KR20040052146A

KR20040052146A - 파필로마바이러스 항원 단백질 및ＣｐＧ-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는파필로마바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약제학적조성물

Info

Publication number: KR20040052146A
Application number: KR1020020079881A
Authority: KR
Inventors: 안웅식; 신정임
Original assignee: 안웅식; 신정임
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2004-06-19
Also published as: US20040115219A1; KR100525321B1

Abstract

본 발명은 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 파필로마바이러스 항원 단백질 및 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다

Description

파필로마바이러스 항원 단백질 및 ＣｐＧ-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 파필로마바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for prophylaxis and treatment of papillomavirus-derived diseases comprising papillomavirus antigen protein and CpG-oligodeoxynucleotide}

본 발명은 파필로마바이러스 항원 단백질 및 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)를 포함함을 특징으로 하는, 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

파필로마바이러스(PV)는 만연하고 있는 심각한 질환으로서, 피부 및 점막 표피의 양성, 이형성 및 악성 과증식을 유도하는 것으로 알려져 있다[참조: Mansur et al., Biochim Biophys Acta, 1155: 323-345, 1993; Pfister, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 99: 111-181, 1984; Broker et al., Cancer Cells, 4: 17-36, 1986].

사람 파필로마바이러스(HPV)는 사람의 편평상피의 과증식, 악성 병변(암종) 등과 관련된 DNA 종양 바이러스이다. 수많은 여성들의 생식계가 사람 파필로마바이러스에 의해 감염되어 있다. 파필로마바이러스 감염이 상당수의 여성들에게 있어 결국에는 경부암으로 진전되며, 여성들의 암 사망중 20%가 HPV와 관련된다.

HPV는 암으로 진행되는 병변에 대한 상대적 경향 및 관련된 임상적 병변에 기초하여 고위험 HPV(예: HPV 타입 16, HPV 타입 18) 및 저위험 HPV(예: HPV-6, HPV-11)로 분류될 수 있다. HPV 타입 16의 감염이 자궁경부암 발생의 주요원인이며[참조: zur Hausen, H., Virol., 184: 9-13, 1991], HPV 단백질중 E6 및 E7 단백질이 자궁경부암의 형성 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다[참조: Scheffner, M. et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 88: 5523-5527, 1991; Werness, B. A. et al., Science, 248: 76-79, 1990; Dyson, N. et al., Science, 243: 934-937, 1989]. HPV 타입 16의 E7 단백질의 아미노산 서열이 이의 핵산 서열로부터 유추되며, 문헌[참조: N. Salzman and P. Hawley, "The Papoviridae", Vol. 2, p. 379, Plenum Press, N.Y. (1987)]에 기술되어 있다.

자궁경부암 환자에서 E7 특이면역반응이 검출되며[참조: de Gruijl, T. D. et al., J. Gen. Virol., 77: 2183-2191, 1996], 이는 E7 단백질이 자궁경부암 면역치료의 목적물이 될 수 있음을 의미한다. 따라서, 여러 동물모델에서 E7 단백질을 이용한 예방 및 치료용 백신의 사용 가능성이 연구되고 있다. 그 예로는 E7 재조합 단백질[참조: Fernando, G. J. P. et al., Clin. Exp. Immunol., 115, 1999], E7 발현 유전자 백신[참조: Hung, C. F. et al., Cancer Res., 61: 3698-3703, 2001], E7 또는 E7의 세포독성 T 임파구(CTL) 에피토프를 발현하는 미생물 및 바이러스 벡터[참조: Lamikanra, A. et al., J. Virol., 75: 9654-9664, 2001; Cheng, W. F. et al., Hum. Gene Ther., 13: 553-568, 2002; Liu, D. W. et al., J. Virol., 74: 2888-2894, 2000; Londono, L. P. et al., Vaccine, 14: 545-552, 1996], 및 E7 CTL 에피토프[참조: Feltkamp, M. C. et al., Eur. J. Immunol., 23: 2242-2249, 1993] 등의 이용을 들 수 있다. 이들 연구에서, CD4+ T 임파구 및 특히 CTL 기능이 종양생성의 억제에 관여하는 면역세포군으로 밝혀졌다.

한편, 면역 시스템은 가능하게는 병원체와 숙주 DNA 사이의 구조적 및 서열 사용의 차이에 의해 세균을 포함한 하등 유기체의 DNA를 인식한다. 특히, 비척추동물로부터 유래된 짧은 스트레치의 DNA 또는 특정 염기 맥락에서 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 이뉴클레오타이드(CpG)를 포함하는 짧은 올리고데옥시뉴클레오타이드 형태의 짧은 스트레치의 DNA가 표적이 되었다.

최근들어, 세균성 DNA 자체가 포유동물의 면역 반응을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 세균성 DNA와 포유동물 DNA 사이의 주요한 차이는 세균성 DNA는 포유동물 DNA에는 포함되지 않는 메틸화되지 않은 CpG(시토신-포스포로티오에이트-구아닌) 이뉴클레오타이드를 다수 포함한다는 것이며, 이에 기초하여 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 포함하는 합성 CpG-ODN이 면역자극제로 사용되고 있다.

메틸화되지 않은 형태의 CpG 모티프를 갖는 ODN은 B 임파구, 대식구 및 NK 세포를 활성화시키며 Th1 타입의 면역반응을 유도하는 것으로 공지되어 있다[참조: Bohle, B. et al., Eur. J. Immunol., 29: 2344-2353, 1999; Klinman, D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 2879-2883, 1996; Krieg, A. M. et al., Nature, 374: 546-549, 1995; Ballas, Z. K. et al., J. Immunol., 157: 1840-1845, 1996; Sparwasser, T. et al., Eur. J. Immunol., 30: 3591-3597, 2000; Sparwasser, T. et al., Eur. J. Immunol., 28: 2045-2054, 1998; Chu, R. S. et al., J. Exp. Med., 186: 1623-1631, 1997; Leclerc, C. et al., Cell. Immunol., 179: 97-106, 1997; Klinman, D. M. et al., J. Immunol., 158: 3635-3639, 1997; Jakob, T. et al., J. Immunol., 161: 3042-3049, 1998]. CpG-ODN은 대식구에서IL-12의 생성을 유도하여 NK 세포에서 IFN-γ의 생성을 유도하여 Th1 타입의 면역반응을 선택적으로 유도한다고 공지되어 있다[참조: Chu, R. S. et al., J. Exp. Med., 186: 1623-1631, 1997; Roman, M. et al., Nature Med., 3: 849-854, 1997]. 또한, CpG-ODN은 항체들중 특히 IgG2a 타입의 항체(Th1 타입의 항체) 생성을 선택적으로 유도하고[참조: Chu, R. S. et al., J. Exp. Med., 186: 1623-1631, 1997; Davis, H. L. et al., J. Immunol., 160: 870-876, 1998], CTL 반응도 증가시킨다고 공지되어 있다[참조: Krieg, A. M. et al., Nature, 374: 546-549, 1995; Warren, T. L. et al., J. Immunol., 165: 6244-6251, 2000]. 이들 CpG-ODN은 현재 면역활성제로서 광범위하게 연구되고 있다[참조: Davis, H. L. et al., J. Immunol., 160: 870-876, 1998; Weiner, G. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10833-10837, 1997; Davis, H. L. et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7213-7218, 1996; Kline, J. N. et al., J. Immunol., 160: 2555-2559, 1998; Scott Gallichan, W. et al., J. Immunol., 166: 3451-3457, 2001]. 그러나, CpG-ODN의 자궁경부암을 포함한 파필로마바이러스 유발 질환에서의 항면역효과에 대해서는 기술된 바 없었다.

현재까지 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 치료하기 위한 다수의 이용가능한 방법들이 있으나, 어떠한 치료법도 지속적인 HPV 유발 질환을 제거하는데 일정하게 효과적인 방법은 제시된 바 없었다.

