라제 유전자내에 하나 이상의 약독화 돌연변이를 갖는 모노네가바이러스 목의 비분절 음성 센스 일본쇄 RNA 바이러스의 유전체 또는 항유전체를 암호화한다.
벡터로서, 상기한 바와 같은 목적하는 유전체 및 항유전체의 변형된 형태를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 면역원성 단백질에 대한 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 서열도 암호화한다. 추가로, 필요에 따라, 하나 이상의 이종 유전자를 목적하는 면역원성 조성물/벡터를 형성하는 데 포함시킬 수도 있다. 목적하는 재조합 바이러스의 적용에 따라, 이종 유전자는 보조인자, 사이토킨(예: 인터루킨), T 헬퍼 에피토프, 제한 마커, 보조제 또는 상이한 미생물성 변원체의 단백질(예를 들면, 바이러스, 세균 또는 진균), 특히 보호성 면역반응을 유발할 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 이종 유전자는 또한 유전자요법에 사용되는 제제를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이종 유전자는 인터루킨-12와 같은 사이토킨을 암호화하며, 이는 재조합 바이러스의 예방학적 또는 치료학적 특성을 개선시키도록 선별한다.
바람직하게는, 벡터는 아데노바이러스이다. 보다 바람직하게는, 아데노바이러스는 복제-결손 아데노바이러스이다. 보다 바람직하게는, 복제-결손 아데노바이러스는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, MLP 프로모터 또는 이의 배합을 포함한다. 보다 바람직하게는, 복제-결손 아데노바이러스는 SV40 프로모터를 포함한다.
고처리량 스크리닝(High throughput screening)
본 발명에 따르는 생물학적 샘플중에서 SHP 억제제를 검출 및 동정하기 위한 방법은 고처리량 스크리닝의 사용을 의도한다. 고성능 스크린으로부터의 정보의 흐름에 3개의 상이한 단계가 있다: 생화학적 검정을 위한 실험 설계, 데이타 무결성 문제 및 데이타 분석. 실험 설계는 스크린 설치시에 가장 중요하며 최적의 검정 조건을 신속게 동정하고 수득된 결과를 정량화하는 데 사용된다. 데이타 무결성 문제는 상이한 세트의 화합물에 대한 검정 가변성의 계산, 체제 효과의 동정 및 가능적 수정 및 데이타가 이의 의도하는 용도에 적합한지에 대한 입증을 포함한다. 최종적으로, 데이타 분석은 데이타의 조작(Ki와 같은 결과 용어로 미처리 데이타를 요약하기 위한 데이타 감소 또는 SAR, QSAR 또는 신경 네트워크 분석과 같은 데이타로부터의 패턴 및 정보의 추출)을 포함한다. 이와 함께, 이들 방법은 다량의 데이타로부터 정보를 추출하는 과제에 초점을 맞춘다.
실험 설계는 최적의 조건의 발견 및 반응 표면의 모델링을 필요로 하는 많은분야에의 용도가 밝혀진 전통적 통계 방법이지만, 흔히 생물학에서는 충분히 활용되지 않아 왔다. 실험 설계를 위한 이론적 기초가 다수의 통계 문헌에 상세히 기술되어 있다(예를 들면, 문헌[참조: Cochran, W.G. and Cox, G.M., Experimental Designs, John Wiley and Sons: New York, 1957; Hicks, C.R., Fundamental Concepts of Design of Experiments, Holt, Rhinehart and Winston, 1974; Box, G.E. , Hunter, W. G. and Hunter, S., Statistics for Experimenters : An Introduction to Design, Data Analysis and Model Building, John Wiley and Sons: New York, 1978; Montgomery, D.C., Design and Analysis of Experiments, John Wiley and Sons: New York, 1984]). 적용 사건 연구를 당해 분야와 관련된 문헌에서 발견할 수 있다. 예에는 문헌[참조: Daniel, C. , Applications of Statistics to Industrial Experimentation, John Wiley and Sons: New York, 1976; Murphy, T.D. , design and analysis of industrial experiments, Chemical Engineering, June 6, 1977, 168-182]에 기술된 바와 같은 산업 과정 최적화; 및 문헌[참조: Deming, S. N. and Morgan, S.L., Experimental Design: a chemometric approach; Elsevier, 1987; Austel, V., Design of Test Series by Combined Apllication of 2n Factorial Schemes and Pattern Recognition Techniques. Quantitative Approaches to Drug Discovery; Dearden, J.C., Ed.; Elsevier, 1983]에 기술된 바와 같은 화학이 포함된다. 생물학 및 화학적 적용을 위한 실험 설계의 사용과 관련된 문제 및 방법론은 문헌[참조: Haaland, Experimental Design in Biotechnology, Marcel Dekker, 1989]에 개시되어 있다.
최소의 실행으로 최대의 정보를 추출하기 위한 체계적 방법을 최적화하기 위한 수단을 고려한다. 많은 경우에, 최적의 조건의 동정은 충분하다. 다른 경우에, 인자 및 반응 사이의 관계를 수학적으로 모델링한다. 상호작용은 이들이 생물학에 예외보다 규칙이 많고, 문제의 복잡함을 매우 증가시킬 수 있거나 보다 악화된 경우에는 데이타의 해석을 불가능하게 할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 실험 설계의 특수한 하위부류는 분산 감소 실험 설계이다. 이러한 설계에서는, 반응의 분산을 그 자체의 반응보다 최적화시킨다. 이들 설계는 최소화된 분산이 당해 검정을 보다 확고하게 하기 때문에 생물학에서 중요하다. 다른 관점에서, 비용이 중요한 요인이며 최적화는 단백질과 같은 불충분한 원료의 사용을 최소화하기 위해 바람직하다. 많은 경우에, 다양한 반응이 사료된다: 예를 들면, 제한 없이, 단백질을 보존하기 위해 수용체 농도를 낮게 유지시키는 동안 분산이 최소화된다. 최종적으로, 모델, 심지어 전통적 실험 설계의 기초를 형성하는 선형 모델과 같이 단순한 모델을 갖는 것에 대한 이익은 예상할 수 있는 바이다.
전통적 실험 설계에서, 조사자들은 이들이 반응에 대한 효과를 가질 수 있다고 사료되는 다수의 인자를 선택하였다. 인자의 수 및 이들의 가능한 범위에 따라, 이들 인자에 의해 정의되는 공간을 표본화하기 위해 상이한 유형의 설계를 선택하였다. 모든 인자는 특정 인자 또는 인자 사이의 상호작용의 유의성을 측정하도록 후에 체제 방법에서 동시에 변화시킨다. 통상 당해 인자는 작동 범위의 극단에서 표본화되며 선형 또는 다항식의 급수 함수가 설계점 사이의 영역을 모델링하기 위해 사용된다.
상이한 실험 설계는 특정 목적을 위해 선택된다. 로봇 검정이 우선 수립된 경우, 흔히 잠재적으로 당해 검정의 강화성에 영향을 줄 수 있는 많은 인자가 있다. 중요한 인자를 발견하기 위해, 저분해능 부분요인설계를 실행시킬 수 있다. 중요한 인자를 동정한 후, 총요인설계를 수립하여 인자들에 대한 최적의 셋팅을 발견할 수 있다. 반응표면 모델링을 수행하여 최적의 셋팅에 대한 영역을 탐색하고, 인자의 민감성을 평가하고 고순서 상호작용을 시험할 수 있다.
최근의 과학 및 기술적 발전은 약물 발견 조사에 대한 새로운 패러다임을 도입하였다. 생검정을 위한 화학적 라이브러리 및 로봇 시스템의 가용성은 하루만에 수백 또는 심지어 수천개의 화합물을 합성 및 시험할 수 있게 한다. 이는 검정 자동화 및 데이타 분석용으로 제공한다. 조합 라이브러리는 다수의 시험용 화합물을 제공한다. 라이브러리를 분자 표적의 배열에 대해 시험하는 경우 사용될 수 있는 방대한 양의 데이타는 구조-활성 관계 분석을 위한 새로운 기회를 창출하며 효과적인 통계 방법에 대한 필요를 증폭시켜 데이타를 보전하고 데이타 내의 경향 및 관계를 동정하게 한다.
본 발명은 특정 조직 또는 세포 유형에서 발현되는 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 억제하는 제제에 대한 신규한, 대규모의 스크린을 제공한다. 당해 접근은 고처리량 제자리 과정(high throughput in situ procedure) 및 연속한 분석과 제제 라이브러리를 결합한다. 다수의 화합물을 로봇 기술을 사용함으로써 1회의 실행으로 시험할 수 있다. 예를 들면, 약 1,000 내지 40,000개의 화합물을 하루에 시험할 수 있다. 바람직하게는, 약 40,000개의 화합물을 하루에 시험한다.
본 발명의 양태에 따르면, 당해 스크린은 웰 플레이트에 기계적으로 분취된 세포의 동결 바이알을 사용한다. 이어서 당해 웰 플레이트를 항온처리하고 플레이트를 제거하여 리포터에 대해 검정한다. 바람직하게는, 배치(batch)당 4억개의 세포를 사용하며, 1000개의 세포를 100 384 웰 플레이트(384개의 웰을 갖는 웰 플레이트)의 각각의 웰에 분취시킨다. 바람직하게는, 약 37℃에서 약 24 내지 약 48시간 동안 항온처리를 수행한다.
제제
본 발명의 상기한 방법은 염증 유전자 경로 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP 및/또는 FXR을 억제하는 데 효과적인 제제를 동정할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 동정될 수 있는 제제는 제한 없이, 소형 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 재조합 수용체(예를 들면, 재조합 SHP, 재조합 FXR, 수용성 재조합 SHP, 수용성 재조합 FXR) 항체 등을 포함한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 염증 유전자 발현 경로 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP 또는 FXR 활성을 억제하는 데 효과적인 소형 분자{예를 들면, NF-κB 프로모터/루시페라제(luc) 유전자 리포터를 포함하는 벡터로 감염된 세포 배양물(당해 세포 배양물은 SHP 또는 FXR을 발현한다)에 투여된 경우, 루시페라제에 증가를 초래함으로써 특성화되는 소형 분자}를 제공한다.
본 발명의 이행에 따르면, 당해 소형 분자는 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/루시페라제(luc) 유전자 리포터를 포함하는 벡터로 감염된, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 및 임의로 간세포 핵인자 4α(HNF4α)를 발현현하는 세포 배양물에 투여된경우, 루시페라제의 증가를 초래함으로써 특성화된다.
용어 "소형 분자"는 이의 통상의 의미 및 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 이해될 수 있는, 본 발명이 속하는 당해 분야의 통상의 용법으로 사용된다. 바람직하게는, 소형 분자의 분자량은 약 50 내지 약 1500이다. 보다 바람직하게는, 당해 제제의 분자량은 약 50 내지 약 750이다. 보다 더욱 바람직하게는, 소형 분자의 분자량은 약 50 내지 약 500이다. 분자량은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 소형 분자의 분자량의 측정을 위한 임의의 채택된 방법에 따라 측정된다.
소형 분자는 매우 다양한 종류의 화합물의 것일 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 소형 분자는 천연 또는 합성 지질일 수 있다. 추가로, 소형 분자는 지용성 내지 수용성의 범위일 수 있다. 본 발명의 이행에 따르면, 소형 분자는 지용성이다.
본 발명의 이행에 따르면, 소형 분자는 천연 또는 합성 스테로이드이다. 스테로이드는 매우 다양한 생리학적 활성을 나타내는 천연 및 합성 지질 또는 지용성 화합물의 대그룹이다.
스테로이드 중에는 특정 알콜(스테로이드), 답즙산, 많은 중요한 호르몬, 일부 천연 약물 및 일부 두꺼비의 피부에서 발견되는 독이 포함된다. 사람의 피부에서 발견되는 각종 스테롤은 태양의 자외선에 노출시 비타민 D로 전환된다. 사실, 콜레스테롤 그 자체는 스테롤이다.
스테롤과 유사하지만 동일하지는 않은 스테로이드 호르몬은 부신피질 하이드로코르티손, 코르티손, 알도스테론 및 프로게스테론; 및 여성 및 남성 호르몬 에스트로겐 및 테스토스테론을 포함한다. 대부분의 경구 피임약은 배란을 억제하는 여성 호르몬으로 이루어진 합성 스테로이드이다. 코르티손 및 코르티손의 각종 합성 유도체가 의학에서 폭넓게 사용된다. 예를 들면, 이러한 스테로이드는 각종 피부병, 류마티스 관절염, 천식 및 알레르기, 및 각종 안과 질환 및 부신 과소증의 경우, 또는 부신 피질의 기능장애에 사용된다. 본 발명의 모든 소형 분자가 스테로이드는 아니며 모든 스테로이드가 본 발명의 소형 분자는 아니다. 본원에 제공된 지침을 토대로 하여, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 특정 소형 분자의 동정 방법을 용이하게 알 수 있다.
본 발명의 추가의 이행에 따르면, 소형 분자는 비스테로이드성 화합물이다. 본원에 제공된 지침을 토대로 하여, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 이러한 이행에 따르는 특정 소형 분자를 동정하는 방법을 용이하게 알 수 있다.
본 발명의 이행에 따르면, 소형 분자는 바람직하게는 비스테로이드성 화합물이다. 보다 바람직하게는, 소형 분자는 분자량이 약 50 내지 약 1500인 비스테로이드성 화합물이다. 보다 더욱 바람직하게는, 소형 분자는 분자량이 약 50 내지 약 750인 비스테로이드성 화합물이다. 보다 더욱 바람직하게는, 소형 분자는 분자량이 약 50 내지 약 500인 비스테로이드성 화합물이다.
본 발명의 이행에 따르면, 소형 분자는 바람직하게는 비에스트로겐 스테로이드 호르몬이다. 보다 바람직하게는, 소형 분자는 분자량이 약 50 내지 약 1500인 비에스트로겐 스테로이드 호르몬이다. 보다 더욱 바람직하게는, 소형 분자는 분자량이 약 50 내지 약 750인 비에스트로겐 스테로이드 호르몬이다. 보다 바람직하게는, 당해 제제는 분자량이 약 50 내지 약 500인 비에스트로겐 스테로이드 호르몬이다.
본 발명의 이행에 따르면, 소형 분자는 SHP 또는 FXR 또는 이를 암호화하는 유전자의 성숙 또는 미성숙 형태에 결합한다. 추가로, 본 발명의 이행은 수용체 또는 리간드에 대해 SHP 또는 FXR의 성숙 또는 미성숙 형태와 경쟁하고 조성물중에 죽상동맥경화증에 대한 유효량으로 존재하는 소형 분자를 고려한다. 따라서, 본 발명은 SHP 또는 FXR 길항제인 소형 분자를 고려한다. 길항제는 천연 리간드의 정상적인 효과를 유발하지 않으면서 수용체에 결합함으로써, 이에 따라 천연 리간드의 효과를 방해하는 구조 유사체이다. 따라서, SHP 또는 FXR 길항제는 리간드 및/또는 수용체 결합 위치에서 경쟁하여 SHP 또는 FXR가 결합하는 것을 방지함으로써 SHP 또는 FXR의 활성을 억제한다. 본원에 제공된 지침을 토대로 하여, 당해 분야의 숙련가들은 SHP 또는 FXR 길항제를 용이하게 동정하고 본 발명의 양태에 따라 동일하게 제조할 수 있다.
치료학적 조성물
또한 치료학적 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은 상기한 바와 같은 광범위한 상태를 치료하는 데 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 치료학적 조성물은 사람(바람직하게는) 및 비-사람 동물과 같은 포유동물에서 상승된 혈청 저밀도 지단백질(LDL) 콜레스테롤 수준의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들면, 당해 동물은 소, 개, 말, 고양이 및 돼지일 수 있다. 특정 적용은 죽상동맥경화증 및 상승된 LDL 콜레스테롤 수준과 관련된 다른 상태의 치료를 포함하지만, 이에 제한되지는않는다.
