KR20040055787A - ｅｅ３-단백질 족 및 상응하는 ＤＮＡ 서열 - Google Patents

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아르민 슈나이더
마르틴 마우러
볼프강 쿠쉰스키
질비아 그뤼네발트
가쓸러니콜라우스
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악사론 바이오사이언스 아게
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Publication date
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Abstract

본 발명은
(i) DNA 서열,
(ii) 상기 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터,
(iv) 상기 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포,
(v) 상기 서열에 의해 코딩되는 유전자 생성물,
(vi) 상기 서열과 관련하여 변형된 유전자이전 동물,
(vii) 상기 유전자 생성물에 대한 항체,
(viii) 상기 유전자 생성물의 발현 및(또는) 단리 방법,
(ix) 약물로서 상기 DNA 서열 및(또는) 유전자 생성물의 용도,
(x) 제약상 활성 화합물, 및 그의 제조 방법 및 용도, 및
(xi) 상기 DNA 서열 및(또는) 유전자 생성물의 비치료적 용도
에 관한 것이다.

Description

ｅｅ３-단백질 족 및 상응하는 ＤＮＡ 서열 {ee3-Protein Family and Corresponding DNA Sequences}
본 발명은 (i) DNA 서열, (ii) 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, (iv) 본 발명의 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포, (v) 본 발명의 서열에 의해 코딩되는 유전자 생성물, (vi) 본 발명의 서열과 관련하여 변형된 유전자이전 동물, (vii) 본 발명의 유전자 생성물에 대해 생성된 항체, (viii) 본 발명의 유전자 생성물을 발현하고(거나) 단리하는 방법, (ix) 약물로서의 본 발명의 DNA 서열 및(또는) 유전자 생성물의 용도, (x) 제약상 활성 화합물 및 그들의 제조 방법 및 또한 이러한 본 발명의 화합물의 용도 및 (xi) 본 발명의 DNA 서열 및(또는) 유전자 생성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.
G 단백질-커플링된 수용체 (GPCR) 부류에 속하는 다수의 단백질이 선행 기술로부터 공지되어 있다. 이들은 신호 전달과 관련된 표면 분자의 가장 큰 족을 구성한다. 이들은 광범위한 리간드 또는 다른 자극물, 예를 들면 빛 (로돕신), 냄새, (후각물질 수용체), 칼슘, 아미노산 또는 생원성 아민, 뉴클레오티드, 펩티드, 지방산 및 지방산 유도체, 및 각종 폴리펩티드에 의해 활성화된다. 후각, 미각 또는 서골비 수용체를 코딩하는 약 1200종을 비롯한 GPCR 부류의 약 1500종의 상이한 단백질은 포유류에 존재한다. "고아" GPCR (즉, 지금까지 어떠한 기능성과도 관련될 수 없었던 수용체)의 총수는 200 내지 500개인 것으로 추정된다 (Howard AD, McAllister G, Feighner SD, Liu Q, Nargund RP, Van der Ploeg LH, Patchett AA (2001) Orphan G protein-coupled receptors natural ligand discovery. Trends Pharmacol Sci 22:132-140.). 카에노르하브디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans)에서, GPCR 서열은 약 5％의 게놈으로 구성되고, 약 1000개 GPCR 단백질을 코딩한다 (Bargmann CI (1998) Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science 282:2028-2033 and Bargmann CI, Kaplan JM (1998) Signal transduction in the Caenorhabditis elegans nervous system. Annu Rev Neurosci 21:279-308).
드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster)는 약 200개 GPCR 서열을 보유하는 것으로 선행 기술에서 밝혀져 있다 (Brody T, Cravchik A (2000) Drosophila melanogaster G protein-coupled receptors. J Cell Biol 150:83-88). 이러한 기하학적으로 유사한 분자의 광범위한 군은 G 단백질에 대한 커플링을 목표로 하여 집중적 방식으로 개발된 것으로 간주된다.
선행 기술에 따르면, GPCR의 부류는 3 또는 4 족으로 분류된다. A 족은 가장 다수의 구성원을 보유하며, 예를 들면, 또한 후각물질 수용체를 포함한다 (Buck L, Axel R (1991) A novel multigene fammily may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell 65:175-187.). B 족은 세크레틴, VIP 및 칼시토닌에 대한 수용체를 포함한다. C 족은 향대사성 글루타메이트 수용체, 칼슘 수용체, GABA-B 수용체, 미각 수용체, 및 페로몬 수용체와 같은수용체를 포함한다. 그러나, 실제적으로 모든 "고아" GPCR 서열은 A 족에 속한다.
GPCR 족의 한가지 특징은 G 단백질을 통한 신호 전달이다. 세포외 리간드의 결합은 신호를 전달하는 G 단백질의 활성화를 유도한다. 약 200종의 상이한 G 단백질이 존재하고, 각 종류의 세포는 상이한 셋트를 가질 수 있다. G 단백질의 활성 형태는 GTP-결합 형태이고, 상기 G 단백질은 불활성 상태로 GDP에 결합된다. G 단백질은 GTPase이기 때문에, 이는 GTP 결합 후에 그 자체로 불활성화된다. 이러한 이유로, G 단백질을 통한 신호 전달은 항상 일시적인 사건이다. 각 G 단백질은 알파, 베타 및 감마의 3가지 아단위로 구성된다. 알파 아단위는 GTP를 결합시킬 수 있으며, 따라서 실질적으로 하류 메신저 ("2차 메신저" 시스템)를 제어할 수 있다. G 단백질 Gs는, 예를 들면, 아데닐레이트 시클라제를 활성화시키고 (자극하고) 따라서 세포내 메신저 cAMP에서의 농도를 증가시킨다. G 단백질 Gi는 아데닐레이트 시클라제를 억제하고, Gq는 포스포리파제 C (2차 메신저: 이노시톨 트리포스페이트 및 디아실글리세롤)를 활성화시킨다. 빈번하게 사용되는 2차 메신저 시스템의 다른 예는 칼슘, K, cGMP 등이다. 또한, 키메라 G 단백질이 있다. G-베타 및 -감마 아단위는 또한, 예를 들어 MAP 키나제 신호 경로의 활성화에서 가능한 트리머 단백질 복합체로부터 분리된 후에 신호 전달을 야기할 수 있다. 특유한 GPCR의 G 단백질 커플링의 특이성은 특히 전형적으로 하류 메신저, 예를 들면 칼슘 cAMP 또는 이노시톨 트리포스페이트의 농도에서의 변화를 전형적으로 측정하는 분석법을 개발하기 위해 사용될 수 있는 중요한 약리학적 특징이다. 아주 최근, 문헌에서의 예비 결과는 또한 GPCR 신호를 전달할 수도 있는 MAP 키나제 신호 경로에대한 주의를 환기시켰다 (Marinissen MJ, Gutkind JS (2001) G protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci 22:368-376.).
최종적으로, G 단백질-독립적 신호 전달은 또한 원칙적으로 가능하다: 따라서, 예를 들면, 베타-2-아드레날린성 수용체와 NHERF 단백질과의 직접적 상호작용은 Na/H 교환체의 활성을 조절한다 (Hall RA, Premont RT, Chow CW, Blitzer JT, Pitcher JA, Claing A, Stoffel RH, Barak LS, Shenolikar S, Weinman EJ, Grinstein S, Lefkowitz RJ (1998) The beta2-adrenergic receptor interacts with the Na+/H+-exchanger regulatory factor to control Na+/H+ exchange. Nature 392:626-630).
전체가 아니더라도 다수의 GPCR 수용체에 적용되는 또 다른 특징은 올리고머화이다. 여기서 약리학적 프로파일 및 리간드 특이성을 변화시킬 수 있는 상이한 GPCR 사이의 헤테로이량체화가 특히 관심을 끈다 (Bouvier M (2001) Oligomerization of G protein-coupled transmitter receptors. Nat Rev Neurosci 2:274-286). 따라서, 예를 들면, GABA-B 수용체는 단지 GBR1과 GBR2간의 헤테로이량체로서 기능한다 (Kuner R, Kohr G, Grunewald S, Eisenhardt G, Bach A, Kornau HC (1999) Role of heteromer formation in GABAB receptor function. Science 263:74-77). 이후, 이러한 종류의 헤테로이량체화는 상당수의 GPCR, 예를 들면 mGluR5, 델타-오피오이드 수용체 등에 대해 기재되어 있다. 아주 최근, 자간전증의 경우에 질병을 유발하는 GPCR 헤테로이량체 쌍에서 하나의 파트너의 증가된 발현에 대해 증거가 발견되었다. 여기서, 브라디키닌 II 수용체의 증가된 발현은 변화된 약리학적 반응이 고혈압성 표현형을 설명할 수 있는 브라디키닌 II-안지오텐신 II 수용체 헤테로이량체의 증가된 형성을 유발한다 (AbdAlla, Lother, Massiery und Quitterer, Nat. Medicine (2001), 7, 1003-1009).
최종적으로, GPCR 부류의 단백질은 바람직한 약리학적 표적 분자이다. 100종의 베스트 셀링 약제 중 25％ 이상이 GPCR-부류 단백질을 표적화한다 (Flower et al., 1999, Biochim. Biophys. Acta, 1422, 207-234). 따라서, 하기 수용체 군의 아고니스트 및 안타고니스트가 특히 약리학적으로 가장 중요하다: 아드레날린 수용체 군, 안지오텐신 II 수용체, 세로토닌 수용체, 도파민 수용체, 히스타민 수용체, 류코트리엔/프로스타글란딘 수용체. 상기 수용체에 작용하는 약제는 정신의학적 증상 (정신분열증, 우울증)으로부터 고혈압에 대한 영향을 매개로 심장 발작용 응급 약제에 이르는 치료학적으로 광범위한 질병을 다룬다. 상기 수용체에 작용하는 통상의 약제의 공지된 예는, 예를 들면, 알파-아드레날린 수용체 아고니스트 (노르페네프린), 베타-아드레날린 수용체 아고니스트 (이소프레날린, 페노테롤), 알파-아드레날린 수용체 차단제 (프라조신), 베타-아드레날린 수용체 차단제 (프로파놀롤), 5-HT 안타고니스트 (시프로헵타딘), H2 수용체 차단제 (시메티딘), H1 수용체 차단제 (테르페나딘), 도파민 아고니스트 (브로모크립틴) 등이다.
그러나, 집중적인 연구 노력에도 불구하고, 상기 수용체에 의해 영향을 받는 신호 전달 경로는 여전히 불충분하게 밝혀져 있다. 또한, 특히 외부 생리학적 상태와 관련하여 각종 GPCR 시스템의 상호 영향의 복합 네트워크 및 하류 세포내 프로세스에 대한 그들의 작용의 보다 깊은 이해가 결여되어 있다.
본 발명의 목적은 GPCR 단백질 부류의 추가의 구성원 및 후자를 기초로 하는 뉴클레오티드 서열을 발견하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 확인된 단백질을 기초로 하여, 예를 들면, 이상조절된 발현 및(또는) 비기능적 변이체의 발현에 의해 유발되나, 또한 생리학적 발현의 경우에서 나타날 수 있는 병태생리학에서 치료학적으로 개재할 수 있는 치료상 활성 물질의 개발을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 또한 상응하는 물질을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 목적이 청구항 1, 5, 6, 8, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 23, 26 및 27의 주제에 의해 달성되는 것을 밝혀내었다. 유리한 실시양태는 관련된 종속항에 기재되어 있다.
본 발명의 한 주제는 임의의 기능적 상동성 유도체, 단편 또는 대립유전자를 비롯한, AA 10 내지 AA 45 (도 13에 따른 서열 5, 각 경우에 N 말단 내지 C 말단으로 칭함), 더 바람직하게는 AA 10 내지 65; AA 10 내지 AA 45 (도 14에 따른 서열 6), 더 바람직하게는 AA 10 내지 75; AA 10 내지 AA 45 (도 15A에 따른 서열 7A), 더 바람직하게는 AA 10 내지 60; AA 10 내지 AA 45 (도 15B에 따른 서열 7B), 더 바람직하게는 AA 10 내지 60, 보다 더 바람직하게는 AA 10 내지 AA 100; AA 10 내지 AA 45 (도 15C에 따른 서열 7C), 더 바람직하게는 AA 10 내지 60, 보다 더 바람직하게는 AA 10 내지 AA 100; AA 10 내지 AA 45 (도 15B에 따른 서열 7B), 더 바람직하게는 AA 10 내지 60, 보다 더 바람직하게는 AA 10 내지 AA 70; AA 10 내지 AA 45 (도 16에 따른 서열 8), 더 바람직하게는 AA 10 내지 60, 보다 더 바람직하게는AA 10 내지 AA 100; 또는 AA 10 내지 AA 45 (도 18에 따른 서열 11), 더 바람직하게는 AA 10 내지 60, 보다 더 바람직하게는 AA 10 내지 AA 100의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 영역을 포함하는 핵산 서열, 특히 DNA 서열에 관한 것이다. ee3 족의 단백질의 아미노산 서열, 및 본 발명의 단백질 또는 그의 단편의 C-말단 (세포내) 구획을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 영역 (바람직하게는 길이가 25개 이상인 AA)이 특히 포함되어야 하는 것이 추가로 바람직하다. 본 명세서는 특히 각 경우에 이중 가닥에서 상보적인 서열을 포함한 본 발명의 서열과 혼성화되는 임의의 핵산 서열을 또한 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태는 유전자 생성물이 각 서열 수 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 및 11에 대해 임의의 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 및 18에 제시된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 및 상기 DNA 서열의 임의의 기능적으로 상동성인 유도체, 대립유전자 또는 단편, 및 또한 생리학적 기능, 예를 들면 아포프토시스 신호 캐스케이드를 억제할 수 있는 비기능적 유도체, 대립유전자, 유사체 또는 단편 (예컨대 DN 변이체)을 개시한다. 본 발명의 상기 DNA 서열 (상보적 DNA 가닥의 서열 포함)과 혼성화되는 DNA 서열이 또한 본원에 개시되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 AA 서열의 유도체, 대립유전자, 단편 또는 유사체, 수 5 내지 8, 또는 다른 자연 수의 ee3 족은 1종 이상의 생물학적 특성을 보유한다. 상기 종류의 유도체, 유사체, 단편 또는 대립유전자는 표준 방법에 의해 제조된다 (Sambrook et al. 1989 und 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). 이러한 결과로, 전사 및 번역 후에 상응하는 천연 ee3 단백질과 상이한 폴리펩티드, 특히 하나 이상의 아미노산과 관련하여 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 제시된 서열을 수득하기 위해, 예를 들면 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 따른 ee3 족에 속하는 하나 이상의 코돈을 본 발명의 DNA 서열에 삽입, 결실 또는 치환시킨다.
본원은 또한 본 발명의 천연 ee3 서열의 부분 DNA 서열, 예를 들면 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 제시된 서열에 관한 것이다. 이들 부분 서열은 전형적으로 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 제시된 뉴클레오티드 서열의 단편을 포함하고, 이들 단편은 60개 이상, 더 바람직하게는 150개 이상, 및 보다 더 바람직하게는 250개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 부분 서열은 특히 C 말단 방향으로 20개 이상의 AA, 바람직하게는 40개 이상, 더 바람직하게는 60개 이상의 AA 20 (서열 5), AA 20 (서열 6), AA 20 (서열 7A), AA 20 (서열 7B), AA 10 (서열 7C) 및, AA 20 (서열 8)으로부터 연장되어 가장 바람직하게는 C 말단까지 연장되는 폴리펩티드 (각각 도 13, 14, SA, 15B, 15C, 16 및 18에 따라 넘버링됨)를 코딩한다. 한편, 20개 이상의 AA를 코딩하는 부분 서열은 또한 위에 언급된 지점으로부터 보다 근위부 또는 원위부에 위치한 코돈에서 개시될 수 있다. 상기한 부분 서열의 임의의 유도체, 유사체 또는 대립유전자가 또한 개시되어 있다. 본 발명의 상기 부분 DNA 서열로부터 생성된 AA 서열이 또한 단독으로 또는 보다 큰 재조합 단백질의 일부로서 개시되어 있다. 본 명세서는 또한 특히 본 발명의 서열의 임의의 발명가능하거나 천연 발생하는 스플라이스 변이체를 포함한다.
본 발명의 번호매김 5, 6, 7 및 8에 따른 서열과 60％ 이상, 바람직하게는80％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95％ 이상 상동성인 서열을 갖는 단백질이 코딩하는 핵산 서열, 특히 DNA 서열이 추가로 바람직하다. 예를 들어, 도 9, 10, 11A, 1113, 11C 또는 12에 따른 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 또는 비기능적 등가물, 예를 들어 대립유전자 변이체 또는 이소형태는, 예를 들면, 단리 및 서열분석 후에 수득할 수 있다. 대립유전자 변이체는 본 발명에 따르면 아미노산 수준에서 60 내지 100％, 바람직하게는 70 내지 100％, 매우 특히 바람직하게는 90 내지 100％ 상동성인 변이체를 의미한다. 대립유전자 변이체는 특히 하나 이상의 본질적인 생리학적 특헝울 여전히 보유하는 천연 ee3 서열, 예를 들면 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 따라 도시된 서열로부터의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 수득가능한 기능적 또는 비기능적 변이체를 포함한다.
상동체 또는 서열-관련된 DNA 서열은 본 발명의 핵산 서열 또는 그의 부분의 샘플과의 혼성화에 의해 상동체 스크리닝하는 통상의 방법에 따라 인간을 비롯한 임의의 포유류 종 또는 다른 종으로부터 단리될 수 있다. 기능적 등가물은 또한 천연 ee3 서열의 상동체, 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 도시된 서열, 예를 들면 다른 포유류로부터의 그들의 상동체, 코딩 및 비코딩 DNA 서열의 절단된 서열, 단일 가닥 DNA 또는 RNA을 의미한다. 이러한 기능적 등가물은, 예를 들면, 통상의 혼성화 방법 또는 PCR에 의해 포유류와 같은 다른 척추동물로부터 상기 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 도시된 DNA 서열 또는 상기 서열로부터 개시하여 단리할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이는 본 발명의 ee3 서열, 특히 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 따른 서열과 혼성화되는 임의의 서열을 포함한다. 이들 DNA서열은 표준 조건하에 본 발명의 서열과 혼성화된다. 유리하게는, 당업자에게 공지된 방식으로 결정할 수 있는 보존된 영역의 짧은 올리고뉴클레오티드가 혼성화에 사용된다. 그러나, 본 발명의 핵산의 보다 긴 단편 또는 전체 서열을 혼성화에 사용하는 것이 또한 가능하다.
상기 표준 조건은 혼성화에 사용된 핵산 서열 (올리고뉴클레오티드, 보다 긴 단편 또는 전체 서열)에 따라 및(또는) 핵산의 종류 (DNA 또는 RNA)의 따라 달라진다. 따라서, 예를 들면, DNA:DNA 하이브리드에 대한 융점은 동일한 길이의 DNA:RNA의 것보다 약 10℃ 낮다. 핵산에 따라, 표준 조건은, 예를 들면, 0.1 내지 5 x SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.2)의 농도를 갖는 수성 완충액 중에서 또는, 또한 50％ 포름아미드의 존재하에 42 내지 58℃의 온도에서, 예를 들면 5 x SSC, 50％ 포름아미드의 존재하에 42℃의 온도를 의미한다. 유리하게는, DNA:DNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 0.1 x SSC 및 약 20 내지 45℃, 바람직하게는 약 30 내지 45℃의 온도이다. DNA:RNA 하이브리드의 경우에, 혼성화 조건은 유리하게는 0.1 x SSC 및 약 30 내지 55℃, 바람직하게는 약 45 내지 55℃의 온도이다. 혼성화에 대해 제시된 이들 온도는, 예로서 길이가 약 100개 뉴클레오티드이고 포름아미드의 부재하에 G + C 함량이 50％인 핵산에 대해 계산된 융점이다. DNA 혼성화에 대한 실험 조건은 유전학의 전문가 교과서 (참조예: Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 기재되어 있고, 예를 들면, 핵산의 길이, 하이브리드 유형 또는 G + C 함량의 함수로서 당업자게에게 공지된 식에 따라 계산할 수 있다. 당업자는 하기 교과서에서혼성화에 대한 추가 정보를 찾을 수 있다: Ausuebel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids hybidization: A Practical Approach, IRL Press at oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
본 발명의 핵산 서열의 등가물은 특히, 예를 들면 프로모터 변이체와 같은 도 9, 10, 11A, IIB, 11C 또는 12에 제시된 서열의 유도체를 포함한다. 제시된 뉴클레오티드 서열의 상류에 함께 또는 개별적으로 위치하는 프로모터는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입(들) 및(또는) 결실(들)에 의해 변화시킬 수 있으며, 상기 프로모터의 기능성 또는 유효성을 보유하거나, 필요에 따라 변화시킬 수 있다. 따라서, 상기 프로모터의 서열을 변형시켜 그들의 유효성을 증가시키거나 그들을 다른 종의 유기체로부터의 보다 유효한 프로모터로 완전히 대체할 수 있다.
본 발명에 따르면, 유도체는 또한 개시 코돈의 -1 내지 -1000 상류 영역에서의 뉴클레오티드 서열이 유전자 발현 및(또는) 단백질 발현이 변화되는, 바람직하게는 증가되는 방식으로 변화된 변이체를 의미한다.
추가로, 유도체는 또한 바람직하게는 3' 말단에서 변형된 변이체를 의미한다. 문헌에서 공지된 상기한 "태그"는 각종 항체의 항원으로서 인식될 수 있는 헥사-히스티딘 앵커 또는 에피토프 (예를 들면 또한 플래그 태그) (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990:60-89 및 Ausubel et al. (eds.) 1998, CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), 및(또는) 번역된 단백질을, 예를 들면 특유한 세포 기관 또는 세포외 공간으로 수송하기 위한 하나 이상의 신호 서열이다.
또한, 본 발명의 핵산 작제물 또는, 예를 들면 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 따른 본 발명의 핵산 또는 그의 유도체, 변이체, 상동체 또는, 특히, 단편을 치료상 또는 진단상 적합한 형태로 발현시킬 수 있다. 재조합 단백질은 특유한 뉴클레오티드 서열에 의해 핵산 또는 핵산 작제물을 연장시킬 수 있는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 생성시키고, 따라서 본원에서 특히 상기한 태그 서열에 의한 연장과 관련하여, 예를 들어 단순 정제에 적합한 변형된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
추가로, 본 발명의 게놈 DNA 서열의 (c)DNA를 포함하거나 이에 상응하는 DNA 서열이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 추가로 서열 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 및 11을 갖는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 단백질을 코딩하는 임의의 DNA 서열을 개시하는 것이 바람직하다. 이들 DNA 서열은 위에서 언급된 도면에서 제시된 서열과 비교하여 소수의 변형만을 가지며, 예를 들어 이소형태일 수 있다. 서열 변형의 수는 전형적으로는 10개보다 많지 않을 것이다. 서열 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 및(또는) 11을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 본질적으로 상응하고 또한 생물학적 활성 단백질을 코딩하는 상기 DNA 서열은 익히 공지된 돌연변이 유발법에 의해 수득할 수 있고, 돌연변이체에 의해 코딩된 단백질의 생물학적 활성은스크리닝 방법, 예를 들면 결합 연구 또는, 예를 들면 신경세포 돌기와 관련하여 생물학적 기능을 발현하는 능력에 의해 확인할 수 있다. 상응하는 돌연변이 유발 방법은 하나 이상의 염기 변형을 갖는 프라이머의 자동화된 합성을 포함하는 "부위-지시된" 돌연변이 유발을 포함한다. 중합 반응 후에, 이종 이중나선 벡터를 적합한 세포계 (예컨대, 이. 콜라이 (E. coli))에 전달하고, 적합하게 형질전환된 클론을 단리한다.
본 발명의 서열의 기능성은 특히 본 발명의 단백질에 의해 유발된 신호 캐스케이드의 보다 원위 인자의 확인과 직접적으로 관련된다. 이 결과로, 본 발명에 따라, 본 발명의 수용체는 MAP 키나제를 자극하는 것으로 밝혀졌다. 상기 MAP 키나제를 확인하기 위해 적합한 리포터 분석법 (예시적인 실시양태 참조)을 이용하는 것과는 별도로, 달리 상기 목적을 위해 예비조립된 키트 (예컨대, 머큐리 (Mercury) 생체내 분석 키트; 클론테크 (Clontech)사 제품)를 사용하는 것도 가능할 수도 있다. 이는 인산화 표적의 상호활성화 도메인에 융합된 tet 리프레서 (전사 인자, 예컨대 jun)의 발현을 포함한다. tet-리프레서 인자의 제어하에 루시퍼라제 작제물의 활성화는 단지 상호활성화제 도메인이 키나제에 의해 특이적으로 인산화되는 경우에만 발생한다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따라 ee3 족의 본 발명의 수용체 또는 본 발명의 변이체의 활성을 세포 신호 전달 경로에 선정하는 것이 가능하다.
본 발명의 서열 동정은 또한 특히 EPO 발현이 증가된 동물 모델에서의 본 발명의 쥐과 ee3_1_m의 상향조절은 세포 생존 또는 상기 상태에 대한 세포 적응에 영향을 미치는 프로세스에서 상기 수용체의 병태생리학적 관련을 나타낸다는 기능적 발견을 기초로 한다. 따라서, 본 발명의 수용체는 감소된 산소 공급, 특히 감소된 뇌 산소 공급에 의해 병발되는 질환에 대해 특히 약리학적으로 중요하다.
또한, 본 발명의 DNA 서열의 제조, 변형 및(또는) 검출을 위해 당업자에게 익히 알려진 생체내, 동일 반응계 또는 시험관내에서 수행할 수 있는 임의의 방법 (PCR (Innis et al. PCR Protocols: A Guide to methods and Applications) 또는 화학적 합성)이 적합하다. 적합한 PCR 프라이머는, 예를 들면, 신규한 기능을 본 발명의 DNA 서열, 예를 들면, 제한효소 분해 부위, 종결 코돈 내에 도입할 수 있다. 이는 클로닝 벡터 내로 전달하기 위해 본 발명의 서열을 상응하게 디자인하는 것을 가능하게 한다.
본 발명은 또한 발현 벡터 또는 상기한 바와 같은 본 발명의 핵산 서열, 전형적으로는 DNA를 포함하는 재조합 핵산 작제물에 관한 것이다. 유리하게는, 본 발명의 핵산 서열은, 예를 들어, 전사 및 번역 신호와 같은 하나 이상의 유전자 조절 인자에 기능적으로 연결된다. 목적하는 용도에 따라, 이러한 연결은 자연적 발현율 또는 달리 자연적 유전자 발현에서의 증가 또는 감소를 발생시킬 수 있다. 이러한 방법으로 제조된 발현 벡터는 숙주 유기체 또는 숙주 세포, 예를 들면 포유류 세포의 세포 배양물을 형질변환시키기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터에 있어서, 천연 조절 인자(들)은 전형적으로, 즉, 예를 들면, ee3 족의 본 발명의 단백질, 특히 예를 들면 포유류로 유래의 서열 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 또는 11의 단백질, 특히 상응하는 인간 조절 서열에 대한 유전자의프로모터 및(또는) 인핸서 영역에 사용될 것이다. 위에서 제시된 이들 천연 조절 서열은, 필요에 따라 또한 변경된 발현 강도를 유도하기 위해 유전적으로 변형시킬 수 있다. 위에서 제시된 상기 천연 조절 서열 이외에 또는 상기 천연 조절 서열 대신에, 다른 유전자가 위에서 제시된 천연 조절 서열의 제어하에서의 천연 조절이 중단되고, 이에 의해 상기 유전자의 발현을 목적하는 바와 같이 증가시키거나 감소시킬 수 있도록 유전적으로 변형시킬 수 있는 본 발명의 DNA 서열의 조절 상류 및(또는) 하류 (5' 또는 3' 조절 서열)을 갖는 것이 가능하다.
