KR20040067161A - 비뇨기 감염 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 유산균과이를 포함하는 기능제품 - Google Patents

비뇨기 감염 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 유산균과이를 포함하는 기능제품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비뇨기 감염 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 프로바이오틱에 관한 것으로, 특히 락토바실러스 코프로필러스 PL9001(KCCM-10245)을 제공한다. 본 발명의 유산균은 각종 비뇨기 감염 질환의 예방제 및 치료제 등으로 사용할 수 있으며, 경구 투여제, 질좌제, 뇨도간 삽입제, 인공 뇨도관 코팅제 등 비뇨기 질환 예방제 및 치료제 제조에 직접 사용되거나, 이를 목적으로 하는 기능성 식음료의 첨가제로 사용될 수 있다.

Description

비뇨기 감염 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 유산균과 이를 포함하는 기능제품 {Lactic acid bacteria which prevent and/or cure urinary tract infection and the beneficial product containing this bacteria}
본 발명은 비뇨기 감염 질환 예방 및 치료제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 락토바실러스 코프로필러스 PL9001의 생균 혹은 사균 혹은 배양액 건조물을 제제화한 비뇨기 감염 질환 예방 또는 치료제 및 이를 포함하는 기능제품을 제공하는 것에 있다.
비뇨기 감염 (Urinary tract infection, UTI) 은 신장, 뇨도, 방광 감염으로 주로 세균에 의해 일어난다. 비뇨기 감염은 면역력이 약화된 사람과 부분적으로 뇨도관이 막힌 사람에게서 재발되는 경향이 있다. 그리고 뇨도관이 짧은 여성에게서 더욱 혼하며 특히 갱년기 이후의 여성 환자에게서는 에스트로겐 분비의 감소에 따른 질 상피 세포의 글리코겐 감소로 질내 유산균의 수가 감소하여 매우 흔하게 일어나는 질병이다 (Hooton, T.M. 2001. Recurrent urinary tract infection in women. Int. J. Antimicrob. Agents 17:259-268).
비뇨기 감염 질환에는 평균 항생제를 7일에서 10일 동안 처리한다. 하지만 항생제 처리는 내성 문제를 야기하며 점차 병원성이 강하고 약제다중내성 병원균이 빈번하게 출현하고 있어 비뇨기 감염을 치료할 수 있는 안전하고 효과적인 방법이 필요하다.
항생제를 대체할 수 있는 것으로 유산균이 부각되고 있다 (Darouiche, R.0., W.H. Donovan, M. Del Temo, J.J. Thornby, D.C. Rudy, and R.A. Hull. 2001. Pilot trial of bacterial interference for preventing urinary tract infection.Urology 58:339-344; Mombelli, B. and M.R.Gismondo. 2000. The use of probiotics in medical practice. Int. J. Antimicrob. Agents 16:531-536).
유산균은 장내 상피세포와 질 상피세포에 부착하여 병원성 세균이 기생하게 되는 것을 차단하는 방어막을 형성하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다 (Bernet, M. F., D. Brassart, J. R. Neeser, and A. L. Servin. 1994. Lactobacillus acidophilus LAl binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria. Gut 35:483-489). 그리고 병원균과의 응집으로 병원균이 부착하는 것을 예방한다. 이런 기전에 덧붙여 유산균이 생산하는 과산화수소수, 박테리오신 등은 여러가지 병원균의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Bernet-Camard, M.-F., V. Livin, D. Brassart, J.-R. Neeser, A. L. Servin, and S. Hudault. 1997. The human Lactobacillus acidophilus strain LAl secretes a nonbacteriocin antibacterial substance(s) active in vitro and in vivo. Appl. Environ. Microbiol.63:2747-2753).
본 발명에서는 위궤양 원인균인 Helicobacter pylori에 대한 억제력을 가지고 있는 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245) (Nam, H., M. Ha, O. Bae, and Y. Lee. 2002. Effect of Weissella confusa Strain PL9001 on the adherence and growth of Helicobacter pylori. Appl. Envir. Microbiol. 68: 4642-4645)을 예로 비뇨기 감염의 주 원인 균인 효모균과 세균에 대한 억제 기능을 가지는 유산균 제제을 제공한다.