본 발명의 치료학적 조성물은 예방적(즉, 감염을 예방하거나 감염의 발병을 감소시키기 위한) 또는 치료적(즉, 감염 후 감염에 의해 유발된 질병 또는 부작용을 치료하기 위한)일 수 있다.
당해 조성물은 본 발명의 제제를 포함할 수 있다. 이를 위해, 하나 이상의 유형의 제제를 적합한 농도로 조정하고 임의의 적합한 희석제, 담체 또는 임의의 이의 배합물로 제형화시킬 수 있다. 생리학적으로 허용되는 매질은 담체 및/또는 희석제로서 사용될 수 있다. 이들은 물, 적합한 등장성 매질, 글리세롤, 에탄올 및 다른 통상의 용매, 포스페이트 완충 염 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일단 제형화된 본 발명의 조성물을 피험자에 직접적으로 투여하고, 피험자로부터 유래한 세포에 세포외 또는 시험관내로 전달할 수 있다. 피험자에 직접적으로 전달하기 위해, 임의의 통상의 형태{예를 들면, 비강, 구강, 안구, 폐, 질 또는 직장 표면과 같은 임의의 점액성 표면에의 비강내, 비경구, 경구, 복강내, 정맥내, 경피 또는 국부 적용(예를 들면, 에어로졸 분무에 의한)}로 투여할 수 있다.
임의의 생물학적으로 허용되는 투여 형태 및 이의 배합이 본 발명의 주제에 의해 고려된다. 이러한 투여 형태의 예에는 제한없이, 저작성 정제, 속용성 정제, 발포정, 재구성가능한 산제, 엘렉서제, 액제, 용제, 현탁제, 유제, 정제, 다층 정제, 이중층 정제, 캡슐제, 연질 젤라틴 캡슐제, 경질 젤라틴 캡슐제, 캐플릿, 로젠지제(lozenge), 저작성 로젠지제, 비드, 산제, 입제, 입자, 미세입자, 분산형 과립, 샤세제, 세정제, 좌제, 크림제, 국소제, 흡입제, 에어로졸 흡입제, 팻치, 입자 흡입제, 이식제, 데포우(depot) 이식제, 섭취제, 주입제, 점적제, 건강식 바, 당제, 동물 사료, 시리얼, 시리얼 피복제, 식품, 영양식품, 기능성 식품 및 이의 배합물이 포함된다. 상기 투여 형태의 제제는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명의 조성물은 경구 투여 형태에 바람직하다. 이들 투여 형태는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는"은 충분히 고순도이며 독성, 부적합, 비안정성, 알레르기 반응 등이 없이, 세포, 조직 또는 막과 접촉하는 데 사용되기에 적합해야 하는 투여 형태를 의미한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 생물학적 피험자에 경구 투여된다. 또한, 본 발명의 치료학적 조성물은 수프의 형태로 투여된다. 필요에 따라, 임의의 풍미제 또는 식품을 수프에 첨가하여 향을 변화시킬 수 있다.
각종 첨가제를 당해 조성물에 혼입시킬 수 있다. 당해 조성물의 임의의 첨가제는 제한 없이, 전분, 당, 지방, 항산화제, 아미노산, 단백질, 이의 유도체 또는 이의 배합물을 포함한다.
본 발명의 범주의 약제학적 조성물의 투여 형태는 각종 방출 형태와 결합될 수 있으며, 이에는 제한 없이, 속방출, 연장된 방출, 펄스 방출, 변형성 방출, 서방출, 시간별 방출, 지속성 방출, 지연성 방출, 장기 작용 및 이의 배합이 포함된다. 즉각적 방출, 확장된 방출, 펄스 방출, 변형성 방출, 제어 방출, 시간별 방출, 지속성 방출, 지연성 방출, 장기 작용 특성 및 이의 배합을 수득하기 위한 노력은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법 및 사용가능한 기술을 사용하여 수행한다. 방출 특성을 수득하기 위한 이들 특정 기법 또는 과정 각각이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "서방출 형태"는 제어 방출용으로 제형화된 하나 이상의 성분을 갖는 임의의 형태를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 "속방출 형태"는 즉각적 방출용으로 제형화된 이의 약제학적 활성 성분 중 일부를 갖는 임의의 형태를 의미한다.
다음의 과정은 제한 없이, 본 발명의 주제 영역내에 속하는 제형의 허용가능한 제조방법을 나타낸다.
속용성 정제는 예를 들면, 제한 없이, 당 및 셀룰로스 유도체와 같은 제제와 당해 제형을 혼합시켜 제조할 수 있으며, 이는 경구 투여 후, 통상 30초 내에 수득된 정제의 용해 또는 분해를 촉진시킨다.
시리얼 피복제는 예를 들면, 제한 없이, 펠렛, 플레이크 또는 다른 기하학적 형태로 형성된 후, 활성 성분의 필름과 부형제를 형성된 요소의 표면상에 증착시키는 정밀 스프레이 피복 장치하에 당해 시리얼 제형을 통과시킴으로써 제조될 수 있다. 이와 같이 처리된 단위는 이어서 건조시켜 시리얼 피복물을 형성한다.
건강식 바는 제한 없이, 당해 제형과 부형제(예를 들면, 결합제, 충전제, 풍미제, 착색제 등)를 가소성 매스(mass) 경도로 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이어서 당해 매스를 확장시키거나 성형하여 "캔디 바" 모양을 형성한 후 건조시키거나 고형화시켜 최종 생성물을 형성한다.
연질 겔 또는 연질 젤라틴 캡슐제는 예를 들면, 제한 없이, 당해 제형을 적합한 비히클(통상 식물성 오일이 사용된다) 중에 분산시켜 고점성의 혼합물을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이어서 당해 혼합물을 연질 겔 산업의 숙련가에게 공지된 기술 및 기계를 사용하여 젤라틴계 필름으로 캡슐화시킨다. 이어서 이렇게 형성된 상업적 단위를 건조시켜 중량을 일정하게 한다.
저작성 정제는 예를 들면, 제한 없이, 당해 제형을 상대적으로 연질이고 향이 가미된 정제 투여 형태, 즉, 연하보다는 저작하도록 설계된 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 통상의 정제 기계 및 과정, 즉, 직접적 압착 및 과립화 또는 압착 전의 슬러깅(slugging)을 사용할 수 있다. 저작성 투여 형태는 약제학적 산업에서 매우 흔한 투여 형태이기 때문에, 약제학적 고체 투여 형태 제조에 관여하는 당업자는 사용되는 방법 및 기계에 숙련되어 있다.
제피 정제는 예를 들면, 제한 없이, 정제상에 인접 필름 층을 증착시키기 위한 회전 팬 피복 방법 또는 공기 현탁 방법과 같은 기법을 사용하여 정제를 피복시킴으로써 제조할 수 있다. 당해 과정은 흔히 정제의 심미적 외관을 개선시키기 위해 수행되지만, 또한 정제의 연하성을 개선시키거나 불쾌한 향 또는 맛을 감추거나 비가시적으로 비피복된 정제의 특성을 개선시키기 위해 수행될 수 있다.
압착 정제는 예를 들면, 제한 없이, 당해 제형을 분해성에 결합성을 첨가하기 위한 부형제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 당해 혼합물을 직접적으로 압착하거나 과립화시킨 후, 당해 산업분야의 숙련가에 공지된 방법 및 기계를 사용하여 압착시킨다. 이어서 수득된 압착 정제 용량 단위를 시장 수요에 따라 포장한다(즉, 단위 용량, 롤, 화물 병, 블리스터 팩 등).
예를 들면, 동물 사료는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 동물 사료는 당해 제형과 결합 성분을 혼합하여 가소성 매스를 형성함으로써 제조될 수 있다. 이어서 당해 매스를 고압하에 압출하여 펠렛 크기로 절단된 관 모양(또는 "스파게티형") 구조를 형성하고 건조시킨다.
본 발명의 범주는 임의의 경로(제한 없이, 경구, 구강, 설하선, 직장, 비경구, 국부, 흡입, 주사 및 경피, 바람직하게는 경구를 포함)에 의한 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물을 고려한다. 영양 조성물의 생리화학적 특성, 이들의 제형 및 투여 경로가 흡수에 중요하다. 흡수는 영양 조성물의 투여 위치로부터 체순환으로의 이동 과정을 의미한다. 경구 투여된 영양 조성물은 편의성, 경제성, 안정성 및 환자 수용성을 위해 주로 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 이들은 흡수가 일어나기 전에 분해 및 용해되어야 한다. 상기한 투여 경로 또는 투여 형태 중 어느 하나를 사용한, 본 발명의 범주의 사용은 공지된 방법 및 당해 분야의 숙련가에 의해 이용가능한 기법을 사용하여 수행한다.
본 발명의 범주는 광범위한 물질로부터 제조될 수 있는 생리학적으로 허용가능한 담체의 용도를 고려한다. 이에 제한되지 않으면서, 이러한 물질은 특정 약제 조성물을 제조하기 위한 희석제, 용매, 결합제 및 부착제, 윤활제, 가소제, 분해제, 착색제, 증량제, 풍미제, 감미제 및 완충제 및 흡수제와 같은 기타 물질을 포함한다.
결합제는 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 또는 다른 적합한 셀룰로스 유도체, 포비돈, 아크릴산 메타크릴산 공중합체, 약제학적 유약, 고무, 유제품(예를 들면, 유장), 전분 및 유도체와 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 통상의 결합제와 같은 넓은 범위의 물질 중에서 선택될 수 있다. 예시의 비제한적 비독성 용매는 물, 에탄올, 이소프로필 알콜, 염화메틸렌 또는 혼합물 및 이의 배합물이다. 예시의 비제한적 증점 물질은 당, 락토스, 젤라틴, 전분 및 이산화규소를 포함한다.
용해 개질 시스템에 사용되는 가소제는 바람직하게는 유기 용매 중에 미리 용해시키고 용액 형태로 첨가한다. 바람직한 가소제는 디에틸 프탈레이트, 디에틸 세바케이트, 트리에틸 시트레이트, 크로노트산, 프로필렌 글리콜, 부틸 프탈레이트, 디부틸 세바케이트, 피마자유 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 입증된 바와 같이, 가소제는 천연적으로 소수성 및 친수성일 수 있다. 수불용성 소수성 물질(예를 들면, 디에틸 프탈레이트, 디에틸 세바케이트 및 피마자유)은 수용성 물질의 방출을 지연시키기 위해 사용된다. 대조적으로, 친수성 가소제는 수불용성 물질이 사용되는 경우에 조성물 방출을 보조하는 캡슐화된 필름를 용해시키는 것을 보조하고 표면에 채널을 만들기 위해 사용된다.
본 발명의 범주의 조성물은 일부, 즉, 분할 용량, 24시간 동안 1회 이상, 24시간 동안 단일 용량, 24시간 동안 2회 용량 또는 24시간 동안 2회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 분할, 2회 또는 기타 다중 용량은 동시 또는 24시간 동안 상이한 시간에 섭취될 수 있다.
본 발명의 조성물은 사람 및 다른 동물에 의한 사용을 의도한다. 투여량은체중에 따라 조정되므로 체중을 기준으로 하여 본원에 기술될 수 있다. 예를 들면, 공식이 55kg 개체에 대해 약 10 내지 1000의 범위를 상술하는 경우, 당해 범위는 35kg 개체에 대해 약 6.3 내지 630mg(즉, 하위 범위는 (35kg/55kg)*10mg=3.6mg으로 제한된다)으로 조정되어야 한다. 소수점 이하의 수는 가장 근접한 정수에서 사사오입한다. 상기한 방법으로 당해 조성물을 크기에 관계 없이, 임의의 개체(임의의 동물을 포함하여)에 적합하게 조정할 수 있다.
폴리펩타이드
본 발명의 방법은 SHP 또는 FXR 활성을 억제하는 제제를 스크리닝한다, SHP 및 FXR 외에, 본 발명은 SHP 또는 FXR 활성을 갖는 임의의 화합물을 사용함을 고려한다. 예를 들면, SHP 또는 FXR의 효능제 또는 서열에 미미한 변화를 갖지만 SHP 또는 FXR과 동일한 효과를 갖는 화합물이다. 이러한 화합물은 SHP 또는 FXR 활성의 억제제에 대한 스크리닝에 유용성을 가질 수 있다.
예를 들면, 표적 화합물은 서열번호 2 또는 4의 참조 서열과 동일한(즉, 100% 동일한) 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있거나, 참조 서열과 비교하여 동일성%가 100% 미만이 되도록 특정한 정수 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 하나 이상의 아미노산 결실, 치환(보존적 및 비보존적 치환을 포함하여) 또는 삽입을 포함한다. 변경은 참조 폴리펩타이드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치 또는 이들 말단 위치 사이의 임의의 부분, 참조 아미노산 서열내의 아미노산 중에 개별적으로 산재되거나 참조 아미노산 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹에서 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 서열 목록(즉, 서열 2 또는 4)에 함유된 아미노산 서열에 대한 서열 동일성을 갖는 분리된 폴리펩타이드의 용도를 고려한다. 특정 서열에 따라, 서열 동일성 정도는 바람직하게는 50%를 초과한다(예를 들면, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상). 이들 상동 단백질은 돌연변이체 및 대립유전자 변이체를 포함한다.
당해 분야에 공지된 바와 같은 "동일성"은 서열을 비교함으로써 측정된 바로서, 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 관계이다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 줄 사이의 일치(match)에 의해 측정된 바로서, 경우에 따라 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 문헌[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기술된 바를 포함한, 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이에 최대의 일치를 제공하도록 설계하는 것이다. 동일성 및 유사성을 측정하는 방법은 공식적으로 시판되는 컴퓨터 프로그램에 체계화되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(Devereux, J., et al. 1984), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S.F., et al., 1990)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 제조원(BLAST Manual, Altschul, S., et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., 1990)으로부터 공식적으로 시판된다. 공지된 Smith Waterman 알고리즘도 또한 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 제공된 동일성%에 대한 다수의 아미노산 변경은 다수의 서열 중 하나의 아미노산의 총 수에 각각의 동일성%(100으로 나눔)의 수적 %를 곱한 후 다수의 서열의 아미노산의 총 수로부터 상기 산출값을 감함으로써 또는 다음 수학식으로 측정할 수 있다:
na≤xa-(xaㆍy)[여기서, na는 아미노산 변경의 개수이고, xa는 다수의 서열의 아미노산의 총 수이고, y는 예를 들면, 70% 대하여 0.70, 80%에 대하여 0.80, 85%에 대하여 0.85 등이고, xa및 y의 임의의 비정수 산출값은 xa로부터 이를 감하기 전에 가장 근접한 정수로 사사오입한다].
SHP 또는 FXR의 구조에서 변형 및 변화가 발생할 수 있지만, 당해 화합물은 SHP 또는 FXR 활성을 유지시킬 수 있다. 예를 들면, 특정 아미노산은 활성 및/또는 항원성의 상당한 손실 없이 서열 내의 다른 아미노산을 대체할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 생물학적 기능 활성을 정의하는 폴리펩타이드의 상호작용 능력 및 성질 때문에, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩타이드 서열(또는, 물론, 이의 하위 DNA 암호화 서열)내에 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.
따라서 본 발명은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 현저하게 동일한 활성 및 본원에 기술된 반응성을 제공하는 생물학적 등가의 분리된 폴리펩타이드를 고려한다.