본 발명의 방법의 유리한 조절 서열은 그램-음성 세균에서 유리하게 적용되는 Cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, l-PR와 같은 프로모터에 또는 l-PL 프로모터에 존재한다. 추가의 유리한 조절 서열은, 예를 들면, amy 및 SPO2와 같은 그램-양성 프로모터, ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH와 같은 그램-양성 프로모터 또는 CaM 키나제II, CMV, 네스틴, L7, EDNF, NF, MBP, NSE, 베타-글로빈, GFAP, GAP43, 티로신 히드록실라제, 카이네이트-수용체 아단위 1, 글루타메이트-수용체 아단위 B와 같은 포유류 프로모터에 존재한다. 원칙적으로, 상기한 바와 같은 조절 서열을 갖는 임의의 천연 프로모터를, 예를 들어, 본 발명의 발현 벡터에 사용할 수 있다.
또한, 합성 프로모터를 사용하는 것도 가능하고 유리하다. 이들 조절 서열은 본 발명의 핵산 서열의 표적화된 발현을 가능하게 하고자 한다. 숙주 유기체에 따라, 이는, 예를 들어 유전자가 도입 후에만 발현되거나 과발현되거나 즉시 발현되고(거나) 과발현되는 것을 의미할 수 있다. 조절 서열 또는 인자는 바람직하게는 발현에 유리한 영향을 미치고, 이에 의해 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 조절 인자는 유리하게는 프로모터 및(또는) 인핸서와 같은 강한 전사 신호를 사용함으로써 전사 수준으로 증강시킬 수 있다. 그러나, 또한, 예를 들어 mRNA의 안정성을 개선시킴으로써 번역을 증강시키는 것도 가능하다.
조절 서열은 전사 및(또는) 번역 수준에서 본 발명의 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 당업자에게 익히 알려진 임의의 인자를 의미한다. 프로모터 서열 이외에, RNA 폴리머라제와 DNA 사이의 개선된 상호작용을 통해 발현을 증가시킬 수 있는 "인핸서" 서열에 특히 중점을 두어야 한다. 예로서 언급할 수 있는 추가의 조절 서열은 "유전자좌 제어 영역", "사일런서" 또는 그의 특정한 부분 서열이다. 이들 서열은 유리하게는 조직-특이적 발현에 사용할 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 발현 벡터는 또한 용어 "조절 서열"하에 본 발명에 따라 포함되는 "터미네이터 서열"을 함유할 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 본 발명의 핵산 서열의 연결이며, 상기 프로모터는 전형적으로는 본 발명의 DNA 서열의 5' 상류에 위치한다. 추가의 조절 신호, 예를 들면, 3' 터미네이터, 폴리아데닐화 신호 또는 인핸서는 발현 벡터에 기능적으로 존재할 수 있다. 또한, 특히 도 9, 10, 11A, 11B, 11C 또는 12에 따른 서열에 대한 또는 상응하는 단백질에 대한 본 발명의 핵산 서열의 하나 이상의 복제물은 본 발명에 따른 유전자 작제물 내에 또는 경우에 따라 또한 별개의 유전자 작제물 상에 존재할 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 상기한 바와 같은 재조합 핵산 작제물 또는 유전자 작제물, 및 전형적으로는 또한 본 발명의 DNA 서열 이외의 추가 인자 및 가능하게는 조절 서열을 함유하는 전체 벡터 작제물를 포함한다. 이들 벡터 작제물 또는 벡터는 적합한 숙주 유기체 내에서의 발현에 사용된다. 유리하게는, 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열, 예를 들면 ee3 족, 특히 ee3_1 또는 ee3_2의 인간 유전자, 또는, 예를 들면, 상기 유전자의 부분 서열을, 상기 유전자를 상기 선택된 숙주 내에서 적합하게 발현시킬 수 있는 숙주-특이적 벡터 내로 삽입한다. 벡터는 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 ("Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-oxford, 1985, ISBN 0 444 904018))에서 찾아볼 수 있다. 벡터는, 플라스미드 이외에, 예를 들면, 파지, 바이러스, 예를 들면 SV40, CMV, 바큘로바이러스, 아데노바이러스, 신드비스 (Sindbis) 바이러스, 트랜스포존, IS 인자, 파스미드, 파지미드, 코스미드, 선형 또는 환형 DNA와 같이 당업자에게 공지된 임의의 다른 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 숙주 유기체 내에서 자율적으로 또는 염색체적으로 복제할 수 있다. 포유류 내로의 통합은 전형적으로는 선형 DNA를 사용한다.
유리하게는, 본 발명의 핵산 서열의 발현은 유전자 복제물의 수를 증가시키고(거나) 유전자 발현에 유리한 영향을 미치는 조절 인자를 증강시킴으로써 증가시킬 수 있다. 그러나, 이와는 별도로, 예를 들면, mRNA의 안정성을 향상시키거나 상기 mRNA의 리보좀 상의 판독 효능을 증가시킴으로써 번역을 증가시키는 것도 가능하다. 유전자 복제물의 수는 핵산 서열 또는 상동성 유전자를, 예를 들면 핵산 단편 또는 바람직하게는 특유한 유전자에 선정되는 조절 유전자 서열 내 또는 유사한 방식으로 작용하는 프로모터 활성을 함유하는 벡터 내로 혼입함으로써 증가시킬 수 있다. 유전자 발현을 증강시키는 조절 서열을 특히 사용한다.
본 발명의 핵산 서열은 상호작용하는 단백질 또는 잠재적으로 상호작용하는 단백질을 코딩하는 서열과 함께 단일 벡터 내로 클로닝시키고 후속적으로 시험관내 숙주 세포에서 또는 생체내 숙주 유기체에서 발현시킬 수 있다. 달리, 잠재적으로 상호작용하는 핵산 서열 및 ee3 족의 본 발명의 코딩 서열을 각 경우에 단일 벡터에 도입하고 상기 벡터를 개별적으로, 예를 들면 형질전환, 형질감염, 형질도입, 전기천공 또는 입자 총과 같은 통상의 방법에 의해 특유한 유기체에 수송하는 것이 또한 가능하다.
또 다른 유리한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 마커 유전자 (예컨대, 항체 내성 유전자 및(또는) 형광 단백질, 특히 GFP를 코딩하는 유전자)가 본 발명의 발현 벡터, 특히 전체 벡터 작제물 내에 존재할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 DNA 서열 및(또는) 본 발명의 발현 벡터, 특히 벡터 작제물로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 적합한 숙주 세포는 원칙적으로 본 발명의 DNA 서열 (결과로서, 예를 들면, 유도체로서 또한 그들의 대립유전자 또는 기능적 등가물을 포함함)을 단독으로 또는 다른 서열, 특히 조절 서열과 함께 발현될 수 있도록 하는 임의의 세포이다. 적합한 숙주 세포는 모든 원핵 또는 진핵 세포, 예를 들면 박테리아, 진균류, 효모, 식물 또는 동물 세포이다. 바람직한 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 바실러스 (Bacillus) 또는 슈도모나스 (Pseudomonas)와 같은 박테리아, 아스퍼길러스 (Aspergillus) 또는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵 효모와 같은 진핵 미생물이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)). 메틸 자화성 효모, 특히 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)는 비교적 다량의 본 발명의 단백질을 제조할 수 있는데 특히 및 유리하게 적합하다. 이러한 목적을 위해, 수용체를, 예를 들면, 또한 발현 정제에 유용한 태그 서열을 함유하는 융합 단백질로서 발현을 가능하게 하는 적합한 발현 벡터 내로 클로닝시킨다. 최종적으로, 효모의 전기천공 후에, 안정한 클론을 선택한다. 인비트로겐 (Invitrogen)사는 이에 필요한 방법 및 모든 수단의 우수한 설명을 제공한다. 발현 산물을 이후에 기능적으로 특성규명하고, 필요한 경우에 본 발명의 스크리닝 방법에 사용할 수 있다.
그러나, 바람직한 실시양태에 있어서, 다중 세포 유기체로부터의 세포를 본 발명의 DNA 서열의 발현에 대해 선택한다. 이는 또한 코딩된 단백질의 가능하게는 필요한 글리코실화 (N- 및(또는) O-커플링됨)의 배경에 대해 발생한다. 원핵 세포와는 대조적으로, 보다 고등 진핵 세포는 적합한 방식으로 상기 기능을 수행할 수 있다. 원칙적으로, 임의의 보다 고등 진핵 세포 배양물을 숙주 세포로서 이용가능하지만, 포유류, 예를 들면 원숭이, 랫트, 햄스터 또는 인간의 세포가 매우 특히 바람직하다. 확립된 세포주의 다중성은 당업자에게 공지되어 있다. 하기 세포주가 언급되며, 이들 목록이 전체는 결코 아니다: 293T (배아 신장 세포주), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1997)), BHK (햄스터 새끼 신장 세포), CHO (햄스터 난소 세포), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77:4216, (1980)), HeLa (인간 자궁 암종 세포) 및 다른 세포주, 특히 실험용으로 확립된 것, 예를 들면, CHO, HeLa, HEK293, Sf9 또는 COS 세포. 인간 세포, 특히 면역계 또는 성인 간세포, 예를 들면 조혈계의 간세포 (골수 유래)가 매우 특히 바람직하다. 본 발명의 인간 형질전환된 세포, 특히 환자의 자가 세포가 본 발명의 DNA 서열 또는 본 발명의 발현 벡터와의 (특히 생체외) 형질전환 후에, 즉 세포의 제거, 필요한 경우 생체외 증폭, 형질전환 선택 및 최종적인 재이식 후에, 예를 들면 유전자 요법의 목적을 위한 약물로서 매우 특히 적합하다.
기능적 특성규명을 위해 및 본 발명의 스크리닝 방법에서 사용하기 위해 곤충 세포에서 ee3 족의 본 발명의 단백질의 이종 제조법이 본 발명에 따라 특히 유리할 것이다. 곤충 세포에서의 내인성 G 단백질의 농도가 비교적 낮기 때문에, 예를 들면, Gi 단백질이 웨스턴 블롯에서 검출될 수 없음을 의미하고, 곤충 세포가 연구할 수용체를 정상적으로 발현하지 않기 때문에, 상기 세포는 ee3 족의 본 발명의 수용체의 신호 전달 경로의 생체내 재구성에 특히 적합하다. 이러한 경우에, ee3 족의 수용체는 각종 곤충 세포주, 예를 들면 Sf9, Sf21, Tn 368 또는 Tn 하이 파이브 (High Five), 또는 MB 세포 내에서 바큘로바이러스 발현 시스템에 의해 발현된다. 이러한 목적을 위해, 재조합 바큘로바이러스는, 예를 들면, BaculoGold 키트 (파르밍겐 (Pharmingen)사제)를 이용하여 제조하고, 상기한 곤충 세포주를 감염시킨다. 본 발명에 따라 G 단백질에의 커플링을 연구하기 위해, 공감염을 수행한다. 이러한 목적을 위해, 세포를 수용체 바이러스, 및 또한 또한 3종의 G 단백질 아단위를 발현시키는 바이러스로 감염시키고, 상응하는 분석법, 예를 들면 cAMP분석법을 수행한다. 따라서, 각종 G 단백질 아단위의 수용체의 활성에 대한 영향을 연구하는 것이 가능하다. 수용체를 발현시키는 곤충 세포 또는 그들의 막을 또한 스크리닝 분석법에서 사용할 수 있다. 곤충 세포를 용이하게 발효기 또는 쉐이커 플라스크 내에서 다량으로 증식시킬 수 있으며, 따라서 스크리닝 방법 및 수용체 정제를 위한 재조합 세포 또는 막 물질을 제공하기 위해 적합한 출발 물질이다.
숙주 세포 및 숙주 세포에 적합한 본 발명의 발현 벡터, 예를 들면 플라스미드, 바이러스 또는 파지, 예를 들면 RNA 폴리머라제/프로모터 시스템을 함유하는 플라스미드, 파지 l, mu 또는 다른 온화한 파지 또는 트랜스포존, 및(또는) 다른 유리한 조절 서열의 배합물은 발현 시스템으로서 작용할 수 있는 본 발명의 숙주 세포를 제조한다. 본 발명의 숙주 세포를 기재로 하는 본 발명의 발현 시스템의 바람직한 예는, 예를 들면 CHO 세포와 같은 포유류 세포 및 예를 들면, pcDNA3neo 벡터, 또는, 예를 들면, HEK293 세포 및 특히 포유류 세포에 적합한 CMV 벡터의 배합물이다.
본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 DNA 서열의 유전자 생성물에 관한 것이다. 유전자 생성물은 본 발명에 따르면 특히 정제된 형태의 일차 전사물, 즉 RNA, 바람직하게는 mRNA, 및 단백질 및(또는) 폴리펩티드를 의미한다. 이들 단백질은 아포프토시스 또는 괴사성, 또는 경우에 따라 염증성 신호 또는 세포 성장 또는 세포 가소성과 관련된 신호를 조절하거나 수송한다. 정제된 유전자 생성물은 상기 서열의 기능적으로 상동성이거나 기능-억제 (비기능적) 대립유전자, 단편, 유사체 또는 유도체를 포함하거나 전형적으로 상기 아미노산 서열로 구성될 경우에 바람직하다. 본 발명에 따르면, 기능적 상동체는 도 13 내지 16 및(또는) 18에 따라 제시되고 서열 5, 6, 7a (7b 및 7c 포함), 8 및 11로 지시된 단백질의 본질적인 기능적 특성 중 하나 이상이 보유되는 방식으로 정의된다. 전형적으로는, 기능적으로 상동성인 본 발명의 단백질은, 예를 들면, 단백질 상호작용 도메인인 본 발명의 단백질의 생물학적으로 기능적인 구획에, 예를 들면 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상 상동성인 서열을 가질 것이다. 본 발명에 따르면, 본 명세서는 특히 예시적인 실시양태 6에 따라 개시된 염색체 3, 5, 8 및 X 상의 상동성 서열, 및 또한 그들의 변이체를 포함한다.
본원에서 유도체는 특히 측쇄의 변형에 의해, 예를 들면 항체, 효소 또는 수용체의 본 발명의 AA 서열에의 접합에 의해 변형된 AA 서열을 또한 의미한다. 그러나, 유도체는 또한 하나 또는 달리 그 이상의 포스페이트 기의 당 (N- 또는 O-글리코시드 결합) 또는 지방(산) 잔기 (예컨대, 미리스트산)의 커플링 및(또는) 특히 유리 OH 기 또는 NH2 기의 본 발명의 올리고- 또는 폴리펩티드의 N 또는 C 말단 상에서의 측쇄의 임의의 변형일 수 있다. 또한, 용어 "유도체"는 융합 단백질, 즉 본 발명의 아미노산 서열이 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드에 커플링되는 단백질도 포함한다.
"유사체"는 천연 서열과 비교하여 하나 이상의 AA 변형 (삽입, 치환)에 의해 구별되는 서열을 나타낸다. 본 발명의 목적상, 치환된 AA (극성 AA, 장쇄 지방족, 단쇄 지방족, (-)하전 또는 (+)하전 AA, 방향족 기를 포함한 AA)의 물리화학적 특성 (용적, 염기도, 소수성 등)을 보유하는 보존적 치환이 바람직하다. 이러한 치환은 생물학적 기능성 서열, 부분적으로는 기능성 또는 생물학적 비기능성 서열을 초래할 수 있다. 예를 들면, 리신 잔기가 아르기닌 잔기를 치환할 수 있고, 이소루이신 잔기가 발린 잔기를 치환할 수 있으며, 글루탐산 잔기가 아스파르트산 잔기를 치환할 수 있다. 그러나, 하나 이상의 아미노산을 부가 또는 제거하거나 또는 그 순서를 변화시키는 것도 가능하며, 이들 중 몇몇을 서로 조합시키는 것도 가능하다. 이러한 방식으로 변경된 단백질을 천연 ee3 단백질, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18과 비교하고 (전형적으로는 상기 언급한 도면의 서열과 60％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상 동일함), 문헌 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990)에 의한 알고리즘에 따라 계산한다. 단리된 단백질 및 그의 기능성 변이체는, 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus) 또는 무스 무스쿨루스 (Mus musculus)와 같은 포유동물의 뇌로부터 유리하게 단리될 수 있다. 또한, 기능성 변이체는 다른 포유동물로부터의 동족체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 천연 서열에서 나타나는 2차 구조까지 보유한 유사체가 바람직하다. 또한, 보존적 치환에 더하여, 본 발명에 따라 보다 덜 보존적인 AA 변이체를 천연 서열에 도입하는 것도 가능하다. 보다 덜 보존적인 AA 치환은, 전형적으로 본원에서 이들의 생물학적 기능, 특히 아포토시스 또는 괴사 신호의 전달자로서 또는 세포 증식, 세포 가소성 또는 세포 성장에 대한 신호의 전달자로서의 기능을 보유한다. 치환 또는 결실의 효과는 적당한 연구, 예를 들면 결합 분석 또는 세포독성 분석에 의해 용이하게 시험할 수 있다.
그럼에도 불구하고, 본 발명은 또한 "우성 음성" 효과를 유발할 수 있는 서열, 즉 1차 서열 변경으로 인해 세포외 리간드에 대한 결합 활성은 여전히 보유하지만 신호를 하류로 (즉, 세포내로) 전달하지 못하는 서열도 포함한다. 본원에 개시될 수 있는 예로는 C 말단이 일부절단된 ee3_1 서열의 변이체, 예를 들면 또한 각각 도 11B 또는 11C 및 도 15B 또는 15C에 따른 2종의 스플라이스 변이체가 있다. 따라서, 이러한 종류의 유사체는 생물학적 기능, 특히 아포토시스의 억제제로서 작용한다. 이러한 종류의 유사체는, 전형적으로 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 서열 (전형적으로 서열 5, 6, 7(b,c), 8 및 11)의 "부위-지정 (site-directed)" 돌연변이유발에 의해 유전자 조작된다. 그 결과, 유사체의 기초가 되며 궁극적으로 재조합 세포 배양액 중에 단백질을 발현할 수 있는 DNA 서열이 생성된다 (상기 문헌 (Sambrook et al., 1989) 참조). 상기 언급한 AA 서열의 기초가 되는 DNA 서열 뿐만 아니라, 상기 언급한 유사체의 임의의 유도체도 개시되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 천연 AA 서열의 단편도 포함한다. 단편은 결실 (N- 또는 C-말단 결실, 또는 서열내 결실)에 의해 구별된다. 단편은 우성-음성 또는 우성-양성 효과를 나타낼 수 있다.
그러나, 본 발명의 유전자 생성물 (단백질)은 또한 본 발명에 따라 도면에 제시된 DNA 서열의 DNA 유도체, DNA 단편 또는 DNA 대립유전자로부터 전사 및 번역 후에 유래된 모든 유전자 생성물 (단백질)을 포함한다.
또한, 본 발명의 단백질은 화학적으로 개질될 수 있다. 따라서, 예를 들면보호기가 N 말단에 존재할 수 있다. 글리코실기가 히드록실 또는 아미노기에 부착될 수 있고, 지질은 본 발명의 단백질에 공유결합될 수 있으며, 이와 유사하게 포스페이트 또는 아세틸기 등이 부착될 수 있다. 임의의 화학물질, 화합물 또는 기가 임의의 합성 경로를 통해 본 발명의 단백질에 결합될 수도 있다. 부가의 아미노산, 예를 들면 개별 아미노산 형태, 펩티드 형태 또는 단백질 도메인 형태 등도 본 발명 단백질의 N- 및(또는) C-말단과 결합할 수 있다.
본원에서 특히 바람직한 것은 본 발명 단백질의 아미노산 서열 중 N-말단에 있는 "신호" 또는 "리더" 서열로, 이 서열은 펩티드와 함께 번역되거나 함께 전사되는 방식으로 해당 펩티드를 특정 세포 소기관 또는 세포외 공간 (또는 배양 배지)으로 이동시킨다. 항원으로서 본 발명의 아미노산 서열이 항체에 결합하도록 하는 아미노산 서열도 N 또는 C 말단에 존재할 수 있다. 본원에서 구체적으로 언급할 수 있는 것으로는 Flag 펩티드가 있고, 이는 1글자 아미노산 코드로 나타낸 서열이 DYKDDDDK이다. 또는, 3개 이상, 바람직하게는 6개 이상의 히스티딘 잔기를 갖는 His 태그가 있다. 이들 서열은 강력한 항원성을 가지기 때문에, 재조합 단백질의 신속한 시험 및 간편한 정제를 가능하게 한다. Flag 펩티드에 결합하는 모노클로날 항체는 이스트만 코닥 컴퍼니 (Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut)로부터 입수가능하다.
추가로, 본 발명은 천연 ee3 서열의 구획, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 개시된 서열의 구획에 관한 것이며, 이러한 구획은 20개 이상, 보다 바람직하게는 30개 이상, 보다 더 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함한다.이러한 종류의 부분 서열은, 예를 들면 당업자에게 공지된 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있고, 바람직하게는 항체를 생성하기 위한 항원으로서 사용된다. 바람직하게는, 이들 구획 및(또는) 유도체, 이들의 대립형질 또는 단편이 본원에 개시될 것이며, 이러한 서열은 단백질의 3차원 모델로 적어도 부분적으로는 본 발명의 천연 ee3 서열에서 단백질 표면을 구성하는 영역 (특히, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16의 영역)을 형성한다. 길이가 20 AA 이상인 바람직한 부분 서열은, 적어도 부분적으로는 본 발명 단백질의 세포질 구획을 포함할 것이며, 특히 바람직하게는 본 발명의 구획이 도 8에 따른 본 발명의 임의 서열의 20 AA 이상의 길이로 이루어진 펩티드를 포함할 것이다 ((도 8에 따른) 위치 600 내지 위치 752, 예를 들면 펩티드 WWFGIRKDFCQFLLEIFPFLRE (위치 609 내지 630, 길이: 21 AA)).
본 발명의 AA 서열, 예를 들면 인간 단백질 ee3_1 또는 ee3_2의 서열은 또한, GPCR 부류의 다른 대표 구성원의 유사한 형태에서 발견될 수도 있는 특이적 서열 모티프를 갖는다. 따라서, 예를 들면, GPCR 부류의 단백질에서는 제3 막횡단 도메인의 하류에 전형적인 시그너쳐 3중 서열 (signature triplet sequence)이 나타난다 (서열 DRY (1글자 코드의 AA)를 함유하는 서열).
본 발명의 ee3_1에 있어서, 서열 DRI (위치 103-105)는 (도 15A에 따른) TM3 (83-102)의 하류에서 발견될 수 있다. 선행 문헌에 공지된 GPCR 부류의 대표적인 구성원 (갈라닌-2 수용체, C5a 수용체 (래트), BK-2 (인간) 또는 CXCR-5 (인간))에 있어서, 서열 DRY 또는 DRF는 상응하는 위치에서 발견될 수 있다.
따라서 매우 특히 바람직한 것은, 만약 AA 삼중 DRI를 포함한다면, 길이가20 AA 이상인 본 발명의 상기 펩티드이다. 본원에서 언급할 수 있는 이러한 종류의 본 발명 펩티드의 예로는 서열 VLVCDRIERGSHFWLLVFMP를 갖는 펩티드가 있다. 이러한 종류의 본 발명 펩티드는, 특히 수용체의 생리학상 기능의 조절과 관련하여 사용될 수 있다. 세포에 그러한 펩티드 서열이 혼입되거나 일반적으로 입수가능한 경우, 세포내 신호 전달 과정의 아고니스트-의존성 활성화, 본 발명 수용체의 G 단백질과의 상호작용 활성화, 및 적절한 경우에 수용체 내재화 (internalization)가 영향을 받을 수 있다. 또한, 적절한 경우에 본 발명의 특정 올리고펩티드 또는 폴리펩티드가 하류 신호 전달 경로를 구성적으로 활성화시키는 데 기여할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 약물로서 사용하거나 약물의 제조를 위해 사용하기에 매우 특히 적합하다.
또한, 길이가 20 AA 이상인 본 발명 폴리펩티드 (예를 들면, ee3_1)의 처음 2개의 세포외 루프 (loop)는, 바람직하게는 2개의 보존된 시스테인 (도 15A에 따른 ee3_1에서의 위치 78 및 145)을 포함하며, 이는 GPCR 단백질 부류의 전형적인 특징이다 (제1 세포외 루프의 말단에 있는 서열 GETCV, 제2 세포외 루프의 중앙에 있는 서열 ELEILCSVNIL). 따라서, 본 발명 올리고펩티드의 서열은, 예를 들면 2개의 상기 언급한 서열을 포함한다.
마지막으로, 매우 특히 바람직한 것은 ee3 단백질 족의 서열 중 TM 영역으로부터 유래한 길이 20 AA 이상의 펩티드이며, 그 예로는 펩티드 LDGHNAFSCIPIFVPLWLSLIT (부분적으로 C-말단 TM 도메인을 포함함)가 있다. 이러한 종류의 본 발명 펩티드는, 바람직하게는 ee3 단백질의 수용체 작용의 조절을 위해사용되고, 특히 ee3 단백질의 수용체 작용의 억제를 위해 사용되며, 그러한 펩티드를 본 발명의 징후에 적용하는 치료 프로필은 아래에 설명한다. TM 구조를 억제하는 펩티드는 수용체의 기능적 변화, 특히 수용체의 기능적 손실을 유발하는데, 이는 정상적인 결합을 방해하기 때문이다. 본 발명에 있어서, 예를 들면 베타-2-아드레날린성 수용체의 6번째 TM 도메인에 대해 수행된 상응하는 방법 (Hebert TE, Moffett S, Morello JP, Loisel TP, Bichet DG, Barret C, Bouvier M (1996) A peptide derived from a beta2-adrenergic receptor transmembrane domain inhibits both receptor dimerization and activation. J Biol Chem 271:16384-16392)을 참조할 수 있다. 또한, 본 발명은 약물로서 사용하거나 약물의 제조에 사용하기 위한, ee3 단백질 족의 서열로부터 유래한 길이 20 AA 이상의 리간드-결합 펩티드 단편을 제공하는데, 이 단편은 결합 부위에 대해 천연 리간드 (세포외 또는 세포내 리간드)와 경쟁할 수 있으며, 이러한 방식으로 천연 ee3 리간드의 결합을 블로킹할 수 있다. 이러한 유형의 본 발명 펩티드는 "유인 (decoy) 수용체"인 것으로 보이며, 본 출원에서 언급한 모든 징후에서 치료 프로필을 나타낸다.
또한, 예를 들면 본 발명의 억제성 펩티드를 동정하는 방법을 개시한다. 본 발명에 있어서, 특히 타라소바 등에 의한 다른 정황의 방법 (Tarasova NT, Rice WG, Michejda CJ (1999) inhibition of G protein-coupled receptor function by disruption of transmembrane domain interactions. J Biol Chem 274:34911-34915)이 이를 위해 적합하며, 상기 문헌은 방법론과 관련하여 그 전문이 본 개시내용에 포함되는 것으로 간주한다. 본 발명의 이러한 억제성 펩티드는, 예를 들면 상이한TM 도메인의 분자내 상호작용 (본 발명의 ee3 단백질 족의 기능에 중요한 전제조건임)을 조절 (예를 들면, 억제)할 수 있다. 이러한 종류의 본 발명 펩티드는 또한 약물로서 또는 약물 제조를 위해 적합하다.
상기 언급한 유형의 본 발명 펩티드는 또한 펩티드 유사체 (펩티도-모방체 (peptido-mimetics))의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 경우, 주쇄의 아미드-유사 결합은 바람직하게는 다른 결합이지만 구조적으로 필적할만한 결합으로 대체되며, 이 결합은 바람직하게는 천연 인간 효소에 의해 절단되지 않는다. 본원에 적합한 것으로는, 예를 들면 올리고카르바메이트가 있다. 단량체 N-보호 아미노알킬 카르복실레이트는, 예를 들면 상응하는 아미노 알콜로부터 용이하게 제조될 수 있고, 염기-불안정성 Fmoc기를 이용하여 활성화된 에스테르로 전환된 후에 고상 합성에 도입될 수 있다. 이러한 종류의 유사체는 상응하는 펩티드보다 더 소수성이기 때문에, 이들은 혈뇌 장벽 (blood-brain barrier)을 극복하는 데 특히 적합하다 (즉, 신경계 용도의 약물로서 특히 적합하다).
