KR20040111636A - 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법 - Google Patents

항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법 Download PDF

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KR20040111636A KR10-2004-7018595A KR20047018595A KR20040111636A KR 20040111636 A KR20040111636 A KR 20040111636A KR 20047018595 A KR20047018595 A KR 20047018595A KR 20040111636 A KR20040111636 A KR 20040111636A
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우에노기미히사
모리기요토시
나카니시사토시
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교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명에 의하면, 축합 퓨린 유도체와, 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물 또는 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 사용한, 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합을 저해하는 물질, 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질과의 결합을 저해하는 물질, 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 발현, 효소활성을 저해하는 물질의 탐색방법이 제공된다.

Description

항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법{METHOD OF SEARCHING SUBSTANE HAVING ANTIDIABETIC ACTIVITY}
당뇨병은 인슐린의 분비 부족 또는 그 표적세포측의 감수성 저하 등에 기초한 당대사를 중심으로 한 대사이상이며, 고혈당을 초래하는 것이 큰 특징이다. 고혈당이 장기간 지속되면 혈관장애를 주요인으로 하여 망막증, 신증, 신경장애 등 각종 장기나 신경에 심각한 합병증이 생긴다. 따라서, 당뇨병의 치료에서는 혈당치를 컨트롤하여 정상치로 유지하는 것이 매우 중요하며, 이를 위한 수단이 오래전부터 연구되고 있다.
당뇨병 중 발증이 완서(緩徐)하고 생명 유지에 반드시 인슐린 치료를 필요로 하지 않는 병형 (2형 당뇨병) 에서는, 운동요법이나 식사요법과 약물의 조합에 의해 혈당치를 컨트롤하는 치료가 실시되고 있다. 약물로는 경구혈당저하제의 일종인 술포닐요소 인슐린분비 촉진제가 임상에서 널리 사용되고 있다. 또, 최근 나테글리니드나 리파글리니드와 같은 비술포닐우레아 K+ATP 채널 블로커인 인슐린분비 촉진제도 시판되고 있다.
술포닐우레아제는 췌장 β세포로부터의 인슐린분비를 촉진함으로써 혈당치를 저하시키는 2형 당뇨병의 치료약이며, 혈당저하작용의 강약이나 작용지속시간 등이 상이한 많은 종류의 술포닐우레아제가 알려져 있다 [Joslin's Diabetes Mellitus 13thEdition,29, 505-525(1994)].
그러나, 술포닐우레아제에는 공통된 부작용이나 합병증, 또는 술포닐우레아제에 대한 무효증이 인정되고 있다 [Joslin's Diabetes Mellitus 13thEdition,29, 505-525(1994)].
술포닐우레아제 사용시의 주된 합병증으로 저혈당증을 들 수 있다 [Bio. Med. J.,296, 949-950(1988), Joslin's Diabetes Mellitus 13thEdition,29, 505-525(1994)].
현재 이용가능한 술포닐우레아제나 나테글리니드나 리파글리니드와 같은 비술포닐우레아 K+ATP 채널 블로커는 모두 혈당치에 비의존적으로 인슐린분비를 촉진하기 때문에, 용량이 틀리면 중대한 저혈당을 초래하거나 또는 충분히 혈당치를 컨트롤할 수 없다는 문제가 있어 반드시 만족할 만한 것은 아니다. 과거 6개월 이내에 술포닐우레아제를 투여받은 환자의 20.2% 에 저혈당 증상이 보인다는 보고도 있다 [Acta. Med. Scand. Suppl.605, 7-48(1977), Joslin's Diabetes Mellitus 13thEdition,29, 505-525(1994)]. 또, 상기 환자의 약 6% 는 저혈당 증상을 매월 경험하고 있다.
상기 이유로부터 술포닐우레아제나 나테글리니드나 리파글리니드와 같은 비술포닐우레아 K+ATP 채널 블로커와는 달리 저혈당 등의 합병증을 일으키지 않는 당뇨병치료제의 개발이 요망되고 있다.
상기 비술포닐우레아 K+ATP 채널 블로커와는 다른 구조를 갖는 축합 퓨린 유도체나 축환 피라딘 유도체 등이 혈당치에 대하여 인슐린분비를 촉진할 수 있는 혈당저하제가 될 수 있다고 보고되어 있다 (WO00/01388, WO01/47931, 일본 공개특허공보 2000-154139호). 그러나, 혈당치에 따라 인슐린분비를 촉진할 수 있는 혈당저하제를 효율적으로 발견하는 방법은 알려져 있지 않다.
축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물이 특이적으로 결합하는 것 및 그 결합 활성과 축합 퓨린 유도체의 혈당저하작용 사이의 관계에 대해서는 알려져 있지 않다.
서열번호 1∼3 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질 (이하, p31 이라고도 함) 은 모두 NADPH 의존적인 레티놀이나 단쇄알코올의 산화환원효소활성을 갖는 효소로서 알려져 있지만 {Biochimica et Biophysica Acta,1338, 47(1997)], 그 효소와 당뇨병의 관련에 관한 보고는 없다.
트리아진 유도체는 키나제 저해작용을 가지며, 당뇨병의 치료에 사용할 수 있다고 알려져 있지만 (WO01/47921), 구체적으로 당뇨병치료 작용을 갖는다고는 나타나 있지 않다. 또, 트리아진 유도체가 인슐린분비 작용을 갖는 것도 알려져 있지 않다.
본 발명은 당뇨병 치료제 및 인슐린분비 촉진제의 탐색방법에 관한 것이다.
도 1 의 A 는 췌장 β세포를 사용했을 때의3H 로 표지된 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물의 결합포화곡선을 나타내는 도면이다. 도면 중, ○-○는 총결합량, ○---○는 비특이적 결합량, ●-●는 특이적 결합량을 나타낸다.
도 1 의 B 는 상기 A 의 개략도이다.
도 2 는 췌장 β세포를 사용했을 때의3H 로 표지된 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물의 특이적 결합에 대한 축합 퓨린 유도체의 저해 작용과 인슐린분비 촉진 작용의 상관관계를 나타내는 도면이다.
도 3 의 A 는, 췌장 β세포 막획분을 사용했을 때의3H 로 표지된 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물의 결합포화곡선을 나타내는 도면이다. 도면 중 ▲---▲는 총결합량, ○---○는 비특이적 결합량, ●-●는 특이적 결합량을 나타낸다.
도 3 의 B 는 상기 A 의 개략도이다.
도 4 는 췌장 β세포 막획분을 사용했을 때의3H 로 표지된 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물의 특이적 결합에 대한 축합 퓨린 유도체의 저해 작용과 인슐린분비 촉진 작용의 상관관계를 나타내는 도면이다. 그래프의 플롯에 붙은 숫자는 화합물번호를 나타낸다. 화합물번호 중 95* 는 화합물 95 의 타르타르산염을 나타낸다.
도 5 는 췌장 β세포의 가용화막 획분을 사용했을 때의3H 로 표지된 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물의 결합을 나타내는 도면이다.
도 6 은 재조합 His-p31 을 9% 아크릴아미드겔을 사용하여 SDS-PAGE 를 실행한 결과를 나타내는 도면이다. 레인 1 은 정제된 재조합 His-p31, 레인 M 은 분자량 마커를 전기영동한 레인이다. 화살표는 재조합 His-p31 단백질의 위치를 나타낸다.
도 7 은 각 화합물의 BIAcore 를 사용하여 산출된 His-p31 단백질과 화합물번호 155 로 나타내는 화합물 (이하, 화합물 155 라고 함) 과의 결합저해활성과 인슐린분비 촉진 활성과의 상관관계를 나타내는 도면이다. 그래프의 플롯에 붙인 숫자는 화합물번호를 나타낸다.
도 8 은 MIN6 세포의 세포추출액과 축합 퓨린 유도체 고정화 입자를 사용한 인슐린분비 촉진제의 탐색을 나타내는 도면이다. 9% 아크릴아미드겔에 의한SDS-PAGE 를 나타낸다. 레인 1 은 화합물 155 를 고정화하지 않은 입자를 사용하여 MIN6 세포추출액으로부터 정제된 단백질, 레인 2 는 화합물 155 고정화 입자를 사용하여 MIN6 세포추출액으로부터 정제된 p31 단백질, 레인 3 은 화합물 155 고정화 입자를 사용하여, 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물로 전처리한 MIN6 세포추출액으로부터 정제된 단백질, 레인 4 는 화합물 155 고정화 입자에 의해 화합물번호 17 로 나타내는 화합물로 전처리한 MIN6 세포추출액으로부터 정제된 단백질, 레인 M 은 분자량 마커를 전기영동한 레인이다. 화살표는 p31 단백질의 위치를 나타낸다.
발명의 개시
본 발명의 목적은, 저혈당증 등의 합병증을 일으키지 않는 당뇨병 치료약, 및 인슐린분비 촉진제의 탐색방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 축합 퓨린 유도체의 인슐린분비 촉진 활성과 축합 퓨린 유도체와 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질과의 결합 활성이 서로 관계가 있다는 것을 알아내어 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)∼(24) 에 관한 것이다.
(1) [1] 피검물질 존재 하, 하기의 일반식 (Ⅰ)
(식 중 R1A는 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, R2A는 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아르알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, R3A는 수소원자, 저급 알킬기 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬기를 나타내고, X1및 X2는 각각 독립하여 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아르알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 아릴기를 나타내고, n은 0∼3 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 화합물, 또는 하기의 일반식 (Ⅱ)
{식 중 X…Y…Z 는 R1N-C=0 (식 중 R1은 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타낸다) 또는 N=C-W [식 중 W 는 할로겐, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, -NR4R5(식 중 R4및 R5는 동일하거나 상이하며 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬을 나타내거나, R4와 R5가 인접하는 질소원자와 일체가 되어 복소환기를 형성한다), -OR6(식 중 R6은 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬을 나타낸다), -SR6a(식 중 R6a는 상기 R6과 동일한 의미이다), 치환 또는 비치환의 저급 알킬 또는 시아노를 나타낸다] 를 나타내고, R2는 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기 R4및 R5와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 할로겐을 나타낸다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기 R4및 R5와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내고, R3은 수소원자, 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 저급 알콕시알킬을 나타내고, n 은 0∼3 의 정수를 나타내고, V1은 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, V2는 치환 저급 알킬 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, V1이 수소원자, 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타내고, 또한 (a) X…Y…Z 가 R1aN-C=0 (식 중 R1a는 상기 R1의 정의 중 치환 저급 알킬 이외의 기를 나타낸다) 를 나타내고, R2가 치환 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 상기와 동일한 의미이다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내거나, (b) X…Y…Z 가 R1N-C=0 (식 중 R1은 상기와 동일한 의미이다) 을 나타내고, R3이 저급 알콕시알킬을 나타내거나, (c) X…Y…Z 가 R1bN-C=0 (식 중 R1b는 치환 저급 알킬을 나타낸다) 를 나타내거나, (d) X…Y…Z 가 N=C-W (식 중 W 는 상기와 동일한 의미이다) 를 나타내고, R2가 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 상기와 동일한 의미이다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내거나, (e) X…Y…Z 가 N=C-W (식 중 W 는 상기와 동일한 의미이다) 를 나타내고, R3이 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 저급 알콕시알킬을 나타내는 경우, V2는 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타낼 수 있다} 로 나타내는 화합물에서 선택되는 화합물 (이하, 축합 퓨린 유도체로 약칭함) 과 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정, [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법.
(2) [1] 피검물질 존재 하, 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체와 그 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정, [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법.
(3) [1] 피검물질 존재 하, 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정, [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정, [5] [4] 의 공정에서 얻어지는 물질로부터 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질에 결합하는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 그축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질에 결합하는 물질의 탐색방법.
(4) [1] 피검물질 존재 하, 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체와 그 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정, [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질에 결합하는 물질의 탐색방법.
(5) [1] 피검물질과 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정, [2] 피검물질을 접촉시키지 않은 경우에서의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 단백질의 활성을 변화시키는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 활성을 변화시키는 물질의 탐색방법.
(6) [1] 피검물질과 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정, [2] 피검물질을 접촉시키지 않은 경우에서의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 단백질의 활성을 억제하는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 활성을 억제하는 물질의 탐색방법.
(7) [1] 피검물질과 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 세포응답을 측정하는 공정, [2] 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 세포응답을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 형질전환주의 세포응답을 변화시키는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 기능을 변화시키는 물질의 탐색방법.
(8) [1] 피검물질과 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 측정하는 공정, [2] 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질의 탐색방법.
(9) [1] 피검물질과 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 그 단백질의 발현량을 측정하는 공정, [2] 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 그 단백질의 발현량을 측정하는 공정, [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정, [4] 피검물질로부터 그 단백질의 발현량을 변화시키는 물질을 선택하는공정, 을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 발현량을 변화시키는 물질의 탐색방법.
(10) 축합 퓨린 유도체가 하기 식 (Ⅲ)
으로 나타내는 화합물인 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 탐색방법.
(11) 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체를 고정화한 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (2) 및 (4)∼(9) 중 어느 하나의 탐색방법.
(12) 담체가 세파로오스 입자인 상기 (11) 의 탐색방법.
(13) 축합 퓨린 유도체가 하기 식 (Ⅳ)
로 나타내는 화합물인 상기 (11) 또는 (12) 의 탐색방법.
(14) 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체를 고정화한 담체.
(15) 축합 퓨린 유도체가 상기 (13) 의 식 (Ⅳ) 로 나타내는 축합 퓨린 유도체인 상기 (14) 의 담체.
(16) 담체가 세파로오스 입자인 상기 (14) 또는 (15) 의 담체.
(17) 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질이 하기 [ⅰ]∼[ⅲ] 에서 선택되는 어느 하나의 단백질인 상기 (2) 및 (4)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 탐색방법.
[ⅰ] 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질
[ⅱ] 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질
[ⅲ] 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 (1) 의 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질
(18) 상기 (1)∼(13) 및 (17) 중 어느 하나의 탐색방법으로 얻어지는 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염.
(19) 상기 (18) 의 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 의약.
(20) 상기 (18) 의 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 당뇨병 치료제.
(21) 상기 (18) 의 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 인슐린분비 촉진제.
(22) 하기의 일반식 (Ⅴ)
[식 중 R1B, R2B및 R3B는 동일하거나 상이하며, 아미노기, 모노 또는 디치환 아미노기, 또는 N 을 함유하는 치환 또는 비치환의 복소환기 (그 복소환기는 N 원자로 트리아진 고리에 결합한다) 를 나타낸다] 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 인슐린분비 촉진제.
(23) 상기 (22) 의 일반식 (Ⅴ) 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 인슐린분비의 촉진방법.
(24) 인슐린분비 촉진제의 제조를 위한 상기 (22) 의 일반식 (Ⅴ) 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 용도.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
1. 본 발명의 탐색방법에 사용되는 축합 퓨린 유도체
본 발명의 탐색방법에 사용되는 축합 퓨린 유도체는, 하기의 일반식 (Ⅰ)
(식 중 R1A는 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, R2A는 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아르알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, R3A는 수소원자, 저급 알킬기 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬기를 나타내고, X1및 X2는 독립하여 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아르알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 아릴기를 나타내고, n 은 0∼3 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 화합물, 또는 하기의 일반식 (Ⅱ)
{식 중 X…Y…Z 는 R1N-C=0 (식 중 R1은 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타낸다) 또는 N=C-W [식 중 W 는 할로겐, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, -NR4R5(식 중 R4및 R5는 동일하거나 다르며 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬을 나타내거나, R4와 R5가 인접하는 질소원자와 일체가 되어 복소환기를 형성한다), -0R6(식 중 R6은 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬을 나타낸다), -SR6a(식 중 R6a는 상기 R6과 동일한 의미이다), 치환 또는 비치환의 저급 알킬 또는 시아노를 나타낸다] 를 나타내고, R2는 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기 R4및 R5와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 할로겐을 나타낸다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기 R4및 R5와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내고, R3은 수소원자, 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 저급 알콕시알킬을 나타내고, n 은 0∼3 의 정수를 나타내고, V1은 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, V2는 치환 저급 알킬 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, V1이 수소원자, 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타내고, 또한 (a) X…Y…Z 가R1aN-C=0 (식 중 R1a는 상기 R1의 정의 중 치환 저급 알킬 이외의 기를 나타낸다) 를 나타내고, R2가 치환 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 상기와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 상기와 동일한 의미이다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내거나, (b) X…Y…Z 가 R1N-C=0 (식 중 R1은 상기와 동일한 의미이다) 를 나타내고, R3이 저급 알콕시알킬을 나타내거나, (c) X…Y…Z 가 R1bN-C=0 (식 중 R1b는 치환 저급 알킬을 나타낸다) 를 나타내거나, (d) X…Y…Z 가 N=C-W (식 중 W 는 상기와 동일한 의미이다) 를 나타내고, R2가 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 알릴, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 상기와 동일한 의미이다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내거나, (e) X…Y…Z 가 N=C-W (식 중 W 는 상기와 동일한 의미이다) 를 나타내고, R3이 저급 알킬, 치환또는 비치환의 아르알킬 또는 저급 알콕시알킬을 나타내는 경우, V2는 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타낼 수 있다} 로 나타내는 화합물에서 선택되는 화합물 (이하, 축합 퓨린 유도체로 약칭함) 이다.
식 (Ⅰ) 의 각 기의 정의에 있어서, 저급 알킬기 또는 저급 알킬 부분을 포함하는 치환기 (예를 들어 아르알킬기) 의 저급 알킬 부분으로는 탄소원자수 1개∼9개 정도의 알킬기를 사용할 수 있고, 알킬기라는 용어에는 직쇄상, 분지쇄상, 고리형 및 이들의 조합으로 이루어지는 알킬기가 포함된다.
고리형 알킬기 또는 알킬기 중의 고리형 알킬 부분은 1 또는 2개 이상의 고리를 갖고 있을 수 있다. R1A가 나타내는 저급 알킬기로는, 직쇄 또는 분지쇄상의 저급 알킬기 또는 1∼3환성(環性)의 고리형 저급 알킬기 (예를 들어 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 3-노르아다만틸기 등) 이 바람직하고, R2A가 나타내는 저급 알킬기로는 직쇄 또는 분지쇄상의 저급 알킬기 또는 단환성의 고리형 저급 알킬기가 바람직하다.
직쇄상 또는 분지쇄상의 저급 알킬기로는, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 네오펜틸기, n-헥실기, n-헵틸기, n-옥틸기 또는 n-노닐기 등을 들 수 있다. 고리형 저급 알킬기로는, 예를 들어 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기, 노르아다만틸기, 아다만틸기 등을 들 수 있다. 이들 중 tert-부틸기 또는 시클로펜틸기가 바람직하다.
아릴기 또는 아릴 부분을 포함하는 치환기 (아르알킬기 등) 에서의 아릴 부분으로는, 단환성 또는 2 이상의 축합환으로 이루어지는 방향족기를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 고리구성 탄소원자수가 6∼14개 정도인 아릴기가 바람직하고, 예를 들어 페닐기, 나프틸기, 인데닐기 또는 안트라닐기 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 아르알킬기로는, 예를 들어 탄소수 7∼15개의 아르알킬기를 사용할 수 있고, 보다 구체적으로는 예를 들어 벤질기, 페네틸기, 벤즈히드릴기, 나프틸메틸기 등을 사용할 수 있다.
방향족 복소환기로는, 단환성 또는 2 이상의 축합환으로 이루어지는 방향족 복소환기를 사용할 수 있다. 방향족 복소환기에 포함되는 헤테로원자의 종류 및 개수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 질소원자, 황원자 및 산소원자로 이루어지는 군에서 선택되는 헤테로원자를 1개 또는 2개 이상 함유하고 있을 수 있다. 보다 구체적으로는, 환구성 원자수가 6 내지 14개 정도인 방향족 복소환기가 바람직하고, 예를 들어 푸릴기, 티에닐기, 피롤릴기, 이미다졸릴기, 피라졸릴기, 트리아졸릴기, 테트라졸릴기, 옥사졸릴기, 티아졸릴기, 피리딜기, 피라디닐기, 피리미디닐기, 피리다지닐기, 트리아지닐기, 인돌릴기, 인다졸릴기, 벤조이미다졸릴기, 벤조옥사졸릴기, 벤조티아졸릴기, 퀴놀릴기, 이소퀴놀릴기, 프탈라지닐기, 나프틸리디닐기, 퀴녹살리닐기, 퀴나졸리닐기, 신놀리닐기 또는 푸리닐기 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
아릴환 또는 방향족 복소환에 치환기가 존재하는 경우에는 그 치환기의 종류 및 개수는 특별히 한정되지 않으며, 2개 이상의 치환기가 존재하는 경우에는 그들은 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들어, 환 위에 1개∼3개 정도의 치환기를 갖고 있을 수 있다. 아릴환 위 또는 방향족 복소환 위의 치환기로는, 예를 들어 치환 또는 비치환의 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 저급 알케닐기, 치환 또는 비치환의 저급 알키닐기, 치환 또는 비치환의 아르알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 히드록실기, 치환 또는 비치환의 저급 알콕시기, 치환 또는 비치환의 아르알킬옥시기, 치환 또는 비치환의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환의 아로일기, 저급 알콕시카르보닐기, 치환 또는 비치환의 저급 알킬티오기, 치환 또는 비치환의 저급 알킬술포닐기, 카르복실기, 치환 또는 비치환의 카르바모일기, 치환 또는 비치환의 저급 알카노일기, 할로겐원자 (본 명세서에서 할로겐원자라 하는 경우에는 불소원자, 염소원자, 브롬원자, 또는 요오드원자 어느 것이든 좋다), 니트로기, 아미노기, 모노 또는 디저급 알킬 치환 아미노기, 시아노기 등을 들 수 있다.
상기 관능기에 있어서, 저급 알킬기 또는 저급 알킬 부분을 포함하는 관능기 (예를 들어 아르알킬기, 저급 알콕시기, 아르알킬옥시기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알킬티오기, 저급 알킬술포닐기, 저급 알카노일기, 모노 또는 디저급 알킬 치환 아미노기 등) 의 저급 알킬 부분으로는 상기에 설명한 것을 사용할 수 있다. 저급 알킬기 또는 저급 알킬 부분이 치환기를 갖는 경우, 치환기의 개수 및 종류는 특별히 한정되지 않고, 2개 이상의 치환기를 갖는 경우에는 그들은 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들어, 1개∼3개 정도의 치환기를 갖고 있을 수 있다. 이러한 치환기로는, 예를 들어 히드록실기, 할로겐원자, 카르복실기, 술포기, 포스포노기, 이들의 산성기로부터 유도되는 에스테르기 (저급 알킬에스테르, 아르알킬에스테르, 아릴에스테르 등) 등을 들 수 있다. 치환기를 갖는 알킬기의 예로서 보다 구체적으로는, 히드록시에틸기, 트리플루오로메틸기 등을 들 수 있다. 디저급 알킬 치환 아미노기에 있어서 2개의 알킬기는 동일하거나 다를 수 있다.