본 발명은 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 변이체인 폴리펩타이드를 사용하고자 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 참조 폴리펩타이드와 상이하지만, 본질적 특성을 유지하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 상이함은 참조 폴리펩타이드의 서열 및 변이체가 전체적으로 매우 유사하며, 많은 영역에서 동일하도록(즉, 생물학적 등가) 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩타이드는 하나 이상의 치환, 첨가 또는 결실의 임의의 배합에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환된 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 암호에 의해 암호화된 것일 수 있거나 그렇지 않은 것일 수 있다. 폴리펩타이드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생할 수 있거나, 자연적으로 발생하는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다. 폴리펩타이드의 비-자연적 발생 변이체는 직접 합성 또는 돌연변이 유발 기법에 의해 제조될 수 있다.
이러한 변화의 제조에서, 아미노산의 수치료(hydropathic) 지수를 고려할 수있다. 폴리펩타이드 상에 상호작용적 생물학적 작용을 수여하는 수치료 아미노산 지수의 중요성이 당해 분야에 일반적으로 알려져 있다(문헌[참조: Kyte & Doolittle, 1982]). 특정 아미노산은 유사한 수치료 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 대체될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 초래하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 아미노산에는 이의 소수성 및 전하 특성을 기준으로 한 수치료 지수가 할당된다. 이들 지수는 다음과 같이 각각의 아미노산 뒤에 괄호안에 명시한다: 이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
아미노산 잔기의 상대적 수치료 특성은 수득된 폴리펩타이드의 2차원 및 3차원 구조를 결정하며, 이는 차례로 폴리펩타이드와 효소, 기질, 수용체, 항체, 항원 등과 같은 다른 분자와의 상호작용을 정의하는 것으로 사료된다. 당해 분야에 아미노산이 유사한 수치료 지수를 갖는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있으며 여전히 기능적으로 동등한 폴리펩타이드가 수득됨이 공지되어 있다. 이러한 변화에서, 수치료 지수가 +/-2 이내인 아미노산 치환이 바람직하며, +/-1 내인 아미노산 치환이 특히 바람직하고, +/-0.5 내인 아미노산 치환이 보다 특히 바람직하다.
유사한 아미노산의 치환은 친수성을 기준으로 하여 제조될 수 있으며, 특히 이에 따라 제조된 생물학적 기능이 동일한 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 면역학적양태에 사용할 것이다. 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌, 미국 특허 번호 제4,554,101호는 이의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 폴리펩타이드의 최대 지역적 평균 친수성이 이의 면역원성 및 항원성, 즉, 폴리펩타이드의 생물학적 특성과 관련됨을 명시한다.
미국 특허 번호 제4,554,101호에 상세히 기술된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당된다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 프롤린(-0.5±1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 및 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 가지는 다른 것으로 치환될 수 있으며 여전히 생물학적으로 등가이며 특히, 면역원적으로 등가인 폴리펩타이드가 수득된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 치환이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 치환이 보다 특히 바람직하다.
따라서, 상기한 바와 같은 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 한다. 고려 대상이 되는 각종 전술한 특징을 취하는 치환체의 예가 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 루이신 및 이소루이신이 포함된다. 아래의 표 XIII에 나타낸 바와 같이, 적합한 아미노산 치환체는 다음을포함한다:
생물학적 또는 기능적으로 등가인 폴리펩타이드는 또한 본 발명의 이행에 따라 사용될 수 있는 바와 같은 부위-특이적 돌연변이를 사용하여 제조될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이는 하위의 DNA의 특정 돌연변이 유발을 통한, 제2 세대 폴리펩타이드 또는 이의 서열로부터 유래한 생물학적, 기능적으로 등가인 폴리펩타이드의제조에 유용한 기법이다. 상기한 바와 같이, 이러한 변화는 아미노산 치환이 바람직할 경우 바람직할 수 있다. 당해 기법은 추가로 용이한 제조 능력 및 예를 들면, DNA에 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화를 도입함으로써, 하나 이상의 전술한 고려를 통합한 시험 서열 변이체를 제공한다. 부위 특이적 돌연변이는 통과되는 결실 접합의 양면상에 안정한 접합체를 형성하는 데 충분한 크기 및 서열 복합성의 프라이머 서열을 제공하기 위해, 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열 및 충분한 수의 인접한 뉴클레오타이드의 사용을 통해 돌연변이체가 생성되게 한다. 통상, 대체시킬 서열의 접합의 양면 상에 약 5개 내지 10개의 잔기가 변형된 길이가 약 17 내지 25개 뉴클레오타이드인 프라이머가 바람직하다.
일반적으로, 부위-특이적 돌연변이 유발 기법이 당해 분야에 공지되어 있다. 이해되다시피, 당해 기법은 통상 일본쇄 및 이본쇄 형태 둘 다로 존재할 수 있는 파지 벡터를 사용한다. 통상, 본원에 따르는 부위-직접적 돌연변이 유발은 우선 선택된 모든 또는 일부의 SHP 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 DNA 서열 내에 포함되는 일본쇄 벡터의 수득을 수행한다. 목적하는 돌연변이된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 예를 들면, 공지된 기법(예를 들면, 합성적)에 의해 제조한다. 이어서 이러한 프라이머를 일본쇄 벡터에 어닐링시키고, 이. 콜라이 폴리머라제 I 클레노우(Klenow) 단편과 같은 효소를 사용하여 확장시켜, 돌연변이-포함 쇄의 합성을 완결한다. 따라서, 이형접합체는 하나의 쇄는 원래의 비-돌연변이 서열을 암호화하고 제2 쇄는 목적하는 돌연변이를 포함하도록 형성된다. 이어서 이러한 이형접합체 벡터는 이. 콜라이 세포와 같은 적합한 세포를 형질전환시키는 데 사용하여, 돌연변이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다. 상업적으로 수득가능한 킷트는 필요한 시약을 제공한다.
당해 폴리펩타이드는 유리하게는 추가의 구조적 또는 기능적 분석 또는 시약의 생성에 사용되는 단편으로 분할될 수 있다. 이는 정제되거나 정제되지 않은 폴리펩타이드를 엔도프로테이나제 glu-C(Boehringer, Indianapolis, IN)와 같은 펩티다제로 처리함으로써 수행될 수 있다. CNBr을 사용한 처리는 펩타이드 단편이 천연 SHP 또는 FXR 폴리펩타이드로부터 생산될 수 있는 다른 방법이다. 재조합 기법은 또한 SHP 또는 FXR 폴리펩타이드의 특정 단편을 제조하는 데 사용될 수 있다.
당해 폴리펩타이드는 "성숙" 또는 "미성숙" 단백질의 형태일 수 있거나 융합 단백질과 같은 보다 큰 단백질 또는 중간체의 일부일 수 있다. 당해 폴리펩타이드는 예를 들면, 분비 또는 리더(leader) 서열, 프로-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같이 정제를 목적으로 하는 서열 또는 재조합체 생성 중 안정성을 위한 추가의 서열을 함유하는 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
당해 폴리펩타이드의 단편 또한 본 발명에 의해 고려된다. 단편은 전체적으로 부분으로서는 동일하지만, 모든 아미노산 서열이 동일하지는 않은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 당해 단편은 예를 들면, 아미노산 서열 중 7개 이상(예를 들면, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 이상)의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 "독립적"일 수 있거나 이들이 영역의 일부, 가장 바람직하게는 단일한 연속적 영역으로서 형성되는 보다 큰 폴리펩타이드 내에 포함된다. 한 양태에서, 당해 단편은 성숙한 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 항원결정인자를 포함한다.
SHP 활성의 억제제를 동정하는 방법에 사용되는 폴리펩타이드는 임의의 적합한 방법으로 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 자연적으로 발생한 폴리펩타이드, 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드, 합성적으로 생산된 폴리펩타이드 및 이들 방법의 배합에 의해 생산된 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 당해 분야에 알려져 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 및 이와 밀접하게 관련된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 당해 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 본 발명의 이행에 따라, 세포주 내에 SHP 또는 리포터 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 제한 없이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 분리된 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터를 포함한다. 다음은 본 발명의 양태에 따라 사용되는 2개의 프로모터이다.
사람 CYP7A1 프로모터 서열(서열 5)
본 발명의 양태에 따르면, 뉴클레오타이드 -514번 내지 +303번의 서열을 포함하는 CYP8B1 프로모터는 사람 CYP8B1의 전사 개시 위치와 비교한다. 사람 CYP8B1 -514번 내지 +303번(서열 7)의 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
추가로, 당해 폴리뉴클레오타이드는 검출가능한 물질(검출가능한 물질 유전자로서 본원에 지칭된)을 암호화하는 유전자를 포함한다. 예를 들면, 제한 없이, 당해 검출가능한 물질 유전자는 반딧불이 루시페라제 유전자, β-갈락토시다제 유전자, 분비된 알칼리성 포스파타제 유전자, 레닐라 루시페라제 유전자 또는 이의 배합을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 검출가능한 물질 유전자는 반딧불이 루시페라제 유전자이다. 본 발명의 이행에 따라, 제한 없이, CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터(예를 들면, 사람 CYP8B1의 전사 개시 위치에 비교한 뉴클레오타이드 -514번 내지 +303번의 서열을 포함하는 CYP8B1)를 포함하는 뉴클레오타이드 서열 및 검출가능한 물질 유전자를 플라스미드 또는 아데노바이러스와 같은 벡터내로 클로닝시켜 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터와 같은 작제물을 형성한다. CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 세포주를 감염 또는 형질감염시키기 위해 세포주에 사용하여 CYP8B1 프로모터가 활성화되는 경우 당해 세포주가 검출가능한 물질을 발현시키도록 할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 또는 SHP 및/또는 FXR을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 당해 프로모터 또는 유전자는 NF-κB 프로모터 및 검출가능한 물질 유전자를 포함하는 벡터내로 클로닝될 수 있다.
본 발명의 양태에 따라, SHP 프로모터를 벡터내로 클로닝시킨다. 바람직하게는, SHP 프로모터는 다음의 핵산 서열을 갖는다:
사람 SHP 프로모터 서열(서열 8)
본 발명의 뉴클레오타이드는 단 이종이량체 단백질(SHP)dmf 암호화하는 유전자 및/또는 간세포 핵인자 4α(HNF4α)를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. SHP 및 임의로 HNF4α를 암호화하는 유전자를 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터 및 검출가능한 물질 유전자를 포함하는 벡터내로 클로닝할 수 있다. 당해 뉴클레오타이드를 제한 없이, 단일 벡터 또는 다중 벡터내로 클로닝할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 참조 폴리뉴클레오타이드와 상이하지만, 본질적인 특성은 유지하는 폴리뉴클레오타이드이다. 당해 변이체의 뉴클레오타이드 서열내의 변화는 참조 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변형시킬 수 있거나 변형시킬 수 없다. 뉴클레오타이드변화는 참조 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 내에 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생된 변이체일 수 있거나 자연적으로 발생되는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비자연적으로 발생하는 변이체는 돌연변이 유발 기법 또는 직접적 합성에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 감소된 엄격성 조건, 보다 바람직하게는 엄격성(stringency) 조건 및 보다 바람직하게는 고도의 엄격성 조건하에 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 엄격성 조건의 예는 아래의 엄격성 조건 표에 나타나 있다: 고도의 엄격성 조건은 예를 들면, 적어도 조건 A 내지 F만큼 엄격한 것이고; 엄격성 조건은 예를 들면, 적어도 조건 G 내지 L만큼 엄격한 것이고; 감소된 엄격성 조건은 예를 들면, 적어도 조건 M 내지 R만큼 엄격한 것이다.
bp1: 당해 하이브리드 길이는 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화된 영역(들)에 대해 예상된 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 미지의 서열의 표적 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 경우, 하이브리드 길이는 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 길이인 것으로 가정된다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오타이드를 하이브리드화하는 경우, 당해 하이브리드 길이는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 정렬하고 당해 영역 또는 최적의 서열 상보성 영역을 동정함으로써 측정될 수 있다.
완충액H: 하이브리드화시에 SSC(1×SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 나트륨 시트레이트이다)를 SSPE(1×SSPE는 0.15Mm NaCl, 10mM NaH2PO4및 1.25mM EDTA이다, pH 7.4)로 대체할 수 있으며 완충액을 세척한다; 하이브리드화를 완결한 후 15분 동안 세척을 수행한다.
TB내지 TR: 길이가 50bp 미만인 것으로 예상되는 하이브리드에 대한 하이브리드화 온도는 당해 하이브리드의 융점(Tm)보다 5-10EC 낮아야 하며, 여기서, Tm은 다음의 방정식에 따라 결정된다. 길이 18bp 미만의 하이브리드에 대해, Tm(EC)=2(A+T 염기 수) + 4(G+C 염기 수). 길이 18 내지 49bp의 하이브리드에 대해, Tm(EC)=81.5+16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N), 여기서, N은 하이브리드 중 염기의 수이며, [Na+]는 하이브리드화 완충액 중 나트륨 이온의 농도이다(1×SSC에 대한 [Na+]=0.165M).
폴리뉴클레오타이드 하이브리드화에 대한 엄격성 조건의 추가의 예는 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌[참조: Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4]에 제공되어 있다.
본 발명은 또한 이들 폴리뉴클레오타이드에 충분히 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공하며 또한 안티센스 서열을 제공한다. 본 발명의 안티센스 서열(또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 지칭됨)은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 억제하는 내부적으로 생성되고 외부적으로 투여된 서열 둘 다를 포함한다. 본 발명의 안티센스 서열은 예를 들면, 약 15 내지 20개의 쌍을 포함한다. 안티센스 서열은 예를 들면, 프로모터가 상부의 해독되지 않은 서열에 결합하는 것을 방지함으로써 전사를 억제하거나, 리보좀이 결합하는 것을 방지함으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 전사체의 번역을 방지하도록 설계될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 여러 방법(예를 들면, 화학적 합성에 의해, DNA 라이브러리로부터, 유기체 그 자체로부터)으로 제조되며 각종 형태(예를 들면, 일본쇄, 이본쇄, 벡터, 프로브, 프라이머)를 취할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 및 RNA, 및 변형된 주쇄를 포함하는 바와 같은 이들의 유사체를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 폴리펩타이드의 재조합 생성에 사용되는 경우, 당해 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 폴리펩타이드의 암호화 서열 또는 이의 단편, 그 자체, 성숙한 폴리펩타이드의 암호화 서열 또는 다른 암호화 서열(예를 들면, 리더 또는 분비 서열, 프리-, 프로- 또는 프리프로- 단백질 서열 또는 다른 융합 단백질 부분을 암호화하는 서열)을 갖는 판독 프레임 내의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 폴리펩타이드의 정제를 촉진시키는 마커 서열을 암호화 서열에 연결시킬 수 있다. 당해 폴리뉴클레오타이드는 또한 비암호화 5' 및 3' 서열(예를 들면, 전사 서열, 비전사 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그날, 리보좀 결합 위치 및 mRNA를 안정화시키는 서열)을 함유할 수 있다.
투여 방법
본 발명은 전술한 조성물을 피험자에 투여하는 방법을 고려한다. 당해 피험자는 포유동물 또는 조류일 수 있다. 바람직하게는, 당해 피험자는 사람이다. 적합한 수의 용량으로 유효량의 조성물을 피험자에 투여하여 목적하는 반응을 유도한다. 본원에 사용된 바와 같은 "유효량"은 단일 용량 또는 일련의 용량 중 일부로서, 포유동물 숙주(바람직하게는 사람)에 대한 투여되어, 처리된 개체의 시스템에 최소한 목적하는 반응, 예를 들면, 죽상동맥경화증의 경우, LDL 콜레스테롤의 혈청 수준을 감소시키는 반응을 초래하는 데 충분한 양을 의미한다. 보호는 면역원성 조성물의 단일 용량에 의해 수행될 수 있거나, 이후에 보호를 유지하기 위해 추가의 부스터(booster) 외에 몇가지 용량의 투여를 필요로 할 수 있다.