추가로, 본 발명은 유전자이전 동물에 관한 것이다. 본 발명의 유전자이전 동물은, (예를 들면, 본 발명 유전자의 프로모터 영역 변형에 의해) 정상 동물과 비교하여 변화된 양의 본 발명 유전자 생성물이 하나 이상의 조직에서 발현되거나 그러한 조직에 함유되도록 유전자 변형된 동물이거나, 또는 변형된 유전자 생성물 (예를 들면, 본 발명에 기재된 ee3 단백질 족의 유도체, 또한 그의 단편)이 함유되거나 이 생성물이 발현되는 동물이다. 유전자이전 동물로는 (a) 유전자 수준에서 본 발명의 DNA 서열이 부분적으로 또는 완전히 존재하지 않거나, 또는 (b) 유전자수준에서는 본 발명의 서열을 여전히 가지고 있지만 그 유전자 생성물을 함유하지 않는 동물이 있다. 또한, 유전자이전 동물에서 본 발명의 천연 서열, 즉 ee3 단백질 족의 서열, 예를 들면 서열 5, 6, 7 (7b 및 7c 포함), 8 및 11 (존재하거나 존재하지 않음)은 본 발명의 DNA 서열 하나 이상에 의해 확장되고(되거나) 본 발명의 DNA 서열 하나 이상에 의해 치환될 수 있다. 치환되고(되거나) 삽입된 서열(들)은 특히 본 발명의 비-천연 서열일 수 있다.
본 발명의 서열에 대한 유전자이전 동물 및(또는) "낙아웃 (knockout)" 동물의 제조, 특히 마우스, 래트, 돼지, 소, 양, 초파리 (드로소필라), 씨. 엘레간스 또는 제브라 피쉬 (zebra fish)의 제조는 당업자에게 친숙한 방식으로 수행한다. 이를 위해, 예를 들면 본 발명의 cDNA 서열 또는 천연이나 비-천연 변이체를, 예를 들면 뉴런의 경우 NSE 프로모터 하에, 희소돌기 아교세포 (oligodendrocyte)의 경우 MBP 프로모터 하에 유전자이전 마우스에서 발현시킨다. 이어서, 유전자 변형 동물을 상이한 질환 모델 (예컨대, 실험적으로 유발된 발작, MCAO)에서 연구한다. 더욱이, 낙아웃 동물의 제조는 전체 생물체에서의 억제제 효과에 대한 정보를 제공하는데, 이는 이와 관련한 "낙아웃 모델"이 본 발명 천연 서열의 억제와 상응하기 때문이다. 이와 관련하여, 이러한 종류의 방법은 본 발명의 억제성 물질, 예를 들면 본 발명의 펩티드, 펩티드 유사체 또는 다른 작은 유기 화합물에 대한 전임상 시험에 사용할 수 있다.
본 발명에 따라, 모든 다세포 생물체, 특히 포유동물, 예를 들면 마우스, 래트, 양, 소 또는 돼지는 유전자이전 동물로 디자인될 수 있다. 유전자이전 식물도또한 원칙적으로 생각할 수 있다. 또한, 유전자이전 생물체는 "낙아웃" 동물일 수도 있다. 이와 관련하여, 유전자이전 동물은 본 발명의 기능성 또는 비-기능성 핵산 서열, 또는 기능성 또는 비-기능성 핵산 작제물을 단독으로, 또는 본 발명의 단백질을 코딩하는 기능성 또는 비-기능성 서열과 함께 함유할 수 있다.
상기 언급한 유전자이전 동물에 관한 본 발명의 추가 실시양태는, 생식세포 또는 전부 또는 일부의 체세포에서 본 발명의 천연 ee3 족 뉴클레오티드 서열 (특히 서열 1 내지 4)이 유전자적 방법에 의해 변화되거나 DNA 성분의 삽입에 의해 개재된 유전자이전 동물이다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부가 갖는 다른 가능한 용도는 유전자이전 또는 낙아웃 동물의 생성, 조건화 또는 영역-특이적 낙아웃 동물의 생성, 또는 유전자 변형 동물에서 특이적 돌연변이의 생성이다 (Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York und Torres et al., (eds.) 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford). 또한, 예를 들면 유전자이전 동물에서 ee3 단백질을 구성적으로 활성화시키기 위해 특정 돌연변이 (예를 들면, 프로모터의 변형 또는 인핸서의 삽입)를 도입 ("낙인 (knock-in)" 동물)하는 것도 가능하다. 또한, 그러한 동물은 본 발명에 따라서, 예를 들면 전임상 연구에서 ee3 단백질 기능의 잠재적 아고니스트에 대한 유사 모델을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
유전자이전 과발현, 또는 배아 간세포에서의 상동성 재조합에 의한 유전자 돌연변이 (눌 (null) 돌연변이, 또는 특이적 결실, 삽입 또는 변형)에 의해, 본 발명 서열의 (병리)생리학에 대한 가치있는 추가 정보를 제공할 수 있는 동물 모델을 생성하는 것도 가능하다. 이러한 방식으로 제조된 동물 모델은 본 발명 단백질 (특히, 신경, 면역학 또는 다른 과정에 있어서 서열 5 내지 8을 갖는 단백질)의 생물학적 기능에 영향을 주는 신규 치료제를 평가하는 데 필수적인 시험 시스템일 수 있다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 ee3 유전자 생성물 상의 에피토프, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 본 발명의 단백질, 또는 그의 유도체, 이소형 또는 대립형질 상의 에피토프를 인식하지만, 예를 들면 본 발명의 mRNA에 대해 유도될 수도 있는 항체에 관한 것이다. 용어 "항체"는 본 발명에 있어서의 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 키메라 항체, 항-유전자형 항체 (본 발명의 항체에 대해 유도됨)를 모두 포함하는 것이며, 이들 모두는 결합된 형태 또는 가용성 형태로 존재할 수 있고, 적절한 경우에 표지물에 의해 표지되고 상기 항체들의 단편일 수도 있다. 본 발명의 단리된 항체 단편 뿐만 아니라, 본 발명의 항체는 또한 다른 (단백질) 성분과의 융합 단백질로서 재조합 형태로 나타날 수 있다. 이와 같은 단편, 또는 융합 단백질의 일부로서의 본 발명 항체는 전형적으로 당업자에게 친숙한 효소 절단, 단백질 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명에 있어서, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 재조합 항체, 또는 이들의 단편이나 단일쇄 항체 또는 다른 합성 항체도 항체로서 언급된다.
폴리클로날 항체는 항체 분자의 이종 혼합물로, 항원을 사용하여 면역화시킨동물의 혈청으로부터 제조한다. 그러나, 본 발명은 또한 (예를 들면, 특이적 에피토프의 펩티드로 충진된 칼럼을 통해) 항체를 정제한 후에 얻은 폴리클로날 1가 항체도 포함한다. 모노클로날 항체는 항원에 대해 특이적으로 유도된 항체의 본질적으로 균일한 집단이며 본질적으로 동일한 에피토프-결합 부위를 갖는 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 선행 문헌 (예컨대, Koehler and Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); 미국 특허 제4,376,110호; Ausuebel et al., Harlow und Lane "Antikoerper"[Antibodies]: Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York)에 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 참고문헌에 기재된 내용은 본 발명의 개시 내용에 본 발명의 일부로서 포함된 것으로 간주한다.
또한, 상기 언급한 출원에 기재된 방법에 의해 본 발명의 항체를 유전공학적으로 조작하여 제조하는 것도 가능하다. 요컨대, 상기 제법은 항체-생성 세포를 배양하고; 상기 세포가 적당한 광학 밀도에 도달한 후에, 구아니디늄 티오시아네이트로의 세포 융해, 아세트산나트륨으로의 산성화, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜로의 추출, 이소프로판올로의 침전, 및 에탄올로의 세척을 통한 공지의 방법으로 상기 세포로부터 mRNA를 단리하는 것을 포함한다. 이어서, 역전사효소를 이용하여 상기 mRNA로부터 cDNA를 합성한다. 이어서, 합성된 cDNA를 직접 또는 유전자 조작 후에 (예를 들면, 부위-지정 돌연변이 유발, 삽입, 역위, 결실 또는 염기 치환의 도입에 의해) 적합한 동물, 진균, 박테리아 또는 바이러스 벡터에 삽입하여 상응하는 숙주 생물체에서 발현시킨다. 이. 콜라이 또는 효모 (예를 들면, 사카로마이세스 세레비지아에)에서 유전자의 클로닝 및 발현을 위한 박테리아 또는 효모 벡터, 예를 들면 pBR322, pUC18/19, pACYC184, 람다 또는 효모 mu 벡터가 바람직하다. 본 발명의 단백질에 대한 특이적 항체는, ee3 단백질 족이 병리생리학상 중요한 질병에 있어서의 진단 시약 및 치료제 둘 다로서 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 하기 부류의 면역글로불린, 즉 IgG, IgD, IgM, IgE, IgA, GILD 및, 적절한 경우에 상기 부류의 하위부류 중 임의의 것에 속할 수 있고, 예를 들면 하위부류는 IgG의 하위부류 또는 그의 혼합물을 의미한다. IgG 및 그의 하위부류, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgGM이 바람직하다. IgG 아형인 IgG1/k 또는 IgG2b/k가 특히 바람직하다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 클론은 시험관내에서, 계내에서 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 고역가의 모노클로날 항체는, 바람직하게는 생체내 또는 계내에서 생성된다.
본 발명의 키메라 항체는 각종 동물 종으로부터 유래한 각종 부분을 포함하는 분자이다 (예컨대, 쥐과 모노클로날 항체로부터 유래한 가변 영역 및 인간 면역글로불린의 불변 영역을 갖는 항체). 키메라 항체는, 한편으로는 투여시의 면역원성을 감소시키기 위해 사용되고, 다른 한편으로는 생성 수율을 증가시키기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 쥐과 모노클로날 항체는 하이브리도마 세포주로부터 높은 수율로 생성되며 인간에서 보다 더 높은 면역원성을 유발하기 때문에 인간/쥐과 키메라 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 키메라 항체 및 그의 제조 방법은 선행 문헌 (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984) ; Morrison et al. Proc. Natl. Acad. sci USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496; Morrion et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); Harlow and Lane, Antikoerper: A Laboratory Manual, 상기 인용)에 공지되어 있다. 이들 참고문헌은 본 발명에 개시 내용의 일부로서 포함된 것으로 간주한다.
이러한 종류의 본 발명 항체는, 매우 특히 바람직하게는 본 발명의 ee3 단백질 상의 세포외 구획, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 단백질 상의 세포외 구획 형태의 에피토프에 대해 유도될 것이다. 본 발명의 항체 (상기 개시된 모든 변이체)는 본 발명의 ee3 단백질 족을 억제하는 데, 예를 들면 실험 연구를 위한 시험관내에서, 계내에서 (예를 들면, 표지 목적으로), 또는 이들을 주사하여 (예를 들면, 정맥내, 피하, 동맥내 또는 근육내 주사) 치료에 사용하기 위해 생체내에서 유용할 수 있다.
본 발명의 항-유전자형 항체는, 대체로 본 발명 항체의 항원-결합 부위와 결합하고 있는 결정기 (determinant)를 인식하는 항체이다. 항-유전자형 항체는 동일한 종 및 동일한 유전자형의 동물 (예컨대, 마우스 계통)을 본 발명의 항-유전자형 항체를 유도하는 모노클로날 항체에 대한 출발 지점으로 하여 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 면역화된 동물은 유전자형 결정기에 대한 항체 (즉, 본 발명의 항-유전자형 항체; 미국 특허 제4,699,880호)를 생성함으로써 면역화 항체의 상기 유전자형 결정기를 인식할 것이다. 본 발명의 항-유전자형 항체는 다른 동물에서 면역 반응을 유도하기 위한 면역원으로서 사용될 수도 있고, "항-항-유전자형 항체"의 생성을 초래하기 위한 면역원으로서 사용될 수도 있다. 상기 항-항-유전자형 항체는 그의 에피토프 구성, 및 항-유전자형 반응을 유발하는 원래의 모노클로날 항체의 관점에서 동일할 수 있다 (반드시 동일할 필요는 없음). 이러한 방식으로, 모노클로날 항체의 유전자형 결정기에 대한 항체를 이용하여 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론을 동정할 수 있다.
본 발명의 단백질에 대해 유도된 모노클로날 항체, 및 본 발명의 상기 단백질에 대한 유사체, 단편 또는 유도체는 상응하는 동물 (예컨대, BALB/c 마우스)에서 항-유전자형 항체의 결합을 유도하는 데 사용될 수 있다. 그러한 면역화 마우스의 비장으로부터 채취한 세포를 사용하여, 항-유전자형 모노클로날 항체를 분비하는 항-유전자형 하이브리도마 세포주를 생성할 수 있다.
또한, 항-유전자형 모노클로날 항체는 지지체 (KLH; 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin))에 커플링된 후에 다른 BALB/c 마우스를 면역화시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 마우스의 혈청은 이후에 본래 모노클로날 항체의 결합성을 가지며 본 발명 단백질 또는 그의 단편이나 유도체의 에피토프에 특이적인 항-항-유전자형 항체를 함유한다. 이러한 방식으로, 항-유전자형 모노클로날 항체는 자신의 고유 유전자형 에피토프 또는 "아이디오토프 (idiotope)" (연구될 에피토프와 구조적으로 유사함)를 갖게 된다.
용어 "항체"는 무손상 분자 및 그의 단편 둘 다를 포함하는 것이다. 언급할 수 있는 단편으로는, 1개 또는 2개의 항원-보체 결합 부위를 갖는 임의의 일부절단된 또는 변화된 항체 단편, 예를 들면 상기 항체에 상응하는 결합 부위를 갖고 경쇄 및 중쇄로 구성된 항체 부분 (예를 들면, Fv, Fab 또는 F(ab')2단편 또는 단일 가닥 단편)이 있다. 일부절단된 이중 가닥 단편, 예를 들면 Fv, Fab 또는 F(ab')2가 바람직하다. Fab 및 F(ab')2단편은, 예를 들면 무손상 항체에서 Fc 단편이 결여된 것이기 때문에, 이들은 혈류로 보다 신속하게 전달될 수 있으며 무손상 항체보다는 조직 결합의 특이성이 비교적 낮다. 본원에서는 본 발명의 항체 자체 뿐만 아니라, 상기 항체의 Fab 및 F(ab')2단편도 본 발명의 단백질을 탐지 (정성적으로)하고 정량하는 데 사용될 수 있으며 (적절한 경우, 또한 본 발명 단백질의 단백질 활성 (예컨대, 특이적 인산화) 탐지), 본 발명 단백질의 단백질 활성에 대한 정성적 및 정량적 측정 및(또는) 정량법의 결과도 또한 본 발명의 주제이다.
이러한 종류의 단편은 전형적으로, 예를 들면 파파인 (Fab 단편 제조용) 또는 펩신 (F(ab')2단편 제조용)과 같은 효소를 사용한 단백질분해성 절단에 의해 제조되거나, 또는 상기 단편은 화학적 산화 또는 항체 유전자의 유전자 조작에 의해얻을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 목적을 위한 항체의 혼합물에 관한 것이다. 상기 항체 이외에, 본 발명에 따라 기재된 임의의 방법 또는 용도를 위해 항체들의 혼합물을 사용하는 것도 가능하다. 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 혼합물의 정제된 분획은 약물로서 사용되거나, 또는 예를 들면 뇌 국소빈혈 (예컨대, 발작), 퇴행성 질병, 특히 신경퇴행성 질병, 및 신경계 장애 (예컨대, 간질)의 치료를 위한 약물의 제조에 사용된다.
본 발명 항체들의 단편 및(또는) 이들의 혼합물을 비롯한 본 발명의 항체는, 세포 발현, 및 적절한 경우에 본 발명 단백질의 분비를 탐지하기 위한 샘플 등에서 본 발명 ee3 유전자 생성물 (특히, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 단백질, 또는 그의 단편 또는 유도체)의 정량적 또는 정성적 탐지에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 항체를 진단제로서 사용하는 것이 개시된다. 따라서, 예를 들면 본 발명의 항체를 통해 본 발명 유전자 생성물 (예컨대, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 단백질)의 양을 측정하고 가능하게는 그의 활성 (예컨대, 특이적 인산화)을 측정할 수 있다. 탐지는 광학 현미경, 유동 세포 계수기 또는 형광 탐지와 병행하여 형광 표지 항체를 사용하는 면역형광법에 의해 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 (이는 상기 항체의 단편 또는 항체들의 혼합물을 포함한다)는 조직학적 연구, 예를 들면 본 발명 단백질의 계내 탐지를 위한 면역전자현미경법의 과정에 적합하다. 계내 탐지는 환자로부터 조직학적 샘플을 채취하고,상기 샘플에 본 발명의 표지 항체를 첨가함으로써 수행할 수 있다. 항체 (또는 이 항체의 단편)는 표지된 형태로 생물학적 샘플에 적용된다. 이러한 방식으로, 샘플 중에서 본 발명 단백질의 존재 뿐만 아니라 연구되는 조직에서 본 발명 단백질의 분포도 결정할 수 있다. 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 조직 추출물, 수확된 세포 (예컨대, 면역세포 또는 심근세포 또는 간세포)이거나, 또는 일반적으로 조직 배양으로 인큐베이션된 세포일 수 있다. 표지된 항체의 탐지는 당업계 공지의 방법을 이용하여 표지의 유형에 따라 수행할 수 있다 (예를 들면, 형광법에 의해 수행함). 그러나, 생물학적 샘플은 고상 지지체, 예를 들면 니트로셀룰로스 또는 다른 지지체 물질에 적용되어, 세포, 세포 부분 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있다. 이후에 지지체는 적합한 완충액으로 1회 또는 수회 세척된 후, 본 발명에 따른 탐지가능하게 표지된 항체로 처리된다. 고상 지지체를 이후에 완충액으로 2차 세척하여, 결합되지 않은 항체를 제거할 수 있다. 이어서, 고상 지지체에 결합된 표지의 양은 종래의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
적합한 지지체로는, 특히 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 덱스트란, 나일론 아밀라제, 천연 또는 개질 셀룰로스, 폴리아크릴아미드 및 마그네타이트가 있다. 지지체는, 본 발명에 따른 조건을 충족시키기 위해 제한된 용해도를 갖거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 비드 형상과 같은 임의의 형상을 지니거나, 실린더형 또는 구형일 수 있으며, 바람직한 지지체는 폴리스티렌 비드이다.
탐지가능한 항체 표지는 각종 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 항체는 궁극적으로 면역분석법 (EIA)에 사용될 효소에 결합될 수 있다. 상기 효소는 이후에 상응하는 기질과 반응하여 탐지될 수 있고, 적절한 경우에 당업자에게 친숙한 벙법 (예컨대, 분광법, 형광법 또는 다른 광학적 방법)으로 정량화될 수 있는 화합물을 생성한다. 이 효소는 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 (staphylococcus) 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소메라제, 효모 알콜 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스포스페이트 이소메라제, 양고추냉이 (horseradish) 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제 또는 아세틸 콜린 에스테라제일 수 있다. 이후에 탐지는 표지에 사용된 효소에 특이적인 발색 기질을 통해 가능해지며, 궁극적으로는 예를 들면 대조군 표준과 비교하여 효소 반응에 의해 전환된 기질을 시각적으로 대조함으로써 수행할 수 있다.
또한, 탐지는 다른 면역 분석법, 예를 들면 항체 또는 항체 단편의 방사능표지 (즉, 방사면역분석 (RIA; Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing Company, New York (1978))를 이용하여 가능해질 수 있다. 방사성동위원소는 섬광계수기 또는 방사능사진을 이용하여 탐지 및 정량화될 수 있다.
형광 화합물도 마찬가지로 표지에 사용될 수 있는데, 그러한 화합물의 예로는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레사민이 있다. 형광-방출 금속, 예를 들면152E또는 란탄 계열의 다른 금속도 사용될 수 있다. 이들 금속은, 예를 들면 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (ETPA) 또는 EDTA와 같은 킬레이트화 기를 통해 항체에 커플링된다. 본 발명의 항체는 화학발광을 이용하여 작용하는 화합물을 통해 추가로 커플링될 수 있다. 화학발광 표지된 항체의 존재 여부는 이후에 화학 반응 과정 동안에 생성된 발광을 통해 탐지된다. 그러한 화합물의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 또는 옥살레이트 에스테르가 있다. 또한, 생물발광 화합물을 사용하는 것도 가능하다. 생물발광은 화학발광의 아형으로, 생물학적 시스템이나 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효능을 증대시키는 시스템에서 나타난다. 생물발광 단백질은 또한 발광에 의해 탐지되는데, 생물발광 화합물의 적합한 예로는 루시페린, 루시퍼라제 및 애쿠오린 (aequorin)이 있다.
또한, 본 발명의 항체는 면역측정 분석 (immunometric assay; 또한 "2-부위" 또는 "샌드위치" 분석으로도 공지됨)에 사용될 수 있다. 전형적인 면역측정 분석 시스템에는, 본 발명의 항체가 고상 시스템에 결합되고 그러한 방식으로 항체를 연구 대상 샘플과 접촉시키는 것에 의해 구별되는 "정방향 (forward)" 분석이 포함된다. 이 방법에서, 항원은 샘플로부터 2원 고상 항체-항원 복합체를 형성함으로써 샘플로부터 단리한다. 적합한 인큐베이션 기간 후에, 고상 지지체를 세척하여 결합하지 않은 항원 등을 비롯한 액상 샘플의 잔류물을 제거한 후, 미지량의 표지된 탐지 항체를 함유하는 용액과 접촉시킨다. 표지된 항체는 본원에서 "리포터 분자"로서 작용한다. 표지된 항체가 고상에 결합된 항원과 결합하도록 하는 2차 인큐베이션 기간 후에, 고상 지지체를 다시 세척하여 반응하지 않은 표지 항체를 제거한다.
다른 분석 형태도 "샌드위치" 분석을 이용할 수 있다. 이 경우, 고상-결합된 항체 및 표지된 항체 둘 다가 분석될 샘플에 동시에 적용된다면 단일 인큐베이션 단계만으로 충분할 수 있다. 인큐베이션이 완결된 후에, 고상 지지체를 세척하여 액상 샘플의 잔류물 및 비-결합된 표지 항체의 잔류물을 제거한다. 고상 지지체 상에 표지된 항체가 존재하는지 여부는 종래의 "정방향" 샌드위치 분석과 동일하게 결정한다. "역방향 (reverse)" 분석은 먼저 표지된 항체의 용액을 단계별로 액상 샘플에 첨가한 후, 가용 상태의 인큐베이션 기간 후에 고상 지지체에 결합된 표지되지 않은 항체를 혼합하는 것을 포함한다. 2차 인큐베이션 단계 후에, 고상 지지체를 종래의 방법으로 세척하여 샘플 잔류물 및 반응하지 않은 표지 항체를 제거한다. 고상 지지체와 반응한 표지된 항체는 이후에 상기한 바와 같이 측정한다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 ee 유전자 생성물, 즉 특히 임의의 유도체, 유사체 및 단편을 비롯하여 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 폴리펩티드를 발현하는 방법을 개시하며, 이 방법을 위한 숙주 세포는 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 것이다. 본 발명의 DNA 서열에 기초하여 유전자 생성물을 발현하는 이 방법은 상응하는 유전자 생성물을 농축 및 정제하지 않고, 오히려 본 발명의 DNA 서열을 도입함으로써 상응하는 유전자 생성물의 발현을 통해 세포성 대사에 영향을 미친다. 특히, 본원에서는 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 세포의 약물로서의 용도, 또는 약물 제조를 위한 용도가 제공되며, 이러한 용도는 특히 질병, 예를 들면 종양증, 신경계 장애, 신경퇴행성 질병 (예컨대, 다발성 경화증, 파키슨병), 뇌 국소빈혈 (예컨대, 발작)의 치료를 목적으로 한다. 본 발명의 숙주 세포는 일반적으로 아포토시스, 괴사, 세포 성장, 세포 분열, 세포 분화 또는 세포 가소성의 조절 불량에 기초한 질병을 위해 제공된다. 본 발명에 따라 이러한 방식으로 생체외 형질전환된 자가 또는 타가 숙주 세포는 이후에 환자에게 이식될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 아미노산 서열, 특히 서열 5, 6, 7 (7b 및 7c 포함), 8 및 11의 서열 중 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상의 AA 부분 서열에 상동성이 있는 부분 서열을 하나 이상 갖는 유전자 생성물을 단리하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 숙주 세포를 본 발명의 발현 벡터로 형질전환시킨 후, 상기 세포를 적합한 발현-촉진 조건하에 배양하여, 유전자 생성물이 배양액으로부터 최종적으로 정제될 수 있게 하는 것을 포함한다. 발현 시스템에 따라, 본 발명 DNA 서열의 유전자 생성물은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 단리될 수 있다. 당업자에게는, 본 발명의 DNA에 의해 코딩된 재조합 단백질을 정제하는 방법 및 구체적인 단리 방법이 숙주 세포의 유형, 또는 단백질이 배지에 분비되는지의 여부에 따라 현저히 달라질 수 있음이 분명할 것이다. 예를 들면, 재조합 단백질이 숙주 세포로부터 분비되도록 하는 발현 시스템을 이용할 수 있다. 이 경우, 배양 배지는 상업적으로 시판되는 단백질 농축용 필터, 예를 들면 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Milipore Pelicon)을 이용하여 농축시켜야 한다. 농축 단계 이후에 정제 단계, 예를 들면 겔 여과 단계, 또는 칼럼 크로마토그래피 방법을 이용한 정제가 뒤따를 수 있다. 그러나 별법으로, DEAE 매트릭스를 갖는 음이온 교환기를 이용할 수도 있다.
사용되는 매트릭스는 단백질 정제 분야에 공지된 임의의 물질, 예를 들면 아크릴아미드, 아가로스 또는 덱스트란 등일 수 있다. 그러나, 전형적으로 카르복시메틸기를 함유하는 양이온 교환기를 이용하는 것도 가능하다. 본 발명의 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 1회 이상의 HPLC 단계를 이용하여 추가로 정제될 수 있다. 특히, 역상 방법을 이용할 수 있다. HPLC 단계는 본 발명의 DNA 서열이 코딩하는 재조합 단백질을 본질적으로 균질하게 수득할 수 있도록 해준다.
또한, 유전자 생성물은 박테리아 세포 배양액 이외에 형질전환된 효모 세포를 이용하여 단리할 수도 있다. 이 경우, 번역된 단백질은 분비될 수 있기 때문에, 단백질 정제가 간편해진다. 분비된 재조합 단백질은 문헌 (Urdal et al., J. Chromato. 296:171 (1994))에 개시된 방법에 의해 효모 숙주 세포로부터 수득할 수 있으며, 상기 문헌은 본 발명 개시 내용의 일부로서 간주한다.
본 발명의 핵산 서열 (특히, 본 발명의 DNA 서열) 및(또는) 본 발명의 유전자 생성물은 약물로서 사용되거나, 또는 약물 제조를 위해 사용될 수 있다. 상기 약물은 그 자체로 투여되거나 (예컨대, 구강, 정맥내, 경구, 비경구, 비강, 피하 투여), 또는 다른 활성 화합물, 부형제 또는 전형적인 약물 첨가제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 핵산은 나출형 핵산, 특히 정맥내로 주사되거나, 또는 벡터에 포함되어 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 벡터는 플라스미드이거나, 또는 바이러스 벡터 (특히, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터)이거나, 또는 본 발명의 나출형 DNA 또는 본 발명의 DNA를 포함하는 플라스미드를 가질 수 있는 리포좀일 수 있다.
본 발명 서열의 용도, 특히 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 1 내지 8 또는 이들의 변이체가 지니는 용도, 및 본 발명의 단백질 헤테로머 (heteromer) 및 이로부터 유래한 본 발명의 시약 (올리고뉴클레오티드, 항체, 펩티드)의 용도는 치료 목적을 위한 약물 제조에 적합하다 (즉, 질병의 치료에 적합하다). 본원에서는 세포 사멸과 증식 사건의 항상성에 대한 조절 불량에 기초한 질병 또는 병리생리학적 상태의 치료를 위한 약물 제조 용도 또는 그러한 치료 용도가 매우 특히 바람직하다.