따라서 본 발명은 각종 비뇨기 감염을 예방하는 프로바이오틱을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
또한 본 발명은 각종 비뇨기 감염을 치료하는 프로바이오틱을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
또한 본 발명은 비뇨기 감염을 예방하고 치료하기 위한 경구용 프로바이오틱을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
또한 본 발명은 비뇨기 감염을 예방하고 치료하기 위한 질 삽입용 프로바이오틱을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
또한 본 발명은 비뇨기 감염을 예방하고 치료하기 위한 뇨도관 삽입용 프로바이오틱을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
또한 본 발명은 비뇨기 감염을 예방하고 치료하기 위한 인공 뇨도관 코팅을 위한 프로바이오틱을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
유산균은 각종 조성물로 제제화 할 수 있으며, 바람직하게는 이 조성물은 캡슐, 정제, 좌약 및 분말 등의 제약 조성물 형태와 각종 식품 첨가에 용이한 형태도 바람직하다. 이러한 제제는 공지된 방법에 의해 제약상 허용되는 담체, 부형제, 용매 또는 보조제를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 방법 및 성분은 잘 알려져 있으며, 표준 텍스트 및 매뉴얼, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Remington. 1995. The Science and Practice of Pharmacy. Mack Publising Co. Easton, PA 18042, USA)에 상세히 기재되어 있다.
또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 유산균을 식품으로 제조할 수도 있다.
또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 발효 유제품을 포함한 발효식품의 종균으로 사용하여 식품제조에 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
도 1. 락토바실러스 코프로필러스 PL9001에 의해 비뇨기 감염균들의 성장이 억제된 모습.
도 2. 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 이 비뇨기 감염균들과 응집된 모습을 광학현미경으로 관찰한 모습.
도 3. 락토바실러스 코프로필러스 PL9001이 T24 방광 상피세포에 부착된 모습을 광학현미경으로 관찰한 모습.
도 4. 락토바실러스 코프로필러스 PL9001에 의해 비뇨기 감염 균들이 방광상피세포에 부착되는 것이 억제된 모습
도 5. 락토바실러스 코프로필러스 PL9001에 의해 비뇨기 감염균들이 T24 방광상피 세포에 부착되는 것이 억제된 것을 퍼센트로 계산한 것을 그린 그래프.
도 6. Candida albicans 와 Staphylococcus aureus 이 락토바실러스 코프로필러스 PL9001와 동시에 T24 방광 상피 세포에 첨가된 후 전자현미경으로 관찰한 모습.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비뇨기 감염 예방제 또는 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1] 락토바실러스 코프로필러스 PL9001의 비뇨기 감염 원인 균의 성장 억제 확인 실험 (Overlay method)
락토바실러스 코프로필러스 PL9001은 MRS 배지에서 배양하였다. 고려대학교 부속 구로병원에 입원한 여성 환자의 소변에서 분리된 4가지 병원균, Candida albicans (CCARM 14120), Escherichia coli (CCARM 1360), Staphylococcus aureus(CCARM 3703), vancomycin-resistant Enterococcus faecium (Van A, CCARM 5100)은 Brain Heart Infusion medium (Difco)에서 배양하여 사용하였다. 각각의 병원균을 흡광도 600 nm에서 0.6이 되도록 하여 Muller Hinton 고체 배지에 접종하고 락토바실러스 코프로필러스 PL9001을 하룻밤 배양 후 아세토니크릴로 추출한 후증류수에 원액 농도의 100배로 농축되도록 용해시켜 10 ㎕를 떨어뜨렸다. 하룻밤 37도에서 배양한 후 각 병원균의 성장 억제환의 크기를 측정하였다.
그림 1에 있듯이 락토바실러스 코프로필러스 PL9001은 비뇨기감염의 주 원인균인 Escherichia coli를 가장 많이 억제하였으며, 다음으로 Staphylococus aureus, Candida albicans, Enterococcus faeicum(VRE)의 순으로 억제하여 모든 비뇨기 감염균에 억제력을 가지고 있다.