투여량은 연령 및 체중과 같은 개체의 특정 조건에 따라 다양할 수 있다. 이는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 통상적인 시험으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 환자에 대한 투여를 위한 각종 투여 형태는 상기되어 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 결정된 바와 같은 조성물의 투여를 위한 임의의 적합한 투여 형태가 본 발명에 의해 고려된다.
다음 실시예는 예시적이고 본 발명은 이로부터 제한되지 않는다.
실시예 1- 에티닐에스트라디올이 마우스 간에서 유전자 발현의 IL-1β 유도를 억제한다.
본 연구는 폐경기 이전의 여성에서 심혈관 질환의 발병이 매우 낮으나, 폐경 후에 극적으로 상승하는 관찰에 기초하여 수행되었다. 호르몬 대체 요법이 폐경 이후 여성에서 심혈관 질환의 발병을 감소시킬 수 있음을 나타내는 수많은 연구가 있다. 에스트로겐에 지질 특성상의 유리한 효과가 있으나, 지질 변화로는 감소된 질환의 발병이 부분적으로만 설명될 수 있다. 염증은 죽상경화 과정의 중요 구성요소이다. 생체 내에서 염증을 억제하는 에스트로겐의 능력을 연구하기 위해서, 난소제거된 암컷 C57BL/6 마우스를 4일동안 비히클 또는 에티닐에스트라디올(EE)로 처리한 후 1시간동안 IL-1β로 처리하였다. 간 RNA의 유전자칩 분석으로 약 100개의 유전자가 IL-1β에 의해 유도됨이 밝혀졌다. EE의 처리로 상기 유전자의 약 3분의 1의 유도를 억제하였다. EE가 기본 발현 수준을 변형시키지 않기 때문에, 이러한 효과는 유전자 활성에 특이적이다. IL-1β 유전자 유도는 ERα 결손 마우스에서 EE로 억제되지 않았다. 또한 EE 처리로, 발현시 NFκB 활성을 억제하는 것으로 공지된 프로스타글란딘 D 신타제를 포함하는 간에서 많은 유전자의 발현을 유도하였다. 그러나, 게니스테인 또는 랄록시펜 처리는 IL-1β 유전자의 억제를 유지하나 프로스타글란딘 D 신타제 또는 기타 유전자의 발현을 자극하지 않았다. 이러하 결과는 생체 내에서 ERα가 전형적인 ER 매개된 유전자 유도가 필요하지 않는 기작에 의해 IL-1β유도된 유전자 발현을 억제할 수 있음을 제시한다.
실험을 수행하여 마우스 간에서 유전자 발현의 IL-1β 조절을 평가하였다. 난소제거된 암컷 C57BL/6 마우스를 옥수수 오일/에탄올 비히클 또는 100㎍/㎏/일의 에티닐에스트라디올(EE)을 5일동안 피하에 투여하여 사전처리 하였다. 5일째, 마우스에 PBS 또는 PBS중의 20㎍/㎏의 IL-1β를 복강내 주입하였다. 1시간 후 간을 제거하고 폴리A RNA를 제조하였다. affymetrix사의 쥐 11K 유전자칩을 사용한 분석에 의해 측정하였다. 각각의 유전자의 경우, 비히클 사전처리 후 PBS 처리를 한 동물에서 발현 수준을 1.0으로 정의하면, 비히클 사전처리 ± IL-1β 또는 EE 사전처리 ±IL-1β로 처리한 마우스에서 발현 수준을 상기에 비교하여 정의하였다. 제시된 결과는 2개의 독립적인 실험의 평균이다. 75개의 유전자는 IL-1β처리에 의해 2배 이상으로 복제가능하게 유도되었다. 반대로, 5개 유전자의 발현은 IL-1β에 의해 억제되었다. 하기 표 III은 이러한 실험의 결과를 제공한다.
| IL-1 유도 | |||
| 유전자 명칭 | 유전자 ID | 비히클 | EE 처리됨 |
| JE/MCP-1 | Scya2 | 82.3 | 64.4 |
| MIP2 | Scyb2 | 60.1 | 91.1 |
| 대식세포인터페론 유도성 단백질 10 | ScyblO | 50.1 | 39.3 |
| gly96 | ler3 | 42.1 | 43.8 |
| ICAM-1 | 1cam1 | 40.9 | 38.4 |
| PAI-1 | Serpinel | 37.6 | 40.8 |
| 혈청 아밀로이드 A3 | Saa3 | 37.4 | 36.0 |
| M-CSF | Csf1 | 32.8 | 23.9 |
| rhoB | Arhb | 30.0 | 18.5 |
| MyD118 | GADD45b | 24.3 | 12.9 |
| IL-1m | Il1m | 23.6 | 18.9 |
| LPS에 의해 유도된 안키린-반복부를 보유한 분자 | aa614971 | 22.7 | 22.7 |
| Ets 전사 인자 rELF3 | Elf3 | 22.5 | 6.7 |
| B94,TNF-α유도된 단백질 2 | Tnfaip2 | 17.1 | 17.7 |
| MIG | Scyb9 | 15.0 | 5.4 |
| 근육세포에 풍부한 칼시뉴린 상호작용 단백질 | Dscrl | 11.1 | 9.3 |
| A20 | Tnfaip3 | 14.0 | 11.4 |
| NF-카파-B l05 | Nfkbl | 13.8 | 6.2 |
| 사이토킨 신호전달의 억제인자 3 | Cish3 | 13.5 | 6.0 |
| IL-1B | IIIb | - | - |
| 칼그래뉼린 B | S100a9 | 12.5 | 25.7 |
| 인터크라인 | Scya7 | 12.4 | 11.4 |
| 아폽토시스 억제제 1 | Birc2 | 12.2 | 8.9 |
| bcl-3 | Bcl3 | 11.6 | 6.2 |
| 부신수질 | Adm | 11.3 | 10.0 |
| Gadd45 | Gadd45a | 10.9 | 3.6 |
| 인터페론 조절 인자 1 | Irf1 | 10.5 | 9.0 |
| 칼그래뉼린 A | S100A8 | 10.4 | 10.7 |
| IL-1 유도 | |||
| 유전자 명칭 | 유전자 ID | 비히클 | EE 처리됨 |
| 아폽토시스 억제제 2 | Birc3 | 9.6 | 4.3 |
| IL-15 수용체 | I115ra | 9.2 | 2.7 |
| IxBa | Nfkbia | 8.7 | 7.4 |
| H-2Ld | H-2L | 8.2 | 4.1 |
| 녹투민 | Ccr4 | 7.7 | 9.0 |
| PDGF-유도된 KC | Grol | 7.3 | 6.1 |
| JAB, 사이토킨 신호전달의 억제인자 1 | Cishl | 7.3 | 1.4 |
| E-셀렉틴 | Sele | 7.2 | 5.2 |
| DNA 결합의 억제제 3 | idb3 | 6.0 | 3.1 |
| C/EBPδ | Cebpd | 7.0 | 5.2 |
| relB | Relb | 7.0 | 7.9 |
| 구아닐레이트 뉴클레오타이드 결합 단백질 2 | Gbp2 | 6.5 | 3.6 |
| 관련 LPS 유도성 C-C 케모카인 수용체 | AF030185 | 6.3 | 5.6 |
| hsp68 | Hsp70-3 | 6.3 | 1.5 |
| CD83 | Cd83 | 6.2 | 4.0 |
| 헴 옥시게나제 1 | Hmox1 | 5.5 | 3.0 |
| 리포칼린 2 | Lcn2 | 5.5 | 2.9 |
| GTP 결합 단백질 IRG-47 | 1fi47 | 5.4 | 3.2 |
| LIX | ScybS | 5.2 | 2.9 |
| VCAM-1 | Vcaml | 5.2 | 12.5 |
| NF-E2 관련 인자2(NRF2) | Nfe212 | 5.2 | 7.2 |
| 유비퀴틴-접합 E2 효소 변이체 2 | Ube2v2 | 5.0 | 5.3 |
| c-JUN | Jun | 4.8 | 5.6 |
| MARCKS-유사 대식세포 단백질 | M1p | 4.8 | 5.1 |
| 인지질 스크램블라제 1 | Plscrl | 4.4 | 5.6 |
| T-세포 특이적 GTPase | Tgtp | 4.4 | 2.8 |
| IL-1 유도 | |||
| 유전자 명칭 | 유전자 ID | 비히클 | EE 처리됨 |
| 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 1 | 1gfbp1 | 4.0 | 4.3 |
| 유도성 6-포스포프럭토-2-키나제 | 163244 | 4.0 | 3.0 |
| IkB-beta | Nfkbib | 4.0 | 2.8 |
| NFkB p00 | Nfkb2 | 4.0 | 2.8 |
| Glvr-1 | Slc20a1 | 3.9 | 5.8 |
| CD14 | Cdl4 | 3.5 | 6.1 |
| c-myc | Myc | 3.0 | 3.4 |
| 혈청 아밀로이드 A 4 | Saa4 | 2.5 | 1.9 |
| 아드레날린작동성 수용체, 베타 2 | Adrb2 | 2.9 | 3.1 |
| 사이토킨-유도성 키나제 Fnk | Cnk | 2.9 | 0.3 |
| junB | Junb | 2.9 | 2.6 |
| MIP-1 감마 | Scya9 | 2.9 | 1.9 |
| 리보솜 내성 상동체에 대한 조절제 | Rrr | 2.8 | 3.3 |
| 메탈로프로테이나제-디스인테그린 | Adamts1 | 2.7 | 4.6 |
| 사이토킨 신호전달의 억제인자 2 | Cish2 | 2.7 | 1.7 |
| p65 NF-카파 B | Rela | 2.5 | 2.4 |
| T-세포 사멸 관련 유전자 | Tdag | 2.5 | 2.2 |
| 칼슘 결합 단백질 A6 | 100a6 | 2.4 | 2.6 |
| PIM-1 단백질 키나제 | Piml | 2.4 | 2.1 |
| 트랜스글루타미나제 | Tgm2 | 2.2 | 8.0 |
| 단백질 티로신 포스파타제 4a1 | Ptp4al | 2.0 | 1.2 |
| TGFB 유도성 초기 성장 반응 | Tieg | 0.31 | 0.38 |
| 성장 인자 수용체 결합된 단백질 7 | Grb7 | 0.27 | 0.13 |
| SHP | NrGb2 | 0.23 | 0.53 |
| GO/G1 전환 유전자 2 | G0s2 | 0.11 | 0.05 |
| 나선-루프-나선 인자 HES-1 | Hesl | 0.09 | 0.25 |
도 1을 참조하여, 에티닐에스트라디올이 유전자 발현의 IL-1β 조절을 차단하는지를 측정하기 위한 연구의 결과를 제공한다. 각각의 유전자의 배가(fold) 조절을 비히클 사전처리된 동물 (x축) 대 EE로 사전처리된 동물 (y축)에 대해 플롯화한다. EE 사전처리에 의해 영향받지 않는 IL-1β유도되는 유전자는 점선된 대각선을 따라 놓일 수 있다. 대부분의 유전자에 대해, 이러한 경우이다. 그러나, 많은 유전자는 유의적으로 대각선 하부에 위치하며, EE는 이러한 유전자의 유도를 억제하였다는 것을 나타낸다. 예를 들면, bcl-3, JAB, LIX 및 Fnk의 IL-1β 유도는 EE 사전처리에 의해 모두 제거되었다 (역시 표 III 참조). 트랜스글루타미나제와 같은 일부 유전자의 발현은 트랜스글루타미나제 발현을 증가시키는 IL-1β 및 에스트로겐 모두의 공지된 능력에 일치하여, EE + IL-1β처리된 마우스에서는 증가하였다. 반대로, EE 사전처리는 대각선에 유의적으로 상부에 위치한 이러한 점에 의해 나타나는 바와 같이, SHP 및 HES-1의 IL-1β중재된 억제를 억제하였다.
도 2를 참조하여, HepG2 세포에서 SHP발현의 IL-1β 억제를 다음과 같이 조사하였다. IL-1β는 일반적으로 유전자 발현의 억제와 연관이 없다. SHP 발현의 직접적인 IL-1β매개된 억제를 입증하기 위해서, HepG2 세포를 100 U/ml의 IL-1β로 처리하였다. 이 후 다양한 시간에서 제조된 전체 RNA를 실시간 PCR을 사용함으로써 SHP 발현에 대해 분석하였다. SHP 발현은 IL-1β로 처리한 후 3시간 및 6시간째에 현저하게 감소하였다 (*p < 0.05 대 0 시간). 이는 IL-1β 처리 후 9시간째 기준선 수준으로 되돌아간 SHP mRNA 수준과 같은 세포 생존력에서 일반적인 감소에 기인하지 않았다.
도 3a, 3b 및 3c를 참조하여, Fnk, JAB 및 LIX의 EE 억제는 IL-1β 유도에 대해 특이적으로 연구되었다. 2개의 잠재적 기작은 유전자 발현상에 명백한 EE 효과를 초래할 수 있다. 우선, EE는 유전자 발현의 기초 수준을 변형시키나, IL-1β 처리에 의해 유도된 배가 유도에 영향을 미치지 않을 것이다. 또한, EE는 기초 유전자 발현상에 효과는 없으나 대신 IL-1β 매개된 유전자 유도를 특이적으로 차단할 것이다.
도 3a를 참조하여, 이러한 2개의 기작을 구별하기 위해, Fnk, JAB, LIX 및 bcl-3의 IL-1 배가 유도 및 SHP의 IL-1β배가 억제를 비히클 (검정 막대) 또는 100㎍/㎏/일의 EE (회색 막대)로 사전처리된 동물에서 정량화하였다. 각각의 유전자의 간 RNA 수준 (평균 +/- SEM)을 각각의 개별적 동물의 RNA의 실시간 PCR에 의해 측정하였다. IL-1β에 의한 Fnk, JAB 및 LIX에 대한 배가 유도 (IL-1β를 투여한 동물에서의 발현 대 PBS를 투여한 동물에서의 발현의 비율로서 정의됨)는 EE 사전처리된 동물에서 감소되었다. 대조적으로, bcl-3 및 SHP에 대한 IL-1β 배가 조절은 비히클 및 EE 처리된 동물에서 동일하였다.
도 3b를 참조하여, EE는 bcl-3의 기초 발현을 억제하고 SHP의 기초 발현을 상승시켰다 (EE 처리된 마우스 대 비히클 처리된 마우스의 비교). EE는 이러한 유전자를 직접적으로 조절하는 IL-1β의 능력상에 효과를 갖지 않았다: bcl-3의 IL-1 유도는 비히클 처리된 마우스에서 6.2배이고 EE 처리된 마우스에서는 5.2배인 반면, IL-1은 비히클 처리된 동물에서 86% 및 EE 처리된 동물에서 85%로 SHP 발현을 억제하였다.
도 4a, 4b, 4c, 4d 및 4e를 참조하여, EE가 에스트로겐 수용체 (ER) 의존적 기작에 의해 유전자 발현의 IL-1β 유도를 차단하는지를 측정하기 위해 실험을 수행하였다. 에스트로겐은 항산화 기작과 같은 ER 독립적 경로를 포함하는 많은 기작에 의해 유전자 발현을 조절할 수 있다. ER은 IL-1β 유전자 조절의 EE 조절을 조정하였다는 것을 입증하기 위해, 마우스를 비히클 + PBS (회색 막대), 비히클 + IL-1β (검정 막대) 또는 100㎍/㎏/일의 에티닐에스트라디올 (EE), 1 또는 10㎍/㎏/일의 17β-에스트라디올 (각각, 1 E2 및 10 E2), 30㎎/㎏/일의 게니스테인, 5㎎/㎏/일의 랄록시펜 또는 10㎎/㎏/일의 ICI182780으로 처리하였다. Fnk, JAB, LIX, bcl-3 및 SHP의 간 발현 수준 (평균 +/- SEM)을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. EE 및 E2는 이러한 유전자의 조절상에 가장 큰 효과를 가졌다 (*p < 0.05 대 IL-1β 단독). 게니스테인 및 SERM 랄록시펜은 또한 조절의 유사한 패턴으로서 나타내지만, 양은 EE 및 E2로 나타나는 것만큼 크지 않았다. 최종적으로, 순수한 ER길항제 ICI-182780은 임의의 이러한 유전자의 발현상에 효과를 갖지 않았다. 따라서 모든 이러한 유전자의 조절은 조정된 ER로 나타난다.