본원 발명은 파필로마바이러스 항원 단백질을 CpG-ODN과 함께 사용하는 경우 이들의 각각의 사용에 비해 E7 특이항체 반응 및 Th 세포증식반응을 증가시키며, 또한 이들을 동시 사용한 경우에만 종양의 예방과 치료에 관한 항종양 활성을 갖고 세포독성(cytotoxic) T 임파구 반응을 나타내며 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 IFN-γ가 생성되는 놀라운 효과를 밝혀내었다.

이에 기초하여, 본원 발명은 Th1 타입의 CD4+ T 임파구 및 CTL 반응을 선택적으로 증가시켜 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 효과적으로 처리할 수 있는 강력한 면역 유도 방법을 제공할 수 있다.

발명의 요지

본원 발명은 면역학적 유효량의 파필로마바이러스 E7 항원 단백질 및 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함함을 특징으로 하는, 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 본원 발명의 조성물은 파필로마바이러스 항원 단백질로서 사람 파필로마바이러스 타입 16의 E7 단백질을 포함한다.

특히 바람직하게는, 본원 발명의 조성물은 파필로마비이러스 항원 단백질로서 사람 파필로마바이러스 타입 16의 E7 재조합 단백질을 포함한다.

바람직하게는, 본원 발명의 조성물은 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드로서 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 이뉴클레오타이드를 포함하고, 하나 이상의 뉴클레오타이드가 연속한 CpG를 분리시키며, 약 8 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함한다.

특히 바람직하게는, 본원 발명의 조성물은 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드로서 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'을 포함한다.

바람직하게는, 본원 발명의 조성물은 자궁경부암을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

도 1은 E7 단독주사, CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN) 단독주사 및 E7과 CpG-ODN의 공동주사에 의한 항종양 예방효과를 나타낸다.

도 2는 E7 단독주사, CpG-ODN 단독주사 및 E7과 CpG-ODN의 공동주사에 의한 항종양 치료효과를 나타낸다.

도 3은 E7 단독주사, CpG-ODN 단독주사 및 E7과 CpG-ODN의 공동주사에 의한 E7 특이항체반응(IgG 및 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3)을 나타낸다.

도 4는 E7 단독주사, CpG-ODN 단독주사 및 E7과 CpG-ODN의 공동주사로 유도되는 E7 특이 Th 세포증식반응 및 CTL 반응을 나타낸다.

도 5는 E7 단독주사, CpG-ODN 단독주사 또는 E7과 CpG-ODN의 공동주사로 유도되는 면역세포에서의 IFN-γ 분비정도 및 E7과 CpG-ODN이 동시주사된 비장면역세포에서 CD4+ T 또는 CD8+ T 임파구를 각각 제거한 후의 IFN-γ 분비정도를 나타낸다.

도 6은 항종양 효과에 대한 면역세포군의 역할을 나타낸다.

본원 발명은 면역학적 유효량의 파필로마바이러스 E7 항원 단백질 및 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

상기에서, 용어 "면역학적 유효량"이란 활성 성분의 양이 투여 대상의 동물내에서 파필로마바이러스 유발 질환을 예방하거나 치료하는데 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 양을 의미한다.

용어 "파필로마바이러스 유발 질환"이란 파필로마바이러스에 의해 유발되어 주변 조직과 형태상 상이하게 보이는 악성 및 비악성 세포군의 세포-증식성 질환을 의미한다.

용어 "예방 또는 치료"에서 예방은 약물이 파필로마바이러스에 노출되기 전에 투여되는 것이며, 치료는 약물이 감염 후 또는 질환의 발병 후에 투여되는 것이다.

용어 "항원"이란 면역 반응을 일으킬 수 있는 분자를 의미한다. 본원 발명의 목적상 "파필로마바이러스 항원"은 천연으로부터 분리한 것이거나 재조합 방법에 의해 제조된 것을 사용할 수 있다.

바람직한 양태로서, 본원 발명은 파필로마바이러스 E7 항원 단백질로서 사람 파필로마바이러스 타입 16의 E7 단백질을 사용한다.

본원 발명의 약제학적 조성물중에 파필로마바이러스 항원 단백질로서 포함될 수 있는 천연으로부터 분리되거나 재조합 방법에 의해 제조된 파필로마바이러스 항원 단백질은 천연 단백질 서열을 갖는 단백질은 물론, 천연의 단백질 서열과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가지고 있으며, 천연의 파필로마바이러스 항원 단백질과 실질적으로 동일한 면역반응을 일으킬 수 있는 단백질을 의미한다. 천연으로부터 분리된 단백질은 파필로마바이러스의 대량 배양으로부터 당 분야에 공지된 통상의 방법을 이용하여 분리 정제될 수 있다.

본원 발명의 파필로마바이러스 항원 단백질로서 특히 바람직한 것은 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 사람 파필로마바이러스 타입 16의 E7 재조합 단백질이다.

본원 발명에서 사용되는 E7 재조합 단백질은 공지의 다양한 재조합 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다.

용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명의 목적상 재조합 발현 벡터는 파필로마바이러스 항원 단백질을 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어 플라스미드, 파지, 다른바이러스 등을 사용할 수 있다. 일반적으로, 적합한 숙주가 재조합 벡터로 형질전환되면, 이 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나 일부 경우에는 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본원 발명의 파필로마바이러스 항원 단백질을 발현시키기에 적합한 진핵 숙주에서 사용가능한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes Simplex Virus), 폭스바이러스(Poxvirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 등이 있으며; 세균 숙주에서 사용할 수 있는 발현 벡터에는, pBluescript, pMAL-c2x, pGEX2T, pUC벡터, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체 등과 같이 에스케리키아 콜라이 유래의 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10, λgt11 등과 같은 매우 다양한 파지 람다 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지 등이 포함된다. 효모 세포에서 유용한 발현 벡터에는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체 등이 포함되며, 곤충 세포에 유용한 벡터에는 pVL 941 등이 포함된다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필수적인 발현 조절 서열을 포함한다. 본원 발명에 따른 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 리보좀 결합 부위 등을 포함한다. 진핵세포의 발현에 적합한 조절 서열은 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 인핸서 등을 포함한다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이며, 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

또한, 하나의 핵산 서열이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 예를 들어 유전자 발현이 가능하도록 전사 활성화 단백질을 암호화하는 서열이 조절 서열(들)에 연결되거나; 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더를 암호화하는 서열이 목적 단백질 또는 펩타이드 암호화 핵산 서열 연결되거나; 전사에 영향을 끼치는 프로모터 또는 인핸서 서열이 목적 단백질 또는 펩타이드 암호화 서열에 연결되거나; 전사에 영향을 끼치는 리보좀 결합 부위가 목적 단백질 또는 펩타이드 암호화 서열에 연결되거나; 해독을 용이하게 하는 리보좀 결합 부위가 목적 단백질 또는 펩타이드 암호화 서열에 연결된다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 통상의 형질전환 방법, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 인산칼슘, 일렉트로포레이션 등의 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 숙주세포를 형질전환시키기 위한 기술 및 이들 내에서 클로닝된 외래 DNA 서열을 발현시키는 방법이 당해 분야에 익히 공지되어 있다[참조: Maniatis et al., Molecula Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and MolecularBiology, Methods in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif., 1991; Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 12073-12080, 1980]

발현되는 단백질은 목적 단백질이 다른 단백질과 융합된 융합 단백질로서 발현될 수 있으며, 예를 들어 E7 단백질과 글루타티온-S-트랜스페라제(GST) 융합 단백질이 에스케리키아 콜라이에서 발현될 수 있다[참조: Fernando G. J., Clin. Exp. Immunol, 115(3): 397-403, 1999 Mar]. 또한, 히트 쇽 단백질 유전자와 융합된 E7 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 아데노-연관 바이러스(AAV)로 숙주세포를 형질감염시켜 이로부터 융합 단백질을 제조할 수 있다[참조: Liu D. W. et al., J Virol., 74(6)2888-94, 2000, Mar].