본원에 있어서, 세포의 전사 변화에 기여하는 작용을 할 수 있는 EPO가 본 발명 수용체 (예를 들면, ee3_1)의 전사를 직접 또는 간접적으로 상향조절한다는 본 발명의 발견도 특히 중요하다. 따라서, 본 발명의 수용체는 EPO의 작용을 매개하기 때문에, 이와 관련한 질병에 있어 매우 중요하다. 이는 특히, 본 발명의 수용체가 EPO의 특정 작용, 예를 들면 신경보호 작용 (예컨대, 신경퇴행성 질병; 여기서 전사 인자 NF-카파B의 활성화는 EPO의 신경보호 작용에 중요함), 또는 뇌 기능 증가 (예컨대, 치매에서)에 선택적으로 영향을 미칠 수 있음을 의미한다.
동물 실험에 대한 상응하는 연구에 의해 본 발명의 주제 물질은 뇌경색, 실험적으로 유도된 뇌척수염 또는 거미막하출혈 등의 신경학적 질환의 모델에 기능적으로 귀속된다.
이는 상기 부분적인 작용의 경우에 바람직한데, 그 이유는 EPO의 투여가 신경보호작용 이외에 상기 신경보호작용과 부분적으로 상충되는 적혈구용적율(hematocrit)의 증가를 유발하며, 혈액의 유동학적 특성이 저하되어, 문헌 (Weissner et al., 2001, J Cereb Blood Flow Metab, 21, 857-64)에 따라 마우스에서 에리트로포이에틴의 과발현에 의해 증명되는 바와 같이, 미세순환에 악영향을 주기 때문이다.
따라서, 본 발명의 주제 물질의 용도, 예를 들어 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드, 발현 벡터, 숙주 세포의 용도 또는 조절과 관련된 본 발명의 수용체의 임의의 위치에 부착할 수 있는 대용 (surrogate) 리간드의 용도는 신경학적 질환, 특히 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 특히 적합하다.
본 발명을 이용하여, 본 발명의 ee3 족 단백질 또는 그의 천연 변이체를 발현하는 임의의 세포 유형, 특히 신경 세포에서, 예를 들어 세포-세포 상호작용, 특히 G-단백질과 커플링된 단백질을 포함하는 상호작용을 조절함으로써 세포 사멸 프로세스, 예를 들어 아포토시스를 초래하는 캐스케이드 또는 괴사를 초래하는 프로세스에 영향을 줄 수 있다.
본 발명에 따라, 본 발명의 천연 단백질, 특히 서열 5 내지 8을 갖는 천연 단백질은 세포내 신호전달 경로의 일부인 수용체로서, 통상적으로는 신호 캐스케이드의 출발점으로서의 역할을 하며, 그의 조절장애는 다수의 질환의 원인이 된다. 이러한 측면에서, 상기 언급한 본 발명의 단백질은 특히, 예를 들어 신호 전달과 같은 세포 프로세스의 성분으로 존재할 수 있으며, 일반적으로 세포 분화, 세포 분열, 성장, 가소성, 재생, 세포 분화, 증식 또는 세포 사멸에 대해 작용한다. 따라서, 본 발명의 단백질, 예를 들어 ee3_1 또는 ee3_2의 기능부전 또는 그의 비기능성 발현 또는 과발현은, 예를 들어 세포 분화, 세포 성장, 세포 가소성 또는 세포 재생의 조절장애에 의해 동반되는 병리생리학적 증상을 유발할 수 있는 것이 통상적이다. 한편, 다른 메카니즘이 병리생리학적 증상, 예를 들어 본 발명의 ee3 수용체의 천연 리간드의 기능부전 또는 과기능을 초래하기도 한다. 이러한 병리생리학적 질환의 분자 메카니즘에 따라, 본 발명의 기능성 단백질의 투여 또는 적어도 그보다 더 많은 상기 단백질의 발현, 또는 세포에서 과발현 또는 발현되는 비기능성 단백질의 억제는 치료 목적상 바람직할 수 있다. 본 발명의 서열, 특히 서열 1 내지 11의 서열은 신경 세포 사멸, 자극 및 신경발생에서의 그의 기능과 관련하여 사용하는 것이 매우 특히 바람직하다. 본 발명의 이러한 발견에 의해, 본 발명의 서열 (뉴클레오티드 및 아미노산 서열) 및 상응하는 유도체 (예, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 항체)의 서열을, 종양증 및 신경학적 질환, 특히 허혈성 증상(졸증), 다발성 경화증, 신경퇴행성 질환, 예를 들어 파킨슨씨 병, 근위축성 측삭 경화증, 유전변성 운동실조증, 신경병증, 헌팅턴병, 간질 및 알쯔하이머병의 치료를 위한 약물의 제조에 이용할 수 있음을 밝혀냈다. 또한, 에리트로포이에틴의 발현이 증가하는 경우에서의 상향조절로 인해, 본 발명의 주제 물질은, EPO가 (보호) 작용하는 임의의 병리학적 프로세스 (예, 졸증, 및 임의 형태의 급성 및 만성 저산소증)에 사용하기 적합하다.
본 발명에 있어서, 효소 보완에 의해 측정하는, 기능성 수용체 활성화에 관한 세포-기초의 HTS 분석법은 분자 관계에 기초하는 다른 적응증을 얻는데 적합한것으로 입증되었다. 이 분석법은 GPCR의 전체적인 조절 메카니즘을 기초로 하며, 활성화된 수용체와 베타-어레스틴(arrestin)의 상호작용을 측정한다. 이를 위해, 상호 보완성의 불활성 베타-갈락토시다제 단편들을 상기 수용체의 C 말단 및 베타-에레스틴에 융합시킨다. 상기 수용체의 활성화는 베타-어레스틴을 보충한다. 이로써 베타-갈락토시다제의 절반 2개가 함께 동반되어, 측정된 신호로서 작용하는 상응하는 기질을 전환시킬 수 있는 베타-갈락토시다제 효소를 기능화한다(ICAST 시스템). 원칙적으로, 상기 분석은 상호 보완성인 절반 2개로 된 융합 단백질로서 발현될 수 있는 임의의 효소를 사용하여 수행할 수 있으며, 통상의 측정법에 의해 기록할 수 있는 기질 반응을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 서열의 치료 용도, 즉 본 발명의 핵산 서열 또는 단백질 서열, 특히 번호 1 내지 4 또는 5 내지 8의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열, 또는 상기 정의한 바와 같은 그의 변이체, 특히 단편의, 포유동물, 예를 들어 인간의 유전자 요법 또는 이러한 종류의 유전자 치료 방법에 있어서의 용도에 관한 것이다. 이러한 유전자 요법은 본 명세서의 청구범위 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 본 발명의 서열을 체내 또는 그의 부분, 예를 들어 개별 조직에 도입하거나 또는 본 발명의 서열의 발현에 영향을 주는 임의의 형태의 요법을 포함한다. 이를 위해, 당업자에게 친숙한 임의의 변형을 유전자 요법의 과정 동안 이용할 수 있으며, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 예컨대 본 발명의 서열을 포함하며 임의로 변형될 수 있는 안티센스 또는 하이브리드 RNA-DNA 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 임의의 서열 (이는 단편, 이소형태,대립유전자, 유도체 등의 임의의 변이체를 포함함)을 포함하는 바이러스 구조물을 사용할 수 있다. 본 발명의 상응하는 나출형 DNA 서열은 또한 유전자 요법에 적합하다. 유사하게, 유전자 치료 목적을 위한 효소 활성을 갖는 핵산 조각 (예, 라이보자임)을 이용할 수 있다.
치료적 이용 이외에, 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드, 본 발명의 단백질 헤테로머 및 이들로부터 유도된 시약 (올리고뉴클레오티드, 항체, 펩티드)의 진단적 용도는 또한, 예를 들어 임신 테스트 과정 동안 인간 질환 또는 유전적 소인을 진단하는 데 적합하다. 상기 질환 또는 소인으로는 특히 치료적 이용과 관련하여 상기 언급한 질환, 특히 신경학적 질환, 면역학적 질환 또는 종양증이 있다. 이러한 진단 방법은 생체내 방법으로 설계할 수 있지만, 통상적으로는 생체외 방법으로 설계된다. 본 발명의 진단 방법의 통상의 생체외 적용은 생물학적 샘플 중의 본 발명의 핵산을 정성적 및(또는) 정량적으로 검출하는 데 유용할 것이다. 이러한 종류의 방법은 바람직하게는 (a) 생물학적 샘플을, 공지된 양의 본 발명의 핵산 또는 이러한 본 발명의 핵산의 증폭을 위한 프라이머로서 적합한 공지된 양의 올리고뉴클레오티드와 인큐베이션하는 단계, (b) 상기 본 발명의 핵산을 특이적 혼성화 또는 PCR 증폭에 의해 검출하는 단계, (c) 혼성화 핵산의 양 또는 PCR 증폭에 의해 얻은 핵산의 양을 정량 표준과 비교하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 생물학적 샘플을, 본 발명의 단백질 헤테로머 또는 본 발명의 단백질/폴리펩티드에 대해 특이적으로 지시되는 항체와 인큐베이션하는 단계, (b) 항체/항원 복합체를 검출하는 단계, 및 (c) 항체/항원 복합체의 양을 정량표준과 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중의 본 발명의 단백질 헤테로머 또는 본 발명의 단백질을 정성적 및(또는) 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 표준은 일반적으로 건강한 유기체로부터 취한 생물학적 샘플이다. 이 경우, 특히 진단 목적상, 특징적인 병리생리학적 자극 이후에 본 발명 서열의 mRNA의 세포내 양이 변화, 예를 들어 증가하는 특성인 본 발명의 유전자, 예를 들어 ee3_1 유전자의 특성을 이용할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따라, 본 발명의 단백질의 발현 비율 변화를 수반하는 질병(예를 들어, 졸증 등)의 예측, 성공적인 질병 치료의 평가 또는 질병의 분류를 수행할 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 방법을 이용하여 상기에 나타낸 질환의 치료를 모니터링할 수 있다.
본 발명의 서열은, 예를 들어 인간에서 상기 서열의 다형성을 결정하는 방법에서 사용할 수 있다. 그에 따라 결정된 본 발명의 서열의 다형성은 본 발명의 개시내용에 포함될뿐 아니라, 예후 진단용 마커 역할을 하거나 또는 본 발명의 서열의 비기능성 발현, 본 발명의 비기능성 서열의 발현 및(또는) 그의 과발현으로 인한 것과 관련이 있는 질환의 예후를 진단하는 역할을 할 수도 있다. 또한, 본 발명의 서열을 이용하여 인간의 유전 질병, 즉 단일유전자 질병 및 다유전자 질병을 연구할 수 있다.
인간 및(또는) 동물 의학 분야에 있어서의 치료 및(또는) 진단용 목적 이외에도, 과학적 용도를 위한 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 용도가 또한 고려된다. 특히, 본 발명의 서열을 이용하여 단세포 또는 다세포 생물내의 관련 서열을 당업자에게 공지된 방식, 예를 들어 cDNA 라이브러리에 의해 동정하거나, 관련 서열을 인간 게놈내에 위치시킬 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 특히 서열 1 내지 4의 서열 (임의의 변이체 포함)을 이와 같이 사용하여, 예를 들면 쥐과 동물 또는 다른 동물 게놈 및 인간 게놈에서 통상의 방법을 이용하는 상동성 스크리닝에 의해, 상기 핵산 또는 그의 기능성 등가물, 동족체 또는 유도체를 코딩하는 mRNA에 대한 유전자를 단리하고, 맵핑하고, 인간 유전 질환 유전자에 대한 마커와 상호관련시킬 수 있다. 이 방법에 의해, 예를 들면 인간에서 ee3 족의 서열의 염색체 유전자좌(locus)(염색체 2 (2q14.2); X-염색체 (Xq28, LocusID: 84548); 염색체 5, 염색체 8, 염색체 3; 염색체 7)를, 표현형이 알려져 있는 특정의 유전 질병, 특히 종양증(예컨대, 간세포 암종)과 통상적으로 상호관련시킴으로써 상기 질병의 진단을 상당히 단순화하고, 새로운 치료 방법을 고안할 수 있다. 이러한 사항은 본 발명의 단백질에 적용된다.
따라서, 본 발명의 핵산을 이용해서, 특히 인간 유전 질환, 즉 단일유전자 질병 및 다유전자 질병 둘 다를 진단할 수 있으며, 그 결과, 상기 핵산을 마커로서 사용하여 유전 질병에 대한 본 발명의 진단 방법을 형성시킨다.
본 발명은 특히 본 발명의 아미노산 및(또는) 핵산 서열을 기초로 하는, 과학적 용도를 위한 분석 시스템을 개시한다. 이와 관련하여, 본 발명의 핵산 서열의 cDNA, 게놈 DNA, 조절 요소, 및 그의 폴리펩티드 및 재조합 또는 비-재조합 단편을 사용하여 분석 시스템을 개발할 수 있다. 본 발명의 이러한 분석 시스템은 시험 물질의 존재하에 프로모터 또는 단백질의 활성을 측정하는 데 특히 적합하다. 상기 분석 시스템은 바람직하게는 다수의 시험 물질을 신속하게 측정할 수 있는 간단한 측정 방법 (열량측정법, 발광측정법, 형광-기초의 방법 또는 방사활성 방법)을 포함한다 (Boehm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign (Drug Design), Spektrum-Verlag, Heidelberg). 기재된 분석 시스템에 의해 화학 라이브러리를 본 발명의 단백질, 특히 서열 5 내지 8의 단백질 (예컨대, 그의 유도체 또는 단편)에 대해 억제 방식 또는 활성화 방식으로 작용하는 물질에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 물질의 동정은 ee3-관련 신호 전달에 대해 특이적으로 작용하는 신규 약물을 동정하는 과정의 제1 단계이다. 이는 특히 G 단백질-커플링된 단백질의 공지된 특성을 이용하는 분석 시스템, 예를 들면 하기 개시된 분석 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 단백질의 생물학적 활성, 통상적으로 아포토시스, 증식, 재생, 세포 성장에 관련된 생물학적 활성은 필요에 따라, 예를 들면 각각 서열 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 및 11을 갖는 단백질의 천연 서열의 안티센스 가닥 (또는 그의 일부)을 코딩하는, 통상적으로 뉴클레오티드 10개 이상 길이의 올리고뉴클레오티드를 당업자에게 친숙한 방법을 이용하여 감염된 세포에 도입함으로써 발작, 패혈증성 쇼크, GvHD (이식편 대 숙주 질환), 퇴행성 질병, 특히 신경퇴행성 질병, 급성 간염 또는 본원에 개시된 다른 적응증의 경우에 억제할 수도 있다. 이는 적절하게 형질전환된 세포에서 차단되는, ee3 족, 예를 들면 ee3_1 또는 ee3_2의 본 발명 단백질의 천연 mRNA를 번역함으로써, 바람직하게는 형질감염된 세포의 생존성, 또는 세포 성장, 세포 가소성, 세포 증식에 대한 조절 효과를 증가시킨다. 또한 이 경우, 재조합 바이러스를 이용해서 상기 기술한 방법을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 서열의 상응하는 조절장애를 기초로 하는 질병 (예를 들면, 상기 언급한 적응증)에서 병리학적으로 증가된 세포 아포토시스, 세포 증식을 라이보자임 방법에 의해 치료할 수도 있다. 이를 위해, 표적 mRNA를 절단할 수 있는 라이보자임을 사용한다. 따라서, 이 경우에 본 발명은 천연 ee3 mRNA, 예를 들면 ee3_1 또는 ee3_2의 mRNA를 절단할 수 있는 라이보자임을 개시하며, 그에 관한 것이다. 본 발명의 라이보자임은, 예를 들면 염기쌍 형성을 통해 본 발명의 표적 mRNA와 상호작용할 수 있어야 하며, 이어서, 예를 들면 ee3_1 또는 ee3 2의 번역을 차단하기 위해 상기 mRNA를 절단할 수 있어야 한다. 적합한 벡터 (특히 플라스미드, 변형된 동물 바이러스, 특히 레트로바이러스)를 통해 본 발명의 라이보자임을 표적 세포에 도입하며, 이러한 벡터는 다른 서열 이외에도, 적절한 경우에 본 발명의 라이보자임에 대한 cDNA 서열을 갖는다.
본 발명의 유전자 생성물의 생물학적 기능 조절, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 유전자 생성물의 생물학적 기능 조절, 통상적으로 아포토시스성 또는 괴사성, 증식성 또는 성장-지시성 신호 전달에서 본 발명의 유전자 생성물의 기능 조절은 상기 언급한 그의 가능성 이외에도 본 발명의 다른 주제 물질에 의해서도 가능하다. 본 발명의 화학 화합물은 특히 본 발명의 ee3 족 단백질의 세포내 기능을 조절, 통상적으로 억제하거나 활성화할 것이며, 본 발명의 기저 DNA 서열의 수준에서, 예를 들면 DNA (예컨대, 프로모터 영역)에 결합하거나 본 발명의 유전자를 조절하는 전사 인자들 중 어떤 것에 결합함으로써 생물학적 기능에 영향을 줄 것이다. 본 발명의 화합물은 통상적으로 본 발명의 단백질, 특히 아미노산서열 1 내지 4 중 어떤 것을 갖는 단백질, 또는 본 발명의 핵산 서열, 특히 서열 5 내지 8 중 어떤 것을 갖는 핵산 서열에 특이적으로 결합함으로써 약리학적 작용, 특히 신경보호 작용, 면역조절 작용, 항-아포토시스 작용 또는 항-증식 작용을 유발할 것이다.
따라서, 본 발명은 화학 화합물, 바람직하게는 분자량이 5,000 미만, 특히 3,000 미만, 특별하게는 1,500 미만이고, 통상적으로 생리학적으로 충분히 허용되는 것이며, 바람직하게는 혈-뇌 (blood-brain) 장벽을 통과할 수 있는 유기화학 화합물을 개시한다. 적절한 경우에, 상기 화합물은 하나 이상의 추가의 활성 화합물 및 바람직하게는 보조제 및(또는) 첨가제를 함유하는 조성물의 일부일 것이며, 약물로서 사용될 수 있을 것이다. 본 발명의 단백질, 특히 본 발명의 단백질의 C-말단, 세포질 도메인 또는 세포외 도메인에 결합하는 결합 상수가 107mol-1이상인 경우의 유기 분자가 특히 바람직할 것이다. 본 발명의 화합물은 경우에 따라 적절한 변형, 예를 들면 부착된 AA 서열에 의한 변형 이후에 확산에 의하거나 또는 막(막내) 전달 단백질을 통해 세포막을 통과할 수 있게끔 설계하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명의 ee3 족 단백질과, 특히 아포토시스 신호, 괴사 신호, 증식 신호, 성장-지시 신호 또는 재생 신호에 대한 결합 파트너와의 상호작용을 억제하거나 증대시키는 화합물이 보다 바람직하다. 이러한 종류의 화합물은 본 발명의 단백질 표면상의 특정 위치를 차지하거나 또는 본 발명의 단백질의 국소적인 형태 변화를 유발함으로써 천연 결합 파트너가 본 발명의 단백질과 결합하는 것을 방지한다.
본 발명의 단백질의 구조적 분석에 의해 특이적 결합 친화성을 갖는 본 발명의 화합물을 특이적으로 찾아낼 수 있다 (Rationales Drug Design (Boehm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg)). 여기서, 본 발명의 단백질들 중 어떤 것, 특히 서열 5 내지 8을 갖는 단백질들 중 어떤 것의 구조 또는 부분 구조, 유도체, 대립유전자, 이소형태 또는 그의 부분은, (예를 들면 "행잉 드롭 (hanging drop)" 방법에 의한 적절한 결정화 이후에) NMR 또는 X-선 결정학 방법에 의해 결정하거나, 또는 그러한 고 해상도 구조를 이용할 수 없는 경우 본 발명의 단백질의 구조적 모델은 구조 예상 알고리즘을 이용해서, 예를 들면 구조가 이미 밝혀진 상동성 단백질 (예컨대, 로돕신)을 이용해서 생성하며, 이러한 구조 또는 구조 모델을 이용함으로써 분자 모델링 프로그램에 의해 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용할 수 있으며 본 발명의 단백질에 대해 높은 친화성을 갖는 것으로 예상될 수 있는 화합물을 동정한다. 적절한 경우에, 상기 정의된 방법을 구조적 설명을 위한 다른 방법과 병행할 수도 있다. 적합한 역장 (force field)을 이용하여 본 발명의 대상 단백질의 대상 하위구조, 예를 들면 활성 부위, 결합 공동 또는 힌지 영역에 대해 잠재적으로 친화성을 갖는 화합물의 친화성을 자극한다. 이후, 이러한 물질들을 합성하여 이들의 결합능 및 치료 유용성에 대하여 적합한 시험 방법으로 시험한다. 본 발명의 ee3 단백질에 결합함으로써 작용을 나타내는 잠재적인 활성 화합물을 동정하는 상기 컴퓨터내 (in silico) 방법은 마찬가지로 본 발명의 주제 물질에 해당한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 항체, 바람직하게는 본 발명의 ee3 족 단백질, 예를 들면 ee3_1, ee3_2 또는 ee3_5에 대해 지시되는 항체, 또는 기초 mRNA에 대해 지시되는 항체이며, 이 항체는 재이식된 숙주 세포로 생체외 도입되거나 또는 생체내 유전자 치료 방법에 의해 숙주 세포로 도입되고, "세포내 항체 (intrabody)"로서 그곳에서 분비되는 것이 아니라 세포내에서 그의 작용을 나타낼 수 있다. 이러한 본 발명의 항체는 잘못 지시된 아포토시스 반응에 대해, 예를 들면 본 발명의 단백질을 과발현함으로써 세포를 보호할 수 있다. 통상적으로 이러한 방법은 환자에서 병리생리학적으로 과도한 아포토시스 작용을 나타내는 조직의 세포, 즉 예를 들면 췌장 세포, 각질세포, 결합 조직 세포, 면역 세포, 신경 세포 또는 근육 세포에 대해 적합할 것이다. 상기 항체 또는 세포내 항체 이외에도, 본 발명의 세포내 항체에 의해 이러한 방식으로 유전적으로 변형된 세포는 또한 본 발명의 일부를 이룬다.
차단 기능뿐 아니라, 적절한 경우에 본 발명의 천연 ee3 단백질, 예를 들면 서열 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 및 11의 단백질 또는 상응하는 천연 대립유전자 또는 천연 스플라이스 변이체의 생물학적 기능, 예를 들면 아포토시스 기능을 활성화하는 기능도 갖는 본 발명의 화합물을 약물로서 사용할 수 있다. 이에 포함되는 화합물로는 상기 언급한 임의의 변이체, 즉 예를 들면 유기화학 화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임이 있다. 본 발명의 화합물은 질병, 특히 신경계 질병, 면역계 질병 또는 증식성 질병의 치료 (약물의 제조)를 위해 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 천연 단백질의 세포 기능, 특히 서열 5 내지 8을 갖는 단백질 또는 그의 천연 변이체의 세포 기능, 즉 예를 들면 아포토시스 반응의 세포 기능에대한 본 발명의 억제제 (예를 들면, 억제 작용을 갖는 항체 (특히 세포내 항체), 라이보자임, 안티센스 RNA, 우성-음성 돌연변이, 또는 상기 언급한, 적절한 경우 억제성 유기화학 화합물 중 어떤 것, 바람직하게는 높은 친화성을 갖는 화합물, 예를 들면 상기 언급한 방법들 중 어떤 방법으로부터 얻을 수 있는 화합물)를 약물, 매우 특별하게는 하기 질병의 치료를 위한 약물로 사용하거나 또는 하기 질병의 치료를 위한 약물의 제조를 위해 사용할 수 있다: 만성 또는 급성 저산소증 증상이 일어나거나 관련되는 질환, 예를 들면 심근 경색, 심부전, 심근병증, 심근염, 심막염, 전충심염, 관상동맥 심질환, 좌우 단락을 동반하는 선천성 심내결손증, 팔로 (Fallot)의 사징증/오징증, 아이젠멘거 (Eisenmenger) 증후군, 쇼크, 사지 저관류, 동맥 폐색성 질환 (AOD), 말초성 AOD (pAOD), 경동맥 협착증, 신장 동맥 협착증, 소혈관 질환, 뇌내 출혈, 대뇌정맥 및 정맥동 혈전증, 혈관 기형, 거미막하 출혈, 혈관성 치매, 비스방거 (Biswanger) 질환, 피질하 동맥경화성 뇌병증, 색전증 동안의 다발성 피질 경색, 혈관염, 당뇨성 망막병증, 상이한 원인의 빈혈의 속발성 증상 (예컨대, 형성부전 빈혈, 골수이형성 증후군, 진성 적혈구증가증, 거대적아구성 빈혈, 철 결핍성 빈혈, 신장 빈혈, 구상적혈구증, 용혈성 빈혈, 탈라세미아, 혈색소병증, 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소 결핍증, 수혈 사고, 리서스 (rhesus) 부적합증, 말라리아, 심판막 치술, 출혈성 빈혈, 비기능항진증 증후군), 폐 섬유증, 기종, 폐 부종: ARDS, IRDS, 반복성 폐 색전증.
종양증 (예컨대, 결장 암종, 유방암종, 전립선 암종, 폐 암종), 면역계 질병 (예컨대, 자가면역 질병, 특히 당뇨병, 건선, 면역결여증, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 또는 아토피, 천식), 바이러스 감염성 질환 (예컨대, HIV, 간염 B 또는 간염 C 감염, 세균성 감염 (예컨대, 연쇄구균성 또는 포도구균성 감염), 퇴행성 질병, 특히 신경퇴행성 질병, 예를 들면 근이영양증, GvHD (예컨대, 간, 신장 또는 심장), 또는 그 밖에 신경계 장애 (특히, 비배타적으로: 발작, 다발성 경화증, 파킨슨병, 거미막하 출혈, 근위축성 측삭 경화증, 유전변성 실조증, 헌팅톤병, 신경병변, 간질, 뇌 손상, 알쯔하이머병); 근이완제 (예컨대, 마취용), 내분비학적 질병 (예컨대, 골다공증 또는 갑상선 기능부전) 및 피부병학적 질병 (건선, 신경피부염); 통증의 만성 또는 급성 상태의 제어, 유전학적 질환, 또한 심리학적 분야 중의 질병 (예컨대, 정신분열증 또는 우울증), 창상 치유, 성 기능의 지원, 심혈관 질병 (예컨대, 허혈성 경색, 심부전, 부정맥, 고혈압), 뇌 기능의 증가.
상기 언급한 모든 적응증 분야는 약물의 제조를 위한 본 발명의 유전자 생성물 또는 본 발명의 DNA 서열의 용도로 적용된다.
상기 언급한 본 발명의 물질은 예를 들면 치료 투여를 위한 상기 조성물을 안정시키거나 또는 생물학적 이용성 및(또는) 약동학적 성질을 향상시키기 위해 제약 담체, 부형제 및(또는) 첨가제를 추가로 포함할 수 있는 제약 조성물의 일부일 수도 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 서열에 의해 유발된 생리학적 반응과 관련된 신호를 개시하거나 또는 전달하는 것에 대해, 제약상 활성 화합물, 특히 억제 특성을 갖는 화합물을 동정하는 방법 (스크리닝 방법)에 관한 것이다. 이러한 제약상 활성 물질은 본 발명의 수용체를 그의 세포외 말단, 그의 TM 도메인에서 차단 (이 경우, 예를 들면 그의 이량체화 또는 다량체화를 약화)시킬 수 있으며, 세포내에서 신호 전달, 예를 들면 ee3 단백질과 세포내 신호 단백질의 상호작용을 차단시키거나 활성화하며, 특히 세포내 단백질인 ranbpm 및(또는) MAP1a/MAP1b와의 상호작용에 영향을 준다 (활성화 또는 억제함).