[실험예 2] 락토바실러스 코프로필러스 PL9001의 비뇨기 감염원인균과의 응집 확인 실험
유산균의 병원균 억제 기전 중 중요한 것의 하나는 응집(coaggregation)이다. 유산균이 병원균과 응집하면 유산균이 생산하는 각종 억제물질이 직접 작용하여 병원균을 죽이며, 또한 병원균이 인체 세포에 부착되는 것을 억제하게 된다. 이를 확인하기 위하여 하룻밤 배양된 락토바실러스 코프로필러스 PL9001과 각각의 비뇨기 감염균을 원심분리로 모은 후 식염수에 흡광도 600 nm에서 0.6이 되도록 현탁액을 만들어 각각 500 ㎕를 섞어 37도 혼합기 (orbital shaker)에서 혼합하였다. 4시간 후 현미경용 슬라이드에 떨어뜨리고 그람 염색 후 광학현미경으로 관찰하거나, 고정 후 전자현미경(JSM-5200, Jeol, Tokyo,Japan) 으로 관찰하였다.
그림 2에서 보듯이 광학현미경(그림 2A)에서 락토바실러스 코프로필러스 PL9001와 Candida albicans의 경우 두 세균의 크기 차이로 쉽게 두 세균이 구별이 되어 Candida albicans에 수많은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001가 응집된 것을 확인할 수 있었다. 또한 그람 음성인 Escherichia coli와의 부착은 그람 염색 후색깔의 차이로 두 세균이 확연히 구별되었으며 이 역시 부착이 우수함을 알 수 있었다. 그람 양성이며 락토바실러스 코프로필러스 PL9001와 그 크기가 유사한 Staphylococcus aureus와 Enterococcus faecium의 경우 그람 염색으로는 쉽게 구분은 되지 않았으나, 락토바실러스 코프로필러스 PL9001가 한쪽이 부푼 독특한 곤봉 모양을 하고 있어, 구균을 감싸고 있는 것이 확인되었다. 이를 확인하기 위해 전자현미경 (SEM)을 찍은 결과 (그림 2B) 더욱 확연히 각 세균과 락토바실러스 코프로필러스 PL9001간의 응집이 확인되었다. 이렇듯 병원균과의 응집은 그 자체로도 병원균이 방광세포에 부착하는 것을 예방할 수도 있으며, 또한 유산균이 생산하는 각종 항세균물질 (antimicrobial agents)이 직접 병원균에 작용하여 병원균의 사멸효과를 가져오게 된다.
[실험예 3] 락토바실러스 코프로필러스 PL9001의 방광 상피세포 부착 확인 실험
장과 질의 경우 유산균의 방어기전 중 하나는 병원균과 세포 부착을 경쟁적으로 하여 병원균의 부착을 억제하는 것이다. 이 기전에는 유산균의 상피세포 부착 능력이 필수적이다. 비뇨기 질병 예방과 치료를 위해서도 락토바실러스 코프로필러스 PL9001가 비뇨기 세포에 부착하는 것이 필수적이므로, 이를 위해 한국 세포주 은행에서 T24 방광상피세포주를 분양 받아 10% Fetal Bovine Serum (GIBCO BRL) 과 1% antibiotic-antimycotics (GIBCO BRL)이 함유된 RPMI 1640 (GIBCO BRL, Grand Island, N.Y.,U.S.A)가 들은 배양 접시 (직경 30 mm)당 3 x 105cells 되도록 넣어37도 이산화탄소 배양기 (5% CO2)에서 배양하였다. 배양접시의 70-80% confluency가 되도록 세포가 자라면 실험에 사용하였다. 배지는 매 2일마다 갈아주었다. 방광 상피세포의 부착을 확인하기 위하여 세포배양액에 108CFU/ml이 되도록 락토바실러스 코프로필러스 PL9001을 넣고 37도 혼합기 (100 rpm)에서 혼합하였다. 세포에 부착되지 않는 세균을 제거하기 위하여 세포를 250 X g에서 5분간 원심분리를 하여 상등액을 제거시킨다. 다음 세포를 15 ml MEM에 혼탁시킨 후 필터 (2 ㎛)를 통해 여과하여 15 ml MEM으로 세척한다. 필터에 부착된 세포를 알부민이 코팅된 현미경용 슬라이드에 붙이고 무수 methanol로 고정하고 그람 염색 후 광학현미경에서 관찰하였다. 그림 3에 있듯이 락토바실러스 코프로필러스 PL9001은 방광세포에 부착이 잘 되었다. 20 field에서 관찰된 세균 수를 계수하여 field 당 평균 부착된 세균 수를 계산한 결과 필드 당 평균 326.88±63.68 개의 유산균이 부착된 것이 확인되었다.