도 5a, 5b, 5c, 5d 및 5e를 참조하여, ERα가 간에서 유전자 발현의 EE 조절에 필요한지를 측정하기 위해 실험을 수행하였다. ERα 또는 ERβ가 간에서 IL-1β 유전자 발현의 EE 조절에 필요한지를 측정하기 위해, C57BL/6 야생형 마우스, C57BL/6 ERαKO 마우스 또는 129 ERβKO 마우스를 5일동안 비히클 (검정 막대) 또는 10㎍/㎏/일의 EE (회색 막대)로 사전처리한 후 1시간동안 IL-1β로 처리하였다. Fnk, JAB, LIX, bcl-3 및 SHP의 간 발현 수준 (평균 +/- SEM)을 실시간 PCR에 의해 정량화하여, 비히클 + PBS를 투여한 동물에서 발현을 1.0으로 정의하였다. 모든 이러한 유전자의 IL-1β 조절의 EE 억제의 패턴을 야생형 동물 및 ERβ가 결손된동물에서 비교하였다 (비히클 및 EE 처리된 동물 사이에 유전자 발현에서 변화의 비교에 대한 *p < 0.05). 대조적으로, EE는 ERα가 결손된 동물에서 이러한 유전자의 IL-1β 조절상에 효과를 갖지 않았다.
표 IV를 참조하여, 마우스 간에서 유전자 발현의 EE 유도를 연구하였다. IL-1β 유전자 유도의 EE 조절의 잠재적 일 기작은 공지된 전사 억제제인 SHP의 유도를 통하였다. 그러나, 랄록시펜은 Fnk, JAB, LIX 및 bcl-3의 IL-1β 유도를 억제할 수 있으나, 랄록시펜은 SHP 발현을 증가시키지 않아서, 상기 기작을 약리학적으로 제거하였다 (도 4). 임의의 기타 유전자의 EE 유도는 IL-1β 유전자 유도의 억제를 설명할 수 있는지를 측정하기 위해서, 유전자칩 결과를 유전자 발현의 EE 유도에 대해 분석하였다. EE 사전처리에 의해 유도된 많은 유전자는 이노시톨-1-포스페이트 신타제 (IPS), 장내 트레포일 인자, 크레아틴 키나제 및 보체 계열의 구성원을 포함하는 EE에 의해 조절되는 것으로 공지되어 있다. 부가적으로, 프로스타글란딘 D 신타제는 EE 처리에 의해 강하게 유도되었다. 실험관 내에서 프로스타글란딘 D 신타제의 과발현은 IKK 활성을 차단함으로써 NFκB 활성을 억제하여, IL-1β 유전자 유도의 억제에 대한 대안적 기작을 잠재적으로 제공한다.
| 유전자 명칭 | 유전자 ID | EE 도입 |
| 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제 | aa221219 | 167.1 |
| 프로스타글란딘 D2 신타제 | Ptgds | 72.8 |
| 케라틴 복합체 2, 염기성,유전자 4 | Krt2-4 | 38.0 |
| 시토크롬 P450, 17 | Cyp17 | 32.3 |
| 프로테이나제 3 | Prtn3 | 24.1 |
| 시토크롬 P450, 7bl | Cyp7bl | 21.1 |
| 장의 세잎 인자 3 | Tff3 | 16.3 |
| IIb형 Na/포스페이트-공수송체 | Npt2b | 13.5 |
| 크레아틴 키나제 B | Ckb | 13.0 |
| CD97 | Cd97 | 6.0 |
| 백혈병 억제 인자 수용체 | Lifr | 5.1 |
| H2A 히스톤 계열, 구성원 X | H2afx | 5.1 |
| 데스모콜린 2 | Dsc2 | 5.0 |
| 뇌의 지방산 결합 단백질 7 | Fabp7 | 4.8 |
| 세포 분열 주기 2 상동체 A | Cdc2a | 4.6 |
| 혈청 글루코코르티코이드 조절된 키나제 | Sgk | 4.5 |
| 림프구 항원 86 | Ly86 | 4.3 |
| 신호 전달자(signal transducer) 및 전사 활성화인자 5A | Stat5a | 4.1 |
| 카텝신 S | Ctss | 4.0 |
| 리소좀 티올 리덕타제 IP30 전구체 | IP30 | 3.7 |
| 용질 전달체 계열 11, 구성원 1 | Slcllal | 3.6 |
| 아포지단백질 A-IV | Apoa4 | 3.5 |
| 인터류킨 17 수용체 | 1117r | 3.5 |
| 스타트민 | Kist | 3.5 |
| 피롤린-5-카복실레이트 신테타제 | Pycs | 3.3 |
| 아폽토시스 억제제 6 | Api6 | 3.3 |
| F4/80 | Emr1 | 3.1 |
| CD68 항원 | Cd68 | 3.1 |
| 프로페르딘 | Pfc | 2.9 |
| CD53 | Cd53 | 2.9 |
| 콜로니 자극 인자 1 수용체 | Csflr | 2.8 |
| ClqB | Clqb | 2.8 |
| 카데린 1 | Cdhl | 2.6 |
| 만노스 수용체,C 1형 | Mrcl | 2.6 |
| 인터페론 활성화된 유전자 203 | 1fi203 | 2.5 |
| ClQc | Clqc | 2.3 |
| 테스토스테론 16-알파-하이드록실라제(C-16-알파) | Cyp2d9 | 2.3 |
| 아포지단백질 C2 | Apoc2 | 2.2 |
표 6a 및 6b를 참조하여, 유전자 발현의 EE 유도가 IL-1β 유전자 유도의 ERα 억제에 필수적이지 않음을 입증하기 위해 실험을 고안하고 수행하였다. 프로스타글란딘 D 시스템의 EE 유도가 IL-1β 유전자 유도의 ERα 매개된 억제에 필수적인지를 측정하기 위해, 비히클 + PBS (회색 막대), 비히클 + IL-1β (검정 막대) 또는 100㎍/㎏/일의 EE, 30mg/㎏/일의 게니스테인, 5mg/㎏/일의 랄록시펜, 또는 10mg/㎏/일의 ICI-182780 +IL-1β로 처리된 마우스에서 프로스타클란딘 D 신타제의 간 발현 수준을 측정하였다. 비히클 + PBS 처리된 마우스에서 발현 수준을 1.0으로 정의하였다. 이러한 RNA 샘플은 도 4에서 사용된 바와 같이 동일하여, EE, 게니스테인 및 랄록시펜의 이러한 투여량 모두가 IL-1β 유도를 억제하였음을 제시하였다. 그러나, 이러한 화합물이 IL-1β 유전자 유도를 억제하는 능력 (EE>게니스테인>랄록시펜) 및 이러한 화합물이 프로스타글란딘 D 신타제 발현을 자극하는 능력 (EE 랄록시펜>게니스테인) 사이의 관련성은 없었다. IPS의 유도에 대한 유사한 패턴을 랄록시펜에 의한 매우 약한 유도 및 게니스테인에 의해 유도되지 않는 것과 함께 발견하였다. 이는 ERα에 의한 유전자 유도가 유전자 발현의 IL-1β 유도를 억제하는 능력에 필수적이지 않음을 제시한다.
도 7a, 7b, 7c, 7d 및 7e를 참조하여, 폐에서 IL-1β 유전자 유도의 EE 억제의 존재 또는 부재를 조사하였다. 간에서 EE 활성의 ERα의 요건은 간에서 ER의 거의 독점적인 존재와 일치한다 (실시간 PCR에 의해 측정된 바와 같음, 패널 A). 반대로, 폐에서는 ERα는 비교적 낮은 수준으로 ERβ는 높은 수준으로 발현한다. 또한 ERβ가 IL-1β가 유전자 발현을 유도하는 능력을 조정할 수 있는지를 측정하기 위해, EE가 Fnk, JAB, LIX 및 bcl-3의 IL-1β 유도를 변형하는 능력을 간, 비장 및 폐에서 측정하였다. 이전과 같이, 이러한 유전자의 IL-1β 유도는 간에서 유의적으로 차단되었다. 비장에서 Fnk 및 JAB의 IL-1β 유도는 또한 EE 사전처리에 의해 차단되었다. 비장에서는 간에서보다 ERα가 유의적으로 더 낮은 수준으로 발현하나, 폐에서보다 어느 정도 더 높게 발현한다. 반대로, EE 사전처리는 폐에서 Fnk, JAB, LIX 또는 bcl-3의 IL-1β의 유도에 효과가 없었다. 조직 특이적 인자가 이러한 결과에 영향을 줄 수 있으나, 폐에서 조절 부재는 ERβ가 이러한 효과를 조정할 수 없고 ERα가 유전자 발현의 IL-1β 유도를 변형하는 능력을 실제로 억제할 수 있는 가설과 일치한다.
도 8을 참조하여, HepG2에서 NFκB 활성의 IL-1β 유도의 ERα 및 ERβ 억제를 평가하였다. 폐에서 Fnk, JAB, LIX 및 bcl-3 발현의 IL-1β유도의 EE 억제는 ERβ가 상기 억제를 보정하는 내재적 불능 또는 간, 비장 및 폐 사이에 조직 특이적 차이에 기인하여 결여될 수 있다. ERβ가 IL-1β 시그날링을 직접 억제하는 능력을 측정하기 위해, HepG2 세포를 사람 ERα 또는 ERβ 발현 플라스미드와 NFκB 유도된 루시페라제 리포터 플라스미드 및 β-갈락토시다제 형질감염 조절 플라스미드와 함께 동시 형질감염 시켰다. 형질감염 후 세포를 비히클, 10nM 17β-에스트라디올 또는 10nM 17β-에스트라디올 + 1uM ICI182780으로 처리하였다. 다음 날 세포를 100U/ml IL-1β로 6시간동안 처리하고 루시페라제 발현에 대해 검정하였다. ERα 및 ERβ 모두는 루시페라제 활성의 IL-1β 유도를 현저하게 억제하나 (*p < 0.01), ER13은 일관되게 ERα보다 덜 유효하였다. 따라서 폐에서 IL-1β 유전자유도의 EE 조절은 ERβ가 IL-1β 시그날링을 억제하는 내재적 불능에 기인하여 결여되는 것이 아니다. 대신, 폐에서 조절 결여는 IL-1β 시그날링의 ER 억제에 필수적인 보조 단백질에서 조직 특이적 발현 차이를 반영할 수 있다.
다음 결론은 이러한 실험의 결과의 증거이다: (1) IL-1β의 1시간 처리는 75개 유전자의 발현을 유도라고 마우스 간에서 5개 유전자의 발현을 억제한다; (2) EE 사전처리는 ER 의존적 방식으로 많은 이러한 IL-1β 조절을 억제한다; (3) EE는 기초 발현 수준을 변형하거나 유전자 유도를 특이적으로 억제함으로써 IL-1β 유도된 유전자 발현 모두를 조절할 수 있다; (4) 유전자 발현의 ERα 유도는 ERα가 IL-1β 매개된 유전자 조절을 차단하는 능력에 필요하지 않다; 및 (5) Fnk, JAB, LIX 및 bcl-3의 IL-1β 유도는 간에서 억제되나, ERβ가 높은 수준으로 발현하는 폐에서는 억제되지 않는다. 이는 ERβ가 IL-1β 시그날링을 억제하는 내재적 불능에 기인하지 않으나, IL-1β 시그날링의 EE 억제에 필수적인 보조인자에서 조직 차이를 반영할 수 있다.
실시예 2- SHP 발현의 조절
다음과 같이 SHP 발현의 조절을 조사하기 위해 몇몇 실험을 수행하였다. 도 9를 참조하여, 마우스 간에서 SHP 발현의 ERα 조절을 연구하였다. 난소제거된 야생형, ERαERβ 이중 결손, ERαKO 또는 ERβKO 마우스를 비히클, 10㎍/㎏/일 E2 + 5mg/㎏/일 ICI182780, 5mg/㎏/일 타목시펜 또는 5mg/㎏/일 PPT를 6주 동안 피하 주사로 처리하였다. SHP의 간에서 발현을 GAPDH 발현에 대한 표준화로 실시간 PCR을사용하여 모니터하였다. WT 동물에서, E2, 타목시펜 및 ERα 선택적 효능제 PPT 모두를 SHP mRNA 수준을 유도하였다. ICI182780은 상기 유도를 억제하였다. E2는 ERαKO 또는 ERαβKO 마우스에서 SHP 발현을 유도하지 않았다. ERβKO 마우스에서 SHP의 기초 발현을 증가시키나, E2는 여전히 SHP의 발현을 유도하였다. 이러한 결과는 함께 마우스 간에서 SHP의 에스트로겐 유도는 ERα에 의해 주로 중재된다는 것을 제시한다.
도 10에서 나타난 바와 같이, 에스트로겐이 쥐 간에서 SHP를 조절하는지를 측정하기 위해 연구를 수행하였다. 난소제거된 스파라구-돌리(Sprague-Dawley) 쥐를 비히클, 10㎍/㎏/일 E2 또는 5mg/㎏/일 PPT로 6주동안 처리하였다. 간에서 SHP 발현을 GAPDH 발현에 대한 표준화로 실시간 PCR에 의해 모니터하였다. E2 및 PPT 모두를 SHP 발현은 현저하게 유도하여, ERα는 또한 쥐 간에서 SHP를 유도함을 제시하였다.
도 11a 및 11b를 참조하여, 사람 세포에서 hSHP 프로모터 활성의 ER 조절을 조사하였다. 사람 HepG2 또는 293 세포를 제어 SV40 유도된 β-갈락토시다제 플라스미드, 1.4kb의 사람 SHP 프로모터로 유도된 루시페라제 플라스미드 및 단백질 또는 사람 ERα를 암호화하지 않는 발현 플라스미드와 함께 동시 형질감염 시켰다. 형질감염 다음 날 세포를 24시간동안 DMSO 비히클 또는 10nM E2로 처리하였다. 이어서 세포 추출물을 β-갈락토시다제 활성에 대해 표준화되는 루시페라제 활성에 대해 분석하였다. E2는 ERα를 발현하는 세포에서만 SHP 프로모터 활성을 유도하였다. 이러한 결과는 E2가 사람 간에서 SHP 발현을 조절할 수 있다는 것을 제시한다.
도 12a, 12b 및 12c를 참조하여, 293 세포에서 hSHP 프로모터 활성의 ER 조절을 조사하였다. 도 12a 및 12b를 참조하여, 293 세포를 제어 SV40 유도된 β-갈락토시다제 플라스미드, 1.4kb의 사람 SHP 프로모터 또는 합성 2xERE/TK 프로모터에 의해 유도된 루시페라제 플라스미드 및 사람 ERα에 대한 발현 플라스미드와 함께 동시 형질감염 시켰다. 다음 날 세포를 24시간동안 1uM의 제시된 화합물 (ICI182780, 4-하이드록시타목시펜 또는 랄록시펜)을 DMSO 비히클(-) 또는 10nM E2(+)와 함께 처리하였다. 이어서 세포 추출물을 β-갈락토시다제 활성에 대한 표준화로 루시페라제 활성에 대해 분석하였다. 마우스에서 나타난 바와 같이, E2 및 타목시펜 모두는 SHP 프로모터 활성을 자극하였다. ICI 및 랄록시펜은 단독으로 불활성이고 E2 활성을 길항작용 하였다. SHP 프로모터는 ERE 유도된 프로모터로부터 현저하게 상이하여, SHP 프로모터 활성의 E2 조절은 전형적인 에스트로겐 반응 요소를 통해 작용할 수 없다는 것을 제시하였다.