본 발명의 방법은 (a) 제5항에 청구된 발현 벡터, 특히 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들면 서열 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 또는 11의 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염될 세포 및, 적절한 경우에, 하나 이상의 리포터 유전자를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질감염될 세포, 및 (b) 본 발명의 단백질에 의해 매개되는 기능, 예를 들면 재생 또는 증식 프로세스에서의 신호 전달을 관찰하는 데 적합한 파라미터를 제공하며, 상기 파라미터는 특히 카스파제-3 활성화이고, 시험 화합물의 첨가 이후에 상기 (a)에서 얻은 숙주 세포계에 대해 시험 화합물을 첨가하지 않은 대조군과 비교해서 측정된다. 이를 위해, 바람직하게는 상기 시험 화합물의 농도를 증가시키는 여러 유사한 실험을 본 발명의 방법에 따라 설정하여 상기 시험 물질의 제약 활성, 예를 들어 아포토시스 억제 작용의 경우 상기 시험 물질의 IC50을 결정할 수 있다.
ee3 단백질의 1차 서열에 대한 지식은 선행 기술에 따라 공지된, 이미 특성화된 GPCR의 특성을 이용하는 재조합 구조물을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들면 본 발명의 ee3 단백질의 특정 서열 영역을 충분히 특성화된 공지의 GPCR의 특정 서열 영역으로 대체할 수 있다. 생성된 구조물을 이용하여 공지된리간드 또는 아고니스트에 의해 G 단백질 커플링 및 이용되는 2차 메신저 시스템을 동정하거나, 또는 리간드, 아고니스트 또는 안타고니스트를 찾아내는 공지된 G 단백질 커플링을 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 언급한 용도를 위한 본 발명의 키메라 수용체는, 예를 들면 코빌카 (Kobilka) 등에 의해 기술된 (본 발명에 포함되는) 문헌 (Kobilka BK, Kobilka TS, Daniel K, Regan JW, Caron MG, Lefkowitz RJ (1988) Chimeric alpha 2-, beta 2- adrenergic receptors: delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science 240:1310-1316)에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 ee3 족의 구성적으로 활성인 수용체 돌연변이를 사용하여 신호 전달 경로에서 상기 수용체의 효과를 특성화하고 리간드에 대해 스크리닝할 수 있다. 7TM-단백질 부류의 대표적인 수용체로서 본 발명의 수용체를 특정 방식으로 돌연변이시켜 상기 수용체의 생리학적 및 약리학적 거동에서의 변화를 유발할 수 있다. 또한, 상기 수용체는, 예를 들면 천연 리간드 또는 아고니스트가 알려지지 않은 경우의 세포내 신호 경로를 동정하는 데 사용될 수도 있다. ee3 단백질의 DRI 컨센서스 서열에서의 돌연변이가 상기 변화를 유발하는 데 있어서 특히 적합하며, 예를 들면 DRY 서열 (Scheer A, Costa T, Fanelli F, De Benedetti PG, Mhaouty-Kodja S, A-buin L, Nenniger-Tosato M, Cotecchia S (2000) Mutational Analysis of the highly conserved arginine within the Glu/Asp-Arg-Tyr motif of the alpha(1b)-adrenergic receptor: effects on receptor isomerization and activation. Mol Pharmacol 57:219-231))에서 R의 Lys, His, Glu, Asp, Ala, Asn및 Ile로의 돌연변이는 Lys로의 돌연변이의 경우에 구성적 활성화에 있어서 강한 증가를 유발한다. His 또는 Asp로의 돌연변이는 구성적 활성화에 있어서 보다 적은 증가를 나타낸다. 흥미롭게도, Arg로의 돌연변이는 이러한 돌연변이가 또한 HTS 스크린에서도 관심의 대상이 되도록 아고니스트 친화성을 증가시킨다.
유사하게, 제3 TM 도메인의 보존된 Arg는 돌연변이가 가능한 부위이다 (Ballesteros J, Kitanovic S, Guarnieri F, Davies P, Fromme BJ, Konvicka K, Chi L, Millar RP, Davidson JS, Weinstein H, Sealfon SC (1998) Functional microdomains in G-protein-coupled receptors. The conserved arginine-cage motif in the gonadotropin-releasing hormone receptor. J Biol Chem 273 :10445-10453).
별법으로, 본 발명의 고정된 기능성 수용체의 용도에 기초한 방법은 내인성 또는 대용 리간드를 동정하는데 사용될 수 있다. 이 경우, 본 발명에 개시된 바와 같이 본 발명의 ee3 족 수용체는 GST, 플래그 태그 (Flag tag) 또는 TAP 태그와의 융합 단백질로서 발현된다. 상응하는 세포는 통상적인 방법에 따라 처리되어 막을 제공하거나 또는 직접적으로 융해화에 사용된다. 적합한 세정제, 예를 들어 도데실말토시드, 디기토닌, 콜레이트 또는 세정제의 혼합물을 사용하여 수용체를 융해화시키면, 수용체는 GST 세파로스 (Sepharose), 항-플래그 M2 아가로스 또는 IgG 세파로스 등과 같은 상응하는 친화성 매트릭스에 결합된다. 매트릭스를 세척하고, 이어서 조직 추출물 또는 세포 상청액과 함께 인큐베이션하고 다시 세척한다. 만일 추출물이 예를 들어 펩티드와 같은 활성 리간드를 함유한다면, 상기 리간드는고정된 수용체에 결합되고, 용출된 후, 예를 들어 질량 분광측정법과 같은 분석 방법에 의해 동정할 수 있다.
본 발명에서 "내재화 분석"은 예를 들어 ee3_1과 같은 본 발명의 수용체에 대한 천연 리간드 또는 특히 대용 리간드를 동정할 수 있는 또다른 절차를 말한다. 이 때, 마찬가지로 GPCR 부류 단백질의 다른 특성이 이용된다. 예를 들어, GPCR 부류 단백질의 내재화 거동을 이용할 수 있다. 이것은 수용체를 활성화시킨 후의 조절 메카니즘으로서 이해되어야 한다. 이 거동에 기초한 스크리닝 방법은 특정 수용체에 관한 더 상세한 생리학적 지식을 요하지 않는다는 이점을 갖는다. 특히 커플링 G 단백질 및 사용되는 신호 전달 경로에 대한 지식을 요하지 않는다.
이러한 종류의 분석은 예를 들어 문헌(Lenkei et al., 2000, J Histochem Cytochem, 48, 1553-64)에 기재되어 있고, 본 발명에 따라 본 발명의 수용체에 대해 사용될 수 있다. 이를 위해, 본 발명에 따라, 우선 본 발명의 단백질과 EGFP의 C-말단 융합 구성물을 제조한다. 이어서, 표준 방법에 따라 안정한 CHO 세포를 제조한다. EGFP 형광에 대한 FACS 분류기를 사용하여 안정한 클론을 선택한다. 최종 선택은 표면 발현의 형광-현미경 평가에 의해 실시한다. 이어서, 세포를 조직 추출물의 HPLC 분획물과 함께 인큐베이션하고, 공초점 현미경으로 내재화를 판정한다. 세포 중심으로부터의 형광 신호의 거리 원리에 따라, 형태측정 소프트웨어 (NIH 이미지 (Image))로 평가를 실시한다. 상기 내재화는 빈도/거리 분포에 의해 잘 구별되었다.
미지의 리간드를 찾기 위해, 연속적인 분획을 실시하여 상응하는 펩티드를순수하게 단리한 후에 상기 펩티드를 예를 들어 서열분석 또는 MALDI-TOF에 의해 동정한다. 원리상 동일한 또다른 적용 방법이 문헌(Ghosh et al., 2000, Biotechniques 29, 170-5; Conway et al., 1999, J Biomol Screen, 4, 75-86)에 기재되어 있으며, 이들 모두 본원에 그 전문이 인용된다.
그러나, 리간드를 동정할 때 및(또는) 적절한 경우에 본 발명의 수용체의 특성화에도 또한 기능성 Ca 분석을 사용할 수 있다. 본 발명에서는, HEK293 세포, CHO 세포 또는 다른 세포에서 생산된 다수의 7TM 수용체 (7개의 막횡단 도메인을 갖는 수용체)가 Gq 부류의 G 단백질과의 커플링을 통해 PLC의 활성화 및 세포내 Ca의 가동화를 초래한다는 사실을 이용한다. 만일 본 발명의 특정 수용체가 Gq 부류의 G 단백질에 커플링되지 않는다면, 상기 수용체는 수용체에 상대적으로 비특이적으로 커플링하는 키메라 G 단백질 또는 G 단백질 G15 또는 G16을 공발현시켜 PLC를 통해 신호를 전달하도록, 즉, Ca를 유리시키도록 강제될 수 있다. 본 발명의 ee3 족 수용체는 전형적으로 단독으로 및 키메라 G 단백질 Gqi5 및 별법으로 G 단백질 Gq15와 함께, 안정하게 및 일시적으로 HEK293 및 CHO 세포에서 발현된다. 이어서, 바람직하게는 세포에 예를 들어 푸라 (Fura)-2 또는 플루오 (Fluo)-3 또는 플루오-4와 같은 막-투과성 Ca-결합 형광 염료를 로딩하고, 세포를 세척한 후에, 다양한 시험 물질로 처리하고, 동시에 Ca의 유리를 예를 들어 FLIPR 기기 (몰레큘라 디바이시스 (Molecular Devices))로 측정한다. 끝으로, 바람직하게는 양성 신호를 내는 시험 물질을 대조군 세포 (벡터로만 형질감염됨)에서 시험하고, 만일 그 신호가 특이적인 것으로 밝혀지면, 약리학적으로, 즉, 투여량-반응 곡선에 의해 특성화한다.
그러나 별법으로, 리간드에 의해 야기된 Ca 반응은 또한 다른 Ca 검출기, 예를 들어 애쿼스크린 (AequoScreen, 벨기에 브뤼셀 소재 유로스크린 (Euroscreen), 예를 들어, http://www.pharmaceutical-technology.com/contractors/compound_man/ euroscreen/ 참조)에 의해 측정될 수 있다. 이 방법은 아포애쿼린 단백질의 유전자를 발현하는 세포를 사용하는 것을 포함한다. 애쿼린은 아포애쿼린에 결합하는 코엘렌트라진을 세포에 로딩한 후에 생산된다. 만일 리간드가 Ca 유리를 야기한다면, 상기 Ca는 애쿼린을 활성화시켜 코엘렌트라진을 산화시킴으로써 빛을 방출한다. 방출되는 빛의 강도는 세포내 Ca 농도 증가에 비례하고 따라서 발견된 리간드 활성의 척도이다 (상응하는 대조군을 고려하여).
본 발명에서 안타고니스트는 충분히 높은 농도의 매우 다양한 리간드의 존재 하에서 수용체를 공지된 아고니스트로 자극하여 동정한다. 대조군 (다른 리간드가 없이 아고니스트만 이용)과 비교하여 변화된 신호, 예를 들어 Ca 신호의 저하는 경쟁적 안타고니스트를 가리킨다.
추가로, 본 발명의 ee3 족 수용체의 특성화 및 리간드의 동정을 위해 cAMP 분석을 사용할 수 있다. ee3 족 수용체의 약리학적 특성화 및 리간드 (아고니스트 또는 안타고니스트)의 동정에 적합한 본 발명의 이러한 접근법은, 보통 "자극성 Gs" 또는 "억제성 Gi" 단백질을 활성화시킴으로써 아데닐레이트 시클라제에 자극 또는 억제 작용을 할 수 있는 GPCR 부류 수용체, 즉 예를 들면 본 발명의 단백질의 특성을 근거로 한다. 시험 물질의 작용에 따라, 예를 들어 고 처리량 스크리닝(high throughput screening)에서, 직접적 또는 간접적 측정을 통해 그와 관련된 세포 cAMP 수준의 변화를 연구할 수 있다. 이것은 포유류 세포에서 안정하게 또는 일시적으로 수용체 유전자를 발현시키는 것을 포함한다 (예시적인 실시양태 2 참조). 아데닐레이트 시클라제를 활성화시켜 세포 cAMP 수준을 증가시키는 GPCR의 경우, 시험 물질 중의 잠재적인 아고니스트는 대조군에 비교하여 증가된 cAMP 농도에 의해 동정된다. 시험 물질 중의 안타고니스트는, 예를 들어 HTS 접근법에서, 아고니스트에 의해 야기된 cAMP 농도 증가의 차단에 의해 동정된다. 본 발명의 Gi-커플링된 ee3 수용체의 경우, 분석은 포르스콜린으로 직접, 또는 Gs-커플링된 수용체를 활성화시켜 아데닐레이트 시클라제를 자극함으로써 cAMP 수준을 증가시키는 것을 포함한다. Gi-커플링된 수용체의 아고니스트는 이러한 증가를 억제한다. 예를 들어 첨가된 방사능표지된 (트리튬) cAMP로 내인성 cAMP를 경쟁적으로 치환시키는 원리에 기초한, 예를 들어 아머샴 (Amersham)의 cAMP(3H)분석 시스템과 같은, 다수의 시판 중인 분석 시스템을 직접 cAMP 측정에 사용할 수 있다. 간접적인 cAMP 측정은 보통 리포터 분석 방식으로 실시된다. 이를 위해, 예를 들어 CRE-루시페라제 시스템과 같은 리포터 시스템을 함유하는 세포주에서 수용체를 발현시킨다. cAMP는 루시페라제의 발현을 활성화시키고, 루시페라제의 활성은 상응하는 기질의 전환 및 생성물의 발광측정으로서 측정된다. 리포터 분석은 특히 대량 스크리닝 방법에 매우 적합하다.
끝으로, 상기 분석 이외에, 본 발명에 따라, 본 발명의 수용체의 2차 메신저시스템의 특성화하고(하거나) 본 발명의 ee3 수용체의 리간드를 동정할 때, 특히 살로몬의 문헌(Salomon et al., (1979). Adv. Cyclic Nucleotide Res. 10, 35-55)에 따라 세포 또는 막에서 아데닐레이트 시클라제 활성을 판정할 때, 이노시톨 3-포스페이트 농도를 판정하거나 또는 아라키돈산의 유리의 변화를 측정할 때 하기 분석 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 통상적인 세포주에서 ee3_1을 과발현시키고, 조직 추출물에 의해 활성화시킨 후에, 상기 2차 메신저 시스템의 활성을 판정할 수 있다. GPCR 부류의 2차 메신저 시스템의 분석은 개별적으로 당 업계의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 각각 예를 들어 문헌(Signal Transduction: A practical approach, G. Milligan, Ed. Oxford University Press, Oxford, England)과 같은 문헌에서 발견할 수 있다. 스크리닝을 위한 추가적인 리포터 분석은 MAP 키나제/루시페라제 및 NFAT 루시페라제 시스템을 포함한다.
ee3 수용체 신호 전달이 또한 MAP 키나제 신호 전달 경로를 통해서도 이루어진다는 본 발명의 발견에 기초하여, 예를 들어 NF-kB 리포터 시스템 또는 루시페라제 시스템을 통해, 리간드의 탐색 또는 억제제 동정을 위한 스크리닝 분석을 개발할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 2차 메신저의 활성화는 또한 본 발명의 수용체에 결합하는 리간드, 아고니스트 또는 안타고니스트를 동정하는데 기여하고, 이러한 방식으로 그들의 특정 세포 과정 상의 아고니스트 및(또는) 안타고니스트 작용을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 리간드, 아고니스트 또는 안타고니스트를 동정하기 위해 마이크로피지오미터 (microphysiometer)가 사용될 수 있다. ee3 족 수용체에결합된 리간드에 의해 야기된 신호는 에너지 소모 과정을 나타낸다. 따라서, 이러한 종류의 과정은 항상 경미한 대사 변화, 특히 경미한 pH 이동을 수반한다. 상기 변화는, 예를 들어 마이크로피지오미터 (사이토센서 (Cytosensor), 몰레큘라 디바이시스)에 의해 세포외에서 기록될 수 있다.
본 발명의 ee3 수용체 족 단백질에 결합할 잠재력을 갖는 리간드, 아고니스트 또는 안타고니스트를 동정한 후에, 본 발명에 따라 리간드 결합 분석을 실시하여 더 상세하게 특성화할 수 있다. 리간드 결합 분석은 수용체의 약리, 즉, 상기 수용체의 매우 다양한 리간드의 친화도를 직접 측정할 수 있도록 한다. 결합 연구를 위해서는, 전형적으로 상기 언급된 임의의 방법 또는 달리 공지된 방법에 의해 동정된 화학적으로 순수한 리간드를, 방사능표지가 수용체와 관련된 상기 리간드의 활성을 감소시키지 않는 방식으로 높은 특이적 활성 (30 내지 2000 Ci/m㏖)을 갖게끔 방사능표지한다. 분석 조건은 사용가능한 신호 대 배경 비율이 측정되도록 완충액 조성, 염, 조정제, 예를 들어 뉴클레오티드 또는 글리세롤과 같은 안정화제에 있어서 상기 수용체를 발현하는 세포와 그로부터 제조된 막 둘다의 사용을 위해 최적화된다. 이러한 결합 분석에서 특이적인 수용체 결합은 수용체 시료 (세포 또는 막)에 관련된 총 방사능, 즉, 특이적인 방사능리간드 1종만 존재할 때와 방사능리간드와 과량의 방사능표지되지 않은 리간드가 둘다 존재할 때 측정한 방사능의 차이로서 정의된다. 이 때 표지되지 않은 리간드는 경쟁적으로 방사능리간드를 치환한다. 가능하다면, 비특이적 결합을 판정하기 위해 2종 이상의 화학적으로 상이한 경쟁적 리간드를 사용한다. 최적의 특이적 결합은 총 결합의 50％ 이상이다. 결합 분석은 여과 분석으로서 분균질하게 또는 섬광 근접 분석으로서 균질하게 실시된다. 첫째 경우, 수용체를 함유하는 시료 (세포 또는 막)를 결합 평형이 형성될 때까지 적합한 완충액 중에서 전형적으로는 RT에서 1시간 및 4 ℃에서 밤새 리간드와 함께 인큐베이션하고, 이어서 예를 들어 유리 섬유 필터 (와트만 (Whatman) 또는 슐라이허 운트 슈엘 (Schleicher ＆ Schuell)사 제품, 적절할 경우 결합된 방사능리간드와 결합되지 않은 리간드를 분리하기 위해, 예를 들어 폴리에틸렌이민으로 미리 처리됨)와 같은 적합한 필터를 통해 여과한다. 필터를 세척한 후에 건조시키거나, 또는 젖은 상태에서 적절한 섬광기로 처리하고, 필요할 수 있는 인큐베이션한 후에, 수득된 방사능을 섬광 계수기에서 측정한다. 섬광 근접 분석은 적합한 섬광 비드, 예를 들어 WGA 비드를 적합한 완충액 중에서 리간드 및 수용체를 함유하는 막과 함께 결합 평형이 형성될 때까지 인큐베이션하는 것을 포함하고, 이어서 방사능을 적합한 섬광 계수기에서 측정한다. 두 결합 분석 모두 HTS 포맷에서 실시될 수 있다.
융해화되거나 또는 정제된 수용체는 섬광 근접 분석 또는 PEG 침전 후의 여과 분석, 흡착 분석 또는 겔 여과 분석과 같은 통상적인 분균질 분석을 사용하여 측정한다 (Hulme E, Birdsall N (1986) Distinctions in acetylcholine receptor activity. Nature 323:396-397).
방사능리간드 대신, 예를 들어, BODIPY와 같이 형광 염료에 공유 결합된 리간드와 같은 형광 리간드를 사용할 수 있다. 형광 리간드와 수용체의 결합은 형광 편광에 의해 측정된다. 이 방법은 HTS 포맷의 1차 스크리닝과 2차 분석 둘다에 적합하다.
본 발명은 바람직한 실시양태에서 추가로 리간드 (아고니스트 또는 안타고니스트), 특히 본 발명의 ee3 서열의 억제제를 동정하기 위한 고 처리량 스크리닝 분석 (HTS)을 개시한다. 억제제, 특히 소형 유기 화합물을 동정하기 위해 본 발명의 방법의 범위 내에서 MAP 신호 전달 경로의 (모든 공지된) 성분을 사용하는 것이 매우 특히 바람직하다. 적합한 시스템은 섬광 근접 분석 (SPA, 아머샴 라이프 사이언스 (Amersham Life Science), MAP 키나제 SPA (문헌(McDonald et al., 1999, Anal Biochem, 268, 318-29) 참조))를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 적용은 그 전체가 본원에 포함된다. 여기서 MAP 캐스케이드는 시험관 내에서 재구성되거나, 개별 성분과 함께 제조되어 GST 융합 단백질이 되거나 (대장균에서 발현됨), 또는 cRAF1의 경우 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 제조된다. 캐스케이드 (MAP-KKK)의 제1 요소는 억제제를 신뢰할만한 방식으로 분석할 수 있도록 영구적으로 고르게 활성화되어야 한다. 이것은 전형적으로 바큘로바이러스 시스템에서 src를 공발현시킴으로써 달성된다. 이것은 cRaf의 ras-유사 활성화를 보장한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 형질감염 후에, 캐스케이드의 조정이 야기되고, 이 조정은 HTS에서 분석될 물질의 첨가에 의한 상기 조정에 대한 영향을 측정할 수 있도록 사용된다.
상기 언급된 본 발명의 방법에 의해 높은 친화도를 갖는 선택적인 물질을 동정한 후에, 상기 물질은 간질, 발작 및 다른 신경계, 면역계 또는 증식성 질병 (종양증)을 위한 약제로서의 용도를 위해 분석된다. 추가적으로, 효모 투-하이브리드(yeast two-hybrid) 시스템 또는 다른 분석을 사용하여 본 발명의 ee3 유전자 생성물, 특히 서열 5, 6, 7A, 7B, 7C, 8 또는 11에 대한 동정된 약리학적 활성 물질의 결합 부위를 판정하는 것이, 즉, 예를 들어 천연 단백질 사이의 상호작용을 초래하는 아미노산을 한정하는 것이 가능하다. 다음 단계에서는 본 특허 출원에 기재된 스크리닝 방법에 의해, 종래에 동정된 천연 상호작용 파트너의 결합을 초래하는 아미노산 (구조적 영역)에 특히 높은 친화도가 있는 물질 (대용 리간드)을 동정할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 폴리펩티드와 그의 가능한 천연 세포내 상호작용 파트너 사이의 상호작용에 영향을 주는 (특히 억제하는)데 사용될 수 있는 물질을 발견하는 것도 또한 가능하다. 이것은 본 발명에 따라, 본 발명의 단백질에 특이적인 결합 친화도가 있는 물질을 발견하는 방법을 개시한다. 특히 문헌(Klein et al., 1998, Nat. Biotechnol, 16, 1334-7)에 기재된 방법이 이와 관련하여 인용된다. 추가적으로 G 단백질-커플링된 수용체의 부류에 속하는 본 발명의 단백질의 공지된 특성 (G 단백질에 커플링, 신호 전달)은 본 발명의 억제제를 동정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 ee3 족 유전자 또는 유전자 생성물, 특히 ee3_1 및 ee3_2 서열의 유전자 또는 유전자 생성물 및(또는) 그들의 천연 변이체들의, 다수의 질병, 예를 들어, 신경퇴행성 질병, 증식성 질병, 즉, 특히 종양성 질병 (종양증, 예를 들어 고형 종양 (육종 (피부 육종 (카포시 육종), 모세포종, 간, 창자, 췌장, 위장, 폐의 암종) 또는 조혈계 종양, 특히 림프종 또는 백혈병) 또는 하이포아포프토시스 또는 하이퍼아포프토시스 질병에 대한 약리학적 중요성 덕분에, 본 발명의 방법에의해 동정된 제약상 활성물질들은 넓은 적용 스펙트럼을 갖는다. 예를 들어 신호 전달 경로 하류의 단백질 키나제 또는 아답터와 같은, 하나 이상의 다른 분자와의 상호작용의 억제 이외에, 특히 세포내에서 전사 또는 본 발명의 단백질의 전사체의 양의 영향도 또한 약리학적 활성의 원인이 될 수 있다. 언급해야할 하나의 예는 본 발명의 화합물에 의해 억제되어 있던 병리학적 과정 이후에, 특히 전사 활성화에 의한 매우 신속한 조절의 경우에서의, 본 발명의 DNA 서열 전사의 신속한 상향조절이다. 따라서, 제약학적 활성 화합물의 바람직한 표적은, 예를 들어 상기 물질이 본 발명의 유전자 생성물의 조절 영역 (예를 들어, 프로모터 또는 증강제 서열)에 특이적으로 결합하거나, 본 발명의 유전자 생성물의 하나 이상의 전사 인자에 결합하거나 (상기 전사 인자의 활성화 또는 억제를 초래함), 또는 그러한 전사 인자 자체의 발현을 조절 (전사 또는 번역)하는 것과 같은 전사의 조절이다.
전사 조절, 즉, 세포내에서 본 발명의 유전자의 mRNA의 양의 조절과는 별도로, 본 발명의 제약학적 활성 화합물은 또한 다른 세포 제어 과정에 개입하여, 예를 들어 본 발명의 단백질의 발현 (예를 들어 번역, 스플라이스 과정, 본 발명의 유전자 생성물의 천연 유도체화, 예를 들어 인산화 또는 본 발명의 유전자 생성물의 분해의 조절) 속도에 영향을 줄 수 있다.
본 발명은 또한 ee3 족, 즉, 특히 ee3_1, ee3_2 또는 ee3_5 단백질 및(또는) 그들의 천연 변이체 (이소형태, 대립유전자, 스플라이스 형태, 단편)으로부터 본 발명의 폴리펩티드의 세포 상호작용 파트너를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 단백질에 특이적인 결합 친화도를 갖는 상호작용 파트너로서의 단백질을 동정하거나, 또는 본 발명의 단백질에 특이적인 결합 친화도를 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 동정하는 것이 가능하다. 본 발명의 ee3 단백질 부류의 단백질의 세포 상호작용 파트너의 예는 다른 GPCR 또는 이온 채널일 수 있다.
이러한 종류의 본 발명의 방법 또는 이 방법을 실시하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 핵산 서열 및(또는) 본 발명의 핵산 구성물의 사용은 효모 투-하이브리드 스크리닝 (y2h 스크리닝) 단독으로서 또는 다른 생화학적 방법과의 조합으로서 실시하는 것이 바람직하다 (Fields and Song, 1989, Nature, 340, 245-6). 이러한 종류의 스크리닝은 또한 문헌(Van Aelst et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6213-7; Vojtek et al., 1993, Cell, 74, 205-14)에서 발견된다. 전형적으로, 예를 들어 문헌(Luo et al., 1997, Biotechniques, 22, 350-2)에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법을 실시할 때 효모 시스템 보다는 포유류 시스템도 사용될 수 있다. 상응하는 상기 언급된 실험적 접근법은 GPCR 단백질 부류의 전형적인 특성, 예를 들어 예를 들어 G 단백질, 즉, 예를 들어 또한 공지된 세포내 상호작용 파트너를 통한 신호 전달을 사용한다.
y2h 스크리닝에서, 본 발명의 서열, 특히 1번 내지 4번의 서열 또는 천연 변이체, 매우 특히 바람직하게는 본 발명의 서열의 세포내 영역, 예를 들어 ee3_1 또는 ee3_2의 리딩 프레임을, 예를 들어 GAL4 결합 도메인을 갖는 틀 내의 "미끼 (bait) 벡터" (예를 들어, 클론테크 (Clontech)사의 pGBT10 또는 pGBKT7) 내에 클로닝한다. 이것은 바람직하게는 통상적인 프로토콜에 따라 효모주 내에서 상호작용하는 단백질을 위해 "먹이 (prey) 라이브러리"를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, y2h 시스템은 또한 특이적인 상호작용 도메인을 동정하기 위하여 "지도화 실험"를 실시하는데 사용될 수 있다.
다른 융합 파트너 또는 다른 세포 시스템을 이용하는 2-하이브리드 시스템, 예를 들어 박테리오매치시스템 (BacterioMatchsystem, 스트라타젠 (Stratagene)) 또는 시토트랩시스템 (cytoTrapsystem, 스트라타젠)도 또한 동등하게 바람직하다. 본 발명에서는 y2h 방법 대신, 예를 들어 본원에 참고로 인용되는 문헌(Luo et al. 1997, Biotechniques, 22, 350-2)에 기재된 바와 같이, 포유류 세포의 상응하는 시스템도 또한 사용할 수 있다.
본 발명에 따라, 또한 상호작용 파트너에 결합하는 단백질을 정제한 후에 단백질 서열분석 방법 (예를 들어, MALDI-TOF, ESI-탠덤-MALDI)을 통해 상응하는 유전자를 동정하기 위해 본 발명의 발현 벡터로 형질감염된 세포로부터 공면역침전법을 통해 상호작용 파트너를 단리할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가적으로 본 발명의 ee3 단백질 및(또는) 그의 천연 변이체의 상호작용 도메인을 동정하기 위한 효모 투-하이브리드 시스템 또는 당 업계에 공지된 상응하는 방법 또는 다른 생화학적 방법의 용도 및 약물요법적 개입을 위한 상기 상호작용 도메인 (천연 서열의 단편)의 용도에 관한 것이다.