또, 상기 관능기에 있어서, 아르알킬기 또는 아르알킬옥시기의 아르알킬 부분은 상기 아르알킬기와 동일한 의미이고, 아릴기, 아릴옥시기 또는 아로일기의 아릴 부분은 상기 아릴기와 동일한 의미이다. 저급 알케닐기로는 직쇄 또는 분기쇄상의 탄소수 2∼6 의 알케닐기를 사용할 수 있다. 예를 들어, 피닐기, 아릴기, 1-프로페닐기, 메타크릴기, 부테닐기, 크로틸기, 펜테닐기, 헥세닐기 등을 사용할 수 있다. 저급 알키닐기로는, 직쇄 또는 분지쇄상의 탄소수 2∼6 의 알키닐기를 사용할 수 있다. 예를 들어, 에티닐기, 프로피닐, 부티닐기, 펜티닐기, 헥시닐기 등을 사용할 수 있다. 저급 알케닐기 또는 알키닐기에서의 불포화 결합의 개수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개이다.
상기 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 아르알킬기, 아릴기, 아르알킬옥시기, 아릴옥시기, 아로일기가 치환기를 갖는 경우, 치환기의 개수, 종류 또는 치환 위치는 특별히 한정되지 않고, 2개 이상의 치환기를 갖는 경우에는 그들은 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들어 1∼3개 정도의 치환기를 갖고 있을 수 있다. 치환기로는 저급 알킬기에 대한 치환기로서 예시한 것을 사용할 수 있다.
또, 상기 일반식 (Ⅰ) 에 있어서, X1또는 X2의 치환 위치는 특별히 한정되지 않고, 각각 환 위의 임의의 위치에 치환 가능하다. 또한, X1또는 X2가 수소원자 이외의 치환기인 경우, 그들이 결합하는 탄소원자의 입체배치는 S 또는 R 모두 가능하다. n 은 0 인 것이 바람직하다.
식 (Ⅱ) 의 각 기의 정의에 있어서, 저급 알킬, 저급 알킬티오, 저급 알콕시카르보닐 및 저급 알콕시알킬의 저급 알킬 부분으로는, 탄소원자수 1∼10개 정도의 직쇄상, 분지쇄상, 고리형 및 이들의 조합으로 이루어지는 알킬이 포함된다. 고리형의 저급 알킬은 1 또는 2개 이상의 환을 갖고 있을 수 있다. 직쇄상 또는 분지쇄상의 저급 알킬로는, 예를 들어 메틸, 에틸,n-프로필, 이소프로필,n-부틸, 이소부틸,sec-부틸,tert-부틸,n-펜틸, 네오펜틸,n-헥실,n-헵틸,n-옥틸,n-노닐,n-데실 등을 들 수 있다. 고리형의 저급 알킬로는, 예를 들어 시클로프로필, 시클로프로필메틸, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 1-메틸시클로헥실, 4-메틸시클로헥실, 노르아다만틸, 아다만틸, 비시클로[2.2.1]헵틸, 비시클로[2.2.2]옥틸, 비시클로[3.3.0]옥틸, 비시클로[3.3.1]노닐 등을 들 수 있다.
저급 알콕시알킬 및 아르알킬의 알킬렌 부분은, 상기 직쇄상 또는 분지쇄상 저급 알킬로부터 수소원자를 하나 제거한 것과 동일한 의미이다.
아릴 및 아르알킬의 아릴 부분은 단환성 또는 2개 이상의 축합환으로 이루어지고, 환 구성 탄소원자수가 6∼14개 정도인, 예를 들어 페닐, 나프틸, 인데닐, 안트라닐 등을 들 수 있다.
방향족 복소환기로는, 예를 들어 질소원자, 산소원자 및 황원자에서 선택되는 적어도 1개의 원자를 포함하는 5원 또는 6원의 단환성 방향족 복소환기, 3∼8원의 고리가 축합한 2환 또는 3환성으로 질소원자, 산소원자 및 황원자에서 선택되는 적어도 1개의 원자를 포함하는 축환성 방향족 복소환기 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 환구성 원자수가 5∼14개 정도인, 예를 들어 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 피리딜, 피라디닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 인돌릴, 인다졸릴, 벤조이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 프탈라지닐, 나프틸리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 푸리닐 등을 들 수 있다.
지환식 복소환기로는, 예를 들어 질소원자, 산소원자 및 황원자에서 선택되는 적어도 1개의 원자를 포함하는 5원 또는 6원의 단환성 지환식 복소환기, 3∼8원의 환이 축합한 2환 또는 3환성으로 질소원자, 산소원자 및 황원자로부터 선택되는 적어도 1개의 원자를 포함하는 축환성 지환식 복소환기 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 피롤리디닐, 2, 5-디옥소피롤리디닐, 티아졸리디닐, 옥사졸리디닐, 2-옥소옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로푸릴, 테트라히드로퀴놀릴, 테트라히드로이소퀴놀릴, 테트라히드로퀴녹살리닐, 옥타히드로퀴놀릴, 디히드로인돌릴, 1, 3-디옥소이소인돌리닐, 1, 3-디옥소라닐, 1, 3-디옥소란-2-스피로시클로펜틸 등을 들 수 있다.
인접하는 질소원자와 일체가 되어 형성되는 복소환기로는, 예를 들어 적어도 1개의 질소원자를 포함하는 5원 또는 6원의 단환성 복소환기 (그 단환성 복소환기는 다른 질소원자, 산소원자 또는 황원자를 포함하고 있을 수 있다), 3∼8원의 환이 축합한 2환 또는 3환성으로 적어도 1개의 질소원자를 포함하는 축환성 복소환기 (그 축합성 복소환기는 다른 질소원자, 산소원자 또는 황원자를 포함하고 있을 수 있다) 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 피롤리디닐, 티아졸리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디노, 호모피페리디노, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 테트라히드로퀴놀릴, 테트라히드로이소퀴놀릴, 옥타히드록퀴놀릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 푸리닐, 디히드로인돌릴, 피롤릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이미다졸릴 등을 들 수 있다.
할로겐으로는, 불소, 염소, 브롬, 요오드의 각 원자를 들 수 있다.
치환 아릴, 치환 아르알킬, 치환 방향족 복소환기 및 치환 지환식 복소환기의 치환기로는, 동일하거나 다르며, 치환수 1∼3 의 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 치환 또는 비치환의 아릴옥시, 치환 또는 비치환의 아로일, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬옥시, 치환 또는 비치환의 저급 알케닐, 치환 또는 비치환의 저급 알키닐, 치환 또는 비치환의 저급 알콕시, 치환 또는 비치환의 저급 알콕시카르보닐, 치환 또는 비치환의 저급 알킬티오, 치환 또는 비치환의 저급 알킬술포닐, 치환 또는 비치환의 저급 알카노일, 모노 또는 디저급 알킬 치환 카르바모일, 모노 또는 디저급 알킬 치환 아미노, 할로겐, 카르복시, 히드록시, 니트로, 아미노, 시아노 등을 들 수 있다. 여기에서, 저급 알케닐로는 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소원자수 2∼6 인, 예를 들어 비닐, 알릴, 1-프로페닐, 메타크릴, 부테닐, 크로틸, 펜테닐, 헥세닐 등을 들 수 있고, 저급 알키닐로는 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소원자수 2∼6 인, 예를 들어 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐 등을 들 수 있다. 저급 알케닐 및 저급 알키닐에서의 불포화 결합의 개수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개이다. 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐, 저급 알킬티오, 저급 알킬술포닐, 저급 알카노일, 모노 또는 디저급 알킬 치환 카르바모일 및 모노 또는 디저급 알킬 치환 아미노의 저급 알킬 부분은 상기 저급 알킬과 동일한 의미이다. 아르알킬 및 아르알킬옥시의 알킬렌 부분은 상기 알킬렌 부분과 동일한 의미이다. 아릴, 아릴옥시 및 아로일의 아릴 부분은 상기 아릴과 동일한 의미이다. 할로겐은 상기 할로겐과 동일한 의미이다. 치환 저급 알킬, 치환 아릴, 치환 아릴옥시, 치환 아로일, 치환 아르알킬, 치환 아르알킬옥시, 치환 저급 알케닐, 치환 저급 알키닐, 치환 저급 알콕시, 치환 저급 알콕시카르보닐, 치환 저급 알킬티오, 치환 저급 알킬술포닐 및 치환 저급 알카노일의 치환기로는 동일하거나 다르며 치환수 1∼3 의 히드록시, 상기와 동일한 의미인 할로겐, 카르복시, 술포, 포스포노, 이들의 산성기로부터 유도되는 에스테르 (저급 알킬에스테르, 아르알킬에스테르, 아릴에스테르 등 ; 이들 에스테르의 저급 알킬 부분, 아르알킬 부분 및 아릴 부분은 각각 상기와 동일한 의미이다) 등을 들 수 있다. 디저급 알킬 치환 카르바모일 및 디저급 알킬 치환 아미노에 있어서 각각 카르바모일 및 아미노에 결합하는 2개의 저급 알킬은 동일하거나 다를 수 있다.
치환 저급 알킬의 치환기로는, 동일하거나 다르며 치환수 1∼3 의 저급 알콕시, 히드록시, 시아노, 아지드, 카르복시, 포스포노 또는 이들의 산성기로부터 유도되는 에스테르 (저급 알킬에스테르, 아르알킬에스테르, 아릴에스테르 등 ; 이들에스테르의 저급 알킬 부분, 아르알킬 부분 및 아릴 부분은 각각 상기와 동일한 의미이다), 저급 알킬티오, 저급 알킬아미노카르보닐, 저급 알콕시카르보닐, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, -NR11R12(식 중 R11및 R12는 동일하거나 다르며 수소원자, 저급 알킬, 저급 알카노일, 아릴, 아르알킬 또는 아르알킬옥시를 나타내거나, R11과 R12가 인접하는 질소원자와 일체가 되어 복소환기를 형성한다), 할로겐, 저급 알킬로 치환되어 있을 수 있는 아릴술포닐옥시, 저급 알킬술포닐, 저급 알킬술포닐옥시, 트리플루오로메탄술포닐옥시 등을 들 수 있다.
여기서, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오, 저급 알킬아미노카르보닐, 저급 알콕시카르보닐, 저급 알카노일, 저급 알킬로 치환되어 있을 수 있는 아릴술포닐옥시, 저급 알킬술포닐 및 저급 알킬술포닐옥시의 저급 알킬 부분은 상기 저급 알킬과 동일한 의미이다. 아릴, 아르알킬, 아르알킬옥시 및 아릴술포닐옥시의 아릴 부분은 상기 아릴과 동일한 의미이다. 아르알킬의 알킬렌 부분은 상기 알킬렌 부분과 동일한 의미이다. 할로겐, 방향족 복소환기, 지환식 복소환기 및 인접하는 질소원자와 일체가 되어 형성되는 복소환기는 상기와 동일한 의미이다. 치환 방향족 복소환기 및 치환 지환식 복소환기의 치환기는 상기와 동일한 의미이다.
또한 식 (Ⅱ) 에 있어서, V1또는 V2의 치환 위치는 특별히 한정되지 않고,환 위의 임의의 위치에 치환 가능하다. 또한, V1또는 V2가 수소원자 이외의 치환기인 경우, 그들이 결합하는 탄소원자의 입체배치는 S 또는 R 모두 가능하다. n 은 0 인 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 화합물로서, 바람직하게는 식 (Ⅰ) 중 R1이 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기이고, R2가 저급 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 아릴기이고, R3이 수소원자, 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬기이고, X1이 수소원자, 저급 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬기이고, X2가 수소원자이고, n 이 0 인 화합물, 또는 식 (Ⅱ) 중 X…Y…Z 가 R1N-C=0 (식 중 R1은 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타낸다) 이고, R2가 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기이고, R3이 수소원자, 또는 저급 알킬이고, V1이 수소원자이고, V2가 치환 저급 알킬이고, n 이 0 인 화합물이고, 더욱 바람직하게는 식 (Ⅰ) 중 R1이 수소원자, n-프로필기, 시클로펜틸기 또는 tert-부틸기이고, R2가 n-프로필기, 에틸기, 또는 벤질기이고, R3이 수소원자, 메틸기, 또는 벤질기이고, X1이수소원자, 저급 알킬기 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬기이고, X2가 수소원자이고, n 이 0 인 화합물, 또는 식 (Ⅱ) 중 X…Y…Z 가 R1N-C=0 (식 중 R1은 에틸기, n-프로필기, 시클로프로필메틸기, 또는 벤질기를 나타낸다) 이고, R2가 n-프로필기, 시클로부틸기, 또는 시클로펜틸기이고, R3이 수소원자이고, V1이 수소원자이고, V2가 피코릴기이고, n 이 0 인 화합물을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 보다 바람직한 축합 퓨린 유도체로는, 구체적으로는 하기 표 1 의 화합물을 들 수 있다.
더욱 바람직한 화합물로는, 하기 식 (Ⅲ)
로 나타내는 상기 표 1 중의 화합물 번호 16 으로 나타내는 화합물 (이하, 화합물 16 이라고도 함) 을 들 수 있다.
2. 본 발명의 탐색방법에 사용되는 축합 퓨린 유도체의 제조방법
상기 식 (Ⅰ) 로 나타내는 화합물의 대표적 화합물의 제조방법은 WO98/15555 에 구체적으로 기재되어 있고, 또한 일본 공개특허공보 평3-204880호, WO00/01388, J. Med. Chem.,35, 3578(1992), J. Med. Chem.,36, 2508(1993), J. Heteocyclic Chem.,30, 241(1993) 등에도 설명되어 있다.
상기 식 (Ⅱ) 로 나타내는 화합물의 대표적 화합물의 제조방법은, WO01/47931 등에 구체적으로 기재되어 있다.
또한, 원료화합물 및 중간체화합물에서의 각 관능기의 변환 및 치환기에 함유되는 관능기의 변환은, 상기 문헌에 기재된 방법 외에도 공지의 다른 방법 [예를 들어, Comprehensive Organic Transformations, second edition, R.C.Larock, John Wiley & Sons Inc. (1999) 에 기재된 방법 등] 에 의해서도 실시할 수 있다.
상기의 방법 등을 적절히 조합하고, 또한 필요에 따라 이들 방법에 수식 및 개변을 가함으로써, 상기 식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ) 에 포함되는 모든 화합물을 제조할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서 얻어지는 중간체화합물 및 목적화합물은, 유기합성화학에서 상용되는 정제방법, 예를 들어 중화, 여과, 추출, 세정, 건조, 농축, 재결정, 각종 크로마토그래피 등의 수단에 의해 단리ㆍ정제할 수 있다. 또한, 중간체화합물은 특별히 정제하지 않고 후속 반응에 제공하는 것도 가능하다.
식 (Ⅰ) 및 식 (Ⅱ) 로 나타내는 화합물의 염을 제조하는 경우에는, 유리형태의 화합물을 적당한 용매에 용해 또는 현탁시킨 후, 적절한 산 또는 염기를 가하여 염을 형성시키고, 필요에 따라 분리ㆍ정제하면 된다. 염의 형태로 얻어진 목적물질을 유리형태로 변환한 후, 원하는 염으로 변환하는 것도 가능하다.
3. 축합 퓨린 유도체 및 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 사용한 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법
① 피검물질 존재하, 상기 1. 에 기재된 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량과, ② 피검물질 부재하, 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하고, ③ 피검물질 존재하와 피검물질 부재하에서의 그 측정치를 비교하여, ④ 피검물질로부터 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합을 저해하는 물질을 선택함으로써 항당뇨병 작용을 갖는 물질을 선택할 수 있다.
[1] 표지화 축합 퓨린 유도체의 제조방법
상기 탐색방법에는 상기 1 의 축합 퓨린 유도체를 그대로 사용할 수도 있지만, 표지된 그 축합 퓨린 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.
표지된 그 화합물로는, 예를 들어3H,125I,13C 등에 의한 방사표지, FITC (플루오레세인이소티오시아네이트) 등에 의한 형광표지, 바이오틴표지된 그 축합 퓨린 유도체 등을 들 수 있지만, 바람직하게는3H 에 의해 방사표지된 그 축합 퓨린 유도체를 들 수 있다.
상기 1 의 축합 퓨린 유도체는 주지의 방법에 준하여 표지할 수 있고, 예를 들어 방사표지하는 경우는, 상기 2 의 본 발명의 탐색방법에 사용하는 축합 퓨린 유도체를 합성할 때에 시판되고 있는 방사표지된 원료를 사용하는 방법, 예를 들어 관능기에 할로겐기를 갖는 축합 퓨린 유도체와 방사성 동위원소를 갖는 수소를 직접 접촉반응시킴으로써, 상기 1 의 축합 퓨린 유도체에 그 방사성 원소를 도입하는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 상기 탐색방법에 화합물 16 의 표지체를 사용하는 경우, 표 1 중의 화합물 번호 23 으로 나타내는 화합물의 R 체를 팔라듐 존재하,3H 가스분위기에서 접촉수소화함으로써 화합물 16 의3H 표지체를 얻을 수 있다.
[2] 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물의 조제방법
본 발명의 탐색방법에 사용되는 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물은 모든 동물 유래의 세포 또는 그 세포의 처리물을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 래트, 마우스, 개, 인간 등 유래의 그 세포 또는 그 세포의 처리물을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 탐색방법에는, 축합 퓨린 유도체와의 특이적인 결합이 인정되는 한에 있어서, 췌장 β세포를 함유하는 장기 또는 조직을 사용할 수도 있다.
구체적으로는, 본 발명의 탐색방법에는, 래트, 마우스, 개, 인간 등의 동물의 췌장, 랑게르한스섬, 췌장으로부터 단리할 수 있는 췌장 β세포 그 자체, 또는 그 세포를 배양하여 얻어지는 세포 배양물, 또는 그들의 처리물을 사용할 수 있다.
췌장 β세포로는, 통상적인 방법에 따라서 췌장으로부터 단리할 수 있는 췌장 β세포 그 자체를 사용할 수 있지만, 불사화 또는 세포주화된 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
불사화 또는 세포주화된 췌장 β세포로서, 구체적으로는 BRIN-BD11 세포 [Diabetes,45, 1132-1140(1996)], INS-1 세포 [Endocrinology,130, 167-178(1992)], βTC 세포 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 9037-9041(1988)], 또는, MIN6 세포 [Endocrinology,127, 126-132(1990)], RINm5F [Diabetes,31, 521-531(1982)], HIT-T15 세포 (ATCC CRL-1777) 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 MIN6 세포를 들 수 있다.
췌장 β세포의 처리물로는, 췌장 β세포 또는 그 세포를 함유하는 조직의 계면활성제 처리물, 초음파 처리물, 기계적 마쇄 처리물, 용매 처리물, 효소 처리물, 췌장 β세포 또는 그 세포를 함유하는 조직의 고정화물, 췌장 β세포 또는 그 세포를 함유하는 조직으로부터 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있는 세포막분획, 단백질분획물, 효소표품 등을 들 수 있다.
상기 계면활성제 처리물은, 예를 들어 Triton X-100, NP-40, 디기토닌 (디기토닌), 수크로오스 모노카프로네이트 (sucrose monocapronate) 등의 동물세포막의가용화에 일반적으로 사용되고 있는 계면활성제를 사용하여 조제할 수 있다.
기계적 마쇄 처리물은, 호모게나이저, 초음파, 프렌치프레스 등을 사용하여 조제할 수 있다.
단백질분획물 및 효소표품은, 세포 또는 조직의 기계적 마쇄 처리물로부터 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미쓰비시화학사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Phamacia사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 어피니티-크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독으로 또는 조합하여 사용함으로써 조제할 수 있다.
[3] 표지화 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 처리물의 결합체의 검출방법
표지화 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 처리물의 결합체는, 췌장 β세포 또는 그 처리물과 결합한 표지화 축합 퓨린 유도체와 미결합의 표지화 축합 퓨린 유도체를 분리한 후, 표지화 축합 퓨린 유도체를 검출함으로써 측정할 수 있다.
췌장 β세포 또는 그 처리물과 결합한 표지화 축합 퓨린 유도체와 미결합의 표지화 축합 퓨린 유도체를 분리하는 방법으로, 췌장 β세포 또는 비용해성의 췌장 β세포의 처리물을 사용하여 결합실험하는 경우는 원심분리에 의해 분리하는 방법을 들 수 있다. 췌장 β세포의 처리물이 단백질분획 또는 효소표품 등의 가용성 물질인 경우는, 겔 여과에 의해 단백질 또는 효소표품 등을 함유하는 분획을 분리하는 방법을 들 수 있다.
표지화 축합 퓨린 유도체는, 그 유도체를 방사성 동위체로 표지한 경우는 액체 신틸레이션 카운터 등을 사용하고, 형광물질로 표지한 경우는 형광검출기 등을 사용하고, 바이오틴으로 표지한 경우는 적당한 효소를 결합시킨 아비딘과 반응시킨 후, 그 효소활성을 측정함으로써 검출ㆍ측정할 수 있고, 그 측정치로부터 표지화 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 처리물의 결합체의 양을 결정할 수 있다.
[4] 인슐린분비 촉진 활성의 측정방법
상기 방법에 의해 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 처리물과의 결합을 저해하는 물질로서 선택되는 물질이 항당뇨병 작용을 갖는 물질인 것은, 예를 들어 췌장 β세포 또는 그 세포를 함유하는 조직과 상기에서 선택되는 물질을 글루코오스 존재하에서 접촉시켰을 때, 그 물질과의 접촉에 의해 췌장 β세포의 인슐린분비가 촉진됨으로써 확인할 수 있다 [Diabetorogia,36, 1139(1993)].
축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합 활성을 지표로 그 결합을 저해하는 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법인 상기 [1]∼[3] 의 탐색방법은, 췌장 β세포의 인슐린분비 촉진 활성을 지표로 직접 그 활성을 촉진시키는 물질을 탐색하는 방법과 비교하여, 조작성, 신속성 등의 면에서 매우 우수한 방법이다.