또한, 파필로마바이러스 항원 단백질은 글리코실화되거나 리피드화(lipidated)될 수 있으며, 항원 제시(presentation)를 증진시키고 항원의 항원 제시 세포에의 표적을 향상시키는 분자를 포함하도록 유도체화될 수 있다.

파필로마바이러스 항원 단백질은, 분리 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 단백질을 분리 정제하는 통상의 기술이 사용될 수 있다. 또한, 파필로마바이러스 재조합 단백질의 분리 정제를 용이하게 하기 위하여, 예를 들어 GST, His-택(tag) 등과의 융합 단백질로 제조할 수 있다.

본원 발명에서 제조된 E7 재조합 단백질은 E7 단백질의 98개의 아미노산을 포함하는 단백질로서, 플라즈마 벡터 pET-E7을 에스케리키아 콜라이에서 발현시켜 E7 단백질과 pET 벡터의 His-택(tag) 펩타이드가 융합된 단백질로서 분비된 것이며, His-택(tag) 펩타이드 잔기는 단백질의 정제를 용이하게 한다. 이와 같이 분리 정제된 E7 재조합 단백질은 내독소(endotoxin)을 제거시킨 후 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본원 발명의 조성물에 사용되는 천연 또는 재조합 파필로마바이러스 항원 단백질은 면역반응을 증강시킬 수 있는 통상의 기술로 변형될 수 있다.

용어 "CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)"란 메틸화되지 않은 하나 이상의 CpG(시토신-포스포로티오에이트-구아닌) 이뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.

바람직하게는, CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 연속한 CpG를 분리시키며, 약 8 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함하는 ODN이다.

특히 바람직하게는, 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (서열 1)을 포함한다.

CpG-ODN은 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생성되거나 천연 공급원으로부터 유도될 수 있다. 물론, 상이한 CpG-ODN의 혼합물도 사용될 수 있다.

화학적으로 합성된 CpG-ODN은 당 분야에 공지된 다수의 방법을 이용하여 드 노보(de novo) 합성될 수 있다. 예를 들어 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 방법[참조: S. L. Beaucage et al., Tet. Let., 22: 1859, 1981], 뉴클레오사이드 H-포스포네이트 방법[참조: Garegg et al., Tet. Let., 27: 4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res., 14: 5399-5407; Garegg et al., Tet. Let. 29: 2619-2622, 1988]을 이용할 수 있다. 이들 화학적 합성 방법은 시판되는 다양한 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 수행할 수 있다. 달리는, 올리고뉴클레오타이드를 공지된 방법, 예를 들어 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴트레아제를 사용하여 존재하는 핵산 서열(예: 게놈 또는 cDNA)로부터 제조될 수 있다.

또한, CpG-ODN은 생체내에서의 분해에 내성을 갖게 하기 위해 적합한 변형을 가할 수 있다. 바람직하게는, 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 포스포로티오에이트 변형은 말단에서 일어날 수 있으며, 예를 들어 마지막 2개 또는 3개의 5' 또는 3' 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합될 수 있다. 또한, CpG-ODN은 분해에 내성을 갖도록 하는 2차 구조(예: 스템 루프 구조)를 포함하도록 변형될 수 있다. 바람직한 안정화된 핵산은 하나 이상의 부분적 포스포로티오에이트 변형된 골격을 갖는 것이다. 포스포로티오에이트는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 이용하여 자동화된 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트가 예를 들어 미국 특허 제4,469,863호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 알킬포스포트리에스테르(하전된 산소 잔기가 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 기술된 바와 같이 알킬화된다)가 시판 시약을 사용하여 자동화된 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다. 다른 DNA 골격 변형을 만드는 방법 및 치환 방법이 문헌[참조: Uhlmann, E. et al., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem., 1: 165, 1990]에 기술되어 있다. 분해에 덜 민감하게 하는 또다른 변형은 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 티오- 및 유사한 변형 형태 뿐만 아니라 이노신 및 퀘신과 같은 비전형 염기를 포함하는 것이다. 디올, 예를 들어 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜을 말단에 포함하는 CpG-ODN도 분해에 보다 내성인 것으로 밝혀졌다.

생체내 투여하는 경우에는, CpG-ODN은 표적 세포의 표면에의 고친화성 결합 또는 증가된 세포 섭취를 위한 분자와 결합되어 '핵산 전달 컴플렉스'를 형성할 수 있다. 핵산은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 이온결합적으로나 공유결합적으로 적합한 분자와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로서 예를 들어 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 등을 사용할 수 있다. 또한, CpG-ODN은 널리 공지된 기술을 이용하여 리포좀 또는 비로좀에 캡슐화될 수 있다.

본원 발명에서는 E7 단백질과 CpG-ODN을 공동 주사하여 동물 모델에서 항종양효과를 관측하였으며, 또한 E7 특이항체반응, Th 세포증식반응, CTL 반응, CD4+ T 임파구 및 CD8+ T 임파구에 의한 IFN-γ 생성을 관측하였다.

구체적으로, E7 단백질과 CpG-ODN을 동시에 주사하여 파필로마바이러스 타입 16의 E7 발현 종양세포주 주사에 대한 항종양 예방효과를 관측하였다(도 1 및 표 2). 그 결과, E7 단백질 또는 CpG-ODN을 각각 주사한 경우에는 도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이 상기와 같은 항종양 예방 효과가 전혀 관측되지 않았으며, E7 단백질과 CpG-ODN을 동시에 주사한 경우에만 항종양 예방 효과가 관측되었다. 이는 항종양 치료효과에서도 유사하여, E7 단백질과 CpG-ODN을 동시에 주사한 경우에만 항종양 치료효과가 관측되었다(도 2). 이는 파필로마바이러스에 의해 유발되는 종양의 예방과 치료 모두에 파필로마바이러스 항원 단백질 및 CpG-ODN이 필수적임을보여 주는 것이다.

이와 같이 본원 발명의 경우에는 파필로마바이러스 항원 단백질 및 CpG-ODN를 각각 사용한 경우에는 어떠한 항종양 효과도 관측할 수 없었고 단지 이둘 모두를 사용한 경우에만 항종양 효과가 관측된다는 점에서, CpG-ODN을 그 자체로서 또는 공지의 면역 효과를 증강시키기 위한 보조제로서 사용하는 종래의 기술로부터는 본원 발명에서와 같은 항종양 효과를 전혀 예측할 수 없다.

또한, E7 단백질과 CpG-ODN의 동시 주사에 의한 E7 특이항체반응을 관측한 결과, E7 단백질과 CpG-ODN을 동시에 주사한 경우 보다 높은 ELISA 역가를 나타내어 E7 단백질의 단독 주사에 비교해 더욱 증가된 항체반응을 보여 주었으며(도 3A), 또한 IgG 이소타입, 즉 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 항체의 생성이 더욱 증가하였다(도 3B, C, D 및 E).

E7 단백질과 CpG-ODN의 동시 주사에 의한 Th 세포증식반응을 관측한 경우에도 E7 단백질과 CpG-ODN을 각각 주사한 경우에 비해 Th 세포증식반응이 상당히 증가하였다(도 4A). 한편, CD4+ T 임파구를 제거했을 경우 Th 세포증식반응은 전혀 탐지되지 않았으며, 이는 항체반응과 CD4+ T 임파구에 연관된 Th 세포증식반응이 서로 직접적 상관 관계가 있음을 의미하는 것이다.