내인성 또는 대용 리간드, 즉, 본 발명의 ee3 족 수용체와 결합하는 특성을 지닌 비-천연 화합물을 동정하기 위한 본 발명의 추가적인 방법은 하기 출발 물질을 포함하는 분석을 사용하여 실시할 수 있다: (a) 매우 다양한 조직 추출물, 및 에리쓰로포이에틴과 같은 물질로 또한 미리 처리될 수 있는 매우 다양한 세포의 세포 배양 상청액이 사용될 수 있다. 이어서, 추출물을 분획하고 개별 분획물은 다시 리간드가 단리될 때까지 분석에서 사용한다. (b) 시판되는 물질 뱅크, 예를 들어 LOPAC (시그마)이 사용되는데, 이것은 희귀 수용체를 위한 잠재적인 리간드, 특히 종래 기술에 따라 7TM 수용체에 결합할 수 있고 따라서 또한 본 발명의 ee3 족 수용체에 결합할 수 있는 (신경)전달물질, 생활성 펩티드, 호르몬, 케모카인 및 다른 천연 물질을 함유한다. (c) 조합 펩티드 라이브러리가 사용된다. 또는 (d) 조성이 크게 다른 시판되는 물질 라이브러리가 사용된다.
예를 들어 EPO에 의한 ee3_1의 상향조절은, 예를 들어, EPO가 신경보호 작용을 하기 때문에 ee3_1이 세포의 생존과 관련이 있음을 가리킨다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 특히 생물학적 기능이 연구되어야 할 천연 형태 또는 다른 비-천연의 인공적으로 생성된 변이체는 본 발명에 따라 아포토시스 분석 또는 세포사 신호 또는 다른 세포 생리학적 과정의 유도, 도입 또는 억제에 있어서 본 발명의 폴리펩티드의 기능 및(또는) 효능을 연구하는 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 ee3 족 단백질 또는 상기 언급된 본 발명의 변이체의, 예를 들어 아포토틱 캐스케이드와의 관련에 대한 연구는, 본 발명의 ee3 서열, 특히 1번 내지 4번의 서열, 또는 변이체의 서열을 함유하는 발현 구성물을 진핵세포에 형질감염시킴으로써 (그 결과로서 이러한 종류의 연구의 용도도 또한 개시됨) 그후에 아포토시스의 유도 연구가 가능해짐으로써 이루어질 수 있다. 이것은, 예를 들어 아넥신 (로슈 디아그노스틱스 (Roche Diagnostics)) 염색, 카스파제-3의 활성 형태를 인식하는 항체 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)), 또는 DNA-히스톤 단편을 인식하는 ELISA(세포사 ELISA, 로슈 디아그노스틱스)에 의해 달성될 수 있다. 상기 아포토시스의 유도는 임의로 세포 유형 특이적이고, 그 결과로 본 발명에서는 복수의 세포주 및 1차 세포의 연구가 바람직하다. 아포토시스의 유도는 또한 임의로 자극-특이적일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 예를 들어, 열 쇼크, 저산소 상태, 시토카인 처리 (예를 들어, IL-1, IL-6, TNF-알파) 또는 H202처리와 같은 복수의 스트레스 상태를 토대로 삼는 것이 바람직하다. 본 발명의 이러한 방법에 적합한 전형적인 세포 유형으로는, 예를 들어 Cos 세포, HEK 세포, PC12 세포, THP-1 세포와 같은 통상적인 세포주, 또는 예를 들어, 신경세포, 성상세포와 같은 1차 세포 뿐만 아니라, 필요할 경우 다른 무한증식성 1차 세포주가 있다.
본 발명은 또한 증식 분석을 위한 본 발명의 핵산, 본 발명의 핵산 구성물 또는 본 발명의 유전자 생성물의 용도 및(또는) 상기 언급된 본 발명의 물질을 사용하는 이러한 종류의 방법에 관한 것이다. 유사하게, 상기 아포토시스 분석에 있어서, 예를 들어 세포 성장, 세포 주기의 진행 또는 종양유발성 형질전환에 있어서 ee3 서열, 특히 ee3_1 또는 ee3_2, 및 그의 천연 또는 비-천연 변이체의 관련을, 본 발명의 ee3 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, ee3_1 또는 ee3_2, 또는 상응하는 변이체를 함유하는 발현 구성물을 진핵세포에 형질감염시켜 연구하고, 이어서 예를 들어, 연질 한천 분석을 사용하여 종양유발의 유도를 연구하는 것이 가능하다 (Housey, et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol., 235, 127-40). 바람직하고 적합한 세포 유형에는 통상적인 세포주, 예를 들어, Cos 세포, HEK 세포, PC12 세포, THP-1 세포와 같은 통상적인 세포주, 또는 예를 들어, 신경세포, 성상세포와 같은 1차 세포 뿐만 아니라, 필요할 경우 다른 무한증식성 1차 세포주가 있다. 특히, 본 발명의 이러한 방법을 사용하여, 특히 증식 과정와 관련하여, ras 신호 전달 경로에 대한 본 발명의 유전자 생성물의 기능 및 ras 신호 전달 경로의 다른 성분과 본 발명의 유전자 생성물의 상호작용을 연구할 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포의 생체내 또는 생체외 형질전환을 위한 자살 유전자/자살 단백질로서의, 청구의 범위 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 청구된 DNA 서열 또는 청구의 범위 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 청구된 유전자 생성물의 용도에 관한 것이다. 특히 아포토틱 및(또는) 괴사 신호의 신호 전달에 있어서의 본 발명의 단백질의 생물학적 기능과 관련하여, 이러한 방식으로 숙주 세포에서 특이적으로 세포사를 유발할 수 있다. 자살 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되어 전사가 억제되고 필요할 때만 활성화도록 본 발명의 DNA 서열 및(또는) 본 발명의 단백질의 용도를 고안하는 것이 바람직하다. 특히, 유전자 치료 과정에서, 환자의 세포를 이식한 후에 생체외 또는 생체내에서 형질감염된 세포를 특이적으로 작동하지 않게 할 수 있다.
요약하면, 본 발명에 따라 포유류 시스템에서 막결합성 G 단백질-커플링된 수용체 (GPCR)의 신규 족을 동정했으며, 이것은 종래의 기술에서 공지된 족과 명료하게 구별될 수 있다고 결론내릴 수 있다. 본 발명에 따라 신규 단백질 부류 및 그를 코딩하는 DNA 서열을 동정하였으며, 중추신경계에서의 그의 차별적인 조절 덕분에, 다수의 생리학적 및 병태생리학적 과정을 밝히고 특성화시킬 수 있다.
본 발명에 따라 본 발명의 ee3_1 단백질의 EPO-유도된 전사 상향조절 (직접적 또는 간접적)에 의해 동정을 실시하였으며, 이것은 예를 들어, ee3_1의 아고니스트 및 안타고니스트가 EPO의 작용을 증강 또는 대신하거나 또는 원하지 않는 작용을 길항할 수 있음을 의미한다. EPO의 특정 작용, 예를 들어 신경퇴행성 질병에서의 신경보호 작용 또는 예를 들어 치매에서의 뇌 기능의 증가가 선택적으로 영향을 받을 수 있다.
여기에 존재하는 유전자는 뇌에서 우선적으로 발현되는 마우스 및 인간에서의 신규 7-막횡단 단백질이다. 이는 G 단백질-커플링된 수용체이다.
EMBL 서열 데이타베이스에서의 상동성 스크리닝은 GPCR의 A 족, 특히 펩티드 수용체에 대해 먼 상동성을 생성하였다.
또한, ee3_1은 적어도 하기 신경계 질환 모델에 의해 제한된 방식으로만 조절된다: 점적 (해마, 발작 단계 5, 발작후 2 시간), 피질 발작 (피질, 폐색 2.5 시간 및 재관류 2 및 6 시간), 래트 중의 전뇌 허혈 (전뇌, 허혈후 3 및 6 시간). 이는 예를 들면 극초기 유전자에 비해 EPO에 의한 조절의 고도의 특이성을 나타낸다.
하기 도면은 본 발명을 더 상세히 설명한다:
도 1a는 Epo 마우스의 뇌에서의 전사 분석을 나타낸다. 그래프는 DNA 어레이 혼성화 실험의 데이타를 나타낸다. EPO-유전자이전 동물 중의 신호 (y 축)를 야생형 마우스 중의 신호 (x 축)의 기능으로서 플롯팅하였다. 신호는 (상대적인)형광 신호이다. 대각선 상의 점들은 EPO-유전자이전 동물의 뇌에서 고도로 조절되는 유전자 생성물을 나타낸다. 8개의 양성 신호를 상기 대각선 2 (WT에 비해 유전자이전 동물에서 2배 과발현)에서 관찰할 수 있다. 도 1b는 마이크로어레이 실험의 결과를 나타낸다. 여기서, EPO-유전자이전 마우스의 뇌 중의 쥐과 ee3_1의 (상대적) 유도 인자 (오른쪽 면)를 WT 동물의 뇌 중의 유도에 대해 즉, 2개의 독립성 혼성화 실험으로부터의 평균 유도 값으로 플롯팅하였다. 유도 인자 1은 한 배 새끼 대조군 동물의 뇌 중의 농도에 상응한다. 본 발명의 서열의 발현은 거의 4배 높다.
도 2는 마우스를 사용하는 실험의 결과를 나타내고, 이 실험은 EPO-유전자이전 동물에서 본 발명의 ee3_1 및 마찬가지로 EPO-유전자이전 동물에서 상향조절되는 알파-글로빈 유전자 생성물의 상승된 유도를 확인하기 위해 사용하였으며, 정량적인 PCR (LightCycler)의 도움으로 수행하였다. 데이타는 6개의 뇌 (유전자이전 (tg) 또는 야생형 (wt))로부터의 풀 RNA 샘플을 나타낸다. 상대적인 유도는 y 축에 따라 플롯팅되었다. 대조군 측정 (상대적인 유도 = 1)에 비해 본 발명의 서열은 유도에서 11배 증가되었다.
도 3은 발생 (7, 11, 15 및 17 일 후 배아) 동안의 마우스 (LightCycler) 및 각종 성체 조직 (뇌, 심장, 간, 신장, 폐, 골격근, 비장 및 고환)에서 본 발명의 ee3_1의 발현을 나타낸다. ee3 전사물의 상대적인 과잉을 y 축에 따라 플롯팅하였다. 쥐과 배아 발생의 모든 단계 및 연구된 모두 조직에서 ee3_1은 상대적으로 편재하여 발현되었다.
EST 데이타에 따르면, ee3_2는 마우스의 배아 암종, 신장, 간, B 세포, 폐, 유방 및 자궁에서 발현되었다.
도 4는 인간의 성체 조직 (심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장)에서의 본 발명의 인간 ee3_1, ee3_2 및 ee3_c5의 발현을 나타낸다. 데이타는 정량적인 PCR 실험 (LightCycler)으로부터의 얻은 것이다. y 축에 따라 플롯팅된 값은 도 3의 것에 상응하며, 이는 연구된 조직에서 본 발명의 ee3 족의 유전자의 사실상 편재 및 병렬 발현을 나타냈다. 신장 및 췌장에서의 ee3 족의 강하게 증가된 발현이 특히 두드러지는 반면, 뇌 및 골격근의 발현은 더 낮다. ee3_1 발현 및 ee3_2 발현은 실질적으로 동일하여 본 발명의 이들 2종의 단백질의 잉여 기능으로 추정될 수 있다.
인간에서, ee3_1 서열을 갖는 EST는 하기 기관에서 발견될 수 있으며 상대적인으로 넓은 발현을 나타낸다: 뇌, 눈, 생식 세포, 심장, 신장, 폐, 태반, 전립선, 전체 배아, 부신, 유방, 결장, 위, 고환. ee3_2의 EST는 인간의 뇌, 결장, 심장, 신장, 폐, 췌장, 부갑상선, 전립선, 고환, 자궁, 방광, 유방, 피부에서 발견될 수 있다.
도 5는 각종 인간 종양 세포주의 본 발명의 인간 ee3_1의 발현의 노던 블롯의 결과를 나타낸다. 인간 ee3_1의 ORF를 포함하는 마우스 프로브를 상기 노던 블롯 (클론테크)의 혼성화를 위해 사용하였다. 본 발명의 인간 ee3_1 RNA 전사물의 편재 발현을 나타냈다.
도 6은 뇌 (래트)의 각종 영역의 ee3_1의 발현을 나타낸다. 여기에서도, 뇌의 각종 영역에서의 편재 분포가 나타나며, 소뇌 및 척수에서 다소 더 강하였다. 프로브 마우스 ee3_1을 사용하였다. 아래에 나타낸 것은 적하 대조군으로서 에티듐 브로마이드-염색 겔의 이미지이다.
도 7은 막횡단 도메인 (TM 도메인)을 고려한 구조적 예상을 기초로한, ee3_1_m의 단백질 위상의 모델을 나타낸다. 상기 모델은 7개의 TM 도메인 (나란히 수평으로 도시됨), 1개의 짧은 세포외 N 말단 (TM 도메인 1 상에 위치함) 및 세포내 C 말단 (TM 도메인 7 하에 도시됨)을 갖는 GPCR 단백질의 전형적인 위상을 나타냈다. 소수성 아미노산을 녹색으로 나타냈다.
도 8은 본 발명의 단백질 ee3_1 ("인간 pro") ee3_2 및 ee3_5의 단백질 단편을 선행 문헌에 이미 공지된 각종 GPCR 단백질 (예컨대, dc32_bio, ccr5-인간 또는 dop21 인간) 및 선행 문헌에 공지된 GPCR A, B 및 C 족의 컨센서스 모티프 (도 8 중의 cons fam A, cons fam B로서)와의 정렬 (서열 비교)을 나타낸다. "Pfam"은 단백질 족을 의미하고, 단백질의 부류에 의해 생성된 컨센서스 모티프의 군을 나타낸다. 목록화된 모티프는 pfam 데이타베이스로부터 얻었다. 본 발명의 ee3 단백질의 족은 GPCR 단백질의 A 족에 명확하게 가장 유사하다.
인간 ee3_1 및 ee3_2에 대한 하기 서열 구획 (하기 AA는 도 8의 것에 상응하게 번호를 매김)은 이미 공지된 GPCR 단백질과 비교하여 특히 본 발명의 단백질 족의 특성이다: AA 75-85, AA 129-135 (특히, 위치 129 및 132 각각의 글리신 및 세린, 위치 174의 글리신), AA 193-200 (특히, 위치 198의 글리신), 위치 260 및 261의 AA, 위치 308 (cys)의 AA, AA 334-340, 위치 539 (His)의 AA, 위치 608 (His)의AA, 위치 611 (Asp)의 AA, 및 최종적으로 위치 637로부터의 전체 C-말단 서열 구획 (특히, 위치 640과 655 사이의 산성 모티프, 666과 670 사이의 염기성 모티프 및 위치 680과 685 사이의 프롤린-부유 모티프를 포함함).
도 9A는 ee3_c1 (ee3_1)로 칭해지며, 번역된 영역 (나타낸 모든 서열이 왼쪽에서 오른쪽으로 상단에서 바닥으로 연속적으로, 즉 행 끝에서 왼쪽 바로 밑 행으로 연속적인 방식으로 읽혀짐)을 포함하는 본 발명의 쥐과 DNA 서열 (서열 1)을 나타낸다. 이 서열 영역 중의 개시 코돈 및 정지 코돈을 볼드체로 강조하였다. 도 9B는 도 9A에 따른 서열의 (3' 비번역된 영역 중의) 하부영역인 본 발명의 또다른 서열을 포함한다.
도 10는 ee3_2로서 칭해지며, 또한 번역된 영역을 포함하는 본 발명의 쥐과 DNA 서열 (서열 2)을 나타낸다. 이 서열 영역 중의 개시 코돈 및 정지 코돈을 볼드체로 강조하였다.
도 11A는 ee3_1로 칭해지며, 또한 번역된 영역을 포함하는 본 발명의 인간 DNA 서열 (서열 3)을 나타낸다. 이 서열 영역 중의 개시 코돈 및 정지 코돈을 볼드체로 강조하였다. 또한, 추정 폴리아데닐화 신호를 볼드체 및 밑줄로서 강조하였다. 도 11B 및 11C는 본 발명의 C-말단 일부절단된 단백질을 코딩하는 다른 C-말단 스플라이스 형태를 나타낸다. 양 도면에서 개시 및 정지 코돈을 추가로 볼드체로 강조하는 것 외에, 도 11B는 또한 스플라이스 부위의 강조된 컨센서스 서열을 함유한다.
도 12는 ee3_2로 칭해지며, 또한 번역된 영역을 포함하는 본 발명의 인간DNA 서열 (서열 4)을 나타낸다. 이 서열 영역 중의 개시 코돈 및 정지 코돈을 볼드체로 강조하였다 (각각, ATG 및 TAA). 또한, 추정 폴리아데닐화 신호를 볼드체로 강조하였다. 도 12의 바닥 서열은 서열의 제1 부위의 연속이다 (이탤릭체의 제1 영역과 제2 영역이 각각 겹침).
도 13은 ee3_1로 칭해지며, N 말단에서 C 말단으로 연속적인 본 발명의 쥐과 AA 서열 (서열 5)을 나타낸다 (또한, 도 9에 따른 밑줄친 DNA 서열 참고).
도 14는 ee3_2로 칭해지며, N 말단에서 C 말단으로 연속적인 본 발명의 쥐과 AA 서열 (서열 6)을 나타낸다 (또한, 도 10에 따른 밑줄친 DNA 서열 참고).
도 15A는 ee3_1로 칭해지며, N 말단에서 C 말단으로 연속적인 본 발명의 인간 AA 서열 (서열 7)을 나타낸다 (또한, 도 11A에 따른 밑줄친 DNA 서열 참고). 도 15B는 ee3_1b_h로 칭해지며, N 말단에서 C 말단으로 연속적인 본 발명의 인간 AA 서열 (서열 7b)을 나타낸다 (또한, 도 11B에 따른 밑줄친 DNA 서열 참고). 도 15C는 ee3_1c_h로 칭해지며, N 말단에서 C 말단으로 연속적인 본 발명의 인간 AA 서열 (서열 7c)을 나타낸다 (또한, 도 11C에 따른 밑줄친 DNA 서열 참고). 도 15B 및 15C에 따른 서열은 도 11A에 나타낸 DNA 서열의 다른 스플라이스 생성물의 AA 서열이다.
도 16은 ee3_2로 칭해지며, N 말단에서 C 말단으로 연속적인 본 발명의 인간 AA 서열 (서열 8)을 나타낸다 (또한, 도 12에 따른 밑줄친 DNA 서열 참고).
도 17은 ee3_5로 칭해지며, 또한 번역된 영역을 포함하는 본 발명의 인간 cDNA 서열 (서열 10)을 나타낸다. 이 서열 영역 중의 개시 코돈 및 정지 코돈 (각각, ATG 및 TAA)을 볼드체로 강조하였다.
도 18은 ee3_5로 칭해지며, N 말단에서 C 말단으로 연속적인 본 발명의 인간 AA 서열 (서열 11)을 나타낸다 (또한, 도 19에 따른 밑줄친 DNA 서열 참고).
도 19 에리스로포이에틴 (EPO) 5000 U/kg 체중으로 복막내로 처리하고, 6 또는 24 시간 후에 관류시키고, 연구한 마우스 뇌의 ee3_1에 대한 정량적인 PCR의 결과를 나타낸다. si-6-1, si-24-1: 염수 주사 6 및 24 시간 후의 동물 각각. ei-6-1, ei-6-2: EPO 주사 6 시간 후의 동물; ei-24-1, ei-24-2: EPO 주사 24 시간 후의 동물. ee3 RNA 발현의 증가를 나타냈으며, 상기 발현은 시간이 흐름에 따라 증가하였다. EPO-처리 동물의 데이타는 통계적으로 유의한 방식으로 염수-처리 동물과 상이하였다 (ANOVA, 뉴만-케울스 사후 검증법 (Newman-Keuls post hoc test)에 따름).
도 20은 마우스 뇌를 통한 가로 구획 상의 계내 혼성화 이미지를 나타낸다. 방사능표지된 프로브 (로서 ee3_1.3)를 사용하며, 소뇌 (ce), 해마 (hc), 치상회 (dg) 및 피질 (co), 특히 내후각 피질 (ent), 후구 (olf)에서의 ee3_1 발현을 시각할 수 있었다. 상응하는 센스 대조군 (로서 ee3-1.3)은 특정 신호를 주지않았다 (나타내지 않음).
도 21은 ee3_1 단백질 (인간)에 대한 C-말단 폴리클로날 항혈청의 제조를 설명한다. a: 높은 항원성 잠재력을 갖는 카르복시 말단 상의 펩티드에피토프의 선별. b: 이뮤노블롯은 일시 형질감염된 HEK293 세포에서의 ee3_1의 특이성 탐지를 나타냄. 각각의 경우에, N-말단 융합된 myc 태그를 갖는 ee3_1 단백질을 생산하는 작제물 Exp.ee3-1-h-Nter-myc로 형질감염시킨 HEK293 세포로부터의 동량의 융해질을 시용하였다. 레인 1: myc-특이성 항체 (업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology) (바이오몰 페인케미칼리엔 (Biomol Feinchemikalien) GmbH에 의해 판매됨), 1:2000 희석으로 사용함)를 통한 N-말단 융합된 myc 태그를 갖는 ee3_1 단백질의 탐지. 레인 2 내지 8: ee3_1-특이성 항혈청 AS4163 (1:500-1:12 000)의 상이한 희석을 사용하는 ee3_1의 탐지. 항혈청은 ee3_1-특이성 밴드 (약 35 kDa)를 고도로 민감한 방식으로 특이적으로 탐지한다. 레인 9: 상응하는 프리-면역 혈청 (pre-immune serum; PIS, 1:500으로 희석됨)은 어떠한 밴도도 탐지하지 못하였다.
도 22는 AS4163 항혈청에 의한 각종 조직 중의 ee3_1의 면역조직화학적 탐지를 나타낸다. A: 체성감각 피질의 뉴론 V층의 특이적 염색. B: A의 확대. C: 내후각 피질의 뉴론. D: 치상회 및 CA3 해마 영역의 ee3_1의 발현. E: CA3 해마 영역의 확대. F: 해마의 CA3과 CA2 사이의 ee3_1 발현의 경계. G: 소뇌, 프르키니에 세포 층 및 소뇌 핵에서의 특이적 면역조직화학적 염색. H: 소뇌의 프르키니에 세포. I: 후구. J: 확대, 거대 승모판 세포의 염색. K: 망막, 망막의 신경절 세포 및 감각 세포의 염색. L: K의 확대, 망막의 감각 세포의 염색. M: 척수 앞뿔의 거대 운동뉴론에서의 ee3_1의 발현. N: 운동핵의 삼차 핵에서의 ee3_1의 발현. 0: 흑질의 염색, 그물 부분. P: Q의 확대, 흑질. Q: ee3_1이 폐의 외부신경계로발현됨. 기관지의 기저 세포의 염색. 세동맥의 염색, 소정맥의 비-염색. R: 전형적인 폐 견본의 기관지, 동맥 및 정맥의 표시. S: 세기관지의 확대. 특정 기저 세포에서의 발현을 더 상세히 뚜렸하게 하지 않음. T: 소동맥 벽 (상부 왼쪽) 및 기관지 벽 (하부 오른쪽)의 확대. U: 소동맥의 세로 구획. 혈관벽에서의 내피 및 개별 평활근 세포의 염색. V: 평활근 세포 및 개별 내피 세포가 면역조직화학적 염색된 소동맥의 교차 구획. W: 함몰 및 포도 구조의 소장. ee3_1에 대한 항체에 의한 기저 함몰 부위의 염색. 융모의 개별 자율 신경이 염색됨. X: W의 확대. Y: 장의 자율 근 신경총에 속하는, 소장 벽의 신경 섬유의 표시. Z: 피하 지방/연결 조직의 말초 신경의 교차 구획. AA: 특이적으로 염색된 신경 섬유를 갖는 심근. BB: 줄무뉘 근육 (골격근). 이미지 중앙의 면역조직화학적 염색이 운동종판과 매우 일치함. 근육다발막의 개별 말초 신경 섬유 (하부 오른쪽).
도 23은 에리스로포이에틴을 유전자이전적으로 과발현하는 마우스의 척수 ((tg6) 이미지의 하단 부분)와 비교하여 야생형 마우스의 척수에서의 ee3_1의 면역조직화학적 염색을 나타낸다 (이미지의 상단 부분). 뚜렷하게 더 강한 신호가 유전자이전 마우스에서 동일한 염색 조건하에 발견되었다. 이 발견은 각각의 경우에 추가의 2마리의 마우스를 통해 확인하였다.
도 24는 마우스의 ee3_1 및 map1b에 대한 이중 면역형광을 나타낸다. 상기 2종의 단백질을 y2h 시스템에서 상호작용 파트너로서 탐지하였다. CNS에서 2종의 단백질의 위치화는 놀라운 정도에 상응하는 것으로 밝혀졌다. 녹색; ee3_1 염색; 적색: Map1b 염색; 황색: 신호 모두의 전자 이미지중첩. 척수 (sc) 및 소뇌 (cb)로부터의 실례를 나타냈다.
도 25는 map1b 유전자에 대한 마우스 돌연변이의 면역조직화학적 염색을 나타내며 (Meixner, et al. (2000), J. Cell Biol., 151, 1169-78.), ee3_1의 단지 잔량이 map1b-동종접합성 ko 동물에서 여전히 발견될 수 있음이 나타났다. a: 해마, b: 피질, c: 소뇌.
도 26은 래트 해마로부터의 성체 신경 줄기 세포 (nsc)에서의 ee3_1에 대한 PCR을 나타낸다. 음성 레인 (N)에서 신호를 탐지할 수 없었다. ee3_1은 이들 신경 줄기 세포에 의해 발현되었다.
도 27은 각종 종으로부터의 ee3 단백질의 단백질 정렬을 나타내며, 엑스. 라에비스 및 디. 레리오로부터의 서열을 고려하였다.
하기 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명한다:
실시예 1
ee3_1_m 및 동족체의 동정 및 분자 클로닝
(a) ee3_1_m의 동정
경심 관류 및 액체 질소에서의 쇼크 동결 후에 유전자이전 에리스로포이에틴-과발현 마우스의 뇌를 마취 하에 제거하였다. RNA를 문헌 (Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem (1987), 162, 156-9)의 방법에 따라 수득하였다. 마우스 cDNA 어레이 (칩) 상의 2마리의 유전자이전 마우스 및 2마리의 한 배 새끼 대조군의 혼성화 실험을 인사이트 (Incyte)의 방법에 따라 수행하였다(http://www.incyte.com/reagents/lifearray/lifearray service.s html 참조). 이는 2개의 상이하게 표지된 샘플 (Cy5 및 Cy3로 표지됨)의 도움으로 경쟁적인 혼성화의 수행과 관련된다. 혼성화 실험은 다수의 상향조절된 서열을 생성하였다. 특히, 반복 실험에서 마찬가지로 상향조절되는 EST 클론 AA185432를 Epo-유전자이전 마우스에서 동정하였다. 상대적인 유도 인자는 비유전자이전 한 배 새끼에 비해 +3.9 ±0.1이었다 (도 1). LightCycler 시스템을 사용하는 정량적인 PCR의 도움으로 상기 상향조절을 확인하였다 (도 2, 정방향 프라이머:, 역방향 프라이머:).
(b) ee3 서열의 클로닝
동정된 EST 서열을 EST 데이타베이스의 BLASTN 조회의 도움으로 연장하였다. 이 방식으로, 또다른 상동성 쥐과 서열인 ee3_2_m을 동정하였다. 적절한 프로그램 (BLAST, TBLASTN)을 사용하는 상동성 스크리닝을 사용함으로써 EST 및 게놈 데이타베이스 (ensembl)에서 인간 동족체의 동정이 가능하였다.