12c를 참조하여, SHP의 E2 유도 및 2xERE 프로모터 활성에 대한 투여 반응 곡선을 제공한다. 약 10배 더 높은 농도의 E2는 SHP 프로모터 활성보다 SHP 프로모터 활성의 유도에 대해 필수적이었다. SHP가 ER 활성의 음성 조절자이기 때문에, SHP 프로모터 활성화에 필수적인 높은 EC50은 E2 수준이 많은 양에 도달하는 경우 이러한 음성 피드백 루프를 단지 발동시키는 수단을 반영할 수 있다.
도 13을 참조하여, 293 세포에서 E2 반응 요소를 지도화하는 연구를 수행하였다. SHP 프로모터 절단 리포터 플라스미드 계열을 ERα 발현 플라스미드 및 β-갈락토시다제 제어 플라스미드와 함께 293 세포로 동시 형질감염 시켰다. 비히클로 처리된 세포에서 1460 bp SHP 프로모터의 발현을 1.0으로 정의하였다. 293 세포에서 기초 발현에 영향을 주는 요소는 -795 및 -549 사이에 위치한 반면, E2 조절은 -1460 및 -1260 사이에 위치하였다.
도 14a, 14b 및 14c를 참조하여, SHP의 ER유도가 CY P7A1 및 CYP8B1를 억제하지 못하는지를 측정하기 위해 연구를 수행하였다. 난소제거된 마우스를 대조용 음식물 (-) 또는 콜레이트를 함유한 음식물(+)로 사육하고 비히클(-) 또는 10㎍/㎏일 에티닐에스트라디올(+)의 일일 피하 주사로 5주 또는 5일동안 처리하였다. 연구 끝에, SHP, CYP7A1 및 CYP8B1의 간 mRNA 수준을 GAPDH 발현에 대한 표준화로 실시간 PCR에 의해 측정하였다. EE는 5일 또는 5주 처리에서 콜레이트에 의해 보여지는 유도보다 더 낮은 수준으로 유도하였다. 그러나, EE 처리는 시점에서 CYP7A1 또는 CYP8B1 발현을 현저하게 변형시킬 수 없고, 반대로 콜레이트는 95% 이상으로 CYP7A1 또는 CYP8B1 발현을 억제하였다. 이러한 결과는 SHP 발현의 단순 유도는 CYP7A1 또는 CYP8B1의 활발하게 억제시키는데 적합하지 않다.
도 15를 참조하여, CYP7A1 및 CYP8B1의 콜레이트 억제에 SHP 유도가 필요한지를 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 난소제거된 마우스를 콜레이트의 농도를 증가시키면서 5일동안 사육하였다. SHP, CYP7A1 및 CYP8B1에 대한 간 mRNA 수준을 GAPDH 발현에 대한 표준화로 실시간 PCR에 의해 측정하였다. CYP7A1 및 CYP8B1을 음식물에서 0.03% 콜레이트와 함께 현저하게 억제시키는 반면, SHP mRNA 순준을 0.3 콜레이트를 음식물에 첨가할 때까지 현저하게 증가시켰다. SHP 유도에 대해CYP7A1 및 CYP8B1 억제보다 10배 더 큰 수준의 콜레이트에 대한 필요는 SHP 발현의 유도는 CYP7A1 및 CYP8B1 발현의 콜레이트 억제에 대한 단일 기작이 아니라는 것을 다시 제시한다.
실시예 3- 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP를 억제하는 화합물을 확인하기 위한 일시적 형질감염
CYP8B1 프로모터 (전사 개시 위치보다 뉴클레오티드 -514번에서 +303번까지의 서열)를 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 게놈 DNA로부터 분리시켰다. 수득한 PCR 생성물은 TOPO TA 클로닝 키트 (In Vitrogen사로부터 이용가능함, Carlsbad, California)를 사용하여 플라스미드 pCR2.1 (In Vitrogen사)로 클로닝시킨 TOPO였다. 정확한 서열을 확인한 후, CYP8B1 프로모터를 EcoRI 분해로 제거하였다. 수득한 DNA 단편의 말단을 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 뭉툭하게 하였다. 이어서 단편을 pRL 없는 절단된 Sma I (Promega 사로부터 이용가능함, Madison, Wisconsin)으로 연결시켜 사람 CYP8B1 프로모터에 의해 유도된 레닐라 루시페라제 리포터를 가진 pCYP8B1-RL을 제작하였다. 사람 HNF-4 및 SHP 암호화 영역을 유사한 표준 분자적 방법에 의해 SV40-프로모터 발현 벡터 pSI (Promega사)로 클로닝시켰다.
이어서 플라스미드를 HepG2 세포에 동시 형질감염 시켰다. HepG2 스톡 세포를 DMEM 높은 글루코스, 10% FBS, 페놀 레드 배지 (Invitrogen사, GIBCO Cat. 제11995-065호)중에 유지한다. 형질감염을 위해, 세포를 페놀 레드 없는 DMEM 높은글루코스 배지 (Invitrogen사, GIBCO Cat. 제31053-028호), 10% 숯 제거된 FBS (HyClone사, Logan, Utah, Cat. 제SH30068.03호)로 이루어진 검정 배지에서 12웰 플레이트의 웰당 1×105세포에서 플레이트시킨다. 다음 날, 형질감염 시약 Tfx-20 (Promega사; E2391)을 0.5㎍ pCYP8B1-RL, 0.4㎍ pSI-HNF4 및 혈청 없는 1㎍ 이하 pSI-SHP, DNA에 대한 Tfx-20의 2:1 비율에서 페놀 레드 없는 DMEM/F12 (Invitrogen사; GIBCO Cat. 제11039-021호)와 함께 혼합하고, 실온에서 10분동안 항온처리 한다. 세포를 혈청 없는 DMEM/F12로 1회 세척하고 배지를 추출한다. Tfx-20/DNA 혼합물을 첨가하고 세포를 37℃에서 1시간동안 항온처리 한다. 항온처리 시간 마지막에, 검정 배지를 첨가하고 세포를 추가로 23 내지 48시간동안 항온처리 한다. 검정 배지를 제거하고 세포를 PBS로 헹군다. 헹굼 용액을 제거하고 250㎕의 1×레닐라 용해 완충액(Promega사; E2810)을 첨가한다. 플레이트를 진동 플랫폼상에 15분동안 위치시킨다. 용해질을 마이크로퓨지 튜브에 이동시켜 30초동안 원심분리에 의해 제거한다. 20㎕ 분취물을 마이크로플로어 플레이트 (ThermoLab system사)에 이동시킨다. 100㎕의 레닐라 검정 시약을 동시에 한 웰에 주입하고 Dynex MLX 미세적정 플레이트 발광측정기 (MicrotitERPlate Luminometer)에서 30초 간격을 통해 판독하였다.
도 16에 참조하여, 수득한 루시페라제 활성을 그래프에 표현한다. SHP 발현 플라스미드의 첨가로 투여량 의존 방식으로 HNF-4 유도된 CYP8B1 프로모터 활성의 발현을 억제시켰다.
시험 화합물을 SHP 활성을 억제할 수 있는지를 측정하기 위해, 시험 화합물을 형질감염 후 검정 배지에 첨가한다. 루시페라제 활성을 SHP 길항제의 존제에 의해 증가시킬 수 있다.
상기 방법의 대안적 양태는 세포를 네오마이신, 하이그로마이신 또는 푸로마이신을 포함하는 표준 선택적 표지를 사용하여 pCYP8B1-RL, pSI-HNF4 및 pSI-SHP와 함께 안정하게 형질감염 시키는 것이다.
실시예 4- 콜레스테롤 생합성 경로에서 SHP를 억제하는 화합물을 확인하기 위한 아데노바이러스성 감염
리포터 유전자 (예를 들면, 반딧불이 루시페라제, 레닐라 루시페라제 또는 -갈락토시라제)의 발현을 유도하는 사람 CYP8B1 프로모터의 영역을 함유하는 리포터 아데노바이러스를 ADEASY 시스템 (QbioGene사, Carsbad, California)에 기술된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 고안한다. CYP8B1 프로모터 리포터 고안물을 우선 전이 벡터 pShuttle 또는 pQBI-AdBN으로 클로닝한다. 수득한 플라스미드를 Pme I으로 선형으로 하여 이 콜라이(E. Coli) 균주 BJ5183을 pAdEasy-1인 바이러스성 플라스미드와 함께 동시 형질감염 시킨다. 재조합체를 카나마이신으러 선별하여 PCR 또는 제한 효소 분석으로 스크린한다.
이어서 정확한 플라스미드를 이 콜라이 균주 DH5a에 형질감염 시키고 형질감염 특성 DNA를 Qiagen Maxilit와 같은 전형적 방법에 의해 정제시킨다. 재조합 아데노바이러스성 고안물을 Pac I으로 분해하여 ITR (전도된 말단 반복물; invertedterminal repeats)를 노출시켜 QBI-293A 세포에 형질감염 시켜 바이러스성 입자를 생성한다. 수득한 플라크를 표준 방법에 의해 증폭하기 위해 사용한다. 염화세슘 농도구배와 같은 방법에 의해 최종 증촉된 아데노바이러스의 정제 후, 최종 아데노바이러스 스톡을 293 세포를 사용하여 적정시킨다. HNF-4 및/또는 SHP 발현하는 아데노바이러스를 pShuttle-CMV와 같은 대안적 전이 벡터를 사용할 수 있는 것을 제외하고, 유사하게 제조한다.
대안적 양태는 HNF-4a[참고: Naiki et al. JBC 277: 14011, 2002, 상기 유전자 목록에 대해 참고로 인용한다]에 반응하는 것으로 공지된 임의의 기타 프로모터를 사용하여 리포터 유전자의 발현을 유도한는 것이다.
상기 방법의 추가 대안적 양태는 단일 아데노바이러스를 사용하여 HNF-4 및 SHP 모두를 발현시키는 것이다. 이러한 경우 전이 벡터 pQBI-AdCMV5-IRES-GFP를 사용한다. SHP cDNA를 CMV5 프로모터의 하류에 클로닝 시킨다. GFP 유전자를 HNF-4a 유전자로 대신한다. 제한 단편 재조합과 같은 표준 기술에 의해 또는 더욱 바람직하게 중복 PCR에 의해 이러한 단계를 이룬다. 수득한 전이 플라스미드는 CMV 프로모터 이후 SHP cDNA에 이어서 내재 리보솜 진입 절편(internal ribosome entry segment; IRES)에 임의로 이어서 HNF-4 cDNA를 함유한다. 기타 프로모터를 전이 플라스미드 pQBI-AdBM5-PAG에서 중요 후기 프로모터(Major Late Promoter; MLP)와 같은 CMV 프로모터 대신 사용할 수 있다. 상기 바람직한 방법은 SHP는 HNF-4가 발현하는 모든 세포에서 발현할 것이라는 것을 확실하게 한다.
또다른 대안적 양태는 리포터 유전자의 발현을 유도하는 사람 CYP7A1 프로모터의 영역을 함유하는 리포터 아데노바이러스와 함께 CPF (LRH-1)을 발현하는 아데노바이러스를 사용하는 것이다.
아데노바이러스성 벡터가 완전한 경우, 이들을 사람 세포, 바람직하게 사람 간암 HepG2 세포를 감염시키는데 사용한다. 세포를 37℃에서, 일반적으로 5시간동안 배지에서 아데노바이러스에 노출시킨다. 이어서 세포를 세척하고, 아데노바이러스와 함께 신선한 배지에 재배양한다. 리포터 플라스미드 및 HNF-4 발현 플라스미드에 대한 적합한 감염 다중성(multiplicity of infection; MOI)을 각각의 바이러스의 각종 MOI의 동시 감염시키는 매트릭스 분석에 의해 측정한다. 유사하게, SHP를 발현하는 아데노바이러스에 대한 적정 MOI를 측정한다. 따라서 최종 검정에서, 세포를 x MOI에서 CYP8B1-리포터 아데노바이러스, y MOI에서 HNF-4 발현 아데노바이러스 및 z MOI에서 SHP 발현 아데노바이러스를 사용하여 감염시킨다. 감염 후, 세포를 비히클 또는 시험 화합물을 사용하여 처리한다. 시험 호합물을 일반적으로 DMSO중에 용해시키고 약 10μM의 최종 농도에서 배양 배지에 첨가한다. 예를 들면, 루시페라제 활성을 LUC-SCREEN 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자 검정 시스템 (Applied Biosystems사로부터 이용가능함, FostERCity, California)을 포함하는 많은 방법 또는 세포의 용해 후 루시페라제 검정 시스템 (Promega사)을 사용함으로써 모니터링 할 수 있다. 루시페라제 활성을 증가시키는 화합물을 SHP 억제제로서 작용할 수 있다.
시험 화합물이 SHP 억제제로서 작용하는 것을 확증하기 위해, HepG2 세포를 x MOI에서 CYP8B1-리포터 아데노바이러스 및 y MOI에서 HNF-4 발현 아데노바이러스를 사용하여 감염시킨다. 이어서 루시페라제 활성을 상기 기술된 바와 같이 모니터링 한다. SHP 억제제는 SHP 부재하는 이러한 세포에서 루시페라제 활성을 변형시키지 않을 것이다.
실시예 5- 콜레이트는 감염성 유전자 발현의 유도를 중재한다
난소제거된 C57BL/6 마우스 (16-20g) (Taconic사)를 8마리 그룹으로 분리시켰다. 휴양 5 내지 7일 후, 마우스를 카제인계 음식물 (#8117, 시험 음식물, Richmond사, IN)으로 5일동안 사육하였다. 카제인 음식물을 분말로 분쇄하여 콜산 (CA; C-1129, Sigma사, St. Louis, MO) 또는 우르소데옥시콜산 (UDCA; U-5127; Sigma사, St. Louis, MO)의 증가하는 농도로 혼합함으로써 보충하였다. 실험 기간 말기에, 간을 RNA 분석을 위해 수거하였다.
RNA 분석
전체 간 RNA를 Trizol 시약 (BRL사)를 사용하여 제조하고 제조사의 프로토콜에 따라 ABI PRISM 7700 검출 시스템 (Applies Biosysem사)을 사용하여 실시간 RE-PCR에 의해 정량화하였다. 데이터를 서열 Dector v1.7 소프트웨어 (Applies Biosysem사)를 사용하여 분석하고 Applies Biosysem 프라이머 세트를 사용하여 GAPDH에 대해 표준화 하였다.
세포 실험
HepG2 세포를 5% CO2 항온기에 37℃에서 성장 배지에서 유지하였다. 세포를 결핍 성장 배지(열-불활성화된 10% FBS, 1% 글루타맥스, 1% MEM 비필수 아미노산. 100U/mi 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 페놀 레드 없는 DMEM (Gibco BRL사))에서 6웰 접시 (Falcon사)에서 웰 당 4-5 ×105세포로 유지하였다. 이어서 세포를 혈청 결핍 배지로 24시간동안 위치한 후 부가적 24시간동안 화합물을 첨가하였다. 이어서 세포를 RNA 분석을 위해 수거하였다.