4. 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 사용한 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법
[1] 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 선택방법
본 발명에서 사용되는 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 선택방법으로는, 축합 퓨린 유도체와 특이적으로 결합하는 단백질을 선택하는 방법이면 모든 공지의 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어, 축합 퓨린 유도체를 담체로 불리는 불용성의 고분자에 고정화하여 결합 활성평가에 사용하는 세포의 추출액과 혼합한 후, 세정하여, 축합 퓨린 유도체에 결합하고 있는 분자를 동정하는 어피니티정제법 [Current Protocols in Protein Science (Chapter 9), John Wiley & Sons (2001)] 등을 들 수 있다.
(1) 담체의 조제방법
본 발명에서 사용되는 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 선택하기 위해 사용되는 담체는, 축합 퓨린 유도체를 고정화할 수 있는 담체이면 모든 담체를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 축합 퓨린 유도체와 화학반응에 의해 결합할 수 있는 관능기를 담체 표면에 갖고, 또한 단백질의 비특이적 흡착이 적고, 조작성이 우수한 담체가 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들어 담체의 재질로는, 아갈로오스, 덱스트란, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌 등을 들 수 있다. 담체의 크기로는, 직경 10㎚ 에서 1㎜, 바람직하게는 50㎚ 에서 100㎛ 의 입자를 들 수 있다. 담체의 형상으로는, 다공질, 관통공질, 무공질 등을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보다 바람직한 담체로는, 예를 들어, NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (아마샴바이오사이언스사 제조), Affi-Gel 10 (바이오래드사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 담체에 고정화할 수 있는 축합 퓨린 유도체는, 담체에 고정화할 수 있는 축합 퓨린 유도체이면 모든 축합 퓨린 유도체를 사용할 수 있다. 담체에 고정화할 수 있는 축합 퓨린 유도체의 구체예로는 하기 식 (Ⅳ)
로 나타내는 화합물 (이하, 화합물 155 로 칭한다) 을 들 수 있다.
축합 퓨린 유도체를 담체에 결합시키는 화학반응은, 본 발명에서의 사용에 지장이 없는 한 모든 반응을 사용할 수 있다.
담체상의 관능기와 축합 퓨린 유도체를 반응시킴으로써 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를 제작할 수 있다. 예를 들어, 관능기로서 카르복실산숙신이미드를 갖는 담체를 축합 퓨린 유도체의 용액과 접촉시켜, 담체상의 카르복실산숙신이미드기와 축합 퓨린 유도체를 반응시킬 수 있다. 이 때의 용매와 반응조건은, 상기 고정화 반응이 진행되는 용매와 반응조건의 조합으로, 카르복실산숙신이미드를 갖는 담체, 축합 퓨린 유도체가, 상기 고정화 반응 이외의 분해반응이나 축합반응 등을, 본 발명의 목적을 저해할 정도로는 일으키지 않는 용매와 반응조건의 조합이면 어떠한 용매와 반응조건의 조합이라도 상관없다. 구체적으로는, 카르복실산숙신이미드를 갖는 담체를 1μmol/ℓ∼1mol/ℓ 의 축합 퓨린 유도체를 함유하는 용액과 접촉시켜, 정치하거나, 또는 로테이터, 믹서 등으로 서서히 교반하면서 0℃∼100℃ 에서 1 초∼1000 시간 반응시켜 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를 조제할 수 있다. 용매로는, 예를 들어, 염, 계면활성제, 완충성분을 함유하는 수용액, 물, N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸술폭시드 (DMSO), 테트라히드로푸란 (THF), 디옥산, 메탄올 등을 들 수 있다.
반응 종료후, 미반응의 축합 퓨린 유도체를 제거하기 위해, 축합 퓨린 유도체가 고정화된 담체를 세정한다. 세정방법은, 축합 퓨린 유도체가 고정화된 담체가 안정적이면서 효율적으로 회수되고, 미반응의 축합 퓨린 유도체를 효율적으로 제거할 수 있는 방법이면, 공지된 모든 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 담체가 입자이면, 반응 종료후 원심분리 (15000rpm, 5 분간, 실온) 하여 상등액을 제거 후, 용매에 현탁하고, 마찬가지로 원심분리, 상등액 제거를 반복함으로써 세정할 수 있다. 담체가 플레이트이면, 플레이트를 용매로 세정할 수 있다. 또한, 필요에 따라 동일한 방법에 의해, 보존이나 세포추출액과의 혼합에 적합한 용매로 치환할 수도 있다. 용매로는, 예를 들어, 염, 계면활성제, 완충성분을 함유하는 수용액, 물, DMF, DHSO, THF, 디옥산, 메탄올 등을 들 수 있다.
축합 퓨린 유도체 고정화 담체상에 미반응의 관능기가 남아 있는 경우는, 필요에 따라 미반응 관능기를 블로킹할 수 있다. 블록킹은, 관능기와 반응하고, 또 담체에 고정화된 축합 퓨린 유도체와는 반응하지 않는 화합물과 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를 반응시킴으로써 실시할 수 있다. 블로킹에는, 관능기와 반응하고, 또 담체에 고정화된 축합 퓨린 유도체와는 반응하지 않는 화합물이면 모두사용할 수 있다. 예를 들어, 담체의 관능기가 카르복실산숙신이미드이면, 트리스, 에탄올아민 등을 사용하여, 축합 퓨린 유도체 고정화 담체상의 미반응의 카르복실산숙신이미드기를 블로킹할 수 있다.
본 발명에 사용되는 축합 퓨린 유도체는, 스페이서 화합물을 통하여 담체에 고정화할 수도 있다. 스페이서 화합물은, 본 발명에서의 사용에 지장이 없는 한 어떠한 화합물도 상관없지만, 예를 들어, Pierece사, Molecular Probe사 및 ShearWater사 등에서 시판되고 있는 스페이서 화합물을 들 수 있다. 구체적으로는, 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트 (LC-SPDP) (Pierece사 제조), 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (S-1531) (Molecular Probe사 제조) 등을 스페이서 화합물로서 들 수 있다. 또한, 6-아미노헥산산, 4-아미노-n-부티르산 등을 스페이서 화합물로서 사용할 수도 있다.
스페이서 화합물을 통한 축합 퓨린과 담체의 결합방법은, 본 발명에서의 사용에 지장이 없는 한 어떠한 방법도 사용할 수 있지만, 예를 들어, 담체에 스페이서 화합물을 도입 후, 축합 퓨린 유도체와 그 스페이서 화합물을 결합시키는 방법이나, 축합 퓨린 유도체에 스페이서 화합물을 결합 후, 담체에 그 스페이서 화합물을 고정화하는 방법을 들 수 있다.
또한, 이들의 스페이서 화합물의 일방의 관능기를 화학적으로 보호하고, 담체 또는 축합 퓨린 유도체와 반응 후, 생성물을 탈보호하여 축합 퓨린 유도체 또는 담체와 반응시켜 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를 조제할 수도 있다.
담체에 스페이서 화합물을 도입 후, 축합 퓨린 유도체를 결합시키는 방법으로는, 예를 들어, 관능기로서 카르복실산숙신이미드기를 갖는 담체와, 1 급 또는 2 급아민을 갖는 카르복실산 화합물인 스페이서 화합물을 반응시킴으로써, 담체 표면에 카르복실기를 가지는 담체를 제조할 수 있다. 1 급아민 또는 2 급아민을 갖는 카르복실산 화합물로는, 예를 들어 6-아미노헥산산, 4-아미노-n-부티르산 등을 들 수 있다.
이 때의 용매와 반응조건은, 상기 고정화 반응이 진행되는 용매와 반응조건의 조합으로서, 담체, 스페이서 화합물이, 상기 고정화 반응 이외의 분해반응이나 축합반응 등을, 그 고정화 반응을 저해할 정도로는 일으키지 않는 용매와 반응조건의 조합이면 어떠한 용매와 반응조건의 조합이라도 상관없다. 구체적으로는, 담체를 1μmol/ℓ∼50mol/ℓ 의 1 급 또는 2 급아민을 갖는 화합물, 예를 들어 6-아미노헥산산, 4-아미노-n-부티르산 등을 함유하는 용액과 접촉시켜, 정치하거나, 또는 로테이터, 믹서 등에 의해 서서히 교반하면서 0℃∼100℃ 에서 1 초∼1000 시간 반응시켜, 표면에 카르복실기를 가지는 담체를 조제할 수 있다. 용매로는, 예를 들어, 물, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 메탄올 등을 들 수 있다.
반응 종료후, 미반응의 스페이서 화합물을 제거하기 위해 담체를 세정한다. 세정방법은, 스페이서 화합물이 고정화된 담체가 안정적이면서 효율적으로 회수되어, 미반응의 축합 퓨린 유도체를 효율적으로 제거할 수 있는 방법이면 공지된 모든 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 담체가 입자이면, 반응 종료후, 원심분리 (15000rpm, 5 분간, 실온) 하여 상등액을 제거 후, 용매에 현탁하고, 마찬가지로 원심분리, 상등액 제거를 반복함으로써 세정할 수 있다. 담체가 플레이트이면, 플레이트를 용매로 세정할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 동일한 방법에 의해 이후의 반응에 적합한 용매로 치환할 수도 있다.
이렇게 해서 얻어진 담체상의 카르복실기와 축합 퓨린 유도체를 반응시킴으로써 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를 제작할 수 있다. 구체적으로는, 스페이서 화합물이 고정화된 담체와 축합 퓨린 유도체용액을 접촉시켜, 담체상의 카르복실기와 축합 퓨린 유도체를 반응시킬 수 있다.
이 때의 용액과 반응조건은, 상기 고정화 반응이 진행되는 용매와 반응조건의 조합으로서, 스페이서 화합물이 고정화된 담체, 축합 퓨린 유도체가, 상기 고정화 반응 이외의 분해반응이나 축합반응 등을, 그 고정화 반응을 저해할 정도로는 일으키지 않는 용액과 반응조건의 조합이면 어떠한 용액과 반응조건의 조합이라도 상관없다. 구체적으로는, 스페이서가 고정화된 담체를 1μmol/ℓ∼50mol/ℓ 의 축합 퓨린 유도체를 함유하는 용액과 접촉시켜, 정치하거나, 또는 로테이터, 믹서 등에 의해 서서히 교반하면서 0℃∼100℃ 에서 1 초∼1000 시간 반응시켜, 담체 표면에 축합 퓨린 유도체를 고정화한 담체를 조제할 수 있다. 용액으로는, 예를 들어 염, 계면활성제, 완충성분을 함유하는 수용액, 물, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 메탄올 등에 축합퓨린을 용해시킨 용액을 들 수 있다.
반응 종료후, 미반응의 축합 퓨린 유도체를 제거하기 위해, 축합 퓨린 유도체가 고정화된 담체를 상기 서술한 방법에 의해 세정한다.
축합 퓨린 유도체 고정화 담체상에 미반응의 관능기가 남아 있는 경우는, 필요에 따라 미반응 관능기를 상기 서술한 방법에 의해 블로킹할 수 있다.
또한, 별도의 축합 퓨린 유도체 고정화 담체의 작성방법으로는, 축합 퓨린 유도체와 스페이서 화합물을 반응시켜, 축합 퓨린 유도체를 담체상으로 결합시키기 위한 스페이서 화합물-축합 퓨린 유도체 복합체를 합성하고, 그 화합물을 담체에 결합시키는 방법을 들 수 있다.
스페이서 화합물-축합 퓨린 유도체 복합체는, 스페이서 화합물과 축합 퓨린 유도체를 반응시킴으로써 조제할 수 있다. 이 때의 용매와 반응조건은, 상기 반응이 진행되는 용매와 반응조건의 조합으로서, 스페이서, 축합 퓨린 유도체, 스페이서 화합물-축합 퓨린 유도체 복합체가, 상기 결합 반응 이외의 분해반응이나 축합반응 등을, 스페이서 화합물과 축합 퓨린 유도체와의 복합체 형성반응을 저해할 정도로는 일으키지 않는 용매와 반응조건의 조합이면 어떠한 용매와 반응조건의 조합이라도 상관없다.
구체적으로는, 예를 들어, 1μmol/ℓ∼1mol/ℓ 의 카르복실산숙신이미드를 갖는 스페이서 화합물과 1μmol/ℓ∼1mol/ℓ 의 축합 퓨린 유도체를 혼합하여, 정치하거나, 또는 로테이터, 믹서 등에 의해 서서히 교반하면서 0℃∼100℃ 에서 1 초∼1000 시간 반응시켜 스페이서-축합 퓨린 유도체를 조제할 수 있다. 용매로는, 예를 들어 염, 계면활성제, 완충성분을 함유하는 수용액, 물, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 메탄올 등을 들 수 있다.
생성된 스페이서 화합물-축합 퓨린 유도체 복합체는, 박층 크로마토그래피, HPLC, 2 상분리 등의 방법에 의해 단리, 정제할 수 있다.
담체와 상기 방법을 사용하여 조제한 스페이서 화합물-축합 퓨린 유도체 복합체를 반응시킴으로써 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를 조제할 수 있다.
이 때의 용액과 반응조건은, 상기 고정화 반응이 진행되는 용액과 반응조건의 조합으로서, 담체, 스페이서-축합 퓨린 유도체 복합체가, 상기 고정화 반응 이외의 분해반응이나 축합반응 등을, 그 복합체와 담체의 결합 반응을 저해할 정도로는 일으키지 않는 용액과 반응조건의 조합이면 어떠한 용액과 반응조건의 조합이라도 상관없다.
구체적으로는, 담체와 1μmol/ℓ∼1mol/ℓ 의 스페이서-축합 퓨린 유도체를 함유하는 용액을 접촉시켜, 상기한 스페이서 화합물을 담체에 고정화하는 방법과 동일한 방법에 의한 고정화방법을 들 수 있다.
이렇게 해서 얻어진 축합 퓨린 유도체 고정화 담체는 용매에 접촉시켜서 보존할 수 있다. 이 때의 용매와 보존조건은, 축합 퓨린 유도체 고정화 담체가 안정적이라면 어떠한 용매와 보존조건의 조합이라도 상관없다. 구체적으로는, 용매로는, 예를 들어, 염, 계면활성제, 완충성분을 함유하는 수용액, 물, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 메탄올 등을 들 수 있다. 보존은 실온 이하가 바람직하고, 차광 하, 헬륨가스, 아르곤가스 등의 불활성가스 치환 하가 보다 바람직하다.
(2) 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질 (이하, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질이라고 칭한다) 을 함유하는 세포추출액의 조제방법
본 발명의 탐색방법에 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은, 축합 퓨린 유도체와 특이적으로 결합하는 단백질이면 그 유래가 한정되지 않지만, 바람직하게는 진핵생물 유래의 단백질, 보다 바람직하게는 동물 유래의 단백질, 더 바람직하게는 포유동물의 기관, 장기, 조직 또는 세포 유래의 단백질을 들 수 있다.
기관, 장기 또는 조직으로는 공지된 모든 조직을 사용할 수 있지만, 췌장, 랑게르한스섬 등의 장기 또는 조직이 바람직하다. 세포로는, 공지된 모든 세포를 사용할 수 있지만, 췌장 β세포주, 췌장 β세포 초대 배양세포 등을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, β세포주로는, BRIN-BD11 세포 [Diabetes,45, 1132-1140(1996)], INS-1 세포 [Endocrinology,130, 167-178(1992)], βTC 세포 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 9037-9041(1988)], MIN6 세포 [Endocrinology,127, 126-132(1990)], HIT-T15 세포 (ATCC CRL-1777), 및 RINm5F [Diabetes,31, 521-531(1982)] 등의 세포를 들 수 있다. β세포 초대 배양 세포로는, 췌장, 랑게르한스섬 등의 조직으로부터 회수한 세포를 단기간 배양한 세포 등을 들 수 있다.
이들의 세포는, 동물세포 배양법 입문 [학회출판센터 (1993)] 등에 기재된 방법에 따라서 배양할 수 있다.
상기 기관, 장기, 조직 또는 세포로부터 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 함유하는 시료를 조제하는 방법은, 단백질을 회수할 수 있는 방법이라면 공지된 모든 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어, 단백질ㆍ효소의 기초실험법, 개정 제2판 (낭코우도, 1994) 등에 기재된 방법을 사용하여 조제할 수 있다. 기관, 장기, 조직 또는 세포의 파쇄방법으로는 공지의 모든 파쇄방법을 사용할 수 있지만, 워링블렌더, 폴리트론, Dounce 형 호모게나이저나 초음파 파쇄기 등의 장치를 사용한 기계적 파쇄, 저장파를 사용한 물리적 파쇄, 계면활성제를 사용한 가용화, 원심분리 등의 조작을 조합함으로써 그 단백질 시료를 조제할 수 있다.
그 단백질 시료는, 냉장상태 또는 동결상태로 보존할 수 있다.
(3) 본 발명에 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 탐색방법
본 발명에 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은, 상기 (1) 의 방법으로 제작할 수 있는 축합 퓨린 유도체 고정화 담체 및 상기 (2) 의 방법으로 조제되는 단백질 시료를 사용하여 탐색할 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 탐색방법은, 축합 퓨린 유도체를 탐색할 수 있는 방법이면 공지된 모든 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 단백질ㆍ효소의 기초실험법, 개정 제2판 (낭코우도, 1994) 등에 기재된 방법을 사용하여 탐색할 수 있다.
구체적으로는, 상기 (1) 의 방법으로 조제한 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를, 상기 (2) 의 방법으로 조제한 단백질 시료에 분산시켜, 정치 또는 로테이터ㆍ믹서 등에 의해 서서히 교반하면서 0℃∼50℃ 에서 1 초∼1000 시간 반응시켜 축합 퓨린 유도체 고정화 담체에 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 흡착시킬 수 있다. 이 결합 반응후, 축합 퓨린 유도체 고정화 담체를 세정함으로써 축합 퓨린 유도체 고정화 담체에 비특이적으로 흡착되는 단백질을 제거할 수 있다. 결합 또는 세정에 사용되는 용액은, 본 법에서 사용할 수 있는 한 어떠한 용액도 상관없고, 예를 들어, 단백질ㆍ효소의 기초실험법, 개정 제2판 (낭코우도, 1994) 에 기재된 용액을 들 수 있다.
축합 퓨린 유도체 고정화 담체에 흡착된 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은,축합 퓨린 유도체와의 결합을 약하게 하는 수단에 의해 축합 퓨린 유도체 고정화 담체로부터 용출할 수 있다. 축합 퓨린 유도체와 그 결합 단백질의 결합을 약하게 하는 수단은, 본 법에서 사용할 수 있는 한 모든 수단을 사용할 수 있고, 예를 들어, 변성제의 첨가, 염농도의 증가, 가열, 계면활성제의 첨가 등의 수단을 들 수 있다. 변성제로는 SDS, 우레아, 염산구아니딘 등을, 염으로는 염화나트륨, 염화칼륨 등을, 계면활성제로는 Nonidet P40, Triton, Tween, 디기토닌 등을 들 수 있다. 또한, 가열이란 예를 들어, 30∼100℃ 로 온도를 올리는 것을 말한다. 이렇게 해서 정제한 그 결합 단백질은, SDS-PAGE, 2차원 전기영동, 질량분석 등의 단백질 분석수법에 의해 검출할 수 있다.
축합 퓨린 유도체 고정화 담체, 또는 블로킹만을 실시한 담체에 대한 그 결합 단백질의 결합성을 비교함으로써, 축합 퓨린 유도체에 특이적으로 결합하는 단백질을 탐색할 수 있다.
(4) 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 동정방법
축합 퓨린 유도체 결합 단백질은, SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 쿠마시브릴런트블루 (CBB: Coomassie Brilliant Blue) 염색 후, 겔로부터 잘라낼 수 있다. 겔 중의 단백질은, 리딜엔드펩티다아제나 트립신 등의 특이적 절단점을 갖는 엔도프로테아제에 의한 처리에 의해 펩티드 단편으로 나눌 수 있다. 얻어진 펩티드단편을 역상 HPLC 등에 의해 정제한 후, 기상 프로테인 시퀀서 또는 질량분석기를 사용하여 당해 단백질의 부분아미노산서열을 조사할 수 있다. 이들 부분아미노산서열의 정보를 사용하여, PIR, SwissProt 등의 아미노산서열 데이터베이스나GeneBank 등의 염기서열 데이터베이스에 대해서 상동성을 검색함으로써, 당해 단백질과 공지 단백질과의 상동성을 알 수 있다.
상기 방법으로 동정된 단백질로는, 서열번호 2 로 나타내는 아미노산서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 그 단백질은, NADPH 의존적인 레티놀이나 단쇄알코올의 산화환원효소활성을 갖는 효소로서 알려져 있다 [Biochimica et Biophysica Acta,1338, 47(1997)].
(5) 본 발명의 탐색방법에 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질
본 발명의 탐색방법에 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질로는, 상기 (3) 및 (4) 의 방법에 의해 동정되는 단백질이면 모두 사용할 수 있고, 그 유래도 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는,
(ⅰ) 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열을 갖는 단백질,
(ⅱ) 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열에 있어서, 1 이상의 아미노산잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열로 이루어지고, 또한 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질,
(ⅲ) 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 이루어지고, 또한 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질,
을 들 수 있다.
서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열로 이루어지는 단백질은,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (이하, 몰레큘러ㆍ클로닝 제3판으로 약기한다), Current Protocols in Molecular Biology, Johh Wiley & Sons (1987-1997) (이하, 커런트ㆍ프로토콜ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지로 약기한다), Nucleic Acids Research,10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79, 6409(1982), Gene,34, 315(1985), Nucleic Acids Research,13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488(1985) 등에 기재된 부위특이적 변이도입법을 사용하여, 예를 들어 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA 에 부위특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다.
결실, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기의 부위특이적 변이법 등의 주지의 방법에 의해 결실, 치환, 삽입 또는 부가할 수 있을 정도의 수로서, 1 개 내지 수십개, 바람직하게는 1∼20 개, 보다 바람직하게는 1∼10 개, 더욱 바람직하게는 1∼5 개이다.
서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열에 있어서 1 이상의 아미노산잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되었다는 것은, 동일 서열 중의 임의의 위치에 있어서 1 또는 복수의 아미노산잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 발생할 수도 있으며, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산잔기는 천연형과 비천연형에 상관없다. 천연형 아미노산잔기로는, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루타민산, 글리신, L-히스티딘, L-이소루신, L-루신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에, 서로 치환가능한 아미노산잔기의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산잔기는 상호 치환가능하다.