얻은 서열을 세파르드 (Shepard) (Shepard AR, Rae JL (1997) Magnetic bead capture of cDNAs from double-stranded plasmid cDNA libraries. Nucleic Acids Res 25:3183-3185)의 PCR 클로닝 방법의 도움으로 쥐과 및 인간 서열 데이타베이스의 스크리닝으로 확인하였다. 상술된 공개 문헌 및 본원에 인용된 선행 문헌은 본 발명의 개시 내용 내에 그의 전체로 포함된다. 상기 방법은 cDNA 분자를 플라스미드 라이브러리로부터 비오틴-커플링된 올리고뉴클레오티드 서열로 혼성화시키고,이어서 상기 플라스미드를 스트렙타비딘-커플링된 자기 비드의 도움으로 추출하고, 진단 PCR로 결과를 확인하고, 상기 단계를 2회 반복하고, 단일 클론이 수득될 때까지 수득한 플라스미드 선별물을 재형질전환시키는 것을 기초로 한다. 하기 프라이머 조합을 사용하였다:
(1) 전장 유전자 구획을 클로닝하기 위해 사용한 올리고뉴클레오티드:
(2) 또한, ee3 서열의 코딩 영역을 기능 분석을 수행할 수 있기 위해 GATEWAY(tm)-상용가능한 벡터 내로 클로닝하였다. 이를 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
(c) 인간 cDNA 라이브러리의 제조
인간 태아 뇌 mRNA (Clontech, Heidelberg, Germany) 2 ㎍ 및 성숙한 마우스 뇌로부터의 mRNA 5 ㎍으로 부터 개시하고, 상응하는 cDNA 라이브러리를 스트라타젠 (Stratagene) (Amsterdam, the Netherlands)의 cDNA 합성 키트를 사용하여 제조하였다. 이 방법은 제조자의 사용설명서에 실질적으로 따라 수행하였다. 제1 가닥cDNA 합성을 cligodT 프라이머를 제조자의 사용설명서에 따라 사용하여 수행하였다. 클로닝-상용가능한 (EcoRI/XhoI) 이중-가닥 cDNA 단편을 크기에 따라 (제조자의 사용설명서/스트라타젠에 따라) 선별하고, 플라스미드 벡터 pbluescript SKII (스트라타젠) 내에 라이게이션하였다. 라이게이션물을 전기천공법으로 이. 콜라이 (DH10B, Gibco) 내로 형질전환시키고, LB-암피실린 한천 플레이트 상에서 증폭시켰다. 플라스미드 DNA를 알칼리 융해 및 이온 교환 크로마토그래피 (키아젠 (Qiagen, Hilden, Germany)으로부터의 QIAfilter 키트)로 단리하였다.
태아 인간 뇌 cDNA 뱅크에 대한 개별 클론의 복잡성은 4백만이었다. 각각의 cDNA 뱅크의 24개의 단일 클론을 삽입 크기에 따라 램덤하게 분석하였으며, 800 bp 내지 4.5 kB 이하의 크기 분포를 나타내고, 인간 뱅크에 대한 cDNA 삽입물의 평균 길이가 약 1.2 kB이었다.
실시예 2
에리스로포이에틴 (EPO)에 의한 ee3_1의 조절
ee3_1을 Epo-유전자이전 마우스 (쥐과 계통 tg6 및 tg2l)의 뇌의 상향조절된 유전자 생성물로서 동정하였다.
본 발명의 실험에 사용한 마우스는 그의 체질에 대해 수회 이미 특성화되었다 (Ruschitzka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11609-13.; Wagner et al., 2001, Blood, 97, 536-42.; Wiessner et al., 2001, J Cereb Blood Flow Metab, 21, 857-64.). 문헌 (Hergersberg et al., Hum. Mol. Genet. 4, 359-366)에 기재된 방법에 따라 유전자이전 작제물을 사용하여 마우스를 생산하였다. 이작제물은 PDGF 프로모터 및 에리스로포이에틴을 코딩한 서열을 포함하였다. 다수의 유전자이전 계통을 생산하고, 이들 중 tg6 및 tg2l을 여기서 연구하였다. 단지 tg6은 문헌 (Ruschitzka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11609-13)의 방법에 따른 혈청 연구로 확인한, 전신적으로 증가된 EPO 발현을 가졌다. 계통 tg21은 증가된 전신 EPO 수준을 가지지 않았다. 문헌 (Sasahara et al., 1991, Cell, 64, 217-27.)의 결과에서 유추하여, 사용된 PDGF-프로모터 단편이 유전자이전 EPO, 특히 신경 세포에서의 발현을 발생시키는 것으로 추정될 수 있다.
tg6 계통의 마우스에서, EPO의 증가된 전신 발현은 적혈구형성에서 구별된 증가를 생성시키며, 적혈구용적율 0.8 이하의 적혈구증가증 및 뚜렷하게 증가된 혈액 용적 (4.0 ml 이하) 을 유도하였다 (Wagner et al., 2001, Blood, 97, 536-42). 대조적으로, tg2l 계통은 매우 뚜렷하게 표현형이 아니다.
예를 들면 ee3_1 유전자의 RNA 생성물은 에리스로포이에틴을 유전자이전적으로 과발현하는 마우스 (계통 tg6 및 tg21 (Ruschitzka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11609-13., Wagner et al., 2001, Blood, 97, S36-42., Wiessner et al., 2001, J Cereb Blood Flow Metab, 21, 857-64.))의 뇌에서 증가적으로 발현되고, DNA 어레이 실험으로 동정하였다. 생리학상 및 병리생리학상 중요한 EPO의 과발현에 의한 전사 EE3_1 조절을 마이크로어레이를 사용하는 전사 분석의 도움으로 유전자이전 계통 모두에서 조절되는 것으로 마찬가지로 밝혀진 또다른 조절인자 유전자 생성물, 즉 알파글로빈을 발견함으로써 확인하였다. 이를 LightCycler 시스템의 도움으로 확인하였다 (도 2). 증가는 특히 해마 영역 (계내혼성화)에서 육안으로 볼 수 있었다.
실시예 3
포유류 세포에서의 본 발명의 서열의 발현 및 안정한 세포주의 제조
ee3 족의 유전자의 오픈 리딩 프레임을 클론테크 (Clontech, Heidelberg, Germany)의 pcDNA 시리즈의 통상의 진핵세포 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 이 방식으로 생산한 발현 플라스미드를 사용하여 특히 인산칼슘 방법으로 인간 배아 신장 세포 (HEK293)를 형질감염시키거나, 리포펙타민으로 CHO 세포 및 CHO-dhfr- 세포를 형질감염시키거나 또는 DEAE-덱스트란 비드로 COS 세포를 형질감염시키고, G418 400 내지 500 mg/ml를 사용하여 선별하였다. 선별 3 주 후에, 개별 클론을 픽킹하고, 추가 분석을 위해 증폭하였다. 약 30개의 클론을 노던 블롯 및 웨스턴 블롯 방법으로 분석하였다. ee3 족의 유전자의 오픈 리딩 프레임을 디히드로폴레이트 환원효소 유전자를 선별 마커로서 함유한 진핵세포 발현 벡터 내로 클로닝하고, 형질감염을 위해 생성된 발현 플라스미드를 사용함으로써 형질감염된 CHO-dhfr-세포를 뉴클레오티드-무함유 배지에서 선별하였다. CHO-dhfr-세포를 이 방식으로 형질감염하였지만, 또한 다른 세포를 이 방식으로 형질감염시키지 않고, 이들 세포를 증가된 농도의 메토트렉세이트를 사용하여 처리하고, 이 방식으로 처리하여 증가된 양의 디히드로폴레이트 환원효소 및 또한 증가된 양의 수용체를 발현하는 세포를 선별할 수 있다.
실시예 4
ee3_1의 카르복시-말단 구획을 사용하는 효모 투-하이브리드 실험
효모 투-하이브리드 시스템에서 유력한 상호작용 파트너를 동정하기 위해 본 발명의 ee3_1의 카르복시-말단 부분을 미끼 벡터 pGBKT7 (클론테크) 내로 클로닝하였다.
사용한 단백질 서열은 하기와 같다:
상응하는 핵산 서열은 하기와 같다:
상호작용 파트너에 대한 스크리닝을 인간 뇌 라이브러리를 사용하고, 숙련가에게 친숙한 표준 방법 (교배 (mating) 방법, 클론테크)에 따라 수행하였다. 결과로서, 오버랩되는 서열을 포함하는 2개의 클론 (클론 11 및 36)을 수득하였다.
동정된 클론 11의 서열은 하기와 같다:
상호작용 유전자 생성물을 RANBPM 또는 RANBP9 (Nishitani H, Hirose E, Uchimura Y, Nakamura M, Umeda M, Nishii K, Mori N, Nishimoto T (2001) Full-sized RanBPM cDNA encodes a protein possessing a long stretch of proline and glutamine within the N-terminal region, comprising a large protein complex. Gene 272:25-3))로서 확인하였다. 마찬가지로, 2개의 다른 상호작용 단백질, 즉 Map1a 및 Map1b를 확인하였다. 흥미롭게도, 단백질 모두의 카르복시-말단 부분이 상호작용 부분으로서 동정되었다. 상기 부분은 단백질 모두의 상동성 영역을 함유한다. 이 영역의 Map1a 및 Map1b의 정렬을 나타내며, 상단 서열은 Map1a이고 바닥 서열은 Map1b이다:
ALIGN으로 2개의 서열의 전역 정렬을 계산하였다.
버젼 2.OuPlease (Myers and Miller, CABIOS (1989) 4:11-17 인용)
서열 1 212 aa 대
서열 2 177 aa
매트릭스 스코어: BLOSUM50, 갭 페널티 (gap penalties): -12/-2
상동성 43.6％; 전역 정렬 스코어: 614
실시예 5
ee3_1/ee3_2의 인간 상동성 서열
(a) 염색체 5q33.1 상에서
또다른 상동성 서열을 콘티그 (contig) AC11406.00015 상에서 Tblastn의 도움으로 결정하였다:
>AC011406.00015
길이: 40,620
마이너스 가닥 HSP:
스코어 = 389 (136.9 비트), 예상치 = 1.3e-41, 합 P(3) = 1.3e-41
상동성 = 72/303 (71％), 양성 = 78/303 (77％), 프레임 = -1
스코어 = 86 (30.3 비트), 예상치 = 1.3e-41, 합 P(3) = 1.3e-41
상동성 = 15/51 (88％), 양성 = 16/51 (94％), 프레임 = -3
스코어 = 67 (23.6 비트), 예상치 = 1.3e-41, 합 P(3) = 1.3e-41
상동성 = 12/57 (63％), 양성 = 17/57 (89％), 프레임 = -2
상응하는 cDNA를 수득할 수 있지만, ee3 단백질에 대해 상동성인 카르복시-말단 단편에서만 번역되었다.
ee3_1_m과의 서열 비교는 하기와 같다:
ALIGN으로 2개의 서열의 전역 정렬을 계산하였다.
버젼 2.OuPlease (Myers and Miller, CABIOS (1989) 4:11-17 인용)
서열 1 350 aa 대
서열 2 148 aa
매트릭스 스코어: BLOSUM50, 갭 페널티 (gap penalties): -12/-2
상동성 29.4％; 전역 정렬 스코어: 649
수득한 cDNA 서열이 게놈 데이타에 전체적으로 상응하기 때문에 단지 하나의 GPCR 단편의 생성은 일정하고, ATG의 프레임 중의 정지 코돈 상류의 존재를 나타냈다 (서열 참조):
마이너스 가닥 HSP:
스코어 = 6976 (1046.7 비트), 예상치 = 0.0, 합 P(2) = 0.0
상동성 = 1396/1397 (100％), 양성 = 1396/1397 (100％), 가닥 = 마이너스/플러스
(b) 염색체 8q11.22 상에서
Ensembl 콘티그 AcO34174 상에서 또다른 상동성 서열을 발견하였다.
상동성 뉴클레오티드 구획의 단백질 서열은 하기와 같다:
(c) 염색체 3p25.3 상에서
염색체 3 상에서 1개의 상동성 서열을 발견하였다:
(d) 염색체 Xp21.1 상에서:
>AC027722.00010
길이: 3,576
마이너스 가닥 HSP:
스코어 = 65 (22.9 비트), 예상치 = 4.1e+02, 합 P(2) = 1.0
상동성 = 11/90 (37％), 양성 = 19/90 (63％), 프레임 = -1
스코어 = 57 (20.1 비트), 예상치 = 4.1e+02, 합 P(2) = 1.0
상동성 = 16/147 (33％), 양성 = 24/147 (49％), 프레임 = -2
이들 상동성 구획에 대해 상응하는 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
및
그러나, 컨센서스 서열 DRI가 빠져 있었다.
(d) 다른 스플라이스 생성물 ee3_1b_h 및 ee3_1c_h
인간 유전자 생성물 ee3_1_h의 다른 스플라이스 생성물, 즉 ee3_1b_h를 발견하였다 (도 11B, 서열 3B 참조). 상기 생성물은 엑손 3 중의 컨센서스 스플라이스-도너 부위로부터 생성되었고, 개질된 카르복시 말단 및 초기 번역 정지를 갖는 개질된 오픈 리딩 프레임을 생성하였다. 이는 제4 TM 도메인 후에 정지되는 단백질 (166개의 아미노산, 분자량: 19.2 kD)을 생성시켰다 (도 15B, 서열 7B 참조). 또한, 제2 M 도메인 후에 일부절단된 도 15C에 따른 상응하는 단백질 서열 (서열 7C)을 갖는 추가의 다른 스플라이스 생성물, 즉 ee3_1c_h를 동정하였다 (도 11C, 서열 3C 참조). 상기 스플라이스 생성물을 세파르드 등의 클로닝 방법의 도움과 함께 클로닝 및 서열분석 방법으로 동정하였다 (실시예 1 참조).
ee3_1b_h에 대한 TM 영역의 예상은 하기와 같았다:
-----> 매우 바람직한 모델: N-말단 외부 4개의 강한 막횡단 나선, 총 스코어: 6315
이 스플라이스 생성물은 전장 수용체의 기능 조정에 있어서 기능적으로 중요하다 (예를 들면, V2 바소프레신 수용체 참조) (Zhu and Wess, 1998, Biochemistry, 37, 15773-84; Schulz, et al., 2000, J Biol Chem, 275, 2381-9)). GPCR 단백질이 호모- 또는 헤테로-이량체화되기 때문에 (Bouvier, 2001, Nat Rev Neurosci, 2, 274-86.) 본 발명의 서열의 이러한 일부절단된 형태는 우성-음성 부위 역할을 할 수 있다.
결과로서, 본 발명은 본원에 개시된 질병의 치료용 약물을 제조하기 위한, 본 발명의 ee3 단백질의 이러한 스플라이스 형태 (예를 들면 본 발명의 발현 벡터에서 나출형 DNA, 본 발명의 단백질 서열 등으로서) 및 또한 이러한 스플라이스 형태의 변형의 용도를 개시한다. 이 개시 내용은 마찬가지로 제약상 영향받는 본 발명의 ee3 족의 수용체의 능력을 연구하기 위한 그의 용도도 또한 포함한다.
실시예 6
ee3 족 단백질의 단백질 위상 데이타
TMPred 프로그램을 사용하는 TM (막횡단) 스크리닝은 하기 매우 바람직한 모델을 생성시켰다:
(a) ee3_1
-----> 매우 바람직한 모델: N-말단 외부 7개의 강한 막횡단 나선, 총 스코어: 11863
TM 도메인 사이의 절편의 간격은 15, 7, 27, 10, 34, 20, 13 AA이고, 세포내 잔기는 길이가 92 AA이었다.
(b) ee3_2에 대해 동일한 상황이 나타났다:
-----> 매우 바람직한 모델: N-말단 외부 7개의 강한 막횡단 나선, 총 스코어: 12351
TM 도메인 사이의 절편의 간격은 15, 0, 33, 10, 34, 20, 16 AA이고, 세포내 잔기는 길이가 90 AA이었다.
(c) 비교를 위해 사용한 대조 실험은 선행 문헌으로부터의 CCR-5 수용체 (마찬가지로 7TM 수용체 부류에 속함)의 위상이었다:
TM 도메인 사이의 절편의 간격은 51, 13, 16, 18, 33, 21 및 17 AA이고, 세포내 잔기는 길이가 46 AA이었다.
멀리 관련된 7TM 수용체 브라디키닌 (bradykinin)-2, CXCR5, 갈라닌 수용체-2 및 아나필로톡신 (anaphylotaxin) C5a의 일반 위상 (단백질의 비-막횡단 잔기 각각, 즉, N 말단 및 C 말단 및 루프 잔기의 아미노산 수를 나타냄)의 비교를 본 발명의 ee3_1과 비교하여 하기에 나타낸다:
이들 단백질의 일반 위상이 뚜렷하게 유사하다는 것을 밝혀냈다.
실시예 7
ee3_1의 모티프 및 신호 서열의 결정
프로사이트 (Prosite) 프로그램을 사용함:
정합 패턴 PSOOOOI ASN_글리코실화
AS 294: NISY
총 정합: 1
정합 패턴 PS00006 CK2_인산_부위
AS 77: TCVE
총 정합: 1
정합 패턴 PSOOOO8 미리스틸
AS 57: GASVGT
AS 263: GQKGGN
총 정합: 2
따라서, 1개의 CK2 인산화 부위는 위치 77에 위치하고, 1개의 아스파라긴 글리코실화 부위는 위치 294에 위치하고, 2개의 미리스틸화 부위는 위치 57 및 263에 위치하였다 (도 7에 따라 연속적으로 번호를 매김). 카르복시 말단에서 발견되는 전형적인 인산화 부위는 없었다.
실시예 8
에리스로포이에틴의 단일 투여에 의한 ee3의 유도
도 19에 나타낸 바와 같이, ee3_1은 에리스로포이에틴 (Erypo, Janssen;5000 U/kg 체중)의 단일 내복막 주사에 의한 전사 수준에서 래트에서 유도되었다. 에리스로포이에틴 주사 6 및 24 시간 후에 룸푼/케타네스트 (Rompun/Ketanest)를 주사하여 래트를 말단에 마취시키고, 뇌를 서서히 들어냈다. 대조군 래트를 염수로 처리하였다. 래트의 ee3_1 메신저 RNA를 LightCycler (Roche, Mannheim, Germany)의 반정량적인 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 시클로필린에 대한 표준 곡선과 함께 샘플의 상대적인 형광과 비교하여 정량하였다.
콤크진스키/사키 (Chomczynski/Sacchi)의 방법 (산성 페놀 추출)을 사용하여 총 RNA를 래트 전뇌 (소뇌 및 후구 없이)로부터 단리한 후에, 제조자의 사용설명서에 따라 RNeasy 추출 키트 (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA)를 사용하여 정제하였다. RNA 농도를 광도계로 측정하고, 총 RNA의 품질을 아가로스 겔 전기영동을 통해 평가하였다. RNA를 사용할 때가지 -80 ℃에 저장하였다.
수퍼스크립트 (Superscript) II (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 역전사시킨 후에, 반응 생성물을 LightCycler 기술로서 실시간 온라인 PCR로 상대적으로 정량하였다. 이를 위해, 3마리의 야생형 마우스 및 3마리의 유전자이전 tg6 마우스의 뇌로부터의 총 RNA 샘플을 사용하였다. 시클로필린에 대한 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 정방향 프라이머의 경우이고, 역방향 프라이머의 경우이며, 결합 온도 60 ℃이고, 래트 ee3_1의 경우 정방향 프라이머:및 역방향 프라이머:이었다.
정량을 위해, 1:3, 1:9, 1.27, 1:81 및 1:243의 연속 cDNA 희석을 하기 계획에 따라 증폭하였다: 94 ℃에서 5 분의 초기 변성, 94 ℃에서 5초의 변성, 특정 프라이머에 따라 (상기 참조) 55 ℃ 또는 60 ℃에서 10초의 결합, 및 72 ℃에서 30초의 연장을 포함하는 50 사이클에 걸친 증폭. 각각의 샘플의 형광을 10초 동안의 각각의 사이클의 끝에 80 ℃에서 측정하였다. 반응 생성물의 특이성을 아가로스 겔 전기영동 및 용융 곡선 분석 (나타내지 않음)으로 입증하였다. 각각의 PCR 반응은 정확하게 1개의 반응 생성물을 생산하였다.
상기 PCR 반응의 대수기를 정량을 위해 사용하였다. 이는 적절한 곡선을 통한 점근선의 부설과 관련되었다. 헤모글로빈의 경우, 실질적으로 평행 경사 선이 생성되어 시클로필린에 대한 표준 곡선과 비교하기 위해 이들 곡선의 슬로프를 사용할 수 있었다. 평균 ±표준 편차는 표준화된 PCR 생성물의 각각의 cDNA 희석에 대해 결정하였다. 이 방식으로 얻은 정량적인 차이는 유전자이전 및 야생형 동물의 RNA 발현의 상대적인 변화에 상응한다. 모든 반응을 단일 반응 생성물로 생산하였다. ee3에 대한 평균 유도 인자는 6 시간 후에 1.35배이고, 24 시간 후에 1.44배이었다.
실시예 9
뇌의 ee3_1 RNA의 분포
마우스의 ee3_1 전사의 위치화를 방사능표지된 올리고프로브를 사용하여 계내 혼성화로 연구하였다. 이를 위해, 두께 15 ㎛인 뇌 구획을 저온유지장치를 사용하며 -20 ℃에서 절단하고, 폴리-L-리신-코팅된 슬라이드 상에 올리고, PBS (pH7.4) 중의 4％ 파라포름알데히드에서 고정하였다. 말단 트랜스퍼라제 (Roche Diagnostics, Mannheim)로 a-35S-dATP를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 방사능표지하였다. 표지화 뿐만 아니라 차후 혼성화를 문헌 (Wisden & Morris, In situ-Hybridization Protocols for the brain, Academic Press 1994)의 프로토콜에 따라 수행하였다.
사용된 방사능표지된 프로브 (로서 ee3_1.3)는 소뇌 (ce), 해마 (hc), 치상회 (dg) 및 피질 (co), 특히 내후각 피질 (ent), 후구 (olf)에서의 ee3_1 발현을 시각화할 수 있었다. 상응하는 센스 대조군 (로서 ee3_1.3)은 특정 신호 (나타내지 않음)를 주지 않았다 (도 20).
실시예 10
마우스 조직 중의 ee3_1 분포의 면역조직화학 표시
파라핀-함몰 조직을 절단하고 (2 ㎛), 예비처리한 슬라이드 (DAKO, Glostrup, Denmark)상에 올리고, 밤새 통풍 건조시키고, 이어서 탈파라핀시켰다 (크실렌 및 알콜의 하위 순위). 500 W에서 10 분 동안 시트레이트 완충액 중에서 마이크로파 처리한 후에, 구획을 1:500의 희석의 항-ee3_1 혈청 (AS4163)과 함께 실온에서 1 시간 동안 습윤한 챔버 내에서 인큐베이션하였다. 제조자의 정보에 따라 DAB을 색원체로서 사용하는 ABC 기술로 면역반응을 시각화하였다 (DAKO,Glostrup, Denmmark). 음성 대조군은 동일하게 처리하지만 1차 항체가 생략된 구획 및 1차 항체 대신에 상응하는 프리-면역 혈청을 사용한 구획을 포함하였다.
면역조직화학적 염색의 결과를 도 22에 나타냈다. 장 및 폐의 일부 구조를 제외하고, 모두에 걸쳐 ee3의 실질적으로 뉴론특이성 위치화를 나타냈다. ee3은 통합 기능 (피질 층 V의 거대 추체 세포, 후구의 승모판 세포, 소뇌의 프르키니에 (Purkinje) 세포)을 갖는 뉴론에 의해 종종 발현된다. 이미지 A 내지 C는 신경 투사의 구별 염색으로 V 층 중의 ee3의 피질 위치화를 나타냈다. 더 집중적인 면역염색은 내후각 피질 (C)을 시각화할 수 있었다. 생리학상 관점으로부터, 내후각 피질로부터 해마로 정보가 흐르며, 이는 학습 및 기억에 기여한다.
내후각 피질의 변화는 종종 발작, 알쯔하이머병 또는 머리 및 뇌 손상 후의 환자에서 발견되었다. 내후각 피질의 질병은 감각 인상의 불충분한 진행 및 학습 곤란을 포함하는 거동의 변화를 유발할 수 있다 (Davis et al., Nurs Res 50 (2) 77-85 (2001)). 이미지 D 내지 F는 ee3의 해마 분포 패턴을 나타냈다. CA3 부분의 발현, 및 CA2 및 CA1 발현의 결실 사이의 예리한 경계선은 여기서 뚜렸하였다. CA1 영역의 뉴론 및, 더 적은 정도로 CA4 영역의 뉴론은 특히 일반 중추-신경 손상이 있는 괴사- 및 염증-무함유 생리학상 세포 사멸 (아포토시스)에 특히 민감하였다 (예컨대, (Hara, et al., Stroke, 31, 236-8, (2000)). 대조적으로, 치상회는 괴저성 손상에 의해 다소 영향받는 것으로 추정된다. 치상회는 병리학상 자극 후에 새로운 뉴론 형성에 연결된다 (Takagi, et al., Brain Res, 831, 283-7, (1999)) (Parent, et al., J Neurosci, 17, 3727-38, (1997)). ee3은 마찬가지로비-신피질 발생의 영역: 통합 뉴론으로서 작용하는 소뇌의 프르키니에 세포 (G, H), 및 후구의 승모판 세포 (I, J)에서 발견되었다. ee3의 강한 발현을 신경절 세포 및 망막의 감각 세포 (K, L)에서 발견할 수 있었다.
최근, 망막의 에리스로포이에틴의 신경보호 작용은 보고되었다 (Junk et al., Erythropoietin administration protects retinal neurons from acute ischemia-reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Aug 6;99(16):10659-64.; Grimm et al., HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nat Med. 2002 Jul; 8(7): 718-24.). 이들 발견은 EPO 유도와 ee3 발현의 연결을 제안한다. EE3은 마찬가지로 운동계에 속하는 뉴론에서 강하게 발현된다. 따라서, 특정 발현은 척수의 거대 운동뉴론의 앞뿔 (도 22 M) 및 운동핵의 삼차 핵의 기능적으로 동등한 뉴론 (도 22 N)에서 발견할 수 있었다.
척수 중의 ee3의 상기 분포는 아마 근위축성 측삭 경화증의 치료 및 진단 개입을 위해 사용할 수 있다. 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루 게흐리그 (Lou Gehrig) 질환; 샤르코 (Charcot) 질환)은 연간 발생률이 100 000 명 당 0.4 내지 1.76 명인 신경퇴행성 질병이다 (Adams et al., Principles of neurology, 6th ed., New York, pp 1090-1095). 이는 전형적인 발현을 갖는 운동뉴론 질병의 가장 통상적인 형태, 예컨대 일반화된 속상수축, 진행성 위축 및 뼈대 근육계의 약화, 연축성 및 양성 추체로 징후, 구음장애, 연하곤란, 및 호흡곤란이다. 병리학은 주로 척수의 앞뿔 및 더 낮은 뇌간의 운동 핵에서의 신경 세포 손실을 포함하지만,또한 피질 중의 제1 순위 운동뉴론에 영향을 끼칠 수 있다. 이 질환의 병인론은 가족의 경우에 수퍼옥사이드 디스무타제 돌연변이의 역할이 매우 잘 설명될지라도 주로 공지되어 있지 않다. 이제까지, ALS를 유발할 수 있는 SOD1 단백질에서의 90 이상의 돌연변이는 기재되어 있다 (Cleveland and Rothstein (2001), Nat Rev Neurosci, 2, 806-19.). 신경세사는 또한 이 질환에서 부분의 역할을 수행하는 것으로 추정된다. 과잉의 글루타메이트에 의해 유발되는 메카니즘인 흥분독성은 또다른 병인론적 인자이고, 이를 인간 환자의 릴루졸 작용에 의해 확인할 수 있다. 카스파세 및 아포토시스 모두의 활성화는 ALS 병인론의 최종 경로로 추정된다 (Ishigaki, et al. (2002), J Neurochem, 82, 576-84., Li, et al. (2000), Science, 288, 335-9.). ALS에 명확히 영향을 끼치는 뉴론 상의 ee3 단백질의 위치화는 이 질환에서 ee3 아고니스트 또는 ee3 안타고니스트의 유효한 치료 기능적/진단 적용성을 나타낸다.