또한, E7 단백질과 CpG-ODN의 동시 주사에 의한 CTL 반응을 관측한 결과, E7 단백질과 CpG-ODN을 동시에 주사한 경우에만 CTL 반응이 관측되었으며, E7 또는 CpG-ODN을 각각 주사한 경우에는 CTL 반응이 관측되지 않았다(도 4B). 이러한 결과들로부터 E7 단백질에 의한 항원 특이적 CTL 반응 유도에 CpG-ODN이 필수적임을알 수 있다.

또한, E7 단백질과 CDN의 동시 주사에 의한 IFN-γ 생성을 관측하였다. IFN-γ 생성에 있어 CpG-ODN의 효과에 대해 보고된 바 있으며[참조: Chu, R. S. et al., J. Exp. Med., 186: 1623-1631, 1997], 본원 발명에서는 항원으로 자극한 경우 E7 단백질과 CpG-ODN이 동시에 주사된 동물군에서만 CD4+ T 임파구에서 IFN-γ의 생성이 유도되었다(도 5B). 이는 항원 자극시 CD8+ T 임파구가 아닌 CD4+ T 임파구가 IFN-γ를 생산함을 의미한다. 유사하게, TC-1 세포주로 자극했을 경우에는 E7 단백질과 CpG-ODN이 동시에 주사된 동물군에서만 CD8+ T 임파구에서 IFN-γ가 생성되는 반면, E7 또는 CpG-ODN이 각각 주사된 동물에서는 IFN-γ 생성을 관측할 수 없었다(도 5D). 이는 TC-1 세포주의 자극시, CD4+ T 임파구가 아닌 CD8+ T 임파구가 IFN-γ를 분비함을 의미한다.

이러한 결과는 E7 단백질과 CpG-ODN을 동시 주사하여 유도된 CTL 반응 유도 결과와도 서로 일치한다. 이는 결국 E7 단백질과 CpG-ODN의 동시 이용이 MHC I 및 II 에 상응하여 CD4+ 및 CD8+ T 임파구에서 IFN-γ의 생성을 유도하는데 필요하다는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 바이러스감염 또는 항종양효과에 대한 IFN-γ의 보호면역성이 밝혀진 바 있다[참조: Samuel, C. E., Virol., 183: 1-11, 1991; Smith, P. M. et al., Virol., 202: 76-88, 1994; Boehm, U. et al., Annu. Rev. Immunol., 15: 749-795, 1997; Yang, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4928-4932, 1992].

또한, TC-1 세포주에 대한 항종양 면역효과에 관여하는 CD4+ 및 CD8+ T 임파구의 역할을 규명하였다(도 6). E7 단백질과 CpG-ODN이 동시 주사된 동물에서 CD4+ 및 CD8+ T 임파구군을 모두 제거했을 경우 비처리 대조군에서와 유사한 종양 형성을 나타내었다. 한편, CD8+ T 임파구만 제거한 경우 대조군에 비교해 약간 늦지만 모든 동물에서 종양이 생성되었다. 이는 CD8+ T 임파구가 가장 중요한 면역세포군임을 입증하는 것이다. CD4+ T 임파구군이 제거된 경우 5마리중 1마리에서 종양에 형성되었으며, 이는 CD4+ T 임파구군도 보호면역성의 형성에 관여하는 면역세포군임을 의미한다. 이는 CD4+ 및 특히 CD8+ T 임파구군이 항종양 효과를 갖는다는 것을 의미한다. TC-1에 대한 항종양면역효과에 대해 항체는 크게 기여하지 못하였다.

이러한 결과는 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 T 임파구군 모두가 TC-1 종양세포주에 대해 항종양기능을 가진다는 다른 연구결과와 일치한다[참조: Hung, C. F. et al., Cancer Res., 61: 3698-3703, 2001; Lamikanra, A. et al., J. Virol., 75: 9654-9664, 2001; Cheng, W. F. et al., Hum. Gene Ther., 13: 553-568, 2002; Liu, D. W. et al., J. Virol., 74: 2888-2894, 2000; Lin, K. Y. et al., Cancer Res., 56: 21-26, 1996].

종양 챌린지에 대한 면역반응 및 보호

	항체반응	Th증식반응	CD4+T(Th1)	CTL(CD8)	예방효과	치료효과
대조군	-	-	-	-	-	-
E7	++	++	-	-	-
CpG-ODN	-	-	-	-	-	-
E7+CpG-ODN	+++	+++	+++	+++	+++	+++

+가 많을수록 보다 강한 반응이며, -는 반응이 없음을 나타낸다.

상기한 결과들을 통해서 명백해진 바와 같이, CpG-ODN이 E7 항원특이 반응, Th 증식 반응, IFN-γ를 분비하는 CD4+ T 임파구(Th1) 및 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 임파구(CTL) 활성을 증가시키는 보조제 역할을 하며, 이로써 E7 단백질과 CpG-ODN의 동시 이용에 의해서만 항원 특이 Th1 타입 CD4+ 및 특히 CD8+ T 세포면역반응을 통해 우수한 파필로마바이러스 유발 질환 억제 면역효과, 특히 자궁경부암 억제 면역효과를 유도하는데 유용하다는 것이 입증된다.

본원 발명의 약제학적 조성물은 파필로마바이러스에 감염되거나 감염된 것으로 의심되는 대상에게 예방적으로나 치료학적으로 투여될 수 있다. 이러한 투여 대상은 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 앓거나 발병할 수 있는 대상을 포함한다. 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환은 예를 들어 보웬양 구진증, 항문 이형성, 호흡 또는 결막 유두종, 자궁경부 이형성, 자궁경부암, 음부암, 전립선암 등을 포함한다.

특히, 본원 발명의 약제학적 조성물은 파필로마바이러스에 의해 유발되는 자궁경부암의 예방 및 치료에 유용하다.

본원 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 당 분야에 공지된 다른 처리, 예를 들어 화학요법 치료, 방사선 치료, 수술 등과 함께 투여될 수 있다. 또한, 당 분야에 공지된 다른 보조제 또는 사이토킨과 공동 투여될 수 있다. 공동 투여될 수 있는 면역 반응을 자극할 수 있는 사이토킨은 예를 들어 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, TNF-α, INF-γ, Flt3 리간드 등을 포함한다.

본원 발명의 약제학적 조성물은 당 분야에서 널리 공지된 방법[참조: Donnelly et al., J. Imm. Methods, 176: 145, 1994; Vitiello et al., J. Clin. Invest, 95:341, 1995]에 의해 투여될 수 있다. 투여 형태는 정제, 트로키제, 분산제, 현탁제, 액제, 캡슐제, 크림제, 연고제, 좌제, 에어로졸제 등을 포함한다. 상기 투여 형태는 또한 이식되는(implanted) 서방출 고안물 등을 포함한다. 또한, 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 경구 또는 비경구, 예를 들어 근육내, 정맥내, 동맥내, 피내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다.

본원 발명의 약제학적 조성물은 국소 투여되거나 전신계 투여될 수 있으며, 국소 투여의 경우에는 전신적 흡수를 최소화하면서 투여 부위에 약물을 집중시킬 수 있어 유리하다. 이러한 국소 투여시 다른 경로에 의한 투여의 경우에 비해 보다 적은 양을 투여할 수 있다. 국소 제형은 경피 고안물, 에어로졸, 크림제, 연고제, 로션제, 산제 등을 포함한다.

본원 발명의 약제학적 조성물은 부형제를 포함한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 제제화를 용이하게 하는 임의 보조제를 사용하여 제형될 수 있다. 제형은 투여 경로에 따라 상이하다. 주사하기 위한 경우, 활성 성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리적 식염수중에 제형화될 수 있다. 점막전달을 위한 경우, 투과될 장애물에 적합한 투과제를 제형에 사용할 수 있다. 이러한 투과제는 당 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 경구 투여의 경우에는 활성 성분을 정제, 환제, 당의정제, 캡슐, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등에 포함하기에 적합한 담체와 배합할 수 있다. 흡입 투여를 위해서는, 활성 성분을 적합한 추진제를 사용하여 가압된 팩으로부터 에어로졸 분무 형태로 전달되거나 카트리지로 제형화될 수 있는 분말의 형태로 전달될 수 있다. 또한, 주사에 의해 투여되는 경우, 현탁제, 액제, 유화제 등으로 형성될 수 있다.