A 군: 루신, 이소루신, 노르로이신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B 군: 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노스베르산
C 군: 아스파라긴, 글루타민
D 군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2, 4-디아미노부탄산, 2, 3-디아미노프로피온산
E 군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
F 군: 세린, 트레오닌, 호모세린
G 군: 페닐알라닌, 티로신
상기에서 얻어지는 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열에 있어서 1 이상의 아미노산잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열로 이루어지는 단백질이 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질이기 위해서는, 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열과, 60% 이상, 통상은 80% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.
아미노산서열이나 염기서열의 상동성은, Karlin and Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA,90, 5873(1993)] 나 FASTA [Methods Enzymol.,183, 63(1990)] 를 사용하여 결정할 수 있다. 이 알고리즘 BLAST 에 기초하여, BLASTN 이나 BLASTX 라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다 [J. Mol. Biol.,215, 403(1990)]. BLAST 에 기초하여 BLASTN 에 의해 염기서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 Score=100, wordlength=12 로 한다. 또한, BLAST 에 기초하여 BLASTX 에 의해 아미노산서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score=50, wordlength=3 으로 한다. BLAST 와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지되어 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
상기에서 얻어지는 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열에 있어서 1 이상의 아미노산잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열로 이루어지는 단백질이 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질인 것은, 이하의 방법으로 확인할 수 있다.
상기 (1) 의 방법으로 얻어지는 축합 퓨린 유도체가 고정화된 담체와 그 단백질을, 축합 퓨린 유도체와 그 단백질의 결합을 저해하지 않는 용매 중에서 충분한 시간 동안 접촉시킨다. 반응후, 원심분리에 의해 그 담체를 분리하고, 축합 퓨린 유도체와 그 단백질의 결합을 해리시키는 작용을 갖지 않는 용매로 그 담체를 현탁한다. 동일한 조작을 수회 반복함으로써 그 담체를 세정할 수 있다.
축합 퓨린 유도체에 결합하고 있는 단백질은, 축합 퓨린 유도체와의 결합을약하게 하는 수단에 의해 축합 퓨린 유도체 고정화 담체로부터 용출할 수 있다. 축합 퓨린 유도체와 결합 단백질의 결합을 약하게 하는 수단으로는, 상기 (3) 의 방법을 들 수 있다. 용출된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 제공하여 그 전기영동에 의해 그 단백질의 밴드를 확인할 수 있는 경우, 그 단백질은 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질이다.
[2] 본 발명의 탐색방법에서 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 조제방법
(1) 장기 등으로부터의 조제
본 발명의 탐색방법에서 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은, 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 한 공지된 모든 방법을 사용하여 조제할 수 있고, 예를 들어 단백질ㆍ효소의 기초실험법 개정 제2판 (낭코우도, 1994) 등에 기재된 방법을 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 탐색방법에서 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은, 진핵생물의 기관, 장기, 조직 또는 세포를 파쇄하여 미정제분획, 부분정제분획, 정제분획으로서 조제할 수 있다. 진핵생물로는 공지된 모든 생물을 사용할 수 있지만, 포유류가 바람직하다. 기관, 장기 또는 조직으로는, 공지된 모든 기관, 장기 또는 조직을 사용할 수 있지만, 예를 들어 췌장, 랑게르한스섬 등을 들 수 있다. 세포로는, 공지된 모든 세포를 사용할 수 있지만, 예를 들어 BRIN-BD11 세포 [Diabetes,45, 1132-1140(1996)], INS-1 세포 [Endocrinology,130, 167-178(1992)], βTC 세포 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 9037-9041(1988)], MIN6세포 [Endocrinology,127, 126-132(1990)], HIT-T15 세포 (ATCC CRL-1777), 및 RINm5F [Diabetes,31, 521-531(1982)] 등의 세포를 들 수 있다. 기관, 장기, 조직 또는 세포의 파쇄방법으로는 공지된 모든 파쇄방법을 사용할 수 있지만, 워링블렌더, 폴리트론, Dounce 형 호모게나이저나 초음파 파쇄기 등의 장치를 사용한 기계적 파쇄, 저장파를 사용한 물리적 파쇄, 계면활성제를 사용한 가용화, 원심분리 등의 조작을 조합함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 함유하는 단백질분획을 조제할 수 있다.
그 단백질분획은, 냉장상태 또는 동결상태로 보존할 수 있다.
그 단백질분획으로부터 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 정제하는 방법으로는, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 축합 퓨린 유도체를 고정화한 담체를 사용한 어피니티정제 등 방법을 단독으로 또는 조합함으로써 정제하는 방법을 들 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 양은, 그 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 반응하는 항체를 사용한 면역블롯법 등에 의해 측정할 수 있다.
정제된 단백질의 축합 퓨린 유도체에 대한 결합 활성의 정도는, 상기 [1] (1) 의 방법으로 조제한 축합 퓨린 유도체를 고정화한 담체를 사용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과의 결합 복합체에 대하여 그 결합을 약하게 하는 수단을 강구함으로써, 그 결합 복합체로부터 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 용출할 수 있다. 축합 퓨린 유도체와 결합 단백질의 결합을 약하게 하는 수단으로는, 상기 [1] (3) 의 방법을 들 수 있다. 용출된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 제공하여 그 전기영동에 의해 그 단백질의 밴드를 확인함으로써 분획한 분획에 함유되는 그 단백질의 결합 활성의 정도를 측정할 수 있다.
또한, 축합퓨린결합 단백질의 활성이 알려져 있는 경우는, 그 단백질의 활성을 측정하는 것에 의해서도 결합 활성을 평가할 수 있다.
예를 들어, 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산서열을 갖는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질 (이하, p31 단백질이라고 칭한다) 은, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons (2001) 에 기재된 방법에 준하여 그 단백질의 활성을 측정함으로써 축합 퓨린 유도체와의 결합 활성을 측정할 수 있다.
또한, 상기에서 조제한 단백질분획으로부터 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 정제하는 방법으로는, 그 단백질에 반응하는 항체를 사용한 어피니티-크로마토그래피에 의해 정제하는 방법도 들 수 있다. 즉, 그 단백질에 반응하는 모노크로날항체나 폴리클로날항체 등을 취득한 후, Harlow, E. and Lane, D. Using antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1999) 등에 기재된 방법 등을 사용하여 그 항체를 크로마토그래피 담체와 가교하여 어피니티칼럼을 조제하고, 이 칼럼을 사용하여, 단백질분획이나 부분정제분획으로부터 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 정제할 수 있다.
(2) 재조합 세포를 사용한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 조제
본 발명에 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은, 그 단백질을 코드하는 DNA 를 사용하여 조제할 수 있다. 그 DNA 는, 상기 [1] (4) 에서 동정된 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 아미노산서열에 기초하여 제작할 수 있는, 그 아미노산서열을 코드하는 합성 DNA 를 사용하여, 그 단백질을 생산하는 세포, 조직 등으로부터 조제되는 cDNA 라이브러리에 대하여, 콜로니 하이브리다이제이션, 또는 플라크 하이브리다이제이션 등의 수법 (몰레큘러ㆍ클로닝 제3판) 을 사용함으로써 취득할 수 있다.
또한, 그 아미노산서열을 쿼리(query)로 하여 공지의 데이터베이스를 탐색함으로써, 그 아미노산서열을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 의 염기서열을 취득할 수도 있다.
상기 방법에 의해 취득할 수 있는 DNA 로는, 구체적으로는 예를 들어,
(ⅰ) 서열번호 4∼6 중 어느 하나로 나타내는 염기서열을 갖는 DNA,
(ⅱ) 상기 [1] (5) 의 (ⅰ)∼(ⅲ) 중 어느 하나에 기재된 단백질을 코드하는 DNA,
(ⅲ) 서열번호 4∼6 중 어느 하나로 나타내는 염기서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이징하고, 또한 축합 퓨린 유도체와 결합하는 단백질을 코드하는 DNA 를 들 수 있다.
스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈가능한 DNA 란, 예를 들어, 서열번호 4∼6 중 어느 하나로 나타내는 염기서열을 갖는 DNA 의 전부 또는 그 DNA 를 제한효소에 의해 소화하여 얻어지는 DNA 단편 등을 프로브로 하여, 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 플라크ㆍ하이브리다이제이션법 또는 서던블롯 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하고, 구체적으로는, 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 를 고정화한 필터를 사용하여, 0.9mol/ℓ 의 염화나트륨 존재하, 65℃ 에서 하이브리다이제이션한 후, 0.1∼2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mmol/ℓ 염화나트륨, 15mmol/ℓ 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여, 65℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은, 몰레큘러ㆍ클로닝 제3판, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다.
하이브리다이징가능한 DNA 로서 구체적으로는, 상기한 BLAST 나 FASTA 등을 사용하고 상기한 파라미터 등도 사용하여 계산하였을 때, 서열번호 4∼6 중 어느 하나로 나타내는 염기서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질은, 몰레큘러ㆍ클로닝 제3판이나 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어 이하 방법에 의해 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 숙주세포 중에서 발현시켜, 제조할 수 있다.
전장(full-length) cDNA 를 바탕으로, 필요에 따라서 그 단백질을 코드하는부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
또한, 필요에 따라, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 부분의 염기서열을 숙주세포의 발현에 최적의 코돈이 되도록 염기를 치환한 DNA 를 조제한다. 그 DNA 는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 효율적 제조에 유용하다.
그 DNA 단편, 또는 전장 cDNA 를 적당한 발현 벡터의 프로모터 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다.
그 재조합 벡터를, 그 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입한다.
숙주세포로는, 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다.
발현 벡터로는, 상기 숙주세포에 있어서 자립복제 가능 내지는 염색체 중으로 삽입할 수 있고, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.
세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우는, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하여 이루어지는 재조합 벡터는 원핵생물 중에서 자립복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 배열, 본 발명의 DNA, 전사종결 배열로 구성된 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 함유될 수도 있다.
발현 벡터로는, 예를 들어 pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거 만하임사 제조), pKK233-2 (Pharmacia사 제조), pSE280 (Invitrogen 사 제), pGEMEX-1 (Promega 사 제), pQE-8 (QIAGEN사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소58-110600호), pKYP200〔Agric. Biol. Chem.,48, 669 (1984)〕, pLSA1〔Agric. Biol. Chem.,53, 277 (1989)〕, pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 4306 (1985)〕, pBluescript Ⅱ SK(-) (Stratagene사 제조), pTrs30〔Escherichia coliJM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 으로부터 조제〕, pTrs32〔Escherichia coliJM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 로부터 조제〕, pGHA2〔Escherichia coliIGHA2 (FERM BP-400) 로부터 조제, 일본 공개특허공보 소60-221091호〕, pGKA2〔Escherichia coliIGKA2 (FERM BP-6798) 로부터 조제, 일본 공개특허공보 소60-221091호〕, pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400〔J.Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕, pGEX (Pharmacia사 제조), pET 시스템 (Novagen사 제조) 등을 들 수 있다.
프로모터로는 숙주세포 중에서 기능하는 것이면 어느 것이나 된다. 예를 들어, trp 프로모터 (Ptrp), lac 프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한 Ptrp를 2 개 직렬시킨 프로모터 (Ptrp×2 ), tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합 배열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 배열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리 (예를 들어 6∼18 염기) 로 조절한 플러스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터에서는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 DNA 의 발현에는 전사종결 배열이 반드시 필요하지는 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사종결 배열을 배치하는 것이 바람직하다.
숙주세포로는 에쉐리히아속, 세라티아속, 바실루스속, 프레비박테륨속, 콜리네박테륨속, 미크로박테륨속, 슈드모나스속 등에 속하는 미생물, 예를 들어 Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichiacoli JM109, Escherichiacoli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli GI698, Escherichia coli TB1, 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아 리퀘파시엔스(Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 바실러서 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테리움 암모니아진스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 이마리오필륨(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, 코리네박테리움 아세토아시도필륨(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 마이크로박테리움 암모니아필륨(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 수도모나스 에스피.(Pseudomonas sp.) D-0110 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로는 상기 숙주세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어 칼슘이온을 사용하는 방법〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)〕, 프로토블러스트법 (일본 공개특허공보 소63-2483942호), 또는 Gene,17, 107 (1982) 나 Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
효모를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예를 들어, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 들 수 있다.
프로모터로는 효모균주 중에서 기능하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어 헥소오스키나제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크폴리펩티드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주세포로는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 슈조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 트리코스포론(Trichosporon) 속, 슈바니마이세스(Schwannimyces) 속, 피키아(Pichia) 속, 칸디다(Candida) 속 등에 속하는 미생물, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 슈조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈바니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 칸디다 유틸러스(Candida utilis) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로는 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어 일렉트로포레이션법〔Methods Enzymol., 194, 182 (1990)〕, 스페로블러스트법〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕, 아세트산리튬법〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예를 들어 pcDNAI, pCDM8 (Invitrogen사 제조), pAGE107〔일본 공개특허공보 평3-22979호, Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕, pAS3-3 (일본 공개특허공보 평2-227075호), pcDNAI/Amp (Invitrogen사 제조), pREP4 (Invitrogen사 제조), pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕, pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로는 동물세포 중에서 기능하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CW) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트쇼크 프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주세포로는 인간의 세포인 나말바 (Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈 햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299호) 등을 들 수 있다.
동물세포로의 재조합 벡터의 도입방법으로는 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어 일렉트로포레이션법〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕, 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션법〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕, Virology, 52, 456 (1973) 등을 들 수 있다.
곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 예를 들어 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A LAboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 의해서, 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큐로바이러스를 곤충세포에 함께 도입하여 곤충세포 배양상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 다시 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
그 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로는 예를 들어 pVL1392, pVL1393, pBlueBacⅢ (모두 Invitorogen사 제조) 등을 들 수 있다.
바큐로바이러스로는 예를 들어, 밤도둑나방과 곤충에게 감염되는 바이러스인 오토그라파 캘리포니아 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충세포로는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 의 난소세포인 Sf9, Sf21〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 의난소세포인 High 5 (Invitrogen사 제조) 등을 사용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큐로바이러스의 공도입 방법으로는, 예를 들어 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션법〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕등을 들 수 있다.
식물세포를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예를 들어 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로는 식물세포 중에서 기능하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주세포로는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알팔파, 벼, 밀, 보리 등의 식물세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로는 식물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느것이나 사용할 수 있고, 예를 들어 아그로박테륨 (Agrobacterium) (일본 공개특허공보 소59-140885호, 일본 공개특허공보 소60-70080호, WO94/00977), 일렉트로포레이션법 (일본 공개특허공보 소60-251887호), 파티클 건 (유전자 총) 을 사용하는 방법 (일본특허 제2606856호, 일본특허 제2517813호) 등을 들 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 생성축적시키고, 그 배양물로부터 채취함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 제조할 수 있다.
그 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 실시할 수 있다.
그 형질전환체가 대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체인 경우, 그 형질전환체를 배양하는 배지로서, 그 형질전환체가 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 그 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지의 어느 것이나 사용해도 된다.
탄소원으로는 그 형질전환체가 자화할 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프락토오스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.
질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그밖의 함질소화합물, 그리고 펩톤, 육(肉) 추출물, 효모 추출물, 콘스치프리카, 카세인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기염으로는 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은 진탕배양 또는 심부통기교반배양 등의 호기적 조건 하에서 실시한다. 배양온도는 15∼40℃가 바람직하고, 배양시간은 통상 16 시간∼7 일간이다. 배양 중의 pH 는 3.0∼9.0 으로 유지하는 것이 바람직하다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 앰피실린이나 테트라사이크린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕, Eagle 의 MEM 배지〔Science, 122, 501 (1952)〕, 둘베코 개변 MEM 배지〔Virology, 8, 396 (1959)〕, 199 배지〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6∼8, 30∼40℃, 5% C02존재 하 등의 조건 하에서 1∼7 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에첨가해도 된다.
곤충세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사 제조), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (Life Technologies사 제조), ExCell 400, ExCell 405 (모두 JRH Biosciences사 제조), Gracc's Insect Medimm〔Nature, 195, 788 (1962)〕등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6∼7, 25∼30℃ 등의 조건 하에서, 1∼5 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.
식물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체는 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 그 형질전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 & 스쿡 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등, 식물호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH5∼9, 20∼40℃ 의 조건 하에서 3∼60 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 하이글로마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.
상기한 바와 같이, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 삽입한 재조합 벡터를 보유하는 미생물, 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포 유래의 형질전환체를, 통상의 배양방법에 따라서 배양하고, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 생성 축적시켜, 그 배양물로부터 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 채취함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 제조할 수 있다.
효모, 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포에 의해 발현시킨 경우에는 당 또는 당쇄가 부가된 단백질을 얻을 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 생산시키는 형태로는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 그대로의 구조로 생산시키는 것 이외에, 몰레큘러 클로닝 제 3 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 마커 펩티드를 연결시킨 융합 단백질로서, 또는 시그널 배열을 연결시킨 분비 단백질로서 생산할 수 있다.
융합시키는 마커 펩티드로는 myc 폴리펩티드, β-갈락토시다제, 프로테인 A, 프로테인 A 의 IgG 결합영역, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 폴리(Arg), 폴리(Glu), 프로테인 G, 말토오스 결합 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 폴리히드티딘쇄 (His-tag), S 펩티드, DNA 결합 단백질 도메인, Tac 항원, 티오레독신, 그린 플루오렛센트 프로테인, FLAG 펩티드, 및 임의 항체의 에피토프 등을 들 수 있다. 시그널 배열로는 임의 분비 단백질의 시그널 배열을 들 수 있다〔야마카와 아키오, 실험의학, 13, 469-474 (1995)〕.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 생산방법으로는 숙주세포 내에 생산시키는 방법, 숙주세포 외에 분비시키는 방법, 또는 숙주세포 외 막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주세포나, 생산시키는 그 단백질의 구조를 변경함으로써, 그 방법을 선택할 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질이 숙주세포 내 또는 숙주세포 외 막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법〔J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)〕, 로우 등의 방법〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)〕, 또는 일본 공개특허공보 평5-336963호, WO94/23021 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 숙주세포 외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성 부위를 포함하는 폴리펩티드의 앞에 시그널 펩티드를 부가한 형태로 발현시킴으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 숙주세포 외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 공개특허공보 평2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준하여 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수 있다.
또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 제조할 수도 있다.
형질전환체가 동물개체 또는 식물개체인 경우에는 통상적인 방법에 따라서 사육 또는 재배하고, 그 단백질을 생성축적시켜 그 동물개체 또는 식물개체보다 그 단백질을 채취함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 제조할 수 있다.
동물개체를 사용하여 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 제조하는 방법으로는 예를 들어 공지된 방법〔American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996),Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
동물개체의 경우에는 예를 들어, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하고, 그 단백질을 그 동물 중에 생성ㆍ축적시켜, 그 동물 중에서 그 단백질을 채취함으로써 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 제조할 수 있다. 그 동물 중의 생성ㆍ축적 장소로는 예를 들어 그 동물의 밀크 (일본 공개특허공보 소63-309192호), 알 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로는, 동물에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있지만, 예를 들어 유선 세포 특이적인 프로모터인 α카세인 프로모터, β카세인 프로모터, β락토글로불린 프로모터, 훼이(whey) 산성 프로테인 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
식물개체를 사용하여 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 제조하는 방법으로는 예를 들어 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법〔조직배양, 20 (1994), 조직배양, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕에 준하여 재배하고, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 그 식물 중에 생성, 축적시키고, 그 식물 중에서 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 채취함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
상기 형질전환체에 의해 제조된 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 단리 정제하기 위해서는 통상의 효소의 단리정제법을 사용할 수 있다. 예를 들어 축합 퓨린 유도체 결합 단백질이, 세포 내에 용해상태에서 발현된 경우에는 배양 종료 후,세포를 원심분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨튼가우린호모지나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 그 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 효소의 단리정제법, 즉, 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAI0N HPA-75 (미쓰비시화학사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Pharmacia사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 사용한 겔 여과법, 어피니티-크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합하여 사용하여 정제표품을 얻을 수 있다.
또한, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우에는 동일하게 세포를 회수한 후, 파쇄하고, 원심분리함으로써, 침전분획으로서 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 불용체를 회수한다. 회수한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 그 가용화액을 희석 또는 투석하고, 그 가용화액 중의 단백질 변성제의 농도를 낮춤으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 정상적인 입체구조로 되돌린다. 그 조작 후, 상기와 동일한 단리정제법에 의해 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 정제표품을 얻을 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질, 또는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 당쇄가 부가된 그 단백질 등의 유전체가 세포 외에 분비된 경우에는 배양상청에 그 단백질 또는 그 단백질의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 그 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양상청을 취득하고, 그 배양상청으로부터, 상기와 같은 단리정제법을 사용함으로써 정제표품을 얻을 수 있다.
또한, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 시험관내(in vitro) 전사ㆍ번역계를 사용하여 제조할 수도 있다.
시험관내 전사ㆍ번역계로는 공지된 방법 [Kigawa T. 등, J. Biomol. NMR, 6, 129 (1998), Spirin A.S. 등, Science, 242, 1162 (1988), Kigawa T. & Yokoyama s., J. Biochem., 110, 166 (l991)] 에 준하여 시험관내 전사ㆍ번역계를 사용할 수 있다. 즉, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 SP6, T7, T3 등의 프로모터의 하류에 연결하고, 각각의 프로모터 특이적인 RNA 폴리머라제를 반응시킴으로써 대량의 축합 퓨린 유도체 결합 단백질 RNA 를 시험관 내에서 합성한 후, 무세포계의 번역계 예를 들어 토끼 망상 적혈구 라이세이트, 밀 배아 추출액이나 대장균 추출액 등을 사용한 번역계를 이용하여, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 생산할 수 있다. 그 반응액으로부터, 상기와 동일한 단리정제법을 사용함으로써, 정제표품을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 탐색방법에서 사용되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질은 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, Advanced ChemTech 사, 퍼킨·엘머사, Pharmacia 사, Protein Technology Instrument 사, Synthecell-Vega 사,PerSeptive 사, 시마즈 제작소 등의 펩티드합성기를 이용하여 화학합성할 수도 있다.
이렇게 하여 취득되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질로서, 예를 들어 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다.
[3] 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용한 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법
항당뇨병 작용을 갖는 물질은 ① 피검물질 존재 하, 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질의 결합량과, ② 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질의 결합량을 측정하고, ③ 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교한 후, ④ 피검물질로부터 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질의 결합을 저해하는 물질을 선택함으로써 취득할 수 있다.