결과
C57BL/6 마우스를 콜레이트를 함유한 고지방 음식물로 이전에 배양하여 3 내지 5주 후 마우스 간에서 염증 유전자 발현을 유도하였다 [참고: Liao et al '93 JCI 91: 2572, Evans et al. '01 Circ Res 89: 823 & Miyake et al '00 JBC 275: 21805]. 이러한 유도를 중재하는 것에서 콜레이트의 상대적 공헌을 측정하기 위해, C57BL/6 마우스를 증가하는 농도의 CA (0.01 내지 1.0%)로 보충된 음식물로 5일동안 사육시켰다. 도 1A에 나타난 바와 같이, TNFα (4배), VCAM-1 (3배) 및 RANTES (1.75배)의 간 수준의 투여량 의존 유도를 관찰하였다. 예상된 바와 같이, 7α-하이드록실라제 (cyp7a)의 투여량 의존 억제를 또한 관찰하였다.
이러한 결과는 담즙에 대한 급성 노출이 더 많은 만성적인 연구에서 고지방 음식물로 제공된 산화 스트레스 또는 담즙의 증가된 수준과 연결된 잠재 독성의 부재에서 염증 유전자 발현을 촉진하는데 충분하다는 것을 제시하였다. 생체 내에서, CA는 FXR과 선택적으로 상호작용하는 것을 나타내는 장내에서 데옥시콜산으로 전환되는데 반해서 [참고: Wang '99 Mol Cell 3: 543 & Makishima '99 Science 284: 1362], UDCA와 같은 더 많은 하이드로필산은 프레그난 X 수용체 (PXR)에 결합을 통하여 작용하고 FXR에 대한 결합을 통해 작용하지 않는다 [참고: Heuman '89 JLR 30: 1161]. FXR를 통한 시그날링은 염증 유전자 발현을 초래하는데 필수적인지를 측정하기 위해서, FXR에 대한 결합을 통해 1% UDCA 담즙산 시그날링은 음식물에 보충된 담즙산의 주요 기작 중 하나이다. 도 1B에 나타난 바와 같이, 염증 유전자 발현의 유도가 관찰되지 않는 반면 UDCA 처리는 cyp7a 발현을 억제하지 않고 PXR 결합을 통하여 작용하는 능력과 일치하는 cyp3a 발현을 유도하였다.
또한, SHP 발현의 유도는 또한 CA와 함께 관찰되고 CA 시그날링에서 FXR에 대한 요구를 지지하는 UDCA (도 1C)와 함께 관찰되지 않았다.
실시예 6- SHP 및 RJP14O의 FXR 특이적 담즙산 유도
FXR을 통한 담즙산 시그날링은 염증 유전자 발현을 촉진할 수 있는 가능성을 추가로 조사하기 위해, 실험을 간세포주인 HepG2에서 수행하였다. HepG2 세포를 24시간동안 증가하는 농도의 체노데옥시콜산 (CDCA) (1-100uM) 또는 선택적인 합성 FXR 리간드인 GW 4064 (1-1000nM)로 처리하였다. CDCA를 CA보다 HepG2 세포에서 cyp7a 발현의 더 잠재적인 억제제이기 때문에 이러한 실험에 사용하였다 [참고: Makishima et al '99 Science 284: 1362]. HepG2 세포는 ICAM-1 및 M-CSF를 구성적으로 포함하는 다수의 염증 유전자를 발현한다 [참고: Stonans et al '99Cytokine 11:151]. ICAM-1 및 M-SCF 발현 모두를 CDCA 또는 GW 4064 처리에 의해 투여량 의존 방식으로 유도하였다. 양성 대조군으로서, SHP mRNA의 유도 및 cyp7a의 억제를 확증하였다. 이러한 결과로 CDCA 또는 GW 4064를 통해 선택적으로 FXR의 활성이 염증 유전자 유도를 초래할 수 있음을 제시한다.
도 19, 20a 및 20b를 참조하여, HepG2 세포에서 CDCA 및 GW 4064의 상대적 발현을 예시한다.
이러한 실험으로 염증 유전자 발현을 촉진하는 FXR의 신규한 작용을 나타낸다. 담즙산을 함유하는 고지방 음식물은 3 내지 5주 후 마우스의 간에서 염증 유전자 유도를 초래할 수 있음을 이전에 나타내었다 [참고: Liao et al '93 JCI 91: 2572 & Evans et al. '01 Circ Res 89: 823]. 그러나, 담즙산과 함께 고지방 음식물에 의해 유발된 산화 스트레스를 통해 이러한 유도가 발생하여 간 독성을 반영할 수 있다 [참고: Delzenne et al '92 Toxicity Letters 61: 291]. 이러한 잠재적 혼동가능한 문제를 피하기 위해, 음식물로 사육한 마우스에 급성 담즙 노출로 이러한 연구를 수행하였다. 그 결과로 0.3% CA의 보충은 염증 유전자 발현을 유도하는데 충분함을 나타내었다. CA의 이러한 농도로 또한 cyp7a 유전자를 현저하게 억제하여 FXR의 예상된 생물학적 활성을 유전자 조절을 중재함을 확증하였다. 염증 유전자 발현의 유도를 더 많은 하이드로필 담즙산, UDCA를 음식물중에 보충시키는 경우 관찰하나, cyp7a의 억제를 여전히 관찰하였다. 이는 UDCA가 PXR에 결합하는 능력에 기인하는 것으로 여겨진다 [참고: Schuetz et al '01 JBC 276: 39411]. 이는 익히 특징 파악된 PXR 조절된 유전자의 유도와 일치하였다. 이러한 결과는 PXR에대한 리간드는 아닌 FXR에 대한 리간드는 간에서 염증 유전자 발현을 유도할 수 있음을 나타낸다. 이러한 결론은 ICAM-1 및 M-CSF의 염증 유전자 유도는 또한 담즙산 CDCA 또는 합성 FXR 리간드인 GW 4064의 존재하에 관찰되는 HepG2 세포 실험에서 지지되었다. GW 4064는 ICAM- 유도에 대해 관찰되는 것에 역시 비교할 만한 90nM의 EC50으로 FXR에 대한 특이적 리간드임을 이전에 특징 파악되었다 [참고: Goodwin et al '00 Mol Cell 6: 5 17].
SHP 발현은 담즙산 또는 FXR에 결합하는 GW 4064에 의해 유도될 수 있기 때문에 [참고: Goodwin et al '00 Mol Cell 6: 5 17 & Sinal '00 Cell 102: 73 1], SHP mRNA 수준을 또한 모니터링 하였다. FXR 리간드 CDCA 및 GW4064만이 SHP 발현을 유도할 수 있고 PXR 리간드 UDCA는 유도할 수 없다는 것을 확증하였다. 최근에, SHP는 실험관 내에서 NIP-KB에 대한 보조활성자임을 나타내었다 [참고: Kim '01 JBC]. NIP-KB는 염증 유전자 발현에 연관된 중추 전사 인자이고 FXR 리간드가 염증 유전자 발현을 강화시키는 것을 설명할 수 있다.
실시예 7- 발현의 유도를 중재하는 콜레이트의 상대적 기여
이러한 유도를 중재하는 콜레이트의 상대적 기여를 측정하기 위해, C57BL/6 마우스를 증가하는 농도의 콜산 (CA; 0.01-1.0%)으로 보충된 음식물로 5일동안 사육시켰다. TNFoc, VCAM-1 및 ICAM-1 mRNA의 간 수준의 투여량 의존 유도를 관찰하였다. 실험관 내에서, CA를 FXR과 선택적으로 상호작용하는 장내에서 데옥시콜산으로 전환시키는 반면, 우르소데옥시콜산과 같은 더 많은 하이드로필 담즙산은 FXR이 아닌 PXR에 대해 결합시키는 것을 통하여 작용한다. FXR을 통한 시그날링이 염증 유전자 발현을 초래하는데 필수적인지를 측정하기 위해, 1% UDCA를 음식물에 보충시켰다.
특히, 도 21 a 내지 d를 참조하여, C57BL/6 마우스를 제시된 바와 같이 죽종형성성 또는 고지방 음식물(나트륨 콜레이트가 없는 죽종형성성 음식물)로 사육시켰다. 5주 후, 제시된 유전자의 간 mRNA 수준을 실시간 PCR로 측정하였다. 데이터를 각각의 그룹에 대한 평균 ± SEM으로 보고한다. *p < 0.01 대 음식물 상의 마우스. 도 22 a-b를 참조하여, C57BL/6 마우스를 제시된 바와 같은 증가하는 농도의 콜산으로 보충된 음식물로 사육하였다. 5일 후, 제시된 유전자의 간 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 데이터를 각각의 그룹에 대한 평균 ± SEM으로 보고한다. 도 23 a 내지 b를 참조하여, C57BL/6 마우스를 1% 우르소데옥시콜산 (UDCA)로 보충된 음식물로 사육시켰다. 5일 후, 제시된 유전자의 간 mRNA 수중을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. B. UDCA의 1% 콜산 (CA)으로 5일동안 사육된 마우스에서 간 SHP mRNA 발현의 비교. 데이터를 각각의 그룹에 대한 평균 ± SEM으로 보고한다.
염증 유전자 발현의 유도는 관찰되지 않는 반면, UDCA 처리는 cyp7a 발현을 억제하고 PXR 결합을 통해 작용하는 능력과 함께 cyp3a 발현을 유도하였다. 또한, SHP 발현의 유도는 또한 CA로만 관찰되고 CA 시그날링에서 FXR에 대한 필요를 지지하는 UDCA 처리에서는 관찰되지 않았다.
FXR을 통한 담즙산 시그날링이 염증 유전자 발현을 촉진하는 가능성을 추가 조사하기 위해, 간세포주인 HepG2에서 실험을 수행하였다. HepG2 세포를 24시간동안 증가하는 농도의 체노데옥시콜산 (CDCA) 또는 선택적 합성 FXR 리간드인 GW4064로 처리하였다. ICAM-1 발현을 CDCA 또는 GW 4064 처리에 의해 투여량 의존 방식으로 유도하였다.
도 24 a 내지 b를 참조하여, HepG2 세포를 24시간동안 증가하는 농도의 체노데옥시콜산 (CDCA)로 처리하였다. 제시된 유전자의 내인성 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 데이터를 각각의 그룹 B에 대한 평균 ± SEM으로 보고한다. 세포를 증가하는 농도의 FXR 효능제 GW 4064로 처리하는 것을 제외하고 상기와 같이 유사한 실험을 고안한다. 데이터를 각각의 그룹에 대한 평균 ± SEM으로 보고한다. C57BL/6 마우스, 도 25를 참조하여, C57BL/6 마우스를 GW 4064 (50mg/kg)의 단일 투여량으로 경구 처리하였다. 투여 후 각종 시점에서, 제시된 유전자의 간 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 데이터를 각각의 그룹에 대한 평균 ± SEM으로 보고한다.
도 26을 참조하여, HepG2 세포를 사함 FXR 및 RXRα 발현 플라스미드 및 사람 SHP의 말단 프로모터 영역 (-360 내지 +40) 또는 사람 ICAM-1 프로모터 (-1101 또는 -810 내지 +18)의 연속적 결실을 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 형질감염 시켰다. 형질감염 후, 세포를 24 또는 48시간동안 GW 4064 (1 uM)로 처리하였다. 데이터는 3개의 독립적인 형질감염의 평균 + S.D.를 나타낸다.
양성 대조군으로서, SHP mRNA의 유도 및 cyp7a의 억제를 모든 화합물에 대해확증하였다. HepG2 세포 형질감염에서, 이는 ICAM-1 프로모터 활성을 또한 GW 4064에 의해 자극하고 활성에 대한 말단 NF-κB 반응 요소를 필요로 하는 것을 나타낸다. SHP가 염증 유전자 발현에 관계된 중추 전사 인자인 NF-κB의 p65 서브유닛에 대한 보조 활성인자로서 작용함을 나타내었다. 이는 FXR 시그날링이 SHP 발현의 유도를 통한 NF-κB 매개된 염증 유전자 발현을 유도하는 증거를 제공한다.
실시예 8- 염증 유전자 발현 경로에서 FXR 및/또는 SHP를 억제하는 화합물을 확인하기 위한 일시적 형질감염
NF-κB 프로모터를 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 게놈 DNA로부터 분리한다. 수득한 PCR 생성물을 TOPO TA 클로닝 키트 (In Vitrogen사)를 사용하여 플라스미드 pCR2.1 (In Vitrogen사로부터 이용가능함, Carlsbad, California)로 TOPO 클로닝한다. 정확한 서열의 확인 후, NF-κB 프로모터를 EcoRI 분해로 제거한다. 수득한 DNA 단편의 말단에 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 뭉툭하게 한다. 이어서 단편을 pRL 없는 분해된 Sma I (Promega사로부터 이용가능함, Madison, Wisconsin)으로 연결시켜, NF-κB 프로모터에 의해 유도된 레닐라 루시페라제 리포터를 갖는 pNF-κB-RL를 제작한다. 사람 SHP 또는 FXR 암호화 영역을 유사한 표준 분자적 방법에 의해 SV40-프로모터 발현 벡터 pSI (Promega사)로 클로닝한다.
이어서 플라스미드를 HepG2 세포에 동시 형질감염 시킨다. HepG2 스톡 세포를 DMEM 높은 글루코스, 10% FBS, 페놀 레드 배지 (Invitrogen사, GIBCO Cat. 제11995-065호)에서 유지시킨다. 형질감염을 위해, 세포를 페놀 레드 없는 DMEM 높은 글루코스 배지 (Invitrogen, GIBCO Cat. 제31053-028호), 10% 숯 제거된 FBS (HyClone사, Logan, Utah, Cat. 제SH30068.03호)로 이루어진 검정 배지에서 12 웰 플레이트의 웰 당 1x105 세포로 플레이트 한다. 다음 날, 혐질감염 시약 Tfx-20 (Promega사; E2391)을 0.5㎍ pNF-κB-RL, 혈청 없는 1㎍ 이하 pSI-FXR 또는 1㎍ 이하 pSI-SHP, 페놀 레드 없는 DMEM/F12 (Invitrogen사, GIBCO Cat. 제11039-21호)를 DNA에 대한 Tfx-20의 2:1 비율에서 혼합하고, 실온에서 10분동안 항온처리 한다. 세포를 혈청 없는 DMEM/F12로 1회 세척하고 배지를 제거한다. Tfx-20/DNA 혼합물을 첨가하고 세포를 37℃에서 1시간동안 항온처리 한다. 항온처리 시간 말기에, 검정 배지를 첨가하고 세포를 추가 23 내지 48 시간동안 항온처리 한다. 검정 배지를 제거하고 세포를 PBS로 헹군다. 헹굼 용액을 제거하고 250㎕의 1×레닐라 용해 완충액 (Promega사; E2810)을 첨가한다. 플레이트를 15분동안 진동 플랫폼상에 위치시킨다. 용해물을 마이크로퓨지 튜브에 이동시키고 30초동안 원심분리에 의해 제거한다. 20㎕의 분취량을 마이크로플로어 플레이트 (ThermoLab systems사)에 이동시킨다. 100㎕의 레닐라 검정 시약을 동시에 한 웰에 주입하고 Dynex MLK 미세적정 플레이트 발광 측정기에서 30초 간격으로 판독시켰다.
시험 화합물은 SHP 활성을 억제할 수 있는지를 측정하기 위해, 시험 화합물을 검정 배지에 첨가하고 형질감염 시킨다. 루시페라제 활성을 SHP 길항제의 존재하에 증가시킨다.
상기 방법의 대안적 양태는 네오마이신, 하이그로마이신 또는 푸로마이신을 포함하는 표준 선별적 표지를 사용하여 pNF-κB-RL 및 pSI-SHP 플라스미드로 세포를 안정적으로 형질감염 시키는 것이다.