투여 용량은 한번에 약 0.5 μg/kg/일 내지 약 1 μg/kg/일, 바람직하게는 약 0.1 μg/kg/일 내지 약 3 μg/kg/일로 최소한 1 주일 간격으로 투여될 수 있으며, 체중, 연령, 성별, 투여 경로, 제형 및 시간, 일반적 건강 상태 등 여러 요인에 의해 달라질 수 있다.

이하, 본원 발명을 구체적인 실시예를 들어 설명하려고 한다. 기술된 실시예는 단지 설명을 위한 것으로서 이로써 본원 발명이 제한되지 않는다.

실시예

약어 설명

ODN: 올리고데옥시뉴클레오타이드; HPV: 사람 파필로마바이러스; PBS: 포스페이트-완충된 식염수; HRP: 양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제; HSV: 헤르페스 심플렉스 바이러스; OD: 흡광도; IPTG: 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드; RT-PCR: 역전사효소연쇄반응; i.p.: 복강내; s.c.: 피하; SI: 자극 지수.

통계분석은 짝지은 스튜던츠 T 시험(The Paired Student's T Test)를 이용하였고, p 수치가 < 0.05일 때 통계적 유의성을 두었다.

실시예 1: 제조합 E7 단백질의 제조

파필로마바이어스 타입 16의 E7 재조합 단백질을 공지된 방법[참조: Novagen 회사의 프로토콜 및 Sin, J. I. et al., Vaccine 15: 1827-1833, 1997]을 이용하여 제조 분리하였다.

자궁경부암세포주(Caski 세포주)에서 2개의 프라이머, 즉 5'-TTGGGATCCACCATGCATGGAGATACACCTAC-3' (BamHI 절단부위 포함) 및 5'-CGGAATTCATTCTTATGGTTTCTG-3' (EcoRI 절단부위 포함)를 이용하여 역전사효소연쇄반응으로 파필로마바이러스 타입 16의 E7 유전자를 얻었다. 얻어진 E7 유전자를 제한효소(BamHI 및 EcoRI)을 이용하여 절단후 DNA 겔에서 E7 유전자를 분리하였다. 그후 분리된 E7 유전자를 BamHI 와 EcoRI으로 효소처리된 pET 벡터(Novagen, Madison, WI)에 클로닝시켰다. 클로닝된 DNA를 사용하여 에스케이키아 콜라이(Escherichia coli) DH5를 형질전환시키고, 카나마이신하에서 성장하는 이. 콜라이를 선별하여 pET-E7 DNA를 분리한 후 이를 사용하여 이. 콜라이 BL21(DE3)를 형질전환시켰다. 수득된 이. 콜라이(pET-E7)를 카나마이신(30 μg/ml)이 함유된 LB 용액에서 배양하여 600 nm 파장에서 OD 값이 약 0.6 내지 0.8에 도달했을 때 1 mM의 IPTG를 첨가한 후, 3시간 동안 배양하였다. 이. 콜라이를 4 krpm에서 20분 동안 원심분리한 후 -20℃에서 냉동-해동 과정을 1회 수행하였다. 세포 침전물을 5 ml의 8 M 우레아 완충액(pH 8.0)에 녹인 후, 상온에서 60분 동안 저어주면서 세포를 파괴하였다. 그후 1.5 krpm에서 30분 동안 원심분리하고, 상등액을 얻은 후, 8 M 우레아 완충액(pH 8.0)으로 세척한 Ni-NTA 수지 컬럼(Qiagen, Valencia, CA)에 통과시켰다. 이어서, 수지 컬럼에 5배 용적의 완충액 B(8 M 우레아 완충액, pH 8.0)을 통과시킨 다음, 5 내지 10배 용적의 완충액 C(8 M 우레아 완충액, pH 6.3)을 통과시켰다. 마지막으로 His-택(tagged) E7 단백질을 10 ml 의 완충액 C(200 mM의 이미다졸이 첨가된 완충액 B)를 사용하여 용출시켰다. 2시간 간격으로 단백질 용액을 6 M 우레아 완충액에서 투석한 후, 4 M 우레아 완충액에서 다시 투석하였다. 마지막으로 생리식염수에서 투석하였다. 그후 Detoxi-Gel 내독소 제거 컬럼(Pierce, Rockford, IL)에 통과시켜 내독소를 제거하였다. 단백질 농도는 공지의 Bradford 방법으로 정량하였다[참조: Bradford, M. M., Anal. Biochem., 72: 248-254, 1976]. 최종적으로 E7 단백질을 -70^oC에서 보관하였다.

상기 제조된 단백질 샘플을 12% SDS-PAGE에서 분리시킨 후, 니트로셀룰로즈 막(Amersham, Piscataway, NJ)에 부착시켰다. 이어서, 니트로셀룰로즈 막을 2% BSA가 함유된 TBST 용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20]에 1시간 담근 후 E7 특이항체(Oncogene, Boston, MA)와 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 반응 후 TBST 용액으로 수회 세척하고, 최종적으로 항-마우스 IgG-HRP(Sigma)와 1시간 동안 반응시킨 후 ECL 용액(Amersham)에서 발색시켰다.

98개의 아미노산을 포함하는 재조합 E7 단백질이 이. 콜라이에서 발현되었다. 재조합 단백질 크기는 SDS-PAGE에서 23 kD 단백질로 확인되었으며 면역블롯 검정(immunoblot assay)에서 E7 특이항체와 반응하였다. 단백질 크기는 실제 예측보다 크게 나타났다(11 kD의 E7 단백질 및 pET 벡터의 His-택 4 kD 단백질). 겔에서의 비정상적인 E7 단백질의 이동 특성은 이전에도 발표된 바 있다[참조: Armstrong, D. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 192: 1380-1387, 1993; Fernando, G. J. P. et al., Clin. Exp. Immunol., 115: 397-403, 1999].

E7 단백질내의 내독소 수준은 내독소 검출 키트(Sigma, Saint Louis, MO)를 이용하여 정량하였다. 단백질내 내독소 수준은 100 EU/mg 이하로 측정되었다.

실시예 2: CpG-ODN의 제조

본 실시예에서는 CpG-ODN 1826 (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3')을 이용하였으며, 각 염기당 포스포로티오에이트로 변화시킨 ODN을 Biobasic Inc.(Canada)에 제조를 의뢰하여 구입하였다. CpG-ODN을 내독소가 제거된 물에 용해시켜 사용하였다.

실시예 3: 항종양 활성

생후 4 내지 6주된 C57BL/6 마우스(대한 바이오링크사)를 동물 모델로서 사용하였으며, 20 μg의 재조합 E7 단백질, 20 μg의 CpG-ODN 또는 이둘 모두를 최종 생리식염수 100 μl에 희석하여 28-게이지 주사침(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)으로 피하 주사하였다.

종양 유도에 사용된 세포주는 TC-1 세포이며, 존홉킨스대학의 Wu 박사에게서 제공받았고, cRPMI (400 ㎍/ml의 G418)에서 배양되었다. TC-1은 E7 발현 세포주로서 C57BL/6 마우스의 폐상피세포(primary lung epithelial cells)에 파필로마바이러스 타입 16의 E6 및 E7, 및 ras 유전자를 이용하여 만든 세포주이다[참조: Wu, T. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11671-11675, 1995]. 각각의 예방 및 치료 효과를 검정하기 위하여 2 x 10⁵및 5 x 10⁴개의 TC-1 세포주를 C57BL/6 마우스의 피하에 주사하였다. 다양한 주사 용량이 이미 발표된 바 있다[참조: Lin, K. Y. et al., Cancer Res., 56: 21-26, 1996]. TC-1 세포주는 생리식염수로 2번 세척한 후 주사에 사용하였다.