상기 방법으로 사용되는 축합 퓨린 유도체로는 상기 2 의 방법으로 제조되는 상기 1 의 화합물을 들 수 있고, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질로는 상기 4 [2] 의 방법으로 제조되는 상기 4 [1] 의 단백질을 들 수 있다. 구체적으로는 상기 4 [1] (5) 의 (ⅰ)∼(ⅲ) 의 단백질을 들 수 있다.
축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 결합체의 양을 측정하는 방법으로는 예를 들어 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 어느 일방의 분자를 멀티 웰 플레이트, 크로마토 담체 또는 라텍스 등의 비드, 표면 플라즈몬 공명 측정용 칩 또는 질량측정용 타깃 등의 고상에, 물리적 흡착, 공유결합 또는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 반응하는 항체 등, 태그 펩티드, 마커 펩티드 및 시그널 펩티드에서 선택되는 펩티드를 특이적으로 인식하는 분자를 개재시킨 결합에 의해 고정화하고, 필요에 따라 비특이 흡착을 억제하는 블로킹 등의 처리를 행한 후, 타방의 분자를 첨가하고, 또한 미흡착인 타방의 분자를 세정제거 후, 타방의 분자인 축합 퓨린 유도체 결합 단백질 또는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성, 결합특성, 표면 플라즈몬 공명의 발생, 또는 질량분석의 신호강도 등에 의해 결합한 타방의 분자를 검출함으로써, 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 단백질의 결합량을 검출하는 방법을 들 수 있다.
피검물질 존재 하에서의 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 결합량과, 피검물질 부재 하에서의 그 결합량을 상기 방법 중 어느 한 방법을 사용하여 비교함으로써, 피검물질로부터 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 결합의 저해활성을 지표로, 항당뇨병 작용을 갖는 물질을 선택할 수 있다.
그 물질이 항당뇨병 작용, 예를 들어 인슐린분비 촉진 작용을 갖는 물질인 것은 췌장 β세포 또는 그 세포를 함유하는 조직과 상기에서 선택되는 물질을 글루코오스 존재 하에서 접촉시켰을 때, 그 물질에 의해 췌장 β세포의 인슐린분비가 촉진되는 것 등에 의해 확인할 수 있다〔Diabetorogia, 36, 1139 (1993)〕.
[4] 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 사용한 축합퓨린 결합 단백질에 결합하는 물질의 탐색방법
축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 결합하는 물질은 ① 피검물질 존재 하, 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그세포의 처리물과의 결합량과, ② 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하고, ③ 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하고, ④ 피검물질로부터 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합을 저해하는 물질을 선택한 후, ⑤ ④ 의 공정에서 얻어지는 물질로부터, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 결합하는 물질을 선택함으로써 취득할 수 있다.
상기 ①∼④ 의 공정은 상기 3 의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 상기 ①∼④ 의 공정에서 선택되는 물질로부터 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 결합하는 물질을 선택하는 방법으로는 예를 들어 표지화한 그 물질과 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우와, 표지화한 그 물질과 췌장 유래 세포 또는 조직 또는 이들의 처리물 이외의 세포 등을 접촉시킨 경우의 그 물질의 결합 활성을 표지에 기초하여 측정, 비교하고, 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물에 대한 결합성이 높은 물질을 선택하는 것에 의한, 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질에 결합하는 물질을 선택하는 방법을 들 수 있다. 결합 활성은 상기 3 [3] 의 방법에 준하여 측정할 수 있다.
[5] 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 결합하는 물질의 탐색 방법
상기 4 [4] 의 방법에 있어서, 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물 대신에,상기 4 [1] 및 [2] 의 방법으로 얻어지는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용하여, 상기 4 [4] ①∼④ 의 공정에서 선택되는 물질로부터, 상기 4 [3] 의 방법에 준하여 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질에 결합하는 물질을 취득할 수 있다.
또한, 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 결합은 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 다른 단백질과의 융합단백질로서 생산하고, 융합시킨 단백질에 친화성을 갖는 물질을 사용하여 태그 펩티드, 마커 펩티드, 또는 시그널 펩티드에서 선택되는 펩티드를 특이적으로 검출함으로써 측정할 수도 있다. 예를 들어, 융합시키는 펩티드로서 β-갈락토시다제, 클로람페니콜ㆍ아세틸트랜스퍼라제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 티오레톡신 등을 사용하였을 때에는 그 효소활성을 지표로, 그린ㆍ플루오렛센트ㆍ프로테인 (GFP) 등을 사용하였을 때에는 그 형광을 지표로, 프로테인 A, 프로테인 A 의 IgG 결합영역, 폴리 (Arg), 폴리 (Glu), 프로테인 G, 말토오스 결합 폴리펩티드, 폴리비스티딘쇄 (His-tag), DNA 결합 폴리펩티드 도메인 등을 사용하였을 때에는 그 특이적 결합분자와의 결합을 지표로, myc 폴리펩티드, S 펩티드, Tac 항원, FLAG 펩티드, 임의 항체의 에피토프 등을 사용하였을 때에는 그 특이적 항체와의 결합을 지표로 검출할 수 있다.
β-갈락토시다제, 클로람페니콜ㆍ아세틸트랜스퍼라제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 티오레독신, 그린ㆍ플루오렛센트ㆍ프로테인 (GFP), 프로테인 A, 프로테인 A 의 IgG 결합영역, 폴리 (Arg), 폴리 (Glu), 프로테인 G, 말토오스 결합 폴리펩티드, 폴리히스티딘쇄 (His-tag), DNA 결합 폴리펩티드 도메인 등은 그들의 특이적 항체와의 결합을 지표로 검출할 수도 있다.
또한, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 축합 퓨린 유도체의 어느 일방 또는 쌍방을 바이오틴 등의 결합에 특이성을 갖는 분자나 형광 시약, RI 표지 시약 등에 의해 수식 후, 상기 반응계에 사용함으로써, 바이오틴 등의 결합 특이성을 사용하여 고상에 결합시키거나, 바이오틴 등의 결합 특이성이나 형광, 방사성 등을 지표로 상호작용을 검출할 수도 있다.
또한, 단백질 및 폴리펩티드를 적절한 형광색소로 라벨화하고, 형광 공명 에너지 이동 (FRET) 에 의해, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 축합 퓨린 유도체가 결합하고 있을 때에만 발하는 형광을 이용하여, 용액계에서 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 축합 퓨린 유도체의 상호작용을 검출할 수 있다.
[6] 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용한 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 활성을 변화시키는 물질의 탐색방법
축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 활성을 변화시키는 물질은 ① 피검물질과 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 접촉시킨 경우의 그 단백질의 활성과, ② 피검물질을 접촉시키지 않은 경우에서의 그 단백질의 활성을 측정하고, ③ 피검물질존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교한 후, ④ 피검물질로부터 그 단백질의 활성을 변화시키는 물질을 선택함으로써 취득할 수 있다.
상기 방법으로 사용되는 축합 퓨린 유도체로는 상기 2 의 방법으로 제조되는 상기 1 의 화합물을 들 수 있고, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질로는 상기 4 [2] 의 방법으로 제조되는 상기 4 [1] 의 단백질을 들 수 있다.
그 단백질의 활성이 공지인 경우에는 공지된 방법에 준하여 그 효소의 활성을 측정할 수 있다.
예를 들어, 그 단백질로서 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하는 경우, 그 활성은 Biochem. Biophys. Acta, 1338, 47 (1977) 에 기재된 방법에 준하여 측정할 수 있다.
구체적으로는 그 단백질의 기질이 될 수 있는 NADP, NADPH 나 레티놀, 레티날, 파라클로로벤즈알데히드 등의 알코올, 알데히드 등〔Biochimica et Biophysica Acta, 1338, 47 (1997)〕등을 사용하여, 그 단백질에 의한 기질의 소실속도 또는 생성물의 생성속도를 분광광도측정, 형광광도측정, 또는 고속액체 크로마토그래피 등으로 모니터함으로써 그 단백질의 활성을 측정할 수 있다.
[7] 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성을 억제하는 물질의 탐색방법
축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성을 억제하는 물질은 상기 [6] 의 방법에 의해 얻어지는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성을 변화시키는 물질 중에서, 그 단백질의 활성을 저하시키는 물질로서 선택할 수 있다.
또한, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성을 억제하는 물질은 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기질 유도체를 조제하고, 양자의 결합을 검출하는 계에, 피검물질을 첨가하여 피검물질에 의한 그 결합의 저해를 지표로, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기질 유도체의 결합을 저해하는 화합물로서 선택함으로써 취득할 수도 있다.
구체적으로는 상기 [3] 의 방법에 의해 선택되는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 결합하는 화합물 중에서, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성을 억제하는 물질을 선택할 수 있다.
또한, ① 피검물질 존재 하, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기질 유도체의 결합량과, ② 피검물질 부재 하에서의 그 단백질과 그 단백질의 기질 유도체와의 결합량을 측정하고, ③ 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교한 후, ④ 피검물질로부터 그 단백질과 그 단백질의 기질 유도체와의 결합을 저해하는 화합물을 선택하는 방법에 의해, 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 활성을 억제하는 물질을 선택할 수도 있다.
여기서, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기질 유도체란, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기질이 될 수 있는 물질로부터 유도되는 물질이고, 구체적으로는 예를 들어 축합 퓨린 유도체 결합 단백질로서, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 사용하는 경우, 그 단백질 기질 유도체로는 NADP, NADPH 의 유도체나 레티놀, 레티날, 파라클로로벤즈알데히드 등의 알코올, 알데히드 등의 그 단백질의 기질이 될 수 있는 물질〔Biochimica et Biophysica Acta, 1338, 47 (1997)〕의 유도체를 들 수 있다.
보다 구체적인 방법으로는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질 또는 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기질 유도체 중 어느 일방의 분자를 멀티 웰 플레이트나 크로마토 담체나 라텍스 등의 비드, 표면 플라즈몬 공명 측정용 칩, 질량측정용 타깃 등의 고상에, 물리적흡착, 공유결합이나, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질에 반응하는 항체 등이나, 태그 펩티드, 마커 펩티드, 또는 시그널 펩티드에서 선택되는 펩티드를 특이적으로 인식하는 분자를 개재시킨 결합에 의해 고정화하고, 필요에 따라 비특이흡착을 억제하는 블로킹 등의 처리를 행한 후, 타방의 분자를 첨가하고, 또한 미흡착인 타방의 분자를 세정 제거 후, 타방의 분자인 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 활성, 결합특성, 표면 플라즈몬 공명의 발생, 또는 질량분석의 신호강도 등에 의해 결합된 타방의 분자를 검출함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기질 유도체의 결합량을 검출할 수 있다.
상기 [5]∼[7] 중 어느 한 방법에서 선택되는 2 개 이상의 방법을 조합함으로써 상기 [5]∼[7] 의 방법에 의해 선택된 물질의 중에서, 인슐린분비 촉진제로서 바람직한 활성을 갖는 화합물을 압축할 수도 있다. 또한, 필요에 따라, 하기 [11] 의 방법에 의해, 인슐린분비 촉진제로서 보다 바람직한 활성을 갖는 화합물을 압출할 수 있다.
인슐린분비 촉진제로서 바람직한 활성을 갖는 화합물이란, 예를 들어 인슐린분비 촉진제로서 바람직하지 못한 활성이 낮은 화합물을 말하고, 예를 들어 종래의 인슐린 촉진제가 갖는 부작용인 체중감소, 골수억제, 간장장애, 신장독성, 신경독성 등이 경감된 화합물을 들 수 있다.
[8] 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기능을 변화시키는 물질의 탐색방법
축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 기능을 변화시키는 물질은 ① 피검물질과 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 세포응답과, ② 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 세포응답을 측정하고, ③ 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교한 후, ④ 피검물질로부터 그 형질전환주의 세포응답을 변화시키는 물질을 선택함으로써 취득할 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 발현하는 형질전환체는 상기 4 [2] (2) 의 방법에 의해 조제할 수 있다.
피검물질과 그 형질전환주를 접촉시킨 경우의 그 형질전환주가 나타내는 세포응답으로는 예를 들어, 세포내 정보전달, 유전자의 전사, 당의 도입, 증식 등의 변화 등을 들 수 있고, 그들의 변화는 공지된 방법에 의해 검출할 수 있다.
보다 구체적인 세포의 응답으로는 예를 들어, 아라키돈산유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생성, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 활성화, pH 의 저하, 멜라닌 색소의 응집 또는 확산, 인슐린의 분비 촉진 등을 들 수 있다.
[9] 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질의 탐색방법
축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질은 ① 피검물질과 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량과, ② 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 측정하고, ③ 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교한 후,④ 피검물질로부터 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질을 선택함으로써 취득할 수 있다.
구체적인 방법으로는 피검물질과 접촉 및 비접촉의 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 발현하는 상기 4 [2] (2) 의 방법에 의해 조제할 수 있는 형질전환 세포의 각각으로부터 통상적인 방법에 따라서 전체 RNA 또는 폴리(A)+RNA 를 조제하고, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 DNA 로부터 조제되는 프라이머 DNA 를 사용한, RT-PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] 에 의해, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 측정하여 각각의 발현량을 비교함으로써, 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질을 취득하는 방법을 들 수 있다.
[10] 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질을 사용한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 발현량을 변화시키는 물질의 탐색방법
축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 발현량을 변화시키는 물질은 ① 피검물질과 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 그 단백질의 발현량과, ② 피검물질 부재 하에서의 그형질전환체의 그 단백질의 발현량을 측정하고, ③ 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교한 후, ④ 피검물질로부터 그 단백질의 발현량을 변화시키는 물질을 선택함으로써 취득할 수 있다.
축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 발현하는 형질전환체는 상기 4 [2](2) 의 방법에 의해 조제할 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 발현량을 측정하는 방법으로는 면역학적 정량법을 들 수 있다.
면역학적 정량법으로는 예를 들어 액상 중에서 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 반응하는 항체 중 에피토프가 다른 2 종류의 모노클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 법,125I 등의 방사성 동위체로 표지한 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 그 단백질을 인식하는 항체를 사용하는 라디오 이뮤노 어세이법 등을 들 수 있다.
축합 퓨린 유도체 결합 단백질과 반응하는 항체는 그 단백질 또는 그 단백질의 부분 단편 펩티드의 정제품을 사용하여 공지된 방법에 의해 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 등으로서 제작할 수 있다.
[11] 인슐린분비 촉진 활성 평가
인슐린분비 촉진제의 평가계로는 공지된 모든 방법을 이용할 수 있다.
동물을 사용하는 방법으로는, 예를 들어 Wistar 계 래트 등을 사용하고, 피검물질 투여시에, 경구 당 부하 시험을 하여 혈당 억제 효과는 있으나, 저혈당을 일으키지 않는 피검물질을 선택하는 방법 (WO00/01388) 등을 들 수 있다.
적출조직이나 배양세포를 사용하는 방법으로는 췌장 랑게르한스섬, 초대 배양 췌장 β세포, 배양 β세포 중, 5∼10mmol/ℓ 의 글루코오스 농도의 생리적인 변화에 따른 인슐린분비능을 나타내는 배양 β세포인 BRIN-BD11세포〔Diabetes, 45, 1132-1140 (1996)〕, INS-1 세포〔Endocrinology, 130, 167-178 (1992)〕, βTC 세포〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 9037-9041 (1988)〕, 또는 MIN6 세포〔Endocrinology, 127, 126-132 (1990)〕를 사용하여, 저글루코오스 농도로 피검물질을 첨가하여도 인슐린분비를 촉진하지 않지만 고글루코오스 농도로 피검물질을 첨가하면 고글루코오스 단독보다 인슐린분비를 촉진하는 피검물질을 선택하는 방법 (일본 공개특허공보 2000-154139호) 등을 들 수 있다.
배양 β세포주 중에서도, 췌장 β세포 MIN6 세포〔Endocrinology, 127, 126-132 (1990)〕는 인슐린함량 및 글루코오스 자극에 의한 인슐린분비량이 생체 내의 췌장 β세포에 가까워, 글루코오스 농도에 응답하여 인슐린분비가 상승하는 점에서 생체 내의 췌장 β세포의 성질을 잘 보존하고 있다〔Endocrinology, 127, 126-132 (1990), Diabetologia, 36, 1139-1145 (1993)〕. 또한, MIN6 세포는 당뇨병 치료약으로서 사용되고 있는 술포닐우레아제, 예를 들어 글리벤클라미드에 응답하여 인슐린분비가 촉진되는〔Cellular Signalling, 5, 777-786 (1993)〕점에서 보다 바람직하다.
MIN6 세포의 배양, 및 MIN6 세포를 사용한 인슐린분비 시험은 Diabetologia, 36, 1139-1145 (1993) 에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다.
또한, 화합물이 세포의 인슐린분비 활성에 미치는 영향은 이하와 같이 하여 모은 세포 배양상청 중의 인슐린량을 측정함으로써 구할 수 있다.
24 웰 플레이트로 배양한 MIN6 세포를, 2 mmol/ℓ 글루코오스를 함유하는 완충액 A〔119mmol/ℓ 염화나트륨, 4.74mmol/ℓ 염화칼륨, 2.54mmol/ℓ 염화칼슘, 1.19mmol/ℓ 황산마그네슘, 1.19mmol/ℓ 인산 2 수소칼륨, 10mmol/ℓ 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산, 0.1% 소혈청알부민 pH7.3〕1㎖ 를 사용하여 2 회 세정한 후, 1㎖ 의 2mmol/ℓ 글루코오스를 함유하는 완충액 A 중, 37℃ 에서 45 분간 인큐베이트한다. 인큐베이트 후, 배양상청을, 각종 농도의 시험화합물 및 8.4mmol/ℓ 클루코오스를 함유하는 완충액 A (1㎖) 와 교환하고, 다시 37℃ 에서 45 분간 인큐베이트하여 배양상청을 모은다. 배양상청 중에 분비된 항체 반응성의 인슐린은 1% 소혈청알부민, 0.1% Tween20, 0.12% EDTAㆍ2Na, 0.1% 아디화나트륨을 함유하는 인산완충액으로 희석한 후, 방사선 면역측정법에 의해 정량할 수 있다. 인간 인슐린을 표준물질로 하여 표준곡선을 작성하고, 그 곡선으로부터 각각의 인슐린치를 산출할 수 있다. 또한, 시험화합물 대신에 용매인 디메틸술폭시드를 첨가하였을 때에 얻어지는 인슐린치를 100% 로 하여 각각의 측정치의 상대량 (%) 을 계산할 수 있다.
[12] 본 발명의 방법으로 선택되는 인슐린분비 촉진 활성을 갖는 화합물
본 발명의 방법으로 선택되는 인슐린분비 촉진 활성을 갖는 화합물로는 하기 일반식 (Ⅴ)
[식중, R1B, R2B및 R3B는 동일하거나 다르며, 아미노기, 모노 또는 디치환 아미노기, 또는 N 을 함유하는 치환 또는 비치환의 복소환기 (그 복소환기는 N 원자로 트리아진환에 결합한다) 를 나타낸다] 로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
N 원자로 트리아진환에 결합하는 복소환기로는 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 벤조이미다졸릴, 프리닐, 피롤리디닐, 2, 5-디옥소피롤리디닐, 티아졸리디닐, 옥사졸리디닐, 2-옥소옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라히드로퀴놀릴, 테트라히드로이소퀴놀릴, 테트라히드로퀴녹살리닐, 옥타히드로퀴놀릴, 디히드로인돌릴 또는 1,3-디옥소이소인돌리닐 등을 들 수 있다.
상기 식 (Ⅴ) 의 각 기의 정의에 있어서, 치환이란 예를 들어 치환 혹은 비치환의 저급 알킬, 치환 혹은 비치환의 아르알킬, 치환 혹은 비치환의 아릴, 치환 혹은 비치환의 방향족 복소환기, 치환 혹은 비치환의 지환식 복소환기에 의한 치환 등을 의미한다.
여기에서 치환 혹은 비치환의 저급 알킬, 치환 혹은 비치환의 아르알킬, 치환 혹은 비치환의 아릴, 치환 혹은 비치환의 방향족 복소환기, 치환 및 비치환의 지환식 복소환기는, 각각 상기 식 (Ⅱ) 의 정의 중의 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 아르알킬, 치환 혹은 비치환의 아릴, 치환 혹은 비치환의 방향족 복소환기, 치환 및 비치환의 지환식 복소환기와 동일한 의미이다.
보다 구체적으로는 하기 표 2 에 기재된 화합물번호 193-200 으로 나타내는 화합물을 들 수 있다.
상기 화합물은 WO01/47921 에 기재된 방법, 및 공지된 일반적인 합성방법에 준하여 합성할 수 있는 것 외에, ChemBrige사로부터 구입할 수도 있다.
[13] 본 발명의 방법으로 선택되는 물질을 함유하는 의약
본 발명의 방법에서 선택되는 물질을 유효성분으로 함유하는 의약은, 이 유효성분을 단독으로 투여할 수도 있지만, 통상적으로는 유효성분을 약리학적으로 허용되는 1개 혹은 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조한 의약제제로서 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 물 혹은 식염, 글리신, 글루코오스, 인체 알부민 등의 수용액 등의 수성 담체에 용해한 무균적인 용액이 사용된다. 또, 제제용액을 생리적 조건에 근접시키기 위한 완충화제나 등장화제와 같은, 약리학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 락트산나트륨, 염화칼륨, 시트르산나트륨 등을 첨가할 수도 있다. 또 동결건조시켜 저장하여, 사용시에 적당한 용매에 용해시켜 사용할 수도 있다.
투여경로는 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구투여 혹은 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구투여를 들 수 있다. 투영형태로는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구투여에 적당한 제제로는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다. 예를 들어 유제 및 시럽제와 같은 액체조제물은 물, 자당, 솔비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 딸기향, 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로 사용하여 제조할 수 있다. 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은, 젖당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 아르긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탤크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로 사용하여 제조할 수 있다.