중뇌의 흑질의 ee3의 위치화 (도 22 0, P)는 파킨슨병에 대한 치료 및 진단 가능성을 열 수 있었다. 파킨슨병은 북미에서 약 1 백만 환자가 갖는 가장 통상적인 운동 질병이다. 65 초과의 개체의 약 1％에 영향을 끼친다. 주요 증상은 경직, 진전, 무운동증이다 (Adams et al., Principles of neurology, 6th ed., New York, pp 1090-1095). 질환의 원인은 공지되어 있지 않다. 그럼에도 불구하고, 사후 조직 및 동물 모델의 분석은 도파민성 신경퇴화를 유지할 수 있는 흑질에서 산화성 스트레스의 진행성 과정을 나타낸다. 산화성 스트레스를 유발할 수 있는 신경독소, 예컨대 6-히드록시도파민 및 MPTP (N-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘)를 신경퇴화의 과정을 연구하기 위해 동물 모델에서 사용하였다. 증상 치료요법제 (예컨대, L-DOPA 및 탈카르복실라제 억제제; 브로모크립틴, 도파민 아고니스트로서 퍼골라이드 및 항콜린성 물질, 예컨대 트리헥시페니딜 (아르탄))가 존재하지만, 병리학상 과정을 중지시킬 수 있는 원인, 즉 신경보호 치료요법을 위해 분명확히 요구된다. 아포토시스성 메카니즘은 동물 모델 및 인간 모두에서의 병인론에 분명히 요구된다 (Mochizuki, et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10918-23, Xu et al. (2002), Nat. Med,, 8, 600-6, Viswanath, et al- (2001), J. Neurosci., 21, 9519-28, Hartmann, et al. (2002) Neurology, 58, 308-10).
신경계에서 ee3의 위치화는 이 단백질 및 신경 세포 사멸, 신경발생 및 신경 가소성의 발현 사이의 연결에 대한 매우 강한 증거이다.
폐에서, ee3을 별개의 구조 (도 22 Q 내지 V)에서 발견할 수 있었다. ee3을 발현하는 기저 세포는 말단 세기관지에서 발견되고, 아마 신경내분비 활성을 갖는 세포이었다. 이 위치화는 기관지 질환에 대한 ee3의 치료상 중요성을 제안한다. 또한, 세동맥의 내피 및 평활근 세포에서 발현된다 (12 U, V). 대조적으로, 소정맥은 ee3의 임의의 면역조직화학적 기록가능한 발현을 나타내지 않았다 (도 22 Q 및 R). 치료요법은 혈액의 이 세포 층에 즉시 접촉하기 때문에 내피 세포에 의한 특정 수용체의 발현이 대단히 약물학상 중요하다. 순환계에서 작용하는 중요한 약물은 세동맥, 특히 내피 또는 평활근계를 표적화한다. 따라서, ee3은 순환상의 질병, 예를 들면 동맥 고혈압에 영향을 미치는 매우 매력적인 표적 단백질이다.
창자에서, ee3은 음와 (도 22 W, X) 및 장 신경총에 아마 속하는 신경 세포 (도 22 Y)의 기부에서 발견되었다. 대부분의 조직학적으로 연구된 기관에서, 기관-특이성 세포의 특이적 염색이 없지만, 다수의 경우에 다소 신경의 개별 염색에서만 상기 염색이 있다 (예를 들면, 심근 (도 22 AA) 또는 연결 조직 (도 22 Z)에서, 참조). 축색돌기 상의 ee3의 이 명확한 위치화는 이 분자로 예를 들면 광범위한 당뇨성 다발성신경병증을 포함하는 말초 신경 (신경병변) 질병의 진단 및 치료를 예상하게 한다. 마찬가지로, 말초 신경계, 예를 들면 HMSN 군 (유전성 운동감각 신경병변)의 통상의 유전학적 질병은 또한 그로부터 이익될 수 있다.
최종적으로, 발현 패턴은 운동종판 상의 위치화와 가장 알맞게 일관된 골격근에서 발견되었다 (도 22 BB). 이는 운동종판, 예를 들면 중증 근무력증의 질병에 대해 잠재적으로 흥미롭다.
실시예 11
ee3은 EPO-과발현 마우스의 단백질 수준에서 상향조절된다.
나타난 면역조직화학 (항혈청 AS 4163)은 또한 에리스로포이에틴에 의한 ee3 단백질의 구별된 상향조절을 나타냈다 (도 23). 병렬 처리한 CNS 구획은 ee3에 대해 뚜렷하게 강화된 신호를 가졌다. 이는 염색하고 각각의 경우에 유전형에 대해 맹검법으로 평가한 각각의 경우에 3마리의 마우스 모두 (야생형 및 EPO-과발현 (tg6))에서 나타났다.
실시예 12
map1b-결함 마우스에서 ee3 및 map1b의 공위치화 및 ee3 발현의 부재
Map1a 및 Map1b의 경쇄를 ee3_1 카르복시 말단을 사용하는 효모 투-하이브리드 스크리닝에서 상호작용 단백질로서 동정하였다 (상기 실시예 참조, 실시예 4). 도 24는 마우스에서 ee3_1 및 map1b에 대한 이중 면역형광을 나타내고, 마우스에서 ee3_1 및 map1b 발현의 예측하지 못한 오버랩핑을 표시하였다.
이중 면역형광 염색의 경우, 마이크로파 처리 (시트레이트 완충액, 50OW, 10 분)한 후에 탈파라핀화된 구획을 토끼 ee3_1 항체 (AS4163) 및 map1a에 대한 염소 항체 (MAP-1B (C20): sc-8971; Santa Cruz; Santa Cruz, USA)와 함께 동시에 습윤한 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 적절한 세척 단계 후에, 구획을 2차 항체 FITC 항-토끼 및 TRITC 항-염소의 혼합물과 30 분 동안 인큐베이션하였다 (항체 모두를 각각의 경우에 PBS에 모두 1:30 희석함, 디아노바 (Dianova, Hamburg, Germany)로부터 입수함). 구획을 PBS로 다시 세척한 후에 제조물을 히스토세이프 (Histosafe)를 사용하여 봉합하고, 적절한 차단 필터를 사용하며 형광 현미경 (Olympus IX81, Olympus, Germany)으로 분석하였다. 신호 오버레이를 분석 소프트웨어 (soft imaging systems, Stuttgart, Germany)의 도움으로 작성하였다. 병렬 단일 형광 염색에서, 각각의 경우에 다른 채널에서 신호의 부재를 나타내며, 예를 들면 불충분한 필터 때문에 각각의 경우에 다른 채널 내로의 신호 "생략"의 현상을 배제하였다. 2차 항체에 대한 상호교환된 발색단을 사용하는 이중 염색은 동일한 사진을 나타냈다 (나타내지 않음).
도 24는 CNS에서 2개의 단백질의 놀라운 공-위치화를 나타낸다. 녹색: ee3_1 염색; 적색: Map1b 염색; 황색: 신호 모두의 전자 이미지중첩. 척수 (sc)및 소뇌 (cb)로부터의 실례를 나타냈다.
Map1b은 중요한 신경 단백질이다. 이는 포유류 중추 신경계의 발생 동안 발현되는 제1 미세관 결합 단백질 (maps) 중 하나이다. 뉴론의 축삭발생과 관련되는 것 같다 (Gonzalez-Billault, et al. (2001), Mol Biol Cell, 12, 2087-98, Gonzalez-Billault, et al. (2002), Brain Res, 943, 56-67.). 뉴론의 상호작용에서 map1b의 기능적으로 중요한 부분은 map1b가 정신 지체의 가장 통상의 유전성 형태인 유약 X 증후군의 병인과 관련된다고 증명한 매우 최근 연구에 의해 지지된다. Map1b mRNA는 유약 X mRNA에 의해 직접적으로 조절되는 단백질인 FMRP에 의해 조절된다. 드로소필라의 연구는 map1b (드로소필라에서의 자극)가 유약 X-유사 표현형의 발현에서 중심부 역활을 수행한다는 것을 밝혀냈다 (Sohn (2001), Science, 294, 1809, Zhang, et al. (2001), Cell, 107, 591-603.). map1b는 또한 퇴행성 유전학적 질환 거대 축삭 신경병증 (GAN)에 대한 원인인 돌연변이된 유전자의 단백질인 기각소닌에 결합한다 (Ding, et al. (2002), J Cell Bol, 158, 427-33.). 말초 신경 손상 후에, map1b는 수질화 신경의 과대성정한 뉴론에서 증가적으로 유도되고, 아마 축삭 발생과 관련된다 (Soares, et al. (2002), Eur J Neurosci, 16, 593-606.). 마지막으로, map1b는 아마 GABA-C 수용체를 그의 시냅스 위치에 위치화킨다 (Pattnaik, et al. (2000), J Neurosci, 20, 6789-96.).
map1b 유전자는 마우스 (낙아웃)에서 유전학적으로 불활성화되었다. 최고 입수가능한 낙아웃은 문헌 (Meixner, Haverkamp, Wassle, Fuhrer, Thalhammer, Kropf, Bittner, Lassmann, Wiche and Propst (2000), J Cell Biol, 151, 1169-78.)에 기재된 마우스이다. map1b 유전자의 동종접합성-불활성화를 갖는 마우스를 ee3 발현에 대해 면역조직화학적으로 연구하였다. ee3_1의 염색성 (도 25)이 매우 크게 감소되었으며, 이는 map1b와 상호작용에 대한 ee3_1 단백질 발현 또는 단백질 안정성의 의존을 나타낸다. 따라서, 이 상호작용의 억제자는 ee3 발현의 현저한 감소를 유도할 것이다.
실시예 13
ee3_1의 탐지용 항혈청의 제조
인간 ee3_1 단백질의 단백질 서열을 DNAStar 프로그램 패키지 (Lasergene)의 프로틴 (Protean) 프로그램 부분을 사용하여 분석하고, 아미노산 299 내지 315에 상응하고 세포내 C 말단에 위치한 에피토프 LHHEDNEETEETPVPEP를 2차구조 예상, 또한 고도로 예상된 표면 확률 및 높은 항원성에 따라 선별하였다. 상기 펩티드 서열을 담체 단백질 KLH에 대한 조절된 특이성 커플링을 가능하게 하기 위해 N 말단 (CLHHEDNEETEETPVPEP)에 부착된 시스테인으로 합성하였다. 2마리의 토끼를 최적화된 계획에 따라 펩티드-KLH 컨쥬게이트로 면역화시켰다. 펩티드 합성, KLH에 대한 차후 커플링 및 2마리의 토끼의 면역화를 바이오트렌드 케미칼린 (BioTrend Chemikalien) GmbH에 주문하였다. 몇 마리의 토끼의 전-면역 혈청을 1차 면역화 이전에 모의-형질감염된 세포 및 뇌 추출물의 웨스턴 블롯 분석에서 그의 교차반응성에 대해 분석하였다. 무시해도 좋은 출신의 2마리의 토끼에 1차 면역화 3주 후에 제1 추가투여하고, 또다른 4 주 후에 제2 추가투여하였다. 1주 후에, 혈액 20 ml를 토끼로부터 채혈하고, 일시 형질감염된 세포 (HEK293, CHO-dhfr-)의 혈청을웨스턴 블롯 분석 및 면역세포화학 염색으로 분석하였다. 제3 또는 제4 추가투여 후에 토끼를 출혈시켰다.
토끼 모두의 혈청이 양성이었다. 특히, AS4163 항혈청이 각종 세포에서 매우 특이적으로 일시 발현된 인간 ee3_1 단백질을 방법 모두에서 인식되고, 웨스턴 블롯 분석에서 희석 1:12 000 이하로 사용될 수 있었다. AS4163 항혈청은 또한 ee3_1 단백질의 면역침전에 적합하고, 따라서 형질감염된 세포 또는 천연 조직으로부터의 함께 상호작용하는 ee3_1 및 단백질의 침전에 사용될 수 있다. AS4163 항혈청은 인간 서열과 단지 1개의 아미노산, 즉 세린로의 N304의 돌연변이만 상이한 쥐과 ee3_1 서열에서의 상응하는 에피토프를 특히 인식하였다. 따라서, AS4163 항혈청은 도 22 내지 24에 나타낸 바와 같이 야생형, 유전자이전 및 낙아웃 마우스에서의 ee3_1 단백질 발현의 면역조직화학적 분석에 대해 매우 적합하다.
실시예 14
ee3_1이 신경 줄기 세포에 의해 발현된다.
신경 줄기 세포를 상술된 바와 같이 4 내지 6주 생 수컷 위스타 (Wistar) 래트의 해마로부터 단리하였다 (Ray et al., 1993). 프로토콜은 독일 법에 부합된다. 동물을 이소푸란 1％ (v/v), N2O 70％, 산소 29％로 마취시키고, 목베기로 죽였다. 뇌를 준비하고, 4.5 g/l 글루코스 (DPBS/Glc)를 함유한 빙냉 둘베코 (Dulbecco) 인산염 완충 염수 (DPBS) 50 ml로 세척하였다. 해마를 6마리의 동물에서 들어내고, DPBS/Glc 10 ml에서 세척하고, 1600 x g에서 4 ℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후에 조직을 가위 및 스캘펠을 사용하여 균질화시켰다. 조직 조각을 DPBS/Glc 배지로 세척하고, 800 g에서 5분 동안 원심분리하고, 펠렛을 핸크 (Hank) 균형 염 용액 (HBSS) 중의 파파인 0.01％ (w/v), 디파스 II (천연 프로테아제) 0.1％ (w/v), DNase I 0.01％ (w/v), 및 12.4 mM 황산망간에서 재현탁하였다. 조직를 피펫 팁을 사용하여 연화시키고, 용액의 가끔씩 (매 10분)의 혼합과 함께 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 현탁액을 이어서 800 x g 및 4 ℃에서 5분 동안 원심분리하고, 펠렛을 2 mM L-글루타민, 페니실린 100 단위/ml 및 스트렙토마이신 100 단위/ml을 함유한 DMEM 함 (Ham) F-12 배지 10 ml로 3회 세척하였다. 세포를 이어서 B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 mM L-글루타민, 페니실린 100 단위/ml 및 스트렙토마이신 100 단위/ml, EGF 20 ng/ml, FGF-2 20 ng/ml, 및 헤파린 2 ㎍/ml를 함유한 뉴로베이설 (neurobasal) 배지 1 ml에서 재현탁하였다. 세포를 무균 조건하에 6-웰 플레이트 내로 25 000-100 000 세포/ml의 농도로 시딩하였다. 플레이트를 37 ℃에서 5％ C02중에서 인큐베이션하였다. 단지 배지의 약 2/3만을 갈며 세포 배양 배지를 주 1회 교환하였다 (Ray J, Peterson DA, Schinstine M, Gage FH (1993) Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc Natl Acad Sci USA 114 90: 3602-6. 참조).
3주 동안 배양된 해마 줄기 세포로부터 동결된 저장액으로부터 해동시킨 후에 표준 프로토콜 (RNeasy 키트, 키아젠)에 따라 RNA를 단리하였다. cDNA를 표준프로토콜에 따라 oligodT 프라이머 및 수퍼스크립트 II 역전사효소 (Gibco)를 사용하여 합성하였다. PCR을 하기 반응 파라미터를 사용하여 수행하였다: 10분 동안 94 ℃에서 변성, 30초 동안 94 ℃, 50초 동안 55 ℃, 60초 동안 72℃의 30 사이클; 5분 동안 72 ℃, 4 ℃, 하기 프라이머 쌍을 사용함: ee3_플러스및 ee3_마이너스.
최근 몇 년 동안, 신경계 질환 과정에서 신경 세포 (신경발생)의 신규 형성의 중요성이 인식되었다. 다수의 다른 조직에 비해, 성숙 뇌는 재생능이 제한되고, 유별나게 높은 정도의 세포 특성화는 파괴된 조직의 기능을 인계받는 잔존한 건강한 조직에 대한 가능성을 제한한다. 그러나, 성체 뇌의 전구체 세포로부터 발생된 신경 세포는 이들 기능을 대체로 인계받는 가능성을 갖는다.
신경발생은 성체 뇌의 구별된 영역 (치상회 (DG)의 외측 심실의 입쪽 하부심실 영역 (SVZ) 및 하부과립 영역 (SGZ))에서 일어난다. 다수의 군은 신경발생이 특히 신경계 손상 (예컨대, 뇌 허혈)에 의해 유도된다고 입증하였다 (Jin, et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 4710-5, Jiang, et al. (2001), Stroke, 32, 1201-7, Kee, et al. (2001), Exp. Brain. Res., 136, 313-20, Perfilieva, et al. (2001), J. Cereb. Blood Flow Metab., 21, 211-7)). 신경발생은 또한 인간에서 발생되고 (Eriksson, et al. (1998), Nat Med, 4, 1313-7.), 실제 기능성 뉴론을 유도한다 (van Praag, et al. (2002), Nature, 415, 1030-4). 치상회 및 신문의 하부과립 영역은 성체 기 동안 새로운 뉴론 발생의 잠재력을 가진다 (Gage, etal. (1998), J Neurobiol, 36, 249-66). 뚜렷하게, ee3을 해마의 신경 줄기 세포 상에 탐지할 수 있다 (도 25). 이는 신경발생에 대해 ee3이 매우 중요함을 암시한다. 신경발생에서의 이 중요성은 일반적으로 임의의 신경퇴행성 질병에 대해 ee3의 유용성에 대한 추가 증거이다.
뇌에서의 내생 줄기 세포에 대한 작용과 대조적으로, ee3을 사용하는 치료술은 줄기 세포의 시험관내 조작 (예컨대, 시험관내 분화 및 증식)을 간섭한다. 현재, 줄기 세포는 다수의 신경퇴행성 질병, 특히 파킨슨병 및 발작에서의 그의 유용성에 대해 조사되고 있다. 예를 들면, 파킨슨 환자에 대한 이식을 위해 세포를 시험관내 분화시키므로서 주사 후에 도파민 결실을 보상하는 것이 바람직하다 (대체 치료요법) (Arenas (2002), Brain Res. Bull, 57, 795-808, Barker (2002), Mov. Disord., 17, 233-41). 도입 줄기 세포의 또다른 가능성은 발작 또는 뇌 손상의 경우에 예를 들면 동맥내 또는 정맥내 주사이다 (Mahmood, et al. (2001), Neurosurgery, 49, 1196-203; discussion 1203-4, Lu, et al. (2001), J Neurotrauma, 18, 813-9, Lu, et al. (2002), Cell Transplant, 11, 275-81, Li et al. (2002), Neurology, 59, 514-23). 줄기 세포 치료요법에서 ee3의 또다른 가능성 용도는 ee3에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트를 항상 유리하는 세포의 생산일 수 있다.
실시예 15
제노푸스 라에비스 (Xenopus laevis) 및 다리오 레리오 (Dario rerio)로부터의 ee3 수용체 족의 추가 관계물의 클로닝
본 발명의 상동성 판단기준 때문에 ee3 단백질 족의 추가 구성원의 클로닝이 가능하였다. EST 데이타베이스를 TBLASTN을 사용하여 인간 ee3_1 단백질로부터의 단백질 서열로 스크리닝하였으며, 그 결과 엑스. 라에비스 (아프리카 클로드 프로그 (African clawed frog)) 및 디. 레리오 (제브라 피쉬)로부터 EST를 얻었다. 상기 EST를 표준 방법을 사용하여 서열분석하였으며, 그 결과 하기 서열과 같다:
x1_ee3 (제노푸스 라에비스)의 전장 서열:
x1_ee3의 오픈 리딩 프레임:
및 x1_ee3의 단백질 서열:
디. 레리오의 경우, 이들 서열은 하기와 같다 (dr_ee3):
dr_ee3의 오픈 리딩 프레임 :
및 dr_ee3의 단백질 서열:
도 27은 엑스. 라에비스 및 디. 레리오로부터의 2종의 단백질의 도움으로 ee3 족의 높은 진화 보존성을 다시 한번 더 설명한다.

Claims (27)

  1. 임의의 기능적 상동성 유도체, 단편 또는 대립유전자를 비롯한, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18의 폴리펩티드 중 길이가 아미노산 20개 이상인 부분 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 영역을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 도면은 청구항의 부분인 DNA 서열, 또는 그와 혼성화되는 DNA 서열.
  2. 임의의 기능적 상동성 유도체, 단편 또는 대립유전자를 비롯한, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열, 또는 그와 혼성화되는 DNA 서열.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 임의의 기능적 상동성 유도체, 단편 또는 대립유전자를 비롯한, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열, 또는 그와 혼성화되는 DNA 서열.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 도 9A, 10, 11A, 11B, 11C, 12 또는 17에 나타낸 (c)DNA 서열 중 길이가 뉴클레오티드 60개 이상인 부분 서열, 특히 도 9A, 10, 11A, 11B, 11C, 12 또는 17에 나타낸 번역된 영역 (대문자)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제5항에 청구된 발현 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 포유류 세포, 특히 인간 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 DNA 서열에 의해 코딩된 것을 특징으로 하는 정제된 유전자 생성물.
  9. 제8항에 있어서, 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 정제된 유전자 생성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 임의의 기능적 상동성 대립유전자, 단편 또는 유도체를 비롯한, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 유전자 생성물.
  11. 천연 ee3 서열에 비해 (특히, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따름) 특이적으로 변형된 서열인, 정상 동물에 비해 (특이적으로) 변화된 양의 제9항또는 제10항에 청구된 하나 이상의 아미노산 서열, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 및 18 중 어느 것에 따른 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 제9항 또는 제10항에 청구된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    특히 제9항에 청구되거나 또는 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 및 18 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 천연 ee3 아미노산 서열, 또는 그의 부분의 변경된 형태를 결실 또는 함유하는,
    유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 유전자이전 동물.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 유전자 생성물 상의 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.
  13. 제12항에 있어서, 모노클로날인 것을 특징으로 하는 항체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 세포외 도메인 상의 서열 구획에 대해 에피토프로서 유도되는 것을 특징으로 하는 항체.
  15. 숙주 세포를 제5항에 청구된 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 특징으로 하는, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 유전자 생성물의 발현 방법.
  16. 제6항 또는 제7항에 청구된 숙주 세포를 적합한 발현-촉진 조건 하에 배양하고, 유전자 생성물을 이어서 배양물로부터 정제하는 것을 특징으로 하는, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 유전자 생성물의 단리 방법.
  17. 약물로서의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 DNA 서열 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 유전자 생성물.
  18. 종양증, 저산소증의 만성 또는 급성 상태, 심혈관 질병, (신경)퇴행성 질병, 면역계 질병, 특히 자가면역 질병, 신경계 장애, 특히 발작, 다발성 경화증, 파키슨병, 근위축성 측삭 경화증, 유전변성 실조증, 헌팅톤병, 신경병변 및 간질 치료 (및(또는) 치료용 약물의 제조)에서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 DNA 서열 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 유전자 생성물의 용도.
  19. ee3 단백질의 세포질 구조에 결합하는 세포내 ee3 단백질, 예를 들면 세포내 항체 및(또는) 그의 세포내 기능을 조정, 특히 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제19항에 있어서, 분자량이 바람직하게는 3000 미만인 유기화학 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 확산 또는 막 전달 단백질에 의해 세포막을통과하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. (a) 적합한 숙주 세포계를 제5항에 청구된 발현 벡터, 특히 도 13, 14, 15A, 15B, 15C, 16 또는 18에 따른 단백질을 코딩하는 발현 벡터, 및 경우에 따라 하나 이상의 리포터 유전자를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질감염시키고,
    (b) 시험 화합물의 첨가가 없는 대조군과 비교하여 시험 화합물을 첨가한 후에 적합한 분석 시스템으로 (a)에 따라 수득한 숙주 세포계에 대해 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된, 본 발명에 따른 유전자 생성물에 의해 매개되는 기능을 관찰하기에 적합하고, 특히 아포토시스, 세포 성장, 세포 증식 및(또는) 세포 가소성을 관찰하기에 적합한 파라미터를 측정하는,
    제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 청구된 제약상 활성 화합물의 동정 방법.
  23. 제22항에 있어서, 추가의 단계 (c)가 본 발명의 단백질 상의 제약상 활성 화합물의 결합 부위를 적합한 생화학적 또는 구조-생물학적 방법으로 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 세포내 Ca 유리를 분석 디자인 내의 (b)에 따른 파라미터로서 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 저산소증의 만성 또는 급성 상태가 발생할 수 있거나 또는 관련된 질환, 예를 들면 심근 경색, 심부전, 심근병증, 심근염, 심막염, 전충심염, 관상동맥 심질환, 좌우 단락을 동반하는 선천성 심내결손증, 팔로 (Fallot)의 사징증/오징증, 아이젠멘거 (Eisenmenger) 증후군, 쇼크, 사지 저관류, 동맥 폐색성 질환 (AOD), 말초성 AOD (pAOD), 경동맥 협착증, 신장 동맥 협착증, 소혈관 질환, 뇌내 출혈, 대뇌정맥 및 정맥동 혈전증, 혈관 기형, 거미막하 출혈, 혈관성 치매, 비스방거 (Biswanger) 질환, 피질하 동맥경화성 뇌병증, 색전증 동안의 다발성 피질 경색, 혈관염, 당뇨성 망막병증, 상이한 원인의 빈혈의 속발성 증상 (예컨대, 형성부전 빈혈, 골수이형성 증후군, 진성 적혈구증가증, 거대적아구성 빈혈, 철 결핍성 빈혈, 신장 빈혈, 구상적혈구증, 용혈성 빈혈, 탈라세미아, 혈색소병증, 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소 결핍증, 수혈 사고, 리서스 (rhesus) 부적합증, 말라리아, 심판막 치술, 출혈성 빈혈, 비기능항진증 증후군), 폐 섬유증, 기종, 폐 부종: ARDS, IRDS, 반복성 폐 색전증, 종양증 (예컨대, 결장 암종, 유방암종, 전립선 암종, 폐 암종), 면역계 질병 (예컨대, 자가면역 질병, 특히 당뇨병, 건선, 면역결여증, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 또는 아토피, 천식), 바이러스 감염성 질환 (예컨대, HIV, 간염 B 또는 간염 C 감염, 세균성 감염 (예컨대, 연쇄구균성 또는 포도구균성 감염), 퇴행성 질병, 특히 신경퇴행성 질병, 예를 들면 근이영양증, GvHD (예컨대, 간, 신장 또는 심장), 또는 그 밖에 신경계 장애 (특히, 비배타적으로: 발작, 다발성 경화증, 파키슨병, 거미막하 출혈, 근위축성 측삭 경화증, 유전변성 실조증, 헌팅톤병, 신경병변, 간질, 뇌 손상, 알쯔하이머병); 근이완제 (예컨대, 마취용), 내분비학적 질병 (예컨대, 골다공증 또는 갑상선 기능부전) 및피부병학적 질병 (건선, 신경피부염); 통증의 만성 또는 급성 상태의 제어, 유전학적 질환, 또한 심리학적 분야 중의 질병 (예컨대, 정신분열증 또는 우울증), 창상 치유, 성 기능의 지원, 심혈관 질병 (예컨대, 허혈성 경색, 심부전, 부정맥, 고혈압), 뇌 기능의 증가, 신경퇴행성 질병, 특히 알쯔하이머 치매 및 파키슨병, 근이영양증, 바이러스 감염성 질환, 종양증 및 자가면역 질병 또는 뇌 국소빈혈 치료 (및(또는) 치료용 약물의 제조)에서, 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 청구된 화합물의 용도.
  26. "효모 투-하이브리드 (yeast two-hybrid)" 시스템을 사용하는, ee3 단백질 또는 그의 천연 대립유전자, 단편 또는 유도체의 세포 상호작용 파트너의 동정 방법.
  27. ee3 단백질에 의해 매개되는 신호 전달과 관련된 추가 단백질을 동정하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 DNA 서열 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 유전자 생성물의 용도.
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WO2004015426A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-19 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
AU2003267347A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-29 Galapagos Genomics N.V. Method of identifying a compound that changes the amyloid-beta precursor protein processing in a cell
US20060216762A1 (en) * 2005-03-24 2006-09-28 Bayer Healthcare Llc Extracting reagent for hydrophobic analyte in whole blood

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
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GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
US20040101930A1 (en) * 2001-06-20 2004-05-27 Jackson Jennifer L. Secreted proteins
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences

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