실시예 3.1: 종양 예방 활성

상기 마우스 동물 모델에서 E7, CpG-ODN 또는 이둘 모두를 사용한 예방주사에 의해 유도되는 항종양 효과에 관측하였다. 각 그룹의 동물(n=11 내지 16)을 20 μg의 E7, 20 μg의 CpG-ODN 또는 이둘 모두로 0주 및 2주에 피하 주사하였다. 마지막 주사 후 3주째에 각 동물당 2 x 10⁵개의 TC-1 종양세포주를 피하 주사하였다.

도 1 및 표 2은 E7(동물당 20 μg), CpG-ODN(동물당 20 μg) 또는 이둘 모두로 2번 예방 주사한 후 2 x 10⁵개의 TC-1 종양세포주로 주사한 후의 항종양 활성을 나타낸다.

항종양 활성

면역화 그룹	종양 챌린지 후 일수(day)
면역화 그룹	15	25	45
비처리 그룹	16/16(100)＊	16/16(100)＊	-
CpG-ODN 처리 그룹	11/11(100)＊	11/11(100)＊	-
E7 처리 그룹	16/16(100)＊	16/16(100)＊	-
E7과 CpG-ODN 동시 처리 그룹	0/11(0)＊	0/11(0)＊	0/11(0)＊

＊ 종양이 형성된 동물수/종양 세포주로 처리된 동물수(%)

상기 표 2로부터 확인되는 바와 같이, E7 또는 CpG-ODN을 각각 단독으로 주사한 경우에는 비처리 대조 그룹에서와 같이 TC-1 종양세포주로 챌린지된 후 종양이 나타났으나, E7과 CpG-ODN을 동시에 주사한 그룹에서는 시간이 경과하더라도 종양이 전혀 나타나지 않았다. 즉, E7 또는 CpG-ODN을 각각 단독으로 처리한 경우에는 어떠한 종양 예방 효과가 나타나지 않았으나, E7과 CpG-ODN을 동시에 처리한 경우에는 마우스 동물 모델 전부에서 완전한 종양 예방 효과를 나타내었다.

또한, 종양 챌린지 후 종양 크기를 관측한 도 1의 결과는 E7 또는 CpG-ODN를 각각 단독으로 주사하는 경우에는 시간이 지남에 따라 종양이 점점 커지나 E7과 CpG-ODN을 동시에 주사한 경우에는 전혀 종양이 자라지 않는다는 것을 보여준다. 이때 종양이 형성된 동물은 30 내지 40일이 경과한 후 모두 죽었으며, E7과 CpG-ODN을 동시 주사한 동물은 4달 이상 모두 생존하였다. 죽은 동물을 부검한 결과, 죽은 동물들은 악액질 쇽(cachectic shock) 때문이었으며 다른 기관에 전혀 전이되지 않았다.

상기한 표 2 및 도 1에서 입증되는 바와 같이, E7과 CpG-ODN를 동시에 예방 주사한 경우에만 E7 발현 종양세포주의 성장을 억제할 수 있는 예방 효과가 있다.

실시예 3.2: 종양 치료 활성

상기 마우스 동물 모델에서 이미 형성된 종양에 대한 E7, CpG-ODN 또는 이둘 모두의 주사에 의해 유도되는 항종양 효과에 관측하였다. 각각의 그룹의 동물에 5 x 10⁴개의 TC-1 종양세포주를 피하주사하고, 종양 크기가 1 내 지 2 mm가 되었을 때 종양주사 부위와 떨어진 곳에 20 μg의 E7, 20 μg의 CpG-ODN 또는 20 μg의 E7과 20 μg의 CpG-ODN을 피하주사하고 다시 1주 후에 피하주사하였다. 주사후 1달 동안 1주일에 2회씩 측정기를 이용하여 종양크기를 측정하였다. 종양크기는 종양의 평균치[(a+b)/2, a: 종양의 장축길이, b: 종양의 단축길이]로 계산되었다.

종양 챌린지 후 종양을 갖는 마우스의 감소율을 관측한 결과를 나타내는 도 2는 E7와 CpG-ODN가 동시에 주사된 동물군에서는 20%의 동물에서만 종양이 탐지되었고 나머지 동물에서는 종양이 사라진 반면, E7 단독 주사된 동물군 및 CpG-ODN 단독 주사된 동물군에서는 비처리 대조군에서와 같이 모든 동물에서 종양이 억제되지 않았음을 나타낸다. 한편, E7과 CpG-ODN이 동시 주사된 동물중 1마리에서 관측된 종양의 크기는 다른 처리군과 비교하여 상대적으로 작았다. 또한, E7 또는CpG-ODN이 각각 단독 주사된 동물군에서는 종양주사 후 40일이 경과한 후 모두 죽었으나, E7과 CpG-ODN이 동시 주사된 처리군에서는 2달 이상 오래 생존하였다.

이는 E7과 CpG-ODN을 동시 주사하는 경우에만 이미 형성된 E7 발현종양세포주의 성장을 억제할 수 있어 항종양 치료 효과가 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3.2: 선택적 면역세포 제거 활성

CD4+ T 임파구 및 CD8+ 임파구의 수를 FACS 분석으로 측정하였다. E7과 CpG-ODN이 동시 주사된 상기한 바와 같은 마우스 동물 모델에서 채취한 비장세포(1 x 10⁵개)를 FACS 완충액(PBS + 1% BSA+ 0.1% 나트륨 아자이드)를 이용하여 3번 세척하고 피코-에리트린에 결합된 항-마우스 CD4 및 CD8 항체(Pharmingen, San Diego, CA)와 30분 동안 4^oC에서 반응시켰다. 그후 FACS 완충액으로 3번 세척하고 유동 세포계수기(flow cytometer: Coulter-Epics XL, Miami, FL)를 이용하여 CD4+ T 임파구 및 CD8+ T 임파구의 수를 측정하였다.

CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 시험관내에서 및 생체내에서 제거시키기 위해 공지된 방법을 이용하였다[참조: Sin, J. I. et al., Human Gene Therapy, 12: 1091-1102, 2001; Sin, J. I. et al., J. Immunol., 162: 2912-2921, 1999].

구체적으로, 시험관내 임파구 제거는 다음과 같이 처리하였다. E7과 CpG-ODN이 공동 주사된 동물로부터의 비장 세포를 항-CD4 항체(Pharmingen) 또는 항-CD8 항체(Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY)와 4^oC에서 1시간동안 반응시켰다. 그후 래비트의 보체(Sigma)와 함께 37^oC에서 1시간 동안 배양시켰다. 세포의 생존율을 트립판 블루 염료 제거 방법을 이용하여 측정하였으며, 2회의 분리 제거 과정후 98% 이상의 T 임파구가 제거되었음을 FACS 통해 확인하였다.

생체내 임파구 제거는 다음과 같이 처리하였다. 미리 프리스탄으로 처리된 누드 마우스에 각각의 하이브리도마 세포주 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)를 주사하여 항-CD4 항체(클론 GK1.5) 및 항-CD8 항체(클론 2.43) 복수액을 채취하였다. 얻어진 100 μl의 복수액(항-CD4 항체 및 항-CD8 항체)를 종양주사하기 전후 3, 0 및 3일에 복강내 주사하였다. FACS를 통해 98% 이상의 CD4+ T 임파구 및 CD8+ T 임파구가 제거됨을 확인하였으며, 0일에 종양을 주사하였다.