실시예 9- 염증 유전자 발현 경로에서 FXR 및/또는 SHP를 억제하는 화합물을 확인하기 위한 아데노바이러스성 감염
리포터 유전자 (예를 들면, 반딧불이 루시페라제, 레닐라 루시페라제 또는 β-갈락토시다제)의 발현을 유도하는 사람 NF-κB 프로모터의 영역을 함유하는 리포터 아데노바이러스를 ADEASY 시스템 (BbioGene사, Carlsbad, California)에서 시술된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 고안한다. NF-κB 프로모터 리포터 고안물을 우선 전이 벡터 pShuttle 또는 pQBI-AdBN으로 클로닝한다. 수득한 플라스미드를 Pme I로 선형화 시키고 이 콜라이 균주 BJ5183과 바이러스성 플라스미드인 pAdEasy-1을 함께 동시 형질감염 시킨다. 재조합체를 카나마이신으로 선별하고 PCR 또는 제한 효소 분석으로 스크린 한다.
이어서 정확한 플라스미드를 이 콜라이 균주 DH5a로 형질변형시키고 형질감염 특성 DNA를 Qiagen Maxikit와 같은 전형적인 방법에 의해 정제한다. 재조합 아데노바이러스성 고안물을 Pac I으로 분해하여 ITR (전도된 말달 반복물)을 노출시키고 QBI-293A 세포로 형질감염시켜 바이러스성 입자를 생성한다. 수득한 플라크를 표준 방법에 의해 증폭을 위해 사용한다. 염화 세슘 농도구배와 같은 방법에 의해 최종 증폭된 아데노바이러스의 정제 후, 최종 아데노바이러스 스톡을 293 세포를 사용하여 적정한다. FXR 또는 SHP를 발현하는 아데노바이러스를 pShuttle-CMV와 같은 대안적 전이 벡터를 사용할 수 있는 것을 제외하고, 유사하게 제조한다.
대안적 양태는 리포터 유전자의 발현을 유도하는 HNF-4a에 반응하는 것으로 공지된 임의의 기타 프로모터를 사용하는 것이다 [참고: Naiki et al. JBC 277: 14011, 2002, 상기 유전자의 목록에 대해 참고로 인용한다].
상기 방법의 추가의 대안적 양태는 HNF-4 및 SHP 또는 FXR 모두를 발현하기 위한 단일 아데노바이러스를 사용하는 것이다. 상기 경우에 전이 벡터 pQBI-AdCMV5-IRES-GFP를 사용한다. SHP cDNA를 CMV5 프로모터의 하류에 클로닝한다. GFP 유전자를 HNF-4a 유전자로 대체한다. 제한 단편 재조합과 같은 표준 기술 또는 더욱 바람직하게 중복 PCR에 의해 이러한 단계를 이룬다. 수득한 전이 플라스미드는 CMV 프로모터 이후 SHP cDNA에 이어서 내재 리보솜 진입 절편(IRES)에 임의로 이어서 HNF-4 cDNA를 함유한다. 기타 프로모터를 전이 플라스미드 pQBI-AdBM5-PAG에서 주요 후기 프로모터 (MLP)와 같은 CMV 프로모터 대신 사용할 수 있다. 이러한 방법은 SHP를 HNF-4를 임의로 발현하는 모든 세포에서 발현하는 것을 확실하게 한다.
또다른 대안적 양태는 리포터 유전자의 발현을 유도하는 사람 NF-κB 프로모터의 영역을 함유하는 리포터 아데노바이러스와 함께 CPF (LRH-1)을 발현하는 아데노바이러스를 사용하는 것이다.
아데노바이러스성 벡터가 완전한 경우, 이를 사람 세포, 가장 바람직하게 사람 감암 HepG2 세포를 감염시키는데 사용한다. 세포를 37℃에서 일반적으로 5시간동안 배지중의 아데노바이러스에 노출시킴으로써 감염시킨다. 리포터 플라스미드및 SHP 발현 플라스미드에 대한 적합한 감염 다중성 (MOI)을 각각의 바이러스의 각종 MOI의 동시 감염을 사용하여 매트릭스 분석에 의해 측정한다. 따라서 최종 검정에서, 세포를 x MOI에서 NF-κB 리포터 아데노바이러스 및 y MOI에서 SHP 발현 아데노바이러스에 감염시킨다. 감염 후, 세포를 비히클 또는 시험 화합물로 처리한다. 시험 화합물을 DMSO중에 일반적으로 용해시키고 약 10 M의 최종 농도에서 배양 배지에 첨가한다. 24 내지 48시간 후, 리포터 활성의 발현을 측정한다. 예를 들면, 루시페라제 활성을 LUC-SCREEN 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자 검정 시스템 (Applied Biosystems사, fostERCity, California)을 포함하는 많은 방법 또는 세포 용해 후 루시페라제 검정 시스템(Promega사)의 사용으로 모니터링 할 수 있다. 루시페라제 활성을 증가시키는 화합물은 SHP 억제제로 작용할 수 있다.
시험 화합물은 SHP 또는 FXR 억제제로서 작용하는 것을 확증하기 위해, HepG2 세포를 x MOI에서 NF-κB-리포터 아데노바이러스로 감염시킨다. 이어서 세포를 비히클 또는 시험 화합물로 처리한다. 이어서 루시페라제 활성을 상기 기술된 바와 같이 모니터링한다. SHP 억제제는 SHP가 없는 이러한 세포에서 루시페라제 활성을 변형시키지 않는다.
특이적 양태를 참조하여 상기에서 예시하고 기술하나, 그럼에도 불구하고 본 발명은 나타난 상세 설명에 제한되는 것으로 의도하지 않는다. 차라리, 발명의 본질로부터 벗어나지 않으면서 청구항의 균등물의 목적 및 범위내에서 상세하게 각종 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명은 본질 또는 필수적 특성으로부터 벗어나지 않으면서 기타 특이적 형태에서 구체화할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 양태는 모든 관점에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되고, 본 발명의 목적은 첨부된 청구항에 의해 제시된다.
Claims (67)
- 제제를 (i) 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 (ii) 파르네소이드 X 수용체(FXR)을 발현하고 NF-κB 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 포함하는 세포 배양물에 투여하는 단계; 및당해 세포 배양물내에서 검출가능한 물질의 증가를 유발하는 제제를 선별하는 단계를 포함하는, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)을 억제하는데 효과적인 제제의 동정 방법.
- 제1항에 있어서, 제제가 소형 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 재조합 SHP, 재조합 FXR 또는 이들의 배합물인 방법.
- 제2항에 있어서, 제제가 분자량이 약 50 내지 약 1500인 소형 분자인 방법.
- 제1항에 있어서, 검출가능한 물질이 반딧불이 루시페라제 유전자, β-갈락토시다제 유전자, 분비된 알칼리성 포스파타제 유전자, 레닐라 루시페라제 유전자 또는 이들의 배합물인 방법.
- 제1항에 있어서, 검출가능한 물질 유전자가 반딧불이 루시페라제 유전자인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 배양물이 변경된 세포 배양물인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 배양물이 형질감염된 세포 배양물인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 배양물이 감염된 세포 배양물인 방법.
- 제1항에 있어서, SHP, FXR 또는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 아데노바이러스, 플라스미드, 레트로바이러스 또는 이들의 배합물로부터 선택된 벡터를 이용하여 세포 배양물로 도입시키는 방법.
- 제9항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스인 방법.
- 제10항에 있어서, 아데노바이러스가 복제-결손 아데노바이러스인 방법.
- 제11항에 있어서, 복제-결손 아데노바이러스가 SV40 프로모터, CMV 프로모터, MLP 프로모터 또는 이들의 배합물을 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 복제-결손 아데노바이러스가 SV40 프로모터를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 배양물이 HELA, 사람 간모세포종 세포주(HepG2), 사람 배아 신장 293 세포주(HEK293), 랫트 FTO-2B, 랫트 McA-RH7777 또는 이들의 배합물 중 어느 하나인 방법.
- 제1항에 있어서, NF-κB 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 제조하는데 사용하기 위한 NF-κB 프로모터를 클로닝함을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, NF-κB 프로모터가 염증 유전자 세포내 부착 분자(ICAM-I) 또는 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 제제를 짧은 이종이량체 단백질(SHP)을 발현하고 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 포함하는 제2 세포 배양물에 투여하여 당해 제2 세포 배양물내에서 검출가능한 물질의 증가를 검출함을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, NF-κB 프로모터를 클로닝하고, 클로닝된 NF-κB 프로모터를 벡터내 검출가능한 물질 유전자의 앞에 삽입하여, 세포 배양물을 감염시키기 전에 염증 유전자 세포내 부착 분자(ICAM-I) 또는 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)를 포함하는 NF-κB 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 형성함을 추가로포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 후보 제제를, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 및 임의로 간세포 핵 인자 4α(HNF4α)를 발현하고 CYP7A1 또는 CYP8B1 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 포함하는 제2 세포 배양물에 투여하여, 당해 제2 세포 배양물내에서 검출가능한 물질의 증가를 검출함을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,(a) 제제를 NF-κB 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 포함하고 SHP 또는 FXR을 발현하지 않는 제2 세포 배양물에 투여하는 단계; 및(b) 당해 제제를 투여한 후에 제1 세포 배양물내에서는 검출가능한 물질의 증가를 유발하고 제2 세포 배양물내에서는 검출가능한 물질의 증가를 유발하지 않는 제제를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 선별된 제제를 피험자에게 투여함을 포함하여, 당해 피험자에서 염증 유전자 활성 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 상태를 예방하거나 개선시키는 방법.
- 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 선별된 제제를 포함하는 조성물.
- 제22항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
- 제22항에 있어서, 제제가 소형 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 재조합 SHP, 재조합 FXR 또는 이들의 배합물인 조성물.
- 제24항에 있어서, 제제가 분자량이 약 50 내지 약 1500인 소형 분자인 조성물.
- 핵 전사 인자 NF-κB 프로모터/루시페라제(luc) 유전자 리포터를 포함하는 벡터로 감염되었거나 형질감염되었거나 변경된, 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)을 발현하는 세포 배양물에 투여한 경우에 루시페라제의 증가를 유발함을 특징으로 하는 제제를 포함하는 조성물.
- 제26항에 있어서, 제제가 소형 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 재조합 SHP, 재조합 FXR 또는 이들의 배합물인 조성물.
- 제27항에 있어서, 소형 분자의 분자량이 약 50 내지 약 1500인 조성물.
- 제27항에 있어서, 소형 분자의 분자량이 약 50 내지 약 750인 조성물.
- 제27항에 있어서, 소형 분자의 분자량이 약 50 내지 약 500인 조성물.
- 제27항에 있어서, 소형 분자가 비스테로이드성 화합물인 조성물.
- 제26항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스, 플라스미드, 레트로바이러스 또는 이들의 배합물 중 어느 하나인 조성물.
- 제32항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스인 조성물.
- 제33항에 있어서, 아데노바이러스가 복제-결손 아데노바이러스인 조성물.
- 제34항에 있어서, 복제-결손 아데노바이러스가 SV40 프로모터, CMV 프로모터, MLP 프로모터 또는 이들의 배합물을 포함하는 조성물.
- 제34항에 있어서, 복제-결손 아데노바이러스가 SV40 프로모터를 포함하는 조성물.
- 제26항에 있어서, 세포 배양물이 HELA, 사람 간모세포종 세포주(HepG2), 사람 배아 신장 293 세포주(HEK293), 랫트 FTO-2B, 랫트 McA-RH7777 또는 이들의 배합물인 조성물.
- 제26항에 있어서, NF-κB 프로모터가 염증 유전자 세포내 부착 분자(ICAM-I) 또는 대식세포-콜로니 자극 인자(MCSF)를 포함하는 조성물.
- 제26항에 있어서, 제제가 염증 유전자 발현 경로에서 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)의 활성을 억제하는 조성물.
- 제26항에 있어서, 제제가 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)의 성숙 또는 미성숙 형태 또는 이를 암호화하는 유전자에 결합하며 동맥경화증에 대해 유효한 양으로 존재하는 조성물.
- 제26항에 있어서, 제제가 수용체 또는 리간드에 대해 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)의 성숙 또는 미성숙 형태와 경쟁하는 조성물.
- 제26항에 있어서, NF-κB 프로모터가 염증 유전자 세포내 부착 분자(ICAM-I) 또는 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)를 포함하는 조성물.
- NF-κB 프로모터 및 검출가능한 물질 유전자를 포함하며, 당해 NF-κB 프로모터가 당해 검출가능한 물질 유전자의 앞에 위치하는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 제43항에 있어서, NF-κB 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터가 벡터로 도입되는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 제44항에 있어서, 벡터가 복제-결손 아데노바이러스 벡터인 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 제45항에 있어서, 복제-결손 아데노바이러스 벡터가 SV40 프로모터, CMV 프로모터, MLP 프로모터 또는 이들의 배합물을 포함하는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 제45항에 있어서, 복제-결손 아데노바이러스가 SV40 프로모터를 포함하는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 제43항에 있어서, 조성물이 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR)을 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 제43항에 있어서, NF-κB 프로모터가 염증 유전자 세포내 부착 분자(ICAM-I) 또는 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)를 포함하는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 제44항에 있어서, 벡터가 숙주 세포내로 도입되는 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터.
- 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8 또는 이들의 배합물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 CYP7A1 CYP8B1 또는 SHP 프로모터.
- 제51항에 있어서, CYP8B1 프로모터가 사람 CYP8B1의 전사 개시 부위에 대해 -514번 내지 +303번 뉴클레오타이드의 CYP8B1의 단편을 포함하는 프로모터.
- 제51항에 있어서, 검출가능한 물질 유전자로 도입되어 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터를 형성하는 프로모터.
- 제53항에 있어서, 검출가능한 물질 유전자가 반딧불이 루시페라제 유전자, β-갈락토시다제 유전자, 분비된 알칼리성 포스파타제 유전자, 레닐라 루시페라제 유전자 또는 이들의 배합물인 프로모터.
- 제53항에 있어서, 검출가능한 물질 유전자가 반딧불이 루시페라제 유전자인 프로모터.
- 제53항에 있어서, 프로모터/검출가능한 물질 유전자 리포터가 벡터내로 도입되는 프로모터.
- 제56항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 SV40인 프로모터.
- 제51항에 있어서, 숙주 세포내로 도입되는 프로모터.
- 비천연적으로 탈활성화된 짧은 이종이량체 단백질(SHP) 또는 파르네소이드 X 수용체(FXR) 복합체를 포함하는 조성물.
- 제59항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
- 제60항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 저작성 정제, 속용성 정제, 발포정, 재구성가능한 산제, 엘릭서제, 액제, 용제, 현탁제, 유제, 정제, 다층 정제, 이층 정제, 캡슐제, 연질 젤라틴 캡슐제, 경질 젤라틴 캡슐제, 캡슐제, 로젠지제(lozenge), 저작성 로젠지제, 비드, 산제, 입제, 입자, 미립자, 분산가능한 입제, 샤세제, 세정제, 좌제, 크림제, 국소제, 흡입제, 에어로졸 흡입제, 팻치, 입자흡입제, 이식제, 데포우(depot) 이식제, 섭취제, 주사제, 주입액, 건강식 바, 당제, 동물 사료, 시리얼, 시리얼 피복제, 식품, 영양식품, 기능성 식품 또는 이의 배합물인 조성물.
- 제60항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 완충제, 희석제, 보조제 또는 이들의 배합물을 추가로 포함하는 조성물.
- 서열 1 내지 서열 4 중 어느 하나에 결합하는 제제를 포함하는 조성물.
- 제63항에 있어서, 제제가 서열 1 또는 서열 3 중 어느 하나에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 조성물.
- 제63항에 있어서, 제제가 서열 2 또는 서열 4 중 어느 하나에 대한 항체인 조성물.
- 상기에서 실질적으로 기술한 바와 같은 조성물.
- 상기에서 실질적으로 기술한 바와 같은 용도.
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