비경구투여에 적당한 제제로는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 예를 들어 주사제는 염 용액, 포도당 용액 혹은 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 조제한다. 좌제는 카카오지, 수소화지방 또는 카르복실산 등의담체를 사용하여 조제된다. 또, 분무제는 이 물질 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도점막을 자극하지 않고, 또한 이 물질을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 조제한다. 담체로서 구체적으로 젖당, 글리세린 등이 예시된다. 이 물질 및 사용하는 담체의 성질에 의해 에어로졸, 드라이파우더 등의 제제가 가능하다. 또, 이들의 비경구제에 있어서도 경구제로 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여회수는 목적으로 하는 치료효과, 투여방법, 치료기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1일 당 10㎍/㎏∼8g/㎏ 이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 실시예, 시험예에 기초하여 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
실시예 1 표지화 축합 퓨린 유도체의 합성
하기 식 (Ⅵ) 로 나타내는 화합물 16 의3H 표지체 (이하, [3H] 표지화합물 16 이라고 함) 는, WO00/01388 에 기재된 방법에 의해 합성할 수 있는 상기 표 1 의 화합물번호 23 으로 나타내는 화합물의 R체를 원료로 사용한3H-gas법에 의해 아마샴 파르마시아사에서 합성되었다.
실시예 2 췌장 β세포의 파쇄액의 조제
MIN6 세포 [Endocrinology, 127, 126-132(1990)] 을, 세포배양용 플라스크 (182㎠, 그라이너사 제조) 내에서, 37℃, 5% 탄산가스하에서, 15% 소의 태아 혈청과 5g/ℓ의 글루코오스를 함유하는 DMEM 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium ; 닛스이제약사 제조) 를 사용하여 밀집적으로 될 때까지 배양하였다. 또한 이하의 조작은 빙상에서 실행하였다.
MIN6 세포가 밀집적으로 된 후, 배지를 제거하고, 30㎖ 의 빙랭한 인산 완충생리식염액 (PBS) 으로 2회 세정하였다. 그 후, 빙랭한 Tris-HCl 완충액 [10mmol/ℓ트리스-염산 (Tris-HCl), 100mmol/ℓ염화나트륨 (NaCl), 2mmol/ℓ에틸렌디아민4아세트산 (EDTA), 10㎍/㎖ 로이펩틴 (leupeptin), 1mmol/ℓ페닐메탄술포닐플루오리드 (PMSF), pH7.4] 를 3㎖ 첨가하고, 셀 스크레퍼를 사용하여, 플라스크에 접착되어 있는 세포를 떼어내, 패스 툴 피펫으로 세포를 회수하였다. 이 조작을 다시 한번 실행함으로써, 182㎠ 플라스크에 대해 계 6㎖ 의 세포현탁액을 취득하였다. 이 세포현탁액을 호모게나이저를 사용하여 세포를 파쇄한 후, 원심분리기 Himac CF7D2 (히타치사 제조) 를 사용하여, 4℃, 10분간, 매분 3500회전으로 원심분리하고, 그 상등을 회수하여 세포파쇄액으로 하였다.
실시예 3 췌장 β세포의 막획분의 조제
실시예 2 에서 얻어진 세포파쇄액을, 원심분리기 Himac CP100α(히타치제작소사 제조), 로우터 RP50T (히타치제작소사 제조) 를 사용하여, 4℃, 30분간, 매분 35000 회전으로 원심분리한 후, 상등을 폐기하고, 남은 침전에 빙랭한 상기의 Tris-HCl 완충액을 첨가하고, 18 게이지 (테루모사 제조) 의 주사바늘을 부착한 실린지 (테루모사 제조) 를 사용하여 현탁하였다. 또한, 원심분리기 Himac CP100α, 로우터 RP50T 를 사용하여, 4℃, 30분간, 매분 35000 회전으로 원심분리한 후, 상등을 버리고, 침전에 적당량의 빙랭한 Tris-HCl 완충액을 첨가하고, 25 게이지 (테루모사 제조) 의 주사바늘을 부착한 실린지 (테루모사 제조) 를 사용하여 현탁한 것을 MIN6 세포의 막획분으로 하였다.
실시예 4 췌장 β세포의 가용화 막획분의 조제
실시예 3 의 막획분에 빙랭한 가용화 버퍼 [20mmol/ℓTris-HCl, 500mmol/ℓ염화칼륨 (KCl), 2mmol/ℓEDTA, 10㎍/㎖ 로이펩틴(leupeptin), 1mmol/ℓPSMF, 1w/v% 디기토닌 (디기토닌), pH7.4] 를 6㎖ 첨가하여 현탁하고, 호모게나이저를 사용하여 호모게나이즈한 후, 그대로 빙상에서 30분간 방치하였다. 그 후, 원심분리기 Himac CP100α, 로우터 RP50T 를 사용하여, 4℃, 60분간, 매분 35000 회전으로 원심분리함으로써 얻어진 상등을, 가용화 막획분으로서 회수하였다. 침전에는 다시 빙랭한 가용화 버퍼를 3㎖ 첨가하고, 상기의 조작을 다시 2회 반복하여,얻어진 상등을 전부 혼합하여 가용화 막획분으로 하였다.
실시예 5 췌장 β세포 및 표지화 축합 퓨린 유도체를 사용한 결합실험
세포배양용의 24 웰 플레이트 (코닝사 제조) 에 대략 밀집적인 상태로 될 때까지 배양한 MIN6 세포를, KRH 완충액 (119mmol/ℓNaCl, 4.74mmol/ℓKCl, 2.54mmol/ℓ염화칼슘 (CaCl2), 1.19mmol/ℓ황산마그네슘 (MgSO4), 1.19mmol/ℓ인산2수소칼륨 (KH2PO4), 10mmol/ℓHEPES, 2mmol/ℓ글루코오스, 0.1w/v% 소 혈청 알부민 (BSA), pH7.3) 을 사용하여, 2회 세정한 후, KRH 완충액을 1웰에 대해 1㎖ 첨가하고, 37℃ 에서 45분간 프리인큐베이션을 실행하였다. 프리인큐베이션 후, 상등을 제거하고, 0.15㎖의 KRH 완충액과 10nmol/ℓ의 [3H] 표지화합물 16, 및 1μmol/ℓ의 농도가 되도록 피험화합물을 첨가하고, 4℃ 에서 반응이 평형에 도달할 때까지 1시간 이상 인큐베이트한 후, KRH 완충액을 사용하여, 세포를 2회 세정하였다. KRH 완충액을 1웰에 대해 2㎖ 첨가하고, 실온에서 20분간 방치한 후 다시 KRH 완충액을 사용하여 세정하고, 각 웰에 남은 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터를 사용하여 측정함으로써 결합량을 구하였다.
피험화합물을 첨가하지 않은 조건하에서의 [3H] 표지화합물 16 의 결합량 (총결합량) 과 10μmol/ℓ의 화합물 16 존재하에서의 [3H] 표지화합물 16 의 결합량 (비특이적 결합량) 과의 차를 특이적 결합량으로 하였다.
도 1A 에 결합포화곡선을, 도 1B 에 개략도를 나타내었다. 이들의 도면으로부터 췌장 β세포를 사용하면 축합 퓨린 유도체에 특이적인 결합을 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, 표 3 에 각 축합 퓨린 유도체에 의한 [3H] 표지화합물 16 결합 저해 작용과 인슐린분비 촉진 활성의 측정값을, 도 2 에 이 저해 작용과 인슐린분비 촉진 작용의 상관관계를 나타내었다. 양 작용의 상관계수는 0.679 이고, 유의한 상관관계가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 6 췌장 β세포의 막획분 및 표지화 축합 퓨린 유도체를 사용한 결합실험
세포배양용의 24 웰 플레이트 (코닝사 제조) 에, 막획분 (150㎍/㎖), [3H] 표지화합물 16, 및 방사표지되어 있지 않은 피험화합물을 함유하는 실시예 2 에 기재된 Tris-HCl 완충액을 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트하였다. 다음에 하베스타 Filtermate 196-UniFilter 24 (Packard사 제조) 를 사용하여 흡인여과함으로써, UniFilter-24GF/B filter plate (Packard사 제조) 상에 막획분을 회수하고, 이 막획분을 1㎖ 의 세정 버퍼 (10mmol/ℓTris-HCl, 100mmol/ℓNaCl, 2mmol/ℓEDTA, 0.1w/v% BSA, pH7.4) 를 사용하여 4회 세정한 후, 건조시키고 나서, 마이크로신티20 (Packard사 제조) 를 150㎕/well 첨가하고, Microplate Sintillation Counter Top Count (Packard사 제조) 를 사용하여 방사활성을 측정하였다. 화합물 16 의 무첨가시의 방사활성을 총결합량, 화합물 16 을 10μmol/ℓ첨가했을 때의 방사활성을 비특이적 결합량으로 하여, 총결합량으로부터 비특이적 결합량을 뺀 나머지를 특이적 결합량으로 하였다.
도 3A 에 결합포화곡선을, 도 3B 에 개략도를 나타내었다. 이들의 결과로부터, 췌장 β세포의 막획분을 사용함으로써, 축합 퓨린 유도체에 특이적인 결합을 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다. 도 4 에 축합 퓨린 유도체에 의한 [3H] 표지화합물 16 결합 저해 작용과 인슐린분비 촉진 작용의 상관관계를 나타내었다. 양 작용의 상관계수는 0.705 이고, 유의한 상관관계가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 7 췌장 β세포의 가용화 막획분을 사용하는 결합실험
가용화 막획분을 단백질 농도 500㎍/㎖ 로 사용한 것 이외에는, 상기 실시예6 과 동일한 방법으로 실험하였다. 또, 용해액을 목적하는 농도로 조제할 때, 계면활성제를 함유하지 않은 가용화 완충액을 사용하여, 용해액에 함유되는 계면활성제의 농도를 0.1w/v% 가 되도록 희석하였다. 따라서 인큐베이션액의 조성은 0.1w/v% 의 디기토닌, 20mmol/ℓTris-HCl, 500mmol/ℓKCl, 2mmol/ℓEDTA, 10㎍/㎖ 로이펩틴 (leupeptin), 1mmol/ℓPMSF, pH7.4 이었다.
화합물번호 16 으로 나타내는 화합물의 무첨가시의 방사활성을 총결합량, 이 화합물을 10μmol/ℓ첨가했을 때의 방사활성을 비특이적 결합량으로 하여, 총결합량으로부터 비특이적 결합량을 뺀 나머지를 특이적 결합량으로 하였다.
도 5 에 총결합량과 비특이적 결합량을 나타내었다. 이 결과로부터, 췌장 β세포의 가용화 막획분을 사용함으로써, 축합 퓨린 유도체의 특이적 결합을 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 8 인슐린분비량의 측정
MIN6 세포의 배양 및 MIN6 세포를 사용한 인슐린분비 시험은 Diabetorogia, 36, 1139-1145(1993) 에 기재된 방법에 준하여 실행하였다.
즉, 14.5mmol/ℓ의 글루코오스 존재하에 있어서, 화합물이 인슐린분비 활성에 부여하는 영향을, 이하와 같이 하여 모은 세포 배양 상등 중의 인슐린량을 측정함으로써 평가하였다.
24 웰 플레이트에서 배양한 MIN6 세포를, 2mmol/ℓ의 글루코오스를 함유하는 완충액 A [119mmol/ℓNaCl, 4.74mmol/ℓKCl, 2.54mmol/ℓCaCl2, 1.19mmol/ℓMgSO4,1.19mmol/ℓKH2PO4, 10mmol/ℓ2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산, 0.1% BSA, pH7.3] 1㎖ 를 사용하여 2회 세정한 후, 1㎖ 의 2mmol/ℓ글루코오스를 함유하는 완충액 A 중, 37℃ 에서 45분간 인큐베이트한 후, 배양 상등을, 각종 농도의 시험화합물 및 8.4mmol/ℓ글루코오스를 함유하는 완충액 A (1㎖) 와 교환하고, 다시 37℃ 에서 45분간 인큐베이트하여 배양 상등을 모았다.
배양 상등 중에 분비된 항체반응성의 인슐린은 1% BSA, 0.1% Tween20, 0.12% EDTAㆍ2Na, 0.1% 아지화 나트륨을 함유하는 인산 완충액으로 희석한 후, 방사선 면역측정법 [Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology, Vol. 2A, 2B, North-Holland Publishing Co., Amsterdam(1973)] 에 의해 정량하였다. 인체 인슐린을 표준물질로 하여 표준곡선을 작성하고, 그 곡선으로부터 각각의 인슐린값을 산출하였다.
실시예 9 미생물의 배양액을 탐색원으로 한 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색 방법
실시예 6 에 기재된 방법에 따라 췌장 β세포의 막획분을 사용하여 미생물의 배양액으로부터 당뇨병 작용을 가진 물질을 선택할 수 있다.
토양으로부터 평판희석법을 사용하여 단리한 미생물을, 0.5% 글루코오스, 3.0% 가용성 전분, 2.0% 대두분, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 콘스티플리커, 0.3% 탄산칼슘 (CaCO3) (스팀(steam) 전 pH7.2) 으로 이루어지는 배지를 넣은 시험관 내에서 28℃, 4일간 교반기상에서 배양한다. 배양 종료후, 배양액과 동량의 디메틸술폭시드를 첨가하여 충분히 교반하고, 원심분리기에 의해 고형분과 상등액으로 분리한다. 상등액 2㎕ 을, 실시예 6 에 기재한 췌장 β세포의 막획분 0.15㎖ 및 10mmol/ℓ의 [3H] 표지화합물 16 을 함유하는 용액에 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트한다. 동시에 배양 상등액 대신에 50% 디메틸술폭시드를 첨가한 췌장 β세포의 막획분 0.15㎖ 및 10mmol/ℓ의 [3H] 표지화합물 16 을 함유하는 용액, 및 추가로 이 용액에 10μmol/ℓ의 비표지의 화합물 16 을 첨가한 용액을 작성하고, 동일한 방법으로 인큐베이트한다.
인큐베이션 종료 후, 실시예 6 에 기재된 방법에 의해 막획분의 회수, 세정, 막에 남은 방사활성을 측정하였다. 비표지의 화합물 16 을 첨가한 경우에 얻어지는 방사활성을 비특이적 결합량, 비표지의 화합물 16 을 첨가하지 않은 경우의 방사활성을 총결합량으로 하여, 실시예 6 에 기재된 방법으로, 각각의 특이적 결합량을 계산한다. 계산된 특이적 결합량을 이용하여, 이하의 식으로부터 각각의 배양 상등액의 결합 저해율을 구할 수 있다.
결합저해율 (%) = (50% 디메틸술폭시드 존재하의 특이적 결합량-배양 상등액 존재하의 특이적 결합량)/50% 디메틸술폭시드 존재하의 특이적 결합량 ×100
실시예 10 화합물 라이브러리를 탐색원으로 사용한 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색 방법
실시예 5 에 기재된 방법에 따라, 췌장 β세포와 [3H] 표지화합물 16 의 결합에 대한 저해 작용을 지표로 하여 항당뇨병 작용을 갖는 물질을 탐색하였다.피검물질은 디메틸술폭시드에 용해하고, 최종농도가 1μmol/ℓ가 되도록 첨가하였다. 비표지의 화합물 16 을 첨가한 경우에 얻어지는 방사활성을 비특이적 결합량, 비표지의 화합물 16 을 첨가하지 않은 경우의 방사활성을 총결합량으로 하여, 실시예 6 에 기재된 방법으로, 각각의 특이적 결합량을 계산하고, 이하의 식을 사용하여 결합저해율을 구하였다.
결합저해율 (%) = (50% 디메틸술폭시드 존재하의 특이적 결합량-배양 상등액 존재하의 특이적 결합량)/50% 디메틸술폭시드 존재하의 특이적 결합량 ×100
7000 종의 화합물을 탐색한 결과, 10μmol/ℓ로 84% 저해율을 나타내는, 하기 식 (Ⅶ) 에 기재한 구조를 갖는 화합물을 선택할 수 있었다.
식 (Ⅶ) 으로 나타내는 구조를 갖는 화합물 (표 4 의 화합물번호 193 으로 나타내는 화합물. 이하 화합물 193 이라고 함) 의 인슐린분비 촉진 작용을, 실시예 8 에 기재된 방법에 의해 측정하였다. 그 결과, 이 화합물의 인슐린분비 촉진량은 화합물 16 에 의한 분비촉진량을 100% 로 한 경우, 195% 이었다 (표 4).
또, 화합물 193 의 유사체인, 하기 표 4 의 화합물번호 194∼199 로 나타내는 화합물은 10μmol/ℓ의 농도에 있어서, 화합물번호 200 으로 나타내는 화합물은1μmol/ℓ의 농도에 있어서 인슐린분비 촉진 활성이 관찰되었다 (표 4).
이상과 같은 점에서 본 발명의 탐색방법의 유용성이 나타났다.
상기 화합물은 ChemBrige사로부터 입수한 것 외에, WO01/47921 에 기재된 방법 및 공지된 일반적인 합성방법에 준하여 합성하였다.
실시예 11 축합 퓨린 유도체 고정화 입자의 제작
축합 퓨린 유도체로서, 상기 표 1 중의 화합물번호 155 로 나타내는 화합물을 선택하여 이하의 실험에 사용하였다.
1㎖ 의 NHS-activated Sepharose 입자 현탁액 (아마샴 파르마시아 바이오텍사 제조) 을 원심분리 (1,000rpm, 1분간, 실온) 하여, 상등을 제거한 펠릿에 5㎖ 의 THF 를 첨가하여 입자를 분산시킨 후, 입자를 원심분리하여 상등을 제거하였다. 이 조작을 3회 반복하였다.
용매를 THF 로 교환한 500㎕ 의 NHS-activated Sepharose 입자의 펠릿에, 화합물 196 의 용액을 첨가하여 NHS-activated Sepharose 입자를 분산시켰다. 이 때의 용매는 THF, 체적은 500㎕, 화합물 155 의 농도는 6mmol/ℓ이었다. 가끔 교반하면서 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응 종료 후, 입자를 원심분리 (1,000rpm, 1분간, 실온) 하여 상등을 제거하였다.
미반응의 화합물 155 를 제거하기 위해, 5㎖ 의 THF 를 첨가하여 입자를 분산시킨 후, 입자를 원심분리 (1,000rpm, 1분간, 실온) 하여 상등을 제거하는 조작을 3회 반복하였다. 미반응의 입자상의 반응점을 불활화하기 위해, 200mmol/ℓ의 모노에탄올아민을 함유하는 THF 용액을 5㎖ 첨가하여 입자를 분산시키고, 10분간 정치하였다. 반응 종료 후, 원심분리 (1,000rpm, 1분간, 실온) 하여 상등을 제거하였다. 미반응의 모노에탄올아민을 제거하기 위해, 5㎖ 의 THF 를 첨가하여 입자를 분산시킨 후, 입자를 원심분리 (1,000rpm, 1분간, 실온) 하여 상등을 제거하는 조작을 3회 반복하였다.
이와 같이 하여 얻어진 화합물 155 고정화 입자를 500㎕입자/㎖ 가 되도록 THF 에 분산시킨 후, 차광조건하에서 4℃ 에서 보존하였다.
실시예 12 세포추출액의 조제
마우스 췌장 β세포주 MIN6 의 배양은, 425㎖ 의 둘베코 변법 이글 배지 (닛스이제약사 제조) 에, FBS 를 75㎖, 7.5% 탄산수소나트륨 (NaHCO3) 을 8.5㎖, 200mmol/ℓ의 L-글루타민을 5㎖, 페니실린 (Penicillin)-스트렙토마이신 (Streptomycin) (각각 10000units/㎖ 및 10㎎/㎖ 의 혼합액) 을 2.5㎖ 를 첨가한 배지 중에서 디쉬를 사용하여, 5% CO2하, 37℃ 의 인큐베이터 내에서 정치배양에 의해 실행하였다.
MIN6 이 밀집적으로 된 후, 세포를 37℃ 의 PBS 로 2 회 세정하고, 4℃ 의 완충액 A [20mmol/ℓ HEPES (pH7.4), 2mmol/ℓEDTA, 1mmol/ℓPMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌] 로 세포를 떼어내었다. 4℃ 에서 30분간, 로테이터로 천천히 교반하였다. 그 후, 원심분리 (12000rpm, 5분간, 4℃) 에 의해 불용성 획분을 침전시켜 상등을 가용획분으로 하였다. 펠릿을 1㎖ 의 완충액 B [20mmol/ℓ HEPES (pH7.4), 2mmol/ℓEDTA, 150mmol/ℓNaCl, 1% 디기토닌, 1mmol/ℓPMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌] 에 현탁하고, 4℃ 에서 30분간, 로테이터로 천천히 교반하였다. 그 후, 원심분리 (12000rpm, 5분간, 4℃) 에 의해 불용성 획분을 침전시켜 상등을 가용화 막획분으로 하였다. 이 방법으로 단백질 농도 약 3㎎/㎖ 의 가용 획분과 가용화 막획분이 얻어졌다. 가용 획분, 가용화 막획분은 -80℃ 에서 보존하였다.
실시예 13 축합 퓨린 유도체 결합 단백질의 취득
실시예 12 에서 제작한 MIN6 의 가용화 막획분을 완충액 B 로 10 배로 희석한 1㎖ 에 500μmol/ℓ의 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물 (이하, 화합물 16 이라고 함) 을 첨가하고, 4℃ 에서 2시간 완만하게 교반하였다. 대조로서 화합물 16 을 첨가하지 않은 MIN6 의 가용화 막획분을 완충액 C [20mmol/ℓ HEPES (pH7.4), 2mmol/ℓEDTA, 150mmol/ℓNaCl, 1% 디기토닌, 1mmol/ℓPMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌] 로 10배로 희석한 용액 1㎖를 4℃ 에서 2시간 천천히 교반하였다. 다음에 화합물 16 을 첨가한 가용화 막획분 및 피검물질을 첨가하지 않은 가용성 막획분 용액에 실시예 8 에서 제작한 화합물번호 155 로 나타내는 화합물을 고정화한 입자 (이하 화합물 155 고정화 입자라 함) 를 첨가하고, 4℃ 에서 30분간 완만하게 교반하였다. 그 후, 원심분리 (12000rpm, 1분간, 4℃) 에 의해 입자를 침전시켜 상등을 제거하였다. 다음에 완충액 C 를 750㎕ 첨가하고, 3초간 교반하여, 원심분리 (12000rpm, 1분간, 4℃) 에 의해 입자를 침전시켜 상등을 제거하였다. 다음에 완충액 D [20mmol/ℓ HEPES (pH7.4), 2mmol/ℓEDTA] 를 750㎕ 첨가하고, 3초간 교반하여, 원심분리 (12000rpm, 1분간, 4℃) 에 의해 입자를 침전시켜 상등을 제거하였다. 그 후, β-메르캅토에탄올을 함유하는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 샘플 버퍼를 30㎕ 첨가하고, 화합물 155 고정화 입자에 결합되어 있는 단백질의 용출을 실행하여, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 실행하였다. 화합물 16 을 첨가한 세포추출액으로부터의 화합물 155 고정화 입자에 의한 정제로, 화합물 16 으로 나타내는 화합물에 의해 화합물 155 고정화 입자로의 특이적 결합이 저해되는 p31 단백질을 발견하였다.
SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 분리한 p31 단백질을 겔로부터 잘라내, 25mmol/ℓ 트리스 염산 완충액 (pH8.5) 중에서 0.3㎍ 의 리딜엔드펩티다아제 (와코쥰야쿠사 제조) 와 함께 37℃ 에서 13시간 반응시켰다. 리딜엔드펩티다아제 소화로 얻어진 펩티드 단편을 함유하는 반응 상등을 회수하고, 역상 HPLC 로 펩티드를 분리하였다. 컬럼은 Magic C18 (0.2㎜ I.D.×5㎝, Michrom BioResources사 제조) 를 사용하고, 아세토니트릴 농도를 5% 내지 60% 까지 직선적으로 상승시키는 그라젠트에 의해 펩티드를 용출시켰다. 분리한 펩티드는 튜브에 분취하고, 기상 프로테인 시퀀서 Procise 492cLC (Applied Biosystems사 제조) 에 의해 아미노산 서열을 결정하였다. 결정한 아미노산 서열을 서열번호 11 로 나타내었다.
리딜엔드펩티다아제 소화 후의 p31 단백질을 함유하는 겔편은, 다시 100mmol/ℓ트리스 염산 완충액 (pH8.8) 중에서 0.3㎍ 의 트립신 (시퀀스 그레이드, 로슈 다이어그노스틱사 제조) 와 함께 37℃ 에서 13시간 반응시켰다. 트립신 소화에서 얻어진 펩티드 단편은, 상기와 동일한 방법에 의해 역상 HPLC 로 분리하고, 그 아미노산 서열을 결정하였다. 결정한 아미노산 서열을 서열번호 12 로 나타내었다.
서열번호 11 및 12 로 나타낸 아미노산 서열은, PIR 단백질 데이터베이스에 대해 상동성 검색을 실시한 결과, 서열번호 2 로 나타낸 마우스 NADPH 의존성 레티놀 디히드로게나아제/리덕타아제 유래의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 199번째의 아미노산 잔기로부터 209번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 및 N 말단으로부터 34번째의 아미노산 잔기로부터 40번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열에 일치하는 것을 확인하였다.
실시예 14 p31 단백질의 조제
[1] 마우스 췌장 β세포주 (MIN6) 로부터 p31 cDNA 클론화와 His-p31 단백질 발현 플라스미드의 조성
마우스 췌장 β세포주 (MIN6) 에서 추출된 전체 RNA 를 주형으로 하고, 올리고 dT 를 프라이머로 하여 1개 사슬 cDNA 를 합성하였다. 이 1개 사슬 cDNA 를 주형으로 하여, 전장 p31 단백질을 코드하는 유전자 부분을 연쇄 중합 반응(Polymerase Chain Reaction ; PCR) 법을 이용하여 조제하고, NOVAGEN사에서 구입한 대장균 발현 벡터 pET-14b 에 삽입함으로써, N 말단에 His 태그가 부착된 His-p31 단백질 발현 플라스미드를 구축하였다. 이하 상세하게 설명한다.
MIN6 세포로부터, 통상적인 방법 [Biochemistry, 18, 5294(1977)] 에 따라 추출한 전체 RNA 1㎍ 으로부터, 1개 사슬 cDNA 합성 키트인 SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR (GIBCO BRL사 제조) 를 이용하여, 올리고 dT 를 프라이머로 하여 1개 사슬 cDNA 를 합성하였다. 상기에서 얻은 1개 사슬 cDNA 의 0.4% 를 PCR 의 주형으로서 사용하였다.
PCR용의 프라이머 세트로서는 GENSET사에서 합성된 서열번호 7 및 8 로 나타내는 염기서열로 이루어지는 합성 DNA 를 사용하였다.
서열번호 7 로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA 에는 NdeI 사이트가, 서열번호 8 로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA 에는 BamHI 사이트가 도입되도록 디자인하였다.
PCR 은 Pyrobest DNA Polymerase (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 실행하였다. 반응액은, 이 폴리멜라아제의 사용설명서에 따라 조제하고, GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) 를 사용하여, 95℃ 에서 5분간 인큐베이트한 후, 94℃ 에서 30초간, 65℃ 에서 1분간, 72℃ 에서 2분간의 반응을 30 사이클을 실행한 후, 다시 72℃ 에서 7분간 인큐베이트함으로써 반응을 실행하였다. 반응 종료 후, DNA 정제 키트인 Prep-A-Gene DNA Purification Systems (BIO-RAD사 제조) 를 사용하여 DNA 를 정제하였다.
상기 DNA 를, NEB2 완충액 (New England Biolab 사 제조) 10㎕에 용해하고, 10단위의 NdeI 및 10단위의 PstI 를 첨가하고, 37℃ 에서 2시간 소화반응하였다. 이 반응액을 아가로스겔 전기영동 후, 약 0.8kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
pET-14b 1㎍ 을 NEB2 완충액 20㎕ 에 용해하고, 20단위의 NdeI 와 20 단위의 PstI 를 첨가하고, 37℃ 2시간 소화반응하였다. 이 반응액을 아가로스겔 전기영동 후, 약 3.4kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
pET-14b 1㎍ 을 NEB2 완충액 20㎕ 에 용해하고, 20단위의 PstI 와 20 단위의 BamHI 를 첨가하고, 37℃ 에서 2시간 소화반응하였다. 이 반응액을 아가로스겔 전기영동 후, 약 1.3kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
상기에서 얻어진, PCR 로 증폭한 DNA 유래의 NdeI-BamHI 단편 (0.8kb) 0.1㎍, pET-14b 유래의 NdeI-PstI 단편 (3.4kb) 0.03㎍ 및 PstI-BamHI 단편 (1.3kb) 0.05㎍ 을 T4DNA 리가아제 완충액 10㎕ 에 용해하고, T4DNA 리가아제 400 단위를 첨가하여, 16℃ 에서 16 시간 결합 반응을 실행하였다.
이 반응액을 사용하여 대장균 BL21주 (Stratagene사 제조) 를 코엔 등의 방법에 의해 형질전환하여 형질전환체를 취득하였다. 이 형질전환주가 보유하는 플라스미드를 공지된 방법에 준하여 단리하고, 그 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다. 이 플라스미드를 pET-14b-p31 이라 명명하였다.
상기에서 취득된, 플라스미드 pET-14b-p31 의 염기서열을 어플라이드 바이오시스템즈사의 염기서열 결정 키트 (BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0) 를 사용하여 결정하였다.
그 결과, 본 실시예에서 클로닝된 유전자는, 서열번호 2 로 나타내는 260 아미노산으로 이루어지는 단백질을 코드하고 있고, 이 아미노산 서열은 GeneBank Accession No. AB045132.1 에 기재되어 있는 마우스 유래의 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 것이 밝혀졌다.
[2] 대장균에 의한 마우스 His-p31 단백질의 발현
상기 [1] 에서 취득된 플라스미드 pET-14b-p31 을 대장균 BL21 주에 코엔 등의 방법에 의해 형질전환하고, 형질전환주 BL21/pET-14b-p31 을 취득하였다. BL21/pET-14b-p31 은 암피실린 함유 L-broth [10g/ℓ박토(Bacto)-트립톤 (DIFCO사 제조), 5g/ℓ효모 추출물 (DIFCO사 제조), 5g/ℓNaCl, 75㎍/㎖ 암피실린] 5㎖ 가들어간 15㎖ 용량의 시험관에서, 37℃에서 8시간 진탕 배양 (220rpm) 하였다. 다음에 암피실린 함유 L-broth 50㎖ 가 들어간 300㎖ 용량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에, 상기 배양액을 2.5㎖ 첨가한 후, 37℃ 에서 0D (590㎚) 가 1.0 이 될 때까지 진탕 배양 (220rpm) 하고, 4℃ 에 보존하였다. 다음에 암피실린 함유 L-broth 500㎖ 가 들어간 2개의 2L 용량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에, 상기 배양액을 20㎖ 씩 첨가하고, 37℃ 에서 통기 교반 배양 (220rpm) 하고, 0D (590㎚) 가 0.9 에 도달한 시점에서 발현유도제인 IPTG (이소프로필-β-D-티오가락토피라노시드) 를 0.2mmol/ℓ가 되도록 첨가하고, His-p31 단백질의 발현을 유도하였다. 발현 유도 후 4시간에 배양을 종료하고, 배양액을 원심분리하여, 약 6.6g (습윤중량) 의 균체를 취득하였다.
[3] 마우스 His-p31 의 정제
실시예 5 에서 얻은 배양균체로부터 마우스 His-p31 의 정제는 전부 0∼4℃ 의 조건하에서 이하의 방법으로 실행하였다.
상기 [2] 에서 얻어진 배양균체 6.6g (습윤중량) 을, 20㎖ 의 호모게나이즈 용액 (20mmol/ℓ인산나트륨 완충액, 500mmol/ℓNaCl, 5mmol/ℓ이미다졸, 10mmol/ℓ디티오스레이톨, pH7.4) 에 현탁 후, 초음파 파쇄기 (이에다무역사 제조, Vibra-Cell, 진폭 레벨 70) 로 5초간, 10회 정도 대장균을 파쇄하여 얻어진 파쇄액을, 9,000rpm 으로 15분간 원심분리하고, 상등을 필터 여과 (MILLIPORE사 제조, Millex-GV, 0.22㎛) 하고, 여과액을 하기의 조건에 의한 금속 킬레이트 어피니티 크로마토그래피로 정제하였다.
금속 킬레이트 어피니티 크로마토그래피 조건
컬럼 : 200mmol/ℓ황산아연 수용액을 24㎖/시간의 유속으로 20분간 흘려보낸 후, 6㎖/시간의 유속으로 2시간 흘려보냄으로써, 아연을 배위시킨 Chelating Sepharose Fast Flow (아마샴 파르마시아 바이오텍사 제조, 10×100㎜)
용출액 : A액 (20mmol/ℓ인산나트륨 완충액, 500mmol/ℓNaCl, 5mmol/ℓ이미다졸, pH7.4) 1000㎖, B액 (20mmol/ℓ인산나트륨 완충액, 500mmol/ℓNaCl, 500mmol/ℓ이미다졸, pH7.4) 1000㎖
유속 : 6㎖/시간
용출 : A 액으로부터 B 액의 직선 농도구배 용출
용출액은 1.3㎖ 씩 분획하고, 각 획분을 메르캅토에탄올 환원하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분석하고, 분자량 31 킬로 달톤 부근의 마우스 His-p31 의 밴드를 포함하는 획분을 모아, 아연 킬레이트 크로마토그래피 마우스 His-p31 획분으로 하였다.
아연 킬레이트 크로마토그래피 마우스 p31 획분을 탈염처리하였다. 탈염처리는 하기의 조건에서 실행하였다.
탈염처리조건
컬럼 : PD-10 (아마샴 파르마시아 바이오택사 제조)
용출액 : 400mmol/ℓ인산칼륨 완충액 (pH7.4)
용출액은 0.5㎖ 씩 분획하고, 각 획분을 메르캅토에탄올 환원하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분석하고, 분자량 31 킬로 달톤 부근의 마우스 His-p31의 밴드를 함유하는 획분을 모아, PD-10 마우스 His-p31 획분으로 하였다. 취득한 His-p31 의 SDS-PAGE 에 의한 해석결과를 도 6 에 나타낸다.
[4] 마우스 His-p31 의 구조 확인
상기 [3] 에서 취득한 마우스 His-p31 단백질은, N 말단의 히스타진 태그를 트롬빈 소화에 의해 제거한 후에 N 말단 아미노산 서열을 해석하였다. 즉 약 10㎍ 의 His-p31 에 대해 100mU 의 바이오틴 수식 트롬빈 (Biotinylated human thrombin, Novagen사 제조) 을 첨가하고, 반응액 (20mmol/ℓTris-HCl 완충액, pH8.4, 1.5mol/ℓNaCl, 2.5mmol/ℓCaCl2) 중에서 20℃, 15시간 반응시켰다. 반응액을 2-메르캅토에탄올 환원하에서 SDS-PAGE 를 실행한 후, J. Biol. Chem., 262, 10035-10038 (1987) 에 기재된 방법에 따라, PVDF막 (ProBlott, Applied Biosystems사 제조) 으로 전기적으로 전사하였다. 전사한 막을 쿠마시 블루 염색하고, 분자량 약 31kDa 의 밴드를 절단하고, 기상 프로테인 시퀀서 (PPSQ-10, 시마쯔제작소 제조) 를 사용하여 메이커 권장의 방법에 의해 N 말단 아미노산 서열을 해석하였다. 얻어진 아미노산 서열은 서열번호 9 로 나타내는 바와 같이, 유전자 서열로부터 추정되는 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1잔기째로부터의 서열에 일치하였다. 서열번호 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 1잔기째부터 3잔기째까지가 pET-14b 벡터 유래, 4잔기째 이후의 서열이 마우스 p31 유래의 아미노산 서열과 일치하고 있는 것을 확인하였다.
실시예 15 p31 단백질을 사용한 결합실험
실시예 14 에서 정제한 His-p31 을 사용한 결합실험을 이하와 같이 실행하였다.
센서 칩 CM5 (BIAcore사 제조) 를 BIAcore2000 (BIAcore사 제조) 에 세트하고, 이 센서 칩을 HBS-EP 버퍼 (100mmol/HEPES, 5mol/ℓNaCl, 500mmol/ℓEDTA, 0.005% Polysorbate 20(v/v), pH7.4, 0.22㎛ 필터여과) 를 사용하여, 첨부된 매뉴얼에 따라 10℃ 에서 평형화하였다.
리간드 고정화용 EDC 시약 (N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드, BIAcore사 제조) 및 NHS 시약 (N-히드록시숙신이미드, BIAcore사 제조) 를 50㎕씩 혼합하고, 70㎕을 센서 칩 상에 유속 10㎕/분으로 유입시켜 칩 표면을 활성화하였다. 고정화용 버퍼 (20mmol/ℓ탄산나트륨 버퍼, pH8.5) 에 상기 표 1 중의 화합물번호 155 로 나타내는 화합물을 100㎍/㎖ 의 농도가 되도록 용해하고, 유속 10㎕/분으로 센서 칩 상에 주입하고, 약 50RU 가 될 때까지 고정화하였다.
다음에 70㎕ 의 1mol/ℓ에탄올아민을 유속 10㎕/분으로 주입하고, 센서 칩 상의 미반응인 카르복실기를 반응시킨 후, 10㎕ 의 100mmol/ℓ염산으로 2회 세정하였다.
HBS-EP 버퍼에 상기 실시예 12 에서 정제한 마우스 His-p31 을 100nmol/ℓ의 농도로 용해한 용액을 His-p31 용액, His-p31 용액에 피검물질 농도가 500μmol/ℓ가 되도록 각 피검물질 용액을 첨가한 것을 His-p31/피검물질 용액으로서 결합실험에 사용하였다. 또, 상기 표 1 중의 화합물번호 16, 17, 36, 38, 103 또는 144로 나타내는 화합물을 각각 50mmol/ℓ의 농도가 되도록 디메틸술폭시드 (DMSO) 에 용해한 용액, 및 표 1 중의 화합물번호 94 또는 183 으로 나타내는 화합물을 각각 10mmol/ℓ의 농도가 되도록 DMSO 에 용해한 용액을 피검물질 용액으로 사용하였다.
피검물질 용액을 유속 20㎕/분으로 300초간 센서 칩에 유입시켜, 유입 종료 15초 후의 결합량 (RU) 을 측정하였다. 센서 칩 표면은, 2mol/ℓ구아니딘-염산 (Guanidine-HCl) 및 10mmol/ℓ글리신-염산 (Glycine-HCl) 을 각 120초씩 유입하고 재생시켰다.
p31 용액 유입 전의 결합량 (RU) 을 100%, 피검물질용액 대신에 DMSO 를 첨가한 His-p31 용액을 유입했을 때의 결합량 (RU) 을 0% 로 하여, His-p31/피검물질용액을 유입했을 때의 결합량 (RU) 으로부터, 각 피검물질에 의한 His-p31 과 고정화된 화합물 155 와의 결합저해율 (%) 을 환산하였다.
각 피검물질의 His-p31 과 고정화된 화합물번호 155 로 나타내는 화합물과의 결합저해율 (%) 과, 시험예 1 에 기재된 방법으로 측정한 각 피검물질의 인슐린분비 촉진 활성의 상관관계를 도 7 에 나타내었다. 피검물질의 His-p31 과 고정된 화합물번호 155 로 나타내는 화합물과의 결합저해율과, 이 물질의 인슐린분비 촉진 활성의 상관계수는 0.78 로, 유의한 상관관계가 있는 것을 알 수 있었다.
또한 상기 피검물질은, WO00/01388, WO01/47931 에 기재된 방법에 준하여 합성하였다.
실시예 16 세포추출액과 화합물번호 155로 나타내는 화합물을 고정화한 입자를 사용한 인슐린분비 촉진제의 탐색
실시예 12 에서 제작한 MIN6 의 가용화 막획분을 완충액 B 로 10배로 희석한 용액 1㎖ 에, 500μmol/ℓ의 피검물질 (화합물번호 16 또는 17 로 나타내는 화합물) 을 첨가하여, 4℃ 에서 2시간 천천히 교반하였다. 대조로서 피검물질을 첨가하지 않은 MIN6 의 가용화 막획분을 완충액 C (20mmol/ℓHEPES (pH7.4), 2mmol/ℓEDTA, 150mmol/ℓNaCl, 1% 디기토닌, 1mmol/ℓPMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌] 으로 10배로 희석한 액 1㎖ 를 4℃ 에서 2시간 천천히 교반하였다. 다음에 피검물질을 첨가한 가용화 막획분 및 피검물질을 첨가하지 않은 가용성 막획분 용액에 실시예 8 에서 제작한 화합물번호 155 로 나타내는 화합물을 고정화한 입자 (이하, 화합물 155 고정화 입자라고 함) 를 첨가하고, 4℃ 에서 30분간 천천히 교반하였다. 그 후, 원심분리 (12000rpm, 1분간, 4℃) 에 의해 입자를 침전시켜 상등을 제거하였다. 다음에 완충액 C 를 750㎕ 첨가하고, 3초간 교반하여, 원심분리 (12000rpm, 1분간, 4℃) 에 의해 입자를 침전시켜 상등을 제거하였다. 다음에 완충액 D [20mmol/ℓ HEPES (ph7.4), 2mmol/ℓEDTA] 를 750㎕ 첨가하고, 3초간 교반하고, 원심분리 (12000rpm, 1분간, 4℃) 에 의해 입자를 침전시켜 상등을 제거하였다. 그 후, β-메르캅토에탄올을 함유하는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 샘플 버퍼를 30㎕ 첨가하고, 화합물 155 고정화 입자에 결합되어 있는 단백질의 용출을 실행하고, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 실행하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다.
피험화합물을 첨가하지 않은 대조실험에서는 p31 단백질의 밴드를 확인할 수 있지만, 피검물질 화합물 16 을 첨가한 실험에서는 p31 단백질의 밴드는 확인할 수없기 때문에, 화합물 155 고정화 입자와 p31 단백질과의 결합을 화합물 16 이 저해하는 것을 나타내고 있다. 한편, 화합물 17 을 피검물질로서 사용한 실험에서는, p31 단백질의 밴드는 확인할 수 있기 때문에, 화합물 155 고정화 입자와 p31 단백질의 결합을 화합물 17 이 저해할 수 없는 것을 나타내고 있다.
실시예 17 His-p31 단백질을 사용한 인슐린분비 촉진제의 탐색 (1)
96 웰 플레이트를 사용한 결합경합실험
실시예 12 에서 조제한 His-p31 단백질 10㎍ 을 함유하는 PBS 용액 100㎕ 을 96 웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 4℃, 하룻밤 정치하여 흡착시키고, 1% BSA/PBS 300㎕ 을 각 웰에 첨가하고, 4℃, 1시간 정치하여 블로킹한다.
플루오레세인이소티오시아네이트 (FITC) 로 라벨화된 화합물번호 155 로 나타내는 화합물 (이하, FITC 라벨 화합물 155 라고 함) 은, 시판되는 NHS-플루오로세인과 상기 표 1 중의 화합물번호 155 로 나타내는 화합물을 DMSO 중, 실온에서 3시간 혼합함으로써 조제할 수 있다.
100μmol/ℓ의 피검물질의 존재하 또는 부재하, 5μmol/ℓ의 FITC 라벨 화합물 155 100㎕ 과 상기 His-p31 단백질을 접촉시켜, 상등 제거 후, 0.05% Tween20 을 함유하는 PBS 로 세정하고, 잔존하는 FITC 라벨 화합물 155 를 형광 플레이트 리더로 측정함으로써, 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과의 결합을 저해하는 작용을 갖는 물질을 선택할 수 있다.
이 물질의 인슐린분비 촉진 활성은 상기 실시예 8 의 방법에 의해 확인할 수 있다.
실시예 18 His-p31 단백질을 사용한 인슐린분비 촉진제의 탐색 (2)
킬레이트세파로오스비드를 사용한 결합경합실험
실시예 14 에서 조제한 His-p31 단백질을 발현하는 유전자 재조합 대장균의 배양물의 파쇄물 상등 400㎕ 과 Zn2+이온킬레이트세팔로오스 10㎕ 을 섞어, 이 단백질을 결합시킨 후, PBS 로 세정하고, 친화성 비드로 한다. 이 친화성 비드를 500μmol/ℓ의 피검물질의 존재하 또는 부재하, 1μmol/ℓ의 FITC 라벨 화합물 155 를 함유하는 용액 1㎖ 와 혼합하고 상등을 제거한다. 이 친화성 비드를 세정한 후, 잔존하는 FITC 라벨 화합물 155 를, 1% SDS 수용액 100㎕ 로 추출하고, 추출액의 형광강도를 분광형광광도계로 측정함으로써, 축합 퓨린 유도체와 축합 퓨린 유도체 결합 단백질과의 결합을 저해하는 물질을 선택할 수 있다.
이 물질의 인슐린분비 촉진 활성은, 상기 실시예 8 의 방법에 의해 확인할 수 있다.