항종양 활성에 관여하는 세포군을 동물 모델로 확인한 결과가 도 6에 나타나 있다. 도 6은 E7과 CpG-ODN을 동시 주사한 후 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 각각 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 모두를 제거한 후 이들 세포군의 항종양 효과에 대한 중요성을 확인할 수 있는 결과이다. 구체적으로, 각 그룹의 동물(n=5)을 20 μg의 E7과 20 μg의 CpG-ODN으로 0주 및 2주에 피하 주사하고, 마지막 주사 후 3주째에 동물에서 CD4+ T, CD8+ T 또는 두개의 세포군을 모두 제거한 후 2 x 10⁵개의 TC-1 종양세포주로 피하 주사한 후 종양을 갖지 않는 마우스의 수를 측정하였다.

이에 따르면 상기 표 1 및 도 1에서 입증된 바와 같이 E7과 CpG-ODN을 동시 주사하고 CD4+ T 세포 및 CD8+ 세포를 제거하지 않은 경우 완전한 종양억제 효과가관측되었으며, CD4+ 및 CD8+ T 임파구 모두를 제거했을 경우에는 비처리 대조군과 유사하게 종양이 형성되었다. 특히, CD8+ T 임파구가 제거된 동물에서는 비처리 대조군에 비교해서는 약간 늦지만 결국 모든 동물에서 종양이 형성되었다. 한편, CD4+ T 임파구가 제거된 동물에서는 5마리중 4마리에서 종양이 관측되지 않았다. 또한, 1마리에서 형성된 종양의 크기도 상대적으로 작았다.

이들 면역세포군 제거실험은 CpG-ODN의 존재하에서 E7이 CD4+ T 임파구 및 특히 CD8+ T 임파구를 활성화시켜 항종양효과를 나타냄을 의미한다. 따라서, 동물 모델에서의 항종양 효과가 CD4+ T 임파구 및 특히 CD8+ T 임파구군에 의해 매개된다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 4: 면역반응유도

실시예 4.1: 항체반응유도

공지된 방법을 이용하여 ELISA를 수행하였다[참조: Sin, J. I. et al., Vaccine, 15: 1827-1833, 1997; Sin, J. I. et al., J. Virol., 74: 11173-11180, 2000].

플레이트를 코팅하기 위하여 재조합 E7 단백질을 생리식염수에 1 μg/ml의 농도로 희석시켜 50 μl씩 각 웰에 첨가한 후 다음날 이용하였다. ELISA 완충액(2% BSA)으로 차단한 후 항-뮤린 IgG-HRP를 1:1000의 농도로 희석하여 50 μl씩 각 웰에 가하여 반응시켰다. 또한, E7 특이 IgG 아부류를 검출하기 위하여HRP가 결합된 항-뮤린 IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3(Zymed, San Francisco, CA)을 항-뮤린 IgG-HRP를 대신하여 사용하였다.

각 그룹의 동물에 20 μg의 E7, 20 μg의 CpG-ODN 또는 20 μg의 E7과 20 μg의 CpG-ODN을 0주 및 2주에 피하 주사하였다. 첫 주사후 2, 4 및 8주에 각 동물 그룹(n=10)에서 혈청을 채취하여 동일 용량으로 혼합한 각 그룹별 혈청을 2배율씩 희석하여 ELISA 역가를 측정하였다. 또한, 4주 및 8주 혈청은 1:100으로 희석하여 ELISA를 수행하였다. ELISA 역가는 대조 그룹의 OD 수치의 2배가 되는 가장 높은 혈청 희석 배율의 역수치로 하였다. OD 수치는 405 nm에서 측정하였다. E7 주사에 비교해 p < 0.05에서 통계적으로 유의하다.

E7 단독, CpG-ODN 단독 또는 E7과 CpG-ODN 공동 주사에 의한 E7 특이항체생성정도를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3A는 E7 단독 주사된 동물의 4주후의 혈청 ELISA 역가는 1,600이었지만 E7과 CpG-ODN이 동시 주사된 동물의 4주후의 혈정 ELISA 역가는 6,400이었음을 보여준다. 이는 E7과 CpG-ODN의 동시 사용에 의해 항체생성이 항체역가에 있어 2배 이상 증가된 것이다. 또한, 주사후 8주의 ELISA 역가는 E7의 경우 800이었고 E7과 CpG-ODN을 동시 사용한 경우 3,200으로 유사한 증가를 보여 주었다. 그러나, CpG-ODN 단독 주사된 동물에서는 비처리 대조군에서와 같이 항체 반응이 관측되지 않았다.

또한, 도 3B, 3C, 3D 및 3E는 E7 특이 항체의 IgG 이소타입에 대한 생성을 나타낸다. 첫째 번 주사후 4주 및 8주 혈청 모두에서, E7과 CpG-ODN 동시 주사의 경우 E7 단독 주사에 비교해 IgG 이소타입의 생성이 더욱 많이 유도되었다.

실제로, IgG1 및 IgE는 Th2에 연관된 항체이고, IgG2a는 Th1에 연관된 항체이다[참조: Finkelman, F. D. et al., Ann. Rev. Immunol., 8: 303-333, 1990]. 특히, E7 단독 주사에 비교해 E7과 CpG-ODN을 동시 주사하는 경우 IgG2a 생성이 더욱 증가하였고, IgG2a/IgG1 수치는 0.2(E7) 및 0.26(E7+CpG-ODN)으로 계산되었다.

이러한 결과로부터 확인되는 바와 같이, CpG-ODN은 전반적인 항체면역반응을 증가시킴으로써 E7과 CpG-ODN의 동시 주사에 의해 E7 단독 주사에 비해 IgG 및 IgG 아부류의 생성이 증가된다.

실시예 4.2: T 헬퍼(Th) 세포증식반응 유도

Th 세포증식반응은 세포면역반응에 중요한 역할을 한다. E7 단독, CpG-ODN 단독 또는 E7과 CpG-ODN이 공동 주사된 각 동물군에서 비장면역세포를 채취하여 Th 세포증식반응을 측정하였다.

Th 세포증식반응을 공지된 방법으로 수행하였다[참조: Sin, J. I. et al., Human Gene Therapy, 12: 1091-1102, 2001; Sin, J. I. et al., J. Immunol., 162: 2912-2921, 1999].

각 그룹의 동물을 20 μg의 E7, 20 μg의 CpG-ODN 또는 20 μg의 E7과 20 μg의 CpG-ODN으로 0주 및 2주에 피하 주사하고, 마지막 주사후 3주째 동물군에서 비장면역세포를 채취하였다. 채취한 비장세포를 다양한 농도(0.5, 1 및 5 μg/ml)의 E7로 3일간 자극한 후³[H]로 표지된 티미딘(각 웰당 1 μCi)을 첨가한 후 다음날 세포를 회수하여 β-계수기(PerkinElmer, Boston, MA)를 이용하여 각 면역군의cpm을 측정하였다. SI는 [실험군 cpm-대조군 cpm]/[대조군 cpm]으로 계산하였다.

도 4A는 E7과 CpG-ODN의 동시 주사가 E7 단독 주사에 비해 Th 세포증식반응을 증가시킨다는 것을 보여준다. 결과는 같은 결과를 나타내는 중복 실험중 하나이다. *는 대조구에 비교해 p < 0.05 에서 통계적으로 유의하고, * *는 E7 주사그룹에 비교해 p < 0.05 에서 통계적으로 유의하다. E7 단독 주사시 E7 특이 Th 세포증식반응이 나타났으나 E7과 CpG-ODN을 동시 주사한 경우에는 더욱 증가된 Th 세포증식반응을 보여주었다. 반면, CpG-ODN 단독 주사시에는 비처리 대조군에서와 같이 Th 세포증식반응이 관측되지 않았다.

실시예 4.3: 세포독성 T 임파구(CTL) 반응 유도

5 시간⁵¹Cr 탐지방법을 이용하여 CTL 검정을 수행하였다.