[실험예 4] 여자환자 소변에서 분리된 세균들의 방광 상피세포 부착 확인 실험
또한 환자에서 분리된 병원균들이 방광 감염균임을 확인하기 위하여 각각의 병원균을 첨가하여 같은 방법으로 부착을 확인하였다. 표 1에 있는 것 처럼 표준 균주 의 경우 부착이 거의 없는 반면 환자의 소변에서 분리된 균들은 부착성이 표준균주의 부착보다 10배 이상 높은 것이 확인되었다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였으며 SPSS에 의해 통계처리하였다.
[실험예 5] 락토바실러스 코프로필러스 PL9001에 의한 비뇨기 감염균의 방광상피세포 부착 억제 확인 실험
락토바실러스 코프로필러스 PL9001에 의한 비뇨기 감염균의 방광상피세포 부착 억제 확인을 세가지 실험으로 확인하였다.
유산균이 먼저 부착된 경우 감염균의 부착을 얼마나 억제하는 지 (Exclusion test)를 확인하기 위해서는 먼저 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (108CFUs/ml) 를 T24 cells (2 x 104CFU/ml)에 첨가하여 30분간 혼합하고, 여기에 각각의 병원균(1-2 X 106CFU/ml)을 첨가하여 30분간 더 혼합하여 부착된 세균을 위와 동일한 방법으로 관찰하였다.
부착된 병원균이 나중에 첨가된 락토바실러스 코프로필러스 PL9001에 의해 얼마나 감소되는지 확인하였다(Displacement). 이를 위해 병원균을 먼저 첨가하여 30분간 혼합하고 다음 락토바실러스 코프로필러스 PL9001를 첨가하여 30분간 더 혼합한 후 세포에 부착된 세균을 위와 동일한 방법으로 관찰하였다.
병원균과 락토바실러스 코프로필러스 PL9001이 서로 얼마나 경쟁적으로 부착하는지를 확인하기 위하여 (Competition test) 병원균과 동시에 첨가하여 30분간 혼합하여 위와 동일한 방법으로 관찰하였다. 관찰된 세균수는 표 2에 나타내었다. 이를 그래프로 나타낸 것이 그림 3이다.
도 5에서 보이듯이 락토바실러스 코프로필러스 PL9001은 병원균이 방광세포에 부착되는 것을 억제하였다. 특히 락토바실러스 코프로필러스 PL9001을 먼저 처리한 경우 비뇨기 질환의 대부분을 차지하는 2종류의 병원균인 C. albicans와 E. coli의 부착이 각기 11% 와 8%이하로 감소되었다. VRE의 경우 37%, Staph. aureus 경우도 58%로 감소되었다. 이 수치는 경쟁적으로 작용하도록 동시에 처리한 경우도 거의 유지되었으며 병원균이 먼저 부착된 경우 나중에 처리한 락토바실러스 코프로필러스 PL9001에 의해서 떨어져 나간 결과는 10-35%의 병원균 감소를 보였다.
또한 전자현미경으로서 관찰한 경우 필드 당 부착한 세균수가 10 이하의 경우는 관찰이 불가능했으나 C. albicans와 Staph. aureus의 경우 전자현미경에서도 세포 부착시 락토바실러스 코프로필러스 PL9001가 부착된 것이 관찰되었다. 특히 C. albicans의 경우 병원성을 가지고 있는 것으로 알려져 있는 H-form(hyphalform)에도 락토바실러스 코프로필러스 PL9001가 부착되는 것이 확인되었다 (Augsten M., C. H bner, M. Nguyen, W. K nkel, A. H rtl, and R. Eck.2002.Defective hyphal induction ofa Candida albicans phosphatidylinosital 3-phosphate 5-kinase null mutant on solid media does not lead to decreased virulence.Infect. Immun.70: 4462-4470;Brown, A.J. and N.A. Cow. 1999.Regulatory networks controllingCandida albicansmorphogenesis.Trends Microbiol.7:333-3380).