실시예 19 His-p31 단백질을 사용한 인슐린분비 촉진제의 탐색 (3)
효소활성저해실험
실시예 12 에서 조제한 His-p31 단백질을 1㎍/㎖, 250μmol/ℓ의 파라클로로벤즈알데히드를 함유하는, 10mmol/ℓ Tris-HCl, 100mmol/ℓ NaCl, 2mmol/ℓEDTA (pH7.4) 용액 1㎖ 에, NADPH 를 5μmol/ℓ가 되도록 첨가하여 37℃ 에서 인큐베이트하고, 피검물질 존재하, 및 부재하에서의 파라클로로벤즈알데히드의 분해에 수반되는 NADPH 의 감소를 340㎚ 의 흡광도로 검출하였다.
피검물질로서 화합물번호 16 또는 17 로 나타내는 물질을 사용했을 때의 His-p31 단백질의 효소활성저해를 측정한 결과, 화합물번호 16 으로 나타내는 화합물은 화합물번호 17 로 나타내는 화합물에 비하여, 이 단백질의 활성을 크게 저해하였다.
실시예 20 His-p31 단백질을 사용한 인슐린분비 촉진제의 탐색 (4)
효소 활성 저해 실험
실시예 12 에서 조제한 His-p31 단백질을 1㎍/㎖, 250μmol/ℓ의 파라클로로벤즈알데히드를 함유하는, 10mmol/ℓ Tris-HCl, 100mmol/ℓ NaCl, 2mmol/ℓEDTA (pH7.4) 용액 150㎕ 에, NADPH 를 5μmol/ℓ가 되도록 첨가하여 37℃ 에서 5분간 인큐베이트한다. 이 반응용액에 0.2mol/ℓ시안화칼륨 (KCN), 0.06mol/ℓ수산화칼륨 (KOH), 1mol/ℓ바토펜안트롤린 디술폰산(Bathophenanthroline disulfonic acid)으로 이루어지는 용액을 150㎕ 첨가하고, 실온에서 5분간 방치한다. 추가로 클로로포름 800㎕ 를 첨가하여 혼합한 후, 4℃, 150,000rpm 으로 5분간 원심한다. 상등을 0.2mol/ℓ암모늄 아세테이트 (pH6.0 으로 4배로 희석한 후, 250㎕ 를 HPLC 에 주입한다. 피검물질 존재하, 및 부재하에서의 p31 에 의한 기질의 분해에 수반되는 NADPH 의 감소를, 형광검출기 (330/460㎚) 로 검출함 [Analytical Biochemistry, 228, 312 (1995)] 으로써, 피검물질로부터 His-p31 의 활성을 저해하는 물질을 선택할 수 있다.
선택되는 물질의 인슐린분비 촉진 활성은, 상기 실시예 8 의 방법에 의해 확인할 수 있다.
실시예 21 His-p31 단백질을 사용한 인슐린분비 촉진제의 탐색 (5)
효소활성저해실험
실시예 12 에서 조제한 His-p31 단백질을 0.1㎍/㎖, 용액 A [1% 소 혈청 일부민, 20% 글리세롤, 1% CHAPS 를 함유하는 20mmol/ℓHEPES-NaOH, 50mmol/ℓKCl, 3mmol/ℓMgCl2(pH7.5) 및 용액 B [40μmol/ℓall-trans 레티날, 25μmol/ℓNADPH, 0.1% 소 혈청 알부민, 2% 글리세롤, 0.1% CHAPS 를 함유하는 40mmol/ℓHEPESㆍNaOH, 100mmol/ℓKCl, 6mmol/ℓMgCl2(pH7.5)] 을 작성한다. 용액 A 0.2㎖ 와 용액 B 0.2㎖ 를 혼합하여 32℃ 에서 10분간 인큐베이트하고, 피검물질 존재하, 및 부재하에서의 레티날의 분해에 수반되는 NADPH 의 감소를 340㎚ 의 흡광도로 검출함 [Biochimica et Biophysica Acta, 1338, 47(1997)] 으로써, 피검물질로부터 His-p31 단백질의 NADPH 산화활성을 저해하는 물질을 선택할 수 있다.
선택되는 물질의 인슐린분비 촉진 활성은, 상기 실시예 8 의 방법에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에 의해, 축합 퓨린 유도체를 사용한, 저혈당 등의 합병증을 일으키지 않는 당뇨병 치료약 및 인슐린분비 촉진제의 탐색 방법이 제공된다.
<110> KYOWA HAKKO KOGYO, CO., LTD. <120> Method for screening of antidiabetic compounds <130> 11486WO1 <150> JP 2002-143599 <151> 2002-05-17 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val 1 5 10 15 Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg 20 25 30 Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln 35 40 45 Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser 50 55 60 Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg 65 70 75 80 Leu Val Ala Thr Ala Val Lys Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val 85 90 95 Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr 100 105 110 Glu Glu Val Trp Asp Lys Thr Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Pro Ala 115 120 125 Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Val Val Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly 145 150 155 160 Phe Ser Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys 165 170 175 Thr Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu 180 185 190 Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met Asp 195 200 205 Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg Arg Leu 210 215 220 Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu 225 230 235 240 Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr 245 250 255 Pro Ser Arg Leu 260 <210> 2 <211> 260 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser Asn Lys Val 1 5 10 15 Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg 20 25 30 Arg Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln 35 40 45 Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser 50 55 60 Val Thr Gly Ile Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Lys 65 70 75 80 Leu Ile Thr Thr Ala Leu Lys Arg His Gln Gly Ile Asp Ile Leu Val 85 90 95 Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Asn Leu Met Asp Val Thr 100 105 110 Glu Glu Val Trp Asp Lys Val Leu Ser Ile Asn Val Thr Ala Thr Ala 115 120 125 Met Met Ile Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Val Val Ile Val Gly Ser Val Ala Gly Phe Thr Arg Phe Pro Ser 145 150 155 160 Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys 165 170 175 Asn Phe Ala Ala Glu Leu Ala Pro Lys Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu 180 185 190 Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Arg Phe Ser Ser Val Leu Trp Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Arg Glu Asp Phe Ile Lys Glu Ala Met Gln Ile Arg Arg Leu 210 215 220 Gly Lys Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu 225 230 235 240 Asp Ala Ser Tyr Ile Asn Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr 245 250 255 Pro Ser Arg Leu 260 <210> 3 <211> 260 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 3 Met Ala Ser Ser Gly Val Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val 1 5 10 15 Ala Ile Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Arg 20 25 30 Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Ile Ser Ser Arg Lys Gln 35 40 45 Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Ala Leu Gln Ala Glu Gly Leu Ser 50 55 60 Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg 65 70 75 80 Leu Val Ala Thr Ala Leu Asn Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val 85 90 95 Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Lys Leu Met Asp Val Thr 100 105 110 Glu Glu Val Trp Asp Lys Ile Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Met Ala 115 120 125 Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Val Val Ile Val Ala Ser Ile Ala Ala Phe Asn Pro Phe Ser Gly 145 150 155 160 Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Val Gly Leu Thr Lys 165 170 175 Asn Leu Ala Leu Glu Leu Ala Ala Gln Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu 180 185 190 Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Lys Ala Leu Trp Glu Asp 195 200 205 Lys Ala Gln Glu Glu Asn Ile Ile Gln Lys Leu Arg Ile Arg Arg Leu 210 215 220 Gly Lys Pro Glu Glu Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu 225 230 235 240 Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Ala Gly Gly Ala 245 250 255 Pro Ser Arg Leu 260 <210> 4 <211> 780 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(780) <400> 4 atg gcc agc tcc ggg atg acc cgc cgg gac ccg ctc gca aat aag gtg 48 Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val 1 5 10 15 gcc ctg gta acg gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttc gcc atc gcc cgg 96 Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg 20 25 30 cgt ttg gcc cag gac ggg gcc cat gtg gtc gtc agc agc cgg aag cag 144 Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln 35 40 45 cag aat gtg gac cag gcg gtg gcc acg ctg cag ggg gag ggg ctg agc 192 Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser 50 55 60 gtg acg ggc acc gtg tgc cat gtg ggg aag gcg gag gac cgg gag cgg 240 Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg 65 70 75 80 ctg gtg gcc acg gct gtg aag ctt cat gga ggt atc gat atc cta gtc 288 Leu Val Ala Thr Ala Val Lys Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val 85 90 95 tcc aat gct gct gtc aac cct ttc ttt gga agc ata atg gat gtc act 336 Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr 100 105 110 gag gag gtg tgg gac aag act ctg gac att aat gtg aag gcc cca gcc 384 Glu Glu Val Trp Asp Lys Thr Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Pro Ala 115 120 125 ctg atg aca aag gca gtg gtg cca gaa atg gag aaa cga gga ggc ggc 432 Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly 130 135 140 tca gtg gtg atc gtg tct tcc ata gca gcc ttc agt cca tct cct ggc 480 Ser Val Val Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly 145 150 155 160 ttc agt cct tac aat gtc agt aaa aca gcc ttg ctg ggc ctg acc aag 528 Phe Ser Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys 165 170 175 acc ctg gcc ata gag ctg gcc cca agg aac att agg gtg aac tgc cta 576 Thr Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu 180 185 190 gca cct gga ctt atc aag act agc ttc agc agg atg ctc tgg atg gac 624 Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met Asp 195 200 205 aag gaa aaa gag gaa agc atg aaa gaa acc ctg cgg ata aga agg tta 672 Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg Arg Leu 210 215 220 ggc gag cca gag gat tgt gct ggc atc gtg tct ttc ctg tgc tct gaa 720 Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu 225 230 235 240 gat gcc agc tac atc act ggg gaa aca gtg gtg gtg ggt gga gga acc 768 Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr 245 250 255 ccg tcc cgc ctc 780 Pro Ser Arg Leu 260 <210> 5 <211> 780 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(780) <400> 5 atg gcc agt tcc ggg ttg act cgt cga aac cct ctc tcc aat aag gtg 48 Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser Asn Lys Val 1 5 10 15 gcc ctg gtc aca gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttt gcc atc gcc cgg 96 Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg 20 25 30 cgc ctg gct gaa gat ggg gcc cac gtg gtc gtc agc agc cgc aaa cag 144 Arg Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln 35 40 45 cag aat gtg gac cgt gca gtg gcc aca cta cag gga gag ggc ctg agt 192 Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser 50 55 60 gtg act ggc atc gtg tgc cac gtg ggg aag gca gag gat cga gaa aag 240 Val Thr Gly Ile Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Lys 65 70 75 80 ctg ata acc acg gct ctg aag cgt cac cag ggg att gat atc ctg gtc 288 Leu Ile Thr Thr Ala Leu Lys Arg His Gln Gly Ile Asp Ile Leu Val 85 90 95 tcc aat gct gct gtc aac cct ttc ttt gga aat cta atg gat gtc aca 336 Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Asn Leu Met Asp Val Thr 100 105 110 gag gag gtg tgg gac aag gtt ttg agc att aat gtg aca gct aca gcc 384 Glu Glu Val Trp Asp Lys Val Leu Ser Ile Asn Val Thr Ala Thr Ala 115 120 125 atg atg att aaa gcg gtg gtg cca gag atg gaa aag cga gga ggc ggc 432 Met Met Ile Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly 130 135 140 tca gtg gtg att gtg ggt tct gta gca ggc ttc act cgg ttc cct tct 480 Ser Val Val Ile Val Gly Ser Val Ala Gly Phe Thr Arg Phe Pro Ser 145 150 155 160 ctg ggt cct tac aat gtt agc aaa aca gct ttg ctg ggt ctt act aag 528 Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys 165 170 175 aac ttt gca gcg gag ttg gcc ccg aag aac att cga gtg aac tgc tta 576 Asn Phe Ala Ala Glu Leu Ala Pro Lys Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu 180 185 190 gca cct gga ctc atc aag act cga ttc agc agt gtg ttg tgg gag gag 624 Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Arg Phe Ser Ser Val Leu Trp Glu Glu 195 200 205 aaa gca aga gag gac ttc ata aaa gaa gcc atg caa atc aga agg cta 672 Lys Ala Arg Glu Asp Phe Ile Lys Glu Ala Met Gln Ile Arg Arg Leu 210 215 220 ggc aag cca gag gat tgt gct ggc ata gtt tcc ttc tta tgc tct gaa 720 Gly Lys Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu 225 230 235 240 gac gcc agt tac atc aat gga gag acc gta gta gtg ggg gga gga acc 768 Asp Ala Ser Tyr Ile Asn Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr 245 250 255 cct tct cgc ctc 780 Pro Ser Arg Leu 260 <210> 6 <211> 780 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <220> <221> CDS <222> (1)..(780) <400> 6 atg gcc agc tct ggg gtg acc cgc cgg gac ccg ctc gcg aat aag gtg 48 Met Ala Ser Ser Gly Val Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val 1 5 10 15 gcc atc gta acg gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttg gcc atc gcc cgg 96 Ala Ile Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Arg 20 25 30 cgt ctg gcc cag gat ggg gcc cac gtg gtc atc agc agc cgg aag cag 144 Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Ile Ser Ser Arg Lys Gln 35 40 45 cag aac gtg gac cgg gcg gtg gct gca ctg cag gcc gag ggg ctg agt 192 Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Ala Leu Gln Ala Glu Gly Leu Ser 50 55 60 gtg acg ggc acc gtg tgc cac gtg ggg aag gcc gag gac cgg gaa cgg 240 Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg 65 70 75 80 ctg gtg gcc acg gcc ctg aac ctc cac gga ggc att gat atc ctg gtc 288 Leu Val Ala Thr Ala Leu Asn Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val 85 90 95 tcc aat gct gca gtc aac ccc ttc ttt gga aag cta atg gat gtc acc 336 Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Lys Leu Met Asp Val Thr 100 105 110 gag gag gtg tgg gac aag att ctg gac att aac gtg aag gcc atg gcc 384 Glu Glu Val Trp Asp Lys Ile Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Met Ala 115 120 125 ctg atg aca aag gcg gtg gtg cca gag atg gag aaa cga gga ggc ggc 432 Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly 130 135 140 tcc gtg gtg atc gtg gcc tcc ata gca gcc ttc aat cca ttc agt ggc 480 Ser Val Val Ile Val Ala Ser Ile Ala Ala Phe Asn Pro Phe Ser Gly 145 150 155 160 ctg ggc cct tat aat gtt agt aaa aca gcc ttg gtg ggc ctt acc aag 528 Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Val Gly Leu Thr Lys 165 170 175 aac ctg gcc ctg gag ctg gct gcc cag aac atc cgg gtg aac tgc ctg 576 Asn Leu Ala Leu Glu Leu Ala Ala Gln Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu 180 185 190 gca ccg gga ctc atc aag acc agc ttc agt aag gcg ttg tgg gag gac 624 Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Lys Ala Leu Trp Glu Asp 195 200 205 aag gca caa gag gaa aac atc ata caa aag ttg agg ata aga agg tta 672 Lys Ala Gln Glu Glu Asn Ile Ile Gln Lys Leu Arg Ile Arg Arg Leu 210 215 220 ggc aaa cca gag gaa tgt gcg ggc atc gtg tct ttc ctg tgc tcc gaa 720 Gly Lys Pro Glu Glu Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu 225 230 235 240 gac gcc agc tac atc act ggg gag aca gtg gtg gtg gct gga gga gca 768 Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Ala Gly Gly Ala 245 250 255 cca tcc cgc ctc 780 Pro Ser Arg Leu 260 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 7 ggaattccat atggccagtt ccgggttgac tc 32 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 8 cgggatccgt cgactcagag gcgagaaggg gttcct 36 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gly Ser His Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser 1 5 10 15 Asn Lys Val Ala 20

Claims (24)

  1. [1] 피검물질 존재 하, 하기의 일반식 (Ⅰ)로 나타내는 화합물
    (식 중 R1A는 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, R2A는 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아르알킬기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, R3A는 수소원자, 저급 알킬기 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬기를 나타내고, X1및 X2는 각각 독립하여 수소원자, 저급 알킬기, 치환 또는 비치환의 아르알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 아릴기를 나타내고, n 은 0∼3 의 정수를 나타낸다),
    또는 하기의 일반식 (Ⅱ)
    {식 중 X…Y…Z 는 R1N-C=0 (식 중 R1은 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타낸다) 또는 N=C-W [식 중 W 는 할로겐, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, -NR4R5(식 중 R4및 R5는 동일하거나 상이하며 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬을 나타내거나, R4와 R5가 인접하는 질소원자와 일체가 되어 복소환기를 형성한다), -OR6(식 중 R6은 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 아르알킬을 나타낸다), -SR6a(식 중 R6a는 상기 R6과 동일한 의미이다), 치환 또는 비치환의 저급 알킬 또는 시아노를 나타낸다] 를 나타내고, R2는 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기 R4및 R5와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 할로겐을 나타낸다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기 R4및 R5와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내고, R3은 수소원자, 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 저급 알콕시알킬을 나타내고, n 은 0∼3 의 정수를 나타내고, V1은 수소원자, 치환 또는 비치환의 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, V2는 치환 저급 알킬 또는 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기를 나타내고, V1이 수소원자, 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타내고, 또한 (a) X…Y…Z 가 R1aN-C=0 (식 중 R1a는 상기 R1의 정의 중 치환 저급 알킬 이외의 기를 나타낸다) 를 나타내고, R2가 치환 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 상기와 동일한 의미이다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내거나, (b) X…Y…Z 가 R1N-C=0 (식 중 R1은 상기와 동일한 의미이다) 을 나타내고, R3이 저급 알콕시알킬을 나타내거나, (c) X…Y…Z 가 R1bN-C=0 (식 중 R1b는 치환 저급 알킬을 나타낸다) 를 나타내거나, (d) X…Y…Z 가 N=C-W (식 중 W 는 상기와 동일한 의미이다) 를 나타내고, R2가 치환 또는 비치환의 저급알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환의 지환식 복소환기, 할로겐, 저급 알킬티오, -NR7R8(식 중 R7및 R8은 각각 상기와 동일한 의미이다), -CO2H, 저급 알콕시카르보닐, -COHal (식 중 Hal 은 상기와 동일한 의미이다), -CONR9R10(식 중 R9및 R10은 각각 상기와 동일한 의미이다) 또는 -CHO 를 나타내거나, (e) X…Y…Z 가 N=C-W (식 중 W 는 상기와 동일한 의미이다) 를 나타내고, R3이 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 저급 알콕시알킬을 나타내는 경우, V2는 저급 알킬, 치환 또는 비치환의 아르알킬 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타낼 수 있다} 로 나타내는 화합물에서 선택되는 화합물 (이하, 축합 퓨린 유도체로 약칭함) 과 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정; [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법.
  2. [1] 피검물질 존재 하, 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체와 그 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정; [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 항당뇨병 작용을 갖는 물질의 탐색방법.
  3. [1] 피검물질 존재 하, 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정; [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합량을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 축합 퓨린 유도체와 췌장 β세포 또는 그 세포의 처리물과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정; [5] [4] 의 공정에서 얻어지는 물질로부터 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질에 결합하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질에 결합하는 물질의 탐색방법.
  4. [1] 피검물질 존재 하, 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체와 그 축합 퓨린유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정; [2] 피검물질 부재 하, 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질을 접촉시킨 경우의 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합량을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 축합 퓨린 유도체와 그 단백질과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질에 결합하는 물질의 탐색방법.
  5. [1] 피검물질과 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정; [2] 피검물질을 접촉시키지 않은 경우에서의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 단백질의 활성을 변화시키는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 활성을 변화시키는 물질의 탐색방법.
  6. [1] 피검물질과 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 접촉시킨 경우의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정; [2] 피검물질을 접촉시키지 않은 경우에서의 그 단백질의 활성을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 단백질의 활성을 억제하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는단백질의 활성을 억제하는 물질의 탐색방법.
  7. [1] 피검물질과 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 세포응답을 측정하는 공정; [2] 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 세포응답을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 형질전환주의 세포응답을 변화시키는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 기능을 변화시키는 물질의 탐색방법.
  8. [1] 피검물질과 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 측정하는 공정; [2] 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질을 선택하는 공정, 을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현량을 변화시키는 물질의 탐색방법.
  9. [1] 피검물질과 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질을 발현하는 형질전환체를 접촉시킨 경우의 그 형질전환체의 그 단백질의 발현량을 측정하는 공정; [2] 피검물질 부재 하에서의 그 형질전환체의 그 단백질의 발현량을 측정하는 공정; [3] 피검물질 존재 하와 피검물질 부재 하에서의 그 측정치를 비교하는 공정; [4] 피검물질로부터 그 단백질의 발현량을 변화시키는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 그 축합 퓨린 유도체에 결합하는 단백질의 발현량을 변화시키는 물질의 탐색방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    축합 퓨린 유도체가 하기 식 (Ⅲ)으로 나타내는 화합물인 탐색방법.
  11. 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체를 고정화한 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는 탐색방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 담체가 세파로오스 입자인 탐색방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    축합 퓨린 유도체가 하기 식 (Ⅳ)로 나타내는 화합물인 탐색방법.
  14. 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체를 고정화한 담체.
  15. 제 14 항에 있어서, 축합 퓨린 유도체가 제 13 항에 기재된 식 (Ⅳ) 로 나타내는 축합 퓨린 유도체인 담체.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 담체가 세파로오스 입자인 담체.
  17. 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질이 하기 [ⅰ]∼[ⅲ] 에서 선택되는 어느 하나의 단백질인 탐색방법.
    [ⅰ] 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질
    [ⅱ] 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질
    [ⅲ] 서열번호 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 제 1 항에 기재된 축합 퓨린 유도체에 결합되는 단백질
  18. 제 1 항 내지 제 13 항, 및 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 탐색방법으로 얻어지는 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염.
  19. 제 18 항에 기재된 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 의약.
  20. 제 18 항에 기재된 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 당뇨병 치료제.
  21. 제 18 항에 기재된 물질 또는 그 물질의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 인슐린분비 촉진제.
  22. 하기의 일반식 (Ⅴ)로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염을유효성분으로서 함유하는 인슐린분비 촉진제.
    [식 중 R1B, R2B및 R3B는 동일하거나 상이하며, 아미노기, 모노 또는 디치환 아미노기, 또는 N 을 함유하는 치환 또는 비치환의 복소환기 (그 복소환기는 N 원자로 트리아진 고리에 결합한다) 를 나타낸다]
  23. 제 22 항에 기재된 일반식 (Ⅴ) 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 인슐린분비의 촉진방법.
  24. 인슐린분비 촉진제의 제조를 위한 제 22 항의 일반식 (Ⅴ) 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 용도.
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