각 그룹의 동물을 20 μg의 E7, 20 μg의 CpG-ODN 또는 20 μg의 E7과 20 μg의 CpG-ODN으로 0주 및 2주에 피하 주사하고, 마지막 주사후 3주째 동물군에서 비장면역세포를 채취하였다. 채취한 비장세포를 20 U/ml의 IL-2(R&D Systems, Minneapolis, MN) 와 미리 미토마이신 C (30 μg/ml)로 3시간 동안 처리된 TC-1 세포주와 함께 5일간 배양하여 활성화시켰다. 그후 100 μCi/ml Na₂ ⁵¹CrO₄와 함께 2시간 동안 배양된 TC-1세포를 상기 활성화된 면역세포와 상이한 비율로 5시간 동안 배양하여 세포용해(cytolytic) 활성을 TC-1 세포주에 대한⁵¹Cr 분비정도로 측정한것이다. 그후 100 μl의 세포배양액을 채취하여 γ-계수기(PerkinElmer)를 이용하여 cpm을 측정하였다. CTL 활성(%)은 100 x [(실험군 cpm-자연적분비 cpm)/(최대분비 cpm - 자연적분비 cpm)]이다. 최대분비 cpm은 1% Triton X-100를 첨가한 표적 TC-1 세포의 cpm으로 하였다.

도 4B는 E7 단독 주사 및 CpG-ODN 단독 주사한 경우에는 CTL 반응이 관측되지 않는 반면, E7과 CpG-ODN을 동시 주사한 경우에는 CTL 반응이 관측된다는 것을 나타낸다. 결과는 같은 결과를 나타내는 중복 실험중 하나이다.

상기 도 4B로부터 입증되는 바와 같이, E7과 CpG-ODN을 동시 주사한 경우에만 CTL 반응이 유도되었다.

이는 E7이 CpG-ODN 존재하에서 E7 특이 CTL 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.

실시예 4.4: IFN-γ 생성

IFN-γ은 Th1 타입 면역반응 및 CTL 반응의 유도에 중요한 역할을 한다. CD4+ T 임파구 및 CD8+ T 임파구에서의 IFN-γ 생성정도를 측정하였다.

각 그룹의 동물을 20 μg의 E7, 20 μg의 CpG-ODN 또는 20 μg의 E7과 20 μg의 CpG-ODN으로 0주 및 2주에 피하 주사하고, 마지막 주사후 3주째 동물군에서 비장면역세포를 채취하였다. 채취한 비장세포를 6 x 10⁶개/ml로 24 웰 플라스크에 가하고, 재조합 E7 단백질 1 μg/ml 첨가하거나 미리 미토마이신 C(30 μg/ml)로 3시간 동안 처리된 TC-1 세포주(5 x 10⁵개 세포/ml)를 첨가한 후, 37^oC의 5% CO₂배양조건에서 3일 동안 배양하였다. 세포배양액을 취하여 IFN-γ 검출 키트(Biosource, Intl., Camarillo, CA)를 이용하여 분비된 IFN-γ의 양을 측정하였다.

구체적으로, CD4+ T 임파구에서의 IFN-γ 생성정도를 측정하기 위하여 동물에서 채취한 비장 면역세포를 E7 단백질로 자극하였다.

도 5A는 E7 단독 주사, CpG-ODN 단독 주사 또는 E7과 CpG-ODN의 공동 주사로 면역 유도된 비장면역세포를 1 μg의 E7 단백질/ml에 첨가한 후 3일 동안 배양한 경우의 IFN-γ 분비를 나타낸다. IFN-γ 생성이 E7과 CpG-ODN으로 동시 주사된 동물 그룹에서만 관측되며 E7 단독 또는 CpG-ODN 단독 주사된 그룹에서는 관측되지 않았다.

도 5B는 E7과 CpG-ODN이 동시주사된 비장면역세포에서 CD4+ T 또는 CD8+ T 임파구를 각각 제거한 후 1 μg의 E7 단백질/ml에 첨가한 후 3일간 배양한 경우의 IFN-γ 분비를 나타낸다. 비장 면역세포에서 CD4+ T 임파구를 제거한 경우 IFN-γ 생성이 관측되지 않았으나, CD+8 T 임파구를 제거한 경우에는 IFN-γ 생성이 관측되었다. 수치 및 막대(bar)는 IFN-γ의 평균값과 오차를 뜻한다. 위 결과는 2회 반복한 결과이며 유사한 결과가 측정되었다.

이러한 결과는 Th1 타입의 CD4+ T 임파구가 E7과 CpG-ODN 동시 주사에 의해서만 활성화되며, CpG-ODN이 E7 특이 Th1 타입의 면역반응을 유도함을 의미한다.

또한, CD8+ T 임파구에서의 IFN-γ 생성 정도를 측정하기 위해서 E7 단독,CpG-ODN 단독 또는 E7과 CpG-ODN 공동 주사하여 처리한 동물에서 채취한 비장 면역세포를 불활성화된 TC-1 세포주(MHC class I⁺, class II^-)와 함께 3일 동안 배양하였다.

도 5C는 E7 단독 주사, CpG-ODN 단독 주사 또는 E7과 CpG-ODN의 공동 주사로 면역 유도된 비장면역세포를 미리 미토마이신 C로 처리된 TC-1와 3일 동안 배양한 경우의 IFN-γ 분비를 나타낸다. IFN-γ생성이 E7과 CpG-ODN으로 동시 주사된 동물 그룹에서만 관측되며 E7 단독 또는 CpG-ODN 단독 주사된 그룹에서는 관측되지 않았다. 이러한 결과는 CTL(IFN-γ 분비 CD8+ T 세포) 결과와도 같다(도 4B).

또한, 도 5D는 E7과 CpG-ODN이 동시주사된 비장면역세포에서 CD4+ T 또는 CD8+ T 임파구를 각각 제거한 후 미리 미토마이신 C로 처리된 TC-1와 3일 동안 배양한 경우의 IFN-γ 분비를 나타낸다. 비장 면역세포에서 CD8+ T 임파구가 제거한 경우 IFN-γ 생성이 관측되지 않았으나, CD+4 T 임파구를 제거한 경우에는 IFN-γ 생성이 관측되었다. 수치 및 막대(bar)는 IFN-γ의 평균값과 오차를 뜻한다. 위 결과는 2회 반복한 결과이며 유사한 결과가 측정되었다.

이러한 결과는 CD8+ T 임파구가 E7과 CpG-ODN의 동시 주사에 의해서만 MHC class I에 연계되어 IFN-γ를 생성함을 의미한다.

이상에서, 본원 발명을 구체적 양태를 들어 설명하였으나, 당업자라면 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본원 발명의 취지 및 범위내에서 다양한 변형이 가능하다. 따라서, 본원 발명은 본원에 예시된 구체적 양태로 제한되지 않는다.

파필로마바이러스 항원 단백질 및 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 본원 발명의 약제학적 조성물은, 이들을 동시에 투여하는 경우에만 동물 모델에서 항종양 활성을 갖고 CTL 반응을 나타내며 CD4+ T 임파구 및 CD8+ T 임파구에서의 IFN-γ 생성을 유도하는 강력한 면역 반응을 유도할 수 있어 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Claims

면역학적 유효량의 파필로마바이러스 E7 항원 단백질 및 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함함을 특징으로 하는, 파필로마바이러스에 의해 유발되는 세포증식성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 파필로마바이러스 항원 단백질이 사람 파필로마바이러스 타입 16의 E7 단백질인 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 사람 파필로마바이러스 타입 16의 E7 단백질이 재조합 단백질인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 연속한 CpG를 분리시키며, 약 8 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드가 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 파필로마바이러스에 의해 유발되는 질환이 자궁경부암인 약제학적 조성물.