이 결과들은 모두 락토바실러스 코프로필러스 PL9001을 지속적으로 사용할 경우 병원균의 감염을 획기적으로 감소시킬 수 있는 것을 보여주는 것이다.
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Claims (26)

  1. 비뇨기 감염 질환의 예방 및 치료 효과를 가지는 유산균
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스인 것을 특징으로 하는 유산균.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245) 인 것을 특징으로 하는 유산균.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유산균은 생균, 건조균, 사균, 혹은 배양액 건조물인 것을 특징으로 하는 유산균.
  5. 유산균을 포함하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스인 것을 특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245)인 것을 특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제.
  8. 제 5항 내지 7항에 있어서, 상기 질환은 Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococus aureus, Enterococcus faecium 등 효모 및 미생물이 원인이 되어 발생하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제.
  9. 제 5항 내지 7항에 있어서 상기 유산균은 생균, 파쇄된 세포벽 분획 또는 배양 여액인 것을 특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제.
  10. 제 5항 내지 7항에 있어서, 유산균 또는 유산균 배양 여액을 포함하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 질 삽입제
  11. 제 10항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245)특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 질 삽입제
  12. 유산균 또는 유산균 배양 여액을 포함하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 뇨도관 삽입제
  13. 제 12항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스를 특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 뇨도관 삽입제
  14. 제 12항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245)을 특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 뇨도관 삽입제
  15. 제 12항 내지 14항의 유산균 또는 유산균 배양 여액을 포함하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 뇨도관 코팅제
  16. 제 15항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스를 특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 뇨도관 코팅제
  17. 제 15항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245) 특징으로 하는 비뇨기 감염 질환 예방제 또는 치료제 목적의 뇨도관 코팅제
  18. 락토바실러스 코프로필러스 또는 상기 균주의 배양 여액을 포함하는 비뇨기 질환 예방 혹은 치료목적의 기능성 식품첨가제.
  19. 제 18항에서 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245) 또는 상기 균주의 배양 여액을 포함하는 비뇨기 질환 예방 혹은 치료목적의 기능성 식품첨가제.
  20. 제 18항 내지 19항에 있어서, 상기 식품 첨가제는 요구르트, 이유식,유제품(우우, 두유 등), 치즈, 김치, 유산균 음료, 젓갈 및 기타 음료 또는 식품에 사용되는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
  21. 락토바실러스를 유제품 제조의 종균으로 사용하여 비뇨기 질환 감염 예방제 혹은 치료제로써의 기능을 가지도록 제조된 식품 또는 음료.
  22. 락토바실러스 코프로필러스를 유제품 제조의 종균으로 사용하여 비뇨기 질환 감염 예방제 혹은 치료제로써의 기능을 가지도록 제조된 식품.
  23. 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245)을 유제품 제조의 종균으로 사용하여 비뇨기 질환 감염 예방제 혹은 치료제로써의 기능을 가지도록 제조된 식품.
  24. 유산균의 생균, 파쇄액, 사균 또는 상기 균주의 배양 여액을 포함하는 비뇨기 질환 예방 혹은 치료목적의 경구 복용제.
  25. 락토바실러스 코프로필러스의 생균, 파쇄액, 사균 또는 상기 균주의 배양 여액을 포함하는 비뇨기 질환 예방 혹은 치료목적의 경구 복용제.
  26. 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001 (KCCM-10245)의 생균, 파쇄액, 사균 또는 상기 균주의 배양 여액을 포함하는 비뇨기 질환 예방 혹은 치료목적의 경구 복용제.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2966164A1 (en) 2011-02-25 2016-01-13 Oü Tervisliku Piima Biotehnoloogiate Arenduskeskus Isolated microorganism strain lactobacillus gasseri mcc2 dsm23882 and its use

Cited By (1)

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EP2966164A1 (en) 2011-02-25 2016-01-13 Oü Tervisliku Piima Biotehnoloogiate Arenduskeskus Isolated microorganism strain lactobacillus gasseri mcc2 dsm23882 and